de bacterias del género en altas concentraciones de oxígeno 2
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Transcript of de bacterias del género en altas concentraciones de oxígeno 2
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 2
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 3
1 RESUMEN
El aacutecido γ-poliglutaacutemico es un poliacutemero inusual que acontece de forma
natural anioacutenico soluble en agua biodegradable comestible y que no resulta
toacutexico ni para el ser humano ni para el ambiente
Diferentes cepas de bacterias del geacutenero Bacillus son capaces de
producir el γ-PGA ya sea como material viscoso extracelular o como
componente capsular En termino industrial estas cepas han sido las maacutes
utilizadas y por ende las maacutes estudiadas hasta el momento
La mayor parte de los estudios llevados a cabo hasta la fecha han estado
orientados a determinar los requerimientos nutricionales para el adecuado
crecimiento celular asiacute como mejorar la productividad de γ-PGA y la variacioacuten
en la composicioacuten de su estructura en lo referente al contenido de aacutecido L- y
D-glutaacutemico
Una de las principales limitantes que han encontrado los estudios previos
sobre produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico en medio liacutequido mediante
fermentacioacuten sumergida es la dificultad del escalamiento muy probablemente
debido a la reduccioacuten en la tasa de transferencia de oxiacutegeno al aumentar los
voluacutemenes de cultivo lo que conlleva a rendimientos pobres o a la generacioacuten
de un poliacutemero de bajo peso molecular
La presente investigacioacuten busca estudiar la produccioacuten de aacutecido γ-
poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis ATCC9945a y el efecto que tiene sobre
el rendimiento y estructura del producto factores propios de la ingenieriacutea
quiacutemica como lo son la presioacuten y la intensidad de agitacioacuten particularmente
desde la perspectiva de su efecto sobre la tasa de transferencia de oxiacutegeno
Para cumplir con dicho objetivo se disentildeoacute un biorreactor que permitioacute realizar
fermentaciones a presioacuten positiva de hasta 4 bar absolutos
Los resultados obtenidos y reportados en esta investigacioacuten sugieren
queBacillus licheniformis ATCC9945a es capaz de crecer eficientemente a
presiones de hasta 242 bar relativos no vieacutendose afectado desde el punto de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 4
vista de viabilidad por el incremento de la variable presioacuten de fermentacioacuten De
igual manera la presioacuten de fermentacioacuten afecta de manera significativa la
productividad de Bacillus licheniformis ATCC9945a en γ-PGA Asiacute mismo la
presioacuten de fermentacioacuten modifica la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 5
2 IacuteNDICE
1 RESUMEN 3
2 IacuteNDICE 5
3 GLOSARIO 9
4 PREFACIO 11
21 Origen del proyecto 11
22 Motivacioacuten 11
5 INTRODUCCIOacuteN 13
31 Objetivos 14
6 MARCO TEOacuteRICO 15
41 Los poliaminoaacutecidos 15
42 El aacutecido γ‐poliglutaacutemico (γ‐PGA) 15
421 Propiedades quiacutemicas y bioquiacutemicas del γ‐PGA 16
422 Siacutentesis microbioloacutegica de γ‐PGA 18
423 Produccioacuten fermentativa de γ‐PGA 22
424 Produccioacuten de γ‐PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a 24
425 Purificacioacuten del γ‐PGA 31
426 Control del peso molecular y degradacioacuten del γ‐PGA 32
427 Aplicaciones del γ‐PGA 33
43 Disentildeo de procesos biotecnoloacutegicos y la transferencia de materia gas‐liquido 38
431 La transferencia de materia gas‐liacutequido 39
432 La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) 40
433 Descripcioacuten de la transferencia maacutesica con kLa 40
44 Fermentaciones a presioacuten 42
7 MATERIALES Y METODOLOGIacuteA 45
51 Informacioacuten de la cepa empleada 45
52 Medio de cultivo empleado 45
53 Preparacioacuten de los inoacuteculos madre 46
531 Conservacioacuten de la cepa en estado productivo 46
54 Montaje del biorreactor a presioacuten 46
55 Condiciones de fermentacioacuten 50
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 6
551 Escalamiento 50
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre 51
56 Determinacioacuten del valor de kLa 52
561 Matraces de cultivo 53
562 Biorreactor 53
563 Graficacioacuten 53
57 Determinacioacuten del contenido de γ‐PGA en el caldo de fermentacioacuten 54
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA en la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo 55
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano 55
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 56
5101 Preparacioacuten de la muestras 56
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual 57
511 Determinacioacuten del peso molecular del γ‐PGA 57
8 RESULTADOS 59
61 Montaje del biorreactor a presioacuten 59
62 Competencia del inoacuteculo madre 59
63 Determinacioacuten de los valores de kLa 60
631 Matraz 60
632 Biorreactor 63
64 Efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto 64
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ‐PGA mediante
GPChelliphellip 65
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γ‐PGA 66
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ‐PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a 70
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 71
69 Determinacioacuten del peso molecular del γ‐PGA 73
9 DISCUSIOacuteN 77
71 Cepa empleada 77
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente 78
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten 79
74 Tiempo de fermentacioacuten 81
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento 83
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 7
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa 84
77 Efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto 86
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γ‐PGA 87
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR 87
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la
biosiacutentesis del γ‐PGA 90
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γ‐PGA 92
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 93
711 Peso molecular del γ‐PGA 95
10 CONCLUSIONES 97
11 AGRADECIMIENTOS 101
12 BIBLIOGRAFIacuteA 103
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 8
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 9
3 GLOSARIO
Bacillus Es un geacutenero de bacterias en forma de bastoacuten y Gram positiva El
geacutenero Bacillus pertenece a la divisioacuten Firmicutes Son aerobios estrictos o
anaerobios facultativos En condiciones estresantes forman una endospora de
ubicacioacuten central Dicha forma esporulada es resistente a las altas
temperaturas y a los desinfectantes quiacutemicos corrientes
γ-PGA Aacutecido gamma-poliglutaacutemico
ATCC American Type Culture Collection coleccioacuten y depositario de microorganismos
de importancia industrial y cientiacutefica
Biorreactor Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente
bioloacutegicamente activo En algunos casos un biorreactor es un recipiente en el
que se lleva a cabo un proceso quiacutemico que involucra organismos o
sustancias bioquiacutemicamente activas derivadas de dichos organismos Este
proceso puede ser aeroacutebico o anaeroacutebico Estos biorreactores son
comuacutenmente ciliacutendricos variando en tamantildeo desde algunos mililitros hasta
metros cuacutebicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable
OTR Tasa de transferencia de oxiacutegeno
OUR Tasa de consume de oxiacutegeno por parte de un microorganismo
kL Coeficiente de transferencia maacutesica
a Aacuterea de transferencia de materia por unidad de volumen
kLa Coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 10
cA
Concentracioacuten de saturacioacuten de oxiacutegeno Maacutexima concentracioacuten de oxiacutegeno que pueda estar disuelto en una fase liacutequida perfectamente mezclada
cA Concentracioacuten de oxiacutegeno en el liacutequido o concentracioacuten real Es determinada experimentalmente haciendo uso de una sonda de oxiacutegeno disuelto
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 11
4 PREFACIO
21 Origen del proyecto
Este proyecto forma parte de una serie de estudios llevados a cabo en
el ETSEIB referentes al empleo y produccioacuten de biopoliacutemeros en Cataluntildea
Anteriormente no solo se ha investigado en torno a la produccioacuten mediante
fermentacioacuten del biopoliacutemero aacutecido poliglutaacutemico sino tambieacuten sobre la
produccioacuten de aacutecido polilaacutectico y su biodegradabilidad entre otros
Una de las principales limitantes que han encontrado los estudios
previos sobre produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico en medio liacutequido mediante
fermentacioacuten sumergida es la dificultad del escalamiento muy probablemente
debido a la reduccioacuten en la tasa de transferencia de oxiacutegeno al aumentar los
voluacutemenes de cultivo lo que conlleva a rendimientos pobres o a la generacioacuten
de un poliacutemero de bajo peso molecular Asiacute mismo la reproducibilidad de los
resultados es pobre en parte por muacuteltiples factores que fueron estudiados con
mayor detalle en este trabajo
Con el propoacutesito de dar solucioacuten a este problema el presente proyecto
plantea una forma diferente y creativa al menos no es la comuacuten en el aacutembito
microbioloacutegico de abordar la limitacioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
durante la fermentacioacuten y que podriacutea ser la responsable de la reduccioacuten en los
rendimientos Asiacute mediante la aplicacioacuten de condiciones de presioacuten positiva se
plantea una posible viacutea de mejora de los rendimientos fermentativos en la
produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico esperando que sus efectos sobre la
viabilidad microbiana sean los menores posibles
22 Motivacioacuten
En la sociedad actual existe una creciente buacutesqueda de soluciones
bioloacutegicas para los problemas que anteriormente abordaacutebamos desde una
percepcioacuten uacutenicamente quiacutemica Asiacute hoy en diacutea con el propoacutesito de garantizar
la preservacioacuten del medio ambiente reducir el impacto de la actividad humana
sobre las especies animales y vegetales y garantizar un planeta a las futuras
generaciones la palabra biopoliacutemero y bioplaacutestico se han vuelto maacutes y maacutes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 12
comunes tanto en el argot popular como en el aacutembito del conocimiento
cientiacutefico donde diacutea con diacutea son maacutes las investigaciones orientadas a este tipo
de productos de naturaleza bioloacutegica y por consiguiente biodegradable
El aacutecido poliglutaacutemico por sus caracteriacutesticas constituye un poliacutemero
natural que ofrece una amplia gama de aplicaciones industriales donde puede
ser empleado tanto como agente espesante o floculador hasta aplicaciones
maacutes novedosas relacionadas con la medicina y la farmacia
En este contexto de buacutesqueda de soluciones amigables con el ambiente
es donde surge la principal motivacioacuten para investigar sobre el aacutecido
poliglutaacutemico en particular sobre coacutemo aumentar la productividad del proceso
fermentativo a partir del cual se realiza su siacutentesis de modo que las ventajas
teoacutericas que ofrece este producto pronto esteacuten disponibles tanto para el
consumidor como para la industria Tristemente los productos biotecnoloacutegicos
casi siempre tienen como principal inconveniente la valoracioacuten econoacutemica
pues tienden a ser difiacuteciles de producir por lo que tienen altos costos
asociados o sus rendimientos son menores a los deseados para hacerlos
econoacutemicamente rentables Por este motivo las investigaciones deben
procurar al menos orientarse a ofrecer soluciones que alguacuten diacutea puedan ser
llevadas a la praacutectica o como sucede con esta investigacioacuten procurar dar
respuesta a los problemas que se enfrentan cuando se trata de llevar un
producto biotecnoloacutegico a la realidad
La importancia de la investigacioacuten biotecnoloacutegica en el campo de los
materiales radica en que en un mundo con materias primas limitadas
particularmente las fuentes foacutesiles los materiales del futuro tendraacuten un origen
maacutes bioloacutegico que mineral o extractivo por lo que la mejora de los procesos
productivos relacionados con estos productos son prioritarios para cualquier
paiacutes que desee mantenerse competitivo en el aacutembito econoacutemico y tecnoloacutegico
mundial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 13
5 INTRODUCCIOacuteN
En la actualidad el desarrollo de biomateriales constituye uno de los
principales ejes de investigacioacuten en el mundo de la ciencia Dentro de estos
biomateriales los biopoliacutemeros han logrado un particularmente alto grado de
atencioacuten especialmente en los uacuteltimos 30 antildeos debidos a sus muacuteltiples
aplicaciones industriales biomeacutedicas y farmaceacuteuticas que estaacuten aportando una
amplia gama de opciones y soluciones a problemas ambientales y en la
formulacioacuten de nuevas preparaciones biomeacutedicas y farmaceacuteuticas
Los biopoliacutemeros son materiales polimeacutericos o macromoleculares que
son sintetizados por seres vivos Debido en gran parte al precio creciente la
viabilidad declinante de las fuentes foacutesiles como materias primas asiacute como el
ritmo crecimiento de la poblacioacuten mundial han propiciado el desarrollo de
fuentes alternativas renovables capaces de suministrar las necesidades
mundiales crecientes en material de energiacutea y produccioacuten quiacutemica Esta
necesidad de nuevas fuentes alternativas ha permitido que la mirada cientiacutefica
se halle puesta sobre la diversidad microbiana que habita el planeta pues los
microorganismos siempre han demostrado ser una fuente importante de
materiales novedosos con la ventaja que en la actualidad se dispone de la
tecnologiacutea necesaria para crecer los microorganismos de manera masiva y
segura Este nuevo modelo conocido como la estrategia de las biorefineriacuteas
ha cambiado la concepcioacuten de la industria quiacutemica moderna y ha sido
empleada exitosamente en la produccioacuten convencional a granel de diversos
productos quiacutemicos como por ejemplo etanol glutamato y aacutecido ciacutetrico
En el presente la produccioacuten de poliacutemeros o monoacutemeros tales como el
13-propanediol el aacutecido polilaacutectico y los polihidroxialcanoatos ha sido uno de
los principales objetivos de mayor investigacioacuten Dentro de estos nuevos
materiales encontramos los poliaminoaacutecidos poliamidas de naturaleza
polimeacuterica cuyos constituyentes estaacuten unidos por enlaces del tipo amida El
aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) es uno de estos poliaminoaacutecidos un poliacutemero
biodegradable constituido por unidades de D- y L-aacutecido glutaacutemico y que es
producido de manera natural en algunas bacterias
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 14
El presente trabajo procura investigar sobre algunas de las condiciones
involucradas en la produccioacuten bacteriana de γ-PGA y que constituyen las
principales barreras que impiden alcanzar los rendimientos necesarios para
que la produccioacuten bioloacutegica de este poliacutemero sea viable tanto desde el punto de
vista bioloacutegico como econoacutemico
31 Objetivos
El objetivo general a partir del cual se estructura el desarrollo de la
presente investigacioacuten es
Estudiar la produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a y el efecto que tiene sobre el rendimiento y estructura del
producto factores propios de la ingenieriacutea quiacutemica como lo son la
presioacuten y la intensidad de agitacioacuten
Los objetivos especiacuteficos que se plantearon alcanzar en el siguiente
proyecto son los siguientes
Disentildear un biorreactor que permita realizar fermentaciones a presioacuten
positiva de hasta 4 bar absolutos
Describir las condiciones baacutesicas requeridas para lograr reproducibilidad
en la produccioacuten deaacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre el rendimiento de
produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico en gL por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre la composicioacuten
enantiomeacuterica y el peso molecular del aacutecido γ-poliglutaacutemico
Establecer el posible efecto de la presioacuten positiva sobre la tasa de
transferencia de oxiacutegeno en el biorreactor
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 15
6 MARCO TEOacuteRICO
41 Los poliaminoaacutecidos
Los poliaminoaacutecidos son poliamidas formadas por un uacutenico aminoaacutecido
y difieren de las proteiacutenas en muacuteltiples aspectos Las proteiacutenas son
biomoleacuteculas compuestas por una amplia gama de aminoaacutecidos mientras que
los poliaminoaacutecidos estaacuten compuestos uacutenicamente por un solo tipo de
aminoaacutecido al menos en su eje central La siacutentesis de proteiacutenas estaacute dirigida
por el ADN que controla la secuencia especiacutefica de aminoaacutecidos que termina
formando una moleacutecula de una proteiacutena en particular Por su parte los
poliaminoaacutecidos son sintetizados por una ruta metaboacutelica de los organismos
completamente distinta En enlace amida en las proteiacutenas acontece
uacutenicamente entre los grupos α-amino y α-carboxilo mientras que en los
poliaminoaacutecidos pueden verse involucradas otras cadenas laterales
funcionales como por ejemplo los grupos β- y γ-carboxiloy ε-amino(Bajaj amp
Singhal 2011)
Existen mayoritariamente tres poliaminoaacutecidos presentes en la
naturaleza el aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina En
el aacutecido γ-poliglutaacutemico los enlaces amida se forman entre el grupo α-amino y
el γ-carboxilo en el eje central La poli ε-lisina presenta monoacutemeros de lisina
unidos por los grupos α-carboxilo y ε-amino La cianoficina consiste en residuos
de aacutecido α-aspaacutertico que contienen residuos de arginina que penden unidos al
grupo β-carboxilo Las foacutermulas de dichos compuestos se presentan en la
figura 1
42 El aacutecido γshypoliglutaacutemico (γshyPGA)
El aacutecido γ-poliglutaacutemico (de ahora en adelante referido como γ-PGA) es
un poliacutemero inusual que acontece de forma natural anioacutenico soluble en agua
biodegradable comestible y que no resulta toacutexico ni para el ser humano ni para
el ambiente que en la naturaleza es producido por algunas bacterias todas
Gram-positivas una archea e inclusive en eucariotas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 16
Fue primeramente descubierto por Ivaacutenovics y colaboradores como
componente de la caacutepsula de la bacteria Bacillus anthracis despueacutes que se
liberara al medio producto tanto del proceso de autoclavado como por el
envejecimiento y lisis natural de los cultivos La comida tradicional japonesa
ldquoNattordquo estaacute constituida por una mezcla de γ-PGA y fructanos que son
producidos por la bacteria Bacillus natto (Bajaj amp Singhal 2011)
Figura 1 Foacutermula y estructura del aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina
(Fuente Feng et al 2007)
421 Propiedades quiacutemicas y bioquiacutemicas del γshyPGA
El γ-PGA es un poliacutemero polianioacutenico que puede estar compuesto
uacutenicamente por D- L- o por ambos enantioacutemeros del aacutecido glutaacutemico Como se
ha comentado ya es altamente soluble en agua El γ-PGA probablemente
pueda adoptar diferentes estructuras La estructura del γ-PGA ha sido predicha
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 17
asumiendo poliaminoaacutecidos constituidos por 10 o 25 moleacuteculas de aacutecido
glutaacutemico Este modelo teoacuterico calculado para una moleacutecula en solucioacuten
acuosa muestra que el γ-PGA consiste de una heacutelice levoacutegira estabilizada por
enlaces de hidroacutegeno intramoleculares Sin embargo otro estudio realizado a
partir de γ-PGA obtenido de Bacillus licheniformis mostroacute que la conformacioacuten
es realmente flexible y depende de la concentracioacuten de γ-PGA y el pH de la
disolucioacuten A bajas concentraciones (01 wv) y a un pH inferior a 7 el γ-PGA
adopta una conformacioacuten basada mayoritariamente en heacutelices del tipo α
mientras que la conformacioacuten tipo hojas β predomina a pH superiores pues
esta conformacioacuten permite una mejor exposicioacuten de las cargas negativas del γ-
PGA (Candelaamp Fouet 2006) Recientemente mediamente experimentos de
dicroiacutesmo circular se ha reportado una estructura desordenada (Joyce et al
2006 Candela amp Fouet 2006) pero sin detallar las condiciones de trabajo de
los experimentos en particular de pH
El peso molecular del γ-PGA parece variar seguacuten sea el organismo que
produce la moleacutecula sin embargo estas diferencias podriacutean deberse a
diferencias en torno a la degradacioacuten natural que acontece con el poliacutemero o a
los meacutetodos de purificacioacuten y anaacutelisis utilizados mismos que puedan afectar el
tamantildeo del γ-PGA Por ejemplo para el caso de Bacillus subtilis el peso
molecular del γ-PGA variacutea entre 160kDa hasta 1500 kDa las cadenas de γ-
PGA consisten entonces de coacutemo miacutenimo 1000 residuos de aacutecido glutaacutemico
Diferentes estudios enfocados en la siacutentesis microbioloacutegica de γ-PGA han
demostrado que el peso molecular de este poliacutemero es dependiente tanto de
las diversas cepas bacterianas que se empleen asiacute como de los componentes
del medio y las condiciones del medio de cultivo e inclusive de razones auacuten no
dilucidadas De alliacute que exista una gran dificultad para obtener un γ-PGA
altamente homogeacuteneo a partir de cultivos bacterianos esto en gran parte
debido a esta inestabilidad descrita asiacute como a la complejidad molecular
involucrada en su biosiacutentesis
Asiacute mismo el γ-PGA puede contener soacutelo aacutecido D-glutaacutemico soacutelo aacutecido
L-glutaacutemico o una mezcla de ambos enantioacutemeros De alliacute que los filamentos
puedan ser de aacutecido γ-poli-L-glutaacutemico (γ-PLGA) de aacutecido γ-poli-D-glutaacutemico
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 18
(γ-PDGA) o de aacutecido γ-poli-L-D-glutaacutemico (γ-PLDGA) La disposicioacuten de los
residuos en el PLGDA requiere un especial anaacutelisis ya que si bien tanto el
PLGA y el PDGA son ambos solubles en etanol cuando ambos se mezclan en
proporcioacuten equimolar precipitan en etanol Esta observacioacuten es utilizada para
demostrar que el γ-PGA producido por Bacillus licheniformis estaacute compuesto
por cadenas tanto de PLGA como de PDGA Asiacute mismo la digestioacuten con L-
glutamilhidrolasa ha demostrado que el γ-PGA de Bacillus subtilis consiste en
una mezcla de isoacutemeros PLGA y PLDGA
422 Siacutentesis microbioloacutegica de γshyPGA
Distribucioacuten en los microorganismos
Inicialmente el γ-PGA fue detectado como un componente de la pared
capsular de la altamente patogeacutenica bacteria Gram-positiva Bacillus anthracis
Posteriormente este poliacutemero seriacutea nuevamente encontrado presente alrededor
de ceacutelulas de otras bacterias Gram-positivas no patogeacutenicas particularmente
del geacutenero Bacillus Gracias a estos descubrimientos fue posible aislar a inicios
del siglo pasado una cepa de Bacillus capaz de producir grandes cantidades de
γ-PGA
Posteriormente y de manera adicional a estas bacterias formadoras de
endosporas del geacutenero Bacillus el γ-PGA fue encontrado en las eubacterias
haloacutefilas Sporosarcina halophila y Planococcus halophilus y en la
archeobacteria haloacutefila Natrialba aegyptiaca Asiacute mismo γ-PGA fue tambieacuten
detectado en cantidades significativas en nematocistos de Cnidaria (eucariota)
En la tabla 1 se presentan los principales organismos productores de γ-
PGA y algunas de las caracteriacutesticas del γ-PGA producido
Ruta de biosiacutentesis
La conversioacuten de glucosa a γ-PGA sugiere que la siacutentesis del poliacutemero
acontece durante la glicoacutelisis y el ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos (ciclo de
Krebs o del aacutecido ciacutetrico) hasta el 2-oxoglurato (α-cetoglutarato) que es un
precursor directo del aacutecido L-glutaacutemico Durante su crecimiento en un medio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 19
Tabla 1 Organismos que han sido reportados como productores de γ-PGA
ORGANISMO CONFORMACIOacuteN CONFORMACIOacuteN DEL FILAMENTO
Bacillus anthracis D D
Bacillus mesentericus D D
Bacillus licheniformis D y L D y L
Bacillus megaterium D y L D + L
Bacillus pumilus D y L ND
Bacillus subtilis D y L L y D+L
Planococcus halophilus D D
Sporosarcina halophila D D
Staphylococcus
epidermidis
D y L ND
Natrialba aegyptiaca L L
Hydra ND ND
Fuente (Candela amp Fouet 2006)
nutritivo Bacillus licheniformis expresa dos enzimas capaces de sintetizar el
aacutecido L-glutaacutemico la glutamato sintasa y la glutamato deshidrogenasa Ambas
enzimas son praacutecticamente insensibles a la inhibicioacuten por producto lo que
permite alcanzar altas concentraciones intracelulares de aacutecido L-glutaacutemico el
cual es entonces direccionado a la siacutentesis de γ-PGA Los estudios maacutes
detallados relacionados con la polimerizacioacuten del γ-PGA se han realizado con
Bacillus anthracis Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis especialmente
Bacillus licheniformis ATCC9945a lo que ha permitido la identificacioacuten de un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 20
sistema enzimaacutetico anclado a la membrada y denominado como PGA-
sintetasa Este sistema enzimaacutetico estaacute constituido por al menos tres
componentes con actividad enzimaacutetica y se presume que cataliza la siguiente
secuencia de reacciones (Troy 1973) (figura 2)
Aacutecido L-glutaacutemico + ATP ɣ-L-glutamil-AMP + PPi (a)
ɣ-L-glutamil-AMP + SH-enzima ɣ-X-glutamil-S-enzima + AMP (b)
ɣ-X-glutamil-S-enzimaɣ-D-glutamil-S-enzima (c)
ɣ-D-glutamil-S-enzima + [ɣ-D-glutamil]n[ɣ-D-glutamil]n+1 + SH-enzima (d)
Figura 2 Posible mecanismo enzimaacutetico de siacutentesis del γ-PGA (Fuente Ashiuchi 2010)
De acuerdo con este modelo solamente el aacutecido L-glutaacutemico es activado
en el paso (a) mediante fosforilacioacuten lo que significa que la biosiacutentesis del γ-
PGA requiere el suministro de energiacutea para la formacioacuten del enlace amida Maacutes
recientemente un segundo mecanismo ha sido descrito por Ashiuchi (2001) e
involucra un complejo enzimaacutetico denominado PgsBCA el cual es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico y donde la
polimerizacioacuten ocurre por un mecanismo de ligacioacuten tipo amida (figura 3)
Inicialmente se habiacutea descrito que el complejo enzimaacutetico era el responsable
de racemizar y polimerizar el aacutecido glutaacutemico sin embargo estas nuevas
evidencias parecen demostrar que el complejo enzimaacutetico involucrado en la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 21
siacutentesis de γ-PGA carece de actividad racemasa y que la formacioacuten del aacutecido
D-glutaacutemico es responsabilidad de una enzima citosoacutelica denominada aacutecido
glutaacutemico racemasa Glr que presenta una alta selectividad por el aacutecido
glutaacutemico y una mayor preferencia por el aacutecido L-glutaacutemico Un modelo de la
viacutea metaboacutelica mayoritariamente aceptada para la siacutentesis de γ-PGA se
presente en la figura 4
Figura 3 Mecanismo propuesto de biosiacutentesis del γ-PGA mediante ligacioacuten tipo amida
(Fuente Ashiuchi 2001)
Figura 4 Viacutea metaboacutelica de biosiacutentesis del γ-PGA (Fuente Buescher amp Margaritis 2007)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 22
Organizacioacuten geneacutetica
Solamente unas pocas bacterias la mayoriacutea dentro del geacutenero Bacillus
han sido reportadas como capaces de producir γ-PGA Asiacute mismo la
produccioacuten de γ-PGA no es uniforme en estos individuos inesperadamente
variacutea inclusive bajo condiciones de cultivo altamente estrictas De alliacute que la
identificacioacuten del sistema regulatorio y los genes involucrados en dicho sistema
es vital para dar solucioacuten a estos problemas de uniformidad y rendimiento El
complejo PGA-sintetasa estaacute codificado por cuatro loci que son denominados
pgs Los cuatro genes pgs son pgsB pgsC pgsAA y pgsE y se les denomina
en conjunto pgsBCA Todos estos genes son necesarios y suficientes para la
produccioacuten de γ-PGA in vivo La figura 5 muestra los elementos geneacuteticos
requeridos para la produccioacuten de γ-PGA en diferentes especies del genero
Bacillus
Figura 5 Elementos geneacuteticos necesarios para la siacutentesis de γ-PGA (Fuente Candela amp
Fouet 2006)
423 Produccioacuten fermentativa de γshyPGA
Diferentes cepas de bacterias del geacutenero Bacillus son capaces de
producir elγ-PGA ya sea como material viscoso extracelular o como
componente capsular En termino industrial estas cepas han sido las maacutes
utilizadas y por ende las maacutes estudiadas hasta el momento La mayor parte de
los estudios han estado orientados a determinar los requerimientos
nutricionales para el adecuado crecimiento celular asiacute como mejorar la
productividad de γ-PGA y la variacioacuten en la composicioacuten de su estructura en lo
referente al contenido de aacutecido L- y D-glutaacutemico Estos estudios como los
realizados por Troy (1973) Cromwicket al (1995) y Kunioka (1997) han
permitido determinar que los requerimientos nutricionales para la produccioacuten de
γ-PGA variacutean seguacuten sea la cepa que se emplea
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 23
De acuerdo a estos requerimientos nutricionales las cepas productoras
de γ-PGA se han dividido en dos grupos uno que requiere la adicioacuten de aacutecido
L-glutaacutemico al medio de cultivo para estimular la produccioacuten de γ-PGA y el
crecimiento celular y otro que no requiere de aacutecido L-glutaacutemico para la
produccioacuten de γ-PGA
Dentro de las bacterias dependientes de aacutecido L-glutaacutemico las cepas
maacutes promisorias han sido B anthracis B licheniformis ATCC9945a B subtilis
IFO3335 y B subtilis F-2-01 Por su parte dentro de las bacterias
independientes de aacutecido L-glutaacutemico encontramos mayoritariamente los caso s
de B subtilis 5E B subtilis TAM-4 y B licheniformis A35 B subtilis 5E puede
producir γ-PGA a partir de L-prolina como uacutenica fuente de carbono
complementado con una fuente de nitroacutegeno en un medio mineral B
licheniformis A35 produce γ-PGA a partir de glucosa y cloruro de amonio en
condiciones desnitrificantes y B subtilis TAM-4 produce grandes cantidades de
γ-PGA cuando crece en un medio de cultivo con una sal de amonio y azuacutecar
como fuentes de nitroacutegeno y carbono respectivamente Asiacute mismo ademaacutes de
la fuente de carbono y nitroacutegeno existen otra serie de factores tales como
fuerza ioacutenica del medio de cultivo pH del medio de cultivo aireacioacuten entre
otros que afectan en gran medida la productividad y calidad del γ-PGA
De primera impresioacuten pareciera conveniente el empleo de las cepas
independientes de aacutecido L-glutaacutemico para la produccioacuten industrial de γ-PGA
sin embargo la informacioacuten disponible en lo referente a la ruta biosinteacutetica el
mecanismo de formacioacuten del γ-PGA y los factores que afectan la productividad
es praacutecticamente nula para estas cepas A partir de los trabajos de
investigacioacuten y los estudios de aplicaciones industriales la produccioacuten de γ-
PGA se ha llevado a cabo mayoritariamente a partir de cepas dependientes de
aacutecido L-glutaacutemico
En la tabla 2 se presentan algunas de las principales cepas bacterianas
empleadas para la produccioacuten de γ-PGA los nutrientes las condiciones de
cultivo el rendimiento obtenido asiacute como los voluacutemenes de cultivo en que se
basan dichos reportes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 24
Tabla 2 Principales bacterias productoras de γ-PGA (Shih amp Van 2001)
CEPA
NUTRIENTES
CONDICIONES DE CULTIVO
RENDIMIENTO
VOLUMEN DE
TRABAJO B licheniformis ATCC9945a
Aacutecido glutaacutemico (20 gL) aacutecido ciacutetrico (12 gL) NH4Cl (7 gL)
30ordmC 4 diacuteas 17-23 gL 100 mL
B subtilis IFO 3335
Aacutecido glutaacutemico (30 gL) aacutecido ciacutetrico (20 gL)
37ordmC 2 diacuteas 10-20 gL 125 mL
B subtilis TAM-4
Fructosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 4 diacuteas 20 gL 100 mL
B licheniformis A35
Glucosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 3-5 diacuteas 8-12 gL 100 mL
B subtilis F02-1
Aacutecido glutaacutemico(70 gL) glucosa (1 gL)
30ordmC 2-3 diacuteas 50 gL 200 mL
B subtilis (natto)
Maltosa (60 gL) salsa de soya (70 gL) glutamato soacutedico (30 gL)
40 ordmC 3-4 diacuteas 35 gL 125 mL
Fuente Shih amp Van 2001
424 Produccioacuten de γshyPGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a
Generalidades de la bacteria Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis es una bacteria comuacutenmente encontrada en el
suelo y en las plumas de las aves Es gram-positiva de forma oval y mesoacutefila
Su temperatura oacuteptima de crecimiento se encuentra alrededor de los 30 ordmC
aunque es capaz de sobrevivir a temperaturas mucho mayores La temperatura
oacuteptima para la secrecioacuten de enzimas es de 37 ordmC Esta bacteria puede existir
como espora cuando las condiciones son inadecuadas o en estado vegetativo
cuando las condiciones le son maacutes favorables (Wecke et al 2006)
Bacillus licheniformis forma parte del grupo Subtilis junto con Bacillus
subtilis y Bacillus pumilus Estas bacterias son conocidas por ser
contaminantes comunes de alimentos asiacute como favorecer su descomposicioacuten
aunque no se consideran patoacutegenos de importancia para el ser humano
(Wecke et al 2006)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 25
La cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis y la siacutentesis de γ-PGA
La produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a fue
primeramente estudiada por Bovarnick en 1942 sin embargo no fue sino a
partir de 1954 cuando Thorne y colaboradores iniciaron una serie de estudios
sistemaacuteticos orientados a investigar los factores que afectan la produccioacuten de
γ-PGA lo que permitioacute determinar algunos factores y condiciones necesarios
para lograr mayores rendimientos Factores tales como presencia de ciertas
sales inorgaacutenicas aacutecido glutaacutemico aacutecido ciacutetrico glicerol y el tamantildeo del inoacuteculo
demostraron tener efectos importantes sobre el rendimiento de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a tanto en condiciones estaacuteticas como cultivos
bajo agitacioacuten Se encontroacute que los mejores rendimientos se produciacutean cuando
el microorganismo era cultivado en agitacioacuten orbital en un medio de cultivo
denominado como medio C (tabla 3) alcanzando una productividad de hasta
15 gL en un periacuteodo de 3-4 diacuteas Asiacute mismo la mayor produccioacuten de poliacutemero
soacutelo se alcanzaba cuando se empleaba agua de grifo y un lote especiacutefico de
FeCl3 Posteriormente se determinariacutea que dicho lote de FeCl3 estaba
contaminado con trazas de Mn2+ y que el agua de grifo conteniacutea cantidades
significativas de Ca2+ Posteriormente Leonard y colaboradores (1958) se
encargariacutean de comprobar la funcioacuten y concentracioacuten oacuteptima de ambos
elementos quiacutemicos mediante la elaboracioacuten de un medio de cultivo
quiacutemicamente definido tomando como base el medio C de Thorne
Tabla 3 Composicioacuten del medio de cultivo C (Thorne et al 1954)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua de grifo
Fuente Shih amp Van 2001
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 26
Leonard y colaboradores encontraron que aunque solamente se requeriacutea
de 15 x 10-7 moles por litro de Mn2+ para alcanzar el maacuteximo crecimiento
concentraciones mayores de Mn2+ mostraban un marcado efecto prolongando
la viabilidad celular y por consiguiente incrementando la productividad de γ-
PGA Un incremento de hasta 615 x 10-4 molL en la concentracioacuten de Mn2+
permitiacutea alcanzar los mayores rendimientos de γ-PGA De igual manera la
adicioacuten de 102 x 10-3 moles por litro de Ca2+ en presencia de 15 x 10-7 moles
por litro de Mn2+ permitiacutea alcanzar auacuten mayores rendimientos deγ-PGA en
comparacioacuten a los valores oacuteptimos de produccioacuten de poliacutemero obtenidos en
ausencia de este elemento El γ-PGA producido consistiacutea en un homopoliacutemero
de unidades repetidas de aacutecido D- y L-glutaacutemico con una concentracioacuten de
aacutecido D-glutaacutemico que variaba entre el 38 y el 86 seguacuten incrementaba la
concentracioacuten de Mn2+ entre 154 x 10-7 y 246 x 10-3 molL siendo esta
observacioacuten independiente de la concentracioacuten presente en el medio de cultivo
de Ca2+
Tabla 4 Composicioacuten del medio E revisado (Leonard et al 1958)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 0000026 a
042 CaCl22H2O 015 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua destilada
Fuente Shih amp Van 2001
A partir de estos resultados Leonard y colaboradores elaboraron el
medio de cultivo denominado Medio E (tabla 4) que es baacutesicamente el medio
original C exceptuando el hecho de que cantidades definidas de Mn2+ y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 27
Ca2+fueron agregadas El Ca2+ fue adicionado con el propoacutesito de asegurar
altas productividades de poliacutemero a cualquier concentracioacuten de Mn2+ que se
empleara mientras que la variacioacuten de la concentracioacuten de este uacuteltimo
elemento permitiriacutea alcanzar el contenido enantiomeacuterico deseado en el
poliacutemero tal y como se comentoacute anteriormente
La estereoquiacutemica del poliacutemero es decir el contenido enantiomeacuterico del
γ-PGA ha sido desde el inicio de las investigaciones uno de los problemas maacutes
complejos y de difiacutecil solucioacuten y de una importancia tanto fundamental como
praacutectica en lo que se refiere al estudio de la produccioacuten de γ-PGA en bacterias
A lo largo de todos estos antildeos han existido numerosas contradicciones entre
los investigadores en cuanto a si el contenido enantiomeacuterico del γ-PGA
producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a estaacute o no afectado por la
concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo Cromwick y Gross (1995)
realizaron un estudio profundo sobre los factores que influenciaban la
produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a Dicho estudio
encontroacute que el porcentaje de aacutecido L-glutaacutemico presente en el γ-PGA variaba
entre 59 y 10 cuando las concentraciones de Mn2+ variaban entre 0 y 615
μmolL asiacute mismo el rendimiento incrementaba desde los 5 hasta los 17 gL en
dicho intervalo de concentracioacuten de Mn2+
Cromwick y Gross (1995) encontraron en este mismo estudio que la
incorporacioacuten de Mn2+ al medio de cultivo es un factor criacutetico para la
conservacioacuten de la viabilidad celular durante periodos de cultivo prolongados
El nuacutemero de ceacutelulas viables se incrementaba del orden de 105 a 109 unidades
formadoras de colonias (ufc) para todas las concentraciones de Mn2+ hasta el
inicio de la fase estacionaria aproximadamente a las 24 horas Sin embargo
despueacutes de 50 horas de cultivo la viabilidad celular se veiacutea reducida
draacutesticamente para aquellas concentraciones de Mn2+ relativamente menores
(0 a 0615 μmolL) mientras que para las concentraciones mayores (338 a 615
μmolL) el nuacutemero de ceacutelulas viables se manteniacutea en el orden de 107-109
inclusive despueacutes de 140 horas de cultivo Asiacute mismo la presencia de Mn2+ en
concentraciones entre 338 y 615 μ incrementaba la utilizacioacuten de las fuentes
de carbono en gran medida cultivos que conteniacutean 615 μmolL de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 28
Mn2+utilizaban el 37 54 y 93 del aacutecido glutaacutemico el glicerol y el aacutecido
ciacutetrico respectivamente en comparacioacuten a aquellos cultivos que no
incorporaban el Mn2+ los cuales solo utilizaban el 19 10 y 17 del aacutecido
glutaacutemico el glicerol y el aacutecido ciacutetrico respectivamente
Uno de los problemas maacutes prolongados en torno a los estudios referidos
a la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC994a es el hecho de
que el microorganismo termina degenerando en una cepa incapaz de producir
γ-PGA despueacutes de cultivo repetitivo Esta inestabilidad exhibida por este
microorganismo es responsable de una gran variacioacuten de cultivo en cultivo en
lo referente a la cantidad y la cineacutetica de formacioacuten del γ-PGA Birrer y
colaboradores (1994) encontraron que el empleo de ceacutelulas vegetativas
criogeacutenicamente congeladas permitiacutea alcanzar un crecimiento y produccioacuten de
poliacutemero consistente de cultivo en cultivo Asiacute mismo y en congruencia con
otros estudios previamente realizados se encontroacute que el crecimiento celular
ocurriacutea baacutesicamente durante las primeras 24 h la mayor productividad
volumeacutetrica de γ-PGA era de 012 gmiddotL-1middoth-1 y se alcanzaba entre los diacuteas 2 y 4
el pH caiacutea de 74 a aproximadamente 5 despueacutes de 42 horas de cultivo e
incrementaba levemente a cerca de 6 despueacutes de 96 horas de cultivo el
empleo de glicerol glutamato y citrato se reduciacutea de 80 a 45 gL 18 a 10 gL y
de 12 a 1 gL respectivamente la produccioacuten de aacutecido aceacutetico hasta un nivel
maacuteximo de 45 gL asiacute como la presencia de 23-butanediol como producto
secundario entre las 42 y las 96 h El estudio del consumo de las fuentes de
carbono resulta un poco sorprendente pues demuestra unas tasas de
consumo del aacutecido ciacutetrico y de glicerol relativamente altas sin embargo para el
caso del aacutecido glutaacutemico dicha tasa de consumo fue por mucho menor y muy
lejana del agotamiento completo de dicha fuente Asiacute mismo la remocioacuten del
aacutecido L-glutaacutemico del medio de cultivo E afectaba en poca medida el
rendimiento en γ-PGA mientras que la remocioacuten de las otras fuentes (glicerol y
aacutecido ciacutetrico) disminuye de manera draacutestica la produccioacuten de γ-PGA Estos
resultados son contradictorios a los encontrados inicialmente por Thorne y
colaboradores (1954) e indica que Bacillus licheniformis ATCC9945 no requiere
de aacutecido L-glutaacutemico para alcanzar altas productividades de γ-PGA Asiacute mismo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 29
la presencia de 23-butanediol es indicador que los niveles de oxiacutegeno en el
medio de cultivo despueacutes de 42 horas son incapaces de sostener un
metabolismo 100 aeroacutebico esto no es de sorprender pues el γ-PGA es un
poliacutemero extracelular extremadamente viscoso y tasas cada vez menores de
transporte de oxiacutegeno son esperables conforme va aumentado la viscosidad en
el medio a medida que la concentracioacuten de γ-PGA se incrementa
Un trabajo de Cromwick y Gross (1996) estudioacute el efecto del pH y la
aireacioacuten sobre la productividad en γ-PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a en condiciones de fermentacioacuten por lotes El pH fue controlado en
los valores de 55 65 74 y 825 y se determinoacute su efecto sobre el crecimiento
celular la utilizacioacuten de las fuentes de carbono la productividad en γ-PGA el
peso molecular y la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA El mayor
rendimiento en γ-PGA se obtuvo a un pH de 65 (15 gL 96 horas de cultivo) y
decrecioacute significativamente en 55 y 74 Esto coincide con el hecho que el
consumo de glicerol y de aacutecido L-glutaacutemico se mantuvo invariable en funcioacuten
del pH sin embargo la mayor tasa de consumo de aacutecido ciacutetrico se observoacute a un
pH de 65 en contraste con 55 y 74 lo cual parece indicar que el metabolismo
del aacutecido ciacutetrico juega un papel importante a dicho valor de pH Previamente
Cromwick y Gross (1995) encontraron que el aacutecido ciacutetrico es efectivamente un
precursor en la produccioacuten del poliacutemero presumiblemente a traveacutes del ciclo de
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De igual manera la alteracioacuten del pH no mostroacute
ninguacuten efecto importante en cuanto al peso molecular y la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA El efecto de la aireacioacuten fue evaluado incrementando
la velocidad de agitacioacuten entre 250 y 800 rpm y la tasa de aireacioacuten entre los
05 y los 20 Lmin a un pH de 65 observaacutendose un incremento en las tasas de
crecimiento y los rendimientos de γ-PGA conforme el suministro de oxiacutegeno
incrementaba
A pesar de la intensa investigacioacuten que se ha llevado a cabo en lo
referente a la produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a el
mecanismo y las viacuteas biosinteacuteticas especiacuteficas por las cuales el poliacutemero es
producido auacuten no han logrado ser dilucidadas con total claridad a pesar de que
no se cuestione le hecho de que efectivamente acontece a traveacutes del ciclo de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 30
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De las tres fuentes de carbono presentes en el medio
de cultivo E el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido L-glutaacutemico constituyen dos sustratos
precursores para la produccioacuten de dicho poliacutemero sin embargo en lo referente
al glicerol auacuten no queda claro como este incrementa la formacioacuten de poliacutemero
maacutes allaacute del hecho de que Troy (1973) encontroacute que el complejo enzimaacutetico
PGA-sintetasa responsable de la polimerizacioacuten del aacutecido L-glutaacutemico a γ-
PGA es estimulada por la presencia de glicerol Considerando que la viacutea de
biosiacutentesis del γ-PGA efectivamente involucra el ciclo de los aacutecidos
tricarboxiacutelicos cualquier fuente de carbono no relacionada directamente como
el glicerol o la glucosa podriacutean en principio ser una fuente primaria de carbono
para el crecimiento celular y la produccioacuten de γ-PGA Efectivamente el empleo
de glucosa como principal fuente de carbono y cantidades traza de aacutecido ciacutetrico
y aacutecido L-glutaacutemico (05 gL) permitieron alcanzar un rendimiento en γ-PGA de
12 gL en cultivos de Bacillus licheniformisATCC9945a (Ko amp Gross 1998) Sin
embargo y a pesar de este hecho Du y colaboradores (1995) encontraron otra
posible explicacioacuten al incremento del rendimiento en presencia de glicerol Ellos
encontraron que en Bacillus licheniformis ATCC9945a las altas
concentraciones de glicerol en el medio de cultivo conllevan a un cambio en la
composicioacuten de los fosfoliacutepidos de la membrana celular incrementando la
proporcioacuten de los fosfoliacutepidos C120 y C101 y reduciendo la de fosfoliacutepidos
C181 y C161 lo que parece favorecer la formacioacuten de una membrana celular
menos compacta lo que conlleva a una efectiva excrecioacuten del γ-PGA fuera de
la membrana celular
En lo referente a produccioacuten a gran escala y en buacutesqueda de la
aplicacioacuten comercial del γ-PGA en grandes cantidades resulta maacutes que
evidente la necesidad de incrementar la productividad Yoon y colaboradores
(2000) desarrollaron una estrategia para la produccioacuten de γ-PGA con un alto
rendimiento mediante cultivo en lote alimentado de Bacillus licheniformis
ATCC9945a Mediante el empleo de un bioreactor de 25 L conteniendo 1 L de
medio de cultivo y bajo condiciones de pH y temperatura de 65 y 37ordmC
respectivamente un 40 de saturacioacuten de oxiacutegeno y una velocidad de
agitacioacuten de 1000 rpm lograron alcanzar una concentracioacuten maacutexima de γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 31
de 35 gL suministrando aacutecido ciacutetrico y aacutecido L-glutaacutemico a una velocidad de
alimentacioacuten de 02 mLmin (144 gh de aacutecido ciacutetrico y 24 gh de aacutecido
glutaacutemico) por un periacuteodo de 3 h despueacutes del agotamiento del aacutecido ciacutetrico
inicial lo cual aconteciacutea alrededor de las 22 h La productividad alcanzada fue
de 1 gmiddotl-1middoth-1
425 Purificacioacuten del γshyPGA
Dado que la produccioacuten del γ-PGA es mayoritariamente extracelular en
concreto en la cepa de intereacutes para el presente estudio la de Bacillus
licheniformis ATCC9945a la purificacioacuten del poliacutemero es directa y consta de
manera general de tres pasos I) la remocioacuten de las ceacutelulas mediante
centrifugacioacuten o filtracioacuten 2) la precipitacioacuten del producto del medio libre de
ceacutelulas mediante metanol etanol o 1-propanol y 3) la diaacutelisis para la remocioacuten
de impurezas de pequentildeo peso molecular
Du y colaboradores (2001) desarrollaron una estrategia eficiente para la
separacioacuten y recuperacioacuten delγ-PGA de caldos altamente viscosos Esta
consiste en dos procesos I) Separar el γ-PGA del caldo de cultivo viscoso y II)
Concentrar la solucioacuten de PGA por ultrafiltracioacuten con el propoacutesito de reducir la
cantidad de alcohol requerida en el proceso de separacioacuten Las ceacutelulas
encapsuladas con γ-PGA poseen carga negativa cerca del valor neutro de pH
esto debido a la ionizacioacuten del grupo carboxilo en las moleacuteculas de γ-PGA Esta
carga negativa en sus superficies les confiere a las ceacutelulas una alta estabilidad
en el medio de cultivo lo que dificulta la sedimentacioacuten de las ceacutelulas durante el
proceso de separacioacuten Esta alta estabilidad asiacute como la elevada viscosidad del
caldo de cultivo son los dos principales problemas que se enfrentan cuando se
trata de separar las ceacutelulas y el γ-PGA del medio de cultivo por lo cual la
reduccioacuten de ambas es vital para una eficiente recuperacioacuten del γ-PGA
Mediante la disminucioacuten del pH es posible reducir el nuacutemero de cargas
negativas sobre la superficie de las ceacutelulas lo que favorece su faacutecil agregacioacuten
y precipitacioacuten Esto permite reducir en hasta un 17 la energiacutea requerida para
una adecuada centrifugacioacuten del caldo de cultivo a un pH de 5 En lo referente
a los requerimientos de alcohol es conocido que un 75-80 del mismo es
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 32
requerido para la precipitacioacuten del γ-PGA presente en un caldo libre de ceacutelulas
a una concentracioacuten de 1-2 Dado que la cantidad de alcohol requerida
disminuye a medida que la concentracioacuten de γ-PGA aumenta es necesaria y
ventajoso sino la concentracioacuten del γ-PGA presente en el medio de cultivo libre
de ceacutelulas a lo largo del proceso de recuperacioacuten Asiacute es posible reducir en un
25 el alcohol requerido para precipitar una solucioacuten de γ-PGA que fue
concentrada de 20 gL a 60 gL mediante ultrafiltracioacuten a un pH de 5
Asiacute mismo y dada la naturaleza anioacutenica del γ-PGA es posible que el
empleo de la cromatografiacutea de intercambio ioacutenica constituya una herramienta
importante para la purificacioacuten de este poliacutemero
426 Control del peso molecular y degradacioacuten del γshyPGA
El peso molecular es una caracteriacutestica importante del γ-PGA microbiano
debido al efecto que tiene el tamantildeo molecular en las propiedades del
poliacutemero El γ-PGA producido por bacterias del geacutenero Bacillus por lo general
presenta un relativamente alto peso molecular Un poliacutemero de alto peso
molecular es uacutetil como agente espesante pero no es uacutetil para otros usos
debido a la alta viscosidad que lo vuelve difiacutecil de modificar quiacutemicamente
mediante la adicioacuten de alguacuten reactivo quiacutemico De acuerdo con el uso que se
pretenda dar es necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso
molecular por ejemplo en lo referente al empleo del γ-PGA en sistemas de
liberacioacuten de faacutermacos o en el disentildeo de faacutermacos polimeacutericos resulta
necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso para controlar el nivel de
liberacioacuten en los distintos tejidos (Shih et al 2001) Es evidente entonces que el
control del peso molecular del γ-PGA no es solamente un asunto de
importancia fundamental o teoacuterica sino de importancia praacutectica para el
desarrollo de aplicaciones comerciales para este poliacutemero Entre los meacutetodos
que se han empleado para la obtencioacuten de γ-PGA con diferentes pesos
moleculares encontramos la hidroacutelisis alcalina la degradacioacuten ultrasoacutenica la
degradacioacuten microbiana o enzimaacutetica y la alteracioacuten de la composicioacuten del
medio de cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 33
En otro estudio Birrer y colaboradores (1994) encontraron que la
variacioacuten de la fuerza ioacutenica del medio de cultivo mediante la adicioacuten de un 4
(pv) de NaCl conllevaba a la formacioacuten de un γ-PGA de un peso molecular
relativamente mayor
A la fecha existen pocos estudios sobre la biodegradacioacuten microbiana o
enzimaacutetica del γ-PGA a moleacuteculas de menor peso molecular sin embargo es
importante sentildealar que en la mayoriacutea de estudios sobre siacutentesis de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a se sugiera la posible existencia de una
enzima ldquodespolimerasardquo responsable de la descomposicioacuten del γ-PGA Lo que
inicialmente se observaba como una reduccioacuten en la viscosidad del medio de
cultivo con el tiempo o bajo ciertas condiciones demostroacute ser una enzima
poliglutamil-γ -hidrolasa responsable de la ruptura hidroliacutetica del γ-PGA en esta
cepa de Bacillus (King et al 2000) Curiosamente la enzima mostroacute ser
activada por la presencia de iones Zn2+ y Ca2+ y tener una alta afinidad por el γ-
PGA
427 Aplicaciones del γshyPGA
Dada la naturaleza del γ-PGA al ser un poliacutemero no toacutexico
biodegradable y cuya produccioacuten puede ser no tan costosa se han sugerido
gran cantidad de aplicaciones durante la uacuteltima deacutecada El γ-PGA de alto peso
molecular es decir mayor a 106 Da es el preferible en gran parte de las
aplicaciones aunque si bien existen otra serie de aplicaciones que se
presentaran a continuacioacuten y que podriacutean demandar diferentes caracteriacutesticas
Es importante destacar eso siacute que salvo las aplicaciones meacutedicas el resto
considera como indiferente la proporcioacuten de aacutecido D-glutaacutemico y de aacutecido L-
glutaacutemico presente en el γ-PGA
Alimentos
Existe una amplia gama de aplicaciones para el γ-PGA en la industria de
alimentos y sus derivados En jugos y otras bebidas el γ-PGA colabora en el
mejoramiento del sabor y su potabilidad Otra aplicacioacuten importante existe en
alimentos soacutelidos a base de harina de trigo como por ejemplo pan pasteles o
pasta donde la adicioacuten de γ-PGA ha demostrado retrasar el envejecimiento y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 34
mejorar la textura asiacute como permitir una mayor conservacioacuten de la forma Para
estas aplicaciones el γ-PGA recomendable es el de alto peso molecular
Asiacute mismo el γ-PGA ha demostrado poseer propiedades
anticongelantes propiedad que se ve incrementada conforme el tamantildeo del
poliacutemero se reduce Esto permitiriacutea emplear el γ-PGA en la conservacioacuten de
alimentos microorganismos y enzimas Debido a que las sales de este
poliacutemero tienen poco sabor por siacute mismas pueden ser empleadas en mayores
concentraciones en comparacioacuten con otros agentes anticongelantes tales como
la glucosa Aunque esta aplicacioacuten es dependiente del tipo de sal del poliacutemero
empleada es independiente de la proporcioacuten de aacutecido L- y D-glutaacutemico
presente en el poliacutemero Asiacute mismo la adicioacuten de γ-PGA en productos
alimenticios que contengan sustancias activas bioloacutegicamente como por
ejemplo carotenoides vitaminas o polifenoles incrementa la absorcioacuten de
dichas sustancias en el intestino delgado
Fertilizante
Es posible producir grandes cantidades de biomasa y γ-PGA a partir de
medios liacutequidos con estieacutercol glicerol aacutecido ciacutetrico y otras sales inorgaacutenicas
resultando un producto que funciona como un fertilizante de liberacioacuten lenta
cuando es aplicado en los campos de cultivo Dado que el γ-PGA es
particularmente inerte a la gran mayoriacutea de las proteasas la liberacioacuten de
nitroacutegeno puede verse reducida auacuten maacutes Inclusive es posible producir dicho
fertilizante mediante fermentacioacuten en fase soacutelida lo que podriacutea resultar auacuten
maacutes ventajoso en ciertos casos pues permite utilizar como co-sustrato de
fermentacioacuten productos agriacutecolas tales salvado de trigo soya o maiacutez Es
importante sentildealar que para dicha aplicacioacuten la proporcioacuten de aacutecido L- y D-
glutaacutemico presente en el poliacutemero es indiferente
Tratamiento de aguas residuales
Debido a la actividad de floculacioacuten que este poliacutemero presenta el
empleo del γ-PGA en el tratamiento de aguas residuales ha sido investigado en
muacuteltiples estudios demostrando una gran capacidad de absorcioacuten y afinidad
por el Cu2+ Adicionalmente se ha demostrado el requerimiento de iones
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 35
multivalentes tales como el Ca2+ Fe3+ y Al3+ para mejorar su actividad
floculante bajo ciertas condiciones
Asiacute mismo tambieacuten se ha empleado el γ-PGA entrecruzado mediante
radiacioacuten γ el cual ha demostrado ser eficiente en la clarificacioacuten de agua
tuacuterbida a concentraciones tan bajas como 1 mgkg
Bioplaacutesticos
La posibilidad de emplear eacutesteres de γ-PGA como plaacutestico
biodegradable tambieacuten constituye otra aplicacioacuten interesante de este poliacutemero
a pesar de que por el momento su costo es todaviacutea muy elevado como para
asegurar el eacutexito comercial Mediante la modificacioacuten de los grupos eacutester es
posible disentildear un plaacutestico que cumpla los requisitos de muacuteltiples propoacutesitos
asiacute mismo los eacutesteres de γ-PGA han demostrado ser maacutes estables a altas
temperaturas que sus respectivas sales de sodio
Hidrogeles
La formacioacuten de hidrogeles por parte de γ-PGA con o sin la adicioacuten de
poliacutemeros adicionales da origen a una amplia gama de novedosas
aplicaciones ya que las propiedades fiacutesicas del gel pueden ser controladas
para cumplir una amplia variedad de necesidades
Mediante irradiacioacuten γ de 19 kGy es posible generar un hidrogel a base
de γ-PGA con un contenido especiacutefico de agua de 3500 Esto constituye un
meacutetodo conveniente y sencillo para gelificar el γ-PGA sin necesidad de
poliacutemeros o entrecruzadores
Los hidrogeles pueden ser empleados en muacuteltiples aplicaciones como en
la liberacioacuten controlada de faacutermacos el disentildeo de biosensores operaciones de
diagnoacutestico e inclusive hasta bioseparadores pueden ser obtenidos a partir de
γ-PGA y PEG-metacrilato Los hidrogeles obtenidos de esta forma poseen la
cineacutetica de liberacioacuten deseada para partiacuteculas de distinto tamantildeo tales como
pequentildeos peacuteptidos proteiacutenas o inclusive ceacutelulas completas (Bajaj amp Singhal
2011)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 36
Una manera sencilla de obtener hidrogeles de γ-PGA es a traveacutes de la
adicioacuten de peroacutexido como entrecruzador al caldo de fermentacioacuten crudo dicho
hidrogel puede emplearse como absorbente de agua en muacuteltiples aplicaciones
que incluyen agricultura horticultura y construccioacuten civil
De igual manera tambieacuten se ha demostrado que los hidrogeles pueden
ser empelados para la liberacioacuten lenta y controlada de faacutermacos en particular
aquellos formados por α-L-PGA y PEG-metacrilato Hidrogeles formados por un
72 deγ-PGA sulfonado y el resto en γ-PGA han demostrado resultados
promisorios en la liberacioacuten controlada de faacutermacos con una liberacioacuten
praacutecticamente nula a un pH de 74 sin embargo a un pH menor a 65 como el
observado en los tejidos inflamados la liberacioacuten del faacutermaco incrementaba
considerablemente
Transportador de faacutermacos
Dado a su biodegradabilidad y biocompatibilidad el γ-PGA constituye un
biopoliacutemero de particular intereacutes en el desarrollo de faacutermacos de liberacioacuten
controlada tal y como se ha sentildealado previamente Dada la presencia de
grupos carboxilo en las cadenas laterales del poliacutemero que pueden
interaccionar con los grupos funcionales presentes en otros agentes
quimioterapeacuteuticos el γ-PGA permite obtener faacutermacos maacutes solubles y faacuteciles
de administrar Inclusive el conjugado faacutermaco-γ-PGA puede ingresar a las
ceacutelulas diana e irse degradando lentamente mientras libera el agente
farmacoloacutegico y a la vez el aacutecido glutaacutemico producido durante su degradacioacuten
puede ingresar directamente al metabolismo celular o ser excretado a traveacutes
del rintildeoacuten (Bajaj amp Singhal 2011)
Uno de los conjugados maacutes prometedores y estudiados hasta el
momento ha sido con el agente anticanceriacutegeno Paclitaxel Dichos conjugados
Paclitaxel-γ-PGA han demostrado presentar un perfil farmacocineacutetico distinto
capaz de proveer una alternativa hidrosoluble a las formulaciones habituales de
este faacutermaco Tambieacuten estos conjugados han mostrado una respuesta
antitumoral marcadamente superior en comparacioacuten con el Paclitaxel soacutelo
tanto en tejidos murinos como humanos Asiacute mismo estos conjugados han
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 37
mostrado reducir la TCD50 (dosis letal media contra ceacutelulas canceriacutegenas) de
una sola irradiacioacuten de 539 Gy a 75 Gy sin afectar la respuesta radioloacutegica de
los tejidos normales sanos
Adhesivos bioloacutegicos
Los adhesivos bioloacutegicos son empleados para la adhesioacuten de tejidos
homeostasis y para el sellado de fugas de liacutequidos o aire en los tejidos durante
una cirugiacutea En la actualidad el adhesivo de mayor uso es la fibrina la cual
presenta un pobre adhesioacuten a los tejidos Un poliacutemero formado por el
entrecruzamiento del γ-PGA y gelatina ha demostrado un gran potencial para
ser empleado como adhesivo quiruacutergico y agente homeostaacutetico conservando la
capacidad de ser degradado lentamente por el cuerpo sin causar respuestas
inflamatorias severas y a la vez solidificando tan raacutepido como la fibrina pero con
una mayor adherencia a los tejidos Similares hallazgos se han obtenido con
poliacutemeros formados del entrecruzamiento de γ-PGA y colaacutegeno porcino (Bajaj
amp Singhal 2011)
Cosmeacuteticos
El γ-PGA puede ser empleado como componente de valor agregado en
la elaboracioacuten de cosmeacuteticos y productos para el cuidado personal tales como
humectantes exfoliantes y antiarrugas Dada sus propiedades quiacutemicas el γ-
PGA es homogeacuteneamente miscible asiacute como quiacutemicamente estable en la gran
mayoriacutea de los ingredientes tiacutepicamente empleados para la elaboracioacuten de
cremas faciales Asiacute mismo ciertas calidades de γ-PGA son capaces de
producir peliacuteculas suaves elaacutesticas humectantes y suaves sobre la piel Dado
que se trata de un humectante natural hidrofiacutelico formidable el γ-PGA ha
demostrado en combinacioacuten con extractos de Aloe vera promover la produccioacuten
natural de factores humectantes tales como aacutecido pirrolidona-carboxiacutelico aacutecido
laacutectico y aacutecido urocaacutenico A nivel microscoacutepico esto se explica por el hecho de
que los hidrogeles de γ-PGA son capaces de absorber hasta 5000 veces su
propio peso en humedad lo que permitiriacutea incrementar de gran manera las
propiedades humectantes de muchos productos cosmetoloacutegicos con la adicioacuten
de γ-PGA algunos electrolitos y el ajuste a un pH adecuado
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 38
Adyuvante en vacunas
El γ-PGA ha demostrado que es capaz de generar una mejor respuesta
inmune contra otros antiacutegenos presentes en una vacuna El γ-PGA de alto peso
molecular ha demostrado estimular la respuesta inmune contra antiacutegenos
virales en conejos y ratones
43 Disentildeo de procesos biotecnoloacutegicos y la transferencia de materia gasshyliquido
Cuando un microorganismo ha sido identificado como productor de un
compuesto de intereacutes existen una serie de consideraciones que deben ser
valoradas previamente antes de que un proceso productivo econoacutemicamente
viable pueda ser llevado a la praacutectica a escala industrial En aquellas
organizaciones e industrias con una soacutelida experiencia en el disentildeo y
escalamiento de procesos fermentativos los nuevos procesos son
incorporados de manera relativamente raacutepida
El desarrollo de un nuevo proceso fermentativo puede ser a groso modo
dividido en cuatro fases
La primera consiste en identificar el producto su potencial valor de
mercado su precio de venta asiacute como la vida uacutetil del mismo
La siguiente fase es seleccionar o disentildear la cepa que seraacute utilizada en
el proceso productivo y por consiguiente disentildear el proceso como tal Esto
involucra una adecuada seleccioacuten del medio de cultivo oacuteptimo y de las
condiciones idoacuteneas de proceso En este sentido la produccioacuten de γ-PGA a
partir de Bacillus licheniformis ATCC9945a ha sido fuertemente investigada en
torno a las condiciones ideales para su produccioacuten sin embargo algunos
reportes y resultados resultan ser incompletos contradictorios o discutibles Sin
embargo lo que si resulta comuacuten en todas las investigaciones en particular en
aquellas donde se han empleado voluacutemenes mayores de produccioacuten como por
ejemplo de 05 a 10 L es que la produccioacuten del γ-PGA se detiene al reducirse
la concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo problema que ha sido
abordado incrementando el caudal de oxiacutegeno yo incrementando la velocidad
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 39
de agitacioacuten sin que se reporten resultados consistentes o claros La
acumulacioacuten del γ-PGA a lo largo de la fermentacioacuten parece reducir
draacutesticamente la tasa de transferencia de oxiacutegeno lo que termina generando
condiciones anaeroacutebicas en tiempos tan cortos como 20 horas con
concentraciones de oxiacutegeno inferiores a 1 mgL
431 La transferencia de materia gasshyliacutequido
Un requisito primordial para la ocurrencia de una reaccioacuten quiacutemica
cualquiera es que los reactantes esteacuten presentes en el sitio de reaccioacuten En los
sistemas multifase los procesos de transporte son generalmente maacutes lentos
que las tasas maacuteximas de reaccioacuten intriacutenseca Este fenoacutemeno da como
resultado que las tasas de reaccioacuten reales sean menores que las que se
podriacutean esperar por efecto de la cineacutetica de reaccioacuten uacutenicamente
Los fundamentos fiacutesicos principales que determinan la transferencia de
materia son los mismos que aplican para la transferencia de calor y de
momento es decir conveccioacuten y difusioacuten
En los sistemas bioloacutegicos multifase como las fermentaciones en medio
sumergido la transferencia de masa ocurre entre dos fases una gaseosa y
otra liacutequida La mayor parte de los procesos fermentativos a gran escala con
excepcioacuten tal vez uacutenicamente de la produccioacuten de etanol y aacutecido laacutectico son
aeroacutebicos y tiacutepicamente son llevados a cabo en biorreactores aireados gas-
liacutequido En estos procesos aeroacutebicos como sucede con la produccioacuten de γ-
PGA por parte de Bacillus licheniformis ATCC9945a la transferencia de
oxiacutegeno desde la fase gaseosa a la fase liacutequida resulta vital para el eacutexito de
dicho bioproceso
En los bioprocesos aeroacutebicos el oxiacutegeno es un sustrato clave y debido
a su baja solubilidad en caldos y medios de cultivo resulta necesario su
continuo suministro La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deber ser
conocida e inclusive predicha con el propoacutesito de llevar a cabo un adecuado
disentildeo operacional del proceso y un correcto escalado de los biorreactores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 40
432 La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR)
El transporte de oxiacutegeno gas-liacutequido en los bioprocesos aeroacutebicos es el
principal proceso gas-liacutequido a considerar a la hora de disentildear un bioproceso
La solubilidad del oxiacutegeno en un medio liacutequido es baja la concentracioacuten de
saturacioacuten de oxiacutegeno es de cerca de 7-8 mgL en un proceso tiacutepico en
aireacioacuten por lo cual una transferencia de oxiacutegeno continua de la fase gaseosa
a la liacutequida es esencial para conservar un metabolismo celular completamente
oxidativo Por ejemplo unos pocos minutos sin aireacioacuten pueden impactar
severamente en la habilidad de Penicillium chrysogenum para producir
penicilina mientras que en organismos aeroacutebicos facultativos esto puede
generar cambios draacutesticos en el rendimiento y el tipo de producto generado en
condiciones de carencia de oxiacutegeno
La transferencia de oxiacutegeno desde una fase gaseosa hasta el interior de
una ceacutelula ocurre siguiendo una serie de pasos secuenciales que son
1) Difusioacuten del O2 desde la fase gaseoso a la interfase gas-liacutequido
2) Transporte a traveacutes de la interfase gas-liacutequido
3) Difusioacuten del O2 a traveacutes de una regioacuten relativamente inactiva del liacutequido
adyacente a la burbuja es decir de la interfase gas-liacutequido a la de
mezclado del liacutequido
4) Transporte del oxiacutegeno disuelto a la ceacutelula los conglomerados celulares
o al pellet de ceacutelulas inmovilizadas
5) Difusioacuten a traveacutes de la peliacutecula inactiva hasta la superficie de la ceacutelula
dentro de los conglomerados celulares o al interior del pellet de ceacutelulas
inmovilizadas
6) Transporte a traveacutes de la membrana celular
7) Transporte del O2 en el interior celular hacia el sitio de demanda
433 Descripcioacuten de la transferencia maacutesica con kLa
La tasa volumeacutetrica de transferencia de materia de un compuesto A (qtA)
en este caso oxiacutegeno (O2) puede ser descrita cuantitativamente como el
producto de un coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (kLa) y una
fuerza impulsora que consiste en la diferencia entre la concentracioacuten de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 41
saturacioacuten del compuesto (cA) y la concentracioacuten actual del compuesto en la
fase liacutequida (cA)
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (unidad s-1) el kLa
es normalmente referido como un coeficiente uacutenico pero en realidad consiste
de dos partes el coeficiente de transferencia de materia propiamente dicho (kL)
que estaacute vinculado con el flujo maacutesico (tasa de transferencia por unidad de
aacuterea) y el aacuterea de la superficie especiacutefica (a) que es el aacuterea de transferencia
por unidad de volumen
La tasa de transferencia de oxiacutegeno (referida como velocidad de
transferencia de oxiacutegeno en algunos casos) el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de materia (kLa) y la concentracioacuten de oxiacutegeno estaacuten
relacionados por la ecuacioacuten
NAa = OTR = kLa(cA- cA) (gm3s)
Noacutetese en la ecuacioacuten que para que la transferencia sea mayor interesa
tener una kLa alta pero ademaacutes (cA-cA) debe tener un valor elevado lo que
podriacutea llevar a plantear que cA sea lo menor posible Sin embargo se requiere
de una concentracioacuten miacutenima de oxiacutegeno para mantener una fermentacioacuten
aerobia Con respecto a dicha ecuacioacuten es importante sentildealar que
1) La concentracioacuten en fase liacutequida cA corresponde a la cantidad de
oxiacutegeno que hay en la fase acuosa y se determina mediante un
electrodo de oxiacutegeno disuelto Si al sistema se introduce aire a presioacuten
atmosfeacuterica dicho valor estaraacute entre los 0-10 mgL
2) La concentracioacuten de saturacioacuten cA corresponde a la solubilidad de
oxiacutegeno y es dependiente de la concentracioacuten de oxiacutegeno en la fase
gaseosa es decir de la presioacuten parcial de oxiacutegeno Una vez conocida la
presioacuten parcial de oxiacutegeno es posible calcular el valor de la solubilidad
mediante la ley de Henry En agua una forma de esta ecuacioacuten seriacutea
pAGcA = He
Donde He es la constante de Henry y cuyo valor (aproximadamente
entre 15-30 atm m3kg) es funcioacuten de la temperatura A partir de esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 42
ecuacioacuten es posible despejar el valor de cA = pAGHe El valor de He
cambia con la temperatura por ejemplo en agua pura a 25 ordmC para el
oxiacutegeno es de 2396 x 106 Pamiddotm3middotkg-1 El valor de cA es modificable si
se manipula
a) Presioacuten podemos aumentar la concentracioacuten de saturacioacuten si
aumentamos la presioacuten parcial de oxiacutegeno por ejemplo si
pasamos de 021 atm a 1 atm introduciendo al reactor oxiacutegeno
puro en vez de aire a presioacuten atmosfeacuterica lo que da por
resultado un aumento en alrededor de cinco veces su valor
Es posible tambieacuten alcanzar un mayor aumento de la
concentracioacuten de saturacioacuten si aumentamos la presioacuten
absoluta no obstante si hacemos fermentaciones con
oxiacutegeno a presioacuten resulta necesario disponer de un
fermentador capaz de resistir tales condiciones de presioacuten
resulta evidentemente maacutes costoso y tambieacuten pueden ocurrir
cambios importantes en el metabolismo de los
microorganismos que puedan afectar su crecimiento o su
rendimiento en producto
b) Temperatura la solubilidad del oxiacutegeno en agua disminuye al
aumentar la temperatura
c) Composicioacuten del liacutequido si en lugar de agua pura se tiene una
disolucioacuten como sucede con la mayoriacutea de los medios que
tiene una composicioacuten salina importante la solubilidad debe
corregirse pues dichos componentes afectan su valor y dicho
efecto estaacute influenciado tanto por los iones presentes como
por los componentes orgaacutenicos
44 Fermentaciones a presioacuten
La gran mayoriacutea de los estudios sobre fermentaciones son generalmente
llevados a cabo bajo condiciones de presioacuten ambiental maacutes allaacute del hecho de
que el fermentador por lo general suele encontrarse positivamente presurizado
Son pocos los ejemplos a excepcioacuten de la cerveza y algunos vinos donde las
fermentaciones son llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten positiva en el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 43
fermentador Esta leve presurizacioacuten suele deberse al proceso de aireacioacuten del
biorreactor debido a la formacioacuten de una presioacuten de vuelta debido a las
restricciones del respiradero de escape del fermentador
La presioacuten positiva en muchos casos puede resultar beneficiosa para los
procesos de fermentacioacuten no soacutelo por el hecho de incrementar la solubilidad del
oxiacutegeno en el caldo de cultivo sino tambieacuten porque reduce las oportunidades
de contaminacioacuten externa durante el proceso de fermentacioacuten Igualmente la
presioacuten puede tener efectos nocivos sobre los procesos fermentativos La
presioacuten tiene el efecto de influenciar las velocidades y la direccioacuten del
metabolismo de los microorganismos Esto es particularmente evidente en el
caso de productos o subproductos volaacutetiles que forman parte de distintas rutas
metaboacutelicas La presioacuten en el fermentador puede evitar la produccioacuten o
expulsioacuten de un producto gaseoso al medio circundante Este fenoacutemeno puede
tener el efecto de interferir con el equilibrio de varias reacciones bioquiacutemicas y
puede resultar en toxicidad al interior de la ceacutelula o en la divergencia de rutas
metaboacutelicas Lo significante de este impacto dependeraacute de la duracioacuten del
proceso asiacute como de la magnitud de la presioacuten a la cual se realice la
fermentacioacuten
De igual manera el efecto de la presioacuten sobre las macromoleacuteculas
guarda una gran semejanza con los efectos de la temperatura lo cual se
desprende del parecido de la forma de los diagramas de estabilidad de las
proteiacutenas y viabilidad de los microorganismos entre ambas variables
temperatura y presioacuten observacioacuten que tambieacuten permite concluir que las
proteiacutenas constituyen los primeros elementos estructurales en ser afectados
de manera negativa por el incremento de la presioacuten La presioacuten parece afectar
en mayor medida las interacciones proteiacutena-proteiacutena en comparacioacuten con la
estabilidad proteica por siacute misma por lo que es vaacutelido concluir que son estas
interacciones las primeras en verse afectadas por dicha variable La
conservacioacuten de la viabilidad en los microorganismos al ser sometidos a
presioacuten dependeraacute en gran medida de su capacidad para conservar una
membrana celular funcional aunque los mecanismos que emplean para tal fin
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 44
auacuten son desconocidos dada la vital importancia de las interacciones proteiacutena-
proteiacutena en las funciones de membrana
Lo maacutes importante es conocer con detalle como efectivamente la presioacuten
ejercida afecta el proceso de fermentacioacuten en particular la bioquiacutemica y la
fisiologiacutea del mismo de igual manera si es posible controlar la direccioacuten de la
fermentacioacuten manipulando la presioacuten o si la presioacuten estaacute generando el
desarrollo de reacciones secundarias indeseadas las respuestas a dichas
interrogantes soacutelo pueden ser dilucidadas mediante la experimentacioacuten praacutectica
del proceso fermentativo en estudio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 45
7 MATERIALES Y METODOLOGIacuteA
51 Informacioacuten de la cepa empleada
Se empleoacute la cepa Bacillus licheniformis ATCC9945a la cual se
encontraba conservada en estado vegetativo y bajo refrigeracioacuten en el
Laboratorio de Biopoliacutemeros del ETSEIB UPC Cataluntildea Con el propoacutesito de
seleccionar colonias altamente mucosas capaces de producir γ-PGA se
procedioacute a rallar la biomasa conservada en placas con Agar LB (pH 75) e
incubarlas por 24 horas a 37 ordmC Las colonias que mostraron una morfologiacutea
mucosa indicadora de la produccioacuten de γ-PGA fueron utilizadas para elaborar
los inoacuteculos empleados en las distintas fermentaciones
52 Medio de cultivo empleado
El medio de cultivo empleado para la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a fue el medio de cultivo E (Leonard et al 1958) con
algunas modificaciones seguacuten recomendado por Birrer y colaboradores (1994)
El detalle de la formulacioacuten se presenta en la tabla 5
Tabla 5 Formulacioacuten del medio de cultivo E empleado en el cultivo SmF de Bacillus
licheniformis ATCC9945a
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO43H2O 043 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 015 CaCl2 011 Glicerol 80 pH 75 Esterilizacioacuten por filtracioacuten (045 μm) Volumen 1 L
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 46
El medio de cultivo fue esterilizado por filtracioacuten (045 μm) y conservado
en refrigeracioacuten a 7 ordmC
53 Preparacioacuten de los inoacuteculos madre
Las colonias seleccionadas fueron inoculadas en matraces de 125 mL
con 25 mL de medio de cultivo E y cultivadas a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica
con varilla imantada a 650 rpm por 12 horas El caldo resultante fue
centrifugado a 8000 rpm por 25 minutos la biomasa recuperada fue
resuspendida en 10 mL de medio de cultivo E y 10 mL de una solucioacuten de
glicerol al 20 Dicha solucioacuten fue distribuida en voluacutemenes de 1 mL en tubos
eppendorf y congeladas a -80 ordmC
Posteriormente uno de estos tubos eppendorf fue empleado para
inocular matraces de 500 mL conteniendo 125 mL de medio de cultivo y fueron
cultivados a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica con varilla imantada a 650 rpm por
14 horas El caldo resultante fue centrifugado nuevamente a 8000 rpm por 25
minutos se recuperoacute la biomasa precipitada y se resuspendioacute en 25 mL de
medio de cultivo E y 25 mL de una solucioacuten de glicerol al 20 Dicha solucioacuten
fue distribuida en voluacutemenes de 2 mL en tubos eppendorf y posteriormente
fueron congelados a -80 ordmC Cada uno de estos eppendorf constituiacutea un inoacuteculo
de origen para una fermentacioacuten individual La absorbancia promedio de estos
inoacuteculos se encontraba cercana a 25
531 Conservacioacuten de la cepa en estado productivo
Los inoacuteculos deben conservarse en todo momento bajo congelacioacuten a
una temperatura inferior a -15 ordmC siendo preferible conservarlos a -80 ordmC La
condicioacuten de produccioacuten de γ-PGA es extremadamente fraacutegil y cambios de
temperatura o descongelamiento pueden conllevar la peacuterdida de dicha
capacidad La reutilizacioacuten de biomasa residual de fermentaciones previas
queda descartada
54 Montaje del biorreactor a presioacuten
En la actualidad los principales fabricantes de biorreactores para la
industria biotecnoloacutegica carecen de equipos de fermentacioacuten a escala
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 47
laboratorio que puedan operar bajo condiciones de presioacuten superiores a los 01
bares relativos Por este motivo se debioacute modificar un reactor quiacutemico a
presioacuten de modo tal que pudiese cumplir los requisitos necesarios para el
cultivo de microorganismos El modelo empleado fue el reactor quiacutemico a
presioacuten modelo 6425-214 de la casa AceGlass (Estados Unidos) de un
volumen total de 2 L Este reactor tiene la capacidad de operar hasta 35 psig
(241 bares relativos) a una temperatura de 100 ordmC y a una agitacioacuten de 300
rpm El mismo seguacuten su disentildeo original se presenta en la figura 6
Figura 6 Reactor quiacutemico a presioacuten modelo 6425-214 de AceGlass Co
Las dimensiones del frasco del reactor de forma ciliacutendrica y fondo
redondeado son las siguientes
Diaacutemetro de boca 95 mm
Diaacutemetro maacuteximo 120 mm
Profundidad 180 mm
Con el propoacutesito de adecuarlo al cultivo de microorganismos el reactor
fue ligeramente modificado en algunos de sus componentes y su distribucioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 48
Entre los principales cambios realizados al sistema se encuentran los
siguientes
1) Incorporacioacuten de una turbina de disco tipo Rushton al tratarse de una
fermentacioacuten aeroacutebica es necesario garantizar una adecuada aireacioacuten
del medio de cultivo mediante agitacioacuten efectiva La paleta de agitacioacuten
original del sistema no cumpliacutea con dicho requisito por lo cual se cambioacute
la misma por una turbina tipo Rushton cuyas dimensiones se muestran
en la figura 7
Dimensiones
A = 75 mm
B = 18 mm
C = 1mm
D = 20 mm
Figura 7 Dimensiones de la turbina tipo Rushton empleada
Esta turbina se encuentra en posicioacuten central a 3 cm del fondo del
reactor y a 6 mm de los deflectores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 49
2) Incorporacioacuten de deflectores se incorporaron dos laacuteminas deflectoras de
disentildeo propio de1 mm de ancho en una posicioacuten de 90 grados con
respecto a la superficie del reactor con el propoacutesito de reducir la
formacioacuten de voacutertice promover una agitacioacuten turbulenta y una mayor
formacioacuten de burbujas La geometriacutea de las laacuteminas deflectoras se
detalla en la Figura 8
Dimensiones
Ancho de laacutemina = 10 mm
Diaacutemetro = 95 mm
Longitud de laacutemina = 200 mm
Figura 8 Geometriacutea de las laacuteminas deflectoras
3) Cambio del motor de agitacioacuten se incorporoacute un motor IKA RW20 con
capacidad de hasta 2000 rpm en sustitucioacuten del motor original con que
A
B
C
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 50
disponiacutea el equipo (el sistema original trae un motor limitado a una
velocidad de agitacioacuten maacutexima de 330 rpm) con el propoacutesito de variar la
agitacioacuten del sistema y observar su efecto sobre el crecimiento y la
produccioacuten de poliacutemero
4) Reubicacioacuten de la vaacutelvula de seguridad de sobrepresioacuten con el
propoacutesito de garantizar una mayor seguridad del equipo maximizar la
vida uacutetil del cilindro de aire comprimido y evitar la sobrepresioacuten que
pueden generar el crecimiento del microorganismo (su metabolismo
puede liberar compuestos gaseosos o volaacutetiles) se trasladoacute la vaacutelvula de
seguridad del equipo de la tuberiacutea de llenado a la tapa del reactor
5) Eliminacioacuten de componentes dado que no resultaban uacutetiles para la
presente investigacioacuten se prescindioacute de instalar en la tapa del equipo el
condensado y el embudo de adicioacuten El disco de ruptura de la tuberiacutea de
llenado fue sustituido por una vaacutelvula de apertura manual con el
propoacutesito de permitir un mejor y maacutes raacutepido ajuste de la presioacuten durante
el establecimiento inicial de las condiciones de fermentacioacuten
55 Condiciones de fermentacioacuten
El detalle de las condiciones de temperatura presioacuten pH y agitacioacuten en
las cuales fueron establecidas las distintas fermentaciones asiacute como la
metodologiacutea de escalamiento empleada se presentan a continuacioacuten
551 Escalamiento
Inicialmente se procediacutea a inocular por duplicado 100 mL de medio de
cultivo con uno de los inoacuteculos madre (2 mL de ceacutelulas de Bacillus licheniformis
ATCC9945a conservados en tubos eppendorf a -20 ordmC) en matraces con
deflectores de 500 mL de capacidad A dichos matraces se les incorporaba una
pastilla de agitacioacuten magneacutetica de 25 cm de longitud y 07 cm de diaacutemetro y
eran colocados en agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm (agitador IKA C-MAG HS7)
por 8 horas a una temperatura aproximada de 30 ordmC
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 51
Posteriormente uno de los matraces (100 mL de cultivo) anteriormente
establecidos era utilizado para inocular 500 mL de medio de cultivo en el
biorreactor a presioacuten manteniendo una temperatura constante de 30 ordmC
aproximadamente Distintas presiones velocidades de agitacioacuten y densidades
oacutepticas del inoacuteculo fueron evaluadas El detalle del disentildeo experimental de
dichas pruebas se presenta a continuacioacuten en la tabla6
Tabla 6 Diferentes condiciones de presioacuten relativa agitacioacuten y absorbancia evaluadas en las
fermentaciones en biorreactor
CONDICIOacuteN
VALORES EVALUADOS
SOBREPRESIOacuteN
Agitacioacuten 300 rpm
Absorbancia del inoacuteculo 120
O bar (0 psig)
052 bar (75 psig)
103 bar (15 psig)
172 bar (25 psig)
241 bar (35 psig)
AGITACIOacuteN
Sobrepresioacuten 103 bar (15 psig)
Absorbancia del inoacuteculo 120
300 rpm
400 rpm
500 rpm
650 rpm
El tiempo de fermentacioacuten para cada uno de los ensayos evaluados fue
de 18 horas tiempo en el que el pH habiacutea descendido a un valor cercano pero
auacuten superior a 6 No se realizoacute ajuste alguno del pH a lo largo de la
fermentacioacuten Posteriormente se procediacutea a centrifugar el caldo de
fermentacioacuten a 8000 rpm por 25 minutos el sobrenadante recuperado era
almacenado para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA presente en
el mismo
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre
Con el propoacutesito de garantizar que el inoacuteculo madre era apto para la
produccioacuten de γ-PGA uno de los matraces inicialmente establecidos era
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 52
conservado bajo agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm y a 30 ordmC durante las 18 horas
que requeriacutea la fermentacioacuten en el biorreactor Posteriormente se determinaba
cualitativamente la produccioacuten de γ-PGA seguacuten la simbologiacutea que se presenta
en la tabla 7
Tabla 7 Simbologiacutea empleada para la medicioacuten cualitativa de la produccioacuten de γ-PGA en los
matraces de control
SIacuteMBOLO OBSERVACIOacuteN CUALITATIVA
- No produccioacuten de γ-PGA
+ Produccioacuten de γ-PGA
+++ Elevada produccioacuten de γ-PGA
56 Determinacioacuten del valor de kLa
Para la determinacioacuten del valor aproximado de kLa tanto en los
matraces coacutemo en el biorreactor se empleoacute el meacutetodo estaacutetico sin operacioacuten
del cultivo celular Dicho valor no fue determinado bajo condiciones de presioacuten
pues se careciacutea con la instrumentacioacuten adecuada sino soacutelo a presioacuten
atmosfeacuterica para ambos casos matraz y biorreactor
Este meacutetodo consiste en disminuir la concentracioacuten de oxiacutegeno hasta
una concentracioacuten de 1-25 mgL despueacutes el sistema es retornado a aireacioacuten
yo agitacioacuten y se mide como va aumentando la concentracioacuten de oxiacutegeno en la
fase liacutequida conforme transcurre el tiempo El objetivo es por tanto disminuir la
concentracioacuten de cA0 lo suficiente como para tener un cambio importante
obteniendo asiacute una curva de ascenso de las concentraciones de oxiacutegeno en el
tiempo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 53
561 Matraces de cultivo
A un matraz de cultivo en reposo conteniendo 100 mL de medio de
cultivo E se le agregoacute 001 g de sulfito de sodio (Na2SO3) y una punta de
espaacutetula de cloruro de cobalto (actuacutea como catalizador) y se agita
manualmente por 20 s Posteriormente se introdujo la sonda de oxiacutegeno
disuelto del medidor Hanna Oxi-check y se dejoacute descender el nivel de oxiacutegeno
disuelto hasta el valor miacutenimo posible entre 20-25 mgL Seguidamente se
activoacute la agitacioacuten magneacutetica y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto cada 10
segundos hasta alcanzar un punto maacuteximo que se repitiese al menos durante
2 minutos
562 Biorreactor
Se procedioacute a llenar el reactor con 600 mL de medio de cultivo y en
estado de reposo se le agregoacute 006 g de sulfito de sodio una punta de espaacutetula
de cloruro de cobalto y se agitoacute suavemente a 100 rpm por 20 segundos
Haciendo uso de la sonda de oxiacutegeno se determinoacute el menor nivel posible de
oxiacutegeno disuelto alrededor de 15-20 mgL Posteriormente se encendioacute la
agitacioacuten mecaacutenica a 300 rpm y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto en
intervalos de 10 segundos hasta alcanzar un valor maacuteximo de oxiacutegeno disuelto
sostenido en el tiempo es decir que se repitiese por al menos un minuto
563 Graficacioacuten
Con el propoacutesito de determinar el valor de kla a partir de la ecuacioacuten de
balance de oxiacutegeno
V(dCAdt) = VkLa(cA-cA)
Se tiene que integrando dicha ecuacioacuten con la concentracioacuten inicial cA0
se obtiene
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 54
Representado ln((cA - cA0)(c
A- cA)) contra el tiempo t se obtiene una
recta cuya pendiente es el valor de kLa
57 Determinacioacuten del contenido de γshyPGA en el caldo de fermentacioacuten
Con el propoacutesito de determinar la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo
post-fermentacioacuten se utilizoacute la teacutecnica analiacutetica llamada cromatografiacutea liacutequida
de alta eficiencia conocida normalmente por sus siglas en ingleacutes HPLC
especiacuteficamente la conocida como cromatografiacutea de permeacioacuten en gel (GPC)
uno de los tipos de cromatografiacutea de exclusioacuten molecular (SEC) maacutes
empleados en la separacioacuten de poliacutemeros
El equipo empleado fue el cromatoacutegrafo modelo 1260 Infinity de Agilent
Technologies La columna de separacioacuten empleada fue una columna PL
aquagel-OH de 8μm para cromatografiacutea GPC en fase acuosa El meacutetodo de
cromatografiacutea empleado consistioacute en eludir 25 μL de la muestra haciendo uso
de una solucioacuten tampoacuten fosfato 005 molL con un tiempo de elucioacuten de 15 min
por muestra El caudal de flujo del eluyente fue de 08 mLmin La deteccioacuten se
llevoacute a cabo a traveacutes de un detector de absorbancia UV-vis de longitud de onda
variable (VWD) a una longitud de onda de 220 nm y tambieacuten un detector de
iacutendice de refraccioacuten (RID) con polaridad positiva y una temperatura de la
unidad oacuteptica de 35 ordmC aunque los resultados reportados y empleados fueron
los obtenidos con el detector VWD El tiempo de retencioacuten de la fraccioacuten
polimeacuterica correspondiente al γ-PGA se encontroacute entre los 65 y los 90
minutos considerando el hecho de que el mismo se trata de una mezcla de
moleacuteculas polimeacutericas de distinta longitud y por ende distinto peso molecular
Para poder cuantificar la cantidad de poliacutemero presente en la muestra se
elaboroacute una curva de calibracioacuten inicial Se prepararon soluciones en agua
destilada de γ-PGA a concentraciones de 10 5 2 1 y 05 gL Las mismas
fueron analizadas mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva para el
pico correspondiente al γ-PGA para cada concentracioacuten Dichos valores fueron
empleados para la elaboracioacuten de la curva de calibracioacuten inicial del equipo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 55
Las muestras a analizar fueron preparadas de la siguiente manera 400
μL del caldo crudo se diluyeron en agua destilada hasta un volumen final de 2
mL (dilucioacuten 5x) y posteriormente fueron filtradas mediante jeringa haciendo
uso de filtros de 045 μm en viales de HPLC Las muestras fueron analizadas
mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva del pico correspondiente al
γ-PGA para cada una de las muestras
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
Con el propoacutesito de determinar el efecto del contenido de γ-PGA sobre la
solubilidad maacutexima de oxiacutegeno en el medio de cultivo en condiciones estaacuteticas
es decir sin crecimiento microbiano (consumo de oxiacutegeno de los
microorganismos nulo) se procedioacute a preparar soluciones de 100 mL de
volumen a concentraciones crecientes de poliacutemero (poliacutemero + biomasa) en
medio de cultivo y medir el nivel de oxiacutegeno disuelto en mgL haciendo uso de
un medidor de oxiacutegeno disuelto Hanna Oxi-check Dichas soluciones fueron
evaluadas en las mismas condiciones de fermentacioacuten empleadas en la
primera etapa de escalamiento matraces de 500 mL con deflectores y a una
agitacioacuten magneacutetica de 650 rpm Se evaluaron concentraciones de biopoliacutemero
de 0 7 14 21 36 54 y 71 gL
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano
Para determinar el crecimiento bacteriano se aprovechoacute el efecto que
dicho crecimiento genera sobre la turbidez del caldo a lo largo de la
fermentacioacuten Por ello se empleoacute la teacutecnica de espectrofotometriacutea
determinando la absorbancia del medio de cultivo inoculado y su incremento
con el tiempo Se empleoacute el coloriacutemetro modelo ZUSI 4200A a una longitud de
onda de 660 nm El equipo era inicialmente calibrado en 0 haciendo uso de
agua destilada acto seguido se determinaba el valor de absorbancia de la
muestra a analizar
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 56
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producido se determinoacute
mediante el meacutetodo desarrollado por Marfey (1984) para la determinacioacuten
cuantitativa de la composicioacuten enantiomeacuterica de aminoaacutecidos Dicho meacutetodo se
basa en la reaccioacuten del aacutecido glutaacutemico con el reactivo de Marfey (1-fluoro-24-
dinitrofenil-5-L-alanina) Dicho compuesto es oacutepticamente activo por lo que al
reaccionar con los enantioacutemeros D- y L- del aacutecido glutaacutemico forma dos
diasteroisoacutemeros que pueden separarse mediante cromatografiacutea HPLC con
tiempos de retencioacuten para el isoacutemero L- y el D- de 675 y 100 minutos
aproximadamente Para poder cuantificar la composicioacuten de manera efectiva
se realizoacute un calibrado previo con mezclas de concentracioacuten conocida de cada
isoacutemero
5101 Preparacioacuten de la muestras
Se introdujo 3 mg del γ-PGA a analizar en viales de 5 mL y se les
adicionoacute 2 mL de HCl 6 molL Se dejaron calentar a 100 ordmC en estufa por un
periacuteodo de 24 horas Posteriormente se trasfirioacute 100 μL de cada una de las
muestras a tubos eppendorf y se dejaron en desecador al vaciacuteo por un periacuteodo
de tres diacuteas empleando NaOH como desecante Seguidamente se disolvioacute los
productos en 100 μL de agua y se hicieron reaccionar con 200 μL de una
disolucioacuten con concentracioacuten de 5 mgmL de reactivo de Marfey en acetona con
20 μL de carbonato aacutecido de sodio (NaHCO3) durante una hora en estufa a 37
ordmC Al finalizar se neutralizoacute como 10 μL de HCl 2 molL y se dejoacute secar al vaciacuteo
por 3 diacuteas en el desecador a vaciacuteo con NaOH como desecante Finalmente se
diluyoacute la muestra en 350 μL de dimetilsulfoacutexido (DMSO) para cromatografiarla
por HPLC
La cromatografiacutea se llevoacute a cabo en el mismo equipo empleado para la
determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA pero con los siguientes cambios
1) Se empleoacute una columna de fase estacionaria reversa Spherisorb ODS2
de 5 μm de poro 25 cm de longitud y 046 cm de diaacutemetro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 57
2) El caudal de flujo del eluyente fue de 15 mLmin
3) El detector de longitud de onda variable (VWD) operaba a 340 nm y el
tiempo de elucioacuten era de 25 minutos
4) El eluyente empleado era una mezcla 8020 de fosfato de trietilamonio
50 mmolL a pH 3 y acetonitrilo El fosfato de trietilamonio se obteniacutea
haciendo reaccionar cantidades equimolares de trietilamina y aacutecido
fosfoacuterico
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual
La composicioacuten porcentual enantiomeacuterica del γ-PGA es decir el
contenido porcentual de aacutecido D- y L-glutaacutemico se determinoacute mediante
contraste de las aacutereas obtenidas en el cromatograma para cada uno de los
picos correspondientes a cada diasteroisoacutemero con el aacuterea total
correspondiente a los productos de reaccioacuten (sumatoria de ambos
diasteroisoacutemeros) La composicioacuten se reportoacute como un porcentaje de aacutecido D-
glutaacutemico y aacutecido L-glutaacutemico presente en la muestra analizada
511 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA Para la determinacioacuten del peso molecular del poliacutemero se procedioacute a
analizar los cromatogramas obtenidos para el caacutelculo de la concentracioacuten de γ-
PGA Se empleoacute el programa informaacutetico ChemStation for LC Systemsreg de
Agilent Technologies Dicho programa posee unas potentes herramientas de
anaacutelisis que permiten automaacuteticamente calcular el peso molecular de un
compuesto Para las muestras analizadas se determinoacute el peso molecular
promedio en nuacutemero (Mn) el peso molecular promedio en peso (Mw) la
polidispersidad y el peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) La recta de
calibrado fue obtenida previamente por Bou y colaboradores con estaacutendares de
polioacutexido de etileno (PEO)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 58
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 59
8 RESULTADOS
61 Montaje del biorreactor a presioacuten
El detalle final del biorreactor empleado puede observarse en la figura 8
Noacutetese que la temperatura es controlada por la accioacuten de una manta teacutermica
externa como sucede con el disentildeo original del reactor y no por el empleo de
un serpentiacuten interno caso de la gran mayoriacutea de biorreactores comerciales a
escala laboratorio El mismo permite operar en condiciones de agitacioacuten de 100
a 650 rpm y a presiones de hasta 24 bar de sobrepresioacuten (35 psig) El
biorreactor resultoacute apto para el crecimiento microbiano alcanzaacutendose valores
de absorbancia de hasta 37 similares a los observados en cultivos en
matraces
Figura 9 Biorreactor empleado para la produccioacuten de γ-PGA bajo presioacuten
62 Competencia del inoacuteculo madre
Mediante la metodologiacutea descrita previamente para la preparacioacuten del
inoacuteculo madre fue posible alcanzar en el 100 de los cultivos de control la
produccioacuten de γ-PGA en alta cantidad Aunque dichos resultados no se
muestran el empleo de inoacuteculos de otra naturaleza como reutilizacioacuten de
biomasa o inoacuteculos conservados a temperaturas superiores a -20 ordmC mostraron
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 60
ser ineficaces y poco reproducibles en cuanto a la produccioacuten de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a Los resultados de los cultivos control
pueden observarse en el graacutefico 10 bajo el nombre de Matraz
63 Determinacioacuten de los valores de kLa
631 Matraz
En lo referente al cultivo en matraz bajo las condiciones de agitacioacuten y
temperatura empleadas y en condiciones estaacuteticas (sin crecimiento
microbiano) se encontroacute un valor de kLa de 0026 s-1 En el graacutefico 1 y 2 se
muestran la curva de concentracioacuten de oxiacutegeno en funcioacuten del tiempo al
reiniciarse el proceso de agitacioacuten asiacute como el caacutelculo de dicho valor de
coeficiente mediante regresioacuten lineal respectivamente
Graacutefico 1 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concentracioacuten m
gL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 61
Graacutefico 2 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00257x ‐ 08809Rsup2 = 09966
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
Cuando se realizoacute la misma determinacioacuten pero a una velocidad de
agitacioacuten menor (430 rpm) el valor de kLa disminuyoacute significativamente En
dicho caso el valor de kLaobtenido fue de 0017 s-1 Estos resultados se
muestran en los graacuteficos 3 y 4
Como se puede observar en dichos graacuteficos el tiempo requerido para
alcanzar el valor maacuteximo estable se incrementoacute considerablemente en 60
segundos lo que indica una menor velocidad de transferencia producto de la
reduccioacuten de la intensidad de la agitacioacuten suministrada al cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 62
Graacutefico 3 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 430 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Graacutefico 4 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00168x ‐ 07551Rsup2 = 09835
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
ln Linear (ln)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 63
632 Biorreactor
Para el caso del biorreactor el valor de kLa determinado fue de 0025 s-1
esto bajo condiciones estaacuteticas (sin crecimiento microbiano) y en las
condiciones de temperatura y operacioacuten previamente descritas
Como se puede observar dicho valor es praacutecticamente igual al obtenido
para el caso del matraz lo que indica condiciones de transferencia de oxiacutegeno
gas-liacutequido muy similares en ambos casos El valor dekLa fue determinado en
un punto lateral del reactor 2 cm por debajo del nivel de medio de cultivo y
contiguo a uno de los deflectores punto donde la transferencia de materia
debiera en principio ser mayor Dichos resultados se presentan en los graacuteficos
5 y 6
Graacutefico 5 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten mecaacutenica del medio de cultivo en biorreactor a 300 rpm
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
560
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Concentracioacuten
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 64
Graacutefico 6 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00246x ‐ 03222Rsup2 = 09902
000
050
100
150
200
250
300
0 20 40 60 80 100 120 140
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
64 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En lo referente a los niveles de oxiacutegeno a distintas concentraciones de γ-
PGA en condiciones estaacuteticas sin crecimiento microbiano se observa una
draacutestica reduccioacuten de dicho nivel conforme se incrementa la concentracioacuten del
biopoliacutemero Dicho fenoacutemeno es esperable dada la alta viscosidad del γ-PGA
La concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo alcanza un valor inicial de
74 mgL el cual se reduce draacutesticamente a 52 mgL a un valor de
concentracioacuten de γ-PGA de 14 gL Esta reduccioacuten es uacutenicamente producto de
la presencia del γ-PGA en el medio de cultivo El graacutefico 7 muestra dicho
fenoacutemeno hasta un valor miacutenimo de oxiacutegeno disuelto de 25 mgL cuando la
concentracioacuten de poliacutemero alcanza un maacuteximo 71 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 65
Graacutefico 7 Efecto de la concentracioacuten de γ-PGA sobre el nivel maacuteximo de oxiacutegeno disuelto en el
medio de cultivo E
y = ‐00569x + 64671Rsup2 = 08709
000
100
200
300
400
500
600
700
800
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Oxiacutegeno disuelto m
gL
γ‐PGA gL
Solubilidad O2 (mgL) Linear (Solubilidad O2 (mgL))
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γshyPGA mediante GPC
La curva de calibracioacuten obtenida a partir de soluciones con
concentracioacuten conocida de γ-PGA se presenta en el graacutefico 8
Como se puede observar se obtuvo un valor del coeficiente de
determinacioacuten R2 de 09983 lo que indica un ajuste lineal suficiente y un valor
del coeficiente de correlacioacuten R de 09991 lo que indica una correlacioacuten
positiva entre los datos contrastados La concentracioacuten de γ-PGA estaacute
determinada entonces por la siguiente ecuacioacuten
Concentracioacuten γ-PGA (gL) = (00027 x Aacuterea) ndash 00916
Esta curva fue posteriormente empleada para determinar la
concentracioacuten de γ-PGA en los caldos de cultivo obtenidos despueacutes de cada
una de las fermentaciones realizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 66
Graacutefico 8 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA mediante
GPC
y = 00027x ‐ 00916Rsup2 = 09983
0
2
4
6
8
10
12
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Concentracioacuten gL
Aacuterea
Series1 Linear (Series1)
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γshyPGA
En lo referente al efecto de la presioacuten (relativa) sobre la productividad en
γ-PGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a se encontroacute un incremento de los
rendimientos fermentativos conforme se incrementaba la presioacuten hasta
alcanzar un valor maacuteximo de sobrepresioacuten de 103 bar (15 psig) una vez
superado dicho umbral la productividad se veiacutea reducida draacutesticamente A 103
bar la productividad en γ-PGA alcanzaba un valor de 1334 gL productividad
mayor a la obtenida en condiciones de aireacioacuten (2 Lmin) a presioacuten
atmosfeacuterica la cual fue de 508 gL Esta productividad maacutexima contrasta con
la obtenida a presioacuten atmosfeacuterica la cual fue miacutenima con un valor de 217 gL
Los graacuteficos 9 y 10 muestran los resultados anteriormente comentados Asiacute
mismo en la tabla 8 se presentan la totalidad de fermentaciones llevadas a
cabo las productividades obtenidas y el promedio de cada condicioacuten Es
importante destacar que cada condicioacuten de presioacuten fue evaluada por duplicado
no encontraacutendose diferencias importantes entre los resultados obtenidos para
ninguno de los casos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 67
Graacutefico 9 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748
617
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 05 1 15 2 25
PGGA (gL)
Presioacuten (bar)
RENDIMIENTO gL
Graacutefico 10 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten y la aireacioacuten a presioacuten atmosfeacuterica (0 relativa)
sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748617 508
4582
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
0 052 103 172 241 0 +Aireacioacuten
Matraz
Concentracioacuten γ‐PGA gL
Presioacuten
RENDIMIENTO gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 68
Tabla 8 Fermentaciones realizadas y concentraciones de γ-PGA obtenidas
Reactor Condiciones A D C (gL)AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10108 5 130
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10926 5 141
AHJC11 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 11753 5 152
AHJC11 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10186 5 131
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 95011 5 122
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 97936 5 126
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28706 3 20
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28194 3 20
AHJC14 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 33184 3 24
AHJC14 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 32866 3 23
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 68396 3 52
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 65871 3 50
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43692 5 54
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 46235 5 57
AHJC16 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 49809 5 62
AHJC16 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 58872 5 74
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 57321 5 72
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43021 5 53
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 57727 5 72
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 62398 5 78
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 60469 5 76
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 58335 5 73
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 6083 5 76
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 57897 5 72
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 51267 5 64
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 48407 5 60
= nuacutemero de muestra A = aacuterea D = dilucioacuten C = concentracioacuten y bar = bar relativo
Algunos de los cromatogramas realizados se muestran en las figuras 10
y 11 Como se puede observar la forma del pico de elucioacuten demuestra que el
biopoliacutemero estaacute compuesto por moleacuteculas de distinta longitud por lo cual
existen diferentes pesos moleculares Es importante destacar que para la gran
mayoriacutea de las fermentaciones realizadas el pico siempre presentoacute su maacutexima
altura al inicio lo que demuestra que la mayor parte de eacutel se trataba de un
poliacutemero de alto peso molecular Igualmente esto podriacutea indicar poca
degradacioacuten del biopoliacutemero durante las 18 horas de fermentacioacuten lo cual es
importante dada la capacidad de Bacillus licheniformis ATCC9945a de
hidrolizar enzimaacuteticamente el γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 69
Figura 10 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA analizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 70
Figura 11 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA (052-103-172 y 241 bar relativas)
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γshyPGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a
En lo referente al efecto de la intensidad de agitacioacuten en rpm sobre la
produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a a una presioacuten de
103 bar relativos (15 psig) se encontroacute un efecto negativo del aumento de la
agitacioacuten por encima de las 300 rpm lo que se demuestra con una importante
reduccioacuten en la concentracioacuten final de γ-PGA obtenida despueacutes de 18 horas de
fermentacioacuten Estos resultados se presentan en el graacutefico 11 Como se puede
observar una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm llega a ser tan perjudicial
para el microorganismo que la productividad en γ-PGA cae por debajo del valor
de 1 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 71
Graacutefico 11 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis
ATCC9945a a 103 bar (15 psig) a 30 ordmC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
300 350 400 450 500 550 600 650 700
Concentracioacuten gL
Agitacioacuten rpm
RENDIMIENTO (gL)
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica resultoacute afectada por las condiciones de
presioacuten Como demuestra el graacutefico 12 la proporcioacuten de aacutecido L-glutaacutemico en
las muestras correspondientes a fermentaciones bajo presioacuten resultoacute ser por
mucho mayor a las observadas en los cultivos control tanto en comparacioacuten
con el de matraz como con el sometido a aireacioacuten
La respectiva curva de calibracioacuten con las muestras conformadas por
mezclas con composicioacuten definida de ambos enantioacutemeros se presente en el
graacutefico 13 Como se puede observar los valores teoacutericos y los valores
experimentales obtenidos en el cromatograma coinciden en buena medida lo
que indica la validez de esta teacutecnica para la determinacioacuten de la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA
En dos casos para las fermentaciones llevada a cabo a 052 bar y 172
bar de sobrepresioacuten (75 y 25 psig respectivamente) la proporcioacuten de aacutecido D-
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 72
glutaacutemico fue de cero en contraste con el control en matraz donde dicha forma
del aacutecido glutaacutemico estaba presente mayoritariamente en un 87
De igual manera en lo que concierne a la fermentacioacuten llevada a cabo a
presioacuten atmosfeacuterica y bajo condiciones de aireacioacuten se observa tambieacuten que el
enantioacutemero mayoritariamente presente es el aacutecido D-glutaacutemico con un 83
en contraste con el aacutecido L-glutaacutemico con apenas un 17 Todas las
fermentaciones llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten presentan un
contenido de aacutecido L-glutaacutemico superior al 83
Aunque no fue posible encontrar una correlacioacuten directa entre la presioacuten
y la composicioacuten porcentual en aacutecido D-glutaacutemico si es posible observar como
las condiciones de presioacuten parecen limitar condicionar o disminuir la presencia
de esta forma del aacutecido glutaacutemico en el γ-PGA
Graacutefico 12 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica en aacutecido
L-glutaacutemico y aacutecido D-glutaacutemica del γ-PGA producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a
R11 (103bar)
R12 (103bar)
R15 (0 +aireacioacuten)
R16 (241bar)
R19 (172bar)
R22 (052bar)
MATRAZ
AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO 9518 8319 1736 10000 8347 10000 1285
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO 482 1681 8264 000 1653 000 8715
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 73
Graacutefico 13 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-
PGA mediante HPLC
000
2900
4700
7700
970010000
7100
5300
2300
300
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
100 L 75 L 25 D 50 L 50 D 25 L 75 D 100 D
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO
69 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA
Los resultados de los pesos moleculares de los poliacutemeros obtenidos en
los distintos ensayos se muestran en la tabla 9 El peso molecular promedio de
permeacioacuten (Mp) de todas las muestras se encontroacute entre los 269-307 x 107
gmol
Tabla 8 Valores de peso molecular promedio en nuacutemero (Mn) peso molecular promedio en
peso (Mw) peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) y polidispersidad (PD) delγ‐PGA
producido en los distintos ensayos evaluados
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
MATRAZ1 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 157 214 29 137
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
MATRAZ2 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 160 216 292 135
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar relativos
207 252 307 122 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 74
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
204 252 307 124 PRIMERO MAYOR
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
202 252 307 125 PRIMERO MAYOR
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
199 251 307 126 PRIMERO MAYOR
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 200 247 307 123
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 226 26 306 115
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 179 223 281 125
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 172 221 264 128
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
217 248 304 114 PRIMERO MAYOR
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
210 246 304 117 PRIMERO MAYOR
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
195 233 284 120 SEGUNDO MAYOR
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
178 225 269 126 SEGUNDO MAYOR
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
223 262 306 118 PRIMERO MAYOR
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
222 261 306 117 PRIMERO PAYOR
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
207 254 307 122 PRIMERO MAYOR
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
187 251 306 134 PRIMERO MAYOR
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
171 246 306 144 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
185 253 306 136 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
202 252 306 125 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 75
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
232 263 306 113 PRIMERO MAYOR
AHJC32-1-18HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
173 228 307 132 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-2-18HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
177 230 306 130 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-1-36HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
165 220 23 133 IGUALES
AHJC32-2-36HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
173 224 302 130 IGUALES
Los valores de polidispersidad estuvieron entre 113 y 144 Asiacute mismo
no se observan mayores diferencias entre los pesos moleculares obtenidos a
distintas presiones aunque la existencia de un segundo pico era maacutes evidente
en los cromatogramas correspondientes a γ-PGA producido en condiciones de
presioacuten relativa 0 Asiacute mismo dichas muestras presentan un peso molecular
levemente menor aunque dicha tendencia no es absoluta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 76
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 77
9 DISCUSIOacuteN
71 Cepa empleada
Bacillus licheniformis ATCC9945a es una cepa que ha sido empleada
con eacutexito en la produccioacuten de γ-PGA particularmente a escala laboratorio maacutes
no ha sido empleada a escala industrial donde otras cepas particularmente de
la especie Bacillus subtilis han sido las preferidas tanto por aspectos de
rendimiento como estabilidad productiva de la cepa El presente estudio
determinoacute una productividad promedio en condiciones de matraz de 4582 gL
despueacutes de 72 horas de cultivo Valores de productividad tan altos no habiacutean
sido reportado previamente para Bacillus licheniformis ATCC9945a donde
valores entre 17 y 23 gL de rendimiento han sido reportados por Troy (1973)
Cromwick y Gross (1996) 26 a 35 gL por Bajaj y colaboradores (2009) y 35
gL por Yoon y colaboradores (2000)
Los motivos de este mayor rendimiento aunque no son claros pueden
deberse a una mejor transferencia de oxiacutegeno en el sistema de agitacioacuten
magneacutetica en comparacioacuten con la agitacioacuten orbital estaacutendar Asiacute por ejemplo y
utilizando la ecuacioacuten simplificada para determinar en valor de kLa en agitacioacuten
orbital (Diacuteaz 2011) tenemos que a 20 ordmC
kLa = 139 x 10-3n (VTVL)084
Asiacute tenemos que para un sistema en agitacioacuten orbital a 250 rpm es decir
a una frecuencia de 417 s-1 con un volumen de medio de cultivo de 100 mL y
un volumen total del matraz 500 mL el valor de kLa es de aproximadamente
0020 s-1 inferior al valor de 0026 s-1 obtenido en el presente estudio para el
cultivo en agitacioacuten magneacutetica a 30 ordmC Dado que la difusividad disminuye al
aumentar la temperatura es de esperar que a 30 ordmC dicho valor de kLa teoacuterico
sea auacuten menor
Es importante sentildealar que en lo referente a la composicioacuten del medio de
cultivo el medio de cultivo E empleado en este estudio es el mismo empleado
previamente por otros autores para el estudio de la produccioacuten de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a por lo cual no se considera que la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 78
composicioacuten del medio de cultivo pueda ser la responsable de las diferencias
con los resultados reportados anteriormente por otros investigadores quienes
en particular tambieacuten emplearon dicho medio de cultivo en sus pruebas
Dicho valor de rendimiento promedio obtenido de 4582 gL (en matraz)
coloca a este cepa al mismo nivel de productividad de las cepas
industrialmente empleadas como sucede con Bacillus subtilis F02-1 con un
rendimiento reportado por Kubota y colaboradores (1993) de 50 gL pero con
una menor necesidad de aacutecido glutaacutemico (20 gL en contra de 80 gL) La
conveniencia del empleo de la cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis debe
entonces evaluarse entorno a su capacidad de escalamiento y conservacioacuten de
la competencia en la produccioacuten de γ-PGA y no entorno a su maacuteximo
rendimiento pues en este aspecto ha demostrado en condiciones oacuteptimas la
capacidad de producir γ-PGA en concentraciones extremadamente elevadas
Los resultados acaacute obtenidos refuerzan lo ya descrito por otros autores quienes
sentildealan precisamente estos aspectos (escalamiento y estabilidad) como los
principales retos para llevar a cabo la produccioacuten de γ-PGA mediante Bacillus
licheniformis ATCC9945a
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente
Uno de los principales problemas que se enfrentoacute a lo largo de la
presente investigacioacuten es la facilidad con la cual la cepa ATCC9945a de
Bacillus licheniformis revierte a formas incapaces de producir γ-PGA Este
fenoacutemeno puede ocurrir incluso con tan soacutelo una generacioacuten de cultivo por lo
cual el empleo de la biomasa generada en una fermentacioacuten previa es
indeseable pues seguramente no daraacute resultados positivos para la produccioacuten
de γ-PGA
Este fenoacutemeno es uno de los principales inconvenientes que se
enfrentan a la hora de evaluar el efecto de diversos paraacutemetros sobre la
productividad de γ-PGA en esta cepa pues la incapacidad de garantizar
resultados reproducibles imposibilita poder evaluar condiciones nutricionales
de agitacioacuten temperatura y demaacutes teniendo la certeza que las diferencias
encontradas solo se deberaacuten a los paraacutemetros bajo control
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 79
Cromwick y colaboradores (1994) reportaron el congelamiento con
nitroacutegeno liacutequido como una forma vaacutelida para la preservacioacuten de las ceacutelulas en
un estado consistente de alta productividad de γ-PGA En nuestro caso la
metodologiacutea empleada fue distinta Se incorporoacute el glicerol como crioprotector y
el congelamiento no se realizoacute mediante nitroacutegeno liacutequido sino que fue
congelamiento convencional utilizando un equipo de refrigeracioacuten con una
capacidad de enfriamiento de hasta -80 ordmC y voluacutemenes de inoacuteculo pequentildeos
de entre 1 y 2 mL cuyo congelamiento fuera particularmente raacutepido
Igualmente se observoacute que los cultivos que mejor comportamiento y
reproducibilidad dieron como inoacuteculo fueron aquellos cuyas ceacutelulas eran
recolectadas previo al inicio de la produccioacuten de γ-PGA Cultivos cuya edad
superaba las 10 horas y que ya presentaban presencia de γ-PGA aunque
podiacutean emplearse para la obtencioacuten de inoacuteculos madres los mismos no
resultaban tan eficientes como los anteriormente descritos
El empleo de esta metodologiacutea de conservacioacuten de la cepa permitioacute una
reproducibilidad del 100 en los ensayos obtenieacutendose poliacutemero en la
totalidad de los cultivos de control que se establecieron durante cada una de
las fermentaciones llevadas a cabo en el biorreactor Estos resultados indican
que dicha metodologiacutea es eficaz para la preservacioacuten a largo plazo de Bacillus
licheniformis ATCC9945a y como estrategia para un adecuado escalamiento
durante el proceso de produccioacuten a mayor escala De igual manera la
descripcioacuten detallada del proceso de conservacioacuten volumen de inoacuteculo
concentracioacuten de la muestra (por absorbancia) temperatura y demaacutes permite
una alta reproducibilidad del meacutetodo en contraposicioacuten con los reportes
existentes por otros autores que no brindaban mayor detalles sobre coacutemo llevar
a cabo este proceso de conservacioacuten
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten
Las fermentaciones a presiones superiores a la presioacuten atmosfeacuterica no
son habituales tanto a nivel de investigacioacuten como a nivel de proceso Dicha
afirmacioacuten queda particularmente ratificada cuando se analizan las opciones
comerciales existentes a escala laboratorio de biorreactores disentildeados para
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 80
operar a presioacuten la cual resulta praacutecticamente nula Por este motivo y para
poder llevar a cabo este estudio se requirioacute adaptar un reactor quiacutemico de
modo tal que permitiese trabajar a presioacuten y a la vez tuviese un control de
agitacioacuten y temperatura miacutenimo de modo tal que permitiese el cultivo de
microorganismos El biorreactor disentildeado fue exitoso pues permitiacutea un
crecimiento microbiano oacuteptimo y la produccioacuten de γ-PGA en un tiempo
relativamente corto de 18 horas
Las modificaciones realizadas en realidad fueron miacutenimas con respecto
a la estructura baacutesica del reactor quiacutemico convencional y con ellas se buscoacute
crear las condiciones que permitiesen incrementar la turbulencia en el sistema
de modo que existiese una mayor oxigenacioacuten y un mayor coeficiente
volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno (kLa) partiendo de antemano de la
hipoacutetesis inicial que sentildealaba al oxiacutegeno como uno de los componentes
limitantes de hecho el de mayor importancia para que este fermentacioacuten
ocurriese de la manera adecuada y con un alto rendimiento de γ-PGA
Se decidioacute emplear un reactor hecho de vidrio en lugar de uno metaacutelico
debido a que las condiciones de oxidacioacuten de la fermentacioacuten y la sensibilidad
de las enzimas involucradas a los iones metaacutelicos haciacutean deseable un material
inerte como sucede con el vidrio De igual manera al emplearse vidrio se tiene
una visioacuten del interior del fermentador las condiciones de agitacioacuten y formacioacuten
de burbujas son visibles asiacute como el crecimiento microbiano lo que permite un
mejor ajuste y correccioacuten de las condiciones de fermentacioacuten al menos durante
las etapas iniciales de investigacioacuten Para poder trabajar a mayores presiones
se hubiese requerido un reactor quiacutemico metaacutelico de un costo sumamente
elevado Los resultados experimentales demostraron que el rango de presioacuten
definido resultoacute ser el correcto para la investigacioacuten
La seleccioacuten de una turbina tipo Rushton radica en que este tipo de
agitador de pala plana se considera como el ideal para la realizacioacuten de
fermentaciones Dado que las paletas de heacutelices Rushton son planas y
colocadas verticalmente a lo largo del eje de agitacioacuten producen un flujo radial
unidireccional que permite una alta difusioacuten de un gas en un liacutequido por lo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 81
comuacuten son utilizadas en la fermentacioacuten de liacuteneas celulares que requieren altas
tasas de oxiacutegeno tales como las levaduras bacterias y algunos hongos
Las laacuteminas deflectoras fueron incorporadas pues aunque a velocidades
muy bajas un agitador de paletas produce una agitacioacuten suave inclusive en un
tanque sin laacuteminas deflectoras cuando son necesarias velocidades elevadas
se requiere la incorporacioacuten de dichas laacuteminas para aumentar la turbulencia de
lo contrario el liacutequido se mueve como un remolino que gira alrededor del
tanque con velocidad elevada pero con poco efecto de mezcla
74 Tiempo de fermentacioacuten
El tiempo de fermentacioacuten empleado en esta investigacioacuten es
significativamente inferior al empleado por otros autores que hablan de un
promedio de 72 horas Es importante sentildealar que 18 horas es el tiempo
suficiente para que el pH del medio de cultivo descienda a cerca de 60
Valores de pH inferiores a este han demostrado ser perjudiciales pues decae
el consumo de aacutecido ciacutetrico se detiene en gran medida la polimerizacioacuten del γ-
PGA y la concentracioacuten tiende a disminuir con el paso del tiempo
Para poder aumentar el periacuteodo de fermentacioacuten se requeririacutea un
sistema de ajuste de pH que opere bajo condiciones del presioacuten mismo que no
se tuvo disponible Es probable que si se prolongara el tiempo de fermentacioacuten
dentro del biorreactor los rendimientos al cabo de 48 o 72 horas seriacutean un
poco mayores siempre y cuando se ajuste el pH en el valor de 65 como
recomiendan Cromwick y colaboradores (1995)
En nuestro caso el incremento del tiempo de fermentacioacuten sin
regulacioacuten del pH de 18 horas a 36 horas mostroacute un incremento miacutenimo en la
productividad (de 025 gL) pero si un cambio en la composicioacuten del γ-PGA
pues el pico de elucioacuten del poliacutemero se desplazoacute levemente hacia un valor de
tiempo mayor lo que podriacutea indicar una degradacioacuten parcial del poliacutemero
inicialmente producido Dichos datos se presentan en la figura 12
Nuestros resultados contradicen lo sentildealado por otros autores quienes
obtienen los mayores rendimientos entre las 48 y 96 horas Birrer y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 82
colaboradores (1995) observaron que Bacillus licheniformis ATCC9945a
alcanza la fase estacionaria a las 24 horas tiempo en el cual muy poco γ-PGA
ha sido formado y por consiguiente la mayor formacioacuten de γ-PGA acontece
entre las 24 y las 96 horas Estos resultados coinciden con los reportados por
Troy (1973) pero difieren a los observados por Goto y Kunioka (1992) con
Bacillus subtilis IFO3335 donde el mayor rendimiento se obtuvo desde las 24 y
hasta las 40 horas Estas diferencias podriacutean deberse a aspectos maacutes
relacionados con los voluacutemenes de fermentacioacuten empleados Por ejemplo para
el caso de Yoon y colaboradores (2000) estos alcanzaron rendimientos de 35
gL con un periacuteodo de fermentacioacuten maacuteximo de 35 horas indicando un
agotamiento del aacutecido ciacutetrico a las 20 horas en su caso el volumen empleado
fue de 1 litro de medio de cultivo
Figura 12 Cromatograma a las 18 (a) y 36 (b) horas de fermentacioacuten con Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 83
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento
Un punto vital para una adecuada fermentacioacuten es la concentracioacuten de
inoacuteculo aspecto que es sentildealado por Troy Cromwick y colaboradores a lo
largo de sus investigaciones pero que no detallan ni cuantifican
adecuadamente o al menos no lo reportan En nuestro caso se empleoacute un
inoacuteculo madre con una absorbancia de 25 o mayor y un inoacuteculo del reactor con
un valor de absorbancia de 120 aproximadamente con el propoacutesito de asiacute
logran estandarizar las condiciones de inoacuteculo Aunque este aspecto no fue
cuantificado a manera cualitativa si se observoacute un importante efecto de este
aspecto (concentracioacuten inicial) sobre la cantidad de γ-PGA obtenido y el tiempo
requerido Esto puede resultarnos obvio teniendo en cuenta una descripcioacuten no
estructurada del crecimiento microbiano pero podriacutea resultar maacutes compleja de
analizar si consideramos que la produccioacuten del γ-PGA estaacute afectada por
paraacutemetros de otra naturaleza maacutes allaacute de la disposicioacuten de nutrientes como
por ejemplo de una estructura celular particular o una relacioacuten de percepcioacuten
de quoacuterum dada Debemos recordar que la percepcioacuten de quoacuterum es un
mecanismo de regulacioacuten de la expresioacuten geneacutetica en respuesta a la densidad
de poblacioacuten celular Las ceacutelulas involucradas producen y excretan sustancias
llamadas autoinductores que sirven de sentildeal quiacutemica para inducir la expresioacuten
geneacutetica colectiva De Vizio (2011) sentildeala que en Bacillus licheniformis NCIMB
8874 la produccioacuten de lichenysin γ-PGA y algunas proteasas extracelulares
estaacute vinculado con los genes comQXPA mismo operoacuten que regula la
percepcioacuten de quoacuterum en Bacillus subtilis
De igual manera la relacioacuten de escalamiento aplicada fue de 16
ligeramente inferior a la que teoacutericamente se utiliza con mayor frecuencia de
110 Aunque este iacutendice no fue objeto de estudio su ajuste tambieacuten afecta de
manera directa los rendimientos obtenidos
La optimizacioacuten de la concentracioacuten del inoacuteculo la relacioacuten de
escalamiento y su frecuencia constituyen aspectos que deben estudiarse con
mayor profundidad para su propia optimizacioacuten pues su efecto sobre esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 84
fermentacioacuten y su rendimiento es bastante significativo Esta afirmacioacuten
adquiere validez cuando vemos que la produccioacuten del γ-PGA no es un
metabolito primario que se forme durante la fase de crecimiento exponencial
sino maacutes bien al inicio de la etapa estacionaria como indica Goto y Kunioka
(antildeo) o durante toda la etapa estacionaria tal y como lo sentildealan tanto Troy
(antildeo) como Birrer y colaboradores (1994) A esto debemos agregarle tambieacuten
lo anteriormente sentildealado referente a la concentracioacuten idoacutenea que produce la
percepcioacuten de quoacuterum responsable de direccionar el metabolismo de la
comunidad microbiana hacia la siacutentesis del γ-PGA
Conociendo la dependencia de esta biosiacutentesis de la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio y partiendo del hecho de que al inicio de la fase
estacionaria la concentracioacuten celular seraacute lo suficientemente alta para poner el
riesgo el mantenimiento de las condiciones aeroacutebicas en el biorreactor pero lo
justa para una adecuada siacutentesis del γ-PGA un inoacuteculo con una alta
concentracioacuten inicial de ceacutelulas podriacutea ayudar a obtener un mayor rendimiento
en un tiempo de fermentacioacuten menor o producir la respuesta de percepcioacuten de
quoacuterum (generalmente se trata de la liberacioacuten de un polipeacuteptido sentildeal) en un
tiempo menor con la consiguiente produccioacuten del γ-PGA
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa es un valor de
suma importancia para el escalamiento de bioprocesos en particular cuando
nos referimos a fermentaciones aeroacutebicas o cultivos de organismos o ceacutelulas
en condiciones de metabolismo aeroacutebico En nuestro caso un adecuado
coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno es garantiacutea que las
condiciones aeroacutebicas se sostendraacuten a lo largo del proceso de fermentacioacuten de
modo que no se produzcan desviacuteos metaboacutelicos indeseados o en el peor de
los casos el inicio del metabolismo anaerobio y la consecuente produccioacuten de
aacutecido aceacutetico
Los valores de kla obtenidos fueron de 0026 s-1 y 0025 s-1 para el
matraz y el bioreactor respectivamente Dichos valores por si mismos nos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 85
indican poco si no determinamos la tasa de consumo de oxiacutegeno requerida
para el cultivo aeroacutebico de Bacillus licheniformis Doran (1995) reporta una
velocidad de consumo de oxiacutegeno m02 para el cultivo aeroacutebico de Bacillus
licheniformis de 231 x 10-5 gO2 g-1cel s
-1 si la concentracioacuten de ceacutelulas X en el
reactor es de 20 gL (determinado experimentalmente como el valor final
alcanzado en matraces con alta concentracioacuten de γ-PGA) la tasa de consumo
de oxiacutegeno (OUR) MO2 seraacute igual a Xm02 es decir 46 x 10-4 mgO2mL-1s-1 A
partir de estos datos y conociendo que kla = MO2ΔcA ΔcA = cA ndash cA sabiendo
que presioacuten atmosfeacuterica cA = 801 mgL a 30 ordmC y el valor cA en el biorreactor
a 30 ordmC es 74 mgL obtenemos un valor de kla del orden de 0062 s-1 Dicho
valor corresponde al valor teoacuterico que seriacutea necesario para mantener el cultivo
con el suministro adecuado y suficiente de oxiacutegeno y que como puede verse
es 25 veces mayor al kla real lo que indica que cuando el cultivo alcance la
maacutexima concentracioacuten celular de 20 gL las condiciones del cultivo no seraacuten
suficientes para un metabolismo cien por ciento aeroacutebico
Tiene sentido entonces que los rendimientos alcanzados en matraz sean
significativamente mayores que los mejores rendimientos obtenidos en
bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica Dado que el cultivo en matraz incorporaba
uacutenicamente 100 mL de medio de cultivo el microorganismo es capaz de
alcanzar una mayor concentracioacuten en una menor unidad de tiempo lo que le
permite alcanzar una mayor concentracioacuten de poliacutemero durante las 26 horas de
cultivo (8 iniciales + 18)
Por su parte para el caso del biorreactor el crecimiento oacuteptimo
probablemente demore maacutes en alcanzarse por lo cual el tiempo que transcurre
entre el alcance de la concentracioacuten limitante de 8 gL (concentracioacuten a la cual
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y la tasa de consumo de oxiacutegeno
(OUR) se igualan) y la concentracioacuten oacuteptima es lo suficiente como para afectar
los rendimientos de γ-PGA Esto resulta evidente al comparar los resultados de
matraz con los de bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica (0 bar relativos) donde la
diferencia en productividad entre ambos es de 43 gL de γ-PGA Dicha
diferencia se explica porque mientras que la concentracioacuten del inoacuteculo madre
mostraba una absorbancia promedio de 25 la del inoacuteculo empleado para el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 86
biorreactor era de 120 (100 ml de medio + inoacuteculo madre creciendo durante 8
horas) es decir praacutecticamente la mitad por lo cual la concentracioacuten inicial de
ceacutelulas era significativamente menor para el biorreactor en comparacioacuten con el
matraz
77 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En condiciones estaacuteticas el contenido de γ-PGAdemostroacute reducir
considerablemente la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
pasando de 74 mgL a 440 mgL a una concentracioacuten del 20 en γ-PGA
Este fenoacutemeno puede deberse al incremento de la viscosidad por la
presencia del poliacutemero en el caldo de cultivo Dicha apreciacioacuten seguramente
afecta de manera negativa la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) pues
reduce tanto cA como cA sin embargo la determinacioacuten del valor de c
A de una
solucioacuten compuesta por sales γ-PGA y productos del metabolismo microbiano
es imposible de determinar teoacutericamente con certeza como para poder
cuantificar la magnitud de reduccioacuten de la OTR numeacutericamente De igual
manera el valor de kLa tambieacuten se ve afectado pues es sabido que a mayor
viscosidad mayor resistencia a la transferencia lo que reduce el valor de este
coeficiente
Asiacute mismo esta reduccioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
podriacutea deberse en parte a la naturaleza anioacutenica del poliacutemero y no solamente
al incremento de la viscosidad La solubilidad se ve afectada por la fuerza
ioacutenica por lo cual una solucioacuten con una concentracioacuten elevada de un poliacutemero
polianioacutenico como el γ-PGA probablemente muestre una importante reduccioacuten
en la solubilidad maacutexima (concentracioacuten de saturacioacuten) del oxiacutegeno en la
misma(Schumpe et al 1978)
Queda claro que dada esta reduccioacuten en la solubilidad de oxiacutegeno al
incrementar el contenido de γ-PGA durante la fermentacioacuten ya sea por la
naturaleza viscosa del biopoliacutemero o por su caraacutecter polianioacutenico la tasa de
transferencia de oxiacutegeno inicial y el valor de kLa se van reduciendo a lo largo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 87
del tiempo lo que dificulta auacuten maacutes garantizar las condiciones de oxigenacioacuten
oacuteptimas para este bioproceso Esto lo podemos explicar pues si tenemos que
OTR = kLa(cA-cA)
dado que al aumentar el contenido de γ-PGA ocurre una reduccioacuten en el valor
de kLa por accioacuten del incremento de la viscosidad (hecho que es
completamente cierto) y al aumentar la concentracioacuten de γ-PGA tambieacuten se
reduce tanto el valor de cA como el de cA (ya sea por efecto de la viscosidad o
de la naturaleza anioacutenico del poliacutemero) la OTR ve su magnitud evidente e
inevitablemente reducida dado que la misma es una relacioacuten de producto entre
ambos factores kLa y (cA ndashcA) Esto podriacutea explicar porque a voluacutemenes de
cultivo de 600 mL (en biorreactor) los rendimientos son mucho menores que en
voluacutemenes de cultivo de 100 ml (matraz) pues probablemente esta caiacuteda en la
OTR sea maacutes acentuada y criacutetica para los microorganismos cuando sucede a
voluacutemenes mayores donde mantener las condiciones de mezcla perfecta y una
alta concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto resultan maacutes dificultosas por lo que el
microorganismo es incapaz de crecer y alcanzar la concentracioacuten idoacutenea para
una maacutexima produccioacuten
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γshyPGA
La concentracioacuten de γ-PGA alcanzada al final de las 18 horas de
fermentacioacuten se vio afectada por la presioacuten Asiacute hasta los 103 bar a mayor
presioacuten mayor concentracioacuten de γ-PGA por encima de este valor de presioacuten la
concentracioacuten de γ-PGA disminuye
Esto puede explicarse por dos factores 1) el efecto de la presioacuten sobre
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y 2) impacto sobre la integridad y
viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γ-PGA
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR
La OTR se ve afectada tanto por el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de oxiacutegeno kLa asiacute como por la diferencia entre la concentracioacuten
de saturacioacuten y la concentracioacuten real en la fase liacutequida (cA-cA) El coeficiente kL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 88
es empiacuterico y su valor depende principalmente de factores tales como la
hidrodinaacutemica del sistema la turbulencia y su geometriacutea
Teoacutericamente kL se puede definir como kL = DABδ donde DAB es la
difusividad de A en B y δ es el espesor de la peliacutecula estancada seguacuten la
teoriacutea de peliacutecula para la transferencia de materia La difusividad en liacutequidos
depende en gran medida de la temperatura (afecta el coeficiente de difusioacuten) y
la concentracioacuten de solutos pero muy poco de la presioacuten (Diacuteaz 2011) En
nuestro caso podriacuteamos suponer que la presioacuten tiene poco efecto sobre kLa
pues tampoco es de esperar un cambio producto de la presioacuten en el aacuterea de
burbujas (a) producida por la agitacioacuten mecaacutenica auacuten maacutes cuando vemos el
hecho de que los ensayos llevados a cabo no contaron con un sistema de
aireacioacuten o burbujeo especiacutefico salvo aquel llevado a presioacuten atmosfeacuterica (0
bar relativa) y debidamente identificado como Aireacioacuten
Asiacute entonces tenemos en el segundo componente de la foacutermula la
diferencia (cA-cA) un punto de particular intereacutes pues efectivamente la
concentracioacuten de saturacioacuten y la concentracioacuten real variacutean con la presioacuten A
pesar de carecer de una sonda de oxiacutegeno disuelto directamente incorporada
al biorreactor y capaz de operar a presioacuten se determinoacute mediante transferencia
(con el sistema cerrado) la concentracioacuten real de oxiacutegeno en el medio de
cultivo a distintas presiones Tales concentraciones y las concentraciones de
saturacioacuten a cada presioacuten se presentan en el graacutefico 14
Para determinar el valor de las distintas concentraciones de saturacioacuten
al trabajar a presiones distintas a la atmosfeacuterica se realizoacute la siguiente
correccioacuten (Montoya amp Bermuacutedez 2003) para el valor de la solubilidad del
oxiacutegeno en agua
Ley de Henry
a 1 atm
Para una presioacuten P distinta a 1 atm tenemos que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 89
en mgL
Donde
C(S) = valor de solubilidad a 1 atm (mgL)
P = presioacuten de operacioacuten (atm)
T = temperatura de operacioacuten (K)
Graacutefico 14 Concentraciones de oxiacutegeno de saturacioacuten y en fas liacutequida a diferentes presiones
en medio de cultivo E sin crecimiento bacteriano
80
153
227
324
422
6681
141154
178
141
724857
1703
2438
y = 48525x + 68875
y = 14191x + 80039
y = 93382x + 11163
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
00
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 05 1 15 2 25 3
Concentracioacuten
Presioacuten (bar)
CONCENTRACIOacuteN DE SATURACIOacuteN CONCENTRACIOacuteN EN FASE LIacuteQUIDA DIFERENCIA
Aunque estos valores deben repetirse con una sonda de oxiacutegeno
disuelto interna (dentro del biorreactor) y bajo una metodologiacutea maacutes pertinente
preliminarmente puede observarse que la diferencia (cA-cA) aumenta al
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 90
aumentar la presioacuten y dado que OTR = kLa(cA-cA) al aumentar dicha
diferencia la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deberiacutea ser mayor Este
incremento de la OTR podriacutea explicar el porqueacute del raacutepido crecimiento
microbiano y la produccioacuten precoz de γ-PGA despueacutes de 18 horas de cultivo
en comparacioacuten con las entre 48 y 96 horas reportadas por otros autores asiacute
como el aumento del rendimiento al aumentar la presioacuten de los 0 bar relativos
(a presioacuten atmosfeacuterica) hasta los 103 bar relativos
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γshyPGA
Al superar los 103 bar relativos el rendimiento en γ-PGA decae
nuevamente Si consideramos un efecto positivo de la presioacuten sobre la OTR
como sentildealamos anteriormente esto no deberiacutea ocurrir Sin embargo al
someter las ceacutelulas a condiciones de presioacuten desconocemos el efecto que
dicha presioacuten puede ejercer sobre los microorganismos y sus rutas
metaboacutelicas asiacute como sobre la estructura de algunas biomoleacuteculas como por
ejemplo proteiacutenas
Meersman y Heremans (2008) sentildealan que el efecto de la presioacuten sobre
el crecimiento de los microorganismos puede explicarse por tres efectos
principales 1) Variaciones en el plegamiento y agregacioacuten de las proteiacutenas 2)
Variaciones en el estado de la membrana celular y 3) Variaciones en el
contenido de proteiacutenas asociadas a la membrana celular Estos aspectos son
de peculiar consideracioacuten pues la γ-PGA sintetasa es un complejo enzimaacutetico
formado por al menos tres unidades enzimaacuteticas distintas y que se encuentra
asociado a la membrana celular de Bacillus licheniformis
En lo referente a las proteiacutenas se sabe que su desnaturalizacioacuten se
produce por efecto de una reduccioacuten en su volumen producto de un cambio
configuracional probablemente de la estructura terciaria Asiacute tenemos que si el
volumen inicial de una proteiacutena viene dado por Vi = Vatomos + Vcavidades +
Vhidratacioacuten si en condiciones de presioacuten ocurre un cambio en el volumen de la
proteiacutena tal que ΔV = ΔVcavidades + ΔΔVhidratacioacuten(el volumen de los aacutetomos no
tiene por queacute variar con la presioacuten) la exposicioacuten de los grupos cargados o
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 91
hidrofoacutebicos de la proteiacutena al agua pueden conllevar a un cambio en la
estructura secundaria y terciaria de modo que la actividad de la proteiacutena se
vea perjudicada parcial o totalmente Esto se debe a que un aumento en la
presioacuten rompe las interacciones hidrofoacutebicas donde las interacciones proteiacutena-
proteiacutena son sustituidas por interacciones proteiacutena-agua particularmente
mediante puente de hidroacutegeno El incremento de la presioacuten podriacutea afectar la
conformacioacuten de alguno o algunos de los componentes del complejo
enzimaacutetico γ-PGA sintetasa lo que sin duda alguna se traduciriacutea en un menor
rendimiento en γ-PGA durante la fermentacioacuten Este posible efecto negativo de
la presioacuten sobre una de las enzimas involucradas en el proceso de biosiacutentesis
del γ-PGA se reafirma cuando vemos como variacutea la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA al aumentar la presioacuten aspecto que se discutiraacute con mayor detalle
maacutes adelante De hecho Ashiuchi y colaboradores (2004) sentildealan que el
complejo enzimaacutetico PgsBCA (γ-PGA sintetasa) es imposible de aislar en su
estado activo debido precisamente a su alta inestabilidad y elevada
hidrofobicidad
Por su parte la membrana celular al tratarse de una bicapa fosfolipiacutedica
es susceptible a sufrir cambios de fase producto de la temperatura o la presioacuten
como por ejemplo la transicioacuten gel-liacutequido El incremento de la presioacuten al igual
que sucede con la temperatura concede mayor fluidez a las bicapas lipiacutedicas
Asiacute en nuestro caso un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea permitir
una mayor difusioacuten de oxiacutegeno al interior celular lo que podriacutea afectar el
crecimiento bacteriano si por ejemplo se formase maacutes especies reactivas
toacutexicas de oxiacutegeno en el interior celular o si cierta maquinaria celular como la
misma γ-PGA sintetasa no fuese capaz de acoplarse adecuadamente en una
membrana con mayor fluidez
En lo referente a la interaccioacuten membrana celular-proteiacutenas es
importante destacar que entre el 20 y el 40 de las proteiacutenas de una ceacutelula
bacteriana suelen estar asociadas a esta estructura Como indicamos
anteriormente un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea afectar el
contenido concentracioacuten y capacidad de anclaje de las proteiacutenas a la
membrana celular El complejo enzimaacutetico γ-PGA sintetasa al tratarse de una
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 92
proteiacutena de membrana podriacutea no acoplarse de manera efectiva a la membrana
celular modificada bajo condiciones de presioacuten o ser liberada al medio de
cultivo lo que afectariacutea negativamente la produccioacuten de γ-PGA Estas
suposiciones podriacutean explicar el porqueacute de la gran cantidad de espuma
generada durante algunas fermentaciones a presioacuten (concretamente en
aquellas a una presioacuten superior a los 103 bar) a pesar de su menor
concentracioacuten de γ-PGA y teniendo presente que en las fermentaciones
microbianas la espuma suele estar constituida mayoritariamente por proteiacutenas
la presioacuten podriacutea estar favoreciendo la liberacioacuten de estas proteiacutenas al caldo de
cultivo y la consecuente formacioacuten abundante de espuma Este fenoacutemeno ya
ha sido reportado en otros microorganismos como Salmonella enterica donde
el tratamiento con presioacuten conllevaba a la peacuterdida de gran parte de sus
proteiacutenas de membrana y su consecuente liberacioacuten al medio de cultivo
(Meersman amp Heremans 2008) Esto se ve respaldado con las observaciones
de Ashiuchi y colaboradores (2004) quienes adicionaron detergentes como el
Tween20 y Triton X-114 (que modifican la estabilidad de la membrana celular y
favorece la liberacioacuten de las proteiacutenas asociadas a ella) a cultivos de Bacillus
spp productores de γ-PGA Ellos observaron una peacuterdida total de la capacidad
de siacutentesis del γ-PGA capacidad que no se recuperaba ni siquiera removiendo
la totalidad de dichos detergentes mediante diaacutelisis con lo cual concluyeron
que es indispensable que el complejo γ-PGA sintetasa se encuentre asociado a
la membrana celular para ser bioloacutegicamente activo
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γshyPGA
Un incremento de la intensidad de agitacioacuten afectariacutea positivamente el
valor de kLa incrementaacutendolo al aumentar el aacuterea de intercambio mediante una
mayor ruptura de las burbujas lo que aumenta el aacuterea de intercambio por
unidad de volumen Sin embargo existen liacutemites para la velocidad de agitacioacuten
esto debido al dantildeo ocasionado a los organismos debido a un esfuerzo
cortante excesivo A pesar de que la turbina Rushton es el impulsor de flujo
axial maacutes recomendado y maacutes eficiente para generar una mezcla perfecta de
alto perfil hidrodinaacutemico un bajo esfuerzo cortante y una alta distribucioacuten un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 93
exceso de agitacioacuten bajo condiciones de presioacuten es evidentemente perjudicial
Es probable que al aplicar presioacuten positiva sobre el cultivo la membrana celular
se encuentre en un estado de fluidez mayor al que presentariacutea a presioacuten
atmosfeacuterica asiacute mismo la presencia de glicerol en el medio de cultivo modifica
la composicioacuten lipiacutedica de la membrana favoreciendo la salida del γ-PGA al
exterior celular al aumentar de igual manera su fluidez Esto queda demostrado
por nuestros resultados a velocidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm
donde ocurre una reduccioacuten de la productividad conforme se aumenta la
agitacioacuten De igual manera la excesiva formacioacuten de espuma que se genera a
intensidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm podriacutea indicar la ruptura celular
y la liberacioacuten de componentes celulares y macromoleacuteculas al caldo de
fermentacioacuten Estas observaciones contradicen lo reportado por otros autores
(Yoon et al 2000) quienes indican velocidades de agitacioacuten oacuteptimas de hasta
1000 rpm a presioacuten atmosfeacuterica para un biorreactor de 24 L y un volumen
efectivo de cultivo de 1 L aunque no se brindan mayor detalle en lo referente al
tipo de turbina empleada
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
El cambio de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producto de la
presioacuten fue un resultado inesperado pues tradicionalmente se habiacutea sentildealado
a la concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo como el principal
responsable de controlar este aspecto Es importante destacar el hecho que
dicho cambio en la composicioacuten no es parcial o escalonado sino que por el
contrario el hecho de aplicar presioacuten durante la fermentacioacuten invierte
praacutecticamente los contenidos de aacutecido D-glutaacutemico y aacutecido L-glutamico de 87
y 13 respectivamente a presioacuten atmosfeacuterica (cultivo en matraz) a 17 y 83
respectivamente a una presioacuten relativa de 103 bar En algunos casos el
contenido de aacutecido D-glutaacutemico fue praacutecticamente 0
Efectivamente se sabe que el complejo γ-PGA sintetasa es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico aunque todaviacutea se
desconoce la arquitectura bioloacutegica de esta sintetasa Igualmente se sabe que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 94
es el componente PgsB el mayormente responsable de la cataacutelisis enzimaacutetica
(reaccioacuten de elongacioacuten del γ-PGA) (Ashiuchi 2010) Una hipoacutetesis que podriacutea
explicar estos resultados es que bajo presioacuten la estructura de esta proteiacutena se
modifique parcialmente (tanto la estructura de la proteiacutena propiamente dicha
como la estructura en funcioacuten de su anclaje a la membrana celular) lo
suficiente como para reducir su afinidad por el aacutecido D-glutaacutemico pero sin
afectar su afinidad por el aacutecido L-glutaacutemico ni conllevar a una
desnaturalizacioacuten de la proteiacutena y la consiguiente peacuterdida total de la actividad
enzimaacutetica Dado que es poco lo que se conoce de la estructura y mecanismo
de accioacuten de esta proteiacutena PgsB es imposible poder determinar con mayor
detalle el coacutemo pueden darse este cambio en la proteiacutena aunque casos
similares se observan durante la desnaturalizacioacuten de proteiacutenas por
temperatura donde las enzimas que operan sobre muacuteltiples sustratos no
pierden su capacidad enzimaacutetica de manera total sobre todos ellos sino que
inicialmente acontece una peacuterdida de afinidad diferenciada seguacuten el sustrato
hasta llegar al punto de desnaturalizacioacuten total donde se pierde toda actividad
enzimaacutetica para todos los sustratos
De igual manera es conocido que existe en Bacillus licheniformis una
enzima racemasa de naturaleza citosoacutelica responsable de transformar el aacutecido
L-glutaacutemico en aacutecido D-glutaacutemico podriacutea entonces tambieacuten asumirse alguacuten
efecto de la presioacuten sobre la actividad de la misma Sin embargo el hecho de
que esta enzima no esteacute asociada a una membrana celular (las proteiacutenas
asociadas a membrana celular tienden a ser maacutes vulnerables a los cambios de
presioacuten por la complejidad e indispensabilidad de su estructura terciaria sobre
su funcioacuten y su anclaje) sea una enzima de un uacutenico dominio y a que
experimentalmente el contenido de aacutecido D-glutaacutemico inclusive a la maacutexima
presioacuten (241 bar) no es cero hacen suponer que la misma se encuentra
bioloacutegicamente activa bajo las condiciones de presioacuten evaluadas
Estos resultados son de suma importancia pues para aplicaciones
biomeacutedicas y farmaceacuteuticas es necesario que el γ-PGA presente un alto
contenido en aacutecido L-glutaacutemico isoacutemero que es reconocido por el organismo
humano El efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre esta composicioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 95
enantiomeacuterica constituye un descubrimiento que pueda facilitar el empleo del γ-
PGA en medicina y que puede ser clave en el disentildeo de un proceso productivo
optimizado para tal fin
711 Peso molecular del γshyPGA En lo correspondiente al peso molecular del γ-PGA se observa que el
tamantildeo del poliacutemero es grande aunque no se observa ninguna tendencia en
los datos que pueda suponer alguacuten efecto de la presioacuten sobre el peso
molecular del poliacutemero Es importante sentildealar que la columna cromatograacutefica
empleada es incapaz de resolver moleacuteculas del alto peso molecular por lo
cual aunque si bien los resultados obtenidos resulten uacutetiles a nivel
comparativo dichos resultados deben tomarse con precaucioacuten Para un mejor
anaacutelisis seriacutea necesario emplear una columna capaz de resolver altos pesos
moleculares
Es importa sentildealar ademaacutes que tal y como se comentoacute anteriormente y
como se muestra en la figura 12 se observa una reduccioacuten del peso molecular
al prolongar el tiempo de fermentacioacuten hasta las 36 horas Para el caso del
reactor AHCJ32 al prolongar el tiempo de fermentacioacuten por 18 horas maacutes se
nota una reduccioacuten en la fraccioacuten de mayor peso molecular y un incremento en
la de menor sin que haya un cambio importante en el rendimiento global Esto
podriacutea deberse a que Bacillus licheniformis ATCC9945a posee enzimas
capaces de hidrolizar el γ-PGA y emplearlo como fuente de carbono Asiacute
mismo dicha observacioacuten sentildeala que si es necesario prolongar el tiempo de
fermentacioacuten es requerido realizar ajustes pues parece ser que la prolongacioacuten
por siacute misma uacutenicamente no es garantiacutea de una mejora en el rendimiento del
proceso fermentativo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 96
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 97
10 CONCLUSIONES
De la elaboracioacuten de la presente investigacioacuten se pueden extraer las
siguientes conclusiones principales
1) El rendimiento promedio en γ-PGA para el cultivo en matraz fue
superior a los 45 gL Dicho rendimiento es el mayor que se haya
reportado hasta la fecha para Bacillus licheniformis ATCC9945a lo
que convierte a esta cepa en una de las que mejor rendimiento
maacuteximo reporta para la biosiacutentesis de dicho poliacutemero natural
2) Un mecanismo eficiente para la conservacioacuten de cultivos de Bacillus
licheniformis ATCC9945a en un estado competente de produccioacuten
de γ-PGA es el congelamiento de ceacutelulas vegetativas a una
temperatura de -80 ordmC Es importante que la absorbancia de las
muestras congeladas sea superior a 25 lo que garantiza una alta
concentracioacuten de ceacutelulas
3) Dada la naturaleza del γ-PGA y su viscosidad el aumento de su
concentracioacuten en el caldo de cultivo a lo largo del tiempo de
fermentacioacuten afecta de manera negativa la tasa de transferencia de
oxiacutegeno disminuyeacutendola paulatinamente El cambio a condiciones
anaeroacutebicas conlleva a la detencioacuten de la biosiacutentesis del γ-PGA y el
consecuente inicio de un metabolismo netamente anaeroacutebico
4) Bacillus licheniformis ATCC9945a es capaz de crecer eficientemente
a presiones de hasta 242 bar relativos no vieacutendose afectado desde
el punto de vista de viabilidad por el incremento de la variable
presioacuten de fermentacioacuten
5) La presioacuten de fermentacioacuten afecta de manera significativa la
productividad de Bacillus licheniformis ATCC9945a en γ-PGA
6) El incremento de la presioacuten de fermentacioacuten hasta los 103 bar
relativos aumenta la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo de cultivo
seis veces (de 218 gL a 1334 gL) en comparacioacuten a los
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 98
rendimientos obtenidos a presioacuten atmosfeacuterica para un periacuteodo de
proceso de 18 horas
7) A presiones de fermentacioacuten superiores a los 103 bar la
productividad decae en comparacioacuten a la obtenida a dicha presioacuten
sin embargo la misma sigue siendo superior a la obtenida a presioacuten
atmosfeacuterica para un periacuteodo de proceso de 18 horas
8) El aumento de la presioacuten probablemente incremente la tasa de
transferencia de oxiacutegeno al incrementar la concentracioacuten de
saturacioacuten del mismo en el medio de cultivo lo que genera un
gradiente de concentracioacuten que permite una mayor transferencia
9) Presiones superiores a 103 bar probablemente afecten estructuras
celulares o biomoleacuteculas tales como las membranas celulares y las
proteiacutenas (γ-PGA sintasa) lo que tiene un efecto perjudicial sobre la
biosiacutentesis de γ-PGA
10) A una temperatura de 30 ordmC y a una presioacuten de 103 bar la
intensidad de agitacioacuten oacuteptima es de 300 rpm Una magnitud de
agitacioacuten mayor produce el dantildeo celular posiblemente por un exceso
de tensioacuten cortante
11) La presioacuten de fermentacioacuten modifica la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA A presioacuten atmosfeacuterica el γ-PGA estaacute compuesto
mayoritariamente por aacutecido D-glutaacutemico A presiones entre 052 y
242 bar dicha composicioacuten se revierte siendo el aacutecido L-glutaacutemico
el isoacutemero maacutes comuacutenmente presente en el γ-PGA
12) La biosiacutentesis de γ-PGA a presioacuten constituye una forma eficiente de
producir un biopoliacutemero mayoritariamente conformado por residuos
de aacutecido L-glutaacutemico aspecto de vital importancia para su aplicacioacuten
biomeacutedica dado que es este isoacutemero del aacutecido glutaacutemico es que es
reconocido y asimilado por el organismo humano
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 99
13) Aunque la modificacioacuten de la presioacuten de fermentacioacuten nunca ha sido
una variable importante en el estudio de los rendimientos para
distintos bioprocesos la presente investigacioacuten demuestra que la
modificacioacuten de dicha variable no soacutelo permite mejorar el
rendimiento global del proceso sino que tambieacuten puede conllevar a
la modificacioacuten del producto final lo que significariacutea una nueva rama
para la investigacioacuten en el disentildeo de bioprocesos de intereacutes
industrial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 100
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 101
11 AGRADECIMIENTOS
Un agradecimiento especial al profesor Jordi Bou por brindarme la
oportunidad de trabajar a su lado en este proyecto por el seguimiento y
asesoriacutea brindada a lo largo del mismo que nos permitioacute alcanzar nuestros
planteamientos y objetivos Espero que los aportes brindados con la presente
investigacioacuten permitan un mejor desarrollo en el futuro de estas temaacuteticas tan
novedosas biopoliacutemeros y fermentaciones bajo condiciones de presioacuten
positiva
Igualmente a la Ing Alejandra Hernaacutendez por la colaboracioacuten y asistencia
brindada durante esta investigacioacuten fue un apoyo importante durante el
desarrollo de las metodologiacuteas y distintas pruebas que se requirieron a lo largo
de esta investigacioacuten
A la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el Desarrollo
(AECID) y a Casa Ameacuterica Cataluntildea que me brindaron la oportunidad de cursar
este programa de maacutester a traveacutes de su programa de extensioacuten de becas a
ciudadanos extranjeros ha sido una oportunidad de crecimiento personal y
profesional que alcanza su punto maacuteximo con la elaboracioacuten de la presente
investigacioacuten El conocimiento adquirido sin duda alguna seraacute un valioso
compantildeero en mi desempentildeo profesional futuro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 102
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 103
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Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 3
1 RESUMEN
El aacutecido γ-poliglutaacutemico es un poliacutemero inusual que acontece de forma
natural anioacutenico soluble en agua biodegradable comestible y que no resulta
toacutexico ni para el ser humano ni para el ambiente
Diferentes cepas de bacterias del geacutenero Bacillus son capaces de
producir el γ-PGA ya sea como material viscoso extracelular o como
componente capsular En termino industrial estas cepas han sido las maacutes
utilizadas y por ende las maacutes estudiadas hasta el momento
La mayor parte de los estudios llevados a cabo hasta la fecha han estado
orientados a determinar los requerimientos nutricionales para el adecuado
crecimiento celular asiacute como mejorar la productividad de γ-PGA y la variacioacuten
en la composicioacuten de su estructura en lo referente al contenido de aacutecido L- y
D-glutaacutemico
Una de las principales limitantes que han encontrado los estudios previos
sobre produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico en medio liacutequido mediante
fermentacioacuten sumergida es la dificultad del escalamiento muy probablemente
debido a la reduccioacuten en la tasa de transferencia de oxiacutegeno al aumentar los
voluacutemenes de cultivo lo que conlleva a rendimientos pobres o a la generacioacuten
de un poliacutemero de bajo peso molecular
La presente investigacioacuten busca estudiar la produccioacuten de aacutecido γ-
poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis ATCC9945a y el efecto que tiene sobre
el rendimiento y estructura del producto factores propios de la ingenieriacutea
quiacutemica como lo son la presioacuten y la intensidad de agitacioacuten particularmente
desde la perspectiva de su efecto sobre la tasa de transferencia de oxiacutegeno
Para cumplir con dicho objetivo se disentildeoacute un biorreactor que permitioacute realizar
fermentaciones a presioacuten positiva de hasta 4 bar absolutos
Los resultados obtenidos y reportados en esta investigacioacuten sugieren
queBacillus licheniformis ATCC9945a es capaz de crecer eficientemente a
presiones de hasta 242 bar relativos no vieacutendose afectado desde el punto de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 4
vista de viabilidad por el incremento de la variable presioacuten de fermentacioacuten De
igual manera la presioacuten de fermentacioacuten afecta de manera significativa la
productividad de Bacillus licheniformis ATCC9945a en γ-PGA Asiacute mismo la
presioacuten de fermentacioacuten modifica la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 5
2 IacuteNDICE
1 RESUMEN 3
2 IacuteNDICE 5
3 GLOSARIO 9
4 PREFACIO 11
21 Origen del proyecto 11
22 Motivacioacuten 11
5 INTRODUCCIOacuteN 13
31 Objetivos 14
6 MARCO TEOacuteRICO 15
41 Los poliaminoaacutecidos 15
42 El aacutecido γ‐poliglutaacutemico (γ‐PGA) 15
421 Propiedades quiacutemicas y bioquiacutemicas del γ‐PGA 16
422 Siacutentesis microbioloacutegica de γ‐PGA 18
423 Produccioacuten fermentativa de γ‐PGA 22
424 Produccioacuten de γ‐PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a 24
425 Purificacioacuten del γ‐PGA 31
426 Control del peso molecular y degradacioacuten del γ‐PGA 32
427 Aplicaciones del γ‐PGA 33
43 Disentildeo de procesos biotecnoloacutegicos y la transferencia de materia gas‐liquido 38
431 La transferencia de materia gas‐liacutequido 39
432 La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) 40
433 Descripcioacuten de la transferencia maacutesica con kLa 40
44 Fermentaciones a presioacuten 42
7 MATERIALES Y METODOLOGIacuteA 45
51 Informacioacuten de la cepa empleada 45
52 Medio de cultivo empleado 45
53 Preparacioacuten de los inoacuteculos madre 46
531 Conservacioacuten de la cepa en estado productivo 46
54 Montaje del biorreactor a presioacuten 46
55 Condiciones de fermentacioacuten 50
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 6
551 Escalamiento 50
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre 51
56 Determinacioacuten del valor de kLa 52
561 Matraces de cultivo 53
562 Biorreactor 53
563 Graficacioacuten 53
57 Determinacioacuten del contenido de γ‐PGA en el caldo de fermentacioacuten 54
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA en la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo 55
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano 55
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 56
5101 Preparacioacuten de la muestras 56
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual 57
511 Determinacioacuten del peso molecular del γ‐PGA 57
8 RESULTADOS 59
61 Montaje del biorreactor a presioacuten 59
62 Competencia del inoacuteculo madre 59
63 Determinacioacuten de los valores de kLa 60
631 Matraz 60
632 Biorreactor 63
64 Efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto 64
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ‐PGA mediante
GPChelliphellip 65
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γ‐PGA 66
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ‐PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a 70
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 71
69 Determinacioacuten del peso molecular del γ‐PGA 73
9 DISCUSIOacuteN 77
71 Cepa empleada 77
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente 78
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten 79
74 Tiempo de fermentacioacuten 81
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento 83
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 7
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa 84
77 Efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto 86
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γ‐PGA 87
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR 87
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la
biosiacutentesis del γ‐PGA 90
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γ‐PGA 92
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 93
711 Peso molecular del γ‐PGA 95
10 CONCLUSIONES 97
11 AGRADECIMIENTOS 101
12 BIBLIOGRAFIacuteA 103
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 8
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 9
3 GLOSARIO
Bacillus Es un geacutenero de bacterias en forma de bastoacuten y Gram positiva El
geacutenero Bacillus pertenece a la divisioacuten Firmicutes Son aerobios estrictos o
anaerobios facultativos En condiciones estresantes forman una endospora de
ubicacioacuten central Dicha forma esporulada es resistente a las altas
temperaturas y a los desinfectantes quiacutemicos corrientes
γ-PGA Aacutecido gamma-poliglutaacutemico
ATCC American Type Culture Collection coleccioacuten y depositario de microorganismos
de importancia industrial y cientiacutefica
Biorreactor Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente
bioloacutegicamente activo En algunos casos un biorreactor es un recipiente en el
que se lleva a cabo un proceso quiacutemico que involucra organismos o
sustancias bioquiacutemicamente activas derivadas de dichos organismos Este
proceso puede ser aeroacutebico o anaeroacutebico Estos biorreactores son
comuacutenmente ciliacutendricos variando en tamantildeo desde algunos mililitros hasta
metros cuacutebicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable
OTR Tasa de transferencia de oxiacutegeno
OUR Tasa de consume de oxiacutegeno por parte de un microorganismo
kL Coeficiente de transferencia maacutesica
a Aacuterea de transferencia de materia por unidad de volumen
kLa Coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 10
cA
Concentracioacuten de saturacioacuten de oxiacutegeno Maacutexima concentracioacuten de oxiacutegeno que pueda estar disuelto en una fase liacutequida perfectamente mezclada
cA Concentracioacuten de oxiacutegeno en el liacutequido o concentracioacuten real Es determinada experimentalmente haciendo uso de una sonda de oxiacutegeno disuelto
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 11
4 PREFACIO
21 Origen del proyecto
Este proyecto forma parte de una serie de estudios llevados a cabo en
el ETSEIB referentes al empleo y produccioacuten de biopoliacutemeros en Cataluntildea
Anteriormente no solo se ha investigado en torno a la produccioacuten mediante
fermentacioacuten del biopoliacutemero aacutecido poliglutaacutemico sino tambieacuten sobre la
produccioacuten de aacutecido polilaacutectico y su biodegradabilidad entre otros
Una de las principales limitantes que han encontrado los estudios
previos sobre produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico en medio liacutequido mediante
fermentacioacuten sumergida es la dificultad del escalamiento muy probablemente
debido a la reduccioacuten en la tasa de transferencia de oxiacutegeno al aumentar los
voluacutemenes de cultivo lo que conlleva a rendimientos pobres o a la generacioacuten
de un poliacutemero de bajo peso molecular Asiacute mismo la reproducibilidad de los
resultados es pobre en parte por muacuteltiples factores que fueron estudiados con
mayor detalle en este trabajo
Con el propoacutesito de dar solucioacuten a este problema el presente proyecto
plantea una forma diferente y creativa al menos no es la comuacuten en el aacutembito
microbioloacutegico de abordar la limitacioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
durante la fermentacioacuten y que podriacutea ser la responsable de la reduccioacuten en los
rendimientos Asiacute mediante la aplicacioacuten de condiciones de presioacuten positiva se
plantea una posible viacutea de mejora de los rendimientos fermentativos en la
produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico esperando que sus efectos sobre la
viabilidad microbiana sean los menores posibles
22 Motivacioacuten
En la sociedad actual existe una creciente buacutesqueda de soluciones
bioloacutegicas para los problemas que anteriormente abordaacutebamos desde una
percepcioacuten uacutenicamente quiacutemica Asiacute hoy en diacutea con el propoacutesito de garantizar
la preservacioacuten del medio ambiente reducir el impacto de la actividad humana
sobre las especies animales y vegetales y garantizar un planeta a las futuras
generaciones la palabra biopoliacutemero y bioplaacutestico se han vuelto maacutes y maacutes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 12
comunes tanto en el argot popular como en el aacutembito del conocimiento
cientiacutefico donde diacutea con diacutea son maacutes las investigaciones orientadas a este tipo
de productos de naturaleza bioloacutegica y por consiguiente biodegradable
El aacutecido poliglutaacutemico por sus caracteriacutesticas constituye un poliacutemero
natural que ofrece una amplia gama de aplicaciones industriales donde puede
ser empleado tanto como agente espesante o floculador hasta aplicaciones
maacutes novedosas relacionadas con la medicina y la farmacia
En este contexto de buacutesqueda de soluciones amigables con el ambiente
es donde surge la principal motivacioacuten para investigar sobre el aacutecido
poliglutaacutemico en particular sobre coacutemo aumentar la productividad del proceso
fermentativo a partir del cual se realiza su siacutentesis de modo que las ventajas
teoacutericas que ofrece este producto pronto esteacuten disponibles tanto para el
consumidor como para la industria Tristemente los productos biotecnoloacutegicos
casi siempre tienen como principal inconveniente la valoracioacuten econoacutemica
pues tienden a ser difiacuteciles de producir por lo que tienen altos costos
asociados o sus rendimientos son menores a los deseados para hacerlos
econoacutemicamente rentables Por este motivo las investigaciones deben
procurar al menos orientarse a ofrecer soluciones que alguacuten diacutea puedan ser
llevadas a la praacutectica o como sucede con esta investigacioacuten procurar dar
respuesta a los problemas que se enfrentan cuando se trata de llevar un
producto biotecnoloacutegico a la realidad
La importancia de la investigacioacuten biotecnoloacutegica en el campo de los
materiales radica en que en un mundo con materias primas limitadas
particularmente las fuentes foacutesiles los materiales del futuro tendraacuten un origen
maacutes bioloacutegico que mineral o extractivo por lo que la mejora de los procesos
productivos relacionados con estos productos son prioritarios para cualquier
paiacutes que desee mantenerse competitivo en el aacutembito econoacutemico y tecnoloacutegico
mundial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 13
5 INTRODUCCIOacuteN
En la actualidad el desarrollo de biomateriales constituye uno de los
principales ejes de investigacioacuten en el mundo de la ciencia Dentro de estos
biomateriales los biopoliacutemeros han logrado un particularmente alto grado de
atencioacuten especialmente en los uacuteltimos 30 antildeos debidos a sus muacuteltiples
aplicaciones industriales biomeacutedicas y farmaceacuteuticas que estaacuten aportando una
amplia gama de opciones y soluciones a problemas ambientales y en la
formulacioacuten de nuevas preparaciones biomeacutedicas y farmaceacuteuticas
Los biopoliacutemeros son materiales polimeacutericos o macromoleculares que
son sintetizados por seres vivos Debido en gran parte al precio creciente la
viabilidad declinante de las fuentes foacutesiles como materias primas asiacute como el
ritmo crecimiento de la poblacioacuten mundial han propiciado el desarrollo de
fuentes alternativas renovables capaces de suministrar las necesidades
mundiales crecientes en material de energiacutea y produccioacuten quiacutemica Esta
necesidad de nuevas fuentes alternativas ha permitido que la mirada cientiacutefica
se halle puesta sobre la diversidad microbiana que habita el planeta pues los
microorganismos siempre han demostrado ser una fuente importante de
materiales novedosos con la ventaja que en la actualidad se dispone de la
tecnologiacutea necesaria para crecer los microorganismos de manera masiva y
segura Este nuevo modelo conocido como la estrategia de las biorefineriacuteas
ha cambiado la concepcioacuten de la industria quiacutemica moderna y ha sido
empleada exitosamente en la produccioacuten convencional a granel de diversos
productos quiacutemicos como por ejemplo etanol glutamato y aacutecido ciacutetrico
En el presente la produccioacuten de poliacutemeros o monoacutemeros tales como el
13-propanediol el aacutecido polilaacutectico y los polihidroxialcanoatos ha sido uno de
los principales objetivos de mayor investigacioacuten Dentro de estos nuevos
materiales encontramos los poliaminoaacutecidos poliamidas de naturaleza
polimeacuterica cuyos constituyentes estaacuten unidos por enlaces del tipo amida El
aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) es uno de estos poliaminoaacutecidos un poliacutemero
biodegradable constituido por unidades de D- y L-aacutecido glutaacutemico y que es
producido de manera natural en algunas bacterias
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 14
El presente trabajo procura investigar sobre algunas de las condiciones
involucradas en la produccioacuten bacteriana de γ-PGA y que constituyen las
principales barreras que impiden alcanzar los rendimientos necesarios para
que la produccioacuten bioloacutegica de este poliacutemero sea viable tanto desde el punto de
vista bioloacutegico como econoacutemico
31 Objetivos
El objetivo general a partir del cual se estructura el desarrollo de la
presente investigacioacuten es
Estudiar la produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a y el efecto que tiene sobre el rendimiento y estructura del
producto factores propios de la ingenieriacutea quiacutemica como lo son la
presioacuten y la intensidad de agitacioacuten
Los objetivos especiacuteficos que se plantearon alcanzar en el siguiente
proyecto son los siguientes
Disentildear un biorreactor que permita realizar fermentaciones a presioacuten
positiva de hasta 4 bar absolutos
Describir las condiciones baacutesicas requeridas para lograr reproducibilidad
en la produccioacuten deaacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre el rendimiento de
produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico en gL por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre la composicioacuten
enantiomeacuterica y el peso molecular del aacutecido γ-poliglutaacutemico
Establecer el posible efecto de la presioacuten positiva sobre la tasa de
transferencia de oxiacutegeno en el biorreactor
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 15
6 MARCO TEOacuteRICO
41 Los poliaminoaacutecidos
Los poliaminoaacutecidos son poliamidas formadas por un uacutenico aminoaacutecido
y difieren de las proteiacutenas en muacuteltiples aspectos Las proteiacutenas son
biomoleacuteculas compuestas por una amplia gama de aminoaacutecidos mientras que
los poliaminoaacutecidos estaacuten compuestos uacutenicamente por un solo tipo de
aminoaacutecido al menos en su eje central La siacutentesis de proteiacutenas estaacute dirigida
por el ADN que controla la secuencia especiacutefica de aminoaacutecidos que termina
formando una moleacutecula de una proteiacutena en particular Por su parte los
poliaminoaacutecidos son sintetizados por una ruta metaboacutelica de los organismos
completamente distinta En enlace amida en las proteiacutenas acontece
uacutenicamente entre los grupos α-amino y α-carboxilo mientras que en los
poliaminoaacutecidos pueden verse involucradas otras cadenas laterales
funcionales como por ejemplo los grupos β- y γ-carboxiloy ε-amino(Bajaj amp
Singhal 2011)
Existen mayoritariamente tres poliaminoaacutecidos presentes en la
naturaleza el aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina En
el aacutecido γ-poliglutaacutemico los enlaces amida se forman entre el grupo α-amino y
el γ-carboxilo en el eje central La poli ε-lisina presenta monoacutemeros de lisina
unidos por los grupos α-carboxilo y ε-amino La cianoficina consiste en residuos
de aacutecido α-aspaacutertico que contienen residuos de arginina que penden unidos al
grupo β-carboxilo Las foacutermulas de dichos compuestos se presentan en la
figura 1
42 El aacutecido γshypoliglutaacutemico (γshyPGA)
El aacutecido γ-poliglutaacutemico (de ahora en adelante referido como γ-PGA) es
un poliacutemero inusual que acontece de forma natural anioacutenico soluble en agua
biodegradable comestible y que no resulta toacutexico ni para el ser humano ni para
el ambiente que en la naturaleza es producido por algunas bacterias todas
Gram-positivas una archea e inclusive en eucariotas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 16
Fue primeramente descubierto por Ivaacutenovics y colaboradores como
componente de la caacutepsula de la bacteria Bacillus anthracis despueacutes que se
liberara al medio producto tanto del proceso de autoclavado como por el
envejecimiento y lisis natural de los cultivos La comida tradicional japonesa
ldquoNattordquo estaacute constituida por una mezcla de γ-PGA y fructanos que son
producidos por la bacteria Bacillus natto (Bajaj amp Singhal 2011)
Figura 1 Foacutermula y estructura del aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina
(Fuente Feng et al 2007)
421 Propiedades quiacutemicas y bioquiacutemicas del γshyPGA
El γ-PGA es un poliacutemero polianioacutenico que puede estar compuesto
uacutenicamente por D- L- o por ambos enantioacutemeros del aacutecido glutaacutemico Como se
ha comentado ya es altamente soluble en agua El γ-PGA probablemente
pueda adoptar diferentes estructuras La estructura del γ-PGA ha sido predicha
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 17
asumiendo poliaminoaacutecidos constituidos por 10 o 25 moleacuteculas de aacutecido
glutaacutemico Este modelo teoacuterico calculado para una moleacutecula en solucioacuten
acuosa muestra que el γ-PGA consiste de una heacutelice levoacutegira estabilizada por
enlaces de hidroacutegeno intramoleculares Sin embargo otro estudio realizado a
partir de γ-PGA obtenido de Bacillus licheniformis mostroacute que la conformacioacuten
es realmente flexible y depende de la concentracioacuten de γ-PGA y el pH de la
disolucioacuten A bajas concentraciones (01 wv) y a un pH inferior a 7 el γ-PGA
adopta una conformacioacuten basada mayoritariamente en heacutelices del tipo α
mientras que la conformacioacuten tipo hojas β predomina a pH superiores pues
esta conformacioacuten permite una mejor exposicioacuten de las cargas negativas del γ-
PGA (Candelaamp Fouet 2006) Recientemente mediamente experimentos de
dicroiacutesmo circular se ha reportado una estructura desordenada (Joyce et al
2006 Candela amp Fouet 2006) pero sin detallar las condiciones de trabajo de
los experimentos en particular de pH
El peso molecular del γ-PGA parece variar seguacuten sea el organismo que
produce la moleacutecula sin embargo estas diferencias podriacutean deberse a
diferencias en torno a la degradacioacuten natural que acontece con el poliacutemero o a
los meacutetodos de purificacioacuten y anaacutelisis utilizados mismos que puedan afectar el
tamantildeo del γ-PGA Por ejemplo para el caso de Bacillus subtilis el peso
molecular del γ-PGA variacutea entre 160kDa hasta 1500 kDa las cadenas de γ-
PGA consisten entonces de coacutemo miacutenimo 1000 residuos de aacutecido glutaacutemico
Diferentes estudios enfocados en la siacutentesis microbioloacutegica de γ-PGA han
demostrado que el peso molecular de este poliacutemero es dependiente tanto de
las diversas cepas bacterianas que se empleen asiacute como de los componentes
del medio y las condiciones del medio de cultivo e inclusive de razones auacuten no
dilucidadas De alliacute que exista una gran dificultad para obtener un γ-PGA
altamente homogeacuteneo a partir de cultivos bacterianos esto en gran parte
debido a esta inestabilidad descrita asiacute como a la complejidad molecular
involucrada en su biosiacutentesis
Asiacute mismo el γ-PGA puede contener soacutelo aacutecido D-glutaacutemico soacutelo aacutecido
L-glutaacutemico o una mezcla de ambos enantioacutemeros De alliacute que los filamentos
puedan ser de aacutecido γ-poli-L-glutaacutemico (γ-PLGA) de aacutecido γ-poli-D-glutaacutemico
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 18
(γ-PDGA) o de aacutecido γ-poli-L-D-glutaacutemico (γ-PLDGA) La disposicioacuten de los
residuos en el PLGDA requiere un especial anaacutelisis ya que si bien tanto el
PLGA y el PDGA son ambos solubles en etanol cuando ambos se mezclan en
proporcioacuten equimolar precipitan en etanol Esta observacioacuten es utilizada para
demostrar que el γ-PGA producido por Bacillus licheniformis estaacute compuesto
por cadenas tanto de PLGA como de PDGA Asiacute mismo la digestioacuten con L-
glutamilhidrolasa ha demostrado que el γ-PGA de Bacillus subtilis consiste en
una mezcla de isoacutemeros PLGA y PLDGA
422 Siacutentesis microbioloacutegica de γshyPGA
Distribucioacuten en los microorganismos
Inicialmente el γ-PGA fue detectado como un componente de la pared
capsular de la altamente patogeacutenica bacteria Gram-positiva Bacillus anthracis
Posteriormente este poliacutemero seriacutea nuevamente encontrado presente alrededor
de ceacutelulas de otras bacterias Gram-positivas no patogeacutenicas particularmente
del geacutenero Bacillus Gracias a estos descubrimientos fue posible aislar a inicios
del siglo pasado una cepa de Bacillus capaz de producir grandes cantidades de
γ-PGA
Posteriormente y de manera adicional a estas bacterias formadoras de
endosporas del geacutenero Bacillus el γ-PGA fue encontrado en las eubacterias
haloacutefilas Sporosarcina halophila y Planococcus halophilus y en la
archeobacteria haloacutefila Natrialba aegyptiaca Asiacute mismo γ-PGA fue tambieacuten
detectado en cantidades significativas en nematocistos de Cnidaria (eucariota)
En la tabla 1 se presentan los principales organismos productores de γ-
PGA y algunas de las caracteriacutesticas del γ-PGA producido
Ruta de biosiacutentesis
La conversioacuten de glucosa a γ-PGA sugiere que la siacutentesis del poliacutemero
acontece durante la glicoacutelisis y el ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos (ciclo de
Krebs o del aacutecido ciacutetrico) hasta el 2-oxoglurato (α-cetoglutarato) que es un
precursor directo del aacutecido L-glutaacutemico Durante su crecimiento en un medio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 19
Tabla 1 Organismos que han sido reportados como productores de γ-PGA
ORGANISMO CONFORMACIOacuteN CONFORMACIOacuteN DEL FILAMENTO
Bacillus anthracis D D
Bacillus mesentericus D D
Bacillus licheniformis D y L D y L
Bacillus megaterium D y L D + L
Bacillus pumilus D y L ND
Bacillus subtilis D y L L y D+L
Planococcus halophilus D D
Sporosarcina halophila D D
Staphylococcus
epidermidis
D y L ND
Natrialba aegyptiaca L L
Hydra ND ND
Fuente (Candela amp Fouet 2006)
nutritivo Bacillus licheniformis expresa dos enzimas capaces de sintetizar el
aacutecido L-glutaacutemico la glutamato sintasa y la glutamato deshidrogenasa Ambas
enzimas son praacutecticamente insensibles a la inhibicioacuten por producto lo que
permite alcanzar altas concentraciones intracelulares de aacutecido L-glutaacutemico el
cual es entonces direccionado a la siacutentesis de γ-PGA Los estudios maacutes
detallados relacionados con la polimerizacioacuten del γ-PGA se han realizado con
Bacillus anthracis Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis especialmente
Bacillus licheniformis ATCC9945a lo que ha permitido la identificacioacuten de un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 20
sistema enzimaacutetico anclado a la membrada y denominado como PGA-
sintetasa Este sistema enzimaacutetico estaacute constituido por al menos tres
componentes con actividad enzimaacutetica y se presume que cataliza la siguiente
secuencia de reacciones (Troy 1973) (figura 2)
Aacutecido L-glutaacutemico + ATP ɣ-L-glutamil-AMP + PPi (a)
ɣ-L-glutamil-AMP + SH-enzima ɣ-X-glutamil-S-enzima + AMP (b)
ɣ-X-glutamil-S-enzimaɣ-D-glutamil-S-enzima (c)
ɣ-D-glutamil-S-enzima + [ɣ-D-glutamil]n[ɣ-D-glutamil]n+1 + SH-enzima (d)
Figura 2 Posible mecanismo enzimaacutetico de siacutentesis del γ-PGA (Fuente Ashiuchi 2010)
De acuerdo con este modelo solamente el aacutecido L-glutaacutemico es activado
en el paso (a) mediante fosforilacioacuten lo que significa que la biosiacutentesis del γ-
PGA requiere el suministro de energiacutea para la formacioacuten del enlace amida Maacutes
recientemente un segundo mecanismo ha sido descrito por Ashiuchi (2001) e
involucra un complejo enzimaacutetico denominado PgsBCA el cual es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico y donde la
polimerizacioacuten ocurre por un mecanismo de ligacioacuten tipo amida (figura 3)
Inicialmente se habiacutea descrito que el complejo enzimaacutetico era el responsable
de racemizar y polimerizar el aacutecido glutaacutemico sin embargo estas nuevas
evidencias parecen demostrar que el complejo enzimaacutetico involucrado en la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 21
siacutentesis de γ-PGA carece de actividad racemasa y que la formacioacuten del aacutecido
D-glutaacutemico es responsabilidad de una enzima citosoacutelica denominada aacutecido
glutaacutemico racemasa Glr que presenta una alta selectividad por el aacutecido
glutaacutemico y una mayor preferencia por el aacutecido L-glutaacutemico Un modelo de la
viacutea metaboacutelica mayoritariamente aceptada para la siacutentesis de γ-PGA se
presente en la figura 4
Figura 3 Mecanismo propuesto de biosiacutentesis del γ-PGA mediante ligacioacuten tipo amida
(Fuente Ashiuchi 2001)
Figura 4 Viacutea metaboacutelica de biosiacutentesis del γ-PGA (Fuente Buescher amp Margaritis 2007)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 22
Organizacioacuten geneacutetica
Solamente unas pocas bacterias la mayoriacutea dentro del geacutenero Bacillus
han sido reportadas como capaces de producir γ-PGA Asiacute mismo la
produccioacuten de γ-PGA no es uniforme en estos individuos inesperadamente
variacutea inclusive bajo condiciones de cultivo altamente estrictas De alliacute que la
identificacioacuten del sistema regulatorio y los genes involucrados en dicho sistema
es vital para dar solucioacuten a estos problemas de uniformidad y rendimiento El
complejo PGA-sintetasa estaacute codificado por cuatro loci que son denominados
pgs Los cuatro genes pgs son pgsB pgsC pgsAA y pgsE y se les denomina
en conjunto pgsBCA Todos estos genes son necesarios y suficientes para la
produccioacuten de γ-PGA in vivo La figura 5 muestra los elementos geneacuteticos
requeridos para la produccioacuten de γ-PGA en diferentes especies del genero
Bacillus
Figura 5 Elementos geneacuteticos necesarios para la siacutentesis de γ-PGA (Fuente Candela amp
Fouet 2006)
423 Produccioacuten fermentativa de γshyPGA
Diferentes cepas de bacterias del geacutenero Bacillus son capaces de
producir elγ-PGA ya sea como material viscoso extracelular o como
componente capsular En termino industrial estas cepas han sido las maacutes
utilizadas y por ende las maacutes estudiadas hasta el momento La mayor parte de
los estudios han estado orientados a determinar los requerimientos
nutricionales para el adecuado crecimiento celular asiacute como mejorar la
productividad de γ-PGA y la variacioacuten en la composicioacuten de su estructura en lo
referente al contenido de aacutecido L- y D-glutaacutemico Estos estudios como los
realizados por Troy (1973) Cromwicket al (1995) y Kunioka (1997) han
permitido determinar que los requerimientos nutricionales para la produccioacuten de
γ-PGA variacutean seguacuten sea la cepa que se emplea
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 23
De acuerdo a estos requerimientos nutricionales las cepas productoras
de γ-PGA se han dividido en dos grupos uno que requiere la adicioacuten de aacutecido
L-glutaacutemico al medio de cultivo para estimular la produccioacuten de γ-PGA y el
crecimiento celular y otro que no requiere de aacutecido L-glutaacutemico para la
produccioacuten de γ-PGA
Dentro de las bacterias dependientes de aacutecido L-glutaacutemico las cepas
maacutes promisorias han sido B anthracis B licheniformis ATCC9945a B subtilis
IFO3335 y B subtilis F-2-01 Por su parte dentro de las bacterias
independientes de aacutecido L-glutaacutemico encontramos mayoritariamente los caso s
de B subtilis 5E B subtilis TAM-4 y B licheniformis A35 B subtilis 5E puede
producir γ-PGA a partir de L-prolina como uacutenica fuente de carbono
complementado con una fuente de nitroacutegeno en un medio mineral B
licheniformis A35 produce γ-PGA a partir de glucosa y cloruro de amonio en
condiciones desnitrificantes y B subtilis TAM-4 produce grandes cantidades de
γ-PGA cuando crece en un medio de cultivo con una sal de amonio y azuacutecar
como fuentes de nitroacutegeno y carbono respectivamente Asiacute mismo ademaacutes de
la fuente de carbono y nitroacutegeno existen otra serie de factores tales como
fuerza ioacutenica del medio de cultivo pH del medio de cultivo aireacioacuten entre
otros que afectan en gran medida la productividad y calidad del γ-PGA
De primera impresioacuten pareciera conveniente el empleo de las cepas
independientes de aacutecido L-glutaacutemico para la produccioacuten industrial de γ-PGA
sin embargo la informacioacuten disponible en lo referente a la ruta biosinteacutetica el
mecanismo de formacioacuten del γ-PGA y los factores que afectan la productividad
es praacutecticamente nula para estas cepas A partir de los trabajos de
investigacioacuten y los estudios de aplicaciones industriales la produccioacuten de γ-
PGA se ha llevado a cabo mayoritariamente a partir de cepas dependientes de
aacutecido L-glutaacutemico
En la tabla 2 se presentan algunas de las principales cepas bacterianas
empleadas para la produccioacuten de γ-PGA los nutrientes las condiciones de
cultivo el rendimiento obtenido asiacute como los voluacutemenes de cultivo en que se
basan dichos reportes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 24
Tabla 2 Principales bacterias productoras de γ-PGA (Shih amp Van 2001)
CEPA
NUTRIENTES
CONDICIONES DE CULTIVO
RENDIMIENTO
VOLUMEN DE
TRABAJO B licheniformis ATCC9945a
Aacutecido glutaacutemico (20 gL) aacutecido ciacutetrico (12 gL) NH4Cl (7 gL)
30ordmC 4 diacuteas 17-23 gL 100 mL
B subtilis IFO 3335
Aacutecido glutaacutemico (30 gL) aacutecido ciacutetrico (20 gL)
37ordmC 2 diacuteas 10-20 gL 125 mL
B subtilis TAM-4
Fructosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 4 diacuteas 20 gL 100 mL
B licheniformis A35
Glucosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 3-5 diacuteas 8-12 gL 100 mL
B subtilis F02-1
Aacutecido glutaacutemico(70 gL) glucosa (1 gL)
30ordmC 2-3 diacuteas 50 gL 200 mL
B subtilis (natto)
Maltosa (60 gL) salsa de soya (70 gL) glutamato soacutedico (30 gL)
40 ordmC 3-4 diacuteas 35 gL 125 mL
Fuente Shih amp Van 2001
424 Produccioacuten de γshyPGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a
Generalidades de la bacteria Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis es una bacteria comuacutenmente encontrada en el
suelo y en las plumas de las aves Es gram-positiva de forma oval y mesoacutefila
Su temperatura oacuteptima de crecimiento se encuentra alrededor de los 30 ordmC
aunque es capaz de sobrevivir a temperaturas mucho mayores La temperatura
oacuteptima para la secrecioacuten de enzimas es de 37 ordmC Esta bacteria puede existir
como espora cuando las condiciones son inadecuadas o en estado vegetativo
cuando las condiciones le son maacutes favorables (Wecke et al 2006)
Bacillus licheniformis forma parte del grupo Subtilis junto con Bacillus
subtilis y Bacillus pumilus Estas bacterias son conocidas por ser
contaminantes comunes de alimentos asiacute como favorecer su descomposicioacuten
aunque no se consideran patoacutegenos de importancia para el ser humano
(Wecke et al 2006)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 25
La cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis y la siacutentesis de γ-PGA
La produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a fue
primeramente estudiada por Bovarnick en 1942 sin embargo no fue sino a
partir de 1954 cuando Thorne y colaboradores iniciaron una serie de estudios
sistemaacuteticos orientados a investigar los factores que afectan la produccioacuten de
γ-PGA lo que permitioacute determinar algunos factores y condiciones necesarios
para lograr mayores rendimientos Factores tales como presencia de ciertas
sales inorgaacutenicas aacutecido glutaacutemico aacutecido ciacutetrico glicerol y el tamantildeo del inoacuteculo
demostraron tener efectos importantes sobre el rendimiento de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a tanto en condiciones estaacuteticas como cultivos
bajo agitacioacuten Se encontroacute que los mejores rendimientos se produciacutean cuando
el microorganismo era cultivado en agitacioacuten orbital en un medio de cultivo
denominado como medio C (tabla 3) alcanzando una productividad de hasta
15 gL en un periacuteodo de 3-4 diacuteas Asiacute mismo la mayor produccioacuten de poliacutemero
soacutelo se alcanzaba cuando se empleaba agua de grifo y un lote especiacutefico de
FeCl3 Posteriormente se determinariacutea que dicho lote de FeCl3 estaba
contaminado con trazas de Mn2+ y que el agua de grifo conteniacutea cantidades
significativas de Ca2+ Posteriormente Leonard y colaboradores (1958) se
encargariacutean de comprobar la funcioacuten y concentracioacuten oacuteptima de ambos
elementos quiacutemicos mediante la elaboracioacuten de un medio de cultivo
quiacutemicamente definido tomando como base el medio C de Thorne
Tabla 3 Composicioacuten del medio de cultivo C (Thorne et al 1954)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua de grifo
Fuente Shih amp Van 2001
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 26
Leonard y colaboradores encontraron que aunque solamente se requeriacutea
de 15 x 10-7 moles por litro de Mn2+ para alcanzar el maacuteximo crecimiento
concentraciones mayores de Mn2+ mostraban un marcado efecto prolongando
la viabilidad celular y por consiguiente incrementando la productividad de γ-
PGA Un incremento de hasta 615 x 10-4 molL en la concentracioacuten de Mn2+
permitiacutea alcanzar los mayores rendimientos de γ-PGA De igual manera la
adicioacuten de 102 x 10-3 moles por litro de Ca2+ en presencia de 15 x 10-7 moles
por litro de Mn2+ permitiacutea alcanzar auacuten mayores rendimientos deγ-PGA en
comparacioacuten a los valores oacuteptimos de produccioacuten de poliacutemero obtenidos en
ausencia de este elemento El γ-PGA producido consistiacutea en un homopoliacutemero
de unidades repetidas de aacutecido D- y L-glutaacutemico con una concentracioacuten de
aacutecido D-glutaacutemico que variaba entre el 38 y el 86 seguacuten incrementaba la
concentracioacuten de Mn2+ entre 154 x 10-7 y 246 x 10-3 molL siendo esta
observacioacuten independiente de la concentracioacuten presente en el medio de cultivo
de Ca2+
Tabla 4 Composicioacuten del medio E revisado (Leonard et al 1958)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 0000026 a
042 CaCl22H2O 015 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua destilada
Fuente Shih amp Van 2001
A partir de estos resultados Leonard y colaboradores elaboraron el
medio de cultivo denominado Medio E (tabla 4) que es baacutesicamente el medio
original C exceptuando el hecho de que cantidades definidas de Mn2+ y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 27
Ca2+fueron agregadas El Ca2+ fue adicionado con el propoacutesito de asegurar
altas productividades de poliacutemero a cualquier concentracioacuten de Mn2+ que se
empleara mientras que la variacioacuten de la concentracioacuten de este uacuteltimo
elemento permitiriacutea alcanzar el contenido enantiomeacuterico deseado en el
poliacutemero tal y como se comentoacute anteriormente
La estereoquiacutemica del poliacutemero es decir el contenido enantiomeacuterico del
γ-PGA ha sido desde el inicio de las investigaciones uno de los problemas maacutes
complejos y de difiacutecil solucioacuten y de una importancia tanto fundamental como
praacutectica en lo que se refiere al estudio de la produccioacuten de γ-PGA en bacterias
A lo largo de todos estos antildeos han existido numerosas contradicciones entre
los investigadores en cuanto a si el contenido enantiomeacuterico del γ-PGA
producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a estaacute o no afectado por la
concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo Cromwick y Gross (1995)
realizaron un estudio profundo sobre los factores que influenciaban la
produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a Dicho estudio
encontroacute que el porcentaje de aacutecido L-glutaacutemico presente en el γ-PGA variaba
entre 59 y 10 cuando las concentraciones de Mn2+ variaban entre 0 y 615
μmolL asiacute mismo el rendimiento incrementaba desde los 5 hasta los 17 gL en
dicho intervalo de concentracioacuten de Mn2+
Cromwick y Gross (1995) encontraron en este mismo estudio que la
incorporacioacuten de Mn2+ al medio de cultivo es un factor criacutetico para la
conservacioacuten de la viabilidad celular durante periodos de cultivo prolongados
El nuacutemero de ceacutelulas viables se incrementaba del orden de 105 a 109 unidades
formadoras de colonias (ufc) para todas las concentraciones de Mn2+ hasta el
inicio de la fase estacionaria aproximadamente a las 24 horas Sin embargo
despueacutes de 50 horas de cultivo la viabilidad celular se veiacutea reducida
draacutesticamente para aquellas concentraciones de Mn2+ relativamente menores
(0 a 0615 μmolL) mientras que para las concentraciones mayores (338 a 615
μmolL) el nuacutemero de ceacutelulas viables se manteniacutea en el orden de 107-109
inclusive despueacutes de 140 horas de cultivo Asiacute mismo la presencia de Mn2+ en
concentraciones entre 338 y 615 μ incrementaba la utilizacioacuten de las fuentes
de carbono en gran medida cultivos que conteniacutean 615 μmolL de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 28
Mn2+utilizaban el 37 54 y 93 del aacutecido glutaacutemico el glicerol y el aacutecido
ciacutetrico respectivamente en comparacioacuten a aquellos cultivos que no
incorporaban el Mn2+ los cuales solo utilizaban el 19 10 y 17 del aacutecido
glutaacutemico el glicerol y el aacutecido ciacutetrico respectivamente
Uno de los problemas maacutes prolongados en torno a los estudios referidos
a la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC994a es el hecho de
que el microorganismo termina degenerando en una cepa incapaz de producir
γ-PGA despueacutes de cultivo repetitivo Esta inestabilidad exhibida por este
microorganismo es responsable de una gran variacioacuten de cultivo en cultivo en
lo referente a la cantidad y la cineacutetica de formacioacuten del γ-PGA Birrer y
colaboradores (1994) encontraron que el empleo de ceacutelulas vegetativas
criogeacutenicamente congeladas permitiacutea alcanzar un crecimiento y produccioacuten de
poliacutemero consistente de cultivo en cultivo Asiacute mismo y en congruencia con
otros estudios previamente realizados se encontroacute que el crecimiento celular
ocurriacutea baacutesicamente durante las primeras 24 h la mayor productividad
volumeacutetrica de γ-PGA era de 012 gmiddotL-1middoth-1 y se alcanzaba entre los diacuteas 2 y 4
el pH caiacutea de 74 a aproximadamente 5 despueacutes de 42 horas de cultivo e
incrementaba levemente a cerca de 6 despueacutes de 96 horas de cultivo el
empleo de glicerol glutamato y citrato se reduciacutea de 80 a 45 gL 18 a 10 gL y
de 12 a 1 gL respectivamente la produccioacuten de aacutecido aceacutetico hasta un nivel
maacuteximo de 45 gL asiacute como la presencia de 23-butanediol como producto
secundario entre las 42 y las 96 h El estudio del consumo de las fuentes de
carbono resulta un poco sorprendente pues demuestra unas tasas de
consumo del aacutecido ciacutetrico y de glicerol relativamente altas sin embargo para el
caso del aacutecido glutaacutemico dicha tasa de consumo fue por mucho menor y muy
lejana del agotamiento completo de dicha fuente Asiacute mismo la remocioacuten del
aacutecido L-glutaacutemico del medio de cultivo E afectaba en poca medida el
rendimiento en γ-PGA mientras que la remocioacuten de las otras fuentes (glicerol y
aacutecido ciacutetrico) disminuye de manera draacutestica la produccioacuten de γ-PGA Estos
resultados son contradictorios a los encontrados inicialmente por Thorne y
colaboradores (1954) e indica que Bacillus licheniformis ATCC9945 no requiere
de aacutecido L-glutaacutemico para alcanzar altas productividades de γ-PGA Asiacute mismo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 29
la presencia de 23-butanediol es indicador que los niveles de oxiacutegeno en el
medio de cultivo despueacutes de 42 horas son incapaces de sostener un
metabolismo 100 aeroacutebico esto no es de sorprender pues el γ-PGA es un
poliacutemero extracelular extremadamente viscoso y tasas cada vez menores de
transporte de oxiacutegeno son esperables conforme va aumentado la viscosidad en
el medio a medida que la concentracioacuten de γ-PGA se incrementa
Un trabajo de Cromwick y Gross (1996) estudioacute el efecto del pH y la
aireacioacuten sobre la productividad en γ-PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a en condiciones de fermentacioacuten por lotes El pH fue controlado en
los valores de 55 65 74 y 825 y se determinoacute su efecto sobre el crecimiento
celular la utilizacioacuten de las fuentes de carbono la productividad en γ-PGA el
peso molecular y la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA El mayor
rendimiento en γ-PGA se obtuvo a un pH de 65 (15 gL 96 horas de cultivo) y
decrecioacute significativamente en 55 y 74 Esto coincide con el hecho que el
consumo de glicerol y de aacutecido L-glutaacutemico se mantuvo invariable en funcioacuten
del pH sin embargo la mayor tasa de consumo de aacutecido ciacutetrico se observoacute a un
pH de 65 en contraste con 55 y 74 lo cual parece indicar que el metabolismo
del aacutecido ciacutetrico juega un papel importante a dicho valor de pH Previamente
Cromwick y Gross (1995) encontraron que el aacutecido ciacutetrico es efectivamente un
precursor en la produccioacuten del poliacutemero presumiblemente a traveacutes del ciclo de
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De igual manera la alteracioacuten del pH no mostroacute
ninguacuten efecto importante en cuanto al peso molecular y la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA El efecto de la aireacioacuten fue evaluado incrementando
la velocidad de agitacioacuten entre 250 y 800 rpm y la tasa de aireacioacuten entre los
05 y los 20 Lmin a un pH de 65 observaacutendose un incremento en las tasas de
crecimiento y los rendimientos de γ-PGA conforme el suministro de oxiacutegeno
incrementaba
A pesar de la intensa investigacioacuten que se ha llevado a cabo en lo
referente a la produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a el
mecanismo y las viacuteas biosinteacuteticas especiacuteficas por las cuales el poliacutemero es
producido auacuten no han logrado ser dilucidadas con total claridad a pesar de que
no se cuestione le hecho de que efectivamente acontece a traveacutes del ciclo de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 30
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De las tres fuentes de carbono presentes en el medio
de cultivo E el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido L-glutaacutemico constituyen dos sustratos
precursores para la produccioacuten de dicho poliacutemero sin embargo en lo referente
al glicerol auacuten no queda claro como este incrementa la formacioacuten de poliacutemero
maacutes allaacute del hecho de que Troy (1973) encontroacute que el complejo enzimaacutetico
PGA-sintetasa responsable de la polimerizacioacuten del aacutecido L-glutaacutemico a γ-
PGA es estimulada por la presencia de glicerol Considerando que la viacutea de
biosiacutentesis del γ-PGA efectivamente involucra el ciclo de los aacutecidos
tricarboxiacutelicos cualquier fuente de carbono no relacionada directamente como
el glicerol o la glucosa podriacutean en principio ser una fuente primaria de carbono
para el crecimiento celular y la produccioacuten de γ-PGA Efectivamente el empleo
de glucosa como principal fuente de carbono y cantidades traza de aacutecido ciacutetrico
y aacutecido L-glutaacutemico (05 gL) permitieron alcanzar un rendimiento en γ-PGA de
12 gL en cultivos de Bacillus licheniformisATCC9945a (Ko amp Gross 1998) Sin
embargo y a pesar de este hecho Du y colaboradores (1995) encontraron otra
posible explicacioacuten al incremento del rendimiento en presencia de glicerol Ellos
encontraron que en Bacillus licheniformis ATCC9945a las altas
concentraciones de glicerol en el medio de cultivo conllevan a un cambio en la
composicioacuten de los fosfoliacutepidos de la membrana celular incrementando la
proporcioacuten de los fosfoliacutepidos C120 y C101 y reduciendo la de fosfoliacutepidos
C181 y C161 lo que parece favorecer la formacioacuten de una membrana celular
menos compacta lo que conlleva a una efectiva excrecioacuten del γ-PGA fuera de
la membrana celular
En lo referente a produccioacuten a gran escala y en buacutesqueda de la
aplicacioacuten comercial del γ-PGA en grandes cantidades resulta maacutes que
evidente la necesidad de incrementar la productividad Yoon y colaboradores
(2000) desarrollaron una estrategia para la produccioacuten de γ-PGA con un alto
rendimiento mediante cultivo en lote alimentado de Bacillus licheniformis
ATCC9945a Mediante el empleo de un bioreactor de 25 L conteniendo 1 L de
medio de cultivo y bajo condiciones de pH y temperatura de 65 y 37ordmC
respectivamente un 40 de saturacioacuten de oxiacutegeno y una velocidad de
agitacioacuten de 1000 rpm lograron alcanzar una concentracioacuten maacutexima de γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 31
de 35 gL suministrando aacutecido ciacutetrico y aacutecido L-glutaacutemico a una velocidad de
alimentacioacuten de 02 mLmin (144 gh de aacutecido ciacutetrico y 24 gh de aacutecido
glutaacutemico) por un periacuteodo de 3 h despueacutes del agotamiento del aacutecido ciacutetrico
inicial lo cual aconteciacutea alrededor de las 22 h La productividad alcanzada fue
de 1 gmiddotl-1middoth-1
425 Purificacioacuten del γshyPGA
Dado que la produccioacuten del γ-PGA es mayoritariamente extracelular en
concreto en la cepa de intereacutes para el presente estudio la de Bacillus
licheniformis ATCC9945a la purificacioacuten del poliacutemero es directa y consta de
manera general de tres pasos I) la remocioacuten de las ceacutelulas mediante
centrifugacioacuten o filtracioacuten 2) la precipitacioacuten del producto del medio libre de
ceacutelulas mediante metanol etanol o 1-propanol y 3) la diaacutelisis para la remocioacuten
de impurezas de pequentildeo peso molecular
Du y colaboradores (2001) desarrollaron una estrategia eficiente para la
separacioacuten y recuperacioacuten delγ-PGA de caldos altamente viscosos Esta
consiste en dos procesos I) Separar el γ-PGA del caldo de cultivo viscoso y II)
Concentrar la solucioacuten de PGA por ultrafiltracioacuten con el propoacutesito de reducir la
cantidad de alcohol requerida en el proceso de separacioacuten Las ceacutelulas
encapsuladas con γ-PGA poseen carga negativa cerca del valor neutro de pH
esto debido a la ionizacioacuten del grupo carboxilo en las moleacuteculas de γ-PGA Esta
carga negativa en sus superficies les confiere a las ceacutelulas una alta estabilidad
en el medio de cultivo lo que dificulta la sedimentacioacuten de las ceacutelulas durante el
proceso de separacioacuten Esta alta estabilidad asiacute como la elevada viscosidad del
caldo de cultivo son los dos principales problemas que se enfrentan cuando se
trata de separar las ceacutelulas y el γ-PGA del medio de cultivo por lo cual la
reduccioacuten de ambas es vital para una eficiente recuperacioacuten del γ-PGA
Mediante la disminucioacuten del pH es posible reducir el nuacutemero de cargas
negativas sobre la superficie de las ceacutelulas lo que favorece su faacutecil agregacioacuten
y precipitacioacuten Esto permite reducir en hasta un 17 la energiacutea requerida para
una adecuada centrifugacioacuten del caldo de cultivo a un pH de 5 En lo referente
a los requerimientos de alcohol es conocido que un 75-80 del mismo es
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 32
requerido para la precipitacioacuten del γ-PGA presente en un caldo libre de ceacutelulas
a una concentracioacuten de 1-2 Dado que la cantidad de alcohol requerida
disminuye a medida que la concentracioacuten de γ-PGA aumenta es necesaria y
ventajoso sino la concentracioacuten del γ-PGA presente en el medio de cultivo libre
de ceacutelulas a lo largo del proceso de recuperacioacuten Asiacute es posible reducir en un
25 el alcohol requerido para precipitar una solucioacuten de γ-PGA que fue
concentrada de 20 gL a 60 gL mediante ultrafiltracioacuten a un pH de 5
Asiacute mismo y dada la naturaleza anioacutenica del γ-PGA es posible que el
empleo de la cromatografiacutea de intercambio ioacutenica constituya una herramienta
importante para la purificacioacuten de este poliacutemero
426 Control del peso molecular y degradacioacuten del γshyPGA
El peso molecular es una caracteriacutestica importante del γ-PGA microbiano
debido al efecto que tiene el tamantildeo molecular en las propiedades del
poliacutemero El γ-PGA producido por bacterias del geacutenero Bacillus por lo general
presenta un relativamente alto peso molecular Un poliacutemero de alto peso
molecular es uacutetil como agente espesante pero no es uacutetil para otros usos
debido a la alta viscosidad que lo vuelve difiacutecil de modificar quiacutemicamente
mediante la adicioacuten de alguacuten reactivo quiacutemico De acuerdo con el uso que se
pretenda dar es necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso
molecular por ejemplo en lo referente al empleo del γ-PGA en sistemas de
liberacioacuten de faacutermacos o en el disentildeo de faacutermacos polimeacutericos resulta
necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso para controlar el nivel de
liberacioacuten en los distintos tejidos (Shih et al 2001) Es evidente entonces que el
control del peso molecular del γ-PGA no es solamente un asunto de
importancia fundamental o teoacuterica sino de importancia praacutectica para el
desarrollo de aplicaciones comerciales para este poliacutemero Entre los meacutetodos
que se han empleado para la obtencioacuten de γ-PGA con diferentes pesos
moleculares encontramos la hidroacutelisis alcalina la degradacioacuten ultrasoacutenica la
degradacioacuten microbiana o enzimaacutetica y la alteracioacuten de la composicioacuten del
medio de cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 33
En otro estudio Birrer y colaboradores (1994) encontraron que la
variacioacuten de la fuerza ioacutenica del medio de cultivo mediante la adicioacuten de un 4
(pv) de NaCl conllevaba a la formacioacuten de un γ-PGA de un peso molecular
relativamente mayor
A la fecha existen pocos estudios sobre la biodegradacioacuten microbiana o
enzimaacutetica del γ-PGA a moleacuteculas de menor peso molecular sin embargo es
importante sentildealar que en la mayoriacutea de estudios sobre siacutentesis de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a se sugiera la posible existencia de una
enzima ldquodespolimerasardquo responsable de la descomposicioacuten del γ-PGA Lo que
inicialmente se observaba como una reduccioacuten en la viscosidad del medio de
cultivo con el tiempo o bajo ciertas condiciones demostroacute ser una enzima
poliglutamil-γ -hidrolasa responsable de la ruptura hidroliacutetica del γ-PGA en esta
cepa de Bacillus (King et al 2000) Curiosamente la enzima mostroacute ser
activada por la presencia de iones Zn2+ y Ca2+ y tener una alta afinidad por el γ-
PGA
427 Aplicaciones del γshyPGA
Dada la naturaleza del γ-PGA al ser un poliacutemero no toacutexico
biodegradable y cuya produccioacuten puede ser no tan costosa se han sugerido
gran cantidad de aplicaciones durante la uacuteltima deacutecada El γ-PGA de alto peso
molecular es decir mayor a 106 Da es el preferible en gran parte de las
aplicaciones aunque si bien existen otra serie de aplicaciones que se
presentaran a continuacioacuten y que podriacutean demandar diferentes caracteriacutesticas
Es importante destacar eso siacute que salvo las aplicaciones meacutedicas el resto
considera como indiferente la proporcioacuten de aacutecido D-glutaacutemico y de aacutecido L-
glutaacutemico presente en el γ-PGA
Alimentos
Existe una amplia gama de aplicaciones para el γ-PGA en la industria de
alimentos y sus derivados En jugos y otras bebidas el γ-PGA colabora en el
mejoramiento del sabor y su potabilidad Otra aplicacioacuten importante existe en
alimentos soacutelidos a base de harina de trigo como por ejemplo pan pasteles o
pasta donde la adicioacuten de γ-PGA ha demostrado retrasar el envejecimiento y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 34
mejorar la textura asiacute como permitir una mayor conservacioacuten de la forma Para
estas aplicaciones el γ-PGA recomendable es el de alto peso molecular
Asiacute mismo el γ-PGA ha demostrado poseer propiedades
anticongelantes propiedad que se ve incrementada conforme el tamantildeo del
poliacutemero se reduce Esto permitiriacutea emplear el γ-PGA en la conservacioacuten de
alimentos microorganismos y enzimas Debido a que las sales de este
poliacutemero tienen poco sabor por siacute mismas pueden ser empleadas en mayores
concentraciones en comparacioacuten con otros agentes anticongelantes tales como
la glucosa Aunque esta aplicacioacuten es dependiente del tipo de sal del poliacutemero
empleada es independiente de la proporcioacuten de aacutecido L- y D-glutaacutemico
presente en el poliacutemero Asiacute mismo la adicioacuten de γ-PGA en productos
alimenticios que contengan sustancias activas bioloacutegicamente como por
ejemplo carotenoides vitaminas o polifenoles incrementa la absorcioacuten de
dichas sustancias en el intestino delgado
Fertilizante
Es posible producir grandes cantidades de biomasa y γ-PGA a partir de
medios liacutequidos con estieacutercol glicerol aacutecido ciacutetrico y otras sales inorgaacutenicas
resultando un producto que funciona como un fertilizante de liberacioacuten lenta
cuando es aplicado en los campos de cultivo Dado que el γ-PGA es
particularmente inerte a la gran mayoriacutea de las proteasas la liberacioacuten de
nitroacutegeno puede verse reducida auacuten maacutes Inclusive es posible producir dicho
fertilizante mediante fermentacioacuten en fase soacutelida lo que podriacutea resultar auacuten
maacutes ventajoso en ciertos casos pues permite utilizar como co-sustrato de
fermentacioacuten productos agriacutecolas tales salvado de trigo soya o maiacutez Es
importante sentildealar que para dicha aplicacioacuten la proporcioacuten de aacutecido L- y D-
glutaacutemico presente en el poliacutemero es indiferente
Tratamiento de aguas residuales
Debido a la actividad de floculacioacuten que este poliacutemero presenta el
empleo del γ-PGA en el tratamiento de aguas residuales ha sido investigado en
muacuteltiples estudios demostrando una gran capacidad de absorcioacuten y afinidad
por el Cu2+ Adicionalmente se ha demostrado el requerimiento de iones
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 35
multivalentes tales como el Ca2+ Fe3+ y Al3+ para mejorar su actividad
floculante bajo ciertas condiciones
Asiacute mismo tambieacuten se ha empleado el γ-PGA entrecruzado mediante
radiacioacuten γ el cual ha demostrado ser eficiente en la clarificacioacuten de agua
tuacuterbida a concentraciones tan bajas como 1 mgkg
Bioplaacutesticos
La posibilidad de emplear eacutesteres de γ-PGA como plaacutestico
biodegradable tambieacuten constituye otra aplicacioacuten interesante de este poliacutemero
a pesar de que por el momento su costo es todaviacutea muy elevado como para
asegurar el eacutexito comercial Mediante la modificacioacuten de los grupos eacutester es
posible disentildear un plaacutestico que cumpla los requisitos de muacuteltiples propoacutesitos
asiacute mismo los eacutesteres de γ-PGA han demostrado ser maacutes estables a altas
temperaturas que sus respectivas sales de sodio
Hidrogeles
La formacioacuten de hidrogeles por parte de γ-PGA con o sin la adicioacuten de
poliacutemeros adicionales da origen a una amplia gama de novedosas
aplicaciones ya que las propiedades fiacutesicas del gel pueden ser controladas
para cumplir una amplia variedad de necesidades
Mediante irradiacioacuten γ de 19 kGy es posible generar un hidrogel a base
de γ-PGA con un contenido especiacutefico de agua de 3500 Esto constituye un
meacutetodo conveniente y sencillo para gelificar el γ-PGA sin necesidad de
poliacutemeros o entrecruzadores
Los hidrogeles pueden ser empleados en muacuteltiples aplicaciones como en
la liberacioacuten controlada de faacutermacos el disentildeo de biosensores operaciones de
diagnoacutestico e inclusive hasta bioseparadores pueden ser obtenidos a partir de
γ-PGA y PEG-metacrilato Los hidrogeles obtenidos de esta forma poseen la
cineacutetica de liberacioacuten deseada para partiacuteculas de distinto tamantildeo tales como
pequentildeos peacuteptidos proteiacutenas o inclusive ceacutelulas completas (Bajaj amp Singhal
2011)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 36
Una manera sencilla de obtener hidrogeles de γ-PGA es a traveacutes de la
adicioacuten de peroacutexido como entrecruzador al caldo de fermentacioacuten crudo dicho
hidrogel puede emplearse como absorbente de agua en muacuteltiples aplicaciones
que incluyen agricultura horticultura y construccioacuten civil
De igual manera tambieacuten se ha demostrado que los hidrogeles pueden
ser empelados para la liberacioacuten lenta y controlada de faacutermacos en particular
aquellos formados por α-L-PGA y PEG-metacrilato Hidrogeles formados por un
72 deγ-PGA sulfonado y el resto en γ-PGA han demostrado resultados
promisorios en la liberacioacuten controlada de faacutermacos con una liberacioacuten
praacutecticamente nula a un pH de 74 sin embargo a un pH menor a 65 como el
observado en los tejidos inflamados la liberacioacuten del faacutermaco incrementaba
considerablemente
Transportador de faacutermacos
Dado a su biodegradabilidad y biocompatibilidad el γ-PGA constituye un
biopoliacutemero de particular intereacutes en el desarrollo de faacutermacos de liberacioacuten
controlada tal y como se ha sentildealado previamente Dada la presencia de
grupos carboxilo en las cadenas laterales del poliacutemero que pueden
interaccionar con los grupos funcionales presentes en otros agentes
quimioterapeacuteuticos el γ-PGA permite obtener faacutermacos maacutes solubles y faacuteciles
de administrar Inclusive el conjugado faacutermaco-γ-PGA puede ingresar a las
ceacutelulas diana e irse degradando lentamente mientras libera el agente
farmacoloacutegico y a la vez el aacutecido glutaacutemico producido durante su degradacioacuten
puede ingresar directamente al metabolismo celular o ser excretado a traveacutes
del rintildeoacuten (Bajaj amp Singhal 2011)
Uno de los conjugados maacutes prometedores y estudiados hasta el
momento ha sido con el agente anticanceriacutegeno Paclitaxel Dichos conjugados
Paclitaxel-γ-PGA han demostrado presentar un perfil farmacocineacutetico distinto
capaz de proveer una alternativa hidrosoluble a las formulaciones habituales de
este faacutermaco Tambieacuten estos conjugados han mostrado una respuesta
antitumoral marcadamente superior en comparacioacuten con el Paclitaxel soacutelo
tanto en tejidos murinos como humanos Asiacute mismo estos conjugados han
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 37
mostrado reducir la TCD50 (dosis letal media contra ceacutelulas canceriacutegenas) de
una sola irradiacioacuten de 539 Gy a 75 Gy sin afectar la respuesta radioloacutegica de
los tejidos normales sanos
Adhesivos bioloacutegicos
Los adhesivos bioloacutegicos son empleados para la adhesioacuten de tejidos
homeostasis y para el sellado de fugas de liacutequidos o aire en los tejidos durante
una cirugiacutea En la actualidad el adhesivo de mayor uso es la fibrina la cual
presenta un pobre adhesioacuten a los tejidos Un poliacutemero formado por el
entrecruzamiento del γ-PGA y gelatina ha demostrado un gran potencial para
ser empleado como adhesivo quiruacutergico y agente homeostaacutetico conservando la
capacidad de ser degradado lentamente por el cuerpo sin causar respuestas
inflamatorias severas y a la vez solidificando tan raacutepido como la fibrina pero con
una mayor adherencia a los tejidos Similares hallazgos se han obtenido con
poliacutemeros formados del entrecruzamiento de γ-PGA y colaacutegeno porcino (Bajaj
amp Singhal 2011)
Cosmeacuteticos
El γ-PGA puede ser empleado como componente de valor agregado en
la elaboracioacuten de cosmeacuteticos y productos para el cuidado personal tales como
humectantes exfoliantes y antiarrugas Dada sus propiedades quiacutemicas el γ-
PGA es homogeacuteneamente miscible asiacute como quiacutemicamente estable en la gran
mayoriacutea de los ingredientes tiacutepicamente empleados para la elaboracioacuten de
cremas faciales Asiacute mismo ciertas calidades de γ-PGA son capaces de
producir peliacuteculas suaves elaacutesticas humectantes y suaves sobre la piel Dado
que se trata de un humectante natural hidrofiacutelico formidable el γ-PGA ha
demostrado en combinacioacuten con extractos de Aloe vera promover la produccioacuten
natural de factores humectantes tales como aacutecido pirrolidona-carboxiacutelico aacutecido
laacutectico y aacutecido urocaacutenico A nivel microscoacutepico esto se explica por el hecho de
que los hidrogeles de γ-PGA son capaces de absorber hasta 5000 veces su
propio peso en humedad lo que permitiriacutea incrementar de gran manera las
propiedades humectantes de muchos productos cosmetoloacutegicos con la adicioacuten
de γ-PGA algunos electrolitos y el ajuste a un pH adecuado
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 38
Adyuvante en vacunas
El γ-PGA ha demostrado que es capaz de generar una mejor respuesta
inmune contra otros antiacutegenos presentes en una vacuna El γ-PGA de alto peso
molecular ha demostrado estimular la respuesta inmune contra antiacutegenos
virales en conejos y ratones
43 Disentildeo de procesos biotecnoloacutegicos y la transferencia de materia gasshyliquido
Cuando un microorganismo ha sido identificado como productor de un
compuesto de intereacutes existen una serie de consideraciones que deben ser
valoradas previamente antes de que un proceso productivo econoacutemicamente
viable pueda ser llevado a la praacutectica a escala industrial En aquellas
organizaciones e industrias con una soacutelida experiencia en el disentildeo y
escalamiento de procesos fermentativos los nuevos procesos son
incorporados de manera relativamente raacutepida
El desarrollo de un nuevo proceso fermentativo puede ser a groso modo
dividido en cuatro fases
La primera consiste en identificar el producto su potencial valor de
mercado su precio de venta asiacute como la vida uacutetil del mismo
La siguiente fase es seleccionar o disentildear la cepa que seraacute utilizada en
el proceso productivo y por consiguiente disentildear el proceso como tal Esto
involucra una adecuada seleccioacuten del medio de cultivo oacuteptimo y de las
condiciones idoacuteneas de proceso En este sentido la produccioacuten de γ-PGA a
partir de Bacillus licheniformis ATCC9945a ha sido fuertemente investigada en
torno a las condiciones ideales para su produccioacuten sin embargo algunos
reportes y resultados resultan ser incompletos contradictorios o discutibles Sin
embargo lo que si resulta comuacuten en todas las investigaciones en particular en
aquellas donde se han empleado voluacutemenes mayores de produccioacuten como por
ejemplo de 05 a 10 L es que la produccioacuten del γ-PGA se detiene al reducirse
la concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo problema que ha sido
abordado incrementando el caudal de oxiacutegeno yo incrementando la velocidad
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 39
de agitacioacuten sin que se reporten resultados consistentes o claros La
acumulacioacuten del γ-PGA a lo largo de la fermentacioacuten parece reducir
draacutesticamente la tasa de transferencia de oxiacutegeno lo que termina generando
condiciones anaeroacutebicas en tiempos tan cortos como 20 horas con
concentraciones de oxiacutegeno inferiores a 1 mgL
431 La transferencia de materia gasshyliacutequido
Un requisito primordial para la ocurrencia de una reaccioacuten quiacutemica
cualquiera es que los reactantes esteacuten presentes en el sitio de reaccioacuten En los
sistemas multifase los procesos de transporte son generalmente maacutes lentos
que las tasas maacuteximas de reaccioacuten intriacutenseca Este fenoacutemeno da como
resultado que las tasas de reaccioacuten reales sean menores que las que se
podriacutean esperar por efecto de la cineacutetica de reaccioacuten uacutenicamente
Los fundamentos fiacutesicos principales que determinan la transferencia de
materia son los mismos que aplican para la transferencia de calor y de
momento es decir conveccioacuten y difusioacuten
En los sistemas bioloacutegicos multifase como las fermentaciones en medio
sumergido la transferencia de masa ocurre entre dos fases una gaseosa y
otra liacutequida La mayor parte de los procesos fermentativos a gran escala con
excepcioacuten tal vez uacutenicamente de la produccioacuten de etanol y aacutecido laacutectico son
aeroacutebicos y tiacutepicamente son llevados a cabo en biorreactores aireados gas-
liacutequido En estos procesos aeroacutebicos como sucede con la produccioacuten de γ-
PGA por parte de Bacillus licheniformis ATCC9945a la transferencia de
oxiacutegeno desde la fase gaseosa a la fase liacutequida resulta vital para el eacutexito de
dicho bioproceso
En los bioprocesos aeroacutebicos el oxiacutegeno es un sustrato clave y debido
a su baja solubilidad en caldos y medios de cultivo resulta necesario su
continuo suministro La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deber ser
conocida e inclusive predicha con el propoacutesito de llevar a cabo un adecuado
disentildeo operacional del proceso y un correcto escalado de los biorreactores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 40
432 La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR)
El transporte de oxiacutegeno gas-liacutequido en los bioprocesos aeroacutebicos es el
principal proceso gas-liacutequido a considerar a la hora de disentildear un bioproceso
La solubilidad del oxiacutegeno en un medio liacutequido es baja la concentracioacuten de
saturacioacuten de oxiacutegeno es de cerca de 7-8 mgL en un proceso tiacutepico en
aireacioacuten por lo cual una transferencia de oxiacutegeno continua de la fase gaseosa
a la liacutequida es esencial para conservar un metabolismo celular completamente
oxidativo Por ejemplo unos pocos minutos sin aireacioacuten pueden impactar
severamente en la habilidad de Penicillium chrysogenum para producir
penicilina mientras que en organismos aeroacutebicos facultativos esto puede
generar cambios draacutesticos en el rendimiento y el tipo de producto generado en
condiciones de carencia de oxiacutegeno
La transferencia de oxiacutegeno desde una fase gaseosa hasta el interior de
una ceacutelula ocurre siguiendo una serie de pasos secuenciales que son
1) Difusioacuten del O2 desde la fase gaseoso a la interfase gas-liacutequido
2) Transporte a traveacutes de la interfase gas-liacutequido
3) Difusioacuten del O2 a traveacutes de una regioacuten relativamente inactiva del liacutequido
adyacente a la burbuja es decir de la interfase gas-liacutequido a la de
mezclado del liacutequido
4) Transporte del oxiacutegeno disuelto a la ceacutelula los conglomerados celulares
o al pellet de ceacutelulas inmovilizadas
5) Difusioacuten a traveacutes de la peliacutecula inactiva hasta la superficie de la ceacutelula
dentro de los conglomerados celulares o al interior del pellet de ceacutelulas
inmovilizadas
6) Transporte a traveacutes de la membrana celular
7) Transporte del O2 en el interior celular hacia el sitio de demanda
433 Descripcioacuten de la transferencia maacutesica con kLa
La tasa volumeacutetrica de transferencia de materia de un compuesto A (qtA)
en este caso oxiacutegeno (O2) puede ser descrita cuantitativamente como el
producto de un coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (kLa) y una
fuerza impulsora que consiste en la diferencia entre la concentracioacuten de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 41
saturacioacuten del compuesto (cA) y la concentracioacuten actual del compuesto en la
fase liacutequida (cA)
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (unidad s-1) el kLa
es normalmente referido como un coeficiente uacutenico pero en realidad consiste
de dos partes el coeficiente de transferencia de materia propiamente dicho (kL)
que estaacute vinculado con el flujo maacutesico (tasa de transferencia por unidad de
aacuterea) y el aacuterea de la superficie especiacutefica (a) que es el aacuterea de transferencia
por unidad de volumen
La tasa de transferencia de oxiacutegeno (referida como velocidad de
transferencia de oxiacutegeno en algunos casos) el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de materia (kLa) y la concentracioacuten de oxiacutegeno estaacuten
relacionados por la ecuacioacuten
NAa = OTR = kLa(cA- cA) (gm3s)
Noacutetese en la ecuacioacuten que para que la transferencia sea mayor interesa
tener una kLa alta pero ademaacutes (cA-cA) debe tener un valor elevado lo que
podriacutea llevar a plantear que cA sea lo menor posible Sin embargo se requiere
de una concentracioacuten miacutenima de oxiacutegeno para mantener una fermentacioacuten
aerobia Con respecto a dicha ecuacioacuten es importante sentildealar que
1) La concentracioacuten en fase liacutequida cA corresponde a la cantidad de
oxiacutegeno que hay en la fase acuosa y se determina mediante un
electrodo de oxiacutegeno disuelto Si al sistema se introduce aire a presioacuten
atmosfeacuterica dicho valor estaraacute entre los 0-10 mgL
2) La concentracioacuten de saturacioacuten cA corresponde a la solubilidad de
oxiacutegeno y es dependiente de la concentracioacuten de oxiacutegeno en la fase
gaseosa es decir de la presioacuten parcial de oxiacutegeno Una vez conocida la
presioacuten parcial de oxiacutegeno es posible calcular el valor de la solubilidad
mediante la ley de Henry En agua una forma de esta ecuacioacuten seriacutea
pAGcA = He
Donde He es la constante de Henry y cuyo valor (aproximadamente
entre 15-30 atm m3kg) es funcioacuten de la temperatura A partir de esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 42
ecuacioacuten es posible despejar el valor de cA = pAGHe El valor de He
cambia con la temperatura por ejemplo en agua pura a 25 ordmC para el
oxiacutegeno es de 2396 x 106 Pamiddotm3middotkg-1 El valor de cA es modificable si
se manipula
a) Presioacuten podemos aumentar la concentracioacuten de saturacioacuten si
aumentamos la presioacuten parcial de oxiacutegeno por ejemplo si
pasamos de 021 atm a 1 atm introduciendo al reactor oxiacutegeno
puro en vez de aire a presioacuten atmosfeacuterica lo que da por
resultado un aumento en alrededor de cinco veces su valor
Es posible tambieacuten alcanzar un mayor aumento de la
concentracioacuten de saturacioacuten si aumentamos la presioacuten
absoluta no obstante si hacemos fermentaciones con
oxiacutegeno a presioacuten resulta necesario disponer de un
fermentador capaz de resistir tales condiciones de presioacuten
resulta evidentemente maacutes costoso y tambieacuten pueden ocurrir
cambios importantes en el metabolismo de los
microorganismos que puedan afectar su crecimiento o su
rendimiento en producto
b) Temperatura la solubilidad del oxiacutegeno en agua disminuye al
aumentar la temperatura
c) Composicioacuten del liacutequido si en lugar de agua pura se tiene una
disolucioacuten como sucede con la mayoriacutea de los medios que
tiene una composicioacuten salina importante la solubilidad debe
corregirse pues dichos componentes afectan su valor y dicho
efecto estaacute influenciado tanto por los iones presentes como
por los componentes orgaacutenicos
44 Fermentaciones a presioacuten
La gran mayoriacutea de los estudios sobre fermentaciones son generalmente
llevados a cabo bajo condiciones de presioacuten ambiental maacutes allaacute del hecho de
que el fermentador por lo general suele encontrarse positivamente presurizado
Son pocos los ejemplos a excepcioacuten de la cerveza y algunos vinos donde las
fermentaciones son llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten positiva en el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 43
fermentador Esta leve presurizacioacuten suele deberse al proceso de aireacioacuten del
biorreactor debido a la formacioacuten de una presioacuten de vuelta debido a las
restricciones del respiradero de escape del fermentador
La presioacuten positiva en muchos casos puede resultar beneficiosa para los
procesos de fermentacioacuten no soacutelo por el hecho de incrementar la solubilidad del
oxiacutegeno en el caldo de cultivo sino tambieacuten porque reduce las oportunidades
de contaminacioacuten externa durante el proceso de fermentacioacuten Igualmente la
presioacuten puede tener efectos nocivos sobre los procesos fermentativos La
presioacuten tiene el efecto de influenciar las velocidades y la direccioacuten del
metabolismo de los microorganismos Esto es particularmente evidente en el
caso de productos o subproductos volaacutetiles que forman parte de distintas rutas
metaboacutelicas La presioacuten en el fermentador puede evitar la produccioacuten o
expulsioacuten de un producto gaseoso al medio circundante Este fenoacutemeno puede
tener el efecto de interferir con el equilibrio de varias reacciones bioquiacutemicas y
puede resultar en toxicidad al interior de la ceacutelula o en la divergencia de rutas
metaboacutelicas Lo significante de este impacto dependeraacute de la duracioacuten del
proceso asiacute como de la magnitud de la presioacuten a la cual se realice la
fermentacioacuten
De igual manera el efecto de la presioacuten sobre las macromoleacuteculas
guarda una gran semejanza con los efectos de la temperatura lo cual se
desprende del parecido de la forma de los diagramas de estabilidad de las
proteiacutenas y viabilidad de los microorganismos entre ambas variables
temperatura y presioacuten observacioacuten que tambieacuten permite concluir que las
proteiacutenas constituyen los primeros elementos estructurales en ser afectados
de manera negativa por el incremento de la presioacuten La presioacuten parece afectar
en mayor medida las interacciones proteiacutena-proteiacutena en comparacioacuten con la
estabilidad proteica por siacute misma por lo que es vaacutelido concluir que son estas
interacciones las primeras en verse afectadas por dicha variable La
conservacioacuten de la viabilidad en los microorganismos al ser sometidos a
presioacuten dependeraacute en gran medida de su capacidad para conservar una
membrana celular funcional aunque los mecanismos que emplean para tal fin
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 44
auacuten son desconocidos dada la vital importancia de las interacciones proteiacutena-
proteiacutena en las funciones de membrana
Lo maacutes importante es conocer con detalle como efectivamente la presioacuten
ejercida afecta el proceso de fermentacioacuten en particular la bioquiacutemica y la
fisiologiacutea del mismo de igual manera si es posible controlar la direccioacuten de la
fermentacioacuten manipulando la presioacuten o si la presioacuten estaacute generando el
desarrollo de reacciones secundarias indeseadas las respuestas a dichas
interrogantes soacutelo pueden ser dilucidadas mediante la experimentacioacuten praacutectica
del proceso fermentativo en estudio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 45
7 MATERIALES Y METODOLOGIacuteA
51 Informacioacuten de la cepa empleada
Se empleoacute la cepa Bacillus licheniformis ATCC9945a la cual se
encontraba conservada en estado vegetativo y bajo refrigeracioacuten en el
Laboratorio de Biopoliacutemeros del ETSEIB UPC Cataluntildea Con el propoacutesito de
seleccionar colonias altamente mucosas capaces de producir γ-PGA se
procedioacute a rallar la biomasa conservada en placas con Agar LB (pH 75) e
incubarlas por 24 horas a 37 ordmC Las colonias que mostraron una morfologiacutea
mucosa indicadora de la produccioacuten de γ-PGA fueron utilizadas para elaborar
los inoacuteculos empleados en las distintas fermentaciones
52 Medio de cultivo empleado
El medio de cultivo empleado para la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a fue el medio de cultivo E (Leonard et al 1958) con
algunas modificaciones seguacuten recomendado por Birrer y colaboradores (1994)
El detalle de la formulacioacuten se presenta en la tabla 5
Tabla 5 Formulacioacuten del medio de cultivo E empleado en el cultivo SmF de Bacillus
licheniformis ATCC9945a
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO43H2O 043 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 015 CaCl2 011 Glicerol 80 pH 75 Esterilizacioacuten por filtracioacuten (045 μm) Volumen 1 L
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 46
El medio de cultivo fue esterilizado por filtracioacuten (045 μm) y conservado
en refrigeracioacuten a 7 ordmC
53 Preparacioacuten de los inoacuteculos madre
Las colonias seleccionadas fueron inoculadas en matraces de 125 mL
con 25 mL de medio de cultivo E y cultivadas a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica
con varilla imantada a 650 rpm por 12 horas El caldo resultante fue
centrifugado a 8000 rpm por 25 minutos la biomasa recuperada fue
resuspendida en 10 mL de medio de cultivo E y 10 mL de una solucioacuten de
glicerol al 20 Dicha solucioacuten fue distribuida en voluacutemenes de 1 mL en tubos
eppendorf y congeladas a -80 ordmC
Posteriormente uno de estos tubos eppendorf fue empleado para
inocular matraces de 500 mL conteniendo 125 mL de medio de cultivo y fueron
cultivados a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica con varilla imantada a 650 rpm por
14 horas El caldo resultante fue centrifugado nuevamente a 8000 rpm por 25
minutos se recuperoacute la biomasa precipitada y se resuspendioacute en 25 mL de
medio de cultivo E y 25 mL de una solucioacuten de glicerol al 20 Dicha solucioacuten
fue distribuida en voluacutemenes de 2 mL en tubos eppendorf y posteriormente
fueron congelados a -80 ordmC Cada uno de estos eppendorf constituiacutea un inoacuteculo
de origen para una fermentacioacuten individual La absorbancia promedio de estos
inoacuteculos se encontraba cercana a 25
531 Conservacioacuten de la cepa en estado productivo
Los inoacuteculos deben conservarse en todo momento bajo congelacioacuten a
una temperatura inferior a -15 ordmC siendo preferible conservarlos a -80 ordmC La
condicioacuten de produccioacuten de γ-PGA es extremadamente fraacutegil y cambios de
temperatura o descongelamiento pueden conllevar la peacuterdida de dicha
capacidad La reutilizacioacuten de biomasa residual de fermentaciones previas
queda descartada
54 Montaje del biorreactor a presioacuten
En la actualidad los principales fabricantes de biorreactores para la
industria biotecnoloacutegica carecen de equipos de fermentacioacuten a escala
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 47
laboratorio que puedan operar bajo condiciones de presioacuten superiores a los 01
bares relativos Por este motivo se debioacute modificar un reactor quiacutemico a
presioacuten de modo tal que pudiese cumplir los requisitos necesarios para el
cultivo de microorganismos El modelo empleado fue el reactor quiacutemico a
presioacuten modelo 6425-214 de la casa AceGlass (Estados Unidos) de un
volumen total de 2 L Este reactor tiene la capacidad de operar hasta 35 psig
(241 bares relativos) a una temperatura de 100 ordmC y a una agitacioacuten de 300
rpm El mismo seguacuten su disentildeo original se presenta en la figura 6
Figura 6 Reactor quiacutemico a presioacuten modelo 6425-214 de AceGlass Co
Las dimensiones del frasco del reactor de forma ciliacutendrica y fondo
redondeado son las siguientes
Diaacutemetro de boca 95 mm
Diaacutemetro maacuteximo 120 mm
Profundidad 180 mm
Con el propoacutesito de adecuarlo al cultivo de microorganismos el reactor
fue ligeramente modificado en algunos de sus componentes y su distribucioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 48
Entre los principales cambios realizados al sistema se encuentran los
siguientes
1) Incorporacioacuten de una turbina de disco tipo Rushton al tratarse de una
fermentacioacuten aeroacutebica es necesario garantizar una adecuada aireacioacuten
del medio de cultivo mediante agitacioacuten efectiva La paleta de agitacioacuten
original del sistema no cumpliacutea con dicho requisito por lo cual se cambioacute
la misma por una turbina tipo Rushton cuyas dimensiones se muestran
en la figura 7
Dimensiones
A = 75 mm
B = 18 mm
C = 1mm
D = 20 mm
Figura 7 Dimensiones de la turbina tipo Rushton empleada
Esta turbina se encuentra en posicioacuten central a 3 cm del fondo del
reactor y a 6 mm de los deflectores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 49
2) Incorporacioacuten de deflectores se incorporaron dos laacuteminas deflectoras de
disentildeo propio de1 mm de ancho en una posicioacuten de 90 grados con
respecto a la superficie del reactor con el propoacutesito de reducir la
formacioacuten de voacutertice promover una agitacioacuten turbulenta y una mayor
formacioacuten de burbujas La geometriacutea de las laacuteminas deflectoras se
detalla en la Figura 8
Dimensiones
Ancho de laacutemina = 10 mm
Diaacutemetro = 95 mm
Longitud de laacutemina = 200 mm
Figura 8 Geometriacutea de las laacuteminas deflectoras
3) Cambio del motor de agitacioacuten se incorporoacute un motor IKA RW20 con
capacidad de hasta 2000 rpm en sustitucioacuten del motor original con que
A
B
C
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 50
disponiacutea el equipo (el sistema original trae un motor limitado a una
velocidad de agitacioacuten maacutexima de 330 rpm) con el propoacutesito de variar la
agitacioacuten del sistema y observar su efecto sobre el crecimiento y la
produccioacuten de poliacutemero
4) Reubicacioacuten de la vaacutelvula de seguridad de sobrepresioacuten con el
propoacutesito de garantizar una mayor seguridad del equipo maximizar la
vida uacutetil del cilindro de aire comprimido y evitar la sobrepresioacuten que
pueden generar el crecimiento del microorganismo (su metabolismo
puede liberar compuestos gaseosos o volaacutetiles) se trasladoacute la vaacutelvula de
seguridad del equipo de la tuberiacutea de llenado a la tapa del reactor
5) Eliminacioacuten de componentes dado que no resultaban uacutetiles para la
presente investigacioacuten se prescindioacute de instalar en la tapa del equipo el
condensado y el embudo de adicioacuten El disco de ruptura de la tuberiacutea de
llenado fue sustituido por una vaacutelvula de apertura manual con el
propoacutesito de permitir un mejor y maacutes raacutepido ajuste de la presioacuten durante
el establecimiento inicial de las condiciones de fermentacioacuten
55 Condiciones de fermentacioacuten
El detalle de las condiciones de temperatura presioacuten pH y agitacioacuten en
las cuales fueron establecidas las distintas fermentaciones asiacute como la
metodologiacutea de escalamiento empleada se presentan a continuacioacuten
551 Escalamiento
Inicialmente se procediacutea a inocular por duplicado 100 mL de medio de
cultivo con uno de los inoacuteculos madre (2 mL de ceacutelulas de Bacillus licheniformis
ATCC9945a conservados en tubos eppendorf a -20 ordmC) en matraces con
deflectores de 500 mL de capacidad A dichos matraces se les incorporaba una
pastilla de agitacioacuten magneacutetica de 25 cm de longitud y 07 cm de diaacutemetro y
eran colocados en agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm (agitador IKA C-MAG HS7)
por 8 horas a una temperatura aproximada de 30 ordmC
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 51
Posteriormente uno de los matraces (100 mL de cultivo) anteriormente
establecidos era utilizado para inocular 500 mL de medio de cultivo en el
biorreactor a presioacuten manteniendo una temperatura constante de 30 ordmC
aproximadamente Distintas presiones velocidades de agitacioacuten y densidades
oacutepticas del inoacuteculo fueron evaluadas El detalle del disentildeo experimental de
dichas pruebas se presenta a continuacioacuten en la tabla6
Tabla 6 Diferentes condiciones de presioacuten relativa agitacioacuten y absorbancia evaluadas en las
fermentaciones en biorreactor
CONDICIOacuteN
VALORES EVALUADOS
SOBREPRESIOacuteN
Agitacioacuten 300 rpm
Absorbancia del inoacuteculo 120
O bar (0 psig)
052 bar (75 psig)
103 bar (15 psig)
172 bar (25 psig)
241 bar (35 psig)
AGITACIOacuteN
Sobrepresioacuten 103 bar (15 psig)
Absorbancia del inoacuteculo 120
300 rpm
400 rpm
500 rpm
650 rpm
El tiempo de fermentacioacuten para cada uno de los ensayos evaluados fue
de 18 horas tiempo en el que el pH habiacutea descendido a un valor cercano pero
auacuten superior a 6 No se realizoacute ajuste alguno del pH a lo largo de la
fermentacioacuten Posteriormente se procediacutea a centrifugar el caldo de
fermentacioacuten a 8000 rpm por 25 minutos el sobrenadante recuperado era
almacenado para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA presente en
el mismo
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre
Con el propoacutesito de garantizar que el inoacuteculo madre era apto para la
produccioacuten de γ-PGA uno de los matraces inicialmente establecidos era
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 52
conservado bajo agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm y a 30 ordmC durante las 18 horas
que requeriacutea la fermentacioacuten en el biorreactor Posteriormente se determinaba
cualitativamente la produccioacuten de γ-PGA seguacuten la simbologiacutea que se presenta
en la tabla 7
Tabla 7 Simbologiacutea empleada para la medicioacuten cualitativa de la produccioacuten de γ-PGA en los
matraces de control
SIacuteMBOLO OBSERVACIOacuteN CUALITATIVA
- No produccioacuten de γ-PGA
+ Produccioacuten de γ-PGA
+++ Elevada produccioacuten de γ-PGA
56 Determinacioacuten del valor de kLa
Para la determinacioacuten del valor aproximado de kLa tanto en los
matraces coacutemo en el biorreactor se empleoacute el meacutetodo estaacutetico sin operacioacuten
del cultivo celular Dicho valor no fue determinado bajo condiciones de presioacuten
pues se careciacutea con la instrumentacioacuten adecuada sino soacutelo a presioacuten
atmosfeacuterica para ambos casos matraz y biorreactor
Este meacutetodo consiste en disminuir la concentracioacuten de oxiacutegeno hasta
una concentracioacuten de 1-25 mgL despueacutes el sistema es retornado a aireacioacuten
yo agitacioacuten y se mide como va aumentando la concentracioacuten de oxiacutegeno en la
fase liacutequida conforme transcurre el tiempo El objetivo es por tanto disminuir la
concentracioacuten de cA0 lo suficiente como para tener un cambio importante
obteniendo asiacute una curva de ascenso de las concentraciones de oxiacutegeno en el
tiempo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 53
561 Matraces de cultivo
A un matraz de cultivo en reposo conteniendo 100 mL de medio de
cultivo E se le agregoacute 001 g de sulfito de sodio (Na2SO3) y una punta de
espaacutetula de cloruro de cobalto (actuacutea como catalizador) y se agita
manualmente por 20 s Posteriormente se introdujo la sonda de oxiacutegeno
disuelto del medidor Hanna Oxi-check y se dejoacute descender el nivel de oxiacutegeno
disuelto hasta el valor miacutenimo posible entre 20-25 mgL Seguidamente se
activoacute la agitacioacuten magneacutetica y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto cada 10
segundos hasta alcanzar un punto maacuteximo que se repitiese al menos durante
2 minutos
562 Biorreactor
Se procedioacute a llenar el reactor con 600 mL de medio de cultivo y en
estado de reposo se le agregoacute 006 g de sulfito de sodio una punta de espaacutetula
de cloruro de cobalto y se agitoacute suavemente a 100 rpm por 20 segundos
Haciendo uso de la sonda de oxiacutegeno se determinoacute el menor nivel posible de
oxiacutegeno disuelto alrededor de 15-20 mgL Posteriormente se encendioacute la
agitacioacuten mecaacutenica a 300 rpm y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto en
intervalos de 10 segundos hasta alcanzar un valor maacuteximo de oxiacutegeno disuelto
sostenido en el tiempo es decir que se repitiese por al menos un minuto
563 Graficacioacuten
Con el propoacutesito de determinar el valor de kla a partir de la ecuacioacuten de
balance de oxiacutegeno
V(dCAdt) = VkLa(cA-cA)
Se tiene que integrando dicha ecuacioacuten con la concentracioacuten inicial cA0
se obtiene
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 54
Representado ln((cA - cA0)(c
A- cA)) contra el tiempo t se obtiene una
recta cuya pendiente es el valor de kLa
57 Determinacioacuten del contenido de γshyPGA en el caldo de fermentacioacuten
Con el propoacutesito de determinar la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo
post-fermentacioacuten se utilizoacute la teacutecnica analiacutetica llamada cromatografiacutea liacutequida
de alta eficiencia conocida normalmente por sus siglas en ingleacutes HPLC
especiacuteficamente la conocida como cromatografiacutea de permeacioacuten en gel (GPC)
uno de los tipos de cromatografiacutea de exclusioacuten molecular (SEC) maacutes
empleados en la separacioacuten de poliacutemeros
El equipo empleado fue el cromatoacutegrafo modelo 1260 Infinity de Agilent
Technologies La columna de separacioacuten empleada fue una columna PL
aquagel-OH de 8μm para cromatografiacutea GPC en fase acuosa El meacutetodo de
cromatografiacutea empleado consistioacute en eludir 25 μL de la muestra haciendo uso
de una solucioacuten tampoacuten fosfato 005 molL con un tiempo de elucioacuten de 15 min
por muestra El caudal de flujo del eluyente fue de 08 mLmin La deteccioacuten se
llevoacute a cabo a traveacutes de un detector de absorbancia UV-vis de longitud de onda
variable (VWD) a una longitud de onda de 220 nm y tambieacuten un detector de
iacutendice de refraccioacuten (RID) con polaridad positiva y una temperatura de la
unidad oacuteptica de 35 ordmC aunque los resultados reportados y empleados fueron
los obtenidos con el detector VWD El tiempo de retencioacuten de la fraccioacuten
polimeacuterica correspondiente al γ-PGA se encontroacute entre los 65 y los 90
minutos considerando el hecho de que el mismo se trata de una mezcla de
moleacuteculas polimeacutericas de distinta longitud y por ende distinto peso molecular
Para poder cuantificar la cantidad de poliacutemero presente en la muestra se
elaboroacute una curva de calibracioacuten inicial Se prepararon soluciones en agua
destilada de γ-PGA a concentraciones de 10 5 2 1 y 05 gL Las mismas
fueron analizadas mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva para el
pico correspondiente al γ-PGA para cada concentracioacuten Dichos valores fueron
empleados para la elaboracioacuten de la curva de calibracioacuten inicial del equipo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 55
Las muestras a analizar fueron preparadas de la siguiente manera 400
μL del caldo crudo se diluyeron en agua destilada hasta un volumen final de 2
mL (dilucioacuten 5x) y posteriormente fueron filtradas mediante jeringa haciendo
uso de filtros de 045 μm en viales de HPLC Las muestras fueron analizadas
mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva del pico correspondiente al
γ-PGA para cada una de las muestras
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
Con el propoacutesito de determinar el efecto del contenido de γ-PGA sobre la
solubilidad maacutexima de oxiacutegeno en el medio de cultivo en condiciones estaacuteticas
es decir sin crecimiento microbiano (consumo de oxiacutegeno de los
microorganismos nulo) se procedioacute a preparar soluciones de 100 mL de
volumen a concentraciones crecientes de poliacutemero (poliacutemero + biomasa) en
medio de cultivo y medir el nivel de oxiacutegeno disuelto en mgL haciendo uso de
un medidor de oxiacutegeno disuelto Hanna Oxi-check Dichas soluciones fueron
evaluadas en las mismas condiciones de fermentacioacuten empleadas en la
primera etapa de escalamiento matraces de 500 mL con deflectores y a una
agitacioacuten magneacutetica de 650 rpm Se evaluaron concentraciones de biopoliacutemero
de 0 7 14 21 36 54 y 71 gL
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano
Para determinar el crecimiento bacteriano se aprovechoacute el efecto que
dicho crecimiento genera sobre la turbidez del caldo a lo largo de la
fermentacioacuten Por ello se empleoacute la teacutecnica de espectrofotometriacutea
determinando la absorbancia del medio de cultivo inoculado y su incremento
con el tiempo Se empleoacute el coloriacutemetro modelo ZUSI 4200A a una longitud de
onda de 660 nm El equipo era inicialmente calibrado en 0 haciendo uso de
agua destilada acto seguido se determinaba el valor de absorbancia de la
muestra a analizar
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 56
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producido se determinoacute
mediante el meacutetodo desarrollado por Marfey (1984) para la determinacioacuten
cuantitativa de la composicioacuten enantiomeacuterica de aminoaacutecidos Dicho meacutetodo se
basa en la reaccioacuten del aacutecido glutaacutemico con el reactivo de Marfey (1-fluoro-24-
dinitrofenil-5-L-alanina) Dicho compuesto es oacutepticamente activo por lo que al
reaccionar con los enantioacutemeros D- y L- del aacutecido glutaacutemico forma dos
diasteroisoacutemeros que pueden separarse mediante cromatografiacutea HPLC con
tiempos de retencioacuten para el isoacutemero L- y el D- de 675 y 100 minutos
aproximadamente Para poder cuantificar la composicioacuten de manera efectiva
se realizoacute un calibrado previo con mezclas de concentracioacuten conocida de cada
isoacutemero
5101 Preparacioacuten de la muestras
Se introdujo 3 mg del γ-PGA a analizar en viales de 5 mL y se les
adicionoacute 2 mL de HCl 6 molL Se dejaron calentar a 100 ordmC en estufa por un
periacuteodo de 24 horas Posteriormente se trasfirioacute 100 μL de cada una de las
muestras a tubos eppendorf y se dejaron en desecador al vaciacuteo por un periacuteodo
de tres diacuteas empleando NaOH como desecante Seguidamente se disolvioacute los
productos en 100 μL de agua y se hicieron reaccionar con 200 μL de una
disolucioacuten con concentracioacuten de 5 mgmL de reactivo de Marfey en acetona con
20 μL de carbonato aacutecido de sodio (NaHCO3) durante una hora en estufa a 37
ordmC Al finalizar se neutralizoacute como 10 μL de HCl 2 molL y se dejoacute secar al vaciacuteo
por 3 diacuteas en el desecador a vaciacuteo con NaOH como desecante Finalmente se
diluyoacute la muestra en 350 μL de dimetilsulfoacutexido (DMSO) para cromatografiarla
por HPLC
La cromatografiacutea se llevoacute a cabo en el mismo equipo empleado para la
determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA pero con los siguientes cambios
1) Se empleoacute una columna de fase estacionaria reversa Spherisorb ODS2
de 5 μm de poro 25 cm de longitud y 046 cm de diaacutemetro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 57
2) El caudal de flujo del eluyente fue de 15 mLmin
3) El detector de longitud de onda variable (VWD) operaba a 340 nm y el
tiempo de elucioacuten era de 25 minutos
4) El eluyente empleado era una mezcla 8020 de fosfato de trietilamonio
50 mmolL a pH 3 y acetonitrilo El fosfato de trietilamonio se obteniacutea
haciendo reaccionar cantidades equimolares de trietilamina y aacutecido
fosfoacuterico
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual
La composicioacuten porcentual enantiomeacuterica del γ-PGA es decir el
contenido porcentual de aacutecido D- y L-glutaacutemico se determinoacute mediante
contraste de las aacutereas obtenidas en el cromatograma para cada uno de los
picos correspondientes a cada diasteroisoacutemero con el aacuterea total
correspondiente a los productos de reaccioacuten (sumatoria de ambos
diasteroisoacutemeros) La composicioacuten se reportoacute como un porcentaje de aacutecido D-
glutaacutemico y aacutecido L-glutaacutemico presente en la muestra analizada
511 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA Para la determinacioacuten del peso molecular del poliacutemero se procedioacute a
analizar los cromatogramas obtenidos para el caacutelculo de la concentracioacuten de γ-
PGA Se empleoacute el programa informaacutetico ChemStation for LC Systemsreg de
Agilent Technologies Dicho programa posee unas potentes herramientas de
anaacutelisis que permiten automaacuteticamente calcular el peso molecular de un
compuesto Para las muestras analizadas se determinoacute el peso molecular
promedio en nuacutemero (Mn) el peso molecular promedio en peso (Mw) la
polidispersidad y el peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) La recta de
calibrado fue obtenida previamente por Bou y colaboradores con estaacutendares de
polioacutexido de etileno (PEO)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 58
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 59
8 RESULTADOS
61 Montaje del biorreactor a presioacuten
El detalle final del biorreactor empleado puede observarse en la figura 8
Noacutetese que la temperatura es controlada por la accioacuten de una manta teacutermica
externa como sucede con el disentildeo original del reactor y no por el empleo de
un serpentiacuten interno caso de la gran mayoriacutea de biorreactores comerciales a
escala laboratorio El mismo permite operar en condiciones de agitacioacuten de 100
a 650 rpm y a presiones de hasta 24 bar de sobrepresioacuten (35 psig) El
biorreactor resultoacute apto para el crecimiento microbiano alcanzaacutendose valores
de absorbancia de hasta 37 similares a los observados en cultivos en
matraces
Figura 9 Biorreactor empleado para la produccioacuten de γ-PGA bajo presioacuten
62 Competencia del inoacuteculo madre
Mediante la metodologiacutea descrita previamente para la preparacioacuten del
inoacuteculo madre fue posible alcanzar en el 100 de los cultivos de control la
produccioacuten de γ-PGA en alta cantidad Aunque dichos resultados no se
muestran el empleo de inoacuteculos de otra naturaleza como reutilizacioacuten de
biomasa o inoacuteculos conservados a temperaturas superiores a -20 ordmC mostraron
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 60
ser ineficaces y poco reproducibles en cuanto a la produccioacuten de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a Los resultados de los cultivos control
pueden observarse en el graacutefico 10 bajo el nombre de Matraz
63 Determinacioacuten de los valores de kLa
631 Matraz
En lo referente al cultivo en matraz bajo las condiciones de agitacioacuten y
temperatura empleadas y en condiciones estaacuteticas (sin crecimiento
microbiano) se encontroacute un valor de kLa de 0026 s-1 En el graacutefico 1 y 2 se
muestran la curva de concentracioacuten de oxiacutegeno en funcioacuten del tiempo al
reiniciarse el proceso de agitacioacuten asiacute como el caacutelculo de dicho valor de
coeficiente mediante regresioacuten lineal respectivamente
Graacutefico 1 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concentracioacuten m
gL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 61
Graacutefico 2 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00257x ‐ 08809Rsup2 = 09966
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
Cuando se realizoacute la misma determinacioacuten pero a una velocidad de
agitacioacuten menor (430 rpm) el valor de kLa disminuyoacute significativamente En
dicho caso el valor de kLaobtenido fue de 0017 s-1 Estos resultados se
muestran en los graacuteficos 3 y 4
Como se puede observar en dichos graacuteficos el tiempo requerido para
alcanzar el valor maacuteximo estable se incrementoacute considerablemente en 60
segundos lo que indica una menor velocidad de transferencia producto de la
reduccioacuten de la intensidad de la agitacioacuten suministrada al cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 62
Graacutefico 3 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 430 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Graacutefico 4 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00168x ‐ 07551Rsup2 = 09835
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
ln Linear (ln)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 63
632 Biorreactor
Para el caso del biorreactor el valor de kLa determinado fue de 0025 s-1
esto bajo condiciones estaacuteticas (sin crecimiento microbiano) y en las
condiciones de temperatura y operacioacuten previamente descritas
Como se puede observar dicho valor es praacutecticamente igual al obtenido
para el caso del matraz lo que indica condiciones de transferencia de oxiacutegeno
gas-liacutequido muy similares en ambos casos El valor dekLa fue determinado en
un punto lateral del reactor 2 cm por debajo del nivel de medio de cultivo y
contiguo a uno de los deflectores punto donde la transferencia de materia
debiera en principio ser mayor Dichos resultados se presentan en los graacuteficos
5 y 6
Graacutefico 5 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten mecaacutenica del medio de cultivo en biorreactor a 300 rpm
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
560
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Concentracioacuten
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 64
Graacutefico 6 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00246x ‐ 03222Rsup2 = 09902
000
050
100
150
200
250
300
0 20 40 60 80 100 120 140
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
64 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En lo referente a los niveles de oxiacutegeno a distintas concentraciones de γ-
PGA en condiciones estaacuteticas sin crecimiento microbiano se observa una
draacutestica reduccioacuten de dicho nivel conforme se incrementa la concentracioacuten del
biopoliacutemero Dicho fenoacutemeno es esperable dada la alta viscosidad del γ-PGA
La concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo alcanza un valor inicial de
74 mgL el cual se reduce draacutesticamente a 52 mgL a un valor de
concentracioacuten de γ-PGA de 14 gL Esta reduccioacuten es uacutenicamente producto de
la presencia del γ-PGA en el medio de cultivo El graacutefico 7 muestra dicho
fenoacutemeno hasta un valor miacutenimo de oxiacutegeno disuelto de 25 mgL cuando la
concentracioacuten de poliacutemero alcanza un maacuteximo 71 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 65
Graacutefico 7 Efecto de la concentracioacuten de γ-PGA sobre el nivel maacuteximo de oxiacutegeno disuelto en el
medio de cultivo E
y = ‐00569x + 64671Rsup2 = 08709
000
100
200
300
400
500
600
700
800
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Oxiacutegeno disuelto m
gL
γ‐PGA gL
Solubilidad O2 (mgL) Linear (Solubilidad O2 (mgL))
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γshyPGA mediante GPC
La curva de calibracioacuten obtenida a partir de soluciones con
concentracioacuten conocida de γ-PGA se presenta en el graacutefico 8
Como se puede observar se obtuvo un valor del coeficiente de
determinacioacuten R2 de 09983 lo que indica un ajuste lineal suficiente y un valor
del coeficiente de correlacioacuten R de 09991 lo que indica una correlacioacuten
positiva entre los datos contrastados La concentracioacuten de γ-PGA estaacute
determinada entonces por la siguiente ecuacioacuten
Concentracioacuten γ-PGA (gL) = (00027 x Aacuterea) ndash 00916
Esta curva fue posteriormente empleada para determinar la
concentracioacuten de γ-PGA en los caldos de cultivo obtenidos despueacutes de cada
una de las fermentaciones realizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 66
Graacutefico 8 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA mediante
GPC
y = 00027x ‐ 00916Rsup2 = 09983
0
2
4
6
8
10
12
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Concentracioacuten gL
Aacuterea
Series1 Linear (Series1)
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γshyPGA
En lo referente al efecto de la presioacuten (relativa) sobre la productividad en
γ-PGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a se encontroacute un incremento de los
rendimientos fermentativos conforme se incrementaba la presioacuten hasta
alcanzar un valor maacuteximo de sobrepresioacuten de 103 bar (15 psig) una vez
superado dicho umbral la productividad se veiacutea reducida draacutesticamente A 103
bar la productividad en γ-PGA alcanzaba un valor de 1334 gL productividad
mayor a la obtenida en condiciones de aireacioacuten (2 Lmin) a presioacuten
atmosfeacuterica la cual fue de 508 gL Esta productividad maacutexima contrasta con
la obtenida a presioacuten atmosfeacuterica la cual fue miacutenima con un valor de 217 gL
Los graacuteficos 9 y 10 muestran los resultados anteriormente comentados Asiacute
mismo en la tabla 8 se presentan la totalidad de fermentaciones llevadas a
cabo las productividades obtenidas y el promedio de cada condicioacuten Es
importante destacar que cada condicioacuten de presioacuten fue evaluada por duplicado
no encontraacutendose diferencias importantes entre los resultados obtenidos para
ninguno de los casos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 67
Graacutefico 9 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748
617
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 05 1 15 2 25
PGGA (gL)
Presioacuten (bar)
RENDIMIENTO gL
Graacutefico 10 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten y la aireacioacuten a presioacuten atmosfeacuterica (0 relativa)
sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748617 508
4582
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
0 052 103 172 241 0 +Aireacioacuten
Matraz
Concentracioacuten γ‐PGA gL
Presioacuten
RENDIMIENTO gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 68
Tabla 8 Fermentaciones realizadas y concentraciones de γ-PGA obtenidas
Reactor Condiciones A D C (gL)AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10108 5 130
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10926 5 141
AHJC11 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 11753 5 152
AHJC11 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10186 5 131
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 95011 5 122
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 97936 5 126
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28706 3 20
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28194 3 20
AHJC14 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 33184 3 24
AHJC14 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 32866 3 23
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 68396 3 52
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 65871 3 50
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43692 5 54
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 46235 5 57
AHJC16 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 49809 5 62
AHJC16 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 58872 5 74
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 57321 5 72
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43021 5 53
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 57727 5 72
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 62398 5 78
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 60469 5 76
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 58335 5 73
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 6083 5 76
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 57897 5 72
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 51267 5 64
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 48407 5 60
= nuacutemero de muestra A = aacuterea D = dilucioacuten C = concentracioacuten y bar = bar relativo
Algunos de los cromatogramas realizados se muestran en las figuras 10
y 11 Como se puede observar la forma del pico de elucioacuten demuestra que el
biopoliacutemero estaacute compuesto por moleacuteculas de distinta longitud por lo cual
existen diferentes pesos moleculares Es importante destacar que para la gran
mayoriacutea de las fermentaciones realizadas el pico siempre presentoacute su maacutexima
altura al inicio lo que demuestra que la mayor parte de eacutel se trataba de un
poliacutemero de alto peso molecular Igualmente esto podriacutea indicar poca
degradacioacuten del biopoliacutemero durante las 18 horas de fermentacioacuten lo cual es
importante dada la capacidad de Bacillus licheniformis ATCC9945a de
hidrolizar enzimaacuteticamente el γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 69
Figura 10 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA analizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 70
Figura 11 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA (052-103-172 y 241 bar relativas)
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γshyPGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a
En lo referente al efecto de la intensidad de agitacioacuten en rpm sobre la
produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a a una presioacuten de
103 bar relativos (15 psig) se encontroacute un efecto negativo del aumento de la
agitacioacuten por encima de las 300 rpm lo que se demuestra con una importante
reduccioacuten en la concentracioacuten final de γ-PGA obtenida despueacutes de 18 horas de
fermentacioacuten Estos resultados se presentan en el graacutefico 11 Como se puede
observar una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm llega a ser tan perjudicial
para el microorganismo que la productividad en γ-PGA cae por debajo del valor
de 1 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 71
Graacutefico 11 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis
ATCC9945a a 103 bar (15 psig) a 30 ordmC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
300 350 400 450 500 550 600 650 700
Concentracioacuten gL
Agitacioacuten rpm
RENDIMIENTO (gL)
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica resultoacute afectada por las condiciones de
presioacuten Como demuestra el graacutefico 12 la proporcioacuten de aacutecido L-glutaacutemico en
las muestras correspondientes a fermentaciones bajo presioacuten resultoacute ser por
mucho mayor a las observadas en los cultivos control tanto en comparacioacuten
con el de matraz como con el sometido a aireacioacuten
La respectiva curva de calibracioacuten con las muestras conformadas por
mezclas con composicioacuten definida de ambos enantioacutemeros se presente en el
graacutefico 13 Como se puede observar los valores teoacutericos y los valores
experimentales obtenidos en el cromatograma coinciden en buena medida lo
que indica la validez de esta teacutecnica para la determinacioacuten de la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA
En dos casos para las fermentaciones llevada a cabo a 052 bar y 172
bar de sobrepresioacuten (75 y 25 psig respectivamente) la proporcioacuten de aacutecido D-
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 72
glutaacutemico fue de cero en contraste con el control en matraz donde dicha forma
del aacutecido glutaacutemico estaba presente mayoritariamente en un 87
De igual manera en lo que concierne a la fermentacioacuten llevada a cabo a
presioacuten atmosfeacuterica y bajo condiciones de aireacioacuten se observa tambieacuten que el
enantioacutemero mayoritariamente presente es el aacutecido D-glutaacutemico con un 83
en contraste con el aacutecido L-glutaacutemico con apenas un 17 Todas las
fermentaciones llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten presentan un
contenido de aacutecido L-glutaacutemico superior al 83
Aunque no fue posible encontrar una correlacioacuten directa entre la presioacuten
y la composicioacuten porcentual en aacutecido D-glutaacutemico si es posible observar como
las condiciones de presioacuten parecen limitar condicionar o disminuir la presencia
de esta forma del aacutecido glutaacutemico en el γ-PGA
Graacutefico 12 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica en aacutecido
L-glutaacutemico y aacutecido D-glutaacutemica del γ-PGA producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a
R11 (103bar)
R12 (103bar)
R15 (0 +aireacioacuten)
R16 (241bar)
R19 (172bar)
R22 (052bar)
MATRAZ
AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO 9518 8319 1736 10000 8347 10000 1285
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO 482 1681 8264 000 1653 000 8715
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 73
Graacutefico 13 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-
PGA mediante HPLC
000
2900
4700
7700
970010000
7100
5300
2300
300
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
100 L 75 L 25 D 50 L 50 D 25 L 75 D 100 D
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO
69 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA
Los resultados de los pesos moleculares de los poliacutemeros obtenidos en
los distintos ensayos se muestran en la tabla 9 El peso molecular promedio de
permeacioacuten (Mp) de todas las muestras se encontroacute entre los 269-307 x 107
gmol
Tabla 8 Valores de peso molecular promedio en nuacutemero (Mn) peso molecular promedio en
peso (Mw) peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) y polidispersidad (PD) delγ‐PGA
producido en los distintos ensayos evaluados
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
MATRAZ1 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 157 214 29 137
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
MATRAZ2 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 160 216 292 135
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar relativos
207 252 307 122 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 74
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
204 252 307 124 PRIMERO MAYOR
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
202 252 307 125 PRIMERO MAYOR
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
199 251 307 126 PRIMERO MAYOR
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 200 247 307 123
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 226 26 306 115
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 179 223 281 125
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 172 221 264 128
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
217 248 304 114 PRIMERO MAYOR
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
210 246 304 117 PRIMERO MAYOR
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
195 233 284 120 SEGUNDO MAYOR
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
178 225 269 126 SEGUNDO MAYOR
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
223 262 306 118 PRIMERO MAYOR
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
222 261 306 117 PRIMERO PAYOR
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
207 254 307 122 PRIMERO MAYOR
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
187 251 306 134 PRIMERO MAYOR
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
171 246 306 144 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
185 253 306 136 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
202 252 306 125 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 75
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
232 263 306 113 PRIMERO MAYOR
AHJC32-1-18HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
173 228 307 132 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-2-18HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
177 230 306 130 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-1-36HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
165 220 23 133 IGUALES
AHJC32-2-36HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
173 224 302 130 IGUALES
Los valores de polidispersidad estuvieron entre 113 y 144 Asiacute mismo
no se observan mayores diferencias entre los pesos moleculares obtenidos a
distintas presiones aunque la existencia de un segundo pico era maacutes evidente
en los cromatogramas correspondientes a γ-PGA producido en condiciones de
presioacuten relativa 0 Asiacute mismo dichas muestras presentan un peso molecular
levemente menor aunque dicha tendencia no es absoluta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 76
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 77
9 DISCUSIOacuteN
71 Cepa empleada
Bacillus licheniformis ATCC9945a es una cepa que ha sido empleada
con eacutexito en la produccioacuten de γ-PGA particularmente a escala laboratorio maacutes
no ha sido empleada a escala industrial donde otras cepas particularmente de
la especie Bacillus subtilis han sido las preferidas tanto por aspectos de
rendimiento como estabilidad productiva de la cepa El presente estudio
determinoacute una productividad promedio en condiciones de matraz de 4582 gL
despueacutes de 72 horas de cultivo Valores de productividad tan altos no habiacutean
sido reportado previamente para Bacillus licheniformis ATCC9945a donde
valores entre 17 y 23 gL de rendimiento han sido reportados por Troy (1973)
Cromwick y Gross (1996) 26 a 35 gL por Bajaj y colaboradores (2009) y 35
gL por Yoon y colaboradores (2000)
Los motivos de este mayor rendimiento aunque no son claros pueden
deberse a una mejor transferencia de oxiacutegeno en el sistema de agitacioacuten
magneacutetica en comparacioacuten con la agitacioacuten orbital estaacutendar Asiacute por ejemplo y
utilizando la ecuacioacuten simplificada para determinar en valor de kLa en agitacioacuten
orbital (Diacuteaz 2011) tenemos que a 20 ordmC
kLa = 139 x 10-3n (VTVL)084
Asiacute tenemos que para un sistema en agitacioacuten orbital a 250 rpm es decir
a una frecuencia de 417 s-1 con un volumen de medio de cultivo de 100 mL y
un volumen total del matraz 500 mL el valor de kLa es de aproximadamente
0020 s-1 inferior al valor de 0026 s-1 obtenido en el presente estudio para el
cultivo en agitacioacuten magneacutetica a 30 ordmC Dado que la difusividad disminuye al
aumentar la temperatura es de esperar que a 30 ordmC dicho valor de kLa teoacuterico
sea auacuten menor
Es importante sentildealar que en lo referente a la composicioacuten del medio de
cultivo el medio de cultivo E empleado en este estudio es el mismo empleado
previamente por otros autores para el estudio de la produccioacuten de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a por lo cual no se considera que la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 78
composicioacuten del medio de cultivo pueda ser la responsable de las diferencias
con los resultados reportados anteriormente por otros investigadores quienes
en particular tambieacuten emplearon dicho medio de cultivo en sus pruebas
Dicho valor de rendimiento promedio obtenido de 4582 gL (en matraz)
coloca a este cepa al mismo nivel de productividad de las cepas
industrialmente empleadas como sucede con Bacillus subtilis F02-1 con un
rendimiento reportado por Kubota y colaboradores (1993) de 50 gL pero con
una menor necesidad de aacutecido glutaacutemico (20 gL en contra de 80 gL) La
conveniencia del empleo de la cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis debe
entonces evaluarse entorno a su capacidad de escalamiento y conservacioacuten de
la competencia en la produccioacuten de γ-PGA y no entorno a su maacuteximo
rendimiento pues en este aspecto ha demostrado en condiciones oacuteptimas la
capacidad de producir γ-PGA en concentraciones extremadamente elevadas
Los resultados acaacute obtenidos refuerzan lo ya descrito por otros autores quienes
sentildealan precisamente estos aspectos (escalamiento y estabilidad) como los
principales retos para llevar a cabo la produccioacuten de γ-PGA mediante Bacillus
licheniformis ATCC9945a
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente
Uno de los principales problemas que se enfrentoacute a lo largo de la
presente investigacioacuten es la facilidad con la cual la cepa ATCC9945a de
Bacillus licheniformis revierte a formas incapaces de producir γ-PGA Este
fenoacutemeno puede ocurrir incluso con tan soacutelo una generacioacuten de cultivo por lo
cual el empleo de la biomasa generada en una fermentacioacuten previa es
indeseable pues seguramente no daraacute resultados positivos para la produccioacuten
de γ-PGA
Este fenoacutemeno es uno de los principales inconvenientes que se
enfrentan a la hora de evaluar el efecto de diversos paraacutemetros sobre la
productividad de γ-PGA en esta cepa pues la incapacidad de garantizar
resultados reproducibles imposibilita poder evaluar condiciones nutricionales
de agitacioacuten temperatura y demaacutes teniendo la certeza que las diferencias
encontradas solo se deberaacuten a los paraacutemetros bajo control
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 79
Cromwick y colaboradores (1994) reportaron el congelamiento con
nitroacutegeno liacutequido como una forma vaacutelida para la preservacioacuten de las ceacutelulas en
un estado consistente de alta productividad de γ-PGA En nuestro caso la
metodologiacutea empleada fue distinta Se incorporoacute el glicerol como crioprotector y
el congelamiento no se realizoacute mediante nitroacutegeno liacutequido sino que fue
congelamiento convencional utilizando un equipo de refrigeracioacuten con una
capacidad de enfriamiento de hasta -80 ordmC y voluacutemenes de inoacuteculo pequentildeos
de entre 1 y 2 mL cuyo congelamiento fuera particularmente raacutepido
Igualmente se observoacute que los cultivos que mejor comportamiento y
reproducibilidad dieron como inoacuteculo fueron aquellos cuyas ceacutelulas eran
recolectadas previo al inicio de la produccioacuten de γ-PGA Cultivos cuya edad
superaba las 10 horas y que ya presentaban presencia de γ-PGA aunque
podiacutean emplearse para la obtencioacuten de inoacuteculos madres los mismos no
resultaban tan eficientes como los anteriormente descritos
El empleo de esta metodologiacutea de conservacioacuten de la cepa permitioacute una
reproducibilidad del 100 en los ensayos obtenieacutendose poliacutemero en la
totalidad de los cultivos de control que se establecieron durante cada una de
las fermentaciones llevadas a cabo en el biorreactor Estos resultados indican
que dicha metodologiacutea es eficaz para la preservacioacuten a largo plazo de Bacillus
licheniformis ATCC9945a y como estrategia para un adecuado escalamiento
durante el proceso de produccioacuten a mayor escala De igual manera la
descripcioacuten detallada del proceso de conservacioacuten volumen de inoacuteculo
concentracioacuten de la muestra (por absorbancia) temperatura y demaacutes permite
una alta reproducibilidad del meacutetodo en contraposicioacuten con los reportes
existentes por otros autores que no brindaban mayor detalles sobre coacutemo llevar
a cabo este proceso de conservacioacuten
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten
Las fermentaciones a presiones superiores a la presioacuten atmosfeacuterica no
son habituales tanto a nivel de investigacioacuten como a nivel de proceso Dicha
afirmacioacuten queda particularmente ratificada cuando se analizan las opciones
comerciales existentes a escala laboratorio de biorreactores disentildeados para
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 80
operar a presioacuten la cual resulta praacutecticamente nula Por este motivo y para
poder llevar a cabo este estudio se requirioacute adaptar un reactor quiacutemico de
modo tal que permitiese trabajar a presioacuten y a la vez tuviese un control de
agitacioacuten y temperatura miacutenimo de modo tal que permitiese el cultivo de
microorganismos El biorreactor disentildeado fue exitoso pues permitiacutea un
crecimiento microbiano oacuteptimo y la produccioacuten de γ-PGA en un tiempo
relativamente corto de 18 horas
Las modificaciones realizadas en realidad fueron miacutenimas con respecto
a la estructura baacutesica del reactor quiacutemico convencional y con ellas se buscoacute
crear las condiciones que permitiesen incrementar la turbulencia en el sistema
de modo que existiese una mayor oxigenacioacuten y un mayor coeficiente
volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno (kLa) partiendo de antemano de la
hipoacutetesis inicial que sentildealaba al oxiacutegeno como uno de los componentes
limitantes de hecho el de mayor importancia para que este fermentacioacuten
ocurriese de la manera adecuada y con un alto rendimiento de γ-PGA
Se decidioacute emplear un reactor hecho de vidrio en lugar de uno metaacutelico
debido a que las condiciones de oxidacioacuten de la fermentacioacuten y la sensibilidad
de las enzimas involucradas a los iones metaacutelicos haciacutean deseable un material
inerte como sucede con el vidrio De igual manera al emplearse vidrio se tiene
una visioacuten del interior del fermentador las condiciones de agitacioacuten y formacioacuten
de burbujas son visibles asiacute como el crecimiento microbiano lo que permite un
mejor ajuste y correccioacuten de las condiciones de fermentacioacuten al menos durante
las etapas iniciales de investigacioacuten Para poder trabajar a mayores presiones
se hubiese requerido un reactor quiacutemico metaacutelico de un costo sumamente
elevado Los resultados experimentales demostraron que el rango de presioacuten
definido resultoacute ser el correcto para la investigacioacuten
La seleccioacuten de una turbina tipo Rushton radica en que este tipo de
agitador de pala plana se considera como el ideal para la realizacioacuten de
fermentaciones Dado que las paletas de heacutelices Rushton son planas y
colocadas verticalmente a lo largo del eje de agitacioacuten producen un flujo radial
unidireccional que permite una alta difusioacuten de un gas en un liacutequido por lo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 81
comuacuten son utilizadas en la fermentacioacuten de liacuteneas celulares que requieren altas
tasas de oxiacutegeno tales como las levaduras bacterias y algunos hongos
Las laacuteminas deflectoras fueron incorporadas pues aunque a velocidades
muy bajas un agitador de paletas produce una agitacioacuten suave inclusive en un
tanque sin laacuteminas deflectoras cuando son necesarias velocidades elevadas
se requiere la incorporacioacuten de dichas laacuteminas para aumentar la turbulencia de
lo contrario el liacutequido se mueve como un remolino que gira alrededor del
tanque con velocidad elevada pero con poco efecto de mezcla
74 Tiempo de fermentacioacuten
El tiempo de fermentacioacuten empleado en esta investigacioacuten es
significativamente inferior al empleado por otros autores que hablan de un
promedio de 72 horas Es importante sentildealar que 18 horas es el tiempo
suficiente para que el pH del medio de cultivo descienda a cerca de 60
Valores de pH inferiores a este han demostrado ser perjudiciales pues decae
el consumo de aacutecido ciacutetrico se detiene en gran medida la polimerizacioacuten del γ-
PGA y la concentracioacuten tiende a disminuir con el paso del tiempo
Para poder aumentar el periacuteodo de fermentacioacuten se requeririacutea un
sistema de ajuste de pH que opere bajo condiciones del presioacuten mismo que no
se tuvo disponible Es probable que si se prolongara el tiempo de fermentacioacuten
dentro del biorreactor los rendimientos al cabo de 48 o 72 horas seriacutean un
poco mayores siempre y cuando se ajuste el pH en el valor de 65 como
recomiendan Cromwick y colaboradores (1995)
En nuestro caso el incremento del tiempo de fermentacioacuten sin
regulacioacuten del pH de 18 horas a 36 horas mostroacute un incremento miacutenimo en la
productividad (de 025 gL) pero si un cambio en la composicioacuten del γ-PGA
pues el pico de elucioacuten del poliacutemero se desplazoacute levemente hacia un valor de
tiempo mayor lo que podriacutea indicar una degradacioacuten parcial del poliacutemero
inicialmente producido Dichos datos se presentan en la figura 12
Nuestros resultados contradicen lo sentildealado por otros autores quienes
obtienen los mayores rendimientos entre las 48 y 96 horas Birrer y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 82
colaboradores (1995) observaron que Bacillus licheniformis ATCC9945a
alcanza la fase estacionaria a las 24 horas tiempo en el cual muy poco γ-PGA
ha sido formado y por consiguiente la mayor formacioacuten de γ-PGA acontece
entre las 24 y las 96 horas Estos resultados coinciden con los reportados por
Troy (1973) pero difieren a los observados por Goto y Kunioka (1992) con
Bacillus subtilis IFO3335 donde el mayor rendimiento se obtuvo desde las 24 y
hasta las 40 horas Estas diferencias podriacutean deberse a aspectos maacutes
relacionados con los voluacutemenes de fermentacioacuten empleados Por ejemplo para
el caso de Yoon y colaboradores (2000) estos alcanzaron rendimientos de 35
gL con un periacuteodo de fermentacioacuten maacuteximo de 35 horas indicando un
agotamiento del aacutecido ciacutetrico a las 20 horas en su caso el volumen empleado
fue de 1 litro de medio de cultivo
Figura 12 Cromatograma a las 18 (a) y 36 (b) horas de fermentacioacuten con Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 83
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento
Un punto vital para una adecuada fermentacioacuten es la concentracioacuten de
inoacuteculo aspecto que es sentildealado por Troy Cromwick y colaboradores a lo
largo de sus investigaciones pero que no detallan ni cuantifican
adecuadamente o al menos no lo reportan En nuestro caso se empleoacute un
inoacuteculo madre con una absorbancia de 25 o mayor y un inoacuteculo del reactor con
un valor de absorbancia de 120 aproximadamente con el propoacutesito de asiacute
logran estandarizar las condiciones de inoacuteculo Aunque este aspecto no fue
cuantificado a manera cualitativa si se observoacute un importante efecto de este
aspecto (concentracioacuten inicial) sobre la cantidad de γ-PGA obtenido y el tiempo
requerido Esto puede resultarnos obvio teniendo en cuenta una descripcioacuten no
estructurada del crecimiento microbiano pero podriacutea resultar maacutes compleja de
analizar si consideramos que la produccioacuten del γ-PGA estaacute afectada por
paraacutemetros de otra naturaleza maacutes allaacute de la disposicioacuten de nutrientes como
por ejemplo de una estructura celular particular o una relacioacuten de percepcioacuten
de quoacuterum dada Debemos recordar que la percepcioacuten de quoacuterum es un
mecanismo de regulacioacuten de la expresioacuten geneacutetica en respuesta a la densidad
de poblacioacuten celular Las ceacutelulas involucradas producen y excretan sustancias
llamadas autoinductores que sirven de sentildeal quiacutemica para inducir la expresioacuten
geneacutetica colectiva De Vizio (2011) sentildeala que en Bacillus licheniformis NCIMB
8874 la produccioacuten de lichenysin γ-PGA y algunas proteasas extracelulares
estaacute vinculado con los genes comQXPA mismo operoacuten que regula la
percepcioacuten de quoacuterum en Bacillus subtilis
De igual manera la relacioacuten de escalamiento aplicada fue de 16
ligeramente inferior a la que teoacutericamente se utiliza con mayor frecuencia de
110 Aunque este iacutendice no fue objeto de estudio su ajuste tambieacuten afecta de
manera directa los rendimientos obtenidos
La optimizacioacuten de la concentracioacuten del inoacuteculo la relacioacuten de
escalamiento y su frecuencia constituyen aspectos que deben estudiarse con
mayor profundidad para su propia optimizacioacuten pues su efecto sobre esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 84
fermentacioacuten y su rendimiento es bastante significativo Esta afirmacioacuten
adquiere validez cuando vemos que la produccioacuten del γ-PGA no es un
metabolito primario que se forme durante la fase de crecimiento exponencial
sino maacutes bien al inicio de la etapa estacionaria como indica Goto y Kunioka
(antildeo) o durante toda la etapa estacionaria tal y como lo sentildealan tanto Troy
(antildeo) como Birrer y colaboradores (1994) A esto debemos agregarle tambieacuten
lo anteriormente sentildealado referente a la concentracioacuten idoacutenea que produce la
percepcioacuten de quoacuterum responsable de direccionar el metabolismo de la
comunidad microbiana hacia la siacutentesis del γ-PGA
Conociendo la dependencia de esta biosiacutentesis de la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio y partiendo del hecho de que al inicio de la fase
estacionaria la concentracioacuten celular seraacute lo suficientemente alta para poner el
riesgo el mantenimiento de las condiciones aeroacutebicas en el biorreactor pero lo
justa para una adecuada siacutentesis del γ-PGA un inoacuteculo con una alta
concentracioacuten inicial de ceacutelulas podriacutea ayudar a obtener un mayor rendimiento
en un tiempo de fermentacioacuten menor o producir la respuesta de percepcioacuten de
quoacuterum (generalmente se trata de la liberacioacuten de un polipeacuteptido sentildeal) en un
tiempo menor con la consiguiente produccioacuten del γ-PGA
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa es un valor de
suma importancia para el escalamiento de bioprocesos en particular cuando
nos referimos a fermentaciones aeroacutebicas o cultivos de organismos o ceacutelulas
en condiciones de metabolismo aeroacutebico En nuestro caso un adecuado
coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno es garantiacutea que las
condiciones aeroacutebicas se sostendraacuten a lo largo del proceso de fermentacioacuten de
modo que no se produzcan desviacuteos metaboacutelicos indeseados o en el peor de
los casos el inicio del metabolismo anaerobio y la consecuente produccioacuten de
aacutecido aceacutetico
Los valores de kla obtenidos fueron de 0026 s-1 y 0025 s-1 para el
matraz y el bioreactor respectivamente Dichos valores por si mismos nos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 85
indican poco si no determinamos la tasa de consumo de oxiacutegeno requerida
para el cultivo aeroacutebico de Bacillus licheniformis Doran (1995) reporta una
velocidad de consumo de oxiacutegeno m02 para el cultivo aeroacutebico de Bacillus
licheniformis de 231 x 10-5 gO2 g-1cel s
-1 si la concentracioacuten de ceacutelulas X en el
reactor es de 20 gL (determinado experimentalmente como el valor final
alcanzado en matraces con alta concentracioacuten de γ-PGA) la tasa de consumo
de oxiacutegeno (OUR) MO2 seraacute igual a Xm02 es decir 46 x 10-4 mgO2mL-1s-1 A
partir de estos datos y conociendo que kla = MO2ΔcA ΔcA = cA ndash cA sabiendo
que presioacuten atmosfeacuterica cA = 801 mgL a 30 ordmC y el valor cA en el biorreactor
a 30 ordmC es 74 mgL obtenemos un valor de kla del orden de 0062 s-1 Dicho
valor corresponde al valor teoacuterico que seriacutea necesario para mantener el cultivo
con el suministro adecuado y suficiente de oxiacutegeno y que como puede verse
es 25 veces mayor al kla real lo que indica que cuando el cultivo alcance la
maacutexima concentracioacuten celular de 20 gL las condiciones del cultivo no seraacuten
suficientes para un metabolismo cien por ciento aeroacutebico
Tiene sentido entonces que los rendimientos alcanzados en matraz sean
significativamente mayores que los mejores rendimientos obtenidos en
bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica Dado que el cultivo en matraz incorporaba
uacutenicamente 100 mL de medio de cultivo el microorganismo es capaz de
alcanzar una mayor concentracioacuten en una menor unidad de tiempo lo que le
permite alcanzar una mayor concentracioacuten de poliacutemero durante las 26 horas de
cultivo (8 iniciales + 18)
Por su parte para el caso del biorreactor el crecimiento oacuteptimo
probablemente demore maacutes en alcanzarse por lo cual el tiempo que transcurre
entre el alcance de la concentracioacuten limitante de 8 gL (concentracioacuten a la cual
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y la tasa de consumo de oxiacutegeno
(OUR) se igualan) y la concentracioacuten oacuteptima es lo suficiente como para afectar
los rendimientos de γ-PGA Esto resulta evidente al comparar los resultados de
matraz con los de bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica (0 bar relativos) donde la
diferencia en productividad entre ambos es de 43 gL de γ-PGA Dicha
diferencia se explica porque mientras que la concentracioacuten del inoacuteculo madre
mostraba una absorbancia promedio de 25 la del inoacuteculo empleado para el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 86
biorreactor era de 120 (100 ml de medio + inoacuteculo madre creciendo durante 8
horas) es decir praacutecticamente la mitad por lo cual la concentracioacuten inicial de
ceacutelulas era significativamente menor para el biorreactor en comparacioacuten con el
matraz
77 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En condiciones estaacuteticas el contenido de γ-PGAdemostroacute reducir
considerablemente la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
pasando de 74 mgL a 440 mgL a una concentracioacuten del 20 en γ-PGA
Este fenoacutemeno puede deberse al incremento de la viscosidad por la
presencia del poliacutemero en el caldo de cultivo Dicha apreciacioacuten seguramente
afecta de manera negativa la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) pues
reduce tanto cA como cA sin embargo la determinacioacuten del valor de c
A de una
solucioacuten compuesta por sales γ-PGA y productos del metabolismo microbiano
es imposible de determinar teoacutericamente con certeza como para poder
cuantificar la magnitud de reduccioacuten de la OTR numeacutericamente De igual
manera el valor de kLa tambieacuten se ve afectado pues es sabido que a mayor
viscosidad mayor resistencia a la transferencia lo que reduce el valor de este
coeficiente
Asiacute mismo esta reduccioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
podriacutea deberse en parte a la naturaleza anioacutenica del poliacutemero y no solamente
al incremento de la viscosidad La solubilidad se ve afectada por la fuerza
ioacutenica por lo cual una solucioacuten con una concentracioacuten elevada de un poliacutemero
polianioacutenico como el γ-PGA probablemente muestre una importante reduccioacuten
en la solubilidad maacutexima (concentracioacuten de saturacioacuten) del oxiacutegeno en la
misma(Schumpe et al 1978)
Queda claro que dada esta reduccioacuten en la solubilidad de oxiacutegeno al
incrementar el contenido de γ-PGA durante la fermentacioacuten ya sea por la
naturaleza viscosa del biopoliacutemero o por su caraacutecter polianioacutenico la tasa de
transferencia de oxiacutegeno inicial y el valor de kLa se van reduciendo a lo largo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 87
del tiempo lo que dificulta auacuten maacutes garantizar las condiciones de oxigenacioacuten
oacuteptimas para este bioproceso Esto lo podemos explicar pues si tenemos que
OTR = kLa(cA-cA)
dado que al aumentar el contenido de γ-PGA ocurre una reduccioacuten en el valor
de kLa por accioacuten del incremento de la viscosidad (hecho que es
completamente cierto) y al aumentar la concentracioacuten de γ-PGA tambieacuten se
reduce tanto el valor de cA como el de cA (ya sea por efecto de la viscosidad o
de la naturaleza anioacutenico del poliacutemero) la OTR ve su magnitud evidente e
inevitablemente reducida dado que la misma es una relacioacuten de producto entre
ambos factores kLa y (cA ndashcA) Esto podriacutea explicar porque a voluacutemenes de
cultivo de 600 mL (en biorreactor) los rendimientos son mucho menores que en
voluacutemenes de cultivo de 100 ml (matraz) pues probablemente esta caiacuteda en la
OTR sea maacutes acentuada y criacutetica para los microorganismos cuando sucede a
voluacutemenes mayores donde mantener las condiciones de mezcla perfecta y una
alta concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto resultan maacutes dificultosas por lo que el
microorganismo es incapaz de crecer y alcanzar la concentracioacuten idoacutenea para
una maacutexima produccioacuten
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γshyPGA
La concentracioacuten de γ-PGA alcanzada al final de las 18 horas de
fermentacioacuten se vio afectada por la presioacuten Asiacute hasta los 103 bar a mayor
presioacuten mayor concentracioacuten de γ-PGA por encima de este valor de presioacuten la
concentracioacuten de γ-PGA disminuye
Esto puede explicarse por dos factores 1) el efecto de la presioacuten sobre
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y 2) impacto sobre la integridad y
viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γ-PGA
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR
La OTR se ve afectada tanto por el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de oxiacutegeno kLa asiacute como por la diferencia entre la concentracioacuten
de saturacioacuten y la concentracioacuten real en la fase liacutequida (cA-cA) El coeficiente kL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 88
es empiacuterico y su valor depende principalmente de factores tales como la
hidrodinaacutemica del sistema la turbulencia y su geometriacutea
Teoacutericamente kL se puede definir como kL = DABδ donde DAB es la
difusividad de A en B y δ es el espesor de la peliacutecula estancada seguacuten la
teoriacutea de peliacutecula para la transferencia de materia La difusividad en liacutequidos
depende en gran medida de la temperatura (afecta el coeficiente de difusioacuten) y
la concentracioacuten de solutos pero muy poco de la presioacuten (Diacuteaz 2011) En
nuestro caso podriacuteamos suponer que la presioacuten tiene poco efecto sobre kLa
pues tampoco es de esperar un cambio producto de la presioacuten en el aacuterea de
burbujas (a) producida por la agitacioacuten mecaacutenica auacuten maacutes cuando vemos el
hecho de que los ensayos llevados a cabo no contaron con un sistema de
aireacioacuten o burbujeo especiacutefico salvo aquel llevado a presioacuten atmosfeacuterica (0
bar relativa) y debidamente identificado como Aireacioacuten
Asiacute entonces tenemos en el segundo componente de la foacutermula la
diferencia (cA-cA) un punto de particular intereacutes pues efectivamente la
concentracioacuten de saturacioacuten y la concentracioacuten real variacutean con la presioacuten A
pesar de carecer de una sonda de oxiacutegeno disuelto directamente incorporada
al biorreactor y capaz de operar a presioacuten se determinoacute mediante transferencia
(con el sistema cerrado) la concentracioacuten real de oxiacutegeno en el medio de
cultivo a distintas presiones Tales concentraciones y las concentraciones de
saturacioacuten a cada presioacuten se presentan en el graacutefico 14
Para determinar el valor de las distintas concentraciones de saturacioacuten
al trabajar a presiones distintas a la atmosfeacuterica se realizoacute la siguiente
correccioacuten (Montoya amp Bermuacutedez 2003) para el valor de la solubilidad del
oxiacutegeno en agua
Ley de Henry
a 1 atm
Para una presioacuten P distinta a 1 atm tenemos que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 89
en mgL
Donde
C(S) = valor de solubilidad a 1 atm (mgL)
P = presioacuten de operacioacuten (atm)
T = temperatura de operacioacuten (K)
Graacutefico 14 Concentraciones de oxiacutegeno de saturacioacuten y en fas liacutequida a diferentes presiones
en medio de cultivo E sin crecimiento bacteriano
80
153
227
324
422
6681
141154
178
141
724857
1703
2438
y = 48525x + 68875
y = 14191x + 80039
y = 93382x + 11163
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
00
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 05 1 15 2 25 3
Concentracioacuten
Presioacuten (bar)
CONCENTRACIOacuteN DE SATURACIOacuteN CONCENTRACIOacuteN EN FASE LIacuteQUIDA DIFERENCIA
Aunque estos valores deben repetirse con una sonda de oxiacutegeno
disuelto interna (dentro del biorreactor) y bajo una metodologiacutea maacutes pertinente
preliminarmente puede observarse que la diferencia (cA-cA) aumenta al
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 90
aumentar la presioacuten y dado que OTR = kLa(cA-cA) al aumentar dicha
diferencia la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deberiacutea ser mayor Este
incremento de la OTR podriacutea explicar el porqueacute del raacutepido crecimiento
microbiano y la produccioacuten precoz de γ-PGA despueacutes de 18 horas de cultivo
en comparacioacuten con las entre 48 y 96 horas reportadas por otros autores asiacute
como el aumento del rendimiento al aumentar la presioacuten de los 0 bar relativos
(a presioacuten atmosfeacuterica) hasta los 103 bar relativos
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γshyPGA
Al superar los 103 bar relativos el rendimiento en γ-PGA decae
nuevamente Si consideramos un efecto positivo de la presioacuten sobre la OTR
como sentildealamos anteriormente esto no deberiacutea ocurrir Sin embargo al
someter las ceacutelulas a condiciones de presioacuten desconocemos el efecto que
dicha presioacuten puede ejercer sobre los microorganismos y sus rutas
metaboacutelicas asiacute como sobre la estructura de algunas biomoleacuteculas como por
ejemplo proteiacutenas
Meersman y Heremans (2008) sentildealan que el efecto de la presioacuten sobre
el crecimiento de los microorganismos puede explicarse por tres efectos
principales 1) Variaciones en el plegamiento y agregacioacuten de las proteiacutenas 2)
Variaciones en el estado de la membrana celular y 3) Variaciones en el
contenido de proteiacutenas asociadas a la membrana celular Estos aspectos son
de peculiar consideracioacuten pues la γ-PGA sintetasa es un complejo enzimaacutetico
formado por al menos tres unidades enzimaacuteticas distintas y que se encuentra
asociado a la membrana celular de Bacillus licheniformis
En lo referente a las proteiacutenas se sabe que su desnaturalizacioacuten se
produce por efecto de una reduccioacuten en su volumen producto de un cambio
configuracional probablemente de la estructura terciaria Asiacute tenemos que si el
volumen inicial de una proteiacutena viene dado por Vi = Vatomos + Vcavidades +
Vhidratacioacuten si en condiciones de presioacuten ocurre un cambio en el volumen de la
proteiacutena tal que ΔV = ΔVcavidades + ΔΔVhidratacioacuten(el volumen de los aacutetomos no
tiene por queacute variar con la presioacuten) la exposicioacuten de los grupos cargados o
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 91
hidrofoacutebicos de la proteiacutena al agua pueden conllevar a un cambio en la
estructura secundaria y terciaria de modo que la actividad de la proteiacutena se
vea perjudicada parcial o totalmente Esto se debe a que un aumento en la
presioacuten rompe las interacciones hidrofoacutebicas donde las interacciones proteiacutena-
proteiacutena son sustituidas por interacciones proteiacutena-agua particularmente
mediante puente de hidroacutegeno El incremento de la presioacuten podriacutea afectar la
conformacioacuten de alguno o algunos de los componentes del complejo
enzimaacutetico γ-PGA sintetasa lo que sin duda alguna se traduciriacutea en un menor
rendimiento en γ-PGA durante la fermentacioacuten Este posible efecto negativo de
la presioacuten sobre una de las enzimas involucradas en el proceso de biosiacutentesis
del γ-PGA se reafirma cuando vemos como variacutea la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA al aumentar la presioacuten aspecto que se discutiraacute con mayor detalle
maacutes adelante De hecho Ashiuchi y colaboradores (2004) sentildealan que el
complejo enzimaacutetico PgsBCA (γ-PGA sintetasa) es imposible de aislar en su
estado activo debido precisamente a su alta inestabilidad y elevada
hidrofobicidad
Por su parte la membrana celular al tratarse de una bicapa fosfolipiacutedica
es susceptible a sufrir cambios de fase producto de la temperatura o la presioacuten
como por ejemplo la transicioacuten gel-liacutequido El incremento de la presioacuten al igual
que sucede con la temperatura concede mayor fluidez a las bicapas lipiacutedicas
Asiacute en nuestro caso un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea permitir
una mayor difusioacuten de oxiacutegeno al interior celular lo que podriacutea afectar el
crecimiento bacteriano si por ejemplo se formase maacutes especies reactivas
toacutexicas de oxiacutegeno en el interior celular o si cierta maquinaria celular como la
misma γ-PGA sintetasa no fuese capaz de acoplarse adecuadamente en una
membrana con mayor fluidez
En lo referente a la interaccioacuten membrana celular-proteiacutenas es
importante destacar que entre el 20 y el 40 de las proteiacutenas de una ceacutelula
bacteriana suelen estar asociadas a esta estructura Como indicamos
anteriormente un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea afectar el
contenido concentracioacuten y capacidad de anclaje de las proteiacutenas a la
membrana celular El complejo enzimaacutetico γ-PGA sintetasa al tratarse de una
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 92
proteiacutena de membrana podriacutea no acoplarse de manera efectiva a la membrana
celular modificada bajo condiciones de presioacuten o ser liberada al medio de
cultivo lo que afectariacutea negativamente la produccioacuten de γ-PGA Estas
suposiciones podriacutean explicar el porqueacute de la gran cantidad de espuma
generada durante algunas fermentaciones a presioacuten (concretamente en
aquellas a una presioacuten superior a los 103 bar) a pesar de su menor
concentracioacuten de γ-PGA y teniendo presente que en las fermentaciones
microbianas la espuma suele estar constituida mayoritariamente por proteiacutenas
la presioacuten podriacutea estar favoreciendo la liberacioacuten de estas proteiacutenas al caldo de
cultivo y la consecuente formacioacuten abundante de espuma Este fenoacutemeno ya
ha sido reportado en otros microorganismos como Salmonella enterica donde
el tratamiento con presioacuten conllevaba a la peacuterdida de gran parte de sus
proteiacutenas de membrana y su consecuente liberacioacuten al medio de cultivo
(Meersman amp Heremans 2008) Esto se ve respaldado con las observaciones
de Ashiuchi y colaboradores (2004) quienes adicionaron detergentes como el
Tween20 y Triton X-114 (que modifican la estabilidad de la membrana celular y
favorece la liberacioacuten de las proteiacutenas asociadas a ella) a cultivos de Bacillus
spp productores de γ-PGA Ellos observaron una peacuterdida total de la capacidad
de siacutentesis del γ-PGA capacidad que no se recuperaba ni siquiera removiendo
la totalidad de dichos detergentes mediante diaacutelisis con lo cual concluyeron
que es indispensable que el complejo γ-PGA sintetasa se encuentre asociado a
la membrana celular para ser bioloacutegicamente activo
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γshyPGA
Un incremento de la intensidad de agitacioacuten afectariacutea positivamente el
valor de kLa incrementaacutendolo al aumentar el aacuterea de intercambio mediante una
mayor ruptura de las burbujas lo que aumenta el aacuterea de intercambio por
unidad de volumen Sin embargo existen liacutemites para la velocidad de agitacioacuten
esto debido al dantildeo ocasionado a los organismos debido a un esfuerzo
cortante excesivo A pesar de que la turbina Rushton es el impulsor de flujo
axial maacutes recomendado y maacutes eficiente para generar una mezcla perfecta de
alto perfil hidrodinaacutemico un bajo esfuerzo cortante y una alta distribucioacuten un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 93
exceso de agitacioacuten bajo condiciones de presioacuten es evidentemente perjudicial
Es probable que al aplicar presioacuten positiva sobre el cultivo la membrana celular
se encuentre en un estado de fluidez mayor al que presentariacutea a presioacuten
atmosfeacuterica asiacute mismo la presencia de glicerol en el medio de cultivo modifica
la composicioacuten lipiacutedica de la membrana favoreciendo la salida del γ-PGA al
exterior celular al aumentar de igual manera su fluidez Esto queda demostrado
por nuestros resultados a velocidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm
donde ocurre una reduccioacuten de la productividad conforme se aumenta la
agitacioacuten De igual manera la excesiva formacioacuten de espuma que se genera a
intensidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm podriacutea indicar la ruptura celular
y la liberacioacuten de componentes celulares y macromoleacuteculas al caldo de
fermentacioacuten Estas observaciones contradicen lo reportado por otros autores
(Yoon et al 2000) quienes indican velocidades de agitacioacuten oacuteptimas de hasta
1000 rpm a presioacuten atmosfeacuterica para un biorreactor de 24 L y un volumen
efectivo de cultivo de 1 L aunque no se brindan mayor detalle en lo referente al
tipo de turbina empleada
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
El cambio de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producto de la
presioacuten fue un resultado inesperado pues tradicionalmente se habiacutea sentildealado
a la concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo como el principal
responsable de controlar este aspecto Es importante destacar el hecho que
dicho cambio en la composicioacuten no es parcial o escalonado sino que por el
contrario el hecho de aplicar presioacuten durante la fermentacioacuten invierte
praacutecticamente los contenidos de aacutecido D-glutaacutemico y aacutecido L-glutamico de 87
y 13 respectivamente a presioacuten atmosfeacuterica (cultivo en matraz) a 17 y 83
respectivamente a una presioacuten relativa de 103 bar En algunos casos el
contenido de aacutecido D-glutaacutemico fue praacutecticamente 0
Efectivamente se sabe que el complejo γ-PGA sintetasa es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico aunque todaviacutea se
desconoce la arquitectura bioloacutegica de esta sintetasa Igualmente se sabe que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 94
es el componente PgsB el mayormente responsable de la cataacutelisis enzimaacutetica
(reaccioacuten de elongacioacuten del γ-PGA) (Ashiuchi 2010) Una hipoacutetesis que podriacutea
explicar estos resultados es que bajo presioacuten la estructura de esta proteiacutena se
modifique parcialmente (tanto la estructura de la proteiacutena propiamente dicha
como la estructura en funcioacuten de su anclaje a la membrana celular) lo
suficiente como para reducir su afinidad por el aacutecido D-glutaacutemico pero sin
afectar su afinidad por el aacutecido L-glutaacutemico ni conllevar a una
desnaturalizacioacuten de la proteiacutena y la consiguiente peacuterdida total de la actividad
enzimaacutetica Dado que es poco lo que se conoce de la estructura y mecanismo
de accioacuten de esta proteiacutena PgsB es imposible poder determinar con mayor
detalle el coacutemo pueden darse este cambio en la proteiacutena aunque casos
similares se observan durante la desnaturalizacioacuten de proteiacutenas por
temperatura donde las enzimas que operan sobre muacuteltiples sustratos no
pierden su capacidad enzimaacutetica de manera total sobre todos ellos sino que
inicialmente acontece una peacuterdida de afinidad diferenciada seguacuten el sustrato
hasta llegar al punto de desnaturalizacioacuten total donde se pierde toda actividad
enzimaacutetica para todos los sustratos
De igual manera es conocido que existe en Bacillus licheniformis una
enzima racemasa de naturaleza citosoacutelica responsable de transformar el aacutecido
L-glutaacutemico en aacutecido D-glutaacutemico podriacutea entonces tambieacuten asumirse alguacuten
efecto de la presioacuten sobre la actividad de la misma Sin embargo el hecho de
que esta enzima no esteacute asociada a una membrana celular (las proteiacutenas
asociadas a membrana celular tienden a ser maacutes vulnerables a los cambios de
presioacuten por la complejidad e indispensabilidad de su estructura terciaria sobre
su funcioacuten y su anclaje) sea una enzima de un uacutenico dominio y a que
experimentalmente el contenido de aacutecido D-glutaacutemico inclusive a la maacutexima
presioacuten (241 bar) no es cero hacen suponer que la misma se encuentra
bioloacutegicamente activa bajo las condiciones de presioacuten evaluadas
Estos resultados son de suma importancia pues para aplicaciones
biomeacutedicas y farmaceacuteuticas es necesario que el γ-PGA presente un alto
contenido en aacutecido L-glutaacutemico isoacutemero que es reconocido por el organismo
humano El efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre esta composicioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 95
enantiomeacuterica constituye un descubrimiento que pueda facilitar el empleo del γ-
PGA en medicina y que puede ser clave en el disentildeo de un proceso productivo
optimizado para tal fin
711 Peso molecular del γshyPGA En lo correspondiente al peso molecular del γ-PGA se observa que el
tamantildeo del poliacutemero es grande aunque no se observa ninguna tendencia en
los datos que pueda suponer alguacuten efecto de la presioacuten sobre el peso
molecular del poliacutemero Es importante sentildealar que la columna cromatograacutefica
empleada es incapaz de resolver moleacuteculas del alto peso molecular por lo
cual aunque si bien los resultados obtenidos resulten uacutetiles a nivel
comparativo dichos resultados deben tomarse con precaucioacuten Para un mejor
anaacutelisis seriacutea necesario emplear una columna capaz de resolver altos pesos
moleculares
Es importa sentildealar ademaacutes que tal y como se comentoacute anteriormente y
como se muestra en la figura 12 se observa una reduccioacuten del peso molecular
al prolongar el tiempo de fermentacioacuten hasta las 36 horas Para el caso del
reactor AHCJ32 al prolongar el tiempo de fermentacioacuten por 18 horas maacutes se
nota una reduccioacuten en la fraccioacuten de mayor peso molecular y un incremento en
la de menor sin que haya un cambio importante en el rendimiento global Esto
podriacutea deberse a que Bacillus licheniformis ATCC9945a posee enzimas
capaces de hidrolizar el γ-PGA y emplearlo como fuente de carbono Asiacute
mismo dicha observacioacuten sentildeala que si es necesario prolongar el tiempo de
fermentacioacuten es requerido realizar ajustes pues parece ser que la prolongacioacuten
por siacute misma uacutenicamente no es garantiacutea de una mejora en el rendimiento del
proceso fermentativo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 96
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 97
10 CONCLUSIONES
De la elaboracioacuten de la presente investigacioacuten se pueden extraer las
siguientes conclusiones principales
1) El rendimiento promedio en γ-PGA para el cultivo en matraz fue
superior a los 45 gL Dicho rendimiento es el mayor que se haya
reportado hasta la fecha para Bacillus licheniformis ATCC9945a lo
que convierte a esta cepa en una de las que mejor rendimiento
maacuteximo reporta para la biosiacutentesis de dicho poliacutemero natural
2) Un mecanismo eficiente para la conservacioacuten de cultivos de Bacillus
licheniformis ATCC9945a en un estado competente de produccioacuten
de γ-PGA es el congelamiento de ceacutelulas vegetativas a una
temperatura de -80 ordmC Es importante que la absorbancia de las
muestras congeladas sea superior a 25 lo que garantiza una alta
concentracioacuten de ceacutelulas
3) Dada la naturaleza del γ-PGA y su viscosidad el aumento de su
concentracioacuten en el caldo de cultivo a lo largo del tiempo de
fermentacioacuten afecta de manera negativa la tasa de transferencia de
oxiacutegeno disminuyeacutendola paulatinamente El cambio a condiciones
anaeroacutebicas conlleva a la detencioacuten de la biosiacutentesis del γ-PGA y el
consecuente inicio de un metabolismo netamente anaeroacutebico
4) Bacillus licheniformis ATCC9945a es capaz de crecer eficientemente
a presiones de hasta 242 bar relativos no vieacutendose afectado desde
el punto de vista de viabilidad por el incremento de la variable
presioacuten de fermentacioacuten
5) La presioacuten de fermentacioacuten afecta de manera significativa la
productividad de Bacillus licheniformis ATCC9945a en γ-PGA
6) El incremento de la presioacuten de fermentacioacuten hasta los 103 bar
relativos aumenta la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo de cultivo
seis veces (de 218 gL a 1334 gL) en comparacioacuten a los
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 98
rendimientos obtenidos a presioacuten atmosfeacuterica para un periacuteodo de
proceso de 18 horas
7) A presiones de fermentacioacuten superiores a los 103 bar la
productividad decae en comparacioacuten a la obtenida a dicha presioacuten
sin embargo la misma sigue siendo superior a la obtenida a presioacuten
atmosfeacuterica para un periacuteodo de proceso de 18 horas
8) El aumento de la presioacuten probablemente incremente la tasa de
transferencia de oxiacutegeno al incrementar la concentracioacuten de
saturacioacuten del mismo en el medio de cultivo lo que genera un
gradiente de concentracioacuten que permite una mayor transferencia
9) Presiones superiores a 103 bar probablemente afecten estructuras
celulares o biomoleacuteculas tales como las membranas celulares y las
proteiacutenas (γ-PGA sintasa) lo que tiene un efecto perjudicial sobre la
biosiacutentesis de γ-PGA
10) A una temperatura de 30 ordmC y a una presioacuten de 103 bar la
intensidad de agitacioacuten oacuteptima es de 300 rpm Una magnitud de
agitacioacuten mayor produce el dantildeo celular posiblemente por un exceso
de tensioacuten cortante
11) La presioacuten de fermentacioacuten modifica la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA A presioacuten atmosfeacuterica el γ-PGA estaacute compuesto
mayoritariamente por aacutecido D-glutaacutemico A presiones entre 052 y
242 bar dicha composicioacuten se revierte siendo el aacutecido L-glutaacutemico
el isoacutemero maacutes comuacutenmente presente en el γ-PGA
12) La biosiacutentesis de γ-PGA a presioacuten constituye una forma eficiente de
producir un biopoliacutemero mayoritariamente conformado por residuos
de aacutecido L-glutaacutemico aspecto de vital importancia para su aplicacioacuten
biomeacutedica dado que es este isoacutemero del aacutecido glutaacutemico es que es
reconocido y asimilado por el organismo humano
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 99
13) Aunque la modificacioacuten de la presioacuten de fermentacioacuten nunca ha sido
una variable importante en el estudio de los rendimientos para
distintos bioprocesos la presente investigacioacuten demuestra que la
modificacioacuten de dicha variable no soacutelo permite mejorar el
rendimiento global del proceso sino que tambieacuten puede conllevar a
la modificacioacuten del producto final lo que significariacutea una nueva rama
para la investigacioacuten en el disentildeo de bioprocesos de intereacutes
industrial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 100
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 101
11 AGRADECIMIENTOS
Un agradecimiento especial al profesor Jordi Bou por brindarme la
oportunidad de trabajar a su lado en este proyecto por el seguimiento y
asesoriacutea brindada a lo largo del mismo que nos permitioacute alcanzar nuestros
planteamientos y objetivos Espero que los aportes brindados con la presente
investigacioacuten permitan un mejor desarrollo en el futuro de estas temaacuteticas tan
novedosas biopoliacutemeros y fermentaciones bajo condiciones de presioacuten
positiva
Igualmente a la Ing Alejandra Hernaacutendez por la colaboracioacuten y asistencia
brindada durante esta investigacioacuten fue un apoyo importante durante el
desarrollo de las metodologiacuteas y distintas pruebas que se requirieron a lo largo
de esta investigacioacuten
A la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el Desarrollo
(AECID) y a Casa Ameacuterica Cataluntildea que me brindaron la oportunidad de cursar
este programa de maacutester a traveacutes de su programa de extensioacuten de becas a
ciudadanos extranjeros ha sido una oportunidad de crecimiento personal y
profesional que alcanza su punto maacuteximo con la elaboracioacuten de la presente
investigacioacuten El conocimiento adquirido sin duda alguna seraacute un valioso
compantildeero en mi desempentildeo profesional futuro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 102
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 103
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Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 4
vista de viabilidad por el incremento de la variable presioacuten de fermentacioacuten De
igual manera la presioacuten de fermentacioacuten afecta de manera significativa la
productividad de Bacillus licheniformis ATCC9945a en γ-PGA Asiacute mismo la
presioacuten de fermentacioacuten modifica la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 5
2 IacuteNDICE
1 RESUMEN 3
2 IacuteNDICE 5
3 GLOSARIO 9
4 PREFACIO 11
21 Origen del proyecto 11
22 Motivacioacuten 11
5 INTRODUCCIOacuteN 13
31 Objetivos 14
6 MARCO TEOacuteRICO 15
41 Los poliaminoaacutecidos 15
42 El aacutecido γ‐poliglutaacutemico (γ‐PGA) 15
421 Propiedades quiacutemicas y bioquiacutemicas del γ‐PGA 16
422 Siacutentesis microbioloacutegica de γ‐PGA 18
423 Produccioacuten fermentativa de γ‐PGA 22
424 Produccioacuten de γ‐PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a 24
425 Purificacioacuten del γ‐PGA 31
426 Control del peso molecular y degradacioacuten del γ‐PGA 32
427 Aplicaciones del γ‐PGA 33
43 Disentildeo de procesos biotecnoloacutegicos y la transferencia de materia gas‐liquido 38
431 La transferencia de materia gas‐liacutequido 39
432 La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) 40
433 Descripcioacuten de la transferencia maacutesica con kLa 40
44 Fermentaciones a presioacuten 42
7 MATERIALES Y METODOLOGIacuteA 45
51 Informacioacuten de la cepa empleada 45
52 Medio de cultivo empleado 45
53 Preparacioacuten de los inoacuteculos madre 46
531 Conservacioacuten de la cepa en estado productivo 46
54 Montaje del biorreactor a presioacuten 46
55 Condiciones de fermentacioacuten 50
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 6
551 Escalamiento 50
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre 51
56 Determinacioacuten del valor de kLa 52
561 Matraces de cultivo 53
562 Biorreactor 53
563 Graficacioacuten 53
57 Determinacioacuten del contenido de γ‐PGA en el caldo de fermentacioacuten 54
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA en la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo 55
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano 55
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 56
5101 Preparacioacuten de la muestras 56
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual 57
511 Determinacioacuten del peso molecular del γ‐PGA 57
8 RESULTADOS 59
61 Montaje del biorreactor a presioacuten 59
62 Competencia del inoacuteculo madre 59
63 Determinacioacuten de los valores de kLa 60
631 Matraz 60
632 Biorreactor 63
64 Efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto 64
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ‐PGA mediante
GPChelliphellip 65
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γ‐PGA 66
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ‐PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a 70
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 71
69 Determinacioacuten del peso molecular del γ‐PGA 73
9 DISCUSIOacuteN 77
71 Cepa empleada 77
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente 78
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten 79
74 Tiempo de fermentacioacuten 81
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento 83
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 7
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa 84
77 Efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto 86
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γ‐PGA 87
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR 87
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la
biosiacutentesis del γ‐PGA 90
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γ‐PGA 92
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 93
711 Peso molecular del γ‐PGA 95
10 CONCLUSIONES 97
11 AGRADECIMIENTOS 101
12 BIBLIOGRAFIacuteA 103
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 8
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 9
3 GLOSARIO
Bacillus Es un geacutenero de bacterias en forma de bastoacuten y Gram positiva El
geacutenero Bacillus pertenece a la divisioacuten Firmicutes Son aerobios estrictos o
anaerobios facultativos En condiciones estresantes forman una endospora de
ubicacioacuten central Dicha forma esporulada es resistente a las altas
temperaturas y a los desinfectantes quiacutemicos corrientes
γ-PGA Aacutecido gamma-poliglutaacutemico
ATCC American Type Culture Collection coleccioacuten y depositario de microorganismos
de importancia industrial y cientiacutefica
Biorreactor Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente
bioloacutegicamente activo En algunos casos un biorreactor es un recipiente en el
que se lleva a cabo un proceso quiacutemico que involucra organismos o
sustancias bioquiacutemicamente activas derivadas de dichos organismos Este
proceso puede ser aeroacutebico o anaeroacutebico Estos biorreactores son
comuacutenmente ciliacutendricos variando en tamantildeo desde algunos mililitros hasta
metros cuacutebicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable
OTR Tasa de transferencia de oxiacutegeno
OUR Tasa de consume de oxiacutegeno por parte de un microorganismo
kL Coeficiente de transferencia maacutesica
a Aacuterea de transferencia de materia por unidad de volumen
kLa Coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 10
cA
Concentracioacuten de saturacioacuten de oxiacutegeno Maacutexima concentracioacuten de oxiacutegeno que pueda estar disuelto en una fase liacutequida perfectamente mezclada
cA Concentracioacuten de oxiacutegeno en el liacutequido o concentracioacuten real Es determinada experimentalmente haciendo uso de una sonda de oxiacutegeno disuelto
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 11
4 PREFACIO
21 Origen del proyecto
Este proyecto forma parte de una serie de estudios llevados a cabo en
el ETSEIB referentes al empleo y produccioacuten de biopoliacutemeros en Cataluntildea
Anteriormente no solo se ha investigado en torno a la produccioacuten mediante
fermentacioacuten del biopoliacutemero aacutecido poliglutaacutemico sino tambieacuten sobre la
produccioacuten de aacutecido polilaacutectico y su biodegradabilidad entre otros
Una de las principales limitantes que han encontrado los estudios
previos sobre produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico en medio liacutequido mediante
fermentacioacuten sumergida es la dificultad del escalamiento muy probablemente
debido a la reduccioacuten en la tasa de transferencia de oxiacutegeno al aumentar los
voluacutemenes de cultivo lo que conlleva a rendimientos pobres o a la generacioacuten
de un poliacutemero de bajo peso molecular Asiacute mismo la reproducibilidad de los
resultados es pobre en parte por muacuteltiples factores que fueron estudiados con
mayor detalle en este trabajo
Con el propoacutesito de dar solucioacuten a este problema el presente proyecto
plantea una forma diferente y creativa al menos no es la comuacuten en el aacutembito
microbioloacutegico de abordar la limitacioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
durante la fermentacioacuten y que podriacutea ser la responsable de la reduccioacuten en los
rendimientos Asiacute mediante la aplicacioacuten de condiciones de presioacuten positiva se
plantea una posible viacutea de mejora de los rendimientos fermentativos en la
produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico esperando que sus efectos sobre la
viabilidad microbiana sean los menores posibles
22 Motivacioacuten
En la sociedad actual existe una creciente buacutesqueda de soluciones
bioloacutegicas para los problemas que anteriormente abordaacutebamos desde una
percepcioacuten uacutenicamente quiacutemica Asiacute hoy en diacutea con el propoacutesito de garantizar
la preservacioacuten del medio ambiente reducir el impacto de la actividad humana
sobre las especies animales y vegetales y garantizar un planeta a las futuras
generaciones la palabra biopoliacutemero y bioplaacutestico se han vuelto maacutes y maacutes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 12
comunes tanto en el argot popular como en el aacutembito del conocimiento
cientiacutefico donde diacutea con diacutea son maacutes las investigaciones orientadas a este tipo
de productos de naturaleza bioloacutegica y por consiguiente biodegradable
El aacutecido poliglutaacutemico por sus caracteriacutesticas constituye un poliacutemero
natural que ofrece una amplia gama de aplicaciones industriales donde puede
ser empleado tanto como agente espesante o floculador hasta aplicaciones
maacutes novedosas relacionadas con la medicina y la farmacia
En este contexto de buacutesqueda de soluciones amigables con el ambiente
es donde surge la principal motivacioacuten para investigar sobre el aacutecido
poliglutaacutemico en particular sobre coacutemo aumentar la productividad del proceso
fermentativo a partir del cual se realiza su siacutentesis de modo que las ventajas
teoacutericas que ofrece este producto pronto esteacuten disponibles tanto para el
consumidor como para la industria Tristemente los productos biotecnoloacutegicos
casi siempre tienen como principal inconveniente la valoracioacuten econoacutemica
pues tienden a ser difiacuteciles de producir por lo que tienen altos costos
asociados o sus rendimientos son menores a los deseados para hacerlos
econoacutemicamente rentables Por este motivo las investigaciones deben
procurar al menos orientarse a ofrecer soluciones que alguacuten diacutea puedan ser
llevadas a la praacutectica o como sucede con esta investigacioacuten procurar dar
respuesta a los problemas que se enfrentan cuando se trata de llevar un
producto biotecnoloacutegico a la realidad
La importancia de la investigacioacuten biotecnoloacutegica en el campo de los
materiales radica en que en un mundo con materias primas limitadas
particularmente las fuentes foacutesiles los materiales del futuro tendraacuten un origen
maacutes bioloacutegico que mineral o extractivo por lo que la mejora de los procesos
productivos relacionados con estos productos son prioritarios para cualquier
paiacutes que desee mantenerse competitivo en el aacutembito econoacutemico y tecnoloacutegico
mundial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 13
5 INTRODUCCIOacuteN
En la actualidad el desarrollo de biomateriales constituye uno de los
principales ejes de investigacioacuten en el mundo de la ciencia Dentro de estos
biomateriales los biopoliacutemeros han logrado un particularmente alto grado de
atencioacuten especialmente en los uacuteltimos 30 antildeos debidos a sus muacuteltiples
aplicaciones industriales biomeacutedicas y farmaceacuteuticas que estaacuten aportando una
amplia gama de opciones y soluciones a problemas ambientales y en la
formulacioacuten de nuevas preparaciones biomeacutedicas y farmaceacuteuticas
Los biopoliacutemeros son materiales polimeacutericos o macromoleculares que
son sintetizados por seres vivos Debido en gran parte al precio creciente la
viabilidad declinante de las fuentes foacutesiles como materias primas asiacute como el
ritmo crecimiento de la poblacioacuten mundial han propiciado el desarrollo de
fuentes alternativas renovables capaces de suministrar las necesidades
mundiales crecientes en material de energiacutea y produccioacuten quiacutemica Esta
necesidad de nuevas fuentes alternativas ha permitido que la mirada cientiacutefica
se halle puesta sobre la diversidad microbiana que habita el planeta pues los
microorganismos siempre han demostrado ser una fuente importante de
materiales novedosos con la ventaja que en la actualidad se dispone de la
tecnologiacutea necesaria para crecer los microorganismos de manera masiva y
segura Este nuevo modelo conocido como la estrategia de las biorefineriacuteas
ha cambiado la concepcioacuten de la industria quiacutemica moderna y ha sido
empleada exitosamente en la produccioacuten convencional a granel de diversos
productos quiacutemicos como por ejemplo etanol glutamato y aacutecido ciacutetrico
En el presente la produccioacuten de poliacutemeros o monoacutemeros tales como el
13-propanediol el aacutecido polilaacutectico y los polihidroxialcanoatos ha sido uno de
los principales objetivos de mayor investigacioacuten Dentro de estos nuevos
materiales encontramos los poliaminoaacutecidos poliamidas de naturaleza
polimeacuterica cuyos constituyentes estaacuten unidos por enlaces del tipo amida El
aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) es uno de estos poliaminoaacutecidos un poliacutemero
biodegradable constituido por unidades de D- y L-aacutecido glutaacutemico y que es
producido de manera natural en algunas bacterias
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 14
El presente trabajo procura investigar sobre algunas de las condiciones
involucradas en la produccioacuten bacteriana de γ-PGA y que constituyen las
principales barreras que impiden alcanzar los rendimientos necesarios para
que la produccioacuten bioloacutegica de este poliacutemero sea viable tanto desde el punto de
vista bioloacutegico como econoacutemico
31 Objetivos
El objetivo general a partir del cual se estructura el desarrollo de la
presente investigacioacuten es
Estudiar la produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a y el efecto que tiene sobre el rendimiento y estructura del
producto factores propios de la ingenieriacutea quiacutemica como lo son la
presioacuten y la intensidad de agitacioacuten
Los objetivos especiacuteficos que se plantearon alcanzar en el siguiente
proyecto son los siguientes
Disentildear un biorreactor que permita realizar fermentaciones a presioacuten
positiva de hasta 4 bar absolutos
Describir las condiciones baacutesicas requeridas para lograr reproducibilidad
en la produccioacuten deaacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre el rendimiento de
produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico en gL por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre la composicioacuten
enantiomeacuterica y el peso molecular del aacutecido γ-poliglutaacutemico
Establecer el posible efecto de la presioacuten positiva sobre la tasa de
transferencia de oxiacutegeno en el biorreactor
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 15
6 MARCO TEOacuteRICO
41 Los poliaminoaacutecidos
Los poliaminoaacutecidos son poliamidas formadas por un uacutenico aminoaacutecido
y difieren de las proteiacutenas en muacuteltiples aspectos Las proteiacutenas son
biomoleacuteculas compuestas por una amplia gama de aminoaacutecidos mientras que
los poliaminoaacutecidos estaacuten compuestos uacutenicamente por un solo tipo de
aminoaacutecido al menos en su eje central La siacutentesis de proteiacutenas estaacute dirigida
por el ADN que controla la secuencia especiacutefica de aminoaacutecidos que termina
formando una moleacutecula de una proteiacutena en particular Por su parte los
poliaminoaacutecidos son sintetizados por una ruta metaboacutelica de los organismos
completamente distinta En enlace amida en las proteiacutenas acontece
uacutenicamente entre los grupos α-amino y α-carboxilo mientras que en los
poliaminoaacutecidos pueden verse involucradas otras cadenas laterales
funcionales como por ejemplo los grupos β- y γ-carboxiloy ε-amino(Bajaj amp
Singhal 2011)
Existen mayoritariamente tres poliaminoaacutecidos presentes en la
naturaleza el aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina En
el aacutecido γ-poliglutaacutemico los enlaces amida se forman entre el grupo α-amino y
el γ-carboxilo en el eje central La poli ε-lisina presenta monoacutemeros de lisina
unidos por los grupos α-carboxilo y ε-amino La cianoficina consiste en residuos
de aacutecido α-aspaacutertico que contienen residuos de arginina que penden unidos al
grupo β-carboxilo Las foacutermulas de dichos compuestos se presentan en la
figura 1
42 El aacutecido γshypoliglutaacutemico (γshyPGA)
El aacutecido γ-poliglutaacutemico (de ahora en adelante referido como γ-PGA) es
un poliacutemero inusual que acontece de forma natural anioacutenico soluble en agua
biodegradable comestible y que no resulta toacutexico ni para el ser humano ni para
el ambiente que en la naturaleza es producido por algunas bacterias todas
Gram-positivas una archea e inclusive en eucariotas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 16
Fue primeramente descubierto por Ivaacutenovics y colaboradores como
componente de la caacutepsula de la bacteria Bacillus anthracis despueacutes que se
liberara al medio producto tanto del proceso de autoclavado como por el
envejecimiento y lisis natural de los cultivos La comida tradicional japonesa
ldquoNattordquo estaacute constituida por una mezcla de γ-PGA y fructanos que son
producidos por la bacteria Bacillus natto (Bajaj amp Singhal 2011)
Figura 1 Foacutermula y estructura del aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina
(Fuente Feng et al 2007)
421 Propiedades quiacutemicas y bioquiacutemicas del γshyPGA
El γ-PGA es un poliacutemero polianioacutenico que puede estar compuesto
uacutenicamente por D- L- o por ambos enantioacutemeros del aacutecido glutaacutemico Como se
ha comentado ya es altamente soluble en agua El γ-PGA probablemente
pueda adoptar diferentes estructuras La estructura del γ-PGA ha sido predicha
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 17
asumiendo poliaminoaacutecidos constituidos por 10 o 25 moleacuteculas de aacutecido
glutaacutemico Este modelo teoacuterico calculado para una moleacutecula en solucioacuten
acuosa muestra que el γ-PGA consiste de una heacutelice levoacutegira estabilizada por
enlaces de hidroacutegeno intramoleculares Sin embargo otro estudio realizado a
partir de γ-PGA obtenido de Bacillus licheniformis mostroacute que la conformacioacuten
es realmente flexible y depende de la concentracioacuten de γ-PGA y el pH de la
disolucioacuten A bajas concentraciones (01 wv) y a un pH inferior a 7 el γ-PGA
adopta una conformacioacuten basada mayoritariamente en heacutelices del tipo α
mientras que la conformacioacuten tipo hojas β predomina a pH superiores pues
esta conformacioacuten permite una mejor exposicioacuten de las cargas negativas del γ-
PGA (Candelaamp Fouet 2006) Recientemente mediamente experimentos de
dicroiacutesmo circular se ha reportado una estructura desordenada (Joyce et al
2006 Candela amp Fouet 2006) pero sin detallar las condiciones de trabajo de
los experimentos en particular de pH
El peso molecular del γ-PGA parece variar seguacuten sea el organismo que
produce la moleacutecula sin embargo estas diferencias podriacutean deberse a
diferencias en torno a la degradacioacuten natural que acontece con el poliacutemero o a
los meacutetodos de purificacioacuten y anaacutelisis utilizados mismos que puedan afectar el
tamantildeo del γ-PGA Por ejemplo para el caso de Bacillus subtilis el peso
molecular del γ-PGA variacutea entre 160kDa hasta 1500 kDa las cadenas de γ-
PGA consisten entonces de coacutemo miacutenimo 1000 residuos de aacutecido glutaacutemico
Diferentes estudios enfocados en la siacutentesis microbioloacutegica de γ-PGA han
demostrado que el peso molecular de este poliacutemero es dependiente tanto de
las diversas cepas bacterianas que se empleen asiacute como de los componentes
del medio y las condiciones del medio de cultivo e inclusive de razones auacuten no
dilucidadas De alliacute que exista una gran dificultad para obtener un γ-PGA
altamente homogeacuteneo a partir de cultivos bacterianos esto en gran parte
debido a esta inestabilidad descrita asiacute como a la complejidad molecular
involucrada en su biosiacutentesis
Asiacute mismo el γ-PGA puede contener soacutelo aacutecido D-glutaacutemico soacutelo aacutecido
L-glutaacutemico o una mezcla de ambos enantioacutemeros De alliacute que los filamentos
puedan ser de aacutecido γ-poli-L-glutaacutemico (γ-PLGA) de aacutecido γ-poli-D-glutaacutemico
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 18
(γ-PDGA) o de aacutecido γ-poli-L-D-glutaacutemico (γ-PLDGA) La disposicioacuten de los
residuos en el PLGDA requiere un especial anaacutelisis ya que si bien tanto el
PLGA y el PDGA son ambos solubles en etanol cuando ambos se mezclan en
proporcioacuten equimolar precipitan en etanol Esta observacioacuten es utilizada para
demostrar que el γ-PGA producido por Bacillus licheniformis estaacute compuesto
por cadenas tanto de PLGA como de PDGA Asiacute mismo la digestioacuten con L-
glutamilhidrolasa ha demostrado que el γ-PGA de Bacillus subtilis consiste en
una mezcla de isoacutemeros PLGA y PLDGA
422 Siacutentesis microbioloacutegica de γshyPGA
Distribucioacuten en los microorganismos
Inicialmente el γ-PGA fue detectado como un componente de la pared
capsular de la altamente patogeacutenica bacteria Gram-positiva Bacillus anthracis
Posteriormente este poliacutemero seriacutea nuevamente encontrado presente alrededor
de ceacutelulas de otras bacterias Gram-positivas no patogeacutenicas particularmente
del geacutenero Bacillus Gracias a estos descubrimientos fue posible aislar a inicios
del siglo pasado una cepa de Bacillus capaz de producir grandes cantidades de
γ-PGA
Posteriormente y de manera adicional a estas bacterias formadoras de
endosporas del geacutenero Bacillus el γ-PGA fue encontrado en las eubacterias
haloacutefilas Sporosarcina halophila y Planococcus halophilus y en la
archeobacteria haloacutefila Natrialba aegyptiaca Asiacute mismo γ-PGA fue tambieacuten
detectado en cantidades significativas en nematocistos de Cnidaria (eucariota)
En la tabla 1 se presentan los principales organismos productores de γ-
PGA y algunas de las caracteriacutesticas del γ-PGA producido
Ruta de biosiacutentesis
La conversioacuten de glucosa a γ-PGA sugiere que la siacutentesis del poliacutemero
acontece durante la glicoacutelisis y el ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos (ciclo de
Krebs o del aacutecido ciacutetrico) hasta el 2-oxoglurato (α-cetoglutarato) que es un
precursor directo del aacutecido L-glutaacutemico Durante su crecimiento en un medio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 19
Tabla 1 Organismos que han sido reportados como productores de γ-PGA
ORGANISMO CONFORMACIOacuteN CONFORMACIOacuteN DEL FILAMENTO
Bacillus anthracis D D
Bacillus mesentericus D D
Bacillus licheniformis D y L D y L
Bacillus megaterium D y L D + L
Bacillus pumilus D y L ND
Bacillus subtilis D y L L y D+L
Planococcus halophilus D D
Sporosarcina halophila D D
Staphylococcus
epidermidis
D y L ND
Natrialba aegyptiaca L L
Hydra ND ND
Fuente (Candela amp Fouet 2006)
nutritivo Bacillus licheniformis expresa dos enzimas capaces de sintetizar el
aacutecido L-glutaacutemico la glutamato sintasa y la glutamato deshidrogenasa Ambas
enzimas son praacutecticamente insensibles a la inhibicioacuten por producto lo que
permite alcanzar altas concentraciones intracelulares de aacutecido L-glutaacutemico el
cual es entonces direccionado a la siacutentesis de γ-PGA Los estudios maacutes
detallados relacionados con la polimerizacioacuten del γ-PGA se han realizado con
Bacillus anthracis Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis especialmente
Bacillus licheniformis ATCC9945a lo que ha permitido la identificacioacuten de un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 20
sistema enzimaacutetico anclado a la membrada y denominado como PGA-
sintetasa Este sistema enzimaacutetico estaacute constituido por al menos tres
componentes con actividad enzimaacutetica y se presume que cataliza la siguiente
secuencia de reacciones (Troy 1973) (figura 2)
Aacutecido L-glutaacutemico + ATP ɣ-L-glutamil-AMP + PPi (a)
ɣ-L-glutamil-AMP + SH-enzima ɣ-X-glutamil-S-enzima + AMP (b)
ɣ-X-glutamil-S-enzimaɣ-D-glutamil-S-enzima (c)
ɣ-D-glutamil-S-enzima + [ɣ-D-glutamil]n[ɣ-D-glutamil]n+1 + SH-enzima (d)
Figura 2 Posible mecanismo enzimaacutetico de siacutentesis del γ-PGA (Fuente Ashiuchi 2010)
De acuerdo con este modelo solamente el aacutecido L-glutaacutemico es activado
en el paso (a) mediante fosforilacioacuten lo que significa que la biosiacutentesis del γ-
PGA requiere el suministro de energiacutea para la formacioacuten del enlace amida Maacutes
recientemente un segundo mecanismo ha sido descrito por Ashiuchi (2001) e
involucra un complejo enzimaacutetico denominado PgsBCA el cual es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico y donde la
polimerizacioacuten ocurre por un mecanismo de ligacioacuten tipo amida (figura 3)
Inicialmente se habiacutea descrito que el complejo enzimaacutetico era el responsable
de racemizar y polimerizar el aacutecido glutaacutemico sin embargo estas nuevas
evidencias parecen demostrar que el complejo enzimaacutetico involucrado en la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 21
siacutentesis de γ-PGA carece de actividad racemasa y que la formacioacuten del aacutecido
D-glutaacutemico es responsabilidad de una enzima citosoacutelica denominada aacutecido
glutaacutemico racemasa Glr que presenta una alta selectividad por el aacutecido
glutaacutemico y una mayor preferencia por el aacutecido L-glutaacutemico Un modelo de la
viacutea metaboacutelica mayoritariamente aceptada para la siacutentesis de γ-PGA se
presente en la figura 4
Figura 3 Mecanismo propuesto de biosiacutentesis del γ-PGA mediante ligacioacuten tipo amida
(Fuente Ashiuchi 2001)
Figura 4 Viacutea metaboacutelica de biosiacutentesis del γ-PGA (Fuente Buescher amp Margaritis 2007)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 22
Organizacioacuten geneacutetica
Solamente unas pocas bacterias la mayoriacutea dentro del geacutenero Bacillus
han sido reportadas como capaces de producir γ-PGA Asiacute mismo la
produccioacuten de γ-PGA no es uniforme en estos individuos inesperadamente
variacutea inclusive bajo condiciones de cultivo altamente estrictas De alliacute que la
identificacioacuten del sistema regulatorio y los genes involucrados en dicho sistema
es vital para dar solucioacuten a estos problemas de uniformidad y rendimiento El
complejo PGA-sintetasa estaacute codificado por cuatro loci que son denominados
pgs Los cuatro genes pgs son pgsB pgsC pgsAA y pgsE y se les denomina
en conjunto pgsBCA Todos estos genes son necesarios y suficientes para la
produccioacuten de γ-PGA in vivo La figura 5 muestra los elementos geneacuteticos
requeridos para la produccioacuten de γ-PGA en diferentes especies del genero
Bacillus
Figura 5 Elementos geneacuteticos necesarios para la siacutentesis de γ-PGA (Fuente Candela amp
Fouet 2006)
423 Produccioacuten fermentativa de γshyPGA
Diferentes cepas de bacterias del geacutenero Bacillus son capaces de
producir elγ-PGA ya sea como material viscoso extracelular o como
componente capsular En termino industrial estas cepas han sido las maacutes
utilizadas y por ende las maacutes estudiadas hasta el momento La mayor parte de
los estudios han estado orientados a determinar los requerimientos
nutricionales para el adecuado crecimiento celular asiacute como mejorar la
productividad de γ-PGA y la variacioacuten en la composicioacuten de su estructura en lo
referente al contenido de aacutecido L- y D-glutaacutemico Estos estudios como los
realizados por Troy (1973) Cromwicket al (1995) y Kunioka (1997) han
permitido determinar que los requerimientos nutricionales para la produccioacuten de
γ-PGA variacutean seguacuten sea la cepa que se emplea
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 23
De acuerdo a estos requerimientos nutricionales las cepas productoras
de γ-PGA se han dividido en dos grupos uno que requiere la adicioacuten de aacutecido
L-glutaacutemico al medio de cultivo para estimular la produccioacuten de γ-PGA y el
crecimiento celular y otro que no requiere de aacutecido L-glutaacutemico para la
produccioacuten de γ-PGA
Dentro de las bacterias dependientes de aacutecido L-glutaacutemico las cepas
maacutes promisorias han sido B anthracis B licheniformis ATCC9945a B subtilis
IFO3335 y B subtilis F-2-01 Por su parte dentro de las bacterias
independientes de aacutecido L-glutaacutemico encontramos mayoritariamente los caso s
de B subtilis 5E B subtilis TAM-4 y B licheniformis A35 B subtilis 5E puede
producir γ-PGA a partir de L-prolina como uacutenica fuente de carbono
complementado con una fuente de nitroacutegeno en un medio mineral B
licheniformis A35 produce γ-PGA a partir de glucosa y cloruro de amonio en
condiciones desnitrificantes y B subtilis TAM-4 produce grandes cantidades de
γ-PGA cuando crece en un medio de cultivo con una sal de amonio y azuacutecar
como fuentes de nitroacutegeno y carbono respectivamente Asiacute mismo ademaacutes de
la fuente de carbono y nitroacutegeno existen otra serie de factores tales como
fuerza ioacutenica del medio de cultivo pH del medio de cultivo aireacioacuten entre
otros que afectan en gran medida la productividad y calidad del γ-PGA
De primera impresioacuten pareciera conveniente el empleo de las cepas
independientes de aacutecido L-glutaacutemico para la produccioacuten industrial de γ-PGA
sin embargo la informacioacuten disponible en lo referente a la ruta biosinteacutetica el
mecanismo de formacioacuten del γ-PGA y los factores que afectan la productividad
es praacutecticamente nula para estas cepas A partir de los trabajos de
investigacioacuten y los estudios de aplicaciones industriales la produccioacuten de γ-
PGA se ha llevado a cabo mayoritariamente a partir de cepas dependientes de
aacutecido L-glutaacutemico
En la tabla 2 se presentan algunas de las principales cepas bacterianas
empleadas para la produccioacuten de γ-PGA los nutrientes las condiciones de
cultivo el rendimiento obtenido asiacute como los voluacutemenes de cultivo en que se
basan dichos reportes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 24
Tabla 2 Principales bacterias productoras de γ-PGA (Shih amp Van 2001)
CEPA
NUTRIENTES
CONDICIONES DE CULTIVO
RENDIMIENTO
VOLUMEN DE
TRABAJO B licheniformis ATCC9945a
Aacutecido glutaacutemico (20 gL) aacutecido ciacutetrico (12 gL) NH4Cl (7 gL)
30ordmC 4 diacuteas 17-23 gL 100 mL
B subtilis IFO 3335
Aacutecido glutaacutemico (30 gL) aacutecido ciacutetrico (20 gL)
37ordmC 2 diacuteas 10-20 gL 125 mL
B subtilis TAM-4
Fructosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 4 diacuteas 20 gL 100 mL
B licheniformis A35
Glucosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 3-5 diacuteas 8-12 gL 100 mL
B subtilis F02-1
Aacutecido glutaacutemico(70 gL) glucosa (1 gL)
30ordmC 2-3 diacuteas 50 gL 200 mL
B subtilis (natto)
Maltosa (60 gL) salsa de soya (70 gL) glutamato soacutedico (30 gL)
40 ordmC 3-4 diacuteas 35 gL 125 mL
Fuente Shih amp Van 2001
424 Produccioacuten de γshyPGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a
Generalidades de la bacteria Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis es una bacteria comuacutenmente encontrada en el
suelo y en las plumas de las aves Es gram-positiva de forma oval y mesoacutefila
Su temperatura oacuteptima de crecimiento se encuentra alrededor de los 30 ordmC
aunque es capaz de sobrevivir a temperaturas mucho mayores La temperatura
oacuteptima para la secrecioacuten de enzimas es de 37 ordmC Esta bacteria puede existir
como espora cuando las condiciones son inadecuadas o en estado vegetativo
cuando las condiciones le son maacutes favorables (Wecke et al 2006)
Bacillus licheniformis forma parte del grupo Subtilis junto con Bacillus
subtilis y Bacillus pumilus Estas bacterias son conocidas por ser
contaminantes comunes de alimentos asiacute como favorecer su descomposicioacuten
aunque no se consideran patoacutegenos de importancia para el ser humano
(Wecke et al 2006)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 25
La cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis y la siacutentesis de γ-PGA
La produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a fue
primeramente estudiada por Bovarnick en 1942 sin embargo no fue sino a
partir de 1954 cuando Thorne y colaboradores iniciaron una serie de estudios
sistemaacuteticos orientados a investigar los factores que afectan la produccioacuten de
γ-PGA lo que permitioacute determinar algunos factores y condiciones necesarios
para lograr mayores rendimientos Factores tales como presencia de ciertas
sales inorgaacutenicas aacutecido glutaacutemico aacutecido ciacutetrico glicerol y el tamantildeo del inoacuteculo
demostraron tener efectos importantes sobre el rendimiento de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a tanto en condiciones estaacuteticas como cultivos
bajo agitacioacuten Se encontroacute que los mejores rendimientos se produciacutean cuando
el microorganismo era cultivado en agitacioacuten orbital en un medio de cultivo
denominado como medio C (tabla 3) alcanzando una productividad de hasta
15 gL en un periacuteodo de 3-4 diacuteas Asiacute mismo la mayor produccioacuten de poliacutemero
soacutelo se alcanzaba cuando se empleaba agua de grifo y un lote especiacutefico de
FeCl3 Posteriormente se determinariacutea que dicho lote de FeCl3 estaba
contaminado con trazas de Mn2+ y que el agua de grifo conteniacutea cantidades
significativas de Ca2+ Posteriormente Leonard y colaboradores (1958) se
encargariacutean de comprobar la funcioacuten y concentracioacuten oacuteptima de ambos
elementos quiacutemicos mediante la elaboracioacuten de un medio de cultivo
quiacutemicamente definido tomando como base el medio C de Thorne
Tabla 3 Composicioacuten del medio de cultivo C (Thorne et al 1954)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua de grifo
Fuente Shih amp Van 2001
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 26
Leonard y colaboradores encontraron que aunque solamente se requeriacutea
de 15 x 10-7 moles por litro de Mn2+ para alcanzar el maacuteximo crecimiento
concentraciones mayores de Mn2+ mostraban un marcado efecto prolongando
la viabilidad celular y por consiguiente incrementando la productividad de γ-
PGA Un incremento de hasta 615 x 10-4 molL en la concentracioacuten de Mn2+
permitiacutea alcanzar los mayores rendimientos de γ-PGA De igual manera la
adicioacuten de 102 x 10-3 moles por litro de Ca2+ en presencia de 15 x 10-7 moles
por litro de Mn2+ permitiacutea alcanzar auacuten mayores rendimientos deγ-PGA en
comparacioacuten a los valores oacuteptimos de produccioacuten de poliacutemero obtenidos en
ausencia de este elemento El γ-PGA producido consistiacutea en un homopoliacutemero
de unidades repetidas de aacutecido D- y L-glutaacutemico con una concentracioacuten de
aacutecido D-glutaacutemico que variaba entre el 38 y el 86 seguacuten incrementaba la
concentracioacuten de Mn2+ entre 154 x 10-7 y 246 x 10-3 molL siendo esta
observacioacuten independiente de la concentracioacuten presente en el medio de cultivo
de Ca2+
Tabla 4 Composicioacuten del medio E revisado (Leonard et al 1958)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 0000026 a
042 CaCl22H2O 015 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua destilada
Fuente Shih amp Van 2001
A partir de estos resultados Leonard y colaboradores elaboraron el
medio de cultivo denominado Medio E (tabla 4) que es baacutesicamente el medio
original C exceptuando el hecho de que cantidades definidas de Mn2+ y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 27
Ca2+fueron agregadas El Ca2+ fue adicionado con el propoacutesito de asegurar
altas productividades de poliacutemero a cualquier concentracioacuten de Mn2+ que se
empleara mientras que la variacioacuten de la concentracioacuten de este uacuteltimo
elemento permitiriacutea alcanzar el contenido enantiomeacuterico deseado en el
poliacutemero tal y como se comentoacute anteriormente
La estereoquiacutemica del poliacutemero es decir el contenido enantiomeacuterico del
γ-PGA ha sido desde el inicio de las investigaciones uno de los problemas maacutes
complejos y de difiacutecil solucioacuten y de una importancia tanto fundamental como
praacutectica en lo que se refiere al estudio de la produccioacuten de γ-PGA en bacterias
A lo largo de todos estos antildeos han existido numerosas contradicciones entre
los investigadores en cuanto a si el contenido enantiomeacuterico del γ-PGA
producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a estaacute o no afectado por la
concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo Cromwick y Gross (1995)
realizaron un estudio profundo sobre los factores que influenciaban la
produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a Dicho estudio
encontroacute que el porcentaje de aacutecido L-glutaacutemico presente en el γ-PGA variaba
entre 59 y 10 cuando las concentraciones de Mn2+ variaban entre 0 y 615
μmolL asiacute mismo el rendimiento incrementaba desde los 5 hasta los 17 gL en
dicho intervalo de concentracioacuten de Mn2+
Cromwick y Gross (1995) encontraron en este mismo estudio que la
incorporacioacuten de Mn2+ al medio de cultivo es un factor criacutetico para la
conservacioacuten de la viabilidad celular durante periodos de cultivo prolongados
El nuacutemero de ceacutelulas viables se incrementaba del orden de 105 a 109 unidades
formadoras de colonias (ufc) para todas las concentraciones de Mn2+ hasta el
inicio de la fase estacionaria aproximadamente a las 24 horas Sin embargo
despueacutes de 50 horas de cultivo la viabilidad celular se veiacutea reducida
draacutesticamente para aquellas concentraciones de Mn2+ relativamente menores
(0 a 0615 μmolL) mientras que para las concentraciones mayores (338 a 615
μmolL) el nuacutemero de ceacutelulas viables se manteniacutea en el orden de 107-109
inclusive despueacutes de 140 horas de cultivo Asiacute mismo la presencia de Mn2+ en
concentraciones entre 338 y 615 μ incrementaba la utilizacioacuten de las fuentes
de carbono en gran medida cultivos que conteniacutean 615 μmolL de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 28
Mn2+utilizaban el 37 54 y 93 del aacutecido glutaacutemico el glicerol y el aacutecido
ciacutetrico respectivamente en comparacioacuten a aquellos cultivos que no
incorporaban el Mn2+ los cuales solo utilizaban el 19 10 y 17 del aacutecido
glutaacutemico el glicerol y el aacutecido ciacutetrico respectivamente
Uno de los problemas maacutes prolongados en torno a los estudios referidos
a la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC994a es el hecho de
que el microorganismo termina degenerando en una cepa incapaz de producir
γ-PGA despueacutes de cultivo repetitivo Esta inestabilidad exhibida por este
microorganismo es responsable de una gran variacioacuten de cultivo en cultivo en
lo referente a la cantidad y la cineacutetica de formacioacuten del γ-PGA Birrer y
colaboradores (1994) encontraron que el empleo de ceacutelulas vegetativas
criogeacutenicamente congeladas permitiacutea alcanzar un crecimiento y produccioacuten de
poliacutemero consistente de cultivo en cultivo Asiacute mismo y en congruencia con
otros estudios previamente realizados se encontroacute que el crecimiento celular
ocurriacutea baacutesicamente durante las primeras 24 h la mayor productividad
volumeacutetrica de γ-PGA era de 012 gmiddotL-1middoth-1 y se alcanzaba entre los diacuteas 2 y 4
el pH caiacutea de 74 a aproximadamente 5 despueacutes de 42 horas de cultivo e
incrementaba levemente a cerca de 6 despueacutes de 96 horas de cultivo el
empleo de glicerol glutamato y citrato se reduciacutea de 80 a 45 gL 18 a 10 gL y
de 12 a 1 gL respectivamente la produccioacuten de aacutecido aceacutetico hasta un nivel
maacuteximo de 45 gL asiacute como la presencia de 23-butanediol como producto
secundario entre las 42 y las 96 h El estudio del consumo de las fuentes de
carbono resulta un poco sorprendente pues demuestra unas tasas de
consumo del aacutecido ciacutetrico y de glicerol relativamente altas sin embargo para el
caso del aacutecido glutaacutemico dicha tasa de consumo fue por mucho menor y muy
lejana del agotamiento completo de dicha fuente Asiacute mismo la remocioacuten del
aacutecido L-glutaacutemico del medio de cultivo E afectaba en poca medida el
rendimiento en γ-PGA mientras que la remocioacuten de las otras fuentes (glicerol y
aacutecido ciacutetrico) disminuye de manera draacutestica la produccioacuten de γ-PGA Estos
resultados son contradictorios a los encontrados inicialmente por Thorne y
colaboradores (1954) e indica que Bacillus licheniformis ATCC9945 no requiere
de aacutecido L-glutaacutemico para alcanzar altas productividades de γ-PGA Asiacute mismo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 29
la presencia de 23-butanediol es indicador que los niveles de oxiacutegeno en el
medio de cultivo despueacutes de 42 horas son incapaces de sostener un
metabolismo 100 aeroacutebico esto no es de sorprender pues el γ-PGA es un
poliacutemero extracelular extremadamente viscoso y tasas cada vez menores de
transporte de oxiacutegeno son esperables conforme va aumentado la viscosidad en
el medio a medida que la concentracioacuten de γ-PGA se incrementa
Un trabajo de Cromwick y Gross (1996) estudioacute el efecto del pH y la
aireacioacuten sobre la productividad en γ-PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a en condiciones de fermentacioacuten por lotes El pH fue controlado en
los valores de 55 65 74 y 825 y se determinoacute su efecto sobre el crecimiento
celular la utilizacioacuten de las fuentes de carbono la productividad en γ-PGA el
peso molecular y la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA El mayor
rendimiento en γ-PGA se obtuvo a un pH de 65 (15 gL 96 horas de cultivo) y
decrecioacute significativamente en 55 y 74 Esto coincide con el hecho que el
consumo de glicerol y de aacutecido L-glutaacutemico se mantuvo invariable en funcioacuten
del pH sin embargo la mayor tasa de consumo de aacutecido ciacutetrico se observoacute a un
pH de 65 en contraste con 55 y 74 lo cual parece indicar que el metabolismo
del aacutecido ciacutetrico juega un papel importante a dicho valor de pH Previamente
Cromwick y Gross (1995) encontraron que el aacutecido ciacutetrico es efectivamente un
precursor en la produccioacuten del poliacutemero presumiblemente a traveacutes del ciclo de
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De igual manera la alteracioacuten del pH no mostroacute
ninguacuten efecto importante en cuanto al peso molecular y la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA El efecto de la aireacioacuten fue evaluado incrementando
la velocidad de agitacioacuten entre 250 y 800 rpm y la tasa de aireacioacuten entre los
05 y los 20 Lmin a un pH de 65 observaacutendose un incremento en las tasas de
crecimiento y los rendimientos de γ-PGA conforme el suministro de oxiacutegeno
incrementaba
A pesar de la intensa investigacioacuten que se ha llevado a cabo en lo
referente a la produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a el
mecanismo y las viacuteas biosinteacuteticas especiacuteficas por las cuales el poliacutemero es
producido auacuten no han logrado ser dilucidadas con total claridad a pesar de que
no se cuestione le hecho de que efectivamente acontece a traveacutes del ciclo de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 30
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De las tres fuentes de carbono presentes en el medio
de cultivo E el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido L-glutaacutemico constituyen dos sustratos
precursores para la produccioacuten de dicho poliacutemero sin embargo en lo referente
al glicerol auacuten no queda claro como este incrementa la formacioacuten de poliacutemero
maacutes allaacute del hecho de que Troy (1973) encontroacute que el complejo enzimaacutetico
PGA-sintetasa responsable de la polimerizacioacuten del aacutecido L-glutaacutemico a γ-
PGA es estimulada por la presencia de glicerol Considerando que la viacutea de
biosiacutentesis del γ-PGA efectivamente involucra el ciclo de los aacutecidos
tricarboxiacutelicos cualquier fuente de carbono no relacionada directamente como
el glicerol o la glucosa podriacutean en principio ser una fuente primaria de carbono
para el crecimiento celular y la produccioacuten de γ-PGA Efectivamente el empleo
de glucosa como principal fuente de carbono y cantidades traza de aacutecido ciacutetrico
y aacutecido L-glutaacutemico (05 gL) permitieron alcanzar un rendimiento en γ-PGA de
12 gL en cultivos de Bacillus licheniformisATCC9945a (Ko amp Gross 1998) Sin
embargo y a pesar de este hecho Du y colaboradores (1995) encontraron otra
posible explicacioacuten al incremento del rendimiento en presencia de glicerol Ellos
encontraron que en Bacillus licheniformis ATCC9945a las altas
concentraciones de glicerol en el medio de cultivo conllevan a un cambio en la
composicioacuten de los fosfoliacutepidos de la membrana celular incrementando la
proporcioacuten de los fosfoliacutepidos C120 y C101 y reduciendo la de fosfoliacutepidos
C181 y C161 lo que parece favorecer la formacioacuten de una membrana celular
menos compacta lo que conlleva a una efectiva excrecioacuten del γ-PGA fuera de
la membrana celular
En lo referente a produccioacuten a gran escala y en buacutesqueda de la
aplicacioacuten comercial del γ-PGA en grandes cantidades resulta maacutes que
evidente la necesidad de incrementar la productividad Yoon y colaboradores
(2000) desarrollaron una estrategia para la produccioacuten de γ-PGA con un alto
rendimiento mediante cultivo en lote alimentado de Bacillus licheniformis
ATCC9945a Mediante el empleo de un bioreactor de 25 L conteniendo 1 L de
medio de cultivo y bajo condiciones de pH y temperatura de 65 y 37ordmC
respectivamente un 40 de saturacioacuten de oxiacutegeno y una velocidad de
agitacioacuten de 1000 rpm lograron alcanzar una concentracioacuten maacutexima de γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 31
de 35 gL suministrando aacutecido ciacutetrico y aacutecido L-glutaacutemico a una velocidad de
alimentacioacuten de 02 mLmin (144 gh de aacutecido ciacutetrico y 24 gh de aacutecido
glutaacutemico) por un periacuteodo de 3 h despueacutes del agotamiento del aacutecido ciacutetrico
inicial lo cual aconteciacutea alrededor de las 22 h La productividad alcanzada fue
de 1 gmiddotl-1middoth-1
425 Purificacioacuten del γshyPGA
Dado que la produccioacuten del γ-PGA es mayoritariamente extracelular en
concreto en la cepa de intereacutes para el presente estudio la de Bacillus
licheniformis ATCC9945a la purificacioacuten del poliacutemero es directa y consta de
manera general de tres pasos I) la remocioacuten de las ceacutelulas mediante
centrifugacioacuten o filtracioacuten 2) la precipitacioacuten del producto del medio libre de
ceacutelulas mediante metanol etanol o 1-propanol y 3) la diaacutelisis para la remocioacuten
de impurezas de pequentildeo peso molecular
Du y colaboradores (2001) desarrollaron una estrategia eficiente para la
separacioacuten y recuperacioacuten delγ-PGA de caldos altamente viscosos Esta
consiste en dos procesos I) Separar el γ-PGA del caldo de cultivo viscoso y II)
Concentrar la solucioacuten de PGA por ultrafiltracioacuten con el propoacutesito de reducir la
cantidad de alcohol requerida en el proceso de separacioacuten Las ceacutelulas
encapsuladas con γ-PGA poseen carga negativa cerca del valor neutro de pH
esto debido a la ionizacioacuten del grupo carboxilo en las moleacuteculas de γ-PGA Esta
carga negativa en sus superficies les confiere a las ceacutelulas una alta estabilidad
en el medio de cultivo lo que dificulta la sedimentacioacuten de las ceacutelulas durante el
proceso de separacioacuten Esta alta estabilidad asiacute como la elevada viscosidad del
caldo de cultivo son los dos principales problemas que se enfrentan cuando se
trata de separar las ceacutelulas y el γ-PGA del medio de cultivo por lo cual la
reduccioacuten de ambas es vital para una eficiente recuperacioacuten del γ-PGA
Mediante la disminucioacuten del pH es posible reducir el nuacutemero de cargas
negativas sobre la superficie de las ceacutelulas lo que favorece su faacutecil agregacioacuten
y precipitacioacuten Esto permite reducir en hasta un 17 la energiacutea requerida para
una adecuada centrifugacioacuten del caldo de cultivo a un pH de 5 En lo referente
a los requerimientos de alcohol es conocido que un 75-80 del mismo es
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 32
requerido para la precipitacioacuten del γ-PGA presente en un caldo libre de ceacutelulas
a una concentracioacuten de 1-2 Dado que la cantidad de alcohol requerida
disminuye a medida que la concentracioacuten de γ-PGA aumenta es necesaria y
ventajoso sino la concentracioacuten del γ-PGA presente en el medio de cultivo libre
de ceacutelulas a lo largo del proceso de recuperacioacuten Asiacute es posible reducir en un
25 el alcohol requerido para precipitar una solucioacuten de γ-PGA que fue
concentrada de 20 gL a 60 gL mediante ultrafiltracioacuten a un pH de 5
Asiacute mismo y dada la naturaleza anioacutenica del γ-PGA es posible que el
empleo de la cromatografiacutea de intercambio ioacutenica constituya una herramienta
importante para la purificacioacuten de este poliacutemero
426 Control del peso molecular y degradacioacuten del γshyPGA
El peso molecular es una caracteriacutestica importante del γ-PGA microbiano
debido al efecto que tiene el tamantildeo molecular en las propiedades del
poliacutemero El γ-PGA producido por bacterias del geacutenero Bacillus por lo general
presenta un relativamente alto peso molecular Un poliacutemero de alto peso
molecular es uacutetil como agente espesante pero no es uacutetil para otros usos
debido a la alta viscosidad que lo vuelve difiacutecil de modificar quiacutemicamente
mediante la adicioacuten de alguacuten reactivo quiacutemico De acuerdo con el uso que se
pretenda dar es necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso
molecular por ejemplo en lo referente al empleo del γ-PGA en sistemas de
liberacioacuten de faacutermacos o en el disentildeo de faacutermacos polimeacutericos resulta
necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso para controlar el nivel de
liberacioacuten en los distintos tejidos (Shih et al 2001) Es evidente entonces que el
control del peso molecular del γ-PGA no es solamente un asunto de
importancia fundamental o teoacuterica sino de importancia praacutectica para el
desarrollo de aplicaciones comerciales para este poliacutemero Entre los meacutetodos
que se han empleado para la obtencioacuten de γ-PGA con diferentes pesos
moleculares encontramos la hidroacutelisis alcalina la degradacioacuten ultrasoacutenica la
degradacioacuten microbiana o enzimaacutetica y la alteracioacuten de la composicioacuten del
medio de cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 33
En otro estudio Birrer y colaboradores (1994) encontraron que la
variacioacuten de la fuerza ioacutenica del medio de cultivo mediante la adicioacuten de un 4
(pv) de NaCl conllevaba a la formacioacuten de un γ-PGA de un peso molecular
relativamente mayor
A la fecha existen pocos estudios sobre la biodegradacioacuten microbiana o
enzimaacutetica del γ-PGA a moleacuteculas de menor peso molecular sin embargo es
importante sentildealar que en la mayoriacutea de estudios sobre siacutentesis de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a se sugiera la posible existencia de una
enzima ldquodespolimerasardquo responsable de la descomposicioacuten del γ-PGA Lo que
inicialmente se observaba como una reduccioacuten en la viscosidad del medio de
cultivo con el tiempo o bajo ciertas condiciones demostroacute ser una enzima
poliglutamil-γ -hidrolasa responsable de la ruptura hidroliacutetica del γ-PGA en esta
cepa de Bacillus (King et al 2000) Curiosamente la enzima mostroacute ser
activada por la presencia de iones Zn2+ y Ca2+ y tener una alta afinidad por el γ-
PGA
427 Aplicaciones del γshyPGA
Dada la naturaleza del γ-PGA al ser un poliacutemero no toacutexico
biodegradable y cuya produccioacuten puede ser no tan costosa se han sugerido
gran cantidad de aplicaciones durante la uacuteltima deacutecada El γ-PGA de alto peso
molecular es decir mayor a 106 Da es el preferible en gran parte de las
aplicaciones aunque si bien existen otra serie de aplicaciones que se
presentaran a continuacioacuten y que podriacutean demandar diferentes caracteriacutesticas
Es importante destacar eso siacute que salvo las aplicaciones meacutedicas el resto
considera como indiferente la proporcioacuten de aacutecido D-glutaacutemico y de aacutecido L-
glutaacutemico presente en el γ-PGA
Alimentos
Existe una amplia gama de aplicaciones para el γ-PGA en la industria de
alimentos y sus derivados En jugos y otras bebidas el γ-PGA colabora en el
mejoramiento del sabor y su potabilidad Otra aplicacioacuten importante existe en
alimentos soacutelidos a base de harina de trigo como por ejemplo pan pasteles o
pasta donde la adicioacuten de γ-PGA ha demostrado retrasar el envejecimiento y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 34
mejorar la textura asiacute como permitir una mayor conservacioacuten de la forma Para
estas aplicaciones el γ-PGA recomendable es el de alto peso molecular
Asiacute mismo el γ-PGA ha demostrado poseer propiedades
anticongelantes propiedad que se ve incrementada conforme el tamantildeo del
poliacutemero se reduce Esto permitiriacutea emplear el γ-PGA en la conservacioacuten de
alimentos microorganismos y enzimas Debido a que las sales de este
poliacutemero tienen poco sabor por siacute mismas pueden ser empleadas en mayores
concentraciones en comparacioacuten con otros agentes anticongelantes tales como
la glucosa Aunque esta aplicacioacuten es dependiente del tipo de sal del poliacutemero
empleada es independiente de la proporcioacuten de aacutecido L- y D-glutaacutemico
presente en el poliacutemero Asiacute mismo la adicioacuten de γ-PGA en productos
alimenticios que contengan sustancias activas bioloacutegicamente como por
ejemplo carotenoides vitaminas o polifenoles incrementa la absorcioacuten de
dichas sustancias en el intestino delgado
Fertilizante
Es posible producir grandes cantidades de biomasa y γ-PGA a partir de
medios liacutequidos con estieacutercol glicerol aacutecido ciacutetrico y otras sales inorgaacutenicas
resultando un producto que funciona como un fertilizante de liberacioacuten lenta
cuando es aplicado en los campos de cultivo Dado que el γ-PGA es
particularmente inerte a la gran mayoriacutea de las proteasas la liberacioacuten de
nitroacutegeno puede verse reducida auacuten maacutes Inclusive es posible producir dicho
fertilizante mediante fermentacioacuten en fase soacutelida lo que podriacutea resultar auacuten
maacutes ventajoso en ciertos casos pues permite utilizar como co-sustrato de
fermentacioacuten productos agriacutecolas tales salvado de trigo soya o maiacutez Es
importante sentildealar que para dicha aplicacioacuten la proporcioacuten de aacutecido L- y D-
glutaacutemico presente en el poliacutemero es indiferente
Tratamiento de aguas residuales
Debido a la actividad de floculacioacuten que este poliacutemero presenta el
empleo del γ-PGA en el tratamiento de aguas residuales ha sido investigado en
muacuteltiples estudios demostrando una gran capacidad de absorcioacuten y afinidad
por el Cu2+ Adicionalmente se ha demostrado el requerimiento de iones
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 35
multivalentes tales como el Ca2+ Fe3+ y Al3+ para mejorar su actividad
floculante bajo ciertas condiciones
Asiacute mismo tambieacuten se ha empleado el γ-PGA entrecruzado mediante
radiacioacuten γ el cual ha demostrado ser eficiente en la clarificacioacuten de agua
tuacuterbida a concentraciones tan bajas como 1 mgkg
Bioplaacutesticos
La posibilidad de emplear eacutesteres de γ-PGA como plaacutestico
biodegradable tambieacuten constituye otra aplicacioacuten interesante de este poliacutemero
a pesar de que por el momento su costo es todaviacutea muy elevado como para
asegurar el eacutexito comercial Mediante la modificacioacuten de los grupos eacutester es
posible disentildear un plaacutestico que cumpla los requisitos de muacuteltiples propoacutesitos
asiacute mismo los eacutesteres de γ-PGA han demostrado ser maacutes estables a altas
temperaturas que sus respectivas sales de sodio
Hidrogeles
La formacioacuten de hidrogeles por parte de γ-PGA con o sin la adicioacuten de
poliacutemeros adicionales da origen a una amplia gama de novedosas
aplicaciones ya que las propiedades fiacutesicas del gel pueden ser controladas
para cumplir una amplia variedad de necesidades
Mediante irradiacioacuten γ de 19 kGy es posible generar un hidrogel a base
de γ-PGA con un contenido especiacutefico de agua de 3500 Esto constituye un
meacutetodo conveniente y sencillo para gelificar el γ-PGA sin necesidad de
poliacutemeros o entrecruzadores
Los hidrogeles pueden ser empleados en muacuteltiples aplicaciones como en
la liberacioacuten controlada de faacutermacos el disentildeo de biosensores operaciones de
diagnoacutestico e inclusive hasta bioseparadores pueden ser obtenidos a partir de
γ-PGA y PEG-metacrilato Los hidrogeles obtenidos de esta forma poseen la
cineacutetica de liberacioacuten deseada para partiacuteculas de distinto tamantildeo tales como
pequentildeos peacuteptidos proteiacutenas o inclusive ceacutelulas completas (Bajaj amp Singhal
2011)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 36
Una manera sencilla de obtener hidrogeles de γ-PGA es a traveacutes de la
adicioacuten de peroacutexido como entrecruzador al caldo de fermentacioacuten crudo dicho
hidrogel puede emplearse como absorbente de agua en muacuteltiples aplicaciones
que incluyen agricultura horticultura y construccioacuten civil
De igual manera tambieacuten se ha demostrado que los hidrogeles pueden
ser empelados para la liberacioacuten lenta y controlada de faacutermacos en particular
aquellos formados por α-L-PGA y PEG-metacrilato Hidrogeles formados por un
72 deγ-PGA sulfonado y el resto en γ-PGA han demostrado resultados
promisorios en la liberacioacuten controlada de faacutermacos con una liberacioacuten
praacutecticamente nula a un pH de 74 sin embargo a un pH menor a 65 como el
observado en los tejidos inflamados la liberacioacuten del faacutermaco incrementaba
considerablemente
Transportador de faacutermacos
Dado a su biodegradabilidad y biocompatibilidad el γ-PGA constituye un
biopoliacutemero de particular intereacutes en el desarrollo de faacutermacos de liberacioacuten
controlada tal y como se ha sentildealado previamente Dada la presencia de
grupos carboxilo en las cadenas laterales del poliacutemero que pueden
interaccionar con los grupos funcionales presentes en otros agentes
quimioterapeacuteuticos el γ-PGA permite obtener faacutermacos maacutes solubles y faacuteciles
de administrar Inclusive el conjugado faacutermaco-γ-PGA puede ingresar a las
ceacutelulas diana e irse degradando lentamente mientras libera el agente
farmacoloacutegico y a la vez el aacutecido glutaacutemico producido durante su degradacioacuten
puede ingresar directamente al metabolismo celular o ser excretado a traveacutes
del rintildeoacuten (Bajaj amp Singhal 2011)
Uno de los conjugados maacutes prometedores y estudiados hasta el
momento ha sido con el agente anticanceriacutegeno Paclitaxel Dichos conjugados
Paclitaxel-γ-PGA han demostrado presentar un perfil farmacocineacutetico distinto
capaz de proveer una alternativa hidrosoluble a las formulaciones habituales de
este faacutermaco Tambieacuten estos conjugados han mostrado una respuesta
antitumoral marcadamente superior en comparacioacuten con el Paclitaxel soacutelo
tanto en tejidos murinos como humanos Asiacute mismo estos conjugados han
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 37
mostrado reducir la TCD50 (dosis letal media contra ceacutelulas canceriacutegenas) de
una sola irradiacioacuten de 539 Gy a 75 Gy sin afectar la respuesta radioloacutegica de
los tejidos normales sanos
Adhesivos bioloacutegicos
Los adhesivos bioloacutegicos son empleados para la adhesioacuten de tejidos
homeostasis y para el sellado de fugas de liacutequidos o aire en los tejidos durante
una cirugiacutea En la actualidad el adhesivo de mayor uso es la fibrina la cual
presenta un pobre adhesioacuten a los tejidos Un poliacutemero formado por el
entrecruzamiento del γ-PGA y gelatina ha demostrado un gran potencial para
ser empleado como adhesivo quiruacutergico y agente homeostaacutetico conservando la
capacidad de ser degradado lentamente por el cuerpo sin causar respuestas
inflamatorias severas y a la vez solidificando tan raacutepido como la fibrina pero con
una mayor adherencia a los tejidos Similares hallazgos se han obtenido con
poliacutemeros formados del entrecruzamiento de γ-PGA y colaacutegeno porcino (Bajaj
amp Singhal 2011)
Cosmeacuteticos
El γ-PGA puede ser empleado como componente de valor agregado en
la elaboracioacuten de cosmeacuteticos y productos para el cuidado personal tales como
humectantes exfoliantes y antiarrugas Dada sus propiedades quiacutemicas el γ-
PGA es homogeacuteneamente miscible asiacute como quiacutemicamente estable en la gran
mayoriacutea de los ingredientes tiacutepicamente empleados para la elaboracioacuten de
cremas faciales Asiacute mismo ciertas calidades de γ-PGA son capaces de
producir peliacuteculas suaves elaacutesticas humectantes y suaves sobre la piel Dado
que se trata de un humectante natural hidrofiacutelico formidable el γ-PGA ha
demostrado en combinacioacuten con extractos de Aloe vera promover la produccioacuten
natural de factores humectantes tales como aacutecido pirrolidona-carboxiacutelico aacutecido
laacutectico y aacutecido urocaacutenico A nivel microscoacutepico esto se explica por el hecho de
que los hidrogeles de γ-PGA son capaces de absorber hasta 5000 veces su
propio peso en humedad lo que permitiriacutea incrementar de gran manera las
propiedades humectantes de muchos productos cosmetoloacutegicos con la adicioacuten
de γ-PGA algunos electrolitos y el ajuste a un pH adecuado
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 38
Adyuvante en vacunas
El γ-PGA ha demostrado que es capaz de generar una mejor respuesta
inmune contra otros antiacutegenos presentes en una vacuna El γ-PGA de alto peso
molecular ha demostrado estimular la respuesta inmune contra antiacutegenos
virales en conejos y ratones
43 Disentildeo de procesos biotecnoloacutegicos y la transferencia de materia gasshyliquido
Cuando un microorganismo ha sido identificado como productor de un
compuesto de intereacutes existen una serie de consideraciones que deben ser
valoradas previamente antes de que un proceso productivo econoacutemicamente
viable pueda ser llevado a la praacutectica a escala industrial En aquellas
organizaciones e industrias con una soacutelida experiencia en el disentildeo y
escalamiento de procesos fermentativos los nuevos procesos son
incorporados de manera relativamente raacutepida
El desarrollo de un nuevo proceso fermentativo puede ser a groso modo
dividido en cuatro fases
La primera consiste en identificar el producto su potencial valor de
mercado su precio de venta asiacute como la vida uacutetil del mismo
La siguiente fase es seleccionar o disentildear la cepa que seraacute utilizada en
el proceso productivo y por consiguiente disentildear el proceso como tal Esto
involucra una adecuada seleccioacuten del medio de cultivo oacuteptimo y de las
condiciones idoacuteneas de proceso En este sentido la produccioacuten de γ-PGA a
partir de Bacillus licheniformis ATCC9945a ha sido fuertemente investigada en
torno a las condiciones ideales para su produccioacuten sin embargo algunos
reportes y resultados resultan ser incompletos contradictorios o discutibles Sin
embargo lo que si resulta comuacuten en todas las investigaciones en particular en
aquellas donde se han empleado voluacutemenes mayores de produccioacuten como por
ejemplo de 05 a 10 L es que la produccioacuten del γ-PGA se detiene al reducirse
la concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo problema que ha sido
abordado incrementando el caudal de oxiacutegeno yo incrementando la velocidad
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 39
de agitacioacuten sin que se reporten resultados consistentes o claros La
acumulacioacuten del γ-PGA a lo largo de la fermentacioacuten parece reducir
draacutesticamente la tasa de transferencia de oxiacutegeno lo que termina generando
condiciones anaeroacutebicas en tiempos tan cortos como 20 horas con
concentraciones de oxiacutegeno inferiores a 1 mgL
431 La transferencia de materia gasshyliacutequido
Un requisito primordial para la ocurrencia de una reaccioacuten quiacutemica
cualquiera es que los reactantes esteacuten presentes en el sitio de reaccioacuten En los
sistemas multifase los procesos de transporte son generalmente maacutes lentos
que las tasas maacuteximas de reaccioacuten intriacutenseca Este fenoacutemeno da como
resultado que las tasas de reaccioacuten reales sean menores que las que se
podriacutean esperar por efecto de la cineacutetica de reaccioacuten uacutenicamente
Los fundamentos fiacutesicos principales que determinan la transferencia de
materia son los mismos que aplican para la transferencia de calor y de
momento es decir conveccioacuten y difusioacuten
En los sistemas bioloacutegicos multifase como las fermentaciones en medio
sumergido la transferencia de masa ocurre entre dos fases una gaseosa y
otra liacutequida La mayor parte de los procesos fermentativos a gran escala con
excepcioacuten tal vez uacutenicamente de la produccioacuten de etanol y aacutecido laacutectico son
aeroacutebicos y tiacutepicamente son llevados a cabo en biorreactores aireados gas-
liacutequido En estos procesos aeroacutebicos como sucede con la produccioacuten de γ-
PGA por parte de Bacillus licheniformis ATCC9945a la transferencia de
oxiacutegeno desde la fase gaseosa a la fase liacutequida resulta vital para el eacutexito de
dicho bioproceso
En los bioprocesos aeroacutebicos el oxiacutegeno es un sustrato clave y debido
a su baja solubilidad en caldos y medios de cultivo resulta necesario su
continuo suministro La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deber ser
conocida e inclusive predicha con el propoacutesito de llevar a cabo un adecuado
disentildeo operacional del proceso y un correcto escalado de los biorreactores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 40
432 La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR)
El transporte de oxiacutegeno gas-liacutequido en los bioprocesos aeroacutebicos es el
principal proceso gas-liacutequido a considerar a la hora de disentildear un bioproceso
La solubilidad del oxiacutegeno en un medio liacutequido es baja la concentracioacuten de
saturacioacuten de oxiacutegeno es de cerca de 7-8 mgL en un proceso tiacutepico en
aireacioacuten por lo cual una transferencia de oxiacutegeno continua de la fase gaseosa
a la liacutequida es esencial para conservar un metabolismo celular completamente
oxidativo Por ejemplo unos pocos minutos sin aireacioacuten pueden impactar
severamente en la habilidad de Penicillium chrysogenum para producir
penicilina mientras que en organismos aeroacutebicos facultativos esto puede
generar cambios draacutesticos en el rendimiento y el tipo de producto generado en
condiciones de carencia de oxiacutegeno
La transferencia de oxiacutegeno desde una fase gaseosa hasta el interior de
una ceacutelula ocurre siguiendo una serie de pasos secuenciales que son
1) Difusioacuten del O2 desde la fase gaseoso a la interfase gas-liacutequido
2) Transporte a traveacutes de la interfase gas-liacutequido
3) Difusioacuten del O2 a traveacutes de una regioacuten relativamente inactiva del liacutequido
adyacente a la burbuja es decir de la interfase gas-liacutequido a la de
mezclado del liacutequido
4) Transporte del oxiacutegeno disuelto a la ceacutelula los conglomerados celulares
o al pellet de ceacutelulas inmovilizadas
5) Difusioacuten a traveacutes de la peliacutecula inactiva hasta la superficie de la ceacutelula
dentro de los conglomerados celulares o al interior del pellet de ceacutelulas
inmovilizadas
6) Transporte a traveacutes de la membrana celular
7) Transporte del O2 en el interior celular hacia el sitio de demanda
433 Descripcioacuten de la transferencia maacutesica con kLa
La tasa volumeacutetrica de transferencia de materia de un compuesto A (qtA)
en este caso oxiacutegeno (O2) puede ser descrita cuantitativamente como el
producto de un coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (kLa) y una
fuerza impulsora que consiste en la diferencia entre la concentracioacuten de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 41
saturacioacuten del compuesto (cA) y la concentracioacuten actual del compuesto en la
fase liacutequida (cA)
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (unidad s-1) el kLa
es normalmente referido como un coeficiente uacutenico pero en realidad consiste
de dos partes el coeficiente de transferencia de materia propiamente dicho (kL)
que estaacute vinculado con el flujo maacutesico (tasa de transferencia por unidad de
aacuterea) y el aacuterea de la superficie especiacutefica (a) que es el aacuterea de transferencia
por unidad de volumen
La tasa de transferencia de oxiacutegeno (referida como velocidad de
transferencia de oxiacutegeno en algunos casos) el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de materia (kLa) y la concentracioacuten de oxiacutegeno estaacuten
relacionados por la ecuacioacuten
NAa = OTR = kLa(cA- cA) (gm3s)
Noacutetese en la ecuacioacuten que para que la transferencia sea mayor interesa
tener una kLa alta pero ademaacutes (cA-cA) debe tener un valor elevado lo que
podriacutea llevar a plantear que cA sea lo menor posible Sin embargo se requiere
de una concentracioacuten miacutenima de oxiacutegeno para mantener una fermentacioacuten
aerobia Con respecto a dicha ecuacioacuten es importante sentildealar que
1) La concentracioacuten en fase liacutequida cA corresponde a la cantidad de
oxiacutegeno que hay en la fase acuosa y se determina mediante un
electrodo de oxiacutegeno disuelto Si al sistema se introduce aire a presioacuten
atmosfeacuterica dicho valor estaraacute entre los 0-10 mgL
2) La concentracioacuten de saturacioacuten cA corresponde a la solubilidad de
oxiacutegeno y es dependiente de la concentracioacuten de oxiacutegeno en la fase
gaseosa es decir de la presioacuten parcial de oxiacutegeno Una vez conocida la
presioacuten parcial de oxiacutegeno es posible calcular el valor de la solubilidad
mediante la ley de Henry En agua una forma de esta ecuacioacuten seriacutea
pAGcA = He
Donde He es la constante de Henry y cuyo valor (aproximadamente
entre 15-30 atm m3kg) es funcioacuten de la temperatura A partir de esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 42
ecuacioacuten es posible despejar el valor de cA = pAGHe El valor de He
cambia con la temperatura por ejemplo en agua pura a 25 ordmC para el
oxiacutegeno es de 2396 x 106 Pamiddotm3middotkg-1 El valor de cA es modificable si
se manipula
a) Presioacuten podemos aumentar la concentracioacuten de saturacioacuten si
aumentamos la presioacuten parcial de oxiacutegeno por ejemplo si
pasamos de 021 atm a 1 atm introduciendo al reactor oxiacutegeno
puro en vez de aire a presioacuten atmosfeacuterica lo que da por
resultado un aumento en alrededor de cinco veces su valor
Es posible tambieacuten alcanzar un mayor aumento de la
concentracioacuten de saturacioacuten si aumentamos la presioacuten
absoluta no obstante si hacemos fermentaciones con
oxiacutegeno a presioacuten resulta necesario disponer de un
fermentador capaz de resistir tales condiciones de presioacuten
resulta evidentemente maacutes costoso y tambieacuten pueden ocurrir
cambios importantes en el metabolismo de los
microorganismos que puedan afectar su crecimiento o su
rendimiento en producto
b) Temperatura la solubilidad del oxiacutegeno en agua disminuye al
aumentar la temperatura
c) Composicioacuten del liacutequido si en lugar de agua pura se tiene una
disolucioacuten como sucede con la mayoriacutea de los medios que
tiene una composicioacuten salina importante la solubilidad debe
corregirse pues dichos componentes afectan su valor y dicho
efecto estaacute influenciado tanto por los iones presentes como
por los componentes orgaacutenicos
44 Fermentaciones a presioacuten
La gran mayoriacutea de los estudios sobre fermentaciones son generalmente
llevados a cabo bajo condiciones de presioacuten ambiental maacutes allaacute del hecho de
que el fermentador por lo general suele encontrarse positivamente presurizado
Son pocos los ejemplos a excepcioacuten de la cerveza y algunos vinos donde las
fermentaciones son llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten positiva en el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 43
fermentador Esta leve presurizacioacuten suele deberse al proceso de aireacioacuten del
biorreactor debido a la formacioacuten de una presioacuten de vuelta debido a las
restricciones del respiradero de escape del fermentador
La presioacuten positiva en muchos casos puede resultar beneficiosa para los
procesos de fermentacioacuten no soacutelo por el hecho de incrementar la solubilidad del
oxiacutegeno en el caldo de cultivo sino tambieacuten porque reduce las oportunidades
de contaminacioacuten externa durante el proceso de fermentacioacuten Igualmente la
presioacuten puede tener efectos nocivos sobre los procesos fermentativos La
presioacuten tiene el efecto de influenciar las velocidades y la direccioacuten del
metabolismo de los microorganismos Esto es particularmente evidente en el
caso de productos o subproductos volaacutetiles que forman parte de distintas rutas
metaboacutelicas La presioacuten en el fermentador puede evitar la produccioacuten o
expulsioacuten de un producto gaseoso al medio circundante Este fenoacutemeno puede
tener el efecto de interferir con el equilibrio de varias reacciones bioquiacutemicas y
puede resultar en toxicidad al interior de la ceacutelula o en la divergencia de rutas
metaboacutelicas Lo significante de este impacto dependeraacute de la duracioacuten del
proceso asiacute como de la magnitud de la presioacuten a la cual se realice la
fermentacioacuten
De igual manera el efecto de la presioacuten sobre las macromoleacuteculas
guarda una gran semejanza con los efectos de la temperatura lo cual se
desprende del parecido de la forma de los diagramas de estabilidad de las
proteiacutenas y viabilidad de los microorganismos entre ambas variables
temperatura y presioacuten observacioacuten que tambieacuten permite concluir que las
proteiacutenas constituyen los primeros elementos estructurales en ser afectados
de manera negativa por el incremento de la presioacuten La presioacuten parece afectar
en mayor medida las interacciones proteiacutena-proteiacutena en comparacioacuten con la
estabilidad proteica por siacute misma por lo que es vaacutelido concluir que son estas
interacciones las primeras en verse afectadas por dicha variable La
conservacioacuten de la viabilidad en los microorganismos al ser sometidos a
presioacuten dependeraacute en gran medida de su capacidad para conservar una
membrana celular funcional aunque los mecanismos que emplean para tal fin
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 44
auacuten son desconocidos dada la vital importancia de las interacciones proteiacutena-
proteiacutena en las funciones de membrana
Lo maacutes importante es conocer con detalle como efectivamente la presioacuten
ejercida afecta el proceso de fermentacioacuten en particular la bioquiacutemica y la
fisiologiacutea del mismo de igual manera si es posible controlar la direccioacuten de la
fermentacioacuten manipulando la presioacuten o si la presioacuten estaacute generando el
desarrollo de reacciones secundarias indeseadas las respuestas a dichas
interrogantes soacutelo pueden ser dilucidadas mediante la experimentacioacuten praacutectica
del proceso fermentativo en estudio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 45
7 MATERIALES Y METODOLOGIacuteA
51 Informacioacuten de la cepa empleada
Se empleoacute la cepa Bacillus licheniformis ATCC9945a la cual se
encontraba conservada en estado vegetativo y bajo refrigeracioacuten en el
Laboratorio de Biopoliacutemeros del ETSEIB UPC Cataluntildea Con el propoacutesito de
seleccionar colonias altamente mucosas capaces de producir γ-PGA se
procedioacute a rallar la biomasa conservada en placas con Agar LB (pH 75) e
incubarlas por 24 horas a 37 ordmC Las colonias que mostraron una morfologiacutea
mucosa indicadora de la produccioacuten de γ-PGA fueron utilizadas para elaborar
los inoacuteculos empleados en las distintas fermentaciones
52 Medio de cultivo empleado
El medio de cultivo empleado para la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a fue el medio de cultivo E (Leonard et al 1958) con
algunas modificaciones seguacuten recomendado por Birrer y colaboradores (1994)
El detalle de la formulacioacuten se presenta en la tabla 5
Tabla 5 Formulacioacuten del medio de cultivo E empleado en el cultivo SmF de Bacillus
licheniformis ATCC9945a
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO43H2O 043 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 015 CaCl2 011 Glicerol 80 pH 75 Esterilizacioacuten por filtracioacuten (045 μm) Volumen 1 L
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 46
El medio de cultivo fue esterilizado por filtracioacuten (045 μm) y conservado
en refrigeracioacuten a 7 ordmC
53 Preparacioacuten de los inoacuteculos madre
Las colonias seleccionadas fueron inoculadas en matraces de 125 mL
con 25 mL de medio de cultivo E y cultivadas a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica
con varilla imantada a 650 rpm por 12 horas El caldo resultante fue
centrifugado a 8000 rpm por 25 minutos la biomasa recuperada fue
resuspendida en 10 mL de medio de cultivo E y 10 mL de una solucioacuten de
glicerol al 20 Dicha solucioacuten fue distribuida en voluacutemenes de 1 mL en tubos
eppendorf y congeladas a -80 ordmC
Posteriormente uno de estos tubos eppendorf fue empleado para
inocular matraces de 500 mL conteniendo 125 mL de medio de cultivo y fueron
cultivados a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica con varilla imantada a 650 rpm por
14 horas El caldo resultante fue centrifugado nuevamente a 8000 rpm por 25
minutos se recuperoacute la biomasa precipitada y se resuspendioacute en 25 mL de
medio de cultivo E y 25 mL de una solucioacuten de glicerol al 20 Dicha solucioacuten
fue distribuida en voluacutemenes de 2 mL en tubos eppendorf y posteriormente
fueron congelados a -80 ordmC Cada uno de estos eppendorf constituiacutea un inoacuteculo
de origen para una fermentacioacuten individual La absorbancia promedio de estos
inoacuteculos se encontraba cercana a 25
531 Conservacioacuten de la cepa en estado productivo
Los inoacuteculos deben conservarse en todo momento bajo congelacioacuten a
una temperatura inferior a -15 ordmC siendo preferible conservarlos a -80 ordmC La
condicioacuten de produccioacuten de γ-PGA es extremadamente fraacutegil y cambios de
temperatura o descongelamiento pueden conllevar la peacuterdida de dicha
capacidad La reutilizacioacuten de biomasa residual de fermentaciones previas
queda descartada
54 Montaje del biorreactor a presioacuten
En la actualidad los principales fabricantes de biorreactores para la
industria biotecnoloacutegica carecen de equipos de fermentacioacuten a escala
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 47
laboratorio que puedan operar bajo condiciones de presioacuten superiores a los 01
bares relativos Por este motivo se debioacute modificar un reactor quiacutemico a
presioacuten de modo tal que pudiese cumplir los requisitos necesarios para el
cultivo de microorganismos El modelo empleado fue el reactor quiacutemico a
presioacuten modelo 6425-214 de la casa AceGlass (Estados Unidos) de un
volumen total de 2 L Este reactor tiene la capacidad de operar hasta 35 psig
(241 bares relativos) a una temperatura de 100 ordmC y a una agitacioacuten de 300
rpm El mismo seguacuten su disentildeo original se presenta en la figura 6
Figura 6 Reactor quiacutemico a presioacuten modelo 6425-214 de AceGlass Co
Las dimensiones del frasco del reactor de forma ciliacutendrica y fondo
redondeado son las siguientes
Diaacutemetro de boca 95 mm
Diaacutemetro maacuteximo 120 mm
Profundidad 180 mm
Con el propoacutesito de adecuarlo al cultivo de microorganismos el reactor
fue ligeramente modificado en algunos de sus componentes y su distribucioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 48
Entre los principales cambios realizados al sistema se encuentran los
siguientes
1) Incorporacioacuten de una turbina de disco tipo Rushton al tratarse de una
fermentacioacuten aeroacutebica es necesario garantizar una adecuada aireacioacuten
del medio de cultivo mediante agitacioacuten efectiva La paleta de agitacioacuten
original del sistema no cumpliacutea con dicho requisito por lo cual se cambioacute
la misma por una turbina tipo Rushton cuyas dimensiones se muestran
en la figura 7
Dimensiones
A = 75 mm
B = 18 mm
C = 1mm
D = 20 mm
Figura 7 Dimensiones de la turbina tipo Rushton empleada
Esta turbina se encuentra en posicioacuten central a 3 cm del fondo del
reactor y a 6 mm de los deflectores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 49
2) Incorporacioacuten de deflectores se incorporaron dos laacuteminas deflectoras de
disentildeo propio de1 mm de ancho en una posicioacuten de 90 grados con
respecto a la superficie del reactor con el propoacutesito de reducir la
formacioacuten de voacutertice promover una agitacioacuten turbulenta y una mayor
formacioacuten de burbujas La geometriacutea de las laacuteminas deflectoras se
detalla en la Figura 8
Dimensiones
Ancho de laacutemina = 10 mm
Diaacutemetro = 95 mm
Longitud de laacutemina = 200 mm
Figura 8 Geometriacutea de las laacuteminas deflectoras
3) Cambio del motor de agitacioacuten se incorporoacute un motor IKA RW20 con
capacidad de hasta 2000 rpm en sustitucioacuten del motor original con que
A
B
C
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 50
disponiacutea el equipo (el sistema original trae un motor limitado a una
velocidad de agitacioacuten maacutexima de 330 rpm) con el propoacutesito de variar la
agitacioacuten del sistema y observar su efecto sobre el crecimiento y la
produccioacuten de poliacutemero
4) Reubicacioacuten de la vaacutelvula de seguridad de sobrepresioacuten con el
propoacutesito de garantizar una mayor seguridad del equipo maximizar la
vida uacutetil del cilindro de aire comprimido y evitar la sobrepresioacuten que
pueden generar el crecimiento del microorganismo (su metabolismo
puede liberar compuestos gaseosos o volaacutetiles) se trasladoacute la vaacutelvula de
seguridad del equipo de la tuberiacutea de llenado a la tapa del reactor
5) Eliminacioacuten de componentes dado que no resultaban uacutetiles para la
presente investigacioacuten se prescindioacute de instalar en la tapa del equipo el
condensado y el embudo de adicioacuten El disco de ruptura de la tuberiacutea de
llenado fue sustituido por una vaacutelvula de apertura manual con el
propoacutesito de permitir un mejor y maacutes raacutepido ajuste de la presioacuten durante
el establecimiento inicial de las condiciones de fermentacioacuten
55 Condiciones de fermentacioacuten
El detalle de las condiciones de temperatura presioacuten pH y agitacioacuten en
las cuales fueron establecidas las distintas fermentaciones asiacute como la
metodologiacutea de escalamiento empleada se presentan a continuacioacuten
551 Escalamiento
Inicialmente se procediacutea a inocular por duplicado 100 mL de medio de
cultivo con uno de los inoacuteculos madre (2 mL de ceacutelulas de Bacillus licheniformis
ATCC9945a conservados en tubos eppendorf a -20 ordmC) en matraces con
deflectores de 500 mL de capacidad A dichos matraces se les incorporaba una
pastilla de agitacioacuten magneacutetica de 25 cm de longitud y 07 cm de diaacutemetro y
eran colocados en agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm (agitador IKA C-MAG HS7)
por 8 horas a una temperatura aproximada de 30 ordmC
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 51
Posteriormente uno de los matraces (100 mL de cultivo) anteriormente
establecidos era utilizado para inocular 500 mL de medio de cultivo en el
biorreactor a presioacuten manteniendo una temperatura constante de 30 ordmC
aproximadamente Distintas presiones velocidades de agitacioacuten y densidades
oacutepticas del inoacuteculo fueron evaluadas El detalle del disentildeo experimental de
dichas pruebas se presenta a continuacioacuten en la tabla6
Tabla 6 Diferentes condiciones de presioacuten relativa agitacioacuten y absorbancia evaluadas en las
fermentaciones en biorreactor
CONDICIOacuteN
VALORES EVALUADOS
SOBREPRESIOacuteN
Agitacioacuten 300 rpm
Absorbancia del inoacuteculo 120
O bar (0 psig)
052 bar (75 psig)
103 bar (15 psig)
172 bar (25 psig)
241 bar (35 psig)
AGITACIOacuteN
Sobrepresioacuten 103 bar (15 psig)
Absorbancia del inoacuteculo 120
300 rpm
400 rpm
500 rpm
650 rpm
El tiempo de fermentacioacuten para cada uno de los ensayos evaluados fue
de 18 horas tiempo en el que el pH habiacutea descendido a un valor cercano pero
auacuten superior a 6 No se realizoacute ajuste alguno del pH a lo largo de la
fermentacioacuten Posteriormente se procediacutea a centrifugar el caldo de
fermentacioacuten a 8000 rpm por 25 minutos el sobrenadante recuperado era
almacenado para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA presente en
el mismo
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre
Con el propoacutesito de garantizar que el inoacuteculo madre era apto para la
produccioacuten de γ-PGA uno de los matraces inicialmente establecidos era
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 52
conservado bajo agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm y a 30 ordmC durante las 18 horas
que requeriacutea la fermentacioacuten en el biorreactor Posteriormente se determinaba
cualitativamente la produccioacuten de γ-PGA seguacuten la simbologiacutea que se presenta
en la tabla 7
Tabla 7 Simbologiacutea empleada para la medicioacuten cualitativa de la produccioacuten de γ-PGA en los
matraces de control
SIacuteMBOLO OBSERVACIOacuteN CUALITATIVA
- No produccioacuten de γ-PGA
+ Produccioacuten de γ-PGA
+++ Elevada produccioacuten de γ-PGA
56 Determinacioacuten del valor de kLa
Para la determinacioacuten del valor aproximado de kLa tanto en los
matraces coacutemo en el biorreactor se empleoacute el meacutetodo estaacutetico sin operacioacuten
del cultivo celular Dicho valor no fue determinado bajo condiciones de presioacuten
pues se careciacutea con la instrumentacioacuten adecuada sino soacutelo a presioacuten
atmosfeacuterica para ambos casos matraz y biorreactor
Este meacutetodo consiste en disminuir la concentracioacuten de oxiacutegeno hasta
una concentracioacuten de 1-25 mgL despueacutes el sistema es retornado a aireacioacuten
yo agitacioacuten y se mide como va aumentando la concentracioacuten de oxiacutegeno en la
fase liacutequida conforme transcurre el tiempo El objetivo es por tanto disminuir la
concentracioacuten de cA0 lo suficiente como para tener un cambio importante
obteniendo asiacute una curva de ascenso de las concentraciones de oxiacutegeno en el
tiempo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 53
561 Matraces de cultivo
A un matraz de cultivo en reposo conteniendo 100 mL de medio de
cultivo E se le agregoacute 001 g de sulfito de sodio (Na2SO3) y una punta de
espaacutetula de cloruro de cobalto (actuacutea como catalizador) y se agita
manualmente por 20 s Posteriormente se introdujo la sonda de oxiacutegeno
disuelto del medidor Hanna Oxi-check y se dejoacute descender el nivel de oxiacutegeno
disuelto hasta el valor miacutenimo posible entre 20-25 mgL Seguidamente se
activoacute la agitacioacuten magneacutetica y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto cada 10
segundos hasta alcanzar un punto maacuteximo que se repitiese al menos durante
2 minutos
562 Biorreactor
Se procedioacute a llenar el reactor con 600 mL de medio de cultivo y en
estado de reposo se le agregoacute 006 g de sulfito de sodio una punta de espaacutetula
de cloruro de cobalto y se agitoacute suavemente a 100 rpm por 20 segundos
Haciendo uso de la sonda de oxiacutegeno se determinoacute el menor nivel posible de
oxiacutegeno disuelto alrededor de 15-20 mgL Posteriormente se encendioacute la
agitacioacuten mecaacutenica a 300 rpm y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto en
intervalos de 10 segundos hasta alcanzar un valor maacuteximo de oxiacutegeno disuelto
sostenido en el tiempo es decir que se repitiese por al menos un minuto
563 Graficacioacuten
Con el propoacutesito de determinar el valor de kla a partir de la ecuacioacuten de
balance de oxiacutegeno
V(dCAdt) = VkLa(cA-cA)
Se tiene que integrando dicha ecuacioacuten con la concentracioacuten inicial cA0
se obtiene
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 54
Representado ln((cA - cA0)(c
A- cA)) contra el tiempo t se obtiene una
recta cuya pendiente es el valor de kLa
57 Determinacioacuten del contenido de γshyPGA en el caldo de fermentacioacuten
Con el propoacutesito de determinar la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo
post-fermentacioacuten se utilizoacute la teacutecnica analiacutetica llamada cromatografiacutea liacutequida
de alta eficiencia conocida normalmente por sus siglas en ingleacutes HPLC
especiacuteficamente la conocida como cromatografiacutea de permeacioacuten en gel (GPC)
uno de los tipos de cromatografiacutea de exclusioacuten molecular (SEC) maacutes
empleados en la separacioacuten de poliacutemeros
El equipo empleado fue el cromatoacutegrafo modelo 1260 Infinity de Agilent
Technologies La columna de separacioacuten empleada fue una columna PL
aquagel-OH de 8μm para cromatografiacutea GPC en fase acuosa El meacutetodo de
cromatografiacutea empleado consistioacute en eludir 25 μL de la muestra haciendo uso
de una solucioacuten tampoacuten fosfato 005 molL con un tiempo de elucioacuten de 15 min
por muestra El caudal de flujo del eluyente fue de 08 mLmin La deteccioacuten se
llevoacute a cabo a traveacutes de un detector de absorbancia UV-vis de longitud de onda
variable (VWD) a una longitud de onda de 220 nm y tambieacuten un detector de
iacutendice de refraccioacuten (RID) con polaridad positiva y una temperatura de la
unidad oacuteptica de 35 ordmC aunque los resultados reportados y empleados fueron
los obtenidos con el detector VWD El tiempo de retencioacuten de la fraccioacuten
polimeacuterica correspondiente al γ-PGA se encontroacute entre los 65 y los 90
minutos considerando el hecho de que el mismo se trata de una mezcla de
moleacuteculas polimeacutericas de distinta longitud y por ende distinto peso molecular
Para poder cuantificar la cantidad de poliacutemero presente en la muestra se
elaboroacute una curva de calibracioacuten inicial Se prepararon soluciones en agua
destilada de γ-PGA a concentraciones de 10 5 2 1 y 05 gL Las mismas
fueron analizadas mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva para el
pico correspondiente al γ-PGA para cada concentracioacuten Dichos valores fueron
empleados para la elaboracioacuten de la curva de calibracioacuten inicial del equipo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 55
Las muestras a analizar fueron preparadas de la siguiente manera 400
μL del caldo crudo se diluyeron en agua destilada hasta un volumen final de 2
mL (dilucioacuten 5x) y posteriormente fueron filtradas mediante jeringa haciendo
uso de filtros de 045 μm en viales de HPLC Las muestras fueron analizadas
mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva del pico correspondiente al
γ-PGA para cada una de las muestras
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
Con el propoacutesito de determinar el efecto del contenido de γ-PGA sobre la
solubilidad maacutexima de oxiacutegeno en el medio de cultivo en condiciones estaacuteticas
es decir sin crecimiento microbiano (consumo de oxiacutegeno de los
microorganismos nulo) se procedioacute a preparar soluciones de 100 mL de
volumen a concentraciones crecientes de poliacutemero (poliacutemero + biomasa) en
medio de cultivo y medir el nivel de oxiacutegeno disuelto en mgL haciendo uso de
un medidor de oxiacutegeno disuelto Hanna Oxi-check Dichas soluciones fueron
evaluadas en las mismas condiciones de fermentacioacuten empleadas en la
primera etapa de escalamiento matraces de 500 mL con deflectores y a una
agitacioacuten magneacutetica de 650 rpm Se evaluaron concentraciones de biopoliacutemero
de 0 7 14 21 36 54 y 71 gL
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano
Para determinar el crecimiento bacteriano se aprovechoacute el efecto que
dicho crecimiento genera sobre la turbidez del caldo a lo largo de la
fermentacioacuten Por ello se empleoacute la teacutecnica de espectrofotometriacutea
determinando la absorbancia del medio de cultivo inoculado y su incremento
con el tiempo Se empleoacute el coloriacutemetro modelo ZUSI 4200A a una longitud de
onda de 660 nm El equipo era inicialmente calibrado en 0 haciendo uso de
agua destilada acto seguido se determinaba el valor de absorbancia de la
muestra a analizar
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 56
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producido se determinoacute
mediante el meacutetodo desarrollado por Marfey (1984) para la determinacioacuten
cuantitativa de la composicioacuten enantiomeacuterica de aminoaacutecidos Dicho meacutetodo se
basa en la reaccioacuten del aacutecido glutaacutemico con el reactivo de Marfey (1-fluoro-24-
dinitrofenil-5-L-alanina) Dicho compuesto es oacutepticamente activo por lo que al
reaccionar con los enantioacutemeros D- y L- del aacutecido glutaacutemico forma dos
diasteroisoacutemeros que pueden separarse mediante cromatografiacutea HPLC con
tiempos de retencioacuten para el isoacutemero L- y el D- de 675 y 100 minutos
aproximadamente Para poder cuantificar la composicioacuten de manera efectiva
se realizoacute un calibrado previo con mezclas de concentracioacuten conocida de cada
isoacutemero
5101 Preparacioacuten de la muestras
Se introdujo 3 mg del γ-PGA a analizar en viales de 5 mL y se les
adicionoacute 2 mL de HCl 6 molL Se dejaron calentar a 100 ordmC en estufa por un
periacuteodo de 24 horas Posteriormente se trasfirioacute 100 μL de cada una de las
muestras a tubos eppendorf y se dejaron en desecador al vaciacuteo por un periacuteodo
de tres diacuteas empleando NaOH como desecante Seguidamente se disolvioacute los
productos en 100 μL de agua y se hicieron reaccionar con 200 μL de una
disolucioacuten con concentracioacuten de 5 mgmL de reactivo de Marfey en acetona con
20 μL de carbonato aacutecido de sodio (NaHCO3) durante una hora en estufa a 37
ordmC Al finalizar se neutralizoacute como 10 μL de HCl 2 molL y se dejoacute secar al vaciacuteo
por 3 diacuteas en el desecador a vaciacuteo con NaOH como desecante Finalmente se
diluyoacute la muestra en 350 μL de dimetilsulfoacutexido (DMSO) para cromatografiarla
por HPLC
La cromatografiacutea se llevoacute a cabo en el mismo equipo empleado para la
determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA pero con los siguientes cambios
1) Se empleoacute una columna de fase estacionaria reversa Spherisorb ODS2
de 5 μm de poro 25 cm de longitud y 046 cm de diaacutemetro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 57
2) El caudal de flujo del eluyente fue de 15 mLmin
3) El detector de longitud de onda variable (VWD) operaba a 340 nm y el
tiempo de elucioacuten era de 25 minutos
4) El eluyente empleado era una mezcla 8020 de fosfato de trietilamonio
50 mmolL a pH 3 y acetonitrilo El fosfato de trietilamonio se obteniacutea
haciendo reaccionar cantidades equimolares de trietilamina y aacutecido
fosfoacuterico
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual
La composicioacuten porcentual enantiomeacuterica del γ-PGA es decir el
contenido porcentual de aacutecido D- y L-glutaacutemico se determinoacute mediante
contraste de las aacutereas obtenidas en el cromatograma para cada uno de los
picos correspondientes a cada diasteroisoacutemero con el aacuterea total
correspondiente a los productos de reaccioacuten (sumatoria de ambos
diasteroisoacutemeros) La composicioacuten se reportoacute como un porcentaje de aacutecido D-
glutaacutemico y aacutecido L-glutaacutemico presente en la muestra analizada
511 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA Para la determinacioacuten del peso molecular del poliacutemero se procedioacute a
analizar los cromatogramas obtenidos para el caacutelculo de la concentracioacuten de γ-
PGA Se empleoacute el programa informaacutetico ChemStation for LC Systemsreg de
Agilent Technologies Dicho programa posee unas potentes herramientas de
anaacutelisis que permiten automaacuteticamente calcular el peso molecular de un
compuesto Para las muestras analizadas se determinoacute el peso molecular
promedio en nuacutemero (Mn) el peso molecular promedio en peso (Mw) la
polidispersidad y el peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) La recta de
calibrado fue obtenida previamente por Bou y colaboradores con estaacutendares de
polioacutexido de etileno (PEO)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 58
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 59
8 RESULTADOS
61 Montaje del biorreactor a presioacuten
El detalle final del biorreactor empleado puede observarse en la figura 8
Noacutetese que la temperatura es controlada por la accioacuten de una manta teacutermica
externa como sucede con el disentildeo original del reactor y no por el empleo de
un serpentiacuten interno caso de la gran mayoriacutea de biorreactores comerciales a
escala laboratorio El mismo permite operar en condiciones de agitacioacuten de 100
a 650 rpm y a presiones de hasta 24 bar de sobrepresioacuten (35 psig) El
biorreactor resultoacute apto para el crecimiento microbiano alcanzaacutendose valores
de absorbancia de hasta 37 similares a los observados en cultivos en
matraces
Figura 9 Biorreactor empleado para la produccioacuten de γ-PGA bajo presioacuten
62 Competencia del inoacuteculo madre
Mediante la metodologiacutea descrita previamente para la preparacioacuten del
inoacuteculo madre fue posible alcanzar en el 100 de los cultivos de control la
produccioacuten de γ-PGA en alta cantidad Aunque dichos resultados no se
muestran el empleo de inoacuteculos de otra naturaleza como reutilizacioacuten de
biomasa o inoacuteculos conservados a temperaturas superiores a -20 ordmC mostraron
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 60
ser ineficaces y poco reproducibles en cuanto a la produccioacuten de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a Los resultados de los cultivos control
pueden observarse en el graacutefico 10 bajo el nombre de Matraz
63 Determinacioacuten de los valores de kLa
631 Matraz
En lo referente al cultivo en matraz bajo las condiciones de agitacioacuten y
temperatura empleadas y en condiciones estaacuteticas (sin crecimiento
microbiano) se encontroacute un valor de kLa de 0026 s-1 En el graacutefico 1 y 2 se
muestran la curva de concentracioacuten de oxiacutegeno en funcioacuten del tiempo al
reiniciarse el proceso de agitacioacuten asiacute como el caacutelculo de dicho valor de
coeficiente mediante regresioacuten lineal respectivamente
Graacutefico 1 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concentracioacuten m
gL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 61
Graacutefico 2 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00257x ‐ 08809Rsup2 = 09966
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
Cuando se realizoacute la misma determinacioacuten pero a una velocidad de
agitacioacuten menor (430 rpm) el valor de kLa disminuyoacute significativamente En
dicho caso el valor de kLaobtenido fue de 0017 s-1 Estos resultados se
muestran en los graacuteficos 3 y 4
Como se puede observar en dichos graacuteficos el tiempo requerido para
alcanzar el valor maacuteximo estable se incrementoacute considerablemente en 60
segundos lo que indica una menor velocidad de transferencia producto de la
reduccioacuten de la intensidad de la agitacioacuten suministrada al cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 62
Graacutefico 3 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 430 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Graacutefico 4 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00168x ‐ 07551Rsup2 = 09835
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
ln Linear (ln)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 63
632 Biorreactor
Para el caso del biorreactor el valor de kLa determinado fue de 0025 s-1
esto bajo condiciones estaacuteticas (sin crecimiento microbiano) y en las
condiciones de temperatura y operacioacuten previamente descritas
Como se puede observar dicho valor es praacutecticamente igual al obtenido
para el caso del matraz lo que indica condiciones de transferencia de oxiacutegeno
gas-liacutequido muy similares en ambos casos El valor dekLa fue determinado en
un punto lateral del reactor 2 cm por debajo del nivel de medio de cultivo y
contiguo a uno de los deflectores punto donde la transferencia de materia
debiera en principio ser mayor Dichos resultados se presentan en los graacuteficos
5 y 6
Graacutefico 5 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten mecaacutenica del medio de cultivo en biorreactor a 300 rpm
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
560
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Concentracioacuten
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 64
Graacutefico 6 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00246x ‐ 03222Rsup2 = 09902
000
050
100
150
200
250
300
0 20 40 60 80 100 120 140
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
64 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En lo referente a los niveles de oxiacutegeno a distintas concentraciones de γ-
PGA en condiciones estaacuteticas sin crecimiento microbiano se observa una
draacutestica reduccioacuten de dicho nivel conforme se incrementa la concentracioacuten del
biopoliacutemero Dicho fenoacutemeno es esperable dada la alta viscosidad del γ-PGA
La concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo alcanza un valor inicial de
74 mgL el cual se reduce draacutesticamente a 52 mgL a un valor de
concentracioacuten de γ-PGA de 14 gL Esta reduccioacuten es uacutenicamente producto de
la presencia del γ-PGA en el medio de cultivo El graacutefico 7 muestra dicho
fenoacutemeno hasta un valor miacutenimo de oxiacutegeno disuelto de 25 mgL cuando la
concentracioacuten de poliacutemero alcanza un maacuteximo 71 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 65
Graacutefico 7 Efecto de la concentracioacuten de γ-PGA sobre el nivel maacuteximo de oxiacutegeno disuelto en el
medio de cultivo E
y = ‐00569x + 64671Rsup2 = 08709
000
100
200
300
400
500
600
700
800
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Oxiacutegeno disuelto m
gL
γ‐PGA gL
Solubilidad O2 (mgL) Linear (Solubilidad O2 (mgL))
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γshyPGA mediante GPC
La curva de calibracioacuten obtenida a partir de soluciones con
concentracioacuten conocida de γ-PGA se presenta en el graacutefico 8
Como se puede observar se obtuvo un valor del coeficiente de
determinacioacuten R2 de 09983 lo que indica un ajuste lineal suficiente y un valor
del coeficiente de correlacioacuten R de 09991 lo que indica una correlacioacuten
positiva entre los datos contrastados La concentracioacuten de γ-PGA estaacute
determinada entonces por la siguiente ecuacioacuten
Concentracioacuten γ-PGA (gL) = (00027 x Aacuterea) ndash 00916
Esta curva fue posteriormente empleada para determinar la
concentracioacuten de γ-PGA en los caldos de cultivo obtenidos despueacutes de cada
una de las fermentaciones realizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 66
Graacutefico 8 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA mediante
GPC
y = 00027x ‐ 00916Rsup2 = 09983
0
2
4
6
8
10
12
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Concentracioacuten gL
Aacuterea
Series1 Linear (Series1)
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γshyPGA
En lo referente al efecto de la presioacuten (relativa) sobre la productividad en
γ-PGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a se encontroacute un incremento de los
rendimientos fermentativos conforme se incrementaba la presioacuten hasta
alcanzar un valor maacuteximo de sobrepresioacuten de 103 bar (15 psig) una vez
superado dicho umbral la productividad se veiacutea reducida draacutesticamente A 103
bar la productividad en γ-PGA alcanzaba un valor de 1334 gL productividad
mayor a la obtenida en condiciones de aireacioacuten (2 Lmin) a presioacuten
atmosfeacuterica la cual fue de 508 gL Esta productividad maacutexima contrasta con
la obtenida a presioacuten atmosfeacuterica la cual fue miacutenima con un valor de 217 gL
Los graacuteficos 9 y 10 muestran los resultados anteriormente comentados Asiacute
mismo en la tabla 8 se presentan la totalidad de fermentaciones llevadas a
cabo las productividades obtenidas y el promedio de cada condicioacuten Es
importante destacar que cada condicioacuten de presioacuten fue evaluada por duplicado
no encontraacutendose diferencias importantes entre los resultados obtenidos para
ninguno de los casos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 67
Graacutefico 9 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748
617
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 05 1 15 2 25
PGGA (gL)
Presioacuten (bar)
RENDIMIENTO gL
Graacutefico 10 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten y la aireacioacuten a presioacuten atmosfeacuterica (0 relativa)
sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748617 508
4582
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
0 052 103 172 241 0 +Aireacioacuten
Matraz
Concentracioacuten γ‐PGA gL
Presioacuten
RENDIMIENTO gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 68
Tabla 8 Fermentaciones realizadas y concentraciones de γ-PGA obtenidas
Reactor Condiciones A D C (gL)AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10108 5 130
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10926 5 141
AHJC11 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 11753 5 152
AHJC11 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10186 5 131
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 95011 5 122
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 97936 5 126
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28706 3 20
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28194 3 20
AHJC14 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 33184 3 24
AHJC14 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 32866 3 23
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 68396 3 52
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 65871 3 50
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43692 5 54
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 46235 5 57
AHJC16 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 49809 5 62
AHJC16 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 58872 5 74
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 57321 5 72
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43021 5 53
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 57727 5 72
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 62398 5 78
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 60469 5 76
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 58335 5 73
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 6083 5 76
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 57897 5 72
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 51267 5 64
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 48407 5 60
= nuacutemero de muestra A = aacuterea D = dilucioacuten C = concentracioacuten y bar = bar relativo
Algunos de los cromatogramas realizados se muestran en las figuras 10
y 11 Como se puede observar la forma del pico de elucioacuten demuestra que el
biopoliacutemero estaacute compuesto por moleacuteculas de distinta longitud por lo cual
existen diferentes pesos moleculares Es importante destacar que para la gran
mayoriacutea de las fermentaciones realizadas el pico siempre presentoacute su maacutexima
altura al inicio lo que demuestra que la mayor parte de eacutel se trataba de un
poliacutemero de alto peso molecular Igualmente esto podriacutea indicar poca
degradacioacuten del biopoliacutemero durante las 18 horas de fermentacioacuten lo cual es
importante dada la capacidad de Bacillus licheniformis ATCC9945a de
hidrolizar enzimaacuteticamente el γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 69
Figura 10 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA analizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 70
Figura 11 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA (052-103-172 y 241 bar relativas)
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γshyPGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a
En lo referente al efecto de la intensidad de agitacioacuten en rpm sobre la
produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a a una presioacuten de
103 bar relativos (15 psig) se encontroacute un efecto negativo del aumento de la
agitacioacuten por encima de las 300 rpm lo que se demuestra con una importante
reduccioacuten en la concentracioacuten final de γ-PGA obtenida despueacutes de 18 horas de
fermentacioacuten Estos resultados se presentan en el graacutefico 11 Como se puede
observar una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm llega a ser tan perjudicial
para el microorganismo que la productividad en γ-PGA cae por debajo del valor
de 1 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 71
Graacutefico 11 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis
ATCC9945a a 103 bar (15 psig) a 30 ordmC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
300 350 400 450 500 550 600 650 700
Concentracioacuten gL
Agitacioacuten rpm
RENDIMIENTO (gL)
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica resultoacute afectada por las condiciones de
presioacuten Como demuestra el graacutefico 12 la proporcioacuten de aacutecido L-glutaacutemico en
las muestras correspondientes a fermentaciones bajo presioacuten resultoacute ser por
mucho mayor a las observadas en los cultivos control tanto en comparacioacuten
con el de matraz como con el sometido a aireacioacuten
La respectiva curva de calibracioacuten con las muestras conformadas por
mezclas con composicioacuten definida de ambos enantioacutemeros se presente en el
graacutefico 13 Como se puede observar los valores teoacutericos y los valores
experimentales obtenidos en el cromatograma coinciden en buena medida lo
que indica la validez de esta teacutecnica para la determinacioacuten de la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA
En dos casos para las fermentaciones llevada a cabo a 052 bar y 172
bar de sobrepresioacuten (75 y 25 psig respectivamente) la proporcioacuten de aacutecido D-
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 72
glutaacutemico fue de cero en contraste con el control en matraz donde dicha forma
del aacutecido glutaacutemico estaba presente mayoritariamente en un 87
De igual manera en lo que concierne a la fermentacioacuten llevada a cabo a
presioacuten atmosfeacuterica y bajo condiciones de aireacioacuten se observa tambieacuten que el
enantioacutemero mayoritariamente presente es el aacutecido D-glutaacutemico con un 83
en contraste con el aacutecido L-glutaacutemico con apenas un 17 Todas las
fermentaciones llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten presentan un
contenido de aacutecido L-glutaacutemico superior al 83
Aunque no fue posible encontrar una correlacioacuten directa entre la presioacuten
y la composicioacuten porcentual en aacutecido D-glutaacutemico si es posible observar como
las condiciones de presioacuten parecen limitar condicionar o disminuir la presencia
de esta forma del aacutecido glutaacutemico en el γ-PGA
Graacutefico 12 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica en aacutecido
L-glutaacutemico y aacutecido D-glutaacutemica del γ-PGA producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a
R11 (103bar)
R12 (103bar)
R15 (0 +aireacioacuten)
R16 (241bar)
R19 (172bar)
R22 (052bar)
MATRAZ
AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO 9518 8319 1736 10000 8347 10000 1285
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO 482 1681 8264 000 1653 000 8715
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 73
Graacutefico 13 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-
PGA mediante HPLC
000
2900
4700
7700
970010000
7100
5300
2300
300
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
100 L 75 L 25 D 50 L 50 D 25 L 75 D 100 D
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO
69 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA
Los resultados de los pesos moleculares de los poliacutemeros obtenidos en
los distintos ensayos se muestran en la tabla 9 El peso molecular promedio de
permeacioacuten (Mp) de todas las muestras se encontroacute entre los 269-307 x 107
gmol
Tabla 8 Valores de peso molecular promedio en nuacutemero (Mn) peso molecular promedio en
peso (Mw) peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) y polidispersidad (PD) delγ‐PGA
producido en los distintos ensayos evaluados
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
MATRAZ1 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 157 214 29 137
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
MATRAZ2 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 160 216 292 135
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar relativos
207 252 307 122 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 74
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
204 252 307 124 PRIMERO MAYOR
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
202 252 307 125 PRIMERO MAYOR
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
199 251 307 126 PRIMERO MAYOR
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 200 247 307 123
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 226 26 306 115
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 179 223 281 125
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 172 221 264 128
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
217 248 304 114 PRIMERO MAYOR
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
210 246 304 117 PRIMERO MAYOR
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
195 233 284 120 SEGUNDO MAYOR
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
178 225 269 126 SEGUNDO MAYOR
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
223 262 306 118 PRIMERO MAYOR
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
222 261 306 117 PRIMERO PAYOR
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
207 254 307 122 PRIMERO MAYOR
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
187 251 306 134 PRIMERO MAYOR
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
171 246 306 144 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
185 253 306 136 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
202 252 306 125 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 75
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
232 263 306 113 PRIMERO MAYOR
AHJC32-1-18HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
173 228 307 132 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-2-18HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
177 230 306 130 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-1-36HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
165 220 23 133 IGUALES
AHJC32-2-36HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
173 224 302 130 IGUALES
Los valores de polidispersidad estuvieron entre 113 y 144 Asiacute mismo
no se observan mayores diferencias entre los pesos moleculares obtenidos a
distintas presiones aunque la existencia de un segundo pico era maacutes evidente
en los cromatogramas correspondientes a γ-PGA producido en condiciones de
presioacuten relativa 0 Asiacute mismo dichas muestras presentan un peso molecular
levemente menor aunque dicha tendencia no es absoluta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 76
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 77
9 DISCUSIOacuteN
71 Cepa empleada
Bacillus licheniformis ATCC9945a es una cepa que ha sido empleada
con eacutexito en la produccioacuten de γ-PGA particularmente a escala laboratorio maacutes
no ha sido empleada a escala industrial donde otras cepas particularmente de
la especie Bacillus subtilis han sido las preferidas tanto por aspectos de
rendimiento como estabilidad productiva de la cepa El presente estudio
determinoacute una productividad promedio en condiciones de matraz de 4582 gL
despueacutes de 72 horas de cultivo Valores de productividad tan altos no habiacutean
sido reportado previamente para Bacillus licheniformis ATCC9945a donde
valores entre 17 y 23 gL de rendimiento han sido reportados por Troy (1973)
Cromwick y Gross (1996) 26 a 35 gL por Bajaj y colaboradores (2009) y 35
gL por Yoon y colaboradores (2000)
Los motivos de este mayor rendimiento aunque no son claros pueden
deberse a una mejor transferencia de oxiacutegeno en el sistema de agitacioacuten
magneacutetica en comparacioacuten con la agitacioacuten orbital estaacutendar Asiacute por ejemplo y
utilizando la ecuacioacuten simplificada para determinar en valor de kLa en agitacioacuten
orbital (Diacuteaz 2011) tenemos que a 20 ordmC
kLa = 139 x 10-3n (VTVL)084
Asiacute tenemos que para un sistema en agitacioacuten orbital a 250 rpm es decir
a una frecuencia de 417 s-1 con un volumen de medio de cultivo de 100 mL y
un volumen total del matraz 500 mL el valor de kLa es de aproximadamente
0020 s-1 inferior al valor de 0026 s-1 obtenido en el presente estudio para el
cultivo en agitacioacuten magneacutetica a 30 ordmC Dado que la difusividad disminuye al
aumentar la temperatura es de esperar que a 30 ordmC dicho valor de kLa teoacuterico
sea auacuten menor
Es importante sentildealar que en lo referente a la composicioacuten del medio de
cultivo el medio de cultivo E empleado en este estudio es el mismo empleado
previamente por otros autores para el estudio de la produccioacuten de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a por lo cual no se considera que la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 78
composicioacuten del medio de cultivo pueda ser la responsable de las diferencias
con los resultados reportados anteriormente por otros investigadores quienes
en particular tambieacuten emplearon dicho medio de cultivo en sus pruebas
Dicho valor de rendimiento promedio obtenido de 4582 gL (en matraz)
coloca a este cepa al mismo nivel de productividad de las cepas
industrialmente empleadas como sucede con Bacillus subtilis F02-1 con un
rendimiento reportado por Kubota y colaboradores (1993) de 50 gL pero con
una menor necesidad de aacutecido glutaacutemico (20 gL en contra de 80 gL) La
conveniencia del empleo de la cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis debe
entonces evaluarse entorno a su capacidad de escalamiento y conservacioacuten de
la competencia en la produccioacuten de γ-PGA y no entorno a su maacuteximo
rendimiento pues en este aspecto ha demostrado en condiciones oacuteptimas la
capacidad de producir γ-PGA en concentraciones extremadamente elevadas
Los resultados acaacute obtenidos refuerzan lo ya descrito por otros autores quienes
sentildealan precisamente estos aspectos (escalamiento y estabilidad) como los
principales retos para llevar a cabo la produccioacuten de γ-PGA mediante Bacillus
licheniformis ATCC9945a
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente
Uno de los principales problemas que se enfrentoacute a lo largo de la
presente investigacioacuten es la facilidad con la cual la cepa ATCC9945a de
Bacillus licheniformis revierte a formas incapaces de producir γ-PGA Este
fenoacutemeno puede ocurrir incluso con tan soacutelo una generacioacuten de cultivo por lo
cual el empleo de la biomasa generada en una fermentacioacuten previa es
indeseable pues seguramente no daraacute resultados positivos para la produccioacuten
de γ-PGA
Este fenoacutemeno es uno de los principales inconvenientes que se
enfrentan a la hora de evaluar el efecto de diversos paraacutemetros sobre la
productividad de γ-PGA en esta cepa pues la incapacidad de garantizar
resultados reproducibles imposibilita poder evaluar condiciones nutricionales
de agitacioacuten temperatura y demaacutes teniendo la certeza que las diferencias
encontradas solo se deberaacuten a los paraacutemetros bajo control
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 79
Cromwick y colaboradores (1994) reportaron el congelamiento con
nitroacutegeno liacutequido como una forma vaacutelida para la preservacioacuten de las ceacutelulas en
un estado consistente de alta productividad de γ-PGA En nuestro caso la
metodologiacutea empleada fue distinta Se incorporoacute el glicerol como crioprotector y
el congelamiento no se realizoacute mediante nitroacutegeno liacutequido sino que fue
congelamiento convencional utilizando un equipo de refrigeracioacuten con una
capacidad de enfriamiento de hasta -80 ordmC y voluacutemenes de inoacuteculo pequentildeos
de entre 1 y 2 mL cuyo congelamiento fuera particularmente raacutepido
Igualmente se observoacute que los cultivos que mejor comportamiento y
reproducibilidad dieron como inoacuteculo fueron aquellos cuyas ceacutelulas eran
recolectadas previo al inicio de la produccioacuten de γ-PGA Cultivos cuya edad
superaba las 10 horas y que ya presentaban presencia de γ-PGA aunque
podiacutean emplearse para la obtencioacuten de inoacuteculos madres los mismos no
resultaban tan eficientes como los anteriormente descritos
El empleo de esta metodologiacutea de conservacioacuten de la cepa permitioacute una
reproducibilidad del 100 en los ensayos obtenieacutendose poliacutemero en la
totalidad de los cultivos de control que se establecieron durante cada una de
las fermentaciones llevadas a cabo en el biorreactor Estos resultados indican
que dicha metodologiacutea es eficaz para la preservacioacuten a largo plazo de Bacillus
licheniformis ATCC9945a y como estrategia para un adecuado escalamiento
durante el proceso de produccioacuten a mayor escala De igual manera la
descripcioacuten detallada del proceso de conservacioacuten volumen de inoacuteculo
concentracioacuten de la muestra (por absorbancia) temperatura y demaacutes permite
una alta reproducibilidad del meacutetodo en contraposicioacuten con los reportes
existentes por otros autores que no brindaban mayor detalles sobre coacutemo llevar
a cabo este proceso de conservacioacuten
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten
Las fermentaciones a presiones superiores a la presioacuten atmosfeacuterica no
son habituales tanto a nivel de investigacioacuten como a nivel de proceso Dicha
afirmacioacuten queda particularmente ratificada cuando se analizan las opciones
comerciales existentes a escala laboratorio de biorreactores disentildeados para
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 80
operar a presioacuten la cual resulta praacutecticamente nula Por este motivo y para
poder llevar a cabo este estudio se requirioacute adaptar un reactor quiacutemico de
modo tal que permitiese trabajar a presioacuten y a la vez tuviese un control de
agitacioacuten y temperatura miacutenimo de modo tal que permitiese el cultivo de
microorganismos El biorreactor disentildeado fue exitoso pues permitiacutea un
crecimiento microbiano oacuteptimo y la produccioacuten de γ-PGA en un tiempo
relativamente corto de 18 horas
Las modificaciones realizadas en realidad fueron miacutenimas con respecto
a la estructura baacutesica del reactor quiacutemico convencional y con ellas se buscoacute
crear las condiciones que permitiesen incrementar la turbulencia en el sistema
de modo que existiese una mayor oxigenacioacuten y un mayor coeficiente
volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno (kLa) partiendo de antemano de la
hipoacutetesis inicial que sentildealaba al oxiacutegeno como uno de los componentes
limitantes de hecho el de mayor importancia para que este fermentacioacuten
ocurriese de la manera adecuada y con un alto rendimiento de γ-PGA
Se decidioacute emplear un reactor hecho de vidrio en lugar de uno metaacutelico
debido a que las condiciones de oxidacioacuten de la fermentacioacuten y la sensibilidad
de las enzimas involucradas a los iones metaacutelicos haciacutean deseable un material
inerte como sucede con el vidrio De igual manera al emplearse vidrio se tiene
una visioacuten del interior del fermentador las condiciones de agitacioacuten y formacioacuten
de burbujas son visibles asiacute como el crecimiento microbiano lo que permite un
mejor ajuste y correccioacuten de las condiciones de fermentacioacuten al menos durante
las etapas iniciales de investigacioacuten Para poder trabajar a mayores presiones
se hubiese requerido un reactor quiacutemico metaacutelico de un costo sumamente
elevado Los resultados experimentales demostraron que el rango de presioacuten
definido resultoacute ser el correcto para la investigacioacuten
La seleccioacuten de una turbina tipo Rushton radica en que este tipo de
agitador de pala plana se considera como el ideal para la realizacioacuten de
fermentaciones Dado que las paletas de heacutelices Rushton son planas y
colocadas verticalmente a lo largo del eje de agitacioacuten producen un flujo radial
unidireccional que permite una alta difusioacuten de un gas en un liacutequido por lo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 81
comuacuten son utilizadas en la fermentacioacuten de liacuteneas celulares que requieren altas
tasas de oxiacutegeno tales como las levaduras bacterias y algunos hongos
Las laacuteminas deflectoras fueron incorporadas pues aunque a velocidades
muy bajas un agitador de paletas produce una agitacioacuten suave inclusive en un
tanque sin laacuteminas deflectoras cuando son necesarias velocidades elevadas
se requiere la incorporacioacuten de dichas laacuteminas para aumentar la turbulencia de
lo contrario el liacutequido se mueve como un remolino que gira alrededor del
tanque con velocidad elevada pero con poco efecto de mezcla
74 Tiempo de fermentacioacuten
El tiempo de fermentacioacuten empleado en esta investigacioacuten es
significativamente inferior al empleado por otros autores que hablan de un
promedio de 72 horas Es importante sentildealar que 18 horas es el tiempo
suficiente para que el pH del medio de cultivo descienda a cerca de 60
Valores de pH inferiores a este han demostrado ser perjudiciales pues decae
el consumo de aacutecido ciacutetrico se detiene en gran medida la polimerizacioacuten del γ-
PGA y la concentracioacuten tiende a disminuir con el paso del tiempo
Para poder aumentar el periacuteodo de fermentacioacuten se requeririacutea un
sistema de ajuste de pH que opere bajo condiciones del presioacuten mismo que no
se tuvo disponible Es probable que si se prolongara el tiempo de fermentacioacuten
dentro del biorreactor los rendimientos al cabo de 48 o 72 horas seriacutean un
poco mayores siempre y cuando se ajuste el pH en el valor de 65 como
recomiendan Cromwick y colaboradores (1995)
En nuestro caso el incremento del tiempo de fermentacioacuten sin
regulacioacuten del pH de 18 horas a 36 horas mostroacute un incremento miacutenimo en la
productividad (de 025 gL) pero si un cambio en la composicioacuten del γ-PGA
pues el pico de elucioacuten del poliacutemero se desplazoacute levemente hacia un valor de
tiempo mayor lo que podriacutea indicar una degradacioacuten parcial del poliacutemero
inicialmente producido Dichos datos se presentan en la figura 12
Nuestros resultados contradicen lo sentildealado por otros autores quienes
obtienen los mayores rendimientos entre las 48 y 96 horas Birrer y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 82
colaboradores (1995) observaron que Bacillus licheniformis ATCC9945a
alcanza la fase estacionaria a las 24 horas tiempo en el cual muy poco γ-PGA
ha sido formado y por consiguiente la mayor formacioacuten de γ-PGA acontece
entre las 24 y las 96 horas Estos resultados coinciden con los reportados por
Troy (1973) pero difieren a los observados por Goto y Kunioka (1992) con
Bacillus subtilis IFO3335 donde el mayor rendimiento se obtuvo desde las 24 y
hasta las 40 horas Estas diferencias podriacutean deberse a aspectos maacutes
relacionados con los voluacutemenes de fermentacioacuten empleados Por ejemplo para
el caso de Yoon y colaboradores (2000) estos alcanzaron rendimientos de 35
gL con un periacuteodo de fermentacioacuten maacuteximo de 35 horas indicando un
agotamiento del aacutecido ciacutetrico a las 20 horas en su caso el volumen empleado
fue de 1 litro de medio de cultivo
Figura 12 Cromatograma a las 18 (a) y 36 (b) horas de fermentacioacuten con Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 83
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento
Un punto vital para una adecuada fermentacioacuten es la concentracioacuten de
inoacuteculo aspecto que es sentildealado por Troy Cromwick y colaboradores a lo
largo de sus investigaciones pero que no detallan ni cuantifican
adecuadamente o al menos no lo reportan En nuestro caso se empleoacute un
inoacuteculo madre con una absorbancia de 25 o mayor y un inoacuteculo del reactor con
un valor de absorbancia de 120 aproximadamente con el propoacutesito de asiacute
logran estandarizar las condiciones de inoacuteculo Aunque este aspecto no fue
cuantificado a manera cualitativa si se observoacute un importante efecto de este
aspecto (concentracioacuten inicial) sobre la cantidad de γ-PGA obtenido y el tiempo
requerido Esto puede resultarnos obvio teniendo en cuenta una descripcioacuten no
estructurada del crecimiento microbiano pero podriacutea resultar maacutes compleja de
analizar si consideramos que la produccioacuten del γ-PGA estaacute afectada por
paraacutemetros de otra naturaleza maacutes allaacute de la disposicioacuten de nutrientes como
por ejemplo de una estructura celular particular o una relacioacuten de percepcioacuten
de quoacuterum dada Debemos recordar que la percepcioacuten de quoacuterum es un
mecanismo de regulacioacuten de la expresioacuten geneacutetica en respuesta a la densidad
de poblacioacuten celular Las ceacutelulas involucradas producen y excretan sustancias
llamadas autoinductores que sirven de sentildeal quiacutemica para inducir la expresioacuten
geneacutetica colectiva De Vizio (2011) sentildeala que en Bacillus licheniformis NCIMB
8874 la produccioacuten de lichenysin γ-PGA y algunas proteasas extracelulares
estaacute vinculado con los genes comQXPA mismo operoacuten que regula la
percepcioacuten de quoacuterum en Bacillus subtilis
De igual manera la relacioacuten de escalamiento aplicada fue de 16
ligeramente inferior a la que teoacutericamente se utiliza con mayor frecuencia de
110 Aunque este iacutendice no fue objeto de estudio su ajuste tambieacuten afecta de
manera directa los rendimientos obtenidos
La optimizacioacuten de la concentracioacuten del inoacuteculo la relacioacuten de
escalamiento y su frecuencia constituyen aspectos que deben estudiarse con
mayor profundidad para su propia optimizacioacuten pues su efecto sobre esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 84
fermentacioacuten y su rendimiento es bastante significativo Esta afirmacioacuten
adquiere validez cuando vemos que la produccioacuten del γ-PGA no es un
metabolito primario que se forme durante la fase de crecimiento exponencial
sino maacutes bien al inicio de la etapa estacionaria como indica Goto y Kunioka
(antildeo) o durante toda la etapa estacionaria tal y como lo sentildealan tanto Troy
(antildeo) como Birrer y colaboradores (1994) A esto debemos agregarle tambieacuten
lo anteriormente sentildealado referente a la concentracioacuten idoacutenea que produce la
percepcioacuten de quoacuterum responsable de direccionar el metabolismo de la
comunidad microbiana hacia la siacutentesis del γ-PGA
Conociendo la dependencia de esta biosiacutentesis de la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio y partiendo del hecho de que al inicio de la fase
estacionaria la concentracioacuten celular seraacute lo suficientemente alta para poner el
riesgo el mantenimiento de las condiciones aeroacutebicas en el biorreactor pero lo
justa para una adecuada siacutentesis del γ-PGA un inoacuteculo con una alta
concentracioacuten inicial de ceacutelulas podriacutea ayudar a obtener un mayor rendimiento
en un tiempo de fermentacioacuten menor o producir la respuesta de percepcioacuten de
quoacuterum (generalmente se trata de la liberacioacuten de un polipeacuteptido sentildeal) en un
tiempo menor con la consiguiente produccioacuten del γ-PGA
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa es un valor de
suma importancia para el escalamiento de bioprocesos en particular cuando
nos referimos a fermentaciones aeroacutebicas o cultivos de organismos o ceacutelulas
en condiciones de metabolismo aeroacutebico En nuestro caso un adecuado
coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno es garantiacutea que las
condiciones aeroacutebicas se sostendraacuten a lo largo del proceso de fermentacioacuten de
modo que no se produzcan desviacuteos metaboacutelicos indeseados o en el peor de
los casos el inicio del metabolismo anaerobio y la consecuente produccioacuten de
aacutecido aceacutetico
Los valores de kla obtenidos fueron de 0026 s-1 y 0025 s-1 para el
matraz y el bioreactor respectivamente Dichos valores por si mismos nos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 85
indican poco si no determinamos la tasa de consumo de oxiacutegeno requerida
para el cultivo aeroacutebico de Bacillus licheniformis Doran (1995) reporta una
velocidad de consumo de oxiacutegeno m02 para el cultivo aeroacutebico de Bacillus
licheniformis de 231 x 10-5 gO2 g-1cel s
-1 si la concentracioacuten de ceacutelulas X en el
reactor es de 20 gL (determinado experimentalmente como el valor final
alcanzado en matraces con alta concentracioacuten de γ-PGA) la tasa de consumo
de oxiacutegeno (OUR) MO2 seraacute igual a Xm02 es decir 46 x 10-4 mgO2mL-1s-1 A
partir de estos datos y conociendo que kla = MO2ΔcA ΔcA = cA ndash cA sabiendo
que presioacuten atmosfeacuterica cA = 801 mgL a 30 ordmC y el valor cA en el biorreactor
a 30 ordmC es 74 mgL obtenemos un valor de kla del orden de 0062 s-1 Dicho
valor corresponde al valor teoacuterico que seriacutea necesario para mantener el cultivo
con el suministro adecuado y suficiente de oxiacutegeno y que como puede verse
es 25 veces mayor al kla real lo que indica que cuando el cultivo alcance la
maacutexima concentracioacuten celular de 20 gL las condiciones del cultivo no seraacuten
suficientes para un metabolismo cien por ciento aeroacutebico
Tiene sentido entonces que los rendimientos alcanzados en matraz sean
significativamente mayores que los mejores rendimientos obtenidos en
bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica Dado que el cultivo en matraz incorporaba
uacutenicamente 100 mL de medio de cultivo el microorganismo es capaz de
alcanzar una mayor concentracioacuten en una menor unidad de tiempo lo que le
permite alcanzar una mayor concentracioacuten de poliacutemero durante las 26 horas de
cultivo (8 iniciales + 18)
Por su parte para el caso del biorreactor el crecimiento oacuteptimo
probablemente demore maacutes en alcanzarse por lo cual el tiempo que transcurre
entre el alcance de la concentracioacuten limitante de 8 gL (concentracioacuten a la cual
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y la tasa de consumo de oxiacutegeno
(OUR) se igualan) y la concentracioacuten oacuteptima es lo suficiente como para afectar
los rendimientos de γ-PGA Esto resulta evidente al comparar los resultados de
matraz con los de bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica (0 bar relativos) donde la
diferencia en productividad entre ambos es de 43 gL de γ-PGA Dicha
diferencia se explica porque mientras que la concentracioacuten del inoacuteculo madre
mostraba una absorbancia promedio de 25 la del inoacuteculo empleado para el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 86
biorreactor era de 120 (100 ml de medio + inoacuteculo madre creciendo durante 8
horas) es decir praacutecticamente la mitad por lo cual la concentracioacuten inicial de
ceacutelulas era significativamente menor para el biorreactor en comparacioacuten con el
matraz
77 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En condiciones estaacuteticas el contenido de γ-PGAdemostroacute reducir
considerablemente la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
pasando de 74 mgL a 440 mgL a una concentracioacuten del 20 en γ-PGA
Este fenoacutemeno puede deberse al incremento de la viscosidad por la
presencia del poliacutemero en el caldo de cultivo Dicha apreciacioacuten seguramente
afecta de manera negativa la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) pues
reduce tanto cA como cA sin embargo la determinacioacuten del valor de c
A de una
solucioacuten compuesta por sales γ-PGA y productos del metabolismo microbiano
es imposible de determinar teoacutericamente con certeza como para poder
cuantificar la magnitud de reduccioacuten de la OTR numeacutericamente De igual
manera el valor de kLa tambieacuten se ve afectado pues es sabido que a mayor
viscosidad mayor resistencia a la transferencia lo que reduce el valor de este
coeficiente
Asiacute mismo esta reduccioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
podriacutea deberse en parte a la naturaleza anioacutenica del poliacutemero y no solamente
al incremento de la viscosidad La solubilidad se ve afectada por la fuerza
ioacutenica por lo cual una solucioacuten con una concentracioacuten elevada de un poliacutemero
polianioacutenico como el γ-PGA probablemente muestre una importante reduccioacuten
en la solubilidad maacutexima (concentracioacuten de saturacioacuten) del oxiacutegeno en la
misma(Schumpe et al 1978)
Queda claro que dada esta reduccioacuten en la solubilidad de oxiacutegeno al
incrementar el contenido de γ-PGA durante la fermentacioacuten ya sea por la
naturaleza viscosa del biopoliacutemero o por su caraacutecter polianioacutenico la tasa de
transferencia de oxiacutegeno inicial y el valor de kLa se van reduciendo a lo largo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 87
del tiempo lo que dificulta auacuten maacutes garantizar las condiciones de oxigenacioacuten
oacuteptimas para este bioproceso Esto lo podemos explicar pues si tenemos que
OTR = kLa(cA-cA)
dado que al aumentar el contenido de γ-PGA ocurre una reduccioacuten en el valor
de kLa por accioacuten del incremento de la viscosidad (hecho que es
completamente cierto) y al aumentar la concentracioacuten de γ-PGA tambieacuten se
reduce tanto el valor de cA como el de cA (ya sea por efecto de la viscosidad o
de la naturaleza anioacutenico del poliacutemero) la OTR ve su magnitud evidente e
inevitablemente reducida dado que la misma es una relacioacuten de producto entre
ambos factores kLa y (cA ndashcA) Esto podriacutea explicar porque a voluacutemenes de
cultivo de 600 mL (en biorreactor) los rendimientos son mucho menores que en
voluacutemenes de cultivo de 100 ml (matraz) pues probablemente esta caiacuteda en la
OTR sea maacutes acentuada y criacutetica para los microorganismos cuando sucede a
voluacutemenes mayores donde mantener las condiciones de mezcla perfecta y una
alta concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto resultan maacutes dificultosas por lo que el
microorganismo es incapaz de crecer y alcanzar la concentracioacuten idoacutenea para
una maacutexima produccioacuten
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γshyPGA
La concentracioacuten de γ-PGA alcanzada al final de las 18 horas de
fermentacioacuten se vio afectada por la presioacuten Asiacute hasta los 103 bar a mayor
presioacuten mayor concentracioacuten de γ-PGA por encima de este valor de presioacuten la
concentracioacuten de γ-PGA disminuye
Esto puede explicarse por dos factores 1) el efecto de la presioacuten sobre
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y 2) impacto sobre la integridad y
viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γ-PGA
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR
La OTR se ve afectada tanto por el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de oxiacutegeno kLa asiacute como por la diferencia entre la concentracioacuten
de saturacioacuten y la concentracioacuten real en la fase liacutequida (cA-cA) El coeficiente kL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 88
es empiacuterico y su valor depende principalmente de factores tales como la
hidrodinaacutemica del sistema la turbulencia y su geometriacutea
Teoacutericamente kL se puede definir como kL = DABδ donde DAB es la
difusividad de A en B y δ es el espesor de la peliacutecula estancada seguacuten la
teoriacutea de peliacutecula para la transferencia de materia La difusividad en liacutequidos
depende en gran medida de la temperatura (afecta el coeficiente de difusioacuten) y
la concentracioacuten de solutos pero muy poco de la presioacuten (Diacuteaz 2011) En
nuestro caso podriacuteamos suponer que la presioacuten tiene poco efecto sobre kLa
pues tampoco es de esperar un cambio producto de la presioacuten en el aacuterea de
burbujas (a) producida por la agitacioacuten mecaacutenica auacuten maacutes cuando vemos el
hecho de que los ensayos llevados a cabo no contaron con un sistema de
aireacioacuten o burbujeo especiacutefico salvo aquel llevado a presioacuten atmosfeacuterica (0
bar relativa) y debidamente identificado como Aireacioacuten
Asiacute entonces tenemos en el segundo componente de la foacutermula la
diferencia (cA-cA) un punto de particular intereacutes pues efectivamente la
concentracioacuten de saturacioacuten y la concentracioacuten real variacutean con la presioacuten A
pesar de carecer de una sonda de oxiacutegeno disuelto directamente incorporada
al biorreactor y capaz de operar a presioacuten se determinoacute mediante transferencia
(con el sistema cerrado) la concentracioacuten real de oxiacutegeno en el medio de
cultivo a distintas presiones Tales concentraciones y las concentraciones de
saturacioacuten a cada presioacuten se presentan en el graacutefico 14
Para determinar el valor de las distintas concentraciones de saturacioacuten
al trabajar a presiones distintas a la atmosfeacuterica se realizoacute la siguiente
correccioacuten (Montoya amp Bermuacutedez 2003) para el valor de la solubilidad del
oxiacutegeno en agua
Ley de Henry
a 1 atm
Para una presioacuten P distinta a 1 atm tenemos que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 89
en mgL
Donde
C(S) = valor de solubilidad a 1 atm (mgL)
P = presioacuten de operacioacuten (atm)
T = temperatura de operacioacuten (K)
Graacutefico 14 Concentraciones de oxiacutegeno de saturacioacuten y en fas liacutequida a diferentes presiones
en medio de cultivo E sin crecimiento bacteriano
80
153
227
324
422
6681
141154
178
141
724857
1703
2438
y = 48525x + 68875
y = 14191x + 80039
y = 93382x + 11163
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
00
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 05 1 15 2 25 3
Concentracioacuten
Presioacuten (bar)
CONCENTRACIOacuteN DE SATURACIOacuteN CONCENTRACIOacuteN EN FASE LIacuteQUIDA DIFERENCIA
Aunque estos valores deben repetirse con una sonda de oxiacutegeno
disuelto interna (dentro del biorreactor) y bajo una metodologiacutea maacutes pertinente
preliminarmente puede observarse que la diferencia (cA-cA) aumenta al
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 90
aumentar la presioacuten y dado que OTR = kLa(cA-cA) al aumentar dicha
diferencia la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deberiacutea ser mayor Este
incremento de la OTR podriacutea explicar el porqueacute del raacutepido crecimiento
microbiano y la produccioacuten precoz de γ-PGA despueacutes de 18 horas de cultivo
en comparacioacuten con las entre 48 y 96 horas reportadas por otros autores asiacute
como el aumento del rendimiento al aumentar la presioacuten de los 0 bar relativos
(a presioacuten atmosfeacuterica) hasta los 103 bar relativos
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γshyPGA
Al superar los 103 bar relativos el rendimiento en γ-PGA decae
nuevamente Si consideramos un efecto positivo de la presioacuten sobre la OTR
como sentildealamos anteriormente esto no deberiacutea ocurrir Sin embargo al
someter las ceacutelulas a condiciones de presioacuten desconocemos el efecto que
dicha presioacuten puede ejercer sobre los microorganismos y sus rutas
metaboacutelicas asiacute como sobre la estructura de algunas biomoleacuteculas como por
ejemplo proteiacutenas
Meersman y Heremans (2008) sentildealan que el efecto de la presioacuten sobre
el crecimiento de los microorganismos puede explicarse por tres efectos
principales 1) Variaciones en el plegamiento y agregacioacuten de las proteiacutenas 2)
Variaciones en el estado de la membrana celular y 3) Variaciones en el
contenido de proteiacutenas asociadas a la membrana celular Estos aspectos son
de peculiar consideracioacuten pues la γ-PGA sintetasa es un complejo enzimaacutetico
formado por al menos tres unidades enzimaacuteticas distintas y que se encuentra
asociado a la membrana celular de Bacillus licheniformis
En lo referente a las proteiacutenas se sabe que su desnaturalizacioacuten se
produce por efecto de una reduccioacuten en su volumen producto de un cambio
configuracional probablemente de la estructura terciaria Asiacute tenemos que si el
volumen inicial de una proteiacutena viene dado por Vi = Vatomos + Vcavidades +
Vhidratacioacuten si en condiciones de presioacuten ocurre un cambio en el volumen de la
proteiacutena tal que ΔV = ΔVcavidades + ΔΔVhidratacioacuten(el volumen de los aacutetomos no
tiene por queacute variar con la presioacuten) la exposicioacuten de los grupos cargados o
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 91
hidrofoacutebicos de la proteiacutena al agua pueden conllevar a un cambio en la
estructura secundaria y terciaria de modo que la actividad de la proteiacutena se
vea perjudicada parcial o totalmente Esto se debe a que un aumento en la
presioacuten rompe las interacciones hidrofoacutebicas donde las interacciones proteiacutena-
proteiacutena son sustituidas por interacciones proteiacutena-agua particularmente
mediante puente de hidroacutegeno El incremento de la presioacuten podriacutea afectar la
conformacioacuten de alguno o algunos de los componentes del complejo
enzimaacutetico γ-PGA sintetasa lo que sin duda alguna se traduciriacutea en un menor
rendimiento en γ-PGA durante la fermentacioacuten Este posible efecto negativo de
la presioacuten sobre una de las enzimas involucradas en el proceso de biosiacutentesis
del γ-PGA se reafirma cuando vemos como variacutea la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA al aumentar la presioacuten aspecto que se discutiraacute con mayor detalle
maacutes adelante De hecho Ashiuchi y colaboradores (2004) sentildealan que el
complejo enzimaacutetico PgsBCA (γ-PGA sintetasa) es imposible de aislar en su
estado activo debido precisamente a su alta inestabilidad y elevada
hidrofobicidad
Por su parte la membrana celular al tratarse de una bicapa fosfolipiacutedica
es susceptible a sufrir cambios de fase producto de la temperatura o la presioacuten
como por ejemplo la transicioacuten gel-liacutequido El incremento de la presioacuten al igual
que sucede con la temperatura concede mayor fluidez a las bicapas lipiacutedicas
Asiacute en nuestro caso un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea permitir
una mayor difusioacuten de oxiacutegeno al interior celular lo que podriacutea afectar el
crecimiento bacteriano si por ejemplo se formase maacutes especies reactivas
toacutexicas de oxiacutegeno en el interior celular o si cierta maquinaria celular como la
misma γ-PGA sintetasa no fuese capaz de acoplarse adecuadamente en una
membrana con mayor fluidez
En lo referente a la interaccioacuten membrana celular-proteiacutenas es
importante destacar que entre el 20 y el 40 de las proteiacutenas de una ceacutelula
bacteriana suelen estar asociadas a esta estructura Como indicamos
anteriormente un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea afectar el
contenido concentracioacuten y capacidad de anclaje de las proteiacutenas a la
membrana celular El complejo enzimaacutetico γ-PGA sintetasa al tratarse de una
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 92
proteiacutena de membrana podriacutea no acoplarse de manera efectiva a la membrana
celular modificada bajo condiciones de presioacuten o ser liberada al medio de
cultivo lo que afectariacutea negativamente la produccioacuten de γ-PGA Estas
suposiciones podriacutean explicar el porqueacute de la gran cantidad de espuma
generada durante algunas fermentaciones a presioacuten (concretamente en
aquellas a una presioacuten superior a los 103 bar) a pesar de su menor
concentracioacuten de γ-PGA y teniendo presente que en las fermentaciones
microbianas la espuma suele estar constituida mayoritariamente por proteiacutenas
la presioacuten podriacutea estar favoreciendo la liberacioacuten de estas proteiacutenas al caldo de
cultivo y la consecuente formacioacuten abundante de espuma Este fenoacutemeno ya
ha sido reportado en otros microorganismos como Salmonella enterica donde
el tratamiento con presioacuten conllevaba a la peacuterdida de gran parte de sus
proteiacutenas de membrana y su consecuente liberacioacuten al medio de cultivo
(Meersman amp Heremans 2008) Esto se ve respaldado con las observaciones
de Ashiuchi y colaboradores (2004) quienes adicionaron detergentes como el
Tween20 y Triton X-114 (que modifican la estabilidad de la membrana celular y
favorece la liberacioacuten de las proteiacutenas asociadas a ella) a cultivos de Bacillus
spp productores de γ-PGA Ellos observaron una peacuterdida total de la capacidad
de siacutentesis del γ-PGA capacidad que no se recuperaba ni siquiera removiendo
la totalidad de dichos detergentes mediante diaacutelisis con lo cual concluyeron
que es indispensable que el complejo γ-PGA sintetasa se encuentre asociado a
la membrana celular para ser bioloacutegicamente activo
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γshyPGA
Un incremento de la intensidad de agitacioacuten afectariacutea positivamente el
valor de kLa incrementaacutendolo al aumentar el aacuterea de intercambio mediante una
mayor ruptura de las burbujas lo que aumenta el aacuterea de intercambio por
unidad de volumen Sin embargo existen liacutemites para la velocidad de agitacioacuten
esto debido al dantildeo ocasionado a los organismos debido a un esfuerzo
cortante excesivo A pesar de que la turbina Rushton es el impulsor de flujo
axial maacutes recomendado y maacutes eficiente para generar una mezcla perfecta de
alto perfil hidrodinaacutemico un bajo esfuerzo cortante y una alta distribucioacuten un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 93
exceso de agitacioacuten bajo condiciones de presioacuten es evidentemente perjudicial
Es probable que al aplicar presioacuten positiva sobre el cultivo la membrana celular
se encuentre en un estado de fluidez mayor al que presentariacutea a presioacuten
atmosfeacuterica asiacute mismo la presencia de glicerol en el medio de cultivo modifica
la composicioacuten lipiacutedica de la membrana favoreciendo la salida del γ-PGA al
exterior celular al aumentar de igual manera su fluidez Esto queda demostrado
por nuestros resultados a velocidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm
donde ocurre una reduccioacuten de la productividad conforme se aumenta la
agitacioacuten De igual manera la excesiva formacioacuten de espuma que se genera a
intensidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm podriacutea indicar la ruptura celular
y la liberacioacuten de componentes celulares y macromoleacuteculas al caldo de
fermentacioacuten Estas observaciones contradicen lo reportado por otros autores
(Yoon et al 2000) quienes indican velocidades de agitacioacuten oacuteptimas de hasta
1000 rpm a presioacuten atmosfeacuterica para un biorreactor de 24 L y un volumen
efectivo de cultivo de 1 L aunque no se brindan mayor detalle en lo referente al
tipo de turbina empleada
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
El cambio de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producto de la
presioacuten fue un resultado inesperado pues tradicionalmente se habiacutea sentildealado
a la concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo como el principal
responsable de controlar este aspecto Es importante destacar el hecho que
dicho cambio en la composicioacuten no es parcial o escalonado sino que por el
contrario el hecho de aplicar presioacuten durante la fermentacioacuten invierte
praacutecticamente los contenidos de aacutecido D-glutaacutemico y aacutecido L-glutamico de 87
y 13 respectivamente a presioacuten atmosfeacuterica (cultivo en matraz) a 17 y 83
respectivamente a una presioacuten relativa de 103 bar En algunos casos el
contenido de aacutecido D-glutaacutemico fue praacutecticamente 0
Efectivamente se sabe que el complejo γ-PGA sintetasa es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico aunque todaviacutea se
desconoce la arquitectura bioloacutegica de esta sintetasa Igualmente se sabe que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 94
es el componente PgsB el mayormente responsable de la cataacutelisis enzimaacutetica
(reaccioacuten de elongacioacuten del γ-PGA) (Ashiuchi 2010) Una hipoacutetesis que podriacutea
explicar estos resultados es que bajo presioacuten la estructura de esta proteiacutena se
modifique parcialmente (tanto la estructura de la proteiacutena propiamente dicha
como la estructura en funcioacuten de su anclaje a la membrana celular) lo
suficiente como para reducir su afinidad por el aacutecido D-glutaacutemico pero sin
afectar su afinidad por el aacutecido L-glutaacutemico ni conllevar a una
desnaturalizacioacuten de la proteiacutena y la consiguiente peacuterdida total de la actividad
enzimaacutetica Dado que es poco lo que se conoce de la estructura y mecanismo
de accioacuten de esta proteiacutena PgsB es imposible poder determinar con mayor
detalle el coacutemo pueden darse este cambio en la proteiacutena aunque casos
similares se observan durante la desnaturalizacioacuten de proteiacutenas por
temperatura donde las enzimas que operan sobre muacuteltiples sustratos no
pierden su capacidad enzimaacutetica de manera total sobre todos ellos sino que
inicialmente acontece una peacuterdida de afinidad diferenciada seguacuten el sustrato
hasta llegar al punto de desnaturalizacioacuten total donde se pierde toda actividad
enzimaacutetica para todos los sustratos
De igual manera es conocido que existe en Bacillus licheniformis una
enzima racemasa de naturaleza citosoacutelica responsable de transformar el aacutecido
L-glutaacutemico en aacutecido D-glutaacutemico podriacutea entonces tambieacuten asumirse alguacuten
efecto de la presioacuten sobre la actividad de la misma Sin embargo el hecho de
que esta enzima no esteacute asociada a una membrana celular (las proteiacutenas
asociadas a membrana celular tienden a ser maacutes vulnerables a los cambios de
presioacuten por la complejidad e indispensabilidad de su estructura terciaria sobre
su funcioacuten y su anclaje) sea una enzima de un uacutenico dominio y a que
experimentalmente el contenido de aacutecido D-glutaacutemico inclusive a la maacutexima
presioacuten (241 bar) no es cero hacen suponer que la misma se encuentra
bioloacutegicamente activa bajo las condiciones de presioacuten evaluadas
Estos resultados son de suma importancia pues para aplicaciones
biomeacutedicas y farmaceacuteuticas es necesario que el γ-PGA presente un alto
contenido en aacutecido L-glutaacutemico isoacutemero que es reconocido por el organismo
humano El efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre esta composicioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 95
enantiomeacuterica constituye un descubrimiento que pueda facilitar el empleo del γ-
PGA en medicina y que puede ser clave en el disentildeo de un proceso productivo
optimizado para tal fin
711 Peso molecular del γshyPGA En lo correspondiente al peso molecular del γ-PGA se observa que el
tamantildeo del poliacutemero es grande aunque no se observa ninguna tendencia en
los datos que pueda suponer alguacuten efecto de la presioacuten sobre el peso
molecular del poliacutemero Es importante sentildealar que la columna cromatograacutefica
empleada es incapaz de resolver moleacuteculas del alto peso molecular por lo
cual aunque si bien los resultados obtenidos resulten uacutetiles a nivel
comparativo dichos resultados deben tomarse con precaucioacuten Para un mejor
anaacutelisis seriacutea necesario emplear una columna capaz de resolver altos pesos
moleculares
Es importa sentildealar ademaacutes que tal y como se comentoacute anteriormente y
como se muestra en la figura 12 se observa una reduccioacuten del peso molecular
al prolongar el tiempo de fermentacioacuten hasta las 36 horas Para el caso del
reactor AHCJ32 al prolongar el tiempo de fermentacioacuten por 18 horas maacutes se
nota una reduccioacuten en la fraccioacuten de mayor peso molecular y un incremento en
la de menor sin que haya un cambio importante en el rendimiento global Esto
podriacutea deberse a que Bacillus licheniformis ATCC9945a posee enzimas
capaces de hidrolizar el γ-PGA y emplearlo como fuente de carbono Asiacute
mismo dicha observacioacuten sentildeala que si es necesario prolongar el tiempo de
fermentacioacuten es requerido realizar ajustes pues parece ser que la prolongacioacuten
por siacute misma uacutenicamente no es garantiacutea de una mejora en el rendimiento del
proceso fermentativo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 96
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 97
10 CONCLUSIONES
De la elaboracioacuten de la presente investigacioacuten se pueden extraer las
siguientes conclusiones principales
1) El rendimiento promedio en γ-PGA para el cultivo en matraz fue
superior a los 45 gL Dicho rendimiento es el mayor que se haya
reportado hasta la fecha para Bacillus licheniformis ATCC9945a lo
que convierte a esta cepa en una de las que mejor rendimiento
maacuteximo reporta para la biosiacutentesis de dicho poliacutemero natural
2) Un mecanismo eficiente para la conservacioacuten de cultivos de Bacillus
licheniformis ATCC9945a en un estado competente de produccioacuten
de γ-PGA es el congelamiento de ceacutelulas vegetativas a una
temperatura de -80 ordmC Es importante que la absorbancia de las
muestras congeladas sea superior a 25 lo que garantiza una alta
concentracioacuten de ceacutelulas
3) Dada la naturaleza del γ-PGA y su viscosidad el aumento de su
concentracioacuten en el caldo de cultivo a lo largo del tiempo de
fermentacioacuten afecta de manera negativa la tasa de transferencia de
oxiacutegeno disminuyeacutendola paulatinamente El cambio a condiciones
anaeroacutebicas conlleva a la detencioacuten de la biosiacutentesis del γ-PGA y el
consecuente inicio de un metabolismo netamente anaeroacutebico
4) Bacillus licheniformis ATCC9945a es capaz de crecer eficientemente
a presiones de hasta 242 bar relativos no vieacutendose afectado desde
el punto de vista de viabilidad por el incremento de la variable
presioacuten de fermentacioacuten
5) La presioacuten de fermentacioacuten afecta de manera significativa la
productividad de Bacillus licheniformis ATCC9945a en γ-PGA
6) El incremento de la presioacuten de fermentacioacuten hasta los 103 bar
relativos aumenta la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo de cultivo
seis veces (de 218 gL a 1334 gL) en comparacioacuten a los
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 98
rendimientos obtenidos a presioacuten atmosfeacuterica para un periacuteodo de
proceso de 18 horas
7) A presiones de fermentacioacuten superiores a los 103 bar la
productividad decae en comparacioacuten a la obtenida a dicha presioacuten
sin embargo la misma sigue siendo superior a la obtenida a presioacuten
atmosfeacuterica para un periacuteodo de proceso de 18 horas
8) El aumento de la presioacuten probablemente incremente la tasa de
transferencia de oxiacutegeno al incrementar la concentracioacuten de
saturacioacuten del mismo en el medio de cultivo lo que genera un
gradiente de concentracioacuten que permite una mayor transferencia
9) Presiones superiores a 103 bar probablemente afecten estructuras
celulares o biomoleacuteculas tales como las membranas celulares y las
proteiacutenas (γ-PGA sintasa) lo que tiene un efecto perjudicial sobre la
biosiacutentesis de γ-PGA
10) A una temperatura de 30 ordmC y a una presioacuten de 103 bar la
intensidad de agitacioacuten oacuteptima es de 300 rpm Una magnitud de
agitacioacuten mayor produce el dantildeo celular posiblemente por un exceso
de tensioacuten cortante
11) La presioacuten de fermentacioacuten modifica la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA A presioacuten atmosfeacuterica el γ-PGA estaacute compuesto
mayoritariamente por aacutecido D-glutaacutemico A presiones entre 052 y
242 bar dicha composicioacuten se revierte siendo el aacutecido L-glutaacutemico
el isoacutemero maacutes comuacutenmente presente en el γ-PGA
12) La biosiacutentesis de γ-PGA a presioacuten constituye una forma eficiente de
producir un biopoliacutemero mayoritariamente conformado por residuos
de aacutecido L-glutaacutemico aspecto de vital importancia para su aplicacioacuten
biomeacutedica dado que es este isoacutemero del aacutecido glutaacutemico es que es
reconocido y asimilado por el organismo humano
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 99
13) Aunque la modificacioacuten de la presioacuten de fermentacioacuten nunca ha sido
una variable importante en el estudio de los rendimientos para
distintos bioprocesos la presente investigacioacuten demuestra que la
modificacioacuten de dicha variable no soacutelo permite mejorar el
rendimiento global del proceso sino que tambieacuten puede conllevar a
la modificacioacuten del producto final lo que significariacutea una nueva rama
para la investigacioacuten en el disentildeo de bioprocesos de intereacutes
industrial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 100
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 101
11 AGRADECIMIENTOS
Un agradecimiento especial al profesor Jordi Bou por brindarme la
oportunidad de trabajar a su lado en este proyecto por el seguimiento y
asesoriacutea brindada a lo largo del mismo que nos permitioacute alcanzar nuestros
planteamientos y objetivos Espero que los aportes brindados con la presente
investigacioacuten permitan un mejor desarrollo en el futuro de estas temaacuteticas tan
novedosas biopoliacutemeros y fermentaciones bajo condiciones de presioacuten
positiva
Igualmente a la Ing Alejandra Hernaacutendez por la colaboracioacuten y asistencia
brindada durante esta investigacioacuten fue un apoyo importante durante el
desarrollo de las metodologiacuteas y distintas pruebas que se requirieron a lo largo
de esta investigacioacuten
A la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el Desarrollo
(AECID) y a Casa Ameacuterica Cataluntildea que me brindaron la oportunidad de cursar
este programa de maacutester a traveacutes de su programa de extensioacuten de becas a
ciudadanos extranjeros ha sido una oportunidad de crecimiento personal y
profesional que alcanza su punto maacuteximo con la elaboracioacuten de la presente
investigacioacuten El conocimiento adquirido sin duda alguna seraacute un valioso
compantildeero en mi desempentildeo profesional futuro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 102
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 103
12 BIBLIOGRAFIacuteA Ashiuchi M (2010) Occurrence and biosynthetic mechanism of poly-γ-
glutamic acidIn Microbiol Monogr (Amino-Acid Homopolymers Occurring in Nature)Vol 15 Hamano Y (ed) Heidelberg Germany Springer-Verlag pp 77ndash94
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Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 5
2 IacuteNDICE
1 RESUMEN 3
2 IacuteNDICE 5
3 GLOSARIO 9
4 PREFACIO 11
21 Origen del proyecto 11
22 Motivacioacuten 11
5 INTRODUCCIOacuteN 13
31 Objetivos 14
6 MARCO TEOacuteRICO 15
41 Los poliaminoaacutecidos 15
42 El aacutecido γ‐poliglutaacutemico (γ‐PGA) 15
421 Propiedades quiacutemicas y bioquiacutemicas del γ‐PGA 16
422 Siacutentesis microbioloacutegica de γ‐PGA 18
423 Produccioacuten fermentativa de γ‐PGA 22
424 Produccioacuten de γ‐PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a 24
425 Purificacioacuten del γ‐PGA 31
426 Control del peso molecular y degradacioacuten del γ‐PGA 32
427 Aplicaciones del γ‐PGA 33
43 Disentildeo de procesos biotecnoloacutegicos y la transferencia de materia gas‐liquido 38
431 La transferencia de materia gas‐liacutequido 39
432 La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) 40
433 Descripcioacuten de la transferencia maacutesica con kLa 40
44 Fermentaciones a presioacuten 42
7 MATERIALES Y METODOLOGIacuteA 45
51 Informacioacuten de la cepa empleada 45
52 Medio de cultivo empleado 45
53 Preparacioacuten de los inoacuteculos madre 46
531 Conservacioacuten de la cepa en estado productivo 46
54 Montaje del biorreactor a presioacuten 46
55 Condiciones de fermentacioacuten 50
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 6
551 Escalamiento 50
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre 51
56 Determinacioacuten del valor de kLa 52
561 Matraces de cultivo 53
562 Biorreactor 53
563 Graficacioacuten 53
57 Determinacioacuten del contenido de γ‐PGA en el caldo de fermentacioacuten 54
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA en la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo 55
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano 55
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 56
5101 Preparacioacuten de la muestras 56
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual 57
511 Determinacioacuten del peso molecular del γ‐PGA 57
8 RESULTADOS 59
61 Montaje del biorreactor a presioacuten 59
62 Competencia del inoacuteculo madre 59
63 Determinacioacuten de los valores de kLa 60
631 Matraz 60
632 Biorreactor 63
64 Efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto 64
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ‐PGA mediante
GPChelliphellip 65
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γ‐PGA 66
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ‐PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a 70
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 71
69 Determinacioacuten del peso molecular del γ‐PGA 73
9 DISCUSIOacuteN 77
71 Cepa empleada 77
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente 78
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten 79
74 Tiempo de fermentacioacuten 81
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento 83
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 7
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa 84
77 Efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto 86
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γ‐PGA 87
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR 87
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la
biosiacutentesis del γ‐PGA 90
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γ‐PGA 92
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 93
711 Peso molecular del γ‐PGA 95
10 CONCLUSIONES 97
11 AGRADECIMIENTOS 101
12 BIBLIOGRAFIacuteA 103
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 8
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 9
3 GLOSARIO
Bacillus Es un geacutenero de bacterias en forma de bastoacuten y Gram positiva El
geacutenero Bacillus pertenece a la divisioacuten Firmicutes Son aerobios estrictos o
anaerobios facultativos En condiciones estresantes forman una endospora de
ubicacioacuten central Dicha forma esporulada es resistente a las altas
temperaturas y a los desinfectantes quiacutemicos corrientes
γ-PGA Aacutecido gamma-poliglutaacutemico
ATCC American Type Culture Collection coleccioacuten y depositario de microorganismos
de importancia industrial y cientiacutefica
Biorreactor Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente
bioloacutegicamente activo En algunos casos un biorreactor es un recipiente en el
que se lleva a cabo un proceso quiacutemico que involucra organismos o
sustancias bioquiacutemicamente activas derivadas de dichos organismos Este
proceso puede ser aeroacutebico o anaeroacutebico Estos biorreactores son
comuacutenmente ciliacutendricos variando en tamantildeo desde algunos mililitros hasta
metros cuacutebicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable
OTR Tasa de transferencia de oxiacutegeno
OUR Tasa de consume de oxiacutegeno por parte de un microorganismo
kL Coeficiente de transferencia maacutesica
a Aacuterea de transferencia de materia por unidad de volumen
kLa Coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 10
cA
Concentracioacuten de saturacioacuten de oxiacutegeno Maacutexima concentracioacuten de oxiacutegeno que pueda estar disuelto en una fase liacutequida perfectamente mezclada
cA Concentracioacuten de oxiacutegeno en el liacutequido o concentracioacuten real Es determinada experimentalmente haciendo uso de una sonda de oxiacutegeno disuelto
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 11
4 PREFACIO
21 Origen del proyecto
Este proyecto forma parte de una serie de estudios llevados a cabo en
el ETSEIB referentes al empleo y produccioacuten de biopoliacutemeros en Cataluntildea
Anteriormente no solo se ha investigado en torno a la produccioacuten mediante
fermentacioacuten del biopoliacutemero aacutecido poliglutaacutemico sino tambieacuten sobre la
produccioacuten de aacutecido polilaacutectico y su biodegradabilidad entre otros
Una de las principales limitantes que han encontrado los estudios
previos sobre produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico en medio liacutequido mediante
fermentacioacuten sumergida es la dificultad del escalamiento muy probablemente
debido a la reduccioacuten en la tasa de transferencia de oxiacutegeno al aumentar los
voluacutemenes de cultivo lo que conlleva a rendimientos pobres o a la generacioacuten
de un poliacutemero de bajo peso molecular Asiacute mismo la reproducibilidad de los
resultados es pobre en parte por muacuteltiples factores que fueron estudiados con
mayor detalle en este trabajo
Con el propoacutesito de dar solucioacuten a este problema el presente proyecto
plantea una forma diferente y creativa al menos no es la comuacuten en el aacutembito
microbioloacutegico de abordar la limitacioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
durante la fermentacioacuten y que podriacutea ser la responsable de la reduccioacuten en los
rendimientos Asiacute mediante la aplicacioacuten de condiciones de presioacuten positiva se
plantea una posible viacutea de mejora de los rendimientos fermentativos en la
produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico esperando que sus efectos sobre la
viabilidad microbiana sean los menores posibles
22 Motivacioacuten
En la sociedad actual existe una creciente buacutesqueda de soluciones
bioloacutegicas para los problemas que anteriormente abordaacutebamos desde una
percepcioacuten uacutenicamente quiacutemica Asiacute hoy en diacutea con el propoacutesito de garantizar
la preservacioacuten del medio ambiente reducir el impacto de la actividad humana
sobre las especies animales y vegetales y garantizar un planeta a las futuras
generaciones la palabra biopoliacutemero y bioplaacutestico se han vuelto maacutes y maacutes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 12
comunes tanto en el argot popular como en el aacutembito del conocimiento
cientiacutefico donde diacutea con diacutea son maacutes las investigaciones orientadas a este tipo
de productos de naturaleza bioloacutegica y por consiguiente biodegradable
El aacutecido poliglutaacutemico por sus caracteriacutesticas constituye un poliacutemero
natural que ofrece una amplia gama de aplicaciones industriales donde puede
ser empleado tanto como agente espesante o floculador hasta aplicaciones
maacutes novedosas relacionadas con la medicina y la farmacia
En este contexto de buacutesqueda de soluciones amigables con el ambiente
es donde surge la principal motivacioacuten para investigar sobre el aacutecido
poliglutaacutemico en particular sobre coacutemo aumentar la productividad del proceso
fermentativo a partir del cual se realiza su siacutentesis de modo que las ventajas
teoacutericas que ofrece este producto pronto esteacuten disponibles tanto para el
consumidor como para la industria Tristemente los productos biotecnoloacutegicos
casi siempre tienen como principal inconveniente la valoracioacuten econoacutemica
pues tienden a ser difiacuteciles de producir por lo que tienen altos costos
asociados o sus rendimientos son menores a los deseados para hacerlos
econoacutemicamente rentables Por este motivo las investigaciones deben
procurar al menos orientarse a ofrecer soluciones que alguacuten diacutea puedan ser
llevadas a la praacutectica o como sucede con esta investigacioacuten procurar dar
respuesta a los problemas que se enfrentan cuando se trata de llevar un
producto biotecnoloacutegico a la realidad
La importancia de la investigacioacuten biotecnoloacutegica en el campo de los
materiales radica en que en un mundo con materias primas limitadas
particularmente las fuentes foacutesiles los materiales del futuro tendraacuten un origen
maacutes bioloacutegico que mineral o extractivo por lo que la mejora de los procesos
productivos relacionados con estos productos son prioritarios para cualquier
paiacutes que desee mantenerse competitivo en el aacutembito econoacutemico y tecnoloacutegico
mundial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 13
5 INTRODUCCIOacuteN
En la actualidad el desarrollo de biomateriales constituye uno de los
principales ejes de investigacioacuten en el mundo de la ciencia Dentro de estos
biomateriales los biopoliacutemeros han logrado un particularmente alto grado de
atencioacuten especialmente en los uacuteltimos 30 antildeos debidos a sus muacuteltiples
aplicaciones industriales biomeacutedicas y farmaceacuteuticas que estaacuten aportando una
amplia gama de opciones y soluciones a problemas ambientales y en la
formulacioacuten de nuevas preparaciones biomeacutedicas y farmaceacuteuticas
Los biopoliacutemeros son materiales polimeacutericos o macromoleculares que
son sintetizados por seres vivos Debido en gran parte al precio creciente la
viabilidad declinante de las fuentes foacutesiles como materias primas asiacute como el
ritmo crecimiento de la poblacioacuten mundial han propiciado el desarrollo de
fuentes alternativas renovables capaces de suministrar las necesidades
mundiales crecientes en material de energiacutea y produccioacuten quiacutemica Esta
necesidad de nuevas fuentes alternativas ha permitido que la mirada cientiacutefica
se halle puesta sobre la diversidad microbiana que habita el planeta pues los
microorganismos siempre han demostrado ser una fuente importante de
materiales novedosos con la ventaja que en la actualidad se dispone de la
tecnologiacutea necesaria para crecer los microorganismos de manera masiva y
segura Este nuevo modelo conocido como la estrategia de las biorefineriacuteas
ha cambiado la concepcioacuten de la industria quiacutemica moderna y ha sido
empleada exitosamente en la produccioacuten convencional a granel de diversos
productos quiacutemicos como por ejemplo etanol glutamato y aacutecido ciacutetrico
En el presente la produccioacuten de poliacutemeros o monoacutemeros tales como el
13-propanediol el aacutecido polilaacutectico y los polihidroxialcanoatos ha sido uno de
los principales objetivos de mayor investigacioacuten Dentro de estos nuevos
materiales encontramos los poliaminoaacutecidos poliamidas de naturaleza
polimeacuterica cuyos constituyentes estaacuten unidos por enlaces del tipo amida El
aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) es uno de estos poliaminoaacutecidos un poliacutemero
biodegradable constituido por unidades de D- y L-aacutecido glutaacutemico y que es
producido de manera natural en algunas bacterias
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 14
El presente trabajo procura investigar sobre algunas de las condiciones
involucradas en la produccioacuten bacteriana de γ-PGA y que constituyen las
principales barreras que impiden alcanzar los rendimientos necesarios para
que la produccioacuten bioloacutegica de este poliacutemero sea viable tanto desde el punto de
vista bioloacutegico como econoacutemico
31 Objetivos
El objetivo general a partir del cual se estructura el desarrollo de la
presente investigacioacuten es
Estudiar la produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a y el efecto que tiene sobre el rendimiento y estructura del
producto factores propios de la ingenieriacutea quiacutemica como lo son la
presioacuten y la intensidad de agitacioacuten
Los objetivos especiacuteficos que se plantearon alcanzar en el siguiente
proyecto son los siguientes
Disentildear un biorreactor que permita realizar fermentaciones a presioacuten
positiva de hasta 4 bar absolutos
Describir las condiciones baacutesicas requeridas para lograr reproducibilidad
en la produccioacuten deaacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre el rendimiento de
produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico en gL por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre la composicioacuten
enantiomeacuterica y el peso molecular del aacutecido γ-poliglutaacutemico
Establecer el posible efecto de la presioacuten positiva sobre la tasa de
transferencia de oxiacutegeno en el biorreactor
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 15
6 MARCO TEOacuteRICO
41 Los poliaminoaacutecidos
Los poliaminoaacutecidos son poliamidas formadas por un uacutenico aminoaacutecido
y difieren de las proteiacutenas en muacuteltiples aspectos Las proteiacutenas son
biomoleacuteculas compuestas por una amplia gama de aminoaacutecidos mientras que
los poliaminoaacutecidos estaacuten compuestos uacutenicamente por un solo tipo de
aminoaacutecido al menos en su eje central La siacutentesis de proteiacutenas estaacute dirigida
por el ADN que controla la secuencia especiacutefica de aminoaacutecidos que termina
formando una moleacutecula de una proteiacutena en particular Por su parte los
poliaminoaacutecidos son sintetizados por una ruta metaboacutelica de los organismos
completamente distinta En enlace amida en las proteiacutenas acontece
uacutenicamente entre los grupos α-amino y α-carboxilo mientras que en los
poliaminoaacutecidos pueden verse involucradas otras cadenas laterales
funcionales como por ejemplo los grupos β- y γ-carboxiloy ε-amino(Bajaj amp
Singhal 2011)
Existen mayoritariamente tres poliaminoaacutecidos presentes en la
naturaleza el aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina En
el aacutecido γ-poliglutaacutemico los enlaces amida se forman entre el grupo α-amino y
el γ-carboxilo en el eje central La poli ε-lisina presenta monoacutemeros de lisina
unidos por los grupos α-carboxilo y ε-amino La cianoficina consiste en residuos
de aacutecido α-aspaacutertico que contienen residuos de arginina que penden unidos al
grupo β-carboxilo Las foacutermulas de dichos compuestos se presentan en la
figura 1
42 El aacutecido γshypoliglutaacutemico (γshyPGA)
El aacutecido γ-poliglutaacutemico (de ahora en adelante referido como γ-PGA) es
un poliacutemero inusual que acontece de forma natural anioacutenico soluble en agua
biodegradable comestible y que no resulta toacutexico ni para el ser humano ni para
el ambiente que en la naturaleza es producido por algunas bacterias todas
Gram-positivas una archea e inclusive en eucariotas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 16
Fue primeramente descubierto por Ivaacutenovics y colaboradores como
componente de la caacutepsula de la bacteria Bacillus anthracis despueacutes que se
liberara al medio producto tanto del proceso de autoclavado como por el
envejecimiento y lisis natural de los cultivos La comida tradicional japonesa
ldquoNattordquo estaacute constituida por una mezcla de γ-PGA y fructanos que son
producidos por la bacteria Bacillus natto (Bajaj amp Singhal 2011)
Figura 1 Foacutermula y estructura del aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina
(Fuente Feng et al 2007)
421 Propiedades quiacutemicas y bioquiacutemicas del γshyPGA
El γ-PGA es un poliacutemero polianioacutenico que puede estar compuesto
uacutenicamente por D- L- o por ambos enantioacutemeros del aacutecido glutaacutemico Como se
ha comentado ya es altamente soluble en agua El γ-PGA probablemente
pueda adoptar diferentes estructuras La estructura del γ-PGA ha sido predicha
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 17
asumiendo poliaminoaacutecidos constituidos por 10 o 25 moleacuteculas de aacutecido
glutaacutemico Este modelo teoacuterico calculado para una moleacutecula en solucioacuten
acuosa muestra que el γ-PGA consiste de una heacutelice levoacutegira estabilizada por
enlaces de hidroacutegeno intramoleculares Sin embargo otro estudio realizado a
partir de γ-PGA obtenido de Bacillus licheniformis mostroacute que la conformacioacuten
es realmente flexible y depende de la concentracioacuten de γ-PGA y el pH de la
disolucioacuten A bajas concentraciones (01 wv) y a un pH inferior a 7 el γ-PGA
adopta una conformacioacuten basada mayoritariamente en heacutelices del tipo α
mientras que la conformacioacuten tipo hojas β predomina a pH superiores pues
esta conformacioacuten permite una mejor exposicioacuten de las cargas negativas del γ-
PGA (Candelaamp Fouet 2006) Recientemente mediamente experimentos de
dicroiacutesmo circular se ha reportado una estructura desordenada (Joyce et al
2006 Candela amp Fouet 2006) pero sin detallar las condiciones de trabajo de
los experimentos en particular de pH
El peso molecular del γ-PGA parece variar seguacuten sea el organismo que
produce la moleacutecula sin embargo estas diferencias podriacutean deberse a
diferencias en torno a la degradacioacuten natural que acontece con el poliacutemero o a
los meacutetodos de purificacioacuten y anaacutelisis utilizados mismos que puedan afectar el
tamantildeo del γ-PGA Por ejemplo para el caso de Bacillus subtilis el peso
molecular del γ-PGA variacutea entre 160kDa hasta 1500 kDa las cadenas de γ-
PGA consisten entonces de coacutemo miacutenimo 1000 residuos de aacutecido glutaacutemico
Diferentes estudios enfocados en la siacutentesis microbioloacutegica de γ-PGA han
demostrado que el peso molecular de este poliacutemero es dependiente tanto de
las diversas cepas bacterianas que se empleen asiacute como de los componentes
del medio y las condiciones del medio de cultivo e inclusive de razones auacuten no
dilucidadas De alliacute que exista una gran dificultad para obtener un γ-PGA
altamente homogeacuteneo a partir de cultivos bacterianos esto en gran parte
debido a esta inestabilidad descrita asiacute como a la complejidad molecular
involucrada en su biosiacutentesis
Asiacute mismo el γ-PGA puede contener soacutelo aacutecido D-glutaacutemico soacutelo aacutecido
L-glutaacutemico o una mezcla de ambos enantioacutemeros De alliacute que los filamentos
puedan ser de aacutecido γ-poli-L-glutaacutemico (γ-PLGA) de aacutecido γ-poli-D-glutaacutemico
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 18
(γ-PDGA) o de aacutecido γ-poli-L-D-glutaacutemico (γ-PLDGA) La disposicioacuten de los
residuos en el PLGDA requiere un especial anaacutelisis ya que si bien tanto el
PLGA y el PDGA son ambos solubles en etanol cuando ambos se mezclan en
proporcioacuten equimolar precipitan en etanol Esta observacioacuten es utilizada para
demostrar que el γ-PGA producido por Bacillus licheniformis estaacute compuesto
por cadenas tanto de PLGA como de PDGA Asiacute mismo la digestioacuten con L-
glutamilhidrolasa ha demostrado que el γ-PGA de Bacillus subtilis consiste en
una mezcla de isoacutemeros PLGA y PLDGA
422 Siacutentesis microbioloacutegica de γshyPGA
Distribucioacuten en los microorganismos
Inicialmente el γ-PGA fue detectado como un componente de la pared
capsular de la altamente patogeacutenica bacteria Gram-positiva Bacillus anthracis
Posteriormente este poliacutemero seriacutea nuevamente encontrado presente alrededor
de ceacutelulas de otras bacterias Gram-positivas no patogeacutenicas particularmente
del geacutenero Bacillus Gracias a estos descubrimientos fue posible aislar a inicios
del siglo pasado una cepa de Bacillus capaz de producir grandes cantidades de
γ-PGA
Posteriormente y de manera adicional a estas bacterias formadoras de
endosporas del geacutenero Bacillus el γ-PGA fue encontrado en las eubacterias
haloacutefilas Sporosarcina halophila y Planococcus halophilus y en la
archeobacteria haloacutefila Natrialba aegyptiaca Asiacute mismo γ-PGA fue tambieacuten
detectado en cantidades significativas en nematocistos de Cnidaria (eucariota)
En la tabla 1 se presentan los principales organismos productores de γ-
PGA y algunas de las caracteriacutesticas del γ-PGA producido
Ruta de biosiacutentesis
La conversioacuten de glucosa a γ-PGA sugiere que la siacutentesis del poliacutemero
acontece durante la glicoacutelisis y el ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos (ciclo de
Krebs o del aacutecido ciacutetrico) hasta el 2-oxoglurato (α-cetoglutarato) que es un
precursor directo del aacutecido L-glutaacutemico Durante su crecimiento en un medio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 19
Tabla 1 Organismos que han sido reportados como productores de γ-PGA
ORGANISMO CONFORMACIOacuteN CONFORMACIOacuteN DEL FILAMENTO
Bacillus anthracis D D
Bacillus mesentericus D D
Bacillus licheniformis D y L D y L
Bacillus megaterium D y L D + L
Bacillus pumilus D y L ND
Bacillus subtilis D y L L y D+L
Planococcus halophilus D D
Sporosarcina halophila D D
Staphylococcus
epidermidis
D y L ND
Natrialba aegyptiaca L L
Hydra ND ND
Fuente (Candela amp Fouet 2006)
nutritivo Bacillus licheniformis expresa dos enzimas capaces de sintetizar el
aacutecido L-glutaacutemico la glutamato sintasa y la glutamato deshidrogenasa Ambas
enzimas son praacutecticamente insensibles a la inhibicioacuten por producto lo que
permite alcanzar altas concentraciones intracelulares de aacutecido L-glutaacutemico el
cual es entonces direccionado a la siacutentesis de γ-PGA Los estudios maacutes
detallados relacionados con la polimerizacioacuten del γ-PGA se han realizado con
Bacillus anthracis Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis especialmente
Bacillus licheniformis ATCC9945a lo que ha permitido la identificacioacuten de un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 20
sistema enzimaacutetico anclado a la membrada y denominado como PGA-
sintetasa Este sistema enzimaacutetico estaacute constituido por al menos tres
componentes con actividad enzimaacutetica y se presume que cataliza la siguiente
secuencia de reacciones (Troy 1973) (figura 2)
Aacutecido L-glutaacutemico + ATP ɣ-L-glutamil-AMP + PPi (a)
ɣ-L-glutamil-AMP + SH-enzima ɣ-X-glutamil-S-enzima + AMP (b)
ɣ-X-glutamil-S-enzimaɣ-D-glutamil-S-enzima (c)
ɣ-D-glutamil-S-enzima + [ɣ-D-glutamil]n[ɣ-D-glutamil]n+1 + SH-enzima (d)
Figura 2 Posible mecanismo enzimaacutetico de siacutentesis del γ-PGA (Fuente Ashiuchi 2010)
De acuerdo con este modelo solamente el aacutecido L-glutaacutemico es activado
en el paso (a) mediante fosforilacioacuten lo que significa que la biosiacutentesis del γ-
PGA requiere el suministro de energiacutea para la formacioacuten del enlace amida Maacutes
recientemente un segundo mecanismo ha sido descrito por Ashiuchi (2001) e
involucra un complejo enzimaacutetico denominado PgsBCA el cual es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico y donde la
polimerizacioacuten ocurre por un mecanismo de ligacioacuten tipo amida (figura 3)
Inicialmente se habiacutea descrito que el complejo enzimaacutetico era el responsable
de racemizar y polimerizar el aacutecido glutaacutemico sin embargo estas nuevas
evidencias parecen demostrar que el complejo enzimaacutetico involucrado en la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 21
siacutentesis de γ-PGA carece de actividad racemasa y que la formacioacuten del aacutecido
D-glutaacutemico es responsabilidad de una enzima citosoacutelica denominada aacutecido
glutaacutemico racemasa Glr que presenta una alta selectividad por el aacutecido
glutaacutemico y una mayor preferencia por el aacutecido L-glutaacutemico Un modelo de la
viacutea metaboacutelica mayoritariamente aceptada para la siacutentesis de γ-PGA se
presente en la figura 4
Figura 3 Mecanismo propuesto de biosiacutentesis del γ-PGA mediante ligacioacuten tipo amida
(Fuente Ashiuchi 2001)
Figura 4 Viacutea metaboacutelica de biosiacutentesis del γ-PGA (Fuente Buescher amp Margaritis 2007)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 22
Organizacioacuten geneacutetica
Solamente unas pocas bacterias la mayoriacutea dentro del geacutenero Bacillus
han sido reportadas como capaces de producir γ-PGA Asiacute mismo la
produccioacuten de γ-PGA no es uniforme en estos individuos inesperadamente
variacutea inclusive bajo condiciones de cultivo altamente estrictas De alliacute que la
identificacioacuten del sistema regulatorio y los genes involucrados en dicho sistema
es vital para dar solucioacuten a estos problemas de uniformidad y rendimiento El
complejo PGA-sintetasa estaacute codificado por cuatro loci que son denominados
pgs Los cuatro genes pgs son pgsB pgsC pgsAA y pgsE y se les denomina
en conjunto pgsBCA Todos estos genes son necesarios y suficientes para la
produccioacuten de γ-PGA in vivo La figura 5 muestra los elementos geneacuteticos
requeridos para la produccioacuten de γ-PGA en diferentes especies del genero
Bacillus
Figura 5 Elementos geneacuteticos necesarios para la siacutentesis de γ-PGA (Fuente Candela amp
Fouet 2006)
423 Produccioacuten fermentativa de γshyPGA
Diferentes cepas de bacterias del geacutenero Bacillus son capaces de
producir elγ-PGA ya sea como material viscoso extracelular o como
componente capsular En termino industrial estas cepas han sido las maacutes
utilizadas y por ende las maacutes estudiadas hasta el momento La mayor parte de
los estudios han estado orientados a determinar los requerimientos
nutricionales para el adecuado crecimiento celular asiacute como mejorar la
productividad de γ-PGA y la variacioacuten en la composicioacuten de su estructura en lo
referente al contenido de aacutecido L- y D-glutaacutemico Estos estudios como los
realizados por Troy (1973) Cromwicket al (1995) y Kunioka (1997) han
permitido determinar que los requerimientos nutricionales para la produccioacuten de
γ-PGA variacutean seguacuten sea la cepa que se emplea
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 23
De acuerdo a estos requerimientos nutricionales las cepas productoras
de γ-PGA se han dividido en dos grupos uno que requiere la adicioacuten de aacutecido
L-glutaacutemico al medio de cultivo para estimular la produccioacuten de γ-PGA y el
crecimiento celular y otro que no requiere de aacutecido L-glutaacutemico para la
produccioacuten de γ-PGA
Dentro de las bacterias dependientes de aacutecido L-glutaacutemico las cepas
maacutes promisorias han sido B anthracis B licheniformis ATCC9945a B subtilis
IFO3335 y B subtilis F-2-01 Por su parte dentro de las bacterias
independientes de aacutecido L-glutaacutemico encontramos mayoritariamente los caso s
de B subtilis 5E B subtilis TAM-4 y B licheniformis A35 B subtilis 5E puede
producir γ-PGA a partir de L-prolina como uacutenica fuente de carbono
complementado con una fuente de nitroacutegeno en un medio mineral B
licheniformis A35 produce γ-PGA a partir de glucosa y cloruro de amonio en
condiciones desnitrificantes y B subtilis TAM-4 produce grandes cantidades de
γ-PGA cuando crece en un medio de cultivo con una sal de amonio y azuacutecar
como fuentes de nitroacutegeno y carbono respectivamente Asiacute mismo ademaacutes de
la fuente de carbono y nitroacutegeno existen otra serie de factores tales como
fuerza ioacutenica del medio de cultivo pH del medio de cultivo aireacioacuten entre
otros que afectan en gran medida la productividad y calidad del γ-PGA
De primera impresioacuten pareciera conveniente el empleo de las cepas
independientes de aacutecido L-glutaacutemico para la produccioacuten industrial de γ-PGA
sin embargo la informacioacuten disponible en lo referente a la ruta biosinteacutetica el
mecanismo de formacioacuten del γ-PGA y los factores que afectan la productividad
es praacutecticamente nula para estas cepas A partir de los trabajos de
investigacioacuten y los estudios de aplicaciones industriales la produccioacuten de γ-
PGA se ha llevado a cabo mayoritariamente a partir de cepas dependientes de
aacutecido L-glutaacutemico
En la tabla 2 se presentan algunas de las principales cepas bacterianas
empleadas para la produccioacuten de γ-PGA los nutrientes las condiciones de
cultivo el rendimiento obtenido asiacute como los voluacutemenes de cultivo en que se
basan dichos reportes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 24
Tabla 2 Principales bacterias productoras de γ-PGA (Shih amp Van 2001)
CEPA
NUTRIENTES
CONDICIONES DE CULTIVO
RENDIMIENTO
VOLUMEN DE
TRABAJO B licheniformis ATCC9945a
Aacutecido glutaacutemico (20 gL) aacutecido ciacutetrico (12 gL) NH4Cl (7 gL)
30ordmC 4 diacuteas 17-23 gL 100 mL
B subtilis IFO 3335
Aacutecido glutaacutemico (30 gL) aacutecido ciacutetrico (20 gL)
37ordmC 2 diacuteas 10-20 gL 125 mL
B subtilis TAM-4
Fructosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 4 diacuteas 20 gL 100 mL
B licheniformis A35
Glucosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 3-5 diacuteas 8-12 gL 100 mL
B subtilis F02-1
Aacutecido glutaacutemico(70 gL) glucosa (1 gL)
30ordmC 2-3 diacuteas 50 gL 200 mL
B subtilis (natto)
Maltosa (60 gL) salsa de soya (70 gL) glutamato soacutedico (30 gL)
40 ordmC 3-4 diacuteas 35 gL 125 mL
Fuente Shih amp Van 2001
424 Produccioacuten de γshyPGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a
Generalidades de la bacteria Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis es una bacteria comuacutenmente encontrada en el
suelo y en las plumas de las aves Es gram-positiva de forma oval y mesoacutefila
Su temperatura oacuteptima de crecimiento se encuentra alrededor de los 30 ordmC
aunque es capaz de sobrevivir a temperaturas mucho mayores La temperatura
oacuteptima para la secrecioacuten de enzimas es de 37 ordmC Esta bacteria puede existir
como espora cuando las condiciones son inadecuadas o en estado vegetativo
cuando las condiciones le son maacutes favorables (Wecke et al 2006)
Bacillus licheniformis forma parte del grupo Subtilis junto con Bacillus
subtilis y Bacillus pumilus Estas bacterias son conocidas por ser
contaminantes comunes de alimentos asiacute como favorecer su descomposicioacuten
aunque no se consideran patoacutegenos de importancia para el ser humano
(Wecke et al 2006)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 25
La cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis y la siacutentesis de γ-PGA
La produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a fue
primeramente estudiada por Bovarnick en 1942 sin embargo no fue sino a
partir de 1954 cuando Thorne y colaboradores iniciaron una serie de estudios
sistemaacuteticos orientados a investigar los factores que afectan la produccioacuten de
γ-PGA lo que permitioacute determinar algunos factores y condiciones necesarios
para lograr mayores rendimientos Factores tales como presencia de ciertas
sales inorgaacutenicas aacutecido glutaacutemico aacutecido ciacutetrico glicerol y el tamantildeo del inoacuteculo
demostraron tener efectos importantes sobre el rendimiento de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a tanto en condiciones estaacuteticas como cultivos
bajo agitacioacuten Se encontroacute que los mejores rendimientos se produciacutean cuando
el microorganismo era cultivado en agitacioacuten orbital en un medio de cultivo
denominado como medio C (tabla 3) alcanzando una productividad de hasta
15 gL en un periacuteodo de 3-4 diacuteas Asiacute mismo la mayor produccioacuten de poliacutemero
soacutelo se alcanzaba cuando se empleaba agua de grifo y un lote especiacutefico de
FeCl3 Posteriormente se determinariacutea que dicho lote de FeCl3 estaba
contaminado con trazas de Mn2+ y que el agua de grifo conteniacutea cantidades
significativas de Ca2+ Posteriormente Leonard y colaboradores (1958) se
encargariacutean de comprobar la funcioacuten y concentracioacuten oacuteptima de ambos
elementos quiacutemicos mediante la elaboracioacuten de un medio de cultivo
quiacutemicamente definido tomando como base el medio C de Thorne
Tabla 3 Composicioacuten del medio de cultivo C (Thorne et al 1954)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua de grifo
Fuente Shih amp Van 2001
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 26
Leonard y colaboradores encontraron que aunque solamente se requeriacutea
de 15 x 10-7 moles por litro de Mn2+ para alcanzar el maacuteximo crecimiento
concentraciones mayores de Mn2+ mostraban un marcado efecto prolongando
la viabilidad celular y por consiguiente incrementando la productividad de γ-
PGA Un incremento de hasta 615 x 10-4 molL en la concentracioacuten de Mn2+
permitiacutea alcanzar los mayores rendimientos de γ-PGA De igual manera la
adicioacuten de 102 x 10-3 moles por litro de Ca2+ en presencia de 15 x 10-7 moles
por litro de Mn2+ permitiacutea alcanzar auacuten mayores rendimientos deγ-PGA en
comparacioacuten a los valores oacuteptimos de produccioacuten de poliacutemero obtenidos en
ausencia de este elemento El γ-PGA producido consistiacutea en un homopoliacutemero
de unidades repetidas de aacutecido D- y L-glutaacutemico con una concentracioacuten de
aacutecido D-glutaacutemico que variaba entre el 38 y el 86 seguacuten incrementaba la
concentracioacuten de Mn2+ entre 154 x 10-7 y 246 x 10-3 molL siendo esta
observacioacuten independiente de la concentracioacuten presente en el medio de cultivo
de Ca2+
Tabla 4 Composicioacuten del medio E revisado (Leonard et al 1958)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 0000026 a
042 CaCl22H2O 015 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua destilada
Fuente Shih amp Van 2001
A partir de estos resultados Leonard y colaboradores elaboraron el
medio de cultivo denominado Medio E (tabla 4) que es baacutesicamente el medio
original C exceptuando el hecho de que cantidades definidas de Mn2+ y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 27
Ca2+fueron agregadas El Ca2+ fue adicionado con el propoacutesito de asegurar
altas productividades de poliacutemero a cualquier concentracioacuten de Mn2+ que se
empleara mientras que la variacioacuten de la concentracioacuten de este uacuteltimo
elemento permitiriacutea alcanzar el contenido enantiomeacuterico deseado en el
poliacutemero tal y como se comentoacute anteriormente
La estereoquiacutemica del poliacutemero es decir el contenido enantiomeacuterico del
γ-PGA ha sido desde el inicio de las investigaciones uno de los problemas maacutes
complejos y de difiacutecil solucioacuten y de una importancia tanto fundamental como
praacutectica en lo que se refiere al estudio de la produccioacuten de γ-PGA en bacterias
A lo largo de todos estos antildeos han existido numerosas contradicciones entre
los investigadores en cuanto a si el contenido enantiomeacuterico del γ-PGA
producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a estaacute o no afectado por la
concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo Cromwick y Gross (1995)
realizaron un estudio profundo sobre los factores que influenciaban la
produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a Dicho estudio
encontroacute que el porcentaje de aacutecido L-glutaacutemico presente en el γ-PGA variaba
entre 59 y 10 cuando las concentraciones de Mn2+ variaban entre 0 y 615
μmolL asiacute mismo el rendimiento incrementaba desde los 5 hasta los 17 gL en
dicho intervalo de concentracioacuten de Mn2+
Cromwick y Gross (1995) encontraron en este mismo estudio que la
incorporacioacuten de Mn2+ al medio de cultivo es un factor criacutetico para la
conservacioacuten de la viabilidad celular durante periodos de cultivo prolongados
El nuacutemero de ceacutelulas viables se incrementaba del orden de 105 a 109 unidades
formadoras de colonias (ufc) para todas las concentraciones de Mn2+ hasta el
inicio de la fase estacionaria aproximadamente a las 24 horas Sin embargo
despueacutes de 50 horas de cultivo la viabilidad celular se veiacutea reducida
draacutesticamente para aquellas concentraciones de Mn2+ relativamente menores
(0 a 0615 μmolL) mientras que para las concentraciones mayores (338 a 615
μmolL) el nuacutemero de ceacutelulas viables se manteniacutea en el orden de 107-109
inclusive despueacutes de 140 horas de cultivo Asiacute mismo la presencia de Mn2+ en
concentraciones entre 338 y 615 μ incrementaba la utilizacioacuten de las fuentes
de carbono en gran medida cultivos que conteniacutean 615 μmolL de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 28
Mn2+utilizaban el 37 54 y 93 del aacutecido glutaacutemico el glicerol y el aacutecido
ciacutetrico respectivamente en comparacioacuten a aquellos cultivos que no
incorporaban el Mn2+ los cuales solo utilizaban el 19 10 y 17 del aacutecido
glutaacutemico el glicerol y el aacutecido ciacutetrico respectivamente
Uno de los problemas maacutes prolongados en torno a los estudios referidos
a la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC994a es el hecho de
que el microorganismo termina degenerando en una cepa incapaz de producir
γ-PGA despueacutes de cultivo repetitivo Esta inestabilidad exhibida por este
microorganismo es responsable de una gran variacioacuten de cultivo en cultivo en
lo referente a la cantidad y la cineacutetica de formacioacuten del γ-PGA Birrer y
colaboradores (1994) encontraron que el empleo de ceacutelulas vegetativas
criogeacutenicamente congeladas permitiacutea alcanzar un crecimiento y produccioacuten de
poliacutemero consistente de cultivo en cultivo Asiacute mismo y en congruencia con
otros estudios previamente realizados se encontroacute que el crecimiento celular
ocurriacutea baacutesicamente durante las primeras 24 h la mayor productividad
volumeacutetrica de γ-PGA era de 012 gmiddotL-1middoth-1 y se alcanzaba entre los diacuteas 2 y 4
el pH caiacutea de 74 a aproximadamente 5 despueacutes de 42 horas de cultivo e
incrementaba levemente a cerca de 6 despueacutes de 96 horas de cultivo el
empleo de glicerol glutamato y citrato se reduciacutea de 80 a 45 gL 18 a 10 gL y
de 12 a 1 gL respectivamente la produccioacuten de aacutecido aceacutetico hasta un nivel
maacuteximo de 45 gL asiacute como la presencia de 23-butanediol como producto
secundario entre las 42 y las 96 h El estudio del consumo de las fuentes de
carbono resulta un poco sorprendente pues demuestra unas tasas de
consumo del aacutecido ciacutetrico y de glicerol relativamente altas sin embargo para el
caso del aacutecido glutaacutemico dicha tasa de consumo fue por mucho menor y muy
lejana del agotamiento completo de dicha fuente Asiacute mismo la remocioacuten del
aacutecido L-glutaacutemico del medio de cultivo E afectaba en poca medida el
rendimiento en γ-PGA mientras que la remocioacuten de las otras fuentes (glicerol y
aacutecido ciacutetrico) disminuye de manera draacutestica la produccioacuten de γ-PGA Estos
resultados son contradictorios a los encontrados inicialmente por Thorne y
colaboradores (1954) e indica que Bacillus licheniformis ATCC9945 no requiere
de aacutecido L-glutaacutemico para alcanzar altas productividades de γ-PGA Asiacute mismo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 29
la presencia de 23-butanediol es indicador que los niveles de oxiacutegeno en el
medio de cultivo despueacutes de 42 horas son incapaces de sostener un
metabolismo 100 aeroacutebico esto no es de sorprender pues el γ-PGA es un
poliacutemero extracelular extremadamente viscoso y tasas cada vez menores de
transporte de oxiacutegeno son esperables conforme va aumentado la viscosidad en
el medio a medida que la concentracioacuten de γ-PGA se incrementa
Un trabajo de Cromwick y Gross (1996) estudioacute el efecto del pH y la
aireacioacuten sobre la productividad en γ-PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a en condiciones de fermentacioacuten por lotes El pH fue controlado en
los valores de 55 65 74 y 825 y se determinoacute su efecto sobre el crecimiento
celular la utilizacioacuten de las fuentes de carbono la productividad en γ-PGA el
peso molecular y la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA El mayor
rendimiento en γ-PGA se obtuvo a un pH de 65 (15 gL 96 horas de cultivo) y
decrecioacute significativamente en 55 y 74 Esto coincide con el hecho que el
consumo de glicerol y de aacutecido L-glutaacutemico se mantuvo invariable en funcioacuten
del pH sin embargo la mayor tasa de consumo de aacutecido ciacutetrico se observoacute a un
pH de 65 en contraste con 55 y 74 lo cual parece indicar que el metabolismo
del aacutecido ciacutetrico juega un papel importante a dicho valor de pH Previamente
Cromwick y Gross (1995) encontraron que el aacutecido ciacutetrico es efectivamente un
precursor en la produccioacuten del poliacutemero presumiblemente a traveacutes del ciclo de
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De igual manera la alteracioacuten del pH no mostroacute
ninguacuten efecto importante en cuanto al peso molecular y la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA El efecto de la aireacioacuten fue evaluado incrementando
la velocidad de agitacioacuten entre 250 y 800 rpm y la tasa de aireacioacuten entre los
05 y los 20 Lmin a un pH de 65 observaacutendose un incremento en las tasas de
crecimiento y los rendimientos de γ-PGA conforme el suministro de oxiacutegeno
incrementaba
A pesar de la intensa investigacioacuten que se ha llevado a cabo en lo
referente a la produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a el
mecanismo y las viacuteas biosinteacuteticas especiacuteficas por las cuales el poliacutemero es
producido auacuten no han logrado ser dilucidadas con total claridad a pesar de que
no se cuestione le hecho de que efectivamente acontece a traveacutes del ciclo de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 30
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De las tres fuentes de carbono presentes en el medio
de cultivo E el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido L-glutaacutemico constituyen dos sustratos
precursores para la produccioacuten de dicho poliacutemero sin embargo en lo referente
al glicerol auacuten no queda claro como este incrementa la formacioacuten de poliacutemero
maacutes allaacute del hecho de que Troy (1973) encontroacute que el complejo enzimaacutetico
PGA-sintetasa responsable de la polimerizacioacuten del aacutecido L-glutaacutemico a γ-
PGA es estimulada por la presencia de glicerol Considerando que la viacutea de
biosiacutentesis del γ-PGA efectivamente involucra el ciclo de los aacutecidos
tricarboxiacutelicos cualquier fuente de carbono no relacionada directamente como
el glicerol o la glucosa podriacutean en principio ser una fuente primaria de carbono
para el crecimiento celular y la produccioacuten de γ-PGA Efectivamente el empleo
de glucosa como principal fuente de carbono y cantidades traza de aacutecido ciacutetrico
y aacutecido L-glutaacutemico (05 gL) permitieron alcanzar un rendimiento en γ-PGA de
12 gL en cultivos de Bacillus licheniformisATCC9945a (Ko amp Gross 1998) Sin
embargo y a pesar de este hecho Du y colaboradores (1995) encontraron otra
posible explicacioacuten al incremento del rendimiento en presencia de glicerol Ellos
encontraron que en Bacillus licheniformis ATCC9945a las altas
concentraciones de glicerol en el medio de cultivo conllevan a un cambio en la
composicioacuten de los fosfoliacutepidos de la membrana celular incrementando la
proporcioacuten de los fosfoliacutepidos C120 y C101 y reduciendo la de fosfoliacutepidos
C181 y C161 lo que parece favorecer la formacioacuten de una membrana celular
menos compacta lo que conlleva a una efectiva excrecioacuten del γ-PGA fuera de
la membrana celular
En lo referente a produccioacuten a gran escala y en buacutesqueda de la
aplicacioacuten comercial del γ-PGA en grandes cantidades resulta maacutes que
evidente la necesidad de incrementar la productividad Yoon y colaboradores
(2000) desarrollaron una estrategia para la produccioacuten de γ-PGA con un alto
rendimiento mediante cultivo en lote alimentado de Bacillus licheniformis
ATCC9945a Mediante el empleo de un bioreactor de 25 L conteniendo 1 L de
medio de cultivo y bajo condiciones de pH y temperatura de 65 y 37ordmC
respectivamente un 40 de saturacioacuten de oxiacutegeno y una velocidad de
agitacioacuten de 1000 rpm lograron alcanzar una concentracioacuten maacutexima de γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 31
de 35 gL suministrando aacutecido ciacutetrico y aacutecido L-glutaacutemico a una velocidad de
alimentacioacuten de 02 mLmin (144 gh de aacutecido ciacutetrico y 24 gh de aacutecido
glutaacutemico) por un periacuteodo de 3 h despueacutes del agotamiento del aacutecido ciacutetrico
inicial lo cual aconteciacutea alrededor de las 22 h La productividad alcanzada fue
de 1 gmiddotl-1middoth-1
425 Purificacioacuten del γshyPGA
Dado que la produccioacuten del γ-PGA es mayoritariamente extracelular en
concreto en la cepa de intereacutes para el presente estudio la de Bacillus
licheniformis ATCC9945a la purificacioacuten del poliacutemero es directa y consta de
manera general de tres pasos I) la remocioacuten de las ceacutelulas mediante
centrifugacioacuten o filtracioacuten 2) la precipitacioacuten del producto del medio libre de
ceacutelulas mediante metanol etanol o 1-propanol y 3) la diaacutelisis para la remocioacuten
de impurezas de pequentildeo peso molecular
Du y colaboradores (2001) desarrollaron una estrategia eficiente para la
separacioacuten y recuperacioacuten delγ-PGA de caldos altamente viscosos Esta
consiste en dos procesos I) Separar el γ-PGA del caldo de cultivo viscoso y II)
Concentrar la solucioacuten de PGA por ultrafiltracioacuten con el propoacutesito de reducir la
cantidad de alcohol requerida en el proceso de separacioacuten Las ceacutelulas
encapsuladas con γ-PGA poseen carga negativa cerca del valor neutro de pH
esto debido a la ionizacioacuten del grupo carboxilo en las moleacuteculas de γ-PGA Esta
carga negativa en sus superficies les confiere a las ceacutelulas una alta estabilidad
en el medio de cultivo lo que dificulta la sedimentacioacuten de las ceacutelulas durante el
proceso de separacioacuten Esta alta estabilidad asiacute como la elevada viscosidad del
caldo de cultivo son los dos principales problemas que se enfrentan cuando se
trata de separar las ceacutelulas y el γ-PGA del medio de cultivo por lo cual la
reduccioacuten de ambas es vital para una eficiente recuperacioacuten del γ-PGA
Mediante la disminucioacuten del pH es posible reducir el nuacutemero de cargas
negativas sobre la superficie de las ceacutelulas lo que favorece su faacutecil agregacioacuten
y precipitacioacuten Esto permite reducir en hasta un 17 la energiacutea requerida para
una adecuada centrifugacioacuten del caldo de cultivo a un pH de 5 En lo referente
a los requerimientos de alcohol es conocido que un 75-80 del mismo es
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 32
requerido para la precipitacioacuten del γ-PGA presente en un caldo libre de ceacutelulas
a una concentracioacuten de 1-2 Dado que la cantidad de alcohol requerida
disminuye a medida que la concentracioacuten de γ-PGA aumenta es necesaria y
ventajoso sino la concentracioacuten del γ-PGA presente en el medio de cultivo libre
de ceacutelulas a lo largo del proceso de recuperacioacuten Asiacute es posible reducir en un
25 el alcohol requerido para precipitar una solucioacuten de γ-PGA que fue
concentrada de 20 gL a 60 gL mediante ultrafiltracioacuten a un pH de 5
Asiacute mismo y dada la naturaleza anioacutenica del γ-PGA es posible que el
empleo de la cromatografiacutea de intercambio ioacutenica constituya una herramienta
importante para la purificacioacuten de este poliacutemero
426 Control del peso molecular y degradacioacuten del γshyPGA
El peso molecular es una caracteriacutestica importante del γ-PGA microbiano
debido al efecto que tiene el tamantildeo molecular en las propiedades del
poliacutemero El γ-PGA producido por bacterias del geacutenero Bacillus por lo general
presenta un relativamente alto peso molecular Un poliacutemero de alto peso
molecular es uacutetil como agente espesante pero no es uacutetil para otros usos
debido a la alta viscosidad que lo vuelve difiacutecil de modificar quiacutemicamente
mediante la adicioacuten de alguacuten reactivo quiacutemico De acuerdo con el uso que se
pretenda dar es necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso
molecular por ejemplo en lo referente al empleo del γ-PGA en sistemas de
liberacioacuten de faacutermacos o en el disentildeo de faacutermacos polimeacutericos resulta
necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso para controlar el nivel de
liberacioacuten en los distintos tejidos (Shih et al 2001) Es evidente entonces que el
control del peso molecular del γ-PGA no es solamente un asunto de
importancia fundamental o teoacuterica sino de importancia praacutectica para el
desarrollo de aplicaciones comerciales para este poliacutemero Entre los meacutetodos
que se han empleado para la obtencioacuten de γ-PGA con diferentes pesos
moleculares encontramos la hidroacutelisis alcalina la degradacioacuten ultrasoacutenica la
degradacioacuten microbiana o enzimaacutetica y la alteracioacuten de la composicioacuten del
medio de cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 33
En otro estudio Birrer y colaboradores (1994) encontraron que la
variacioacuten de la fuerza ioacutenica del medio de cultivo mediante la adicioacuten de un 4
(pv) de NaCl conllevaba a la formacioacuten de un γ-PGA de un peso molecular
relativamente mayor
A la fecha existen pocos estudios sobre la biodegradacioacuten microbiana o
enzimaacutetica del γ-PGA a moleacuteculas de menor peso molecular sin embargo es
importante sentildealar que en la mayoriacutea de estudios sobre siacutentesis de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a se sugiera la posible existencia de una
enzima ldquodespolimerasardquo responsable de la descomposicioacuten del γ-PGA Lo que
inicialmente se observaba como una reduccioacuten en la viscosidad del medio de
cultivo con el tiempo o bajo ciertas condiciones demostroacute ser una enzima
poliglutamil-γ -hidrolasa responsable de la ruptura hidroliacutetica del γ-PGA en esta
cepa de Bacillus (King et al 2000) Curiosamente la enzima mostroacute ser
activada por la presencia de iones Zn2+ y Ca2+ y tener una alta afinidad por el γ-
PGA
427 Aplicaciones del γshyPGA
Dada la naturaleza del γ-PGA al ser un poliacutemero no toacutexico
biodegradable y cuya produccioacuten puede ser no tan costosa se han sugerido
gran cantidad de aplicaciones durante la uacuteltima deacutecada El γ-PGA de alto peso
molecular es decir mayor a 106 Da es el preferible en gran parte de las
aplicaciones aunque si bien existen otra serie de aplicaciones que se
presentaran a continuacioacuten y que podriacutean demandar diferentes caracteriacutesticas
Es importante destacar eso siacute que salvo las aplicaciones meacutedicas el resto
considera como indiferente la proporcioacuten de aacutecido D-glutaacutemico y de aacutecido L-
glutaacutemico presente en el γ-PGA
Alimentos
Existe una amplia gama de aplicaciones para el γ-PGA en la industria de
alimentos y sus derivados En jugos y otras bebidas el γ-PGA colabora en el
mejoramiento del sabor y su potabilidad Otra aplicacioacuten importante existe en
alimentos soacutelidos a base de harina de trigo como por ejemplo pan pasteles o
pasta donde la adicioacuten de γ-PGA ha demostrado retrasar el envejecimiento y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 34
mejorar la textura asiacute como permitir una mayor conservacioacuten de la forma Para
estas aplicaciones el γ-PGA recomendable es el de alto peso molecular
Asiacute mismo el γ-PGA ha demostrado poseer propiedades
anticongelantes propiedad que se ve incrementada conforme el tamantildeo del
poliacutemero se reduce Esto permitiriacutea emplear el γ-PGA en la conservacioacuten de
alimentos microorganismos y enzimas Debido a que las sales de este
poliacutemero tienen poco sabor por siacute mismas pueden ser empleadas en mayores
concentraciones en comparacioacuten con otros agentes anticongelantes tales como
la glucosa Aunque esta aplicacioacuten es dependiente del tipo de sal del poliacutemero
empleada es independiente de la proporcioacuten de aacutecido L- y D-glutaacutemico
presente en el poliacutemero Asiacute mismo la adicioacuten de γ-PGA en productos
alimenticios que contengan sustancias activas bioloacutegicamente como por
ejemplo carotenoides vitaminas o polifenoles incrementa la absorcioacuten de
dichas sustancias en el intestino delgado
Fertilizante
Es posible producir grandes cantidades de biomasa y γ-PGA a partir de
medios liacutequidos con estieacutercol glicerol aacutecido ciacutetrico y otras sales inorgaacutenicas
resultando un producto que funciona como un fertilizante de liberacioacuten lenta
cuando es aplicado en los campos de cultivo Dado que el γ-PGA es
particularmente inerte a la gran mayoriacutea de las proteasas la liberacioacuten de
nitroacutegeno puede verse reducida auacuten maacutes Inclusive es posible producir dicho
fertilizante mediante fermentacioacuten en fase soacutelida lo que podriacutea resultar auacuten
maacutes ventajoso en ciertos casos pues permite utilizar como co-sustrato de
fermentacioacuten productos agriacutecolas tales salvado de trigo soya o maiacutez Es
importante sentildealar que para dicha aplicacioacuten la proporcioacuten de aacutecido L- y D-
glutaacutemico presente en el poliacutemero es indiferente
Tratamiento de aguas residuales
Debido a la actividad de floculacioacuten que este poliacutemero presenta el
empleo del γ-PGA en el tratamiento de aguas residuales ha sido investigado en
muacuteltiples estudios demostrando una gran capacidad de absorcioacuten y afinidad
por el Cu2+ Adicionalmente se ha demostrado el requerimiento de iones
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 35
multivalentes tales como el Ca2+ Fe3+ y Al3+ para mejorar su actividad
floculante bajo ciertas condiciones
Asiacute mismo tambieacuten se ha empleado el γ-PGA entrecruzado mediante
radiacioacuten γ el cual ha demostrado ser eficiente en la clarificacioacuten de agua
tuacuterbida a concentraciones tan bajas como 1 mgkg
Bioplaacutesticos
La posibilidad de emplear eacutesteres de γ-PGA como plaacutestico
biodegradable tambieacuten constituye otra aplicacioacuten interesante de este poliacutemero
a pesar de que por el momento su costo es todaviacutea muy elevado como para
asegurar el eacutexito comercial Mediante la modificacioacuten de los grupos eacutester es
posible disentildear un plaacutestico que cumpla los requisitos de muacuteltiples propoacutesitos
asiacute mismo los eacutesteres de γ-PGA han demostrado ser maacutes estables a altas
temperaturas que sus respectivas sales de sodio
Hidrogeles
La formacioacuten de hidrogeles por parte de γ-PGA con o sin la adicioacuten de
poliacutemeros adicionales da origen a una amplia gama de novedosas
aplicaciones ya que las propiedades fiacutesicas del gel pueden ser controladas
para cumplir una amplia variedad de necesidades
Mediante irradiacioacuten γ de 19 kGy es posible generar un hidrogel a base
de γ-PGA con un contenido especiacutefico de agua de 3500 Esto constituye un
meacutetodo conveniente y sencillo para gelificar el γ-PGA sin necesidad de
poliacutemeros o entrecruzadores
Los hidrogeles pueden ser empleados en muacuteltiples aplicaciones como en
la liberacioacuten controlada de faacutermacos el disentildeo de biosensores operaciones de
diagnoacutestico e inclusive hasta bioseparadores pueden ser obtenidos a partir de
γ-PGA y PEG-metacrilato Los hidrogeles obtenidos de esta forma poseen la
cineacutetica de liberacioacuten deseada para partiacuteculas de distinto tamantildeo tales como
pequentildeos peacuteptidos proteiacutenas o inclusive ceacutelulas completas (Bajaj amp Singhal
2011)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 36
Una manera sencilla de obtener hidrogeles de γ-PGA es a traveacutes de la
adicioacuten de peroacutexido como entrecruzador al caldo de fermentacioacuten crudo dicho
hidrogel puede emplearse como absorbente de agua en muacuteltiples aplicaciones
que incluyen agricultura horticultura y construccioacuten civil
De igual manera tambieacuten se ha demostrado que los hidrogeles pueden
ser empelados para la liberacioacuten lenta y controlada de faacutermacos en particular
aquellos formados por α-L-PGA y PEG-metacrilato Hidrogeles formados por un
72 deγ-PGA sulfonado y el resto en γ-PGA han demostrado resultados
promisorios en la liberacioacuten controlada de faacutermacos con una liberacioacuten
praacutecticamente nula a un pH de 74 sin embargo a un pH menor a 65 como el
observado en los tejidos inflamados la liberacioacuten del faacutermaco incrementaba
considerablemente
Transportador de faacutermacos
Dado a su biodegradabilidad y biocompatibilidad el γ-PGA constituye un
biopoliacutemero de particular intereacutes en el desarrollo de faacutermacos de liberacioacuten
controlada tal y como se ha sentildealado previamente Dada la presencia de
grupos carboxilo en las cadenas laterales del poliacutemero que pueden
interaccionar con los grupos funcionales presentes en otros agentes
quimioterapeacuteuticos el γ-PGA permite obtener faacutermacos maacutes solubles y faacuteciles
de administrar Inclusive el conjugado faacutermaco-γ-PGA puede ingresar a las
ceacutelulas diana e irse degradando lentamente mientras libera el agente
farmacoloacutegico y a la vez el aacutecido glutaacutemico producido durante su degradacioacuten
puede ingresar directamente al metabolismo celular o ser excretado a traveacutes
del rintildeoacuten (Bajaj amp Singhal 2011)
Uno de los conjugados maacutes prometedores y estudiados hasta el
momento ha sido con el agente anticanceriacutegeno Paclitaxel Dichos conjugados
Paclitaxel-γ-PGA han demostrado presentar un perfil farmacocineacutetico distinto
capaz de proveer una alternativa hidrosoluble a las formulaciones habituales de
este faacutermaco Tambieacuten estos conjugados han mostrado una respuesta
antitumoral marcadamente superior en comparacioacuten con el Paclitaxel soacutelo
tanto en tejidos murinos como humanos Asiacute mismo estos conjugados han
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 37
mostrado reducir la TCD50 (dosis letal media contra ceacutelulas canceriacutegenas) de
una sola irradiacioacuten de 539 Gy a 75 Gy sin afectar la respuesta radioloacutegica de
los tejidos normales sanos
Adhesivos bioloacutegicos
Los adhesivos bioloacutegicos son empleados para la adhesioacuten de tejidos
homeostasis y para el sellado de fugas de liacutequidos o aire en los tejidos durante
una cirugiacutea En la actualidad el adhesivo de mayor uso es la fibrina la cual
presenta un pobre adhesioacuten a los tejidos Un poliacutemero formado por el
entrecruzamiento del γ-PGA y gelatina ha demostrado un gran potencial para
ser empleado como adhesivo quiruacutergico y agente homeostaacutetico conservando la
capacidad de ser degradado lentamente por el cuerpo sin causar respuestas
inflamatorias severas y a la vez solidificando tan raacutepido como la fibrina pero con
una mayor adherencia a los tejidos Similares hallazgos se han obtenido con
poliacutemeros formados del entrecruzamiento de γ-PGA y colaacutegeno porcino (Bajaj
amp Singhal 2011)
Cosmeacuteticos
El γ-PGA puede ser empleado como componente de valor agregado en
la elaboracioacuten de cosmeacuteticos y productos para el cuidado personal tales como
humectantes exfoliantes y antiarrugas Dada sus propiedades quiacutemicas el γ-
PGA es homogeacuteneamente miscible asiacute como quiacutemicamente estable en la gran
mayoriacutea de los ingredientes tiacutepicamente empleados para la elaboracioacuten de
cremas faciales Asiacute mismo ciertas calidades de γ-PGA son capaces de
producir peliacuteculas suaves elaacutesticas humectantes y suaves sobre la piel Dado
que se trata de un humectante natural hidrofiacutelico formidable el γ-PGA ha
demostrado en combinacioacuten con extractos de Aloe vera promover la produccioacuten
natural de factores humectantes tales como aacutecido pirrolidona-carboxiacutelico aacutecido
laacutectico y aacutecido urocaacutenico A nivel microscoacutepico esto se explica por el hecho de
que los hidrogeles de γ-PGA son capaces de absorber hasta 5000 veces su
propio peso en humedad lo que permitiriacutea incrementar de gran manera las
propiedades humectantes de muchos productos cosmetoloacutegicos con la adicioacuten
de γ-PGA algunos electrolitos y el ajuste a un pH adecuado
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 38
Adyuvante en vacunas
El γ-PGA ha demostrado que es capaz de generar una mejor respuesta
inmune contra otros antiacutegenos presentes en una vacuna El γ-PGA de alto peso
molecular ha demostrado estimular la respuesta inmune contra antiacutegenos
virales en conejos y ratones
43 Disentildeo de procesos biotecnoloacutegicos y la transferencia de materia gasshyliquido
Cuando un microorganismo ha sido identificado como productor de un
compuesto de intereacutes existen una serie de consideraciones que deben ser
valoradas previamente antes de que un proceso productivo econoacutemicamente
viable pueda ser llevado a la praacutectica a escala industrial En aquellas
organizaciones e industrias con una soacutelida experiencia en el disentildeo y
escalamiento de procesos fermentativos los nuevos procesos son
incorporados de manera relativamente raacutepida
El desarrollo de un nuevo proceso fermentativo puede ser a groso modo
dividido en cuatro fases
La primera consiste en identificar el producto su potencial valor de
mercado su precio de venta asiacute como la vida uacutetil del mismo
La siguiente fase es seleccionar o disentildear la cepa que seraacute utilizada en
el proceso productivo y por consiguiente disentildear el proceso como tal Esto
involucra una adecuada seleccioacuten del medio de cultivo oacuteptimo y de las
condiciones idoacuteneas de proceso En este sentido la produccioacuten de γ-PGA a
partir de Bacillus licheniformis ATCC9945a ha sido fuertemente investigada en
torno a las condiciones ideales para su produccioacuten sin embargo algunos
reportes y resultados resultan ser incompletos contradictorios o discutibles Sin
embargo lo que si resulta comuacuten en todas las investigaciones en particular en
aquellas donde se han empleado voluacutemenes mayores de produccioacuten como por
ejemplo de 05 a 10 L es que la produccioacuten del γ-PGA se detiene al reducirse
la concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo problema que ha sido
abordado incrementando el caudal de oxiacutegeno yo incrementando la velocidad
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 39
de agitacioacuten sin que se reporten resultados consistentes o claros La
acumulacioacuten del γ-PGA a lo largo de la fermentacioacuten parece reducir
draacutesticamente la tasa de transferencia de oxiacutegeno lo que termina generando
condiciones anaeroacutebicas en tiempos tan cortos como 20 horas con
concentraciones de oxiacutegeno inferiores a 1 mgL
431 La transferencia de materia gasshyliacutequido
Un requisito primordial para la ocurrencia de una reaccioacuten quiacutemica
cualquiera es que los reactantes esteacuten presentes en el sitio de reaccioacuten En los
sistemas multifase los procesos de transporte son generalmente maacutes lentos
que las tasas maacuteximas de reaccioacuten intriacutenseca Este fenoacutemeno da como
resultado que las tasas de reaccioacuten reales sean menores que las que se
podriacutean esperar por efecto de la cineacutetica de reaccioacuten uacutenicamente
Los fundamentos fiacutesicos principales que determinan la transferencia de
materia son los mismos que aplican para la transferencia de calor y de
momento es decir conveccioacuten y difusioacuten
En los sistemas bioloacutegicos multifase como las fermentaciones en medio
sumergido la transferencia de masa ocurre entre dos fases una gaseosa y
otra liacutequida La mayor parte de los procesos fermentativos a gran escala con
excepcioacuten tal vez uacutenicamente de la produccioacuten de etanol y aacutecido laacutectico son
aeroacutebicos y tiacutepicamente son llevados a cabo en biorreactores aireados gas-
liacutequido En estos procesos aeroacutebicos como sucede con la produccioacuten de γ-
PGA por parte de Bacillus licheniformis ATCC9945a la transferencia de
oxiacutegeno desde la fase gaseosa a la fase liacutequida resulta vital para el eacutexito de
dicho bioproceso
En los bioprocesos aeroacutebicos el oxiacutegeno es un sustrato clave y debido
a su baja solubilidad en caldos y medios de cultivo resulta necesario su
continuo suministro La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deber ser
conocida e inclusive predicha con el propoacutesito de llevar a cabo un adecuado
disentildeo operacional del proceso y un correcto escalado de los biorreactores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 40
432 La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR)
El transporte de oxiacutegeno gas-liacutequido en los bioprocesos aeroacutebicos es el
principal proceso gas-liacutequido a considerar a la hora de disentildear un bioproceso
La solubilidad del oxiacutegeno en un medio liacutequido es baja la concentracioacuten de
saturacioacuten de oxiacutegeno es de cerca de 7-8 mgL en un proceso tiacutepico en
aireacioacuten por lo cual una transferencia de oxiacutegeno continua de la fase gaseosa
a la liacutequida es esencial para conservar un metabolismo celular completamente
oxidativo Por ejemplo unos pocos minutos sin aireacioacuten pueden impactar
severamente en la habilidad de Penicillium chrysogenum para producir
penicilina mientras que en organismos aeroacutebicos facultativos esto puede
generar cambios draacutesticos en el rendimiento y el tipo de producto generado en
condiciones de carencia de oxiacutegeno
La transferencia de oxiacutegeno desde una fase gaseosa hasta el interior de
una ceacutelula ocurre siguiendo una serie de pasos secuenciales que son
1) Difusioacuten del O2 desde la fase gaseoso a la interfase gas-liacutequido
2) Transporte a traveacutes de la interfase gas-liacutequido
3) Difusioacuten del O2 a traveacutes de una regioacuten relativamente inactiva del liacutequido
adyacente a la burbuja es decir de la interfase gas-liacutequido a la de
mezclado del liacutequido
4) Transporte del oxiacutegeno disuelto a la ceacutelula los conglomerados celulares
o al pellet de ceacutelulas inmovilizadas
5) Difusioacuten a traveacutes de la peliacutecula inactiva hasta la superficie de la ceacutelula
dentro de los conglomerados celulares o al interior del pellet de ceacutelulas
inmovilizadas
6) Transporte a traveacutes de la membrana celular
7) Transporte del O2 en el interior celular hacia el sitio de demanda
433 Descripcioacuten de la transferencia maacutesica con kLa
La tasa volumeacutetrica de transferencia de materia de un compuesto A (qtA)
en este caso oxiacutegeno (O2) puede ser descrita cuantitativamente como el
producto de un coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (kLa) y una
fuerza impulsora que consiste en la diferencia entre la concentracioacuten de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 41
saturacioacuten del compuesto (cA) y la concentracioacuten actual del compuesto en la
fase liacutequida (cA)
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (unidad s-1) el kLa
es normalmente referido como un coeficiente uacutenico pero en realidad consiste
de dos partes el coeficiente de transferencia de materia propiamente dicho (kL)
que estaacute vinculado con el flujo maacutesico (tasa de transferencia por unidad de
aacuterea) y el aacuterea de la superficie especiacutefica (a) que es el aacuterea de transferencia
por unidad de volumen
La tasa de transferencia de oxiacutegeno (referida como velocidad de
transferencia de oxiacutegeno en algunos casos) el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de materia (kLa) y la concentracioacuten de oxiacutegeno estaacuten
relacionados por la ecuacioacuten
NAa = OTR = kLa(cA- cA) (gm3s)
Noacutetese en la ecuacioacuten que para que la transferencia sea mayor interesa
tener una kLa alta pero ademaacutes (cA-cA) debe tener un valor elevado lo que
podriacutea llevar a plantear que cA sea lo menor posible Sin embargo se requiere
de una concentracioacuten miacutenima de oxiacutegeno para mantener una fermentacioacuten
aerobia Con respecto a dicha ecuacioacuten es importante sentildealar que
1) La concentracioacuten en fase liacutequida cA corresponde a la cantidad de
oxiacutegeno que hay en la fase acuosa y se determina mediante un
electrodo de oxiacutegeno disuelto Si al sistema se introduce aire a presioacuten
atmosfeacuterica dicho valor estaraacute entre los 0-10 mgL
2) La concentracioacuten de saturacioacuten cA corresponde a la solubilidad de
oxiacutegeno y es dependiente de la concentracioacuten de oxiacutegeno en la fase
gaseosa es decir de la presioacuten parcial de oxiacutegeno Una vez conocida la
presioacuten parcial de oxiacutegeno es posible calcular el valor de la solubilidad
mediante la ley de Henry En agua una forma de esta ecuacioacuten seriacutea
pAGcA = He
Donde He es la constante de Henry y cuyo valor (aproximadamente
entre 15-30 atm m3kg) es funcioacuten de la temperatura A partir de esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 42
ecuacioacuten es posible despejar el valor de cA = pAGHe El valor de He
cambia con la temperatura por ejemplo en agua pura a 25 ordmC para el
oxiacutegeno es de 2396 x 106 Pamiddotm3middotkg-1 El valor de cA es modificable si
se manipula
a) Presioacuten podemos aumentar la concentracioacuten de saturacioacuten si
aumentamos la presioacuten parcial de oxiacutegeno por ejemplo si
pasamos de 021 atm a 1 atm introduciendo al reactor oxiacutegeno
puro en vez de aire a presioacuten atmosfeacuterica lo que da por
resultado un aumento en alrededor de cinco veces su valor
Es posible tambieacuten alcanzar un mayor aumento de la
concentracioacuten de saturacioacuten si aumentamos la presioacuten
absoluta no obstante si hacemos fermentaciones con
oxiacutegeno a presioacuten resulta necesario disponer de un
fermentador capaz de resistir tales condiciones de presioacuten
resulta evidentemente maacutes costoso y tambieacuten pueden ocurrir
cambios importantes en el metabolismo de los
microorganismos que puedan afectar su crecimiento o su
rendimiento en producto
b) Temperatura la solubilidad del oxiacutegeno en agua disminuye al
aumentar la temperatura
c) Composicioacuten del liacutequido si en lugar de agua pura se tiene una
disolucioacuten como sucede con la mayoriacutea de los medios que
tiene una composicioacuten salina importante la solubilidad debe
corregirse pues dichos componentes afectan su valor y dicho
efecto estaacute influenciado tanto por los iones presentes como
por los componentes orgaacutenicos
44 Fermentaciones a presioacuten
La gran mayoriacutea de los estudios sobre fermentaciones son generalmente
llevados a cabo bajo condiciones de presioacuten ambiental maacutes allaacute del hecho de
que el fermentador por lo general suele encontrarse positivamente presurizado
Son pocos los ejemplos a excepcioacuten de la cerveza y algunos vinos donde las
fermentaciones son llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten positiva en el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 43
fermentador Esta leve presurizacioacuten suele deberse al proceso de aireacioacuten del
biorreactor debido a la formacioacuten de una presioacuten de vuelta debido a las
restricciones del respiradero de escape del fermentador
La presioacuten positiva en muchos casos puede resultar beneficiosa para los
procesos de fermentacioacuten no soacutelo por el hecho de incrementar la solubilidad del
oxiacutegeno en el caldo de cultivo sino tambieacuten porque reduce las oportunidades
de contaminacioacuten externa durante el proceso de fermentacioacuten Igualmente la
presioacuten puede tener efectos nocivos sobre los procesos fermentativos La
presioacuten tiene el efecto de influenciar las velocidades y la direccioacuten del
metabolismo de los microorganismos Esto es particularmente evidente en el
caso de productos o subproductos volaacutetiles que forman parte de distintas rutas
metaboacutelicas La presioacuten en el fermentador puede evitar la produccioacuten o
expulsioacuten de un producto gaseoso al medio circundante Este fenoacutemeno puede
tener el efecto de interferir con el equilibrio de varias reacciones bioquiacutemicas y
puede resultar en toxicidad al interior de la ceacutelula o en la divergencia de rutas
metaboacutelicas Lo significante de este impacto dependeraacute de la duracioacuten del
proceso asiacute como de la magnitud de la presioacuten a la cual se realice la
fermentacioacuten
De igual manera el efecto de la presioacuten sobre las macromoleacuteculas
guarda una gran semejanza con los efectos de la temperatura lo cual se
desprende del parecido de la forma de los diagramas de estabilidad de las
proteiacutenas y viabilidad de los microorganismos entre ambas variables
temperatura y presioacuten observacioacuten que tambieacuten permite concluir que las
proteiacutenas constituyen los primeros elementos estructurales en ser afectados
de manera negativa por el incremento de la presioacuten La presioacuten parece afectar
en mayor medida las interacciones proteiacutena-proteiacutena en comparacioacuten con la
estabilidad proteica por siacute misma por lo que es vaacutelido concluir que son estas
interacciones las primeras en verse afectadas por dicha variable La
conservacioacuten de la viabilidad en los microorganismos al ser sometidos a
presioacuten dependeraacute en gran medida de su capacidad para conservar una
membrana celular funcional aunque los mecanismos que emplean para tal fin
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 44
auacuten son desconocidos dada la vital importancia de las interacciones proteiacutena-
proteiacutena en las funciones de membrana
Lo maacutes importante es conocer con detalle como efectivamente la presioacuten
ejercida afecta el proceso de fermentacioacuten en particular la bioquiacutemica y la
fisiologiacutea del mismo de igual manera si es posible controlar la direccioacuten de la
fermentacioacuten manipulando la presioacuten o si la presioacuten estaacute generando el
desarrollo de reacciones secundarias indeseadas las respuestas a dichas
interrogantes soacutelo pueden ser dilucidadas mediante la experimentacioacuten praacutectica
del proceso fermentativo en estudio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 45
7 MATERIALES Y METODOLOGIacuteA
51 Informacioacuten de la cepa empleada
Se empleoacute la cepa Bacillus licheniformis ATCC9945a la cual se
encontraba conservada en estado vegetativo y bajo refrigeracioacuten en el
Laboratorio de Biopoliacutemeros del ETSEIB UPC Cataluntildea Con el propoacutesito de
seleccionar colonias altamente mucosas capaces de producir γ-PGA se
procedioacute a rallar la biomasa conservada en placas con Agar LB (pH 75) e
incubarlas por 24 horas a 37 ordmC Las colonias que mostraron una morfologiacutea
mucosa indicadora de la produccioacuten de γ-PGA fueron utilizadas para elaborar
los inoacuteculos empleados en las distintas fermentaciones
52 Medio de cultivo empleado
El medio de cultivo empleado para la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a fue el medio de cultivo E (Leonard et al 1958) con
algunas modificaciones seguacuten recomendado por Birrer y colaboradores (1994)
El detalle de la formulacioacuten se presenta en la tabla 5
Tabla 5 Formulacioacuten del medio de cultivo E empleado en el cultivo SmF de Bacillus
licheniformis ATCC9945a
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO43H2O 043 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 015 CaCl2 011 Glicerol 80 pH 75 Esterilizacioacuten por filtracioacuten (045 μm) Volumen 1 L
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 46
El medio de cultivo fue esterilizado por filtracioacuten (045 μm) y conservado
en refrigeracioacuten a 7 ordmC
53 Preparacioacuten de los inoacuteculos madre
Las colonias seleccionadas fueron inoculadas en matraces de 125 mL
con 25 mL de medio de cultivo E y cultivadas a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica
con varilla imantada a 650 rpm por 12 horas El caldo resultante fue
centrifugado a 8000 rpm por 25 minutos la biomasa recuperada fue
resuspendida en 10 mL de medio de cultivo E y 10 mL de una solucioacuten de
glicerol al 20 Dicha solucioacuten fue distribuida en voluacutemenes de 1 mL en tubos
eppendorf y congeladas a -80 ordmC
Posteriormente uno de estos tubos eppendorf fue empleado para
inocular matraces de 500 mL conteniendo 125 mL de medio de cultivo y fueron
cultivados a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica con varilla imantada a 650 rpm por
14 horas El caldo resultante fue centrifugado nuevamente a 8000 rpm por 25
minutos se recuperoacute la biomasa precipitada y se resuspendioacute en 25 mL de
medio de cultivo E y 25 mL de una solucioacuten de glicerol al 20 Dicha solucioacuten
fue distribuida en voluacutemenes de 2 mL en tubos eppendorf y posteriormente
fueron congelados a -80 ordmC Cada uno de estos eppendorf constituiacutea un inoacuteculo
de origen para una fermentacioacuten individual La absorbancia promedio de estos
inoacuteculos se encontraba cercana a 25
531 Conservacioacuten de la cepa en estado productivo
Los inoacuteculos deben conservarse en todo momento bajo congelacioacuten a
una temperatura inferior a -15 ordmC siendo preferible conservarlos a -80 ordmC La
condicioacuten de produccioacuten de γ-PGA es extremadamente fraacutegil y cambios de
temperatura o descongelamiento pueden conllevar la peacuterdida de dicha
capacidad La reutilizacioacuten de biomasa residual de fermentaciones previas
queda descartada
54 Montaje del biorreactor a presioacuten
En la actualidad los principales fabricantes de biorreactores para la
industria biotecnoloacutegica carecen de equipos de fermentacioacuten a escala
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 47
laboratorio que puedan operar bajo condiciones de presioacuten superiores a los 01
bares relativos Por este motivo se debioacute modificar un reactor quiacutemico a
presioacuten de modo tal que pudiese cumplir los requisitos necesarios para el
cultivo de microorganismos El modelo empleado fue el reactor quiacutemico a
presioacuten modelo 6425-214 de la casa AceGlass (Estados Unidos) de un
volumen total de 2 L Este reactor tiene la capacidad de operar hasta 35 psig
(241 bares relativos) a una temperatura de 100 ordmC y a una agitacioacuten de 300
rpm El mismo seguacuten su disentildeo original se presenta en la figura 6
Figura 6 Reactor quiacutemico a presioacuten modelo 6425-214 de AceGlass Co
Las dimensiones del frasco del reactor de forma ciliacutendrica y fondo
redondeado son las siguientes
Diaacutemetro de boca 95 mm
Diaacutemetro maacuteximo 120 mm
Profundidad 180 mm
Con el propoacutesito de adecuarlo al cultivo de microorganismos el reactor
fue ligeramente modificado en algunos de sus componentes y su distribucioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 48
Entre los principales cambios realizados al sistema se encuentran los
siguientes
1) Incorporacioacuten de una turbina de disco tipo Rushton al tratarse de una
fermentacioacuten aeroacutebica es necesario garantizar una adecuada aireacioacuten
del medio de cultivo mediante agitacioacuten efectiva La paleta de agitacioacuten
original del sistema no cumpliacutea con dicho requisito por lo cual se cambioacute
la misma por una turbina tipo Rushton cuyas dimensiones se muestran
en la figura 7
Dimensiones
A = 75 mm
B = 18 mm
C = 1mm
D = 20 mm
Figura 7 Dimensiones de la turbina tipo Rushton empleada
Esta turbina se encuentra en posicioacuten central a 3 cm del fondo del
reactor y a 6 mm de los deflectores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 49
2) Incorporacioacuten de deflectores se incorporaron dos laacuteminas deflectoras de
disentildeo propio de1 mm de ancho en una posicioacuten de 90 grados con
respecto a la superficie del reactor con el propoacutesito de reducir la
formacioacuten de voacutertice promover una agitacioacuten turbulenta y una mayor
formacioacuten de burbujas La geometriacutea de las laacuteminas deflectoras se
detalla en la Figura 8
Dimensiones
Ancho de laacutemina = 10 mm
Diaacutemetro = 95 mm
Longitud de laacutemina = 200 mm
Figura 8 Geometriacutea de las laacuteminas deflectoras
3) Cambio del motor de agitacioacuten se incorporoacute un motor IKA RW20 con
capacidad de hasta 2000 rpm en sustitucioacuten del motor original con que
A
B
C
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 50
disponiacutea el equipo (el sistema original trae un motor limitado a una
velocidad de agitacioacuten maacutexima de 330 rpm) con el propoacutesito de variar la
agitacioacuten del sistema y observar su efecto sobre el crecimiento y la
produccioacuten de poliacutemero
4) Reubicacioacuten de la vaacutelvula de seguridad de sobrepresioacuten con el
propoacutesito de garantizar una mayor seguridad del equipo maximizar la
vida uacutetil del cilindro de aire comprimido y evitar la sobrepresioacuten que
pueden generar el crecimiento del microorganismo (su metabolismo
puede liberar compuestos gaseosos o volaacutetiles) se trasladoacute la vaacutelvula de
seguridad del equipo de la tuberiacutea de llenado a la tapa del reactor
5) Eliminacioacuten de componentes dado que no resultaban uacutetiles para la
presente investigacioacuten se prescindioacute de instalar en la tapa del equipo el
condensado y el embudo de adicioacuten El disco de ruptura de la tuberiacutea de
llenado fue sustituido por una vaacutelvula de apertura manual con el
propoacutesito de permitir un mejor y maacutes raacutepido ajuste de la presioacuten durante
el establecimiento inicial de las condiciones de fermentacioacuten
55 Condiciones de fermentacioacuten
El detalle de las condiciones de temperatura presioacuten pH y agitacioacuten en
las cuales fueron establecidas las distintas fermentaciones asiacute como la
metodologiacutea de escalamiento empleada se presentan a continuacioacuten
551 Escalamiento
Inicialmente se procediacutea a inocular por duplicado 100 mL de medio de
cultivo con uno de los inoacuteculos madre (2 mL de ceacutelulas de Bacillus licheniformis
ATCC9945a conservados en tubos eppendorf a -20 ordmC) en matraces con
deflectores de 500 mL de capacidad A dichos matraces se les incorporaba una
pastilla de agitacioacuten magneacutetica de 25 cm de longitud y 07 cm de diaacutemetro y
eran colocados en agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm (agitador IKA C-MAG HS7)
por 8 horas a una temperatura aproximada de 30 ordmC
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 51
Posteriormente uno de los matraces (100 mL de cultivo) anteriormente
establecidos era utilizado para inocular 500 mL de medio de cultivo en el
biorreactor a presioacuten manteniendo una temperatura constante de 30 ordmC
aproximadamente Distintas presiones velocidades de agitacioacuten y densidades
oacutepticas del inoacuteculo fueron evaluadas El detalle del disentildeo experimental de
dichas pruebas se presenta a continuacioacuten en la tabla6
Tabla 6 Diferentes condiciones de presioacuten relativa agitacioacuten y absorbancia evaluadas en las
fermentaciones en biorreactor
CONDICIOacuteN
VALORES EVALUADOS
SOBREPRESIOacuteN
Agitacioacuten 300 rpm
Absorbancia del inoacuteculo 120
O bar (0 psig)
052 bar (75 psig)
103 bar (15 psig)
172 bar (25 psig)
241 bar (35 psig)
AGITACIOacuteN
Sobrepresioacuten 103 bar (15 psig)
Absorbancia del inoacuteculo 120
300 rpm
400 rpm
500 rpm
650 rpm
El tiempo de fermentacioacuten para cada uno de los ensayos evaluados fue
de 18 horas tiempo en el que el pH habiacutea descendido a un valor cercano pero
auacuten superior a 6 No se realizoacute ajuste alguno del pH a lo largo de la
fermentacioacuten Posteriormente se procediacutea a centrifugar el caldo de
fermentacioacuten a 8000 rpm por 25 minutos el sobrenadante recuperado era
almacenado para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA presente en
el mismo
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre
Con el propoacutesito de garantizar que el inoacuteculo madre era apto para la
produccioacuten de γ-PGA uno de los matraces inicialmente establecidos era
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 52
conservado bajo agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm y a 30 ordmC durante las 18 horas
que requeriacutea la fermentacioacuten en el biorreactor Posteriormente se determinaba
cualitativamente la produccioacuten de γ-PGA seguacuten la simbologiacutea que se presenta
en la tabla 7
Tabla 7 Simbologiacutea empleada para la medicioacuten cualitativa de la produccioacuten de γ-PGA en los
matraces de control
SIacuteMBOLO OBSERVACIOacuteN CUALITATIVA
- No produccioacuten de γ-PGA
+ Produccioacuten de γ-PGA
+++ Elevada produccioacuten de γ-PGA
56 Determinacioacuten del valor de kLa
Para la determinacioacuten del valor aproximado de kLa tanto en los
matraces coacutemo en el biorreactor se empleoacute el meacutetodo estaacutetico sin operacioacuten
del cultivo celular Dicho valor no fue determinado bajo condiciones de presioacuten
pues se careciacutea con la instrumentacioacuten adecuada sino soacutelo a presioacuten
atmosfeacuterica para ambos casos matraz y biorreactor
Este meacutetodo consiste en disminuir la concentracioacuten de oxiacutegeno hasta
una concentracioacuten de 1-25 mgL despueacutes el sistema es retornado a aireacioacuten
yo agitacioacuten y se mide como va aumentando la concentracioacuten de oxiacutegeno en la
fase liacutequida conforme transcurre el tiempo El objetivo es por tanto disminuir la
concentracioacuten de cA0 lo suficiente como para tener un cambio importante
obteniendo asiacute una curva de ascenso de las concentraciones de oxiacutegeno en el
tiempo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 53
561 Matraces de cultivo
A un matraz de cultivo en reposo conteniendo 100 mL de medio de
cultivo E se le agregoacute 001 g de sulfito de sodio (Na2SO3) y una punta de
espaacutetula de cloruro de cobalto (actuacutea como catalizador) y se agita
manualmente por 20 s Posteriormente se introdujo la sonda de oxiacutegeno
disuelto del medidor Hanna Oxi-check y se dejoacute descender el nivel de oxiacutegeno
disuelto hasta el valor miacutenimo posible entre 20-25 mgL Seguidamente se
activoacute la agitacioacuten magneacutetica y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto cada 10
segundos hasta alcanzar un punto maacuteximo que se repitiese al menos durante
2 minutos
562 Biorreactor
Se procedioacute a llenar el reactor con 600 mL de medio de cultivo y en
estado de reposo se le agregoacute 006 g de sulfito de sodio una punta de espaacutetula
de cloruro de cobalto y se agitoacute suavemente a 100 rpm por 20 segundos
Haciendo uso de la sonda de oxiacutegeno se determinoacute el menor nivel posible de
oxiacutegeno disuelto alrededor de 15-20 mgL Posteriormente se encendioacute la
agitacioacuten mecaacutenica a 300 rpm y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto en
intervalos de 10 segundos hasta alcanzar un valor maacuteximo de oxiacutegeno disuelto
sostenido en el tiempo es decir que se repitiese por al menos un minuto
563 Graficacioacuten
Con el propoacutesito de determinar el valor de kla a partir de la ecuacioacuten de
balance de oxiacutegeno
V(dCAdt) = VkLa(cA-cA)
Se tiene que integrando dicha ecuacioacuten con la concentracioacuten inicial cA0
se obtiene
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 54
Representado ln((cA - cA0)(c
A- cA)) contra el tiempo t se obtiene una
recta cuya pendiente es el valor de kLa
57 Determinacioacuten del contenido de γshyPGA en el caldo de fermentacioacuten
Con el propoacutesito de determinar la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo
post-fermentacioacuten se utilizoacute la teacutecnica analiacutetica llamada cromatografiacutea liacutequida
de alta eficiencia conocida normalmente por sus siglas en ingleacutes HPLC
especiacuteficamente la conocida como cromatografiacutea de permeacioacuten en gel (GPC)
uno de los tipos de cromatografiacutea de exclusioacuten molecular (SEC) maacutes
empleados en la separacioacuten de poliacutemeros
El equipo empleado fue el cromatoacutegrafo modelo 1260 Infinity de Agilent
Technologies La columna de separacioacuten empleada fue una columna PL
aquagel-OH de 8μm para cromatografiacutea GPC en fase acuosa El meacutetodo de
cromatografiacutea empleado consistioacute en eludir 25 μL de la muestra haciendo uso
de una solucioacuten tampoacuten fosfato 005 molL con un tiempo de elucioacuten de 15 min
por muestra El caudal de flujo del eluyente fue de 08 mLmin La deteccioacuten se
llevoacute a cabo a traveacutes de un detector de absorbancia UV-vis de longitud de onda
variable (VWD) a una longitud de onda de 220 nm y tambieacuten un detector de
iacutendice de refraccioacuten (RID) con polaridad positiva y una temperatura de la
unidad oacuteptica de 35 ordmC aunque los resultados reportados y empleados fueron
los obtenidos con el detector VWD El tiempo de retencioacuten de la fraccioacuten
polimeacuterica correspondiente al γ-PGA se encontroacute entre los 65 y los 90
minutos considerando el hecho de que el mismo se trata de una mezcla de
moleacuteculas polimeacutericas de distinta longitud y por ende distinto peso molecular
Para poder cuantificar la cantidad de poliacutemero presente en la muestra se
elaboroacute una curva de calibracioacuten inicial Se prepararon soluciones en agua
destilada de γ-PGA a concentraciones de 10 5 2 1 y 05 gL Las mismas
fueron analizadas mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva para el
pico correspondiente al γ-PGA para cada concentracioacuten Dichos valores fueron
empleados para la elaboracioacuten de la curva de calibracioacuten inicial del equipo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 55
Las muestras a analizar fueron preparadas de la siguiente manera 400
μL del caldo crudo se diluyeron en agua destilada hasta un volumen final de 2
mL (dilucioacuten 5x) y posteriormente fueron filtradas mediante jeringa haciendo
uso de filtros de 045 μm en viales de HPLC Las muestras fueron analizadas
mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva del pico correspondiente al
γ-PGA para cada una de las muestras
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
Con el propoacutesito de determinar el efecto del contenido de γ-PGA sobre la
solubilidad maacutexima de oxiacutegeno en el medio de cultivo en condiciones estaacuteticas
es decir sin crecimiento microbiano (consumo de oxiacutegeno de los
microorganismos nulo) se procedioacute a preparar soluciones de 100 mL de
volumen a concentraciones crecientes de poliacutemero (poliacutemero + biomasa) en
medio de cultivo y medir el nivel de oxiacutegeno disuelto en mgL haciendo uso de
un medidor de oxiacutegeno disuelto Hanna Oxi-check Dichas soluciones fueron
evaluadas en las mismas condiciones de fermentacioacuten empleadas en la
primera etapa de escalamiento matraces de 500 mL con deflectores y a una
agitacioacuten magneacutetica de 650 rpm Se evaluaron concentraciones de biopoliacutemero
de 0 7 14 21 36 54 y 71 gL
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano
Para determinar el crecimiento bacteriano se aprovechoacute el efecto que
dicho crecimiento genera sobre la turbidez del caldo a lo largo de la
fermentacioacuten Por ello se empleoacute la teacutecnica de espectrofotometriacutea
determinando la absorbancia del medio de cultivo inoculado y su incremento
con el tiempo Se empleoacute el coloriacutemetro modelo ZUSI 4200A a una longitud de
onda de 660 nm El equipo era inicialmente calibrado en 0 haciendo uso de
agua destilada acto seguido se determinaba el valor de absorbancia de la
muestra a analizar
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 56
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producido se determinoacute
mediante el meacutetodo desarrollado por Marfey (1984) para la determinacioacuten
cuantitativa de la composicioacuten enantiomeacuterica de aminoaacutecidos Dicho meacutetodo se
basa en la reaccioacuten del aacutecido glutaacutemico con el reactivo de Marfey (1-fluoro-24-
dinitrofenil-5-L-alanina) Dicho compuesto es oacutepticamente activo por lo que al
reaccionar con los enantioacutemeros D- y L- del aacutecido glutaacutemico forma dos
diasteroisoacutemeros que pueden separarse mediante cromatografiacutea HPLC con
tiempos de retencioacuten para el isoacutemero L- y el D- de 675 y 100 minutos
aproximadamente Para poder cuantificar la composicioacuten de manera efectiva
se realizoacute un calibrado previo con mezclas de concentracioacuten conocida de cada
isoacutemero
5101 Preparacioacuten de la muestras
Se introdujo 3 mg del γ-PGA a analizar en viales de 5 mL y se les
adicionoacute 2 mL de HCl 6 molL Se dejaron calentar a 100 ordmC en estufa por un
periacuteodo de 24 horas Posteriormente se trasfirioacute 100 μL de cada una de las
muestras a tubos eppendorf y se dejaron en desecador al vaciacuteo por un periacuteodo
de tres diacuteas empleando NaOH como desecante Seguidamente se disolvioacute los
productos en 100 μL de agua y se hicieron reaccionar con 200 μL de una
disolucioacuten con concentracioacuten de 5 mgmL de reactivo de Marfey en acetona con
20 μL de carbonato aacutecido de sodio (NaHCO3) durante una hora en estufa a 37
ordmC Al finalizar se neutralizoacute como 10 μL de HCl 2 molL y se dejoacute secar al vaciacuteo
por 3 diacuteas en el desecador a vaciacuteo con NaOH como desecante Finalmente se
diluyoacute la muestra en 350 μL de dimetilsulfoacutexido (DMSO) para cromatografiarla
por HPLC
La cromatografiacutea se llevoacute a cabo en el mismo equipo empleado para la
determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA pero con los siguientes cambios
1) Se empleoacute una columna de fase estacionaria reversa Spherisorb ODS2
de 5 μm de poro 25 cm de longitud y 046 cm de diaacutemetro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 57
2) El caudal de flujo del eluyente fue de 15 mLmin
3) El detector de longitud de onda variable (VWD) operaba a 340 nm y el
tiempo de elucioacuten era de 25 minutos
4) El eluyente empleado era una mezcla 8020 de fosfato de trietilamonio
50 mmolL a pH 3 y acetonitrilo El fosfato de trietilamonio se obteniacutea
haciendo reaccionar cantidades equimolares de trietilamina y aacutecido
fosfoacuterico
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual
La composicioacuten porcentual enantiomeacuterica del γ-PGA es decir el
contenido porcentual de aacutecido D- y L-glutaacutemico se determinoacute mediante
contraste de las aacutereas obtenidas en el cromatograma para cada uno de los
picos correspondientes a cada diasteroisoacutemero con el aacuterea total
correspondiente a los productos de reaccioacuten (sumatoria de ambos
diasteroisoacutemeros) La composicioacuten se reportoacute como un porcentaje de aacutecido D-
glutaacutemico y aacutecido L-glutaacutemico presente en la muestra analizada
511 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA Para la determinacioacuten del peso molecular del poliacutemero se procedioacute a
analizar los cromatogramas obtenidos para el caacutelculo de la concentracioacuten de γ-
PGA Se empleoacute el programa informaacutetico ChemStation for LC Systemsreg de
Agilent Technologies Dicho programa posee unas potentes herramientas de
anaacutelisis que permiten automaacuteticamente calcular el peso molecular de un
compuesto Para las muestras analizadas se determinoacute el peso molecular
promedio en nuacutemero (Mn) el peso molecular promedio en peso (Mw) la
polidispersidad y el peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) La recta de
calibrado fue obtenida previamente por Bou y colaboradores con estaacutendares de
polioacutexido de etileno (PEO)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 58
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 59
8 RESULTADOS
61 Montaje del biorreactor a presioacuten
El detalle final del biorreactor empleado puede observarse en la figura 8
Noacutetese que la temperatura es controlada por la accioacuten de una manta teacutermica
externa como sucede con el disentildeo original del reactor y no por el empleo de
un serpentiacuten interno caso de la gran mayoriacutea de biorreactores comerciales a
escala laboratorio El mismo permite operar en condiciones de agitacioacuten de 100
a 650 rpm y a presiones de hasta 24 bar de sobrepresioacuten (35 psig) El
biorreactor resultoacute apto para el crecimiento microbiano alcanzaacutendose valores
de absorbancia de hasta 37 similares a los observados en cultivos en
matraces
Figura 9 Biorreactor empleado para la produccioacuten de γ-PGA bajo presioacuten
62 Competencia del inoacuteculo madre
Mediante la metodologiacutea descrita previamente para la preparacioacuten del
inoacuteculo madre fue posible alcanzar en el 100 de los cultivos de control la
produccioacuten de γ-PGA en alta cantidad Aunque dichos resultados no se
muestran el empleo de inoacuteculos de otra naturaleza como reutilizacioacuten de
biomasa o inoacuteculos conservados a temperaturas superiores a -20 ordmC mostraron
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 60
ser ineficaces y poco reproducibles en cuanto a la produccioacuten de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a Los resultados de los cultivos control
pueden observarse en el graacutefico 10 bajo el nombre de Matraz
63 Determinacioacuten de los valores de kLa
631 Matraz
En lo referente al cultivo en matraz bajo las condiciones de agitacioacuten y
temperatura empleadas y en condiciones estaacuteticas (sin crecimiento
microbiano) se encontroacute un valor de kLa de 0026 s-1 En el graacutefico 1 y 2 se
muestran la curva de concentracioacuten de oxiacutegeno en funcioacuten del tiempo al
reiniciarse el proceso de agitacioacuten asiacute como el caacutelculo de dicho valor de
coeficiente mediante regresioacuten lineal respectivamente
Graacutefico 1 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concentracioacuten m
gL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 61
Graacutefico 2 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00257x ‐ 08809Rsup2 = 09966
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
Cuando se realizoacute la misma determinacioacuten pero a una velocidad de
agitacioacuten menor (430 rpm) el valor de kLa disminuyoacute significativamente En
dicho caso el valor de kLaobtenido fue de 0017 s-1 Estos resultados se
muestran en los graacuteficos 3 y 4
Como se puede observar en dichos graacuteficos el tiempo requerido para
alcanzar el valor maacuteximo estable se incrementoacute considerablemente en 60
segundos lo que indica una menor velocidad de transferencia producto de la
reduccioacuten de la intensidad de la agitacioacuten suministrada al cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 62
Graacutefico 3 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 430 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Graacutefico 4 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00168x ‐ 07551Rsup2 = 09835
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
ln Linear (ln)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 63
632 Biorreactor
Para el caso del biorreactor el valor de kLa determinado fue de 0025 s-1
esto bajo condiciones estaacuteticas (sin crecimiento microbiano) y en las
condiciones de temperatura y operacioacuten previamente descritas
Como se puede observar dicho valor es praacutecticamente igual al obtenido
para el caso del matraz lo que indica condiciones de transferencia de oxiacutegeno
gas-liacutequido muy similares en ambos casos El valor dekLa fue determinado en
un punto lateral del reactor 2 cm por debajo del nivel de medio de cultivo y
contiguo a uno de los deflectores punto donde la transferencia de materia
debiera en principio ser mayor Dichos resultados se presentan en los graacuteficos
5 y 6
Graacutefico 5 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten mecaacutenica del medio de cultivo en biorreactor a 300 rpm
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
560
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Concentracioacuten
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 64
Graacutefico 6 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00246x ‐ 03222Rsup2 = 09902
000
050
100
150
200
250
300
0 20 40 60 80 100 120 140
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
64 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En lo referente a los niveles de oxiacutegeno a distintas concentraciones de γ-
PGA en condiciones estaacuteticas sin crecimiento microbiano se observa una
draacutestica reduccioacuten de dicho nivel conforme se incrementa la concentracioacuten del
biopoliacutemero Dicho fenoacutemeno es esperable dada la alta viscosidad del γ-PGA
La concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo alcanza un valor inicial de
74 mgL el cual se reduce draacutesticamente a 52 mgL a un valor de
concentracioacuten de γ-PGA de 14 gL Esta reduccioacuten es uacutenicamente producto de
la presencia del γ-PGA en el medio de cultivo El graacutefico 7 muestra dicho
fenoacutemeno hasta un valor miacutenimo de oxiacutegeno disuelto de 25 mgL cuando la
concentracioacuten de poliacutemero alcanza un maacuteximo 71 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 65
Graacutefico 7 Efecto de la concentracioacuten de γ-PGA sobre el nivel maacuteximo de oxiacutegeno disuelto en el
medio de cultivo E
y = ‐00569x + 64671Rsup2 = 08709
000
100
200
300
400
500
600
700
800
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Oxiacutegeno disuelto m
gL
γ‐PGA gL
Solubilidad O2 (mgL) Linear (Solubilidad O2 (mgL))
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γshyPGA mediante GPC
La curva de calibracioacuten obtenida a partir de soluciones con
concentracioacuten conocida de γ-PGA se presenta en el graacutefico 8
Como se puede observar se obtuvo un valor del coeficiente de
determinacioacuten R2 de 09983 lo que indica un ajuste lineal suficiente y un valor
del coeficiente de correlacioacuten R de 09991 lo que indica una correlacioacuten
positiva entre los datos contrastados La concentracioacuten de γ-PGA estaacute
determinada entonces por la siguiente ecuacioacuten
Concentracioacuten γ-PGA (gL) = (00027 x Aacuterea) ndash 00916
Esta curva fue posteriormente empleada para determinar la
concentracioacuten de γ-PGA en los caldos de cultivo obtenidos despueacutes de cada
una de las fermentaciones realizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 66
Graacutefico 8 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA mediante
GPC
y = 00027x ‐ 00916Rsup2 = 09983
0
2
4
6
8
10
12
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Concentracioacuten gL
Aacuterea
Series1 Linear (Series1)
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γshyPGA
En lo referente al efecto de la presioacuten (relativa) sobre la productividad en
γ-PGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a se encontroacute un incremento de los
rendimientos fermentativos conforme se incrementaba la presioacuten hasta
alcanzar un valor maacuteximo de sobrepresioacuten de 103 bar (15 psig) una vez
superado dicho umbral la productividad se veiacutea reducida draacutesticamente A 103
bar la productividad en γ-PGA alcanzaba un valor de 1334 gL productividad
mayor a la obtenida en condiciones de aireacioacuten (2 Lmin) a presioacuten
atmosfeacuterica la cual fue de 508 gL Esta productividad maacutexima contrasta con
la obtenida a presioacuten atmosfeacuterica la cual fue miacutenima con un valor de 217 gL
Los graacuteficos 9 y 10 muestran los resultados anteriormente comentados Asiacute
mismo en la tabla 8 se presentan la totalidad de fermentaciones llevadas a
cabo las productividades obtenidas y el promedio de cada condicioacuten Es
importante destacar que cada condicioacuten de presioacuten fue evaluada por duplicado
no encontraacutendose diferencias importantes entre los resultados obtenidos para
ninguno de los casos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 67
Graacutefico 9 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748
617
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 05 1 15 2 25
PGGA (gL)
Presioacuten (bar)
RENDIMIENTO gL
Graacutefico 10 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten y la aireacioacuten a presioacuten atmosfeacuterica (0 relativa)
sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748617 508
4582
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
0 052 103 172 241 0 +Aireacioacuten
Matraz
Concentracioacuten γ‐PGA gL
Presioacuten
RENDIMIENTO gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 68
Tabla 8 Fermentaciones realizadas y concentraciones de γ-PGA obtenidas
Reactor Condiciones A D C (gL)AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10108 5 130
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10926 5 141
AHJC11 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 11753 5 152
AHJC11 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10186 5 131
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 95011 5 122
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 97936 5 126
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28706 3 20
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28194 3 20
AHJC14 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 33184 3 24
AHJC14 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 32866 3 23
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 68396 3 52
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 65871 3 50
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43692 5 54
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 46235 5 57
AHJC16 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 49809 5 62
AHJC16 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 58872 5 74
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 57321 5 72
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43021 5 53
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 57727 5 72
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 62398 5 78
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 60469 5 76
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 58335 5 73
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 6083 5 76
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 57897 5 72
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 51267 5 64
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 48407 5 60
= nuacutemero de muestra A = aacuterea D = dilucioacuten C = concentracioacuten y bar = bar relativo
Algunos de los cromatogramas realizados se muestran en las figuras 10
y 11 Como se puede observar la forma del pico de elucioacuten demuestra que el
biopoliacutemero estaacute compuesto por moleacuteculas de distinta longitud por lo cual
existen diferentes pesos moleculares Es importante destacar que para la gran
mayoriacutea de las fermentaciones realizadas el pico siempre presentoacute su maacutexima
altura al inicio lo que demuestra que la mayor parte de eacutel se trataba de un
poliacutemero de alto peso molecular Igualmente esto podriacutea indicar poca
degradacioacuten del biopoliacutemero durante las 18 horas de fermentacioacuten lo cual es
importante dada la capacidad de Bacillus licheniformis ATCC9945a de
hidrolizar enzimaacuteticamente el γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 69
Figura 10 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA analizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 70
Figura 11 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA (052-103-172 y 241 bar relativas)
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γshyPGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a
En lo referente al efecto de la intensidad de agitacioacuten en rpm sobre la
produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a a una presioacuten de
103 bar relativos (15 psig) se encontroacute un efecto negativo del aumento de la
agitacioacuten por encima de las 300 rpm lo que se demuestra con una importante
reduccioacuten en la concentracioacuten final de γ-PGA obtenida despueacutes de 18 horas de
fermentacioacuten Estos resultados se presentan en el graacutefico 11 Como se puede
observar una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm llega a ser tan perjudicial
para el microorganismo que la productividad en γ-PGA cae por debajo del valor
de 1 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 71
Graacutefico 11 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis
ATCC9945a a 103 bar (15 psig) a 30 ordmC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
300 350 400 450 500 550 600 650 700
Concentracioacuten gL
Agitacioacuten rpm
RENDIMIENTO (gL)
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica resultoacute afectada por las condiciones de
presioacuten Como demuestra el graacutefico 12 la proporcioacuten de aacutecido L-glutaacutemico en
las muestras correspondientes a fermentaciones bajo presioacuten resultoacute ser por
mucho mayor a las observadas en los cultivos control tanto en comparacioacuten
con el de matraz como con el sometido a aireacioacuten
La respectiva curva de calibracioacuten con las muestras conformadas por
mezclas con composicioacuten definida de ambos enantioacutemeros se presente en el
graacutefico 13 Como se puede observar los valores teoacutericos y los valores
experimentales obtenidos en el cromatograma coinciden en buena medida lo
que indica la validez de esta teacutecnica para la determinacioacuten de la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA
En dos casos para las fermentaciones llevada a cabo a 052 bar y 172
bar de sobrepresioacuten (75 y 25 psig respectivamente) la proporcioacuten de aacutecido D-
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 72
glutaacutemico fue de cero en contraste con el control en matraz donde dicha forma
del aacutecido glutaacutemico estaba presente mayoritariamente en un 87
De igual manera en lo que concierne a la fermentacioacuten llevada a cabo a
presioacuten atmosfeacuterica y bajo condiciones de aireacioacuten se observa tambieacuten que el
enantioacutemero mayoritariamente presente es el aacutecido D-glutaacutemico con un 83
en contraste con el aacutecido L-glutaacutemico con apenas un 17 Todas las
fermentaciones llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten presentan un
contenido de aacutecido L-glutaacutemico superior al 83
Aunque no fue posible encontrar una correlacioacuten directa entre la presioacuten
y la composicioacuten porcentual en aacutecido D-glutaacutemico si es posible observar como
las condiciones de presioacuten parecen limitar condicionar o disminuir la presencia
de esta forma del aacutecido glutaacutemico en el γ-PGA
Graacutefico 12 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica en aacutecido
L-glutaacutemico y aacutecido D-glutaacutemica del γ-PGA producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a
R11 (103bar)
R12 (103bar)
R15 (0 +aireacioacuten)
R16 (241bar)
R19 (172bar)
R22 (052bar)
MATRAZ
AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO 9518 8319 1736 10000 8347 10000 1285
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO 482 1681 8264 000 1653 000 8715
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 73
Graacutefico 13 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-
PGA mediante HPLC
000
2900
4700
7700
970010000
7100
5300
2300
300
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
100 L 75 L 25 D 50 L 50 D 25 L 75 D 100 D
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO
69 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA
Los resultados de los pesos moleculares de los poliacutemeros obtenidos en
los distintos ensayos se muestran en la tabla 9 El peso molecular promedio de
permeacioacuten (Mp) de todas las muestras se encontroacute entre los 269-307 x 107
gmol
Tabla 8 Valores de peso molecular promedio en nuacutemero (Mn) peso molecular promedio en
peso (Mw) peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) y polidispersidad (PD) delγ‐PGA
producido en los distintos ensayos evaluados
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
MATRAZ1 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 157 214 29 137
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
MATRAZ2 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 160 216 292 135
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar relativos
207 252 307 122 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 74
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
204 252 307 124 PRIMERO MAYOR
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
202 252 307 125 PRIMERO MAYOR
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
199 251 307 126 PRIMERO MAYOR
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 200 247 307 123
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 226 26 306 115
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 179 223 281 125
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 172 221 264 128
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
217 248 304 114 PRIMERO MAYOR
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
210 246 304 117 PRIMERO MAYOR
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
195 233 284 120 SEGUNDO MAYOR
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
178 225 269 126 SEGUNDO MAYOR
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
223 262 306 118 PRIMERO MAYOR
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
222 261 306 117 PRIMERO PAYOR
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
207 254 307 122 PRIMERO MAYOR
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
187 251 306 134 PRIMERO MAYOR
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
171 246 306 144 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
185 253 306 136 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
202 252 306 125 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 75
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
232 263 306 113 PRIMERO MAYOR
AHJC32-1-18HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
173 228 307 132 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-2-18HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
177 230 306 130 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-1-36HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
165 220 23 133 IGUALES
AHJC32-2-36HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
173 224 302 130 IGUALES
Los valores de polidispersidad estuvieron entre 113 y 144 Asiacute mismo
no se observan mayores diferencias entre los pesos moleculares obtenidos a
distintas presiones aunque la existencia de un segundo pico era maacutes evidente
en los cromatogramas correspondientes a γ-PGA producido en condiciones de
presioacuten relativa 0 Asiacute mismo dichas muestras presentan un peso molecular
levemente menor aunque dicha tendencia no es absoluta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 76
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 77
9 DISCUSIOacuteN
71 Cepa empleada
Bacillus licheniformis ATCC9945a es una cepa que ha sido empleada
con eacutexito en la produccioacuten de γ-PGA particularmente a escala laboratorio maacutes
no ha sido empleada a escala industrial donde otras cepas particularmente de
la especie Bacillus subtilis han sido las preferidas tanto por aspectos de
rendimiento como estabilidad productiva de la cepa El presente estudio
determinoacute una productividad promedio en condiciones de matraz de 4582 gL
despueacutes de 72 horas de cultivo Valores de productividad tan altos no habiacutean
sido reportado previamente para Bacillus licheniformis ATCC9945a donde
valores entre 17 y 23 gL de rendimiento han sido reportados por Troy (1973)
Cromwick y Gross (1996) 26 a 35 gL por Bajaj y colaboradores (2009) y 35
gL por Yoon y colaboradores (2000)
Los motivos de este mayor rendimiento aunque no son claros pueden
deberse a una mejor transferencia de oxiacutegeno en el sistema de agitacioacuten
magneacutetica en comparacioacuten con la agitacioacuten orbital estaacutendar Asiacute por ejemplo y
utilizando la ecuacioacuten simplificada para determinar en valor de kLa en agitacioacuten
orbital (Diacuteaz 2011) tenemos que a 20 ordmC
kLa = 139 x 10-3n (VTVL)084
Asiacute tenemos que para un sistema en agitacioacuten orbital a 250 rpm es decir
a una frecuencia de 417 s-1 con un volumen de medio de cultivo de 100 mL y
un volumen total del matraz 500 mL el valor de kLa es de aproximadamente
0020 s-1 inferior al valor de 0026 s-1 obtenido en el presente estudio para el
cultivo en agitacioacuten magneacutetica a 30 ordmC Dado que la difusividad disminuye al
aumentar la temperatura es de esperar que a 30 ordmC dicho valor de kLa teoacuterico
sea auacuten menor
Es importante sentildealar que en lo referente a la composicioacuten del medio de
cultivo el medio de cultivo E empleado en este estudio es el mismo empleado
previamente por otros autores para el estudio de la produccioacuten de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a por lo cual no se considera que la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 78
composicioacuten del medio de cultivo pueda ser la responsable de las diferencias
con los resultados reportados anteriormente por otros investigadores quienes
en particular tambieacuten emplearon dicho medio de cultivo en sus pruebas
Dicho valor de rendimiento promedio obtenido de 4582 gL (en matraz)
coloca a este cepa al mismo nivel de productividad de las cepas
industrialmente empleadas como sucede con Bacillus subtilis F02-1 con un
rendimiento reportado por Kubota y colaboradores (1993) de 50 gL pero con
una menor necesidad de aacutecido glutaacutemico (20 gL en contra de 80 gL) La
conveniencia del empleo de la cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis debe
entonces evaluarse entorno a su capacidad de escalamiento y conservacioacuten de
la competencia en la produccioacuten de γ-PGA y no entorno a su maacuteximo
rendimiento pues en este aspecto ha demostrado en condiciones oacuteptimas la
capacidad de producir γ-PGA en concentraciones extremadamente elevadas
Los resultados acaacute obtenidos refuerzan lo ya descrito por otros autores quienes
sentildealan precisamente estos aspectos (escalamiento y estabilidad) como los
principales retos para llevar a cabo la produccioacuten de γ-PGA mediante Bacillus
licheniformis ATCC9945a
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente
Uno de los principales problemas que se enfrentoacute a lo largo de la
presente investigacioacuten es la facilidad con la cual la cepa ATCC9945a de
Bacillus licheniformis revierte a formas incapaces de producir γ-PGA Este
fenoacutemeno puede ocurrir incluso con tan soacutelo una generacioacuten de cultivo por lo
cual el empleo de la biomasa generada en una fermentacioacuten previa es
indeseable pues seguramente no daraacute resultados positivos para la produccioacuten
de γ-PGA
Este fenoacutemeno es uno de los principales inconvenientes que se
enfrentan a la hora de evaluar el efecto de diversos paraacutemetros sobre la
productividad de γ-PGA en esta cepa pues la incapacidad de garantizar
resultados reproducibles imposibilita poder evaluar condiciones nutricionales
de agitacioacuten temperatura y demaacutes teniendo la certeza que las diferencias
encontradas solo se deberaacuten a los paraacutemetros bajo control
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 79
Cromwick y colaboradores (1994) reportaron el congelamiento con
nitroacutegeno liacutequido como una forma vaacutelida para la preservacioacuten de las ceacutelulas en
un estado consistente de alta productividad de γ-PGA En nuestro caso la
metodologiacutea empleada fue distinta Se incorporoacute el glicerol como crioprotector y
el congelamiento no se realizoacute mediante nitroacutegeno liacutequido sino que fue
congelamiento convencional utilizando un equipo de refrigeracioacuten con una
capacidad de enfriamiento de hasta -80 ordmC y voluacutemenes de inoacuteculo pequentildeos
de entre 1 y 2 mL cuyo congelamiento fuera particularmente raacutepido
Igualmente se observoacute que los cultivos que mejor comportamiento y
reproducibilidad dieron como inoacuteculo fueron aquellos cuyas ceacutelulas eran
recolectadas previo al inicio de la produccioacuten de γ-PGA Cultivos cuya edad
superaba las 10 horas y que ya presentaban presencia de γ-PGA aunque
podiacutean emplearse para la obtencioacuten de inoacuteculos madres los mismos no
resultaban tan eficientes como los anteriormente descritos
El empleo de esta metodologiacutea de conservacioacuten de la cepa permitioacute una
reproducibilidad del 100 en los ensayos obtenieacutendose poliacutemero en la
totalidad de los cultivos de control que se establecieron durante cada una de
las fermentaciones llevadas a cabo en el biorreactor Estos resultados indican
que dicha metodologiacutea es eficaz para la preservacioacuten a largo plazo de Bacillus
licheniformis ATCC9945a y como estrategia para un adecuado escalamiento
durante el proceso de produccioacuten a mayor escala De igual manera la
descripcioacuten detallada del proceso de conservacioacuten volumen de inoacuteculo
concentracioacuten de la muestra (por absorbancia) temperatura y demaacutes permite
una alta reproducibilidad del meacutetodo en contraposicioacuten con los reportes
existentes por otros autores que no brindaban mayor detalles sobre coacutemo llevar
a cabo este proceso de conservacioacuten
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten
Las fermentaciones a presiones superiores a la presioacuten atmosfeacuterica no
son habituales tanto a nivel de investigacioacuten como a nivel de proceso Dicha
afirmacioacuten queda particularmente ratificada cuando se analizan las opciones
comerciales existentes a escala laboratorio de biorreactores disentildeados para
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 80
operar a presioacuten la cual resulta praacutecticamente nula Por este motivo y para
poder llevar a cabo este estudio se requirioacute adaptar un reactor quiacutemico de
modo tal que permitiese trabajar a presioacuten y a la vez tuviese un control de
agitacioacuten y temperatura miacutenimo de modo tal que permitiese el cultivo de
microorganismos El biorreactor disentildeado fue exitoso pues permitiacutea un
crecimiento microbiano oacuteptimo y la produccioacuten de γ-PGA en un tiempo
relativamente corto de 18 horas
Las modificaciones realizadas en realidad fueron miacutenimas con respecto
a la estructura baacutesica del reactor quiacutemico convencional y con ellas se buscoacute
crear las condiciones que permitiesen incrementar la turbulencia en el sistema
de modo que existiese una mayor oxigenacioacuten y un mayor coeficiente
volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno (kLa) partiendo de antemano de la
hipoacutetesis inicial que sentildealaba al oxiacutegeno como uno de los componentes
limitantes de hecho el de mayor importancia para que este fermentacioacuten
ocurriese de la manera adecuada y con un alto rendimiento de γ-PGA
Se decidioacute emplear un reactor hecho de vidrio en lugar de uno metaacutelico
debido a que las condiciones de oxidacioacuten de la fermentacioacuten y la sensibilidad
de las enzimas involucradas a los iones metaacutelicos haciacutean deseable un material
inerte como sucede con el vidrio De igual manera al emplearse vidrio se tiene
una visioacuten del interior del fermentador las condiciones de agitacioacuten y formacioacuten
de burbujas son visibles asiacute como el crecimiento microbiano lo que permite un
mejor ajuste y correccioacuten de las condiciones de fermentacioacuten al menos durante
las etapas iniciales de investigacioacuten Para poder trabajar a mayores presiones
se hubiese requerido un reactor quiacutemico metaacutelico de un costo sumamente
elevado Los resultados experimentales demostraron que el rango de presioacuten
definido resultoacute ser el correcto para la investigacioacuten
La seleccioacuten de una turbina tipo Rushton radica en que este tipo de
agitador de pala plana se considera como el ideal para la realizacioacuten de
fermentaciones Dado que las paletas de heacutelices Rushton son planas y
colocadas verticalmente a lo largo del eje de agitacioacuten producen un flujo radial
unidireccional que permite una alta difusioacuten de un gas en un liacutequido por lo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 81
comuacuten son utilizadas en la fermentacioacuten de liacuteneas celulares que requieren altas
tasas de oxiacutegeno tales como las levaduras bacterias y algunos hongos
Las laacuteminas deflectoras fueron incorporadas pues aunque a velocidades
muy bajas un agitador de paletas produce una agitacioacuten suave inclusive en un
tanque sin laacuteminas deflectoras cuando son necesarias velocidades elevadas
se requiere la incorporacioacuten de dichas laacuteminas para aumentar la turbulencia de
lo contrario el liacutequido se mueve como un remolino que gira alrededor del
tanque con velocidad elevada pero con poco efecto de mezcla
74 Tiempo de fermentacioacuten
El tiempo de fermentacioacuten empleado en esta investigacioacuten es
significativamente inferior al empleado por otros autores que hablan de un
promedio de 72 horas Es importante sentildealar que 18 horas es el tiempo
suficiente para que el pH del medio de cultivo descienda a cerca de 60
Valores de pH inferiores a este han demostrado ser perjudiciales pues decae
el consumo de aacutecido ciacutetrico se detiene en gran medida la polimerizacioacuten del γ-
PGA y la concentracioacuten tiende a disminuir con el paso del tiempo
Para poder aumentar el periacuteodo de fermentacioacuten se requeririacutea un
sistema de ajuste de pH que opere bajo condiciones del presioacuten mismo que no
se tuvo disponible Es probable que si se prolongara el tiempo de fermentacioacuten
dentro del biorreactor los rendimientos al cabo de 48 o 72 horas seriacutean un
poco mayores siempre y cuando se ajuste el pH en el valor de 65 como
recomiendan Cromwick y colaboradores (1995)
En nuestro caso el incremento del tiempo de fermentacioacuten sin
regulacioacuten del pH de 18 horas a 36 horas mostroacute un incremento miacutenimo en la
productividad (de 025 gL) pero si un cambio en la composicioacuten del γ-PGA
pues el pico de elucioacuten del poliacutemero se desplazoacute levemente hacia un valor de
tiempo mayor lo que podriacutea indicar una degradacioacuten parcial del poliacutemero
inicialmente producido Dichos datos se presentan en la figura 12
Nuestros resultados contradicen lo sentildealado por otros autores quienes
obtienen los mayores rendimientos entre las 48 y 96 horas Birrer y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 82
colaboradores (1995) observaron que Bacillus licheniformis ATCC9945a
alcanza la fase estacionaria a las 24 horas tiempo en el cual muy poco γ-PGA
ha sido formado y por consiguiente la mayor formacioacuten de γ-PGA acontece
entre las 24 y las 96 horas Estos resultados coinciden con los reportados por
Troy (1973) pero difieren a los observados por Goto y Kunioka (1992) con
Bacillus subtilis IFO3335 donde el mayor rendimiento se obtuvo desde las 24 y
hasta las 40 horas Estas diferencias podriacutean deberse a aspectos maacutes
relacionados con los voluacutemenes de fermentacioacuten empleados Por ejemplo para
el caso de Yoon y colaboradores (2000) estos alcanzaron rendimientos de 35
gL con un periacuteodo de fermentacioacuten maacuteximo de 35 horas indicando un
agotamiento del aacutecido ciacutetrico a las 20 horas en su caso el volumen empleado
fue de 1 litro de medio de cultivo
Figura 12 Cromatograma a las 18 (a) y 36 (b) horas de fermentacioacuten con Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 83
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento
Un punto vital para una adecuada fermentacioacuten es la concentracioacuten de
inoacuteculo aspecto que es sentildealado por Troy Cromwick y colaboradores a lo
largo de sus investigaciones pero que no detallan ni cuantifican
adecuadamente o al menos no lo reportan En nuestro caso se empleoacute un
inoacuteculo madre con una absorbancia de 25 o mayor y un inoacuteculo del reactor con
un valor de absorbancia de 120 aproximadamente con el propoacutesito de asiacute
logran estandarizar las condiciones de inoacuteculo Aunque este aspecto no fue
cuantificado a manera cualitativa si se observoacute un importante efecto de este
aspecto (concentracioacuten inicial) sobre la cantidad de γ-PGA obtenido y el tiempo
requerido Esto puede resultarnos obvio teniendo en cuenta una descripcioacuten no
estructurada del crecimiento microbiano pero podriacutea resultar maacutes compleja de
analizar si consideramos que la produccioacuten del γ-PGA estaacute afectada por
paraacutemetros de otra naturaleza maacutes allaacute de la disposicioacuten de nutrientes como
por ejemplo de una estructura celular particular o una relacioacuten de percepcioacuten
de quoacuterum dada Debemos recordar que la percepcioacuten de quoacuterum es un
mecanismo de regulacioacuten de la expresioacuten geneacutetica en respuesta a la densidad
de poblacioacuten celular Las ceacutelulas involucradas producen y excretan sustancias
llamadas autoinductores que sirven de sentildeal quiacutemica para inducir la expresioacuten
geneacutetica colectiva De Vizio (2011) sentildeala que en Bacillus licheniformis NCIMB
8874 la produccioacuten de lichenysin γ-PGA y algunas proteasas extracelulares
estaacute vinculado con los genes comQXPA mismo operoacuten que regula la
percepcioacuten de quoacuterum en Bacillus subtilis
De igual manera la relacioacuten de escalamiento aplicada fue de 16
ligeramente inferior a la que teoacutericamente se utiliza con mayor frecuencia de
110 Aunque este iacutendice no fue objeto de estudio su ajuste tambieacuten afecta de
manera directa los rendimientos obtenidos
La optimizacioacuten de la concentracioacuten del inoacuteculo la relacioacuten de
escalamiento y su frecuencia constituyen aspectos que deben estudiarse con
mayor profundidad para su propia optimizacioacuten pues su efecto sobre esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 84
fermentacioacuten y su rendimiento es bastante significativo Esta afirmacioacuten
adquiere validez cuando vemos que la produccioacuten del γ-PGA no es un
metabolito primario que se forme durante la fase de crecimiento exponencial
sino maacutes bien al inicio de la etapa estacionaria como indica Goto y Kunioka
(antildeo) o durante toda la etapa estacionaria tal y como lo sentildealan tanto Troy
(antildeo) como Birrer y colaboradores (1994) A esto debemos agregarle tambieacuten
lo anteriormente sentildealado referente a la concentracioacuten idoacutenea que produce la
percepcioacuten de quoacuterum responsable de direccionar el metabolismo de la
comunidad microbiana hacia la siacutentesis del γ-PGA
Conociendo la dependencia de esta biosiacutentesis de la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio y partiendo del hecho de que al inicio de la fase
estacionaria la concentracioacuten celular seraacute lo suficientemente alta para poner el
riesgo el mantenimiento de las condiciones aeroacutebicas en el biorreactor pero lo
justa para una adecuada siacutentesis del γ-PGA un inoacuteculo con una alta
concentracioacuten inicial de ceacutelulas podriacutea ayudar a obtener un mayor rendimiento
en un tiempo de fermentacioacuten menor o producir la respuesta de percepcioacuten de
quoacuterum (generalmente se trata de la liberacioacuten de un polipeacuteptido sentildeal) en un
tiempo menor con la consiguiente produccioacuten del γ-PGA
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa es un valor de
suma importancia para el escalamiento de bioprocesos en particular cuando
nos referimos a fermentaciones aeroacutebicas o cultivos de organismos o ceacutelulas
en condiciones de metabolismo aeroacutebico En nuestro caso un adecuado
coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno es garantiacutea que las
condiciones aeroacutebicas se sostendraacuten a lo largo del proceso de fermentacioacuten de
modo que no se produzcan desviacuteos metaboacutelicos indeseados o en el peor de
los casos el inicio del metabolismo anaerobio y la consecuente produccioacuten de
aacutecido aceacutetico
Los valores de kla obtenidos fueron de 0026 s-1 y 0025 s-1 para el
matraz y el bioreactor respectivamente Dichos valores por si mismos nos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 85
indican poco si no determinamos la tasa de consumo de oxiacutegeno requerida
para el cultivo aeroacutebico de Bacillus licheniformis Doran (1995) reporta una
velocidad de consumo de oxiacutegeno m02 para el cultivo aeroacutebico de Bacillus
licheniformis de 231 x 10-5 gO2 g-1cel s
-1 si la concentracioacuten de ceacutelulas X en el
reactor es de 20 gL (determinado experimentalmente como el valor final
alcanzado en matraces con alta concentracioacuten de γ-PGA) la tasa de consumo
de oxiacutegeno (OUR) MO2 seraacute igual a Xm02 es decir 46 x 10-4 mgO2mL-1s-1 A
partir de estos datos y conociendo que kla = MO2ΔcA ΔcA = cA ndash cA sabiendo
que presioacuten atmosfeacuterica cA = 801 mgL a 30 ordmC y el valor cA en el biorreactor
a 30 ordmC es 74 mgL obtenemos un valor de kla del orden de 0062 s-1 Dicho
valor corresponde al valor teoacuterico que seriacutea necesario para mantener el cultivo
con el suministro adecuado y suficiente de oxiacutegeno y que como puede verse
es 25 veces mayor al kla real lo que indica que cuando el cultivo alcance la
maacutexima concentracioacuten celular de 20 gL las condiciones del cultivo no seraacuten
suficientes para un metabolismo cien por ciento aeroacutebico
Tiene sentido entonces que los rendimientos alcanzados en matraz sean
significativamente mayores que los mejores rendimientos obtenidos en
bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica Dado que el cultivo en matraz incorporaba
uacutenicamente 100 mL de medio de cultivo el microorganismo es capaz de
alcanzar una mayor concentracioacuten en una menor unidad de tiempo lo que le
permite alcanzar una mayor concentracioacuten de poliacutemero durante las 26 horas de
cultivo (8 iniciales + 18)
Por su parte para el caso del biorreactor el crecimiento oacuteptimo
probablemente demore maacutes en alcanzarse por lo cual el tiempo que transcurre
entre el alcance de la concentracioacuten limitante de 8 gL (concentracioacuten a la cual
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y la tasa de consumo de oxiacutegeno
(OUR) se igualan) y la concentracioacuten oacuteptima es lo suficiente como para afectar
los rendimientos de γ-PGA Esto resulta evidente al comparar los resultados de
matraz con los de bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica (0 bar relativos) donde la
diferencia en productividad entre ambos es de 43 gL de γ-PGA Dicha
diferencia se explica porque mientras que la concentracioacuten del inoacuteculo madre
mostraba una absorbancia promedio de 25 la del inoacuteculo empleado para el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 86
biorreactor era de 120 (100 ml de medio + inoacuteculo madre creciendo durante 8
horas) es decir praacutecticamente la mitad por lo cual la concentracioacuten inicial de
ceacutelulas era significativamente menor para el biorreactor en comparacioacuten con el
matraz
77 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En condiciones estaacuteticas el contenido de γ-PGAdemostroacute reducir
considerablemente la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
pasando de 74 mgL a 440 mgL a una concentracioacuten del 20 en γ-PGA
Este fenoacutemeno puede deberse al incremento de la viscosidad por la
presencia del poliacutemero en el caldo de cultivo Dicha apreciacioacuten seguramente
afecta de manera negativa la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) pues
reduce tanto cA como cA sin embargo la determinacioacuten del valor de c
A de una
solucioacuten compuesta por sales γ-PGA y productos del metabolismo microbiano
es imposible de determinar teoacutericamente con certeza como para poder
cuantificar la magnitud de reduccioacuten de la OTR numeacutericamente De igual
manera el valor de kLa tambieacuten se ve afectado pues es sabido que a mayor
viscosidad mayor resistencia a la transferencia lo que reduce el valor de este
coeficiente
Asiacute mismo esta reduccioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
podriacutea deberse en parte a la naturaleza anioacutenica del poliacutemero y no solamente
al incremento de la viscosidad La solubilidad se ve afectada por la fuerza
ioacutenica por lo cual una solucioacuten con una concentracioacuten elevada de un poliacutemero
polianioacutenico como el γ-PGA probablemente muestre una importante reduccioacuten
en la solubilidad maacutexima (concentracioacuten de saturacioacuten) del oxiacutegeno en la
misma(Schumpe et al 1978)
Queda claro que dada esta reduccioacuten en la solubilidad de oxiacutegeno al
incrementar el contenido de γ-PGA durante la fermentacioacuten ya sea por la
naturaleza viscosa del biopoliacutemero o por su caraacutecter polianioacutenico la tasa de
transferencia de oxiacutegeno inicial y el valor de kLa se van reduciendo a lo largo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 87
del tiempo lo que dificulta auacuten maacutes garantizar las condiciones de oxigenacioacuten
oacuteptimas para este bioproceso Esto lo podemos explicar pues si tenemos que
OTR = kLa(cA-cA)
dado que al aumentar el contenido de γ-PGA ocurre una reduccioacuten en el valor
de kLa por accioacuten del incremento de la viscosidad (hecho que es
completamente cierto) y al aumentar la concentracioacuten de γ-PGA tambieacuten se
reduce tanto el valor de cA como el de cA (ya sea por efecto de la viscosidad o
de la naturaleza anioacutenico del poliacutemero) la OTR ve su magnitud evidente e
inevitablemente reducida dado que la misma es una relacioacuten de producto entre
ambos factores kLa y (cA ndashcA) Esto podriacutea explicar porque a voluacutemenes de
cultivo de 600 mL (en biorreactor) los rendimientos son mucho menores que en
voluacutemenes de cultivo de 100 ml (matraz) pues probablemente esta caiacuteda en la
OTR sea maacutes acentuada y criacutetica para los microorganismos cuando sucede a
voluacutemenes mayores donde mantener las condiciones de mezcla perfecta y una
alta concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto resultan maacutes dificultosas por lo que el
microorganismo es incapaz de crecer y alcanzar la concentracioacuten idoacutenea para
una maacutexima produccioacuten
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γshyPGA
La concentracioacuten de γ-PGA alcanzada al final de las 18 horas de
fermentacioacuten se vio afectada por la presioacuten Asiacute hasta los 103 bar a mayor
presioacuten mayor concentracioacuten de γ-PGA por encima de este valor de presioacuten la
concentracioacuten de γ-PGA disminuye
Esto puede explicarse por dos factores 1) el efecto de la presioacuten sobre
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y 2) impacto sobre la integridad y
viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γ-PGA
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR
La OTR se ve afectada tanto por el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de oxiacutegeno kLa asiacute como por la diferencia entre la concentracioacuten
de saturacioacuten y la concentracioacuten real en la fase liacutequida (cA-cA) El coeficiente kL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 88
es empiacuterico y su valor depende principalmente de factores tales como la
hidrodinaacutemica del sistema la turbulencia y su geometriacutea
Teoacutericamente kL se puede definir como kL = DABδ donde DAB es la
difusividad de A en B y δ es el espesor de la peliacutecula estancada seguacuten la
teoriacutea de peliacutecula para la transferencia de materia La difusividad en liacutequidos
depende en gran medida de la temperatura (afecta el coeficiente de difusioacuten) y
la concentracioacuten de solutos pero muy poco de la presioacuten (Diacuteaz 2011) En
nuestro caso podriacuteamos suponer que la presioacuten tiene poco efecto sobre kLa
pues tampoco es de esperar un cambio producto de la presioacuten en el aacuterea de
burbujas (a) producida por la agitacioacuten mecaacutenica auacuten maacutes cuando vemos el
hecho de que los ensayos llevados a cabo no contaron con un sistema de
aireacioacuten o burbujeo especiacutefico salvo aquel llevado a presioacuten atmosfeacuterica (0
bar relativa) y debidamente identificado como Aireacioacuten
Asiacute entonces tenemos en el segundo componente de la foacutermula la
diferencia (cA-cA) un punto de particular intereacutes pues efectivamente la
concentracioacuten de saturacioacuten y la concentracioacuten real variacutean con la presioacuten A
pesar de carecer de una sonda de oxiacutegeno disuelto directamente incorporada
al biorreactor y capaz de operar a presioacuten se determinoacute mediante transferencia
(con el sistema cerrado) la concentracioacuten real de oxiacutegeno en el medio de
cultivo a distintas presiones Tales concentraciones y las concentraciones de
saturacioacuten a cada presioacuten se presentan en el graacutefico 14
Para determinar el valor de las distintas concentraciones de saturacioacuten
al trabajar a presiones distintas a la atmosfeacuterica se realizoacute la siguiente
correccioacuten (Montoya amp Bermuacutedez 2003) para el valor de la solubilidad del
oxiacutegeno en agua
Ley de Henry
a 1 atm
Para una presioacuten P distinta a 1 atm tenemos que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 89
en mgL
Donde
C(S) = valor de solubilidad a 1 atm (mgL)
P = presioacuten de operacioacuten (atm)
T = temperatura de operacioacuten (K)
Graacutefico 14 Concentraciones de oxiacutegeno de saturacioacuten y en fas liacutequida a diferentes presiones
en medio de cultivo E sin crecimiento bacteriano
80
153
227
324
422
6681
141154
178
141
724857
1703
2438
y = 48525x + 68875
y = 14191x + 80039
y = 93382x + 11163
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
00
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 05 1 15 2 25 3
Concentracioacuten
Presioacuten (bar)
CONCENTRACIOacuteN DE SATURACIOacuteN CONCENTRACIOacuteN EN FASE LIacuteQUIDA DIFERENCIA
Aunque estos valores deben repetirse con una sonda de oxiacutegeno
disuelto interna (dentro del biorreactor) y bajo una metodologiacutea maacutes pertinente
preliminarmente puede observarse que la diferencia (cA-cA) aumenta al
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 90
aumentar la presioacuten y dado que OTR = kLa(cA-cA) al aumentar dicha
diferencia la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deberiacutea ser mayor Este
incremento de la OTR podriacutea explicar el porqueacute del raacutepido crecimiento
microbiano y la produccioacuten precoz de γ-PGA despueacutes de 18 horas de cultivo
en comparacioacuten con las entre 48 y 96 horas reportadas por otros autores asiacute
como el aumento del rendimiento al aumentar la presioacuten de los 0 bar relativos
(a presioacuten atmosfeacuterica) hasta los 103 bar relativos
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γshyPGA
Al superar los 103 bar relativos el rendimiento en γ-PGA decae
nuevamente Si consideramos un efecto positivo de la presioacuten sobre la OTR
como sentildealamos anteriormente esto no deberiacutea ocurrir Sin embargo al
someter las ceacutelulas a condiciones de presioacuten desconocemos el efecto que
dicha presioacuten puede ejercer sobre los microorganismos y sus rutas
metaboacutelicas asiacute como sobre la estructura de algunas biomoleacuteculas como por
ejemplo proteiacutenas
Meersman y Heremans (2008) sentildealan que el efecto de la presioacuten sobre
el crecimiento de los microorganismos puede explicarse por tres efectos
principales 1) Variaciones en el plegamiento y agregacioacuten de las proteiacutenas 2)
Variaciones en el estado de la membrana celular y 3) Variaciones en el
contenido de proteiacutenas asociadas a la membrana celular Estos aspectos son
de peculiar consideracioacuten pues la γ-PGA sintetasa es un complejo enzimaacutetico
formado por al menos tres unidades enzimaacuteticas distintas y que se encuentra
asociado a la membrana celular de Bacillus licheniformis
En lo referente a las proteiacutenas se sabe que su desnaturalizacioacuten se
produce por efecto de una reduccioacuten en su volumen producto de un cambio
configuracional probablemente de la estructura terciaria Asiacute tenemos que si el
volumen inicial de una proteiacutena viene dado por Vi = Vatomos + Vcavidades +
Vhidratacioacuten si en condiciones de presioacuten ocurre un cambio en el volumen de la
proteiacutena tal que ΔV = ΔVcavidades + ΔΔVhidratacioacuten(el volumen de los aacutetomos no
tiene por queacute variar con la presioacuten) la exposicioacuten de los grupos cargados o
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 91
hidrofoacutebicos de la proteiacutena al agua pueden conllevar a un cambio en la
estructura secundaria y terciaria de modo que la actividad de la proteiacutena se
vea perjudicada parcial o totalmente Esto se debe a que un aumento en la
presioacuten rompe las interacciones hidrofoacutebicas donde las interacciones proteiacutena-
proteiacutena son sustituidas por interacciones proteiacutena-agua particularmente
mediante puente de hidroacutegeno El incremento de la presioacuten podriacutea afectar la
conformacioacuten de alguno o algunos de los componentes del complejo
enzimaacutetico γ-PGA sintetasa lo que sin duda alguna se traduciriacutea en un menor
rendimiento en γ-PGA durante la fermentacioacuten Este posible efecto negativo de
la presioacuten sobre una de las enzimas involucradas en el proceso de biosiacutentesis
del γ-PGA se reafirma cuando vemos como variacutea la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA al aumentar la presioacuten aspecto que se discutiraacute con mayor detalle
maacutes adelante De hecho Ashiuchi y colaboradores (2004) sentildealan que el
complejo enzimaacutetico PgsBCA (γ-PGA sintetasa) es imposible de aislar en su
estado activo debido precisamente a su alta inestabilidad y elevada
hidrofobicidad
Por su parte la membrana celular al tratarse de una bicapa fosfolipiacutedica
es susceptible a sufrir cambios de fase producto de la temperatura o la presioacuten
como por ejemplo la transicioacuten gel-liacutequido El incremento de la presioacuten al igual
que sucede con la temperatura concede mayor fluidez a las bicapas lipiacutedicas
Asiacute en nuestro caso un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea permitir
una mayor difusioacuten de oxiacutegeno al interior celular lo que podriacutea afectar el
crecimiento bacteriano si por ejemplo se formase maacutes especies reactivas
toacutexicas de oxiacutegeno en el interior celular o si cierta maquinaria celular como la
misma γ-PGA sintetasa no fuese capaz de acoplarse adecuadamente en una
membrana con mayor fluidez
En lo referente a la interaccioacuten membrana celular-proteiacutenas es
importante destacar que entre el 20 y el 40 de las proteiacutenas de una ceacutelula
bacteriana suelen estar asociadas a esta estructura Como indicamos
anteriormente un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea afectar el
contenido concentracioacuten y capacidad de anclaje de las proteiacutenas a la
membrana celular El complejo enzimaacutetico γ-PGA sintetasa al tratarse de una
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 92
proteiacutena de membrana podriacutea no acoplarse de manera efectiva a la membrana
celular modificada bajo condiciones de presioacuten o ser liberada al medio de
cultivo lo que afectariacutea negativamente la produccioacuten de γ-PGA Estas
suposiciones podriacutean explicar el porqueacute de la gran cantidad de espuma
generada durante algunas fermentaciones a presioacuten (concretamente en
aquellas a una presioacuten superior a los 103 bar) a pesar de su menor
concentracioacuten de γ-PGA y teniendo presente que en las fermentaciones
microbianas la espuma suele estar constituida mayoritariamente por proteiacutenas
la presioacuten podriacutea estar favoreciendo la liberacioacuten de estas proteiacutenas al caldo de
cultivo y la consecuente formacioacuten abundante de espuma Este fenoacutemeno ya
ha sido reportado en otros microorganismos como Salmonella enterica donde
el tratamiento con presioacuten conllevaba a la peacuterdida de gran parte de sus
proteiacutenas de membrana y su consecuente liberacioacuten al medio de cultivo
(Meersman amp Heremans 2008) Esto se ve respaldado con las observaciones
de Ashiuchi y colaboradores (2004) quienes adicionaron detergentes como el
Tween20 y Triton X-114 (que modifican la estabilidad de la membrana celular y
favorece la liberacioacuten de las proteiacutenas asociadas a ella) a cultivos de Bacillus
spp productores de γ-PGA Ellos observaron una peacuterdida total de la capacidad
de siacutentesis del γ-PGA capacidad que no se recuperaba ni siquiera removiendo
la totalidad de dichos detergentes mediante diaacutelisis con lo cual concluyeron
que es indispensable que el complejo γ-PGA sintetasa se encuentre asociado a
la membrana celular para ser bioloacutegicamente activo
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γshyPGA
Un incremento de la intensidad de agitacioacuten afectariacutea positivamente el
valor de kLa incrementaacutendolo al aumentar el aacuterea de intercambio mediante una
mayor ruptura de las burbujas lo que aumenta el aacuterea de intercambio por
unidad de volumen Sin embargo existen liacutemites para la velocidad de agitacioacuten
esto debido al dantildeo ocasionado a los organismos debido a un esfuerzo
cortante excesivo A pesar de que la turbina Rushton es el impulsor de flujo
axial maacutes recomendado y maacutes eficiente para generar una mezcla perfecta de
alto perfil hidrodinaacutemico un bajo esfuerzo cortante y una alta distribucioacuten un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 93
exceso de agitacioacuten bajo condiciones de presioacuten es evidentemente perjudicial
Es probable que al aplicar presioacuten positiva sobre el cultivo la membrana celular
se encuentre en un estado de fluidez mayor al que presentariacutea a presioacuten
atmosfeacuterica asiacute mismo la presencia de glicerol en el medio de cultivo modifica
la composicioacuten lipiacutedica de la membrana favoreciendo la salida del γ-PGA al
exterior celular al aumentar de igual manera su fluidez Esto queda demostrado
por nuestros resultados a velocidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm
donde ocurre una reduccioacuten de la productividad conforme se aumenta la
agitacioacuten De igual manera la excesiva formacioacuten de espuma que se genera a
intensidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm podriacutea indicar la ruptura celular
y la liberacioacuten de componentes celulares y macromoleacuteculas al caldo de
fermentacioacuten Estas observaciones contradicen lo reportado por otros autores
(Yoon et al 2000) quienes indican velocidades de agitacioacuten oacuteptimas de hasta
1000 rpm a presioacuten atmosfeacuterica para un biorreactor de 24 L y un volumen
efectivo de cultivo de 1 L aunque no se brindan mayor detalle en lo referente al
tipo de turbina empleada
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
El cambio de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producto de la
presioacuten fue un resultado inesperado pues tradicionalmente se habiacutea sentildealado
a la concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo como el principal
responsable de controlar este aspecto Es importante destacar el hecho que
dicho cambio en la composicioacuten no es parcial o escalonado sino que por el
contrario el hecho de aplicar presioacuten durante la fermentacioacuten invierte
praacutecticamente los contenidos de aacutecido D-glutaacutemico y aacutecido L-glutamico de 87
y 13 respectivamente a presioacuten atmosfeacuterica (cultivo en matraz) a 17 y 83
respectivamente a una presioacuten relativa de 103 bar En algunos casos el
contenido de aacutecido D-glutaacutemico fue praacutecticamente 0
Efectivamente se sabe que el complejo γ-PGA sintetasa es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico aunque todaviacutea se
desconoce la arquitectura bioloacutegica de esta sintetasa Igualmente se sabe que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 94
es el componente PgsB el mayormente responsable de la cataacutelisis enzimaacutetica
(reaccioacuten de elongacioacuten del γ-PGA) (Ashiuchi 2010) Una hipoacutetesis que podriacutea
explicar estos resultados es que bajo presioacuten la estructura de esta proteiacutena se
modifique parcialmente (tanto la estructura de la proteiacutena propiamente dicha
como la estructura en funcioacuten de su anclaje a la membrana celular) lo
suficiente como para reducir su afinidad por el aacutecido D-glutaacutemico pero sin
afectar su afinidad por el aacutecido L-glutaacutemico ni conllevar a una
desnaturalizacioacuten de la proteiacutena y la consiguiente peacuterdida total de la actividad
enzimaacutetica Dado que es poco lo que se conoce de la estructura y mecanismo
de accioacuten de esta proteiacutena PgsB es imposible poder determinar con mayor
detalle el coacutemo pueden darse este cambio en la proteiacutena aunque casos
similares se observan durante la desnaturalizacioacuten de proteiacutenas por
temperatura donde las enzimas que operan sobre muacuteltiples sustratos no
pierden su capacidad enzimaacutetica de manera total sobre todos ellos sino que
inicialmente acontece una peacuterdida de afinidad diferenciada seguacuten el sustrato
hasta llegar al punto de desnaturalizacioacuten total donde se pierde toda actividad
enzimaacutetica para todos los sustratos
De igual manera es conocido que existe en Bacillus licheniformis una
enzima racemasa de naturaleza citosoacutelica responsable de transformar el aacutecido
L-glutaacutemico en aacutecido D-glutaacutemico podriacutea entonces tambieacuten asumirse alguacuten
efecto de la presioacuten sobre la actividad de la misma Sin embargo el hecho de
que esta enzima no esteacute asociada a una membrana celular (las proteiacutenas
asociadas a membrana celular tienden a ser maacutes vulnerables a los cambios de
presioacuten por la complejidad e indispensabilidad de su estructura terciaria sobre
su funcioacuten y su anclaje) sea una enzima de un uacutenico dominio y a que
experimentalmente el contenido de aacutecido D-glutaacutemico inclusive a la maacutexima
presioacuten (241 bar) no es cero hacen suponer que la misma se encuentra
bioloacutegicamente activa bajo las condiciones de presioacuten evaluadas
Estos resultados son de suma importancia pues para aplicaciones
biomeacutedicas y farmaceacuteuticas es necesario que el γ-PGA presente un alto
contenido en aacutecido L-glutaacutemico isoacutemero que es reconocido por el organismo
humano El efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre esta composicioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 95
enantiomeacuterica constituye un descubrimiento que pueda facilitar el empleo del γ-
PGA en medicina y que puede ser clave en el disentildeo de un proceso productivo
optimizado para tal fin
711 Peso molecular del γshyPGA En lo correspondiente al peso molecular del γ-PGA se observa que el
tamantildeo del poliacutemero es grande aunque no se observa ninguna tendencia en
los datos que pueda suponer alguacuten efecto de la presioacuten sobre el peso
molecular del poliacutemero Es importante sentildealar que la columna cromatograacutefica
empleada es incapaz de resolver moleacuteculas del alto peso molecular por lo
cual aunque si bien los resultados obtenidos resulten uacutetiles a nivel
comparativo dichos resultados deben tomarse con precaucioacuten Para un mejor
anaacutelisis seriacutea necesario emplear una columna capaz de resolver altos pesos
moleculares
Es importa sentildealar ademaacutes que tal y como se comentoacute anteriormente y
como se muestra en la figura 12 se observa una reduccioacuten del peso molecular
al prolongar el tiempo de fermentacioacuten hasta las 36 horas Para el caso del
reactor AHCJ32 al prolongar el tiempo de fermentacioacuten por 18 horas maacutes se
nota una reduccioacuten en la fraccioacuten de mayor peso molecular y un incremento en
la de menor sin que haya un cambio importante en el rendimiento global Esto
podriacutea deberse a que Bacillus licheniformis ATCC9945a posee enzimas
capaces de hidrolizar el γ-PGA y emplearlo como fuente de carbono Asiacute
mismo dicha observacioacuten sentildeala que si es necesario prolongar el tiempo de
fermentacioacuten es requerido realizar ajustes pues parece ser que la prolongacioacuten
por siacute misma uacutenicamente no es garantiacutea de una mejora en el rendimiento del
proceso fermentativo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 96
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 97
10 CONCLUSIONES
De la elaboracioacuten de la presente investigacioacuten se pueden extraer las
siguientes conclusiones principales
1) El rendimiento promedio en γ-PGA para el cultivo en matraz fue
superior a los 45 gL Dicho rendimiento es el mayor que se haya
reportado hasta la fecha para Bacillus licheniformis ATCC9945a lo
que convierte a esta cepa en una de las que mejor rendimiento
maacuteximo reporta para la biosiacutentesis de dicho poliacutemero natural
2) Un mecanismo eficiente para la conservacioacuten de cultivos de Bacillus
licheniformis ATCC9945a en un estado competente de produccioacuten
de γ-PGA es el congelamiento de ceacutelulas vegetativas a una
temperatura de -80 ordmC Es importante que la absorbancia de las
muestras congeladas sea superior a 25 lo que garantiza una alta
concentracioacuten de ceacutelulas
3) Dada la naturaleza del γ-PGA y su viscosidad el aumento de su
concentracioacuten en el caldo de cultivo a lo largo del tiempo de
fermentacioacuten afecta de manera negativa la tasa de transferencia de
oxiacutegeno disminuyeacutendola paulatinamente El cambio a condiciones
anaeroacutebicas conlleva a la detencioacuten de la biosiacutentesis del γ-PGA y el
consecuente inicio de un metabolismo netamente anaeroacutebico
4) Bacillus licheniformis ATCC9945a es capaz de crecer eficientemente
a presiones de hasta 242 bar relativos no vieacutendose afectado desde
el punto de vista de viabilidad por el incremento de la variable
presioacuten de fermentacioacuten
5) La presioacuten de fermentacioacuten afecta de manera significativa la
productividad de Bacillus licheniformis ATCC9945a en γ-PGA
6) El incremento de la presioacuten de fermentacioacuten hasta los 103 bar
relativos aumenta la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo de cultivo
seis veces (de 218 gL a 1334 gL) en comparacioacuten a los
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 98
rendimientos obtenidos a presioacuten atmosfeacuterica para un periacuteodo de
proceso de 18 horas
7) A presiones de fermentacioacuten superiores a los 103 bar la
productividad decae en comparacioacuten a la obtenida a dicha presioacuten
sin embargo la misma sigue siendo superior a la obtenida a presioacuten
atmosfeacuterica para un periacuteodo de proceso de 18 horas
8) El aumento de la presioacuten probablemente incremente la tasa de
transferencia de oxiacutegeno al incrementar la concentracioacuten de
saturacioacuten del mismo en el medio de cultivo lo que genera un
gradiente de concentracioacuten que permite una mayor transferencia
9) Presiones superiores a 103 bar probablemente afecten estructuras
celulares o biomoleacuteculas tales como las membranas celulares y las
proteiacutenas (γ-PGA sintasa) lo que tiene un efecto perjudicial sobre la
biosiacutentesis de γ-PGA
10) A una temperatura de 30 ordmC y a una presioacuten de 103 bar la
intensidad de agitacioacuten oacuteptima es de 300 rpm Una magnitud de
agitacioacuten mayor produce el dantildeo celular posiblemente por un exceso
de tensioacuten cortante
11) La presioacuten de fermentacioacuten modifica la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA A presioacuten atmosfeacuterica el γ-PGA estaacute compuesto
mayoritariamente por aacutecido D-glutaacutemico A presiones entre 052 y
242 bar dicha composicioacuten se revierte siendo el aacutecido L-glutaacutemico
el isoacutemero maacutes comuacutenmente presente en el γ-PGA
12) La biosiacutentesis de γ-PGA a presioacuten constituye una forma eficiente de
producir un biopoliacutemero mayoritariamente conformado por residuos
de aacutecido L-glutaacutemico aspecto de vital importancia para su aplicacioacuten
biomeacutedica dado que es este isoacutemero del aacutecido glutaacutemico es que es
reconocido y asimilado por el organismo humano
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 99
13) Aunque la modificacioacuten de la presioacuten de fermentacioacuten nunca ha sido
una variable importante en el estudio de los rendimientos para
distintos bioprocesos la presente investigacioacuten demuestra que la
modificacioacuten de dicha variable no soacutelo permite mejorar el
rendimiento global del proceso sino que tambieacuten puede conllevar a
la modificacioacuten del producto final lo que significariacutea una nueva rama
para la investigacioacuten en el disentildeo de bioprocesos de intereacutes
industrial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 100
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 101
11 AGRADECIMIENTOS
Un agradecimiento especial al profesor Jordi Bou por brindarme la
oportunidad de trabajar a su lado en este proyecto por el seguimiento y
asesoriacutea brindada a lo largo del mismo que nos permitioacute alcanzar nuestros
planteamientos y objetivos Espero que los aportes brindados con la presente
investigacioacuten permitan un mejor desarrollo en el futuro de estas temaacuteticas tan
novedosas biopoliacutemeros y fermentaciones bajo condiciones de presioacuten
positiva
Igualmente a la Ing Alejandra Hernaacutendez por la colaboracioacuten y asistencia
brindada durante esta investigacioacuten fue un apoyo importante durante el
desarrollo de las metodologiacuteas y distintas pruebas que se requirieron a lo largo
de esta investigacioacuten
A la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el Desarrollo
(AECID) y a Casa Ameacuterica Cataluntildea que me brindaron la oportunidad de cursar
este programa de maacutester a traveacutes de su programa de extensioacuten de becas a
ciudadanos extranjeros ha sido una oportunidad de crecimiento personal y
profesional que alcanza su punto maacuteximo con la elaboracioacuten de la presente
investigacioacuten El conocimiento adquirido sin duda alguna seraacute un valioso
compantildeero en mi desempentildeo profesional futuro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 102
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 103
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Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 6
551 Escalamiento 50
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre 51
56 Determinacioacuten del valor de kLa 52
561 Matraces de cultivo 53
562 Biorreactor 53
563 Graficacioacuten 53
57 Determinacioacuten del contenido de γ‐PGA en el caldo de fermentacioacuten 54
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA en la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo 55
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano 55
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 56
5101 Preparacioacuten de la muestras 56
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual 57
511 Determinacioacuten del peso molecular del γ‐PGA 57
8 RESULTADOS 59
61 Montaje del biorreactor a presioacuten 59
62 Competencia del inoacuteculo madre 59
63 Determinacioacuten de los valores de kLa 60
631 Matraz 60
632 Biorreactor 63
64 Efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto 64
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ‐PGA mediante
GPChelliphellip 65
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γ‐PGA 66
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ‐PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a 70
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 71
69 Determinacioacuten del peso molecular del γ‐PGA 73
9 DISCUSIOacuteN 77
71 Cepa empleada 77
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente 78
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten 79
74 Tiempo de fermentacioacuten 81
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento 83
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 7
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa 84
77 Efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto 86
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γ‐PGA 87
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR 87
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la
biosiacutentesis del γ‐PGA 90
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γ‐PGA 92
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 93
711 Peso molecular del γ‐PGA 95
10 CONCLUSIONES 97
11 AGRADECIMIENTOS 101
12 BIBLIOGRAFIacuteA 103
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 8
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 9
3 GLOSARIO
Bacillus Es un geacutenero de bacterias en forma de bastoacuten y Gram positiva El
geacutenero Bacillus pertenece a la divisioacuten Firmicutes Son aerobios estrictos o
anaerobios facultativos En condiciones estresantes forman una endospora de
ubicacioacuten central Dicha forma esporulada es resistente a las altas
temperaturas y a los desinfectantes quiacutemicos corrientes
γ-PGA Aacutecido gamma-poliglutaacutemico
ATCC American Type Culture Collection coleccioacuten y depositario de microorganismos
de importancia industrial y cientiacutefica
Biorreactor Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente
bioloacutegicamente activo En algunos casos un biorreactor es un recipiente en el
que se lleva a cabo un proceso quiacutemico que involucra organismos o
sustancias bioquiacutemicamente activas derivadas de dichos organismos Este
proceso puede ser aeroacutebico o anaeroacutebico Estos biorreactores son
comuacutenmente ciliacutendricos variando en tamantildeo desde algunos mililitros hasta
metros cuacutebicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable
OTR Tasa de transferencia de oxiacutegeno
OUR Tasa de consume de oxiacutegeno por parte de un microorganismo
kL Coeficiente de transferencia maacutesica
a Aacuterea de transferencia de materia por unidad de volumen
kLa Coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 10
cA
Concentracioacuten de saturacioacuten de oxiacutegeno Maacutexima concentracioacuten de oxiacutegeno que pueda estar disuelto en una fase liacutequida perfectamente mezclada
cA Concentracioacuten de oxiacutegeno en el liacutequido o concentracioacuten real Es determinada experimentalmente haciendo uso de una sonda de oxiacutegeno disuelto
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 11
4 PREFACIO
21 Origen del proyecto
Este proyecto forma parte de una serie de estudios llevados a cabo en
el ETSEIB referentes al empleo y produccioacuten de biopoliacutemeros en Cataluntildea
Anteriormente no solo se ha investigado en torno a la produccioacuten mediante
fermentacioacuten del biopoliacutemero aacutecido poliglutaacutemico sino tambieacuten sobre la
produccioacuten de aacutecido polilaacutectico y su biodegradabilidad entre otros
Una de las principales limitantes que han encontrado los estudios
previos sobre produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico en medio liacutequido mediante
fermentacioacuten sumergida es la dificultad del escalamiento muy probablemente
debido a la reduccioacuten en la tasa de transferencia de oxiacutegeno al aumentar los
voluacutemenes de cultivo lo que conlleva a rendimientos pobres o a la generacioacuten
de un poliacutemero de bajo peso molecular Asiacute mismo la reproducibilidad de los
resultados es pobre en parte por muacuteltiples factores que fueron estudiados con
mayor detalle en este trabajo
Con el propoacutesito de dar solucioacuten a este problema el presente proyecto
plantea una forma diferente y creativa al menos no es la comuacuten en el aacutembito
microbioloacutegico de abordar la limitacioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
durante la fermentacioacuten y que podriacutea ser la responsable de la reduccioacuten en los
rendimientos Asiacute mediante la aplicacioacuten de condiciones de presioacuten positiva se
plantea una posible viacutea de mejora de los rendimientos fermentativos en la
produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico esperando que sus efectos sobre la
viabilidad microbiana sean los menores posibles
22 Motivacioacuten
En la sociedad actual existe una creciente buacutesqueda de soluciones
bioloacutegicas para los problemas que anteriormente abordaacutebamos desde una
percepcioacuten uacutenicamente quiacutemica Asiacute hoy en diacutea con el propoacutesito de garantizar
la preservacioacuten del medio ambiente reducir el impacto de la actividad humana
sobre las especies animales y vegetales y garantizar un planeta a las futuras
generaciones la palabra biopoliacutemero y bioplaacutestico se han vuelto maacutes y maacutes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 12
comunes tanto en el argot popular como en el aacutembito del conocimiento
cientiacutefico donde diacutea con diacutea son maacutes las investigaciones orientadas a este tipo
de productos de naturaleza bioloacutegica y por consiguiente biodegradable
El aacutecido poliglutaacutemico por sus caracteriacutesticas constituye un poliacutemero
natural que ofrece una amplia gama de aplicaciones industriales donde puede
ser empleado tanto como agente espesante o floculador hasta aplicaciones
maacutes novedosas relacionadas con la medicina y la farmacia
En este contexto de buacutesqueda de soluciones amigables con el ambiente
es donde surge la principal motivacioacuten para investigar sobre el aacutecido
poliglutaacutemico en particular sobre coacutemo aumentar la productividad del proceso
fermentativo a partir del cual se realiza su siacutentesis de modo que las ventajas
teoacutericas que ofrece este producto pronto esteacuten disponibles tanto para el
consumidor como para la industria Tristemente los productos biotecnoloacutegicos
casi siempre tienen como principal inconveniente la valoracioacuten econoacutemica
pues tienden a ser difiacuteciles de producir por lo que tienen altos costos
asociados o sus rendimientos son menores a los deseados para hacerlos
econoacutemicamente rentables Por este motivo las investigaciones deben
procurar al menos orientarse a ofrecer soluciones que alguacuten diacutea puedan ser
llevadas a la praacutectica o como sucede con esta investigacioacuten procurar dar
respuesta a los problemas que se enfrentan cuando se trata de llevar un
producto biotecnoloacutegico a la realidad
La importancia de la investigacioacuten biotecnoloacutegica en el campo de los
materiales radica en que en un mundo con materias primas limitadas
particularmente las fuentes foacutesiles los materiales del futuro tendraacuten un origen
maacutes bioloacutegico que mineral o extractivo por lo que la mejora de los procesos
productivos relacionados con estos productos son prioritarios para cualquier
paiacutes que desee mantenerse competitivo en el aacutembito econoacutemico y tecnoloacutegico
mundial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 13
5 INTRODUCCIOacuteN
En la actualidad el desarrollo de biomateriales constituye uno de los
principales ejes de investigacioacuten en el mundo de la ciencia Dentro de estos
biomateriales los biopoliacutemeros han logrado un particularmente alto grado de
atencioacuten especialmente en los uacuteltimos 30 antildeos debidos a sus muacuteltiples
aplicaciones industriales biomeacutedicas y farmaceacuteuticas que estaacuten aportando una
amplia gama de opciones y soluciones a problemas ambientales y en la
formulacioacuten de nuevas preparaciones biomeacutedicas y farmaceacuteuticas
Los biopoliacutemeros son materiales polimeacutericos o macromoleculares que
son sintetizados por seres vivos Debido en gran parte al precio creciente la
viabilidad declinante de las fuentes foacutesiles como materias primas asiacute como el
ritmo crecimiento de la poblacioacuten mundial han propiciado el desarrollo de
fuentes alternativas renovables capaces de suministrar las necesidades
mundiales crecientes en material de energiacutea y produccioacuten quiacutemica Esta
necesidad de nuevas fuentes alternativas ha permitido que la mirada cientiacutefica
se halle puesta sobre la diversidad microbiana que habita el planeta pues los
microorganismos siempre han demostrado ser una fuente importante de
materiales novedosos con la ventaja que en la actualidad se dispone de la
tecnologiacutea necesaria para crecer los microorganismos de manera masiva y
segura Este nuevo modelo conocido como la estrategia de las biorefineriacuteas
ha cambiado la concepcioacuten de la industria quiacutemica moderna y ha sido
empleada exitosamente en la produccioacuten convencional a granel de diversos
productos quiacutemicos como por ejemplo etanol glutamato y aacutecido ciacutetrico
En el presente la produccioacuten de poliacutemeros o monoacutemeros tales como el
13-propanediol el aacutecido polilaacutectico y los polihidroxialcanoatos ha sido uno de
los principales objetivos de mayor investigacioacuten Dentro de estos nuevos
materiales encontramos los poliaminoaacutecidos poliamidas de naturaleza
polimeacuterica cuyos constituyentes estaacuten unidos por enlaces del tipo amida El
aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) es uno de estos poliaminoaacutecidos un poliacutemero
biodegradable constituido por unidades de D- y L-aacutecido glutaacutemico y que es
producido de manera natural en algunas bacterias
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 14
El presente trabajo procura investigar sobre algunas de las condiciones
involucradas en la produccioacuten bacteriana de γ-PGA y que constituyen las
principales barreras que impiden alcanzar los rendimientos necesarios para
que la produccioacuten bioloacutegica de este poliacutemero sea viable tanto desde el punto de
vista bioloacutegico como econoacutemico
31 Objetivos
El objetivo general a partir del cual se estructura el desarrollo de la
presente investigacioacuten es
Estudiar la produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a y el efecto que tiene sobre el rendimiento y estructura del
producto factores propios de la ingenieriacutea quiacutemica como lo son la
presioacuten y la intensidad de agitacioacuten
Los objetivos especiacuteficos que se plantearon alcanzar en el siguiente
proyecto son los siguientes
Disentildear un biorreactor que permita realizar fermentaciones a presioacuten
positiva de hasta 4 bar absolutos
Describir las condiciones baacutesicas requeridas para lograr reproducibilidad
en la produccioacuten deaacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre el rendimiento de
produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico en gL por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre la composicioacuten
enantiomeacuterica y el peso molecular del aacutecido γ-poliglutaacutemico
Establecer el posible efecto de la presioacuten positiva sobre la tasa de
transferencia de oxiacutegeno en el biorreactor
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 15
6 MARCO TEOacuteRICO
41 Los poliaminoaacutecidos
Los poliaminoaacutecidos son poliamidas formadas por un uacutenico aminoaacutecido
y difieren de las proteiacutenas en muacuteltiples aspectos Las proteiacutenas son
biomoleacuteculas compuestas por una amplia gama de aminoaacutecidos mientras que
los poliaminoaacutecidos estaacuten compuestos uacutenicamente por un solo tipo de
aminoaacutecido al menos en su eje central La siacutentesis de proteiacutenas estaacute dirigida
por el ADN que controla la secuencia especiacutefica de aminoaacutecidos que termina
formando una moleacutecula de una proteiacutena en particular Por su parte los
poliaminoaacutecidos son sintetizados por una ruta metaboacutelica de los organismos
completamente distinta En enlace amida en las proteiacutenas acontece
uacutenicamente entre los grupos α-amino y α-carboxilo mientras que en los
poliaminoaacutecidos pueden verse involucradas otras cadenas laterales
funcionales como por ejemplo los grupos β- y γ-carboxiloy ε-amino(Bajaj amp
Singhal 2011)
Existen mayoritariamente tres poliaminoaacutecidos presentes en la
naturaleza el aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina En
el aacutecido γ-poliglutaacutemico los enlaces amida se forman entre el grupo α-amino y
el γ-carboxilo en el eje central La poli ε-lisina presenta monoacutemeros de lisina
unidos por los grupos α-carboxilo y ε-amino La cianoficina consiste en residuos
de aacutecido α-aspaacutertico que contienen residuos de arginina que penden unidos al
grupo β-carboxilo Las foacutermulas de dichos compuestos se presentan en la
figura 1
42 El aacutecido γshypoliglutaacutemico (γshyPGA)
El aacutecido γ-poliglutaacutemico (de ahora en adelante referido como γ-PGA) es
un poliacutemero inusual que acontece de forma natural anioacutenico soluble en agua
biodegradable comestible y que no resulta toacutexico ni para el ser humano ni para
el ambiente que en la naturaleza es producido por algunas bacterias todas
Gram-positivas una archea e inclusive en eucariotas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 16
Fue primeramente descubierto por Ivaacutenovics y colaboradores como
componente de la caacutepsula de la bacteria Bacillus anthracis despueacutes que se
liberara al medio producto tanto del proceso de autoclavado como por el
envejecimiento y lisis natural de los cultivos La comida tradicional japonesa
ldquoNattordquo estaacute constituida por una mezcla de γ-PGA y fructanos que son
producidos por la bacteria Bacillus natto (Bajaj amp Singhal 2011)
Figura 1 Foacutermula y estructura del aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina
(Fuente Feng et al 2007)
421 Propiedades quiacutemicas y bioquiacutemicas del γshyPGA
El γ-PGA es un poliacutemero polianioacutenico que puede estar compuesto
uacutenicamente por D- L- o por ambos enantioacutemeros del aacutecido glutaacutemico Como se
ha comentado ya es altamente soluble en agua El γ-PGA probablemente
pueda adoptar diferentes estructuras La estructura del γ-PGA ha sido predicha
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 17
asumiendo poliaminoaacutecidos constituidos por 10 o 25 moleacuteculas de aacutecido
glutaacutemico Este modelo teoacuterico calculado para una moleacutecula en solucioacuten
acuosa muestra que el γ-PGA consiste de una heacutelice levoacutegira estabilizada por
enlaces de hidroacutegeno intramoleculares Sin embargo otro estudio realizado a
partir de γ-PGA obtenido de Bacillus licheniformis mostroacute que la conformacioacuten
es realmente flexible y depende de la concentracioacuten de γ-PGA y el pH de la
disolucioacuten A bajas concentraciones (01 wv) y a un pH inferior a 7 el γ-PGA
adopta una conformacioacuten basada mayoritariamente en heacutelices del tipo α
mientras que la conformacioacuten tipo hojas β predomina a pH superiores pues
esta conformacioacuten permite una mejor exposicioacuten de las cargas negativas del γ-
PGA (Candelaamp Fouet 2006) Recientemente mediamente experimentos de
dicroiacutesmo circular se ha reportado una estructura desordenada (Joyce et al
2006 Candela amp Fouet 2006) pero sin detallar las condiciones de trabajo de
los experimentos en particular de pH
El peso molecular del γ-PGA parece variar seguacuten sea el organismo que
produce la moleacutecula sin embargo estas diferencias podriacutean deberse a
diferencias en torno a la degradacioacuten natural que acontece con el poliacutemero o a
los meacutetodos de purificacioacuten y anaacutelisis utilizados mismos que puedan afectar el
tamantildeo del γ-PGA Por ejemplo para el caso de Bacillus subtilis el peso
molecular del γ-PGA variacutea entre 160kDa hasta 1500 kDa las cadenas de γ-
PGA consisten entonces de coacutemo miacutenimo 1000 residuos de aacutecido glutaacutemico
Diferentes estudios enfocados en la siacutentesis microbioloacutegica de γ-PGA han
demostrado que el peso molecular de este poliacutemero es dependiente tanto de
las diversas cepas bacterianas que se empleen asiacute como de los componentes
del medio y las condiciones del medio de cultivo e inclusive de razones auacuten no
dilucidadas De alliacute que exista una gran dificultad para obtener un γ-PGA
altamente homogeacuteneo a partir de cultivos bacterianos esto en gran parte
debido a esta inestabilidad descrita asiacute como a la complejidad molecular
involucrada en su biosiacutentesis
Asiacute mismo el γ-PGA puede contener soacutelo aacutecido D-glutaacutemico soacutelo aacutecido
L-glutaacutemico o una mezcla de ambos enantioacutemeros De alliacute que los filamentos
puedan ser de aacutecido γ-poli-L-glutaacutemico (γ-PLGA) de aacutecido γ-poli-D-glutaacutemico
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 18
(γ-PDGA) o de aacutecido γ-poli-L-D-glutaacutemico (γ-PLDGA) La disposicioacuten de los
residuos en el PLGDA requiere un especial anaacutelisis ya que si bien tanto el
PLGA y el PDGA son ambos solubles en etanol cuando ambos se mezclan en
proporcioacuten equimolar precipitan en etanol Esta observacioacuten es utilizada para
demostrar que el γ-PGA producido por Bacillus licheniformis estaacute compuesto
por cadenas tanto de PLGA como de PDGA Asiacute mismo la digestioacuten con L-
glutamilhidrolasa ha demostrado que el γ-PGA de Bacillus subtilis consiste en
una mezcla de isoacutemeros PLGA y PLDGA
422 Siacutentesis microbioloacutegica de γshyPGA
Distribucioacuten en los microorganismos
Inicialmente el γ-PGA fue detectado como un componente de la pared
capsular de la altamente patogeacutenica bacteria Gram-positiva Bacillus anthracis
Posteriormente este poliacutemero seriacutea nuevamente encontrado presente alrededor
de ceacutelulas de otras bacterias Gram-positivas no patogeacutenicas particularmente
del geacutenero Bacillus Gracias a estos descubrimientos fue posible aislar a inicios
del siglo pasado una cepa de Bacillus capaz de producir grandes cantidades de
γ-PGA
Posteriormente y de manera adicional a estas bacterias formadoras de
endosporas del geacutenero Bacillus el γ-PGA fue encontrado en las eubacterias
haloacutefilas Sporosarcina halophila y Planococcus halophilus y en la
archeobacteria haloacutefila Natrialba aegyptiaca Asiacute mismo γ-PGA fue tambieacuten
detectado en cantidades significativas en nematocistos de Cnidaria (eucariota)
En la tabla 1 se presentan los principales organismos productores de γ-
PGA y algunas de las caracteriacutesticas del γ-PGA producido
Ruta de biosiacutentesis
La conversioacuten de glucosa a γ-PGA sugiere que la siacutentesis del poliacutemero
acontece durante la glicoacutelisis y el ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos (ciclo de
Krebs o del aacutecido ciacutetrico) hasta el 2-oxoglurato (α-cetoglutarato) que es un
precursor directo del aacutecido L-glutaacutemico Durante su crecimiento en un medio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 19
Tabla 1 Organismos que han sido reportados como productores de γ-PGA
ORGANISMO CONFORMACIOacuteN CONFORMACIOacuteN DEL FILAMENTO
Bacillus anthracis D D
Bacillus mesentericus D D
Bacillus licheniformis D y L D y L
Bacillus megaterium D y L D + L
Bacillus pumilus D y L ND
Bacillus subtilis D y L L y D+L
Planococcus halophilus D D
Sporosarcina halophila D D
Staphylococcus
epidermidis
D y L ND
Natrialba aegyptiaca L L
Hydra ND ND
Fuente (Candela amp Fouet 2006)
nutritivo Bacillus licheniformis expresa dos enzimas capaces de sintetizar el
aacutecido L-glutaacutemico la glutamato sintasa y la glutamato deshidrogenasa Ambas
enzimas son praacutecticamente insensibles a la inhibicioacuten por producto lo que
permite alcanzar altas concentraciones intracelulares de aacutecido L-glutaacutemico el
cual es entonces direccionado a la siacutentesis de γ-PGA Los estudios maacutes
detallados relacionados con la polimerizacioacuten del γ-PGA se han realizado con
Bacillus anthracis Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis especialmente
Bacillus licheniformis ATCC9945a lo que ha permitido la identificacioacuten de un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 20
sistema enzimaacutetico anclado a la membrada y denominado como PGA-
sintetasa Este sistema enzimaacutetico estaacute constituido por al menos tres
componentes con actividad enzimaacutetica y se presume que cataliza la siguiente
secuencia de reacciones (Troy 1973) (figura 2)
Aacutecido L-glutaacutemico + ATP ɣ-L-glutamil-AMP + PPi (a)
ɣ-L-glutamil-AMP + SH-enzima ɣ-X-glutamil-S-enzima + AMP (b)
ɣ-X-glutamil-S-enzimaɣ-D-glutamil-S-enzima (c)
ɣ-D-glutamil-S-enzima + [ɣ-D-glutamil]n[ɣ-D-glutamil]n+1 + SH-enzima (d)
Figura 2 Posible mecanismo enzimaacutetico de siacutentesis del γ-PGA (Fuente Ashiuchi 2010)
De acuerdo con este modelo solamente el aacutecido L-glutaacutemico es activado
en el paso (a) mediante fosforilacioacuten lo que significa que la biosiacutentesis del γ-
PGA requiere el suministro de energiacutea para la formacioacuten del enlace amida Maacutes
recientemente un segundo mecanismo ha sido descrito por Ashiuchi (2001) e
involucra un complejo enzimaacutetico denominado PgsBCA el cual es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico y donde la
polimerizacioacuten ocurre por un mecanismo de ligacioacuten tipo amida (figura 3)
Inicialmente se habiacutea descrito que el complejo enzimaacutetico era el responsable
de racemizar y polimerizar el aacutecido glutaacutemico sin embargo estas nuevas
evidencias parecen demostrar que el complejo enzimaacutetico involucrado en la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 21
siacutentesis de γ-PGA carece de actividad racemasa y que la formacioacuten del aacutecido
D-glutaacutemico es responsabilidad de una enzima citosoacutelica denominada aacutecido
glutaacutemico racemasa Glr que presenta una alta selectividad por el aacutecido
glutaacutemico y una mayor preferencia por el aacutecido L-glutaacutemico Un modelo de la
viacutea metaboacutelica mayoritariamente aceptada para la siacutentesis de γ-PGA se
presente en la figura 4
Figura 3 Mecanismo propuesto de biosiacutentesis del γ-PGA mediante ligacioacuten tipo amida
(Fuente Ashiuchi 2001)
Figura 4 Viacutea metaboacutelica de biosiacutentesis del γ-PGA (Fuente Buescher amp Margaritis 2007)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 22
Organizacioacuten geneacutetica
Solamente unas pocas bacterias la mayoriacutea dentro del geacutenero Bacillus
han sido reportadas como capaces de producir γ-PGA Asiacute mismo la
produccioacuten de γ-PGA no es uniforme en estos individuos inesperadamente
variacutea inclusive bajo condiciones de cultivo altamente estrictas De alliacute que la
identificacioacuten del sistema regulatorio y los genes involucrados en dicho sistema
es vital para dar solucioacuten a estos problemas de uniformidad y rendimiento El
complejo PGA-sintetasa estaacute codificado por cuatro loci que son denominados
pgs Los cuatro genes pgs son pgsB pgsC pgsAA y pgsE y se les denomina
en conjunto pgsBCA Todos estos genes son necesarios y suficientes para la
produccioacuten de γ-PGA in vivo La figura 5 muestra los elementos geneacuteticos
requeridos para la produccioacuten de γ-PGA en diferentes especies del genero
Bacillus
Figura 5 Elementos geneacuteticos necesarios para la siacutentesis de γ-PGA (Fuente Candela amp
Fouet 2006)
423 Produccioacuten fermentativa de γshyPGA
Diferentes cepas de bacterias del geacutenero Bacillus son capaces de
producir elγ-PGA ya sea como material viscoso extracelular o como
componente capsular En termino industrial estas cepas han sido las maacutes
utilizadas y por ende las maacutes estudiadas hasta el momento La mayor parte de
los estudios han estado orientados a determinar los requerimientos
nutricionales para el adecuado crecimiento celular asiacute como mejorar la
productividad de γ-PGA y la variacioacuten en la composicioacuten de su estructura en lo
referente al contenido de aacutecido L- y D-glutaacutemico Estos estudios como los
realizados por Troy (1973) Cromwicket al (1995) y Kunioka (1997) han
permitido determinar que los requerimientos nutricionales para la produccioacuten de
γ-PGA variacutean seguacuten sea la cepa que se emplea
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 23
De acuerdo a estos requerimientos nutricionales las cepas productoras
de γ-PGA se han dividido en dos grupos uno que requiere la adicioacuten de aacutecido
L-glutaacutemico al medio de cultivo para estimular la produccioacuten de γ-PGA y el
crecimiento celular y otro que no requiere de aacutecido L-glutaacutemico para la
produccioacuten de γ-PGA
Dentro de las bacterias dependientes de aacutecido L-glutaacutemico las cepas
maacutes promisorias han sido B anthracis B licheniformis ATCC9945a B subtilis
IFO3335 y B subtilis F-2-01 Por su parte dentro de las bacterias
independientes de aacutecido L-glutaacutemico encontramos mayoritariamente los caso s
de B subtilis 5E B subtilis TAM-4 y B licheniformis A35 B subtilis 5E puede
producir γ-PGA a partir de L-prolina como uacutenica fuente de carbono
complementado con una fuente de nitroacutegeno en un medio mineral B
licheniformis A35 produce γ-PGA a partir de glucosa y cloruro de amonio en
condiciones desnitrificantes y B subtilis TAM-4 produce grandes cantidades de
γ-PGA cuando crece en un medio de cultivo con una sal de amonio y azuacutecar
como fuentes de nitroacutegeno y carbono respectivamente Asiacute mismo ademaacutes de
la fuente de carbono y nitroacutegeno existen otra serie de factores tales como
fuerza ioacutenica del medio de cultivo pH del medio de cultivo aireacioacuten entre
otros que afectan en gran medida la productividad y calidad del γ-PGA
De primera impresioacuten pareciera conveniente el empleo de las cepas
independientes de aacutecido L-glutaacutemico para la produccioacuten industrial de γ-PGA
sin embargo la informacioacuten disponible en lo referente a la ruta biosinteacutetica el
mecanismo de formacioacuten del γ-PGA y los factores que afectan la productividad
es praacutecticamente nula para estas cepas A partir de los trabajos de
investigacioacuten y los estudios de aplicaciones industriales la produccioacuten de γ-
PGA se ha llevado a cabo mayoritariamente a partir de cepas dependientes de
aacutecido L-glutaacutemico
En la tabla 2 se presentan algunas de las principales cepas bacterianas
empleadas para la produccioacuten de γ-PGA los nutrientes las condiciones de
cultivo el rendimiento obtenido asiacute como los voluacutemenes de cultivo en que se
basan dichos reportes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 24
Tabla 2 Principales bacterias productoras de γ-PGA (Shih amp Van 2001)
CEPA
NUTRIENTES
CONDICIONES DE CULTIVO
RENDIMIENTO
VOLUMEN DE
TRABAJO B licheniformis ATCC9945a
Aacutecido glutaacutemico (20 gL) aacutecido ciacutetrico (12 gL) NH4Cl (7 gL)
30ordmC 4 diacuteas 17-23 gL 100 mL
B subtilis IFO 3335
Aacutecido glutaacutemico (30 gL) aacutecido ciacutetrico (20 gL)
37ordmC 2 diacuteas 10-20 gL 125 mL
B subtilis TAM-4
Fructosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 4 diacuteas 20 gL 100 mL
B licheniformis A35
Glucosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 3-5 diacuteas 8-12 gL 100 mL
B subtilis F02-1
Aacutecido glutaacutemico(70 gL) glucosa (1 gL)
30ordmC 2-3 diacuteas 50 gL 200 mL
B subtilis (natto)
Maltosa (60 gL) salsa de soya (70 gL) glutamato soacutedico (30 gL)
40 ordmC 3-4 diacuteas 35 gL 125 mL
Fuente Shih amp Van 2001
424 Produccioacuten de γshyPGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a
Generalidades de la bacteria Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis es una bacteria comuacutenmente encontrada en el
suelo y en las plumas de las aves Es gram-positiva de forma oval y mesoacutefila
Su temperatura oacuteptima de crecimiento se encuentra alrededor de los 30 ordmC
aunque es capaz de sobrevivir a temperaturas mucho mayores La temperatura
oacuteptima para la secrecioacuten de enzimas es de 37 ordmC Esta bacteria puede existir
como espora cuando las condiciones son inadecuadas o en estado vegetativo
cuando las condiciones le son maacutes favorables (Wecke et al 2006)
Bacillus licheniformis forma parte del grupo Subtilis junto con Bacillus
subtilis y Bacillus pumilus Estas bacterias son conocidas por ser
contaminantes comunes de alimentos asiacute como favorecer su descomposicioacuten
aunque no se consideran patoacutegenos de importancia para el ser humano
(Wecke et al 2006)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 25
La cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis y la siacutentesis de γ-PGA
La produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a fue
primeramente estudiada por Bovarnick en 1942 sin embargo no fue sino a
partir de 1954 cuando Thorne y colaboradores iniciaron una serie de estudios
sistemaacuteticos orientados a investigar los factores que afectan la produccioacuten de
γ-PGA lo que permitioacute determinar algunos factores y condiciones necesarios
para lograr mayores rendimientos Factores tales como presencia de ciertas
sales inorgaacutenicas aacutecido glutaacutemico aacutecido ciacutetrico glicerol y el tamantildeo del inoacuteculo
demostraron tener efectos importantes sobre el rendimiento de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a tanto en condiciones estaacuteticas como cultivos
bajo agitacioacuten Se encontroacute que los mejores rendimientos se produciacutean cuando
el microorganismo era cultivado en agitacioacuten orbital en un medio de cultivo
denominado como medio C (tabla 3) alcanzando una productividad de hasta
15 gL en un periacuteodo de 3-4 diacuteas Asiacute mismo la mayor produccioacuten de poliacutemero
soacutelo se alcanzaba cuando se empleaba agua de grifo y un lote especiacutefico de
FeCl3 Posteriormente se determinariacutea que dicho lote de FeCl3 estaba
contaminado con trazas de Mn2+ y que el agua de grifo conteniacutea cantidades
significativas de Ca2+ Posteriormente Leonard y colaboradores (1958) se
encargariacutean de comprobar la funcioacuten y concentracioacuten oacuteptima de ambos
elementos quiacutemicos mediante la elaboracioacuten de un medio de cultivo
quiacutemicamente definido tomando como base el medio C de Thorne
Tabla 3 Composicioacuten del medio de cultivo C (Thorne et al 1954)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua de grifo
Fuente Shih amp Van 2001
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 26
Leonard y colaboradores encontraron que aunque solamente se requeriacutea
de 15 x 10-7 moles por litro de Mn2+ para alcanzar el maacuteximo crecimiento
concentraciones mayores de Mn2+ mostraban un marcado efecto prolongando
la viabilidad celular y por consiguiente incrementando la productividad de γ-
PGA Un incremento de hasta 615 x 10-4 molL en la concentracioacuten de Mn2+
permitiacutea alcanzar los mayores rendimientos de γ-PGA De igual manera la
adicioacuten de 102 x 10-3 moles por litro de Ca2+ en presencia de 15 x 10-7 moles
por litro de Mn2+ permitiacutea alcanzar auacuten mayores rendimientos deγ-PGA en
comparacioacuten a los valores oacuteptimos de produccioacuten de poliacutemero obtenidos en
ausencia de este elemento El γ-PGA producido consistiacutea en un homopoliacutemero
de unidades repetidas de aacutecido D- y L-glutaacutemico con una concentracioacuten de
aacutecido D-glutaacutemico que variaba entre el 38 y el 86 seguacuten incrementaba la
concentracioacuten de Mn2+ entre 154 x 10-7 y 246 x 10-3 molL siendo esta
observacioacuten independiente de la concentracioacuten presente en el medio de cultivo
de Ca2+
Tabla 4 Composicioacuten del medio E revisado (Leonard et al 1958)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 0000026 a
042 CaCl22H2O 015 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua destilada
Fuente Shih amp Van 2001
A partir de estos resultados Leonard y colaboradores elaboraron el
medio de cultivo denominado Medio E (tabla 4) que es baacutesicamente el medio
original C exceptuando el hecho de que cantidades definidas de Mn2+ y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 27
Ca2+fueron agregadas El Ca2+ fue adicionado con el propoacutesito de asegurar
altas productividades de poliacutemero a cualquier concentracioacuten de Mn2+ que se
empleara mientras que la variacioacuten de la concentracioacuten de este uacuteltimo
elemento permitiriacutea alcanzar el contenido enantiomeacuterico deseado en el
poliacutemero tal y como se comentoacute anteriormente
La estereoquiacutemica del poliacutemero es decir el contenido enantiomeacuterico del
γ-PGA ha sido desde el inicio de las investigaciones uno de los problemas maacutes
complejos y de difiacutecil solucioacuten y de una importancia tanto fundamental como
praacutectica en lo que se refiere al estudio de la produccioacuten de γ-PGA en bacterias
A lo largo de todos estos antildeos han existido numerosas contradicciones entre
los investigadores en cuanto a si el contenido enantiomeacuterico del γ-PGA
producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a estaacute o no afectado por la
concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo Cromwick y Gross (1995)
realizaron un estudio profundo sobre los factores que influenciaban la
produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a Dicho estudio
encontroacute que el porcentaje de aacutecido L-glutaacutemico presente en el γ-PGA variaba
entre 59 y 10 cuando las concentraciones de Mn2+ variaban entre 0 y 615
μmolL asiacute mismo el rendimiento incrementaba desde los 5 hasta los 17 gL en
dicho intervalo de concentracioacuten de Mn2+
Cromwick y Gross (1995) encontraron en este mismo estudio que la
incorporacioacuten de Mn2+ al medio de cultivo es un factor criacutetico para la
conservacioacuten de la viabilidad celular durante periodos de cultivo prolongados
El nuacutemero de ceacutelulas viables se incrementaba del orden de 105 a 109 unidades
formadoras de colonias (ufc) para todas las concentraciones de Mn2+ hasta el
inicio de la fase estacionaria aproximadamente a las 24 horas Sin embargo
despueacutes de 50 horas de cultivo la viabilidad celular se veiacutea reducida
draacutesticamente para aquellas concentraciones de Mn2+ relativamente menores
(0 a 0615 μmolL) mientras que para las concentraciones mayores (338 a 615
μmolL) el nuacutemero de ceacutelulas viables se manteniacutea en el orden de 107-109
inclusive despueacutes de 140 horas de cultivo Asiacute mismo la presencia de Mn2+ en
concentraciones entre 338 y 615 μ incrementaba la utilizacioacuten de las fuentes
de carbono en gran medida cultivos que conteniacutean 615 μmolL de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 28
Mn2+utilizaban el 37 54 y 93 del aacutecido glutaacutemico el glicerol y el aacutecido
ciacutetrico respectivamente en comparacioacuten a aquellos cultivos que no
incorporaban el Mn2+ los cuales solo utilizaban el 19 10 y 17 del aacutecido
glutaacutemico el glicerol y el aacutecido ciacutetrico respectivamente
Uno de los problemas maacutes prolongados en torno a los estudios referidos
a la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC994a es el hecho de
que el microorganismo termina degenerando en una cepa incapaz de producir
γ-PGA despueacutes de cultivo repetitivo Esta inestabilidad exhibida por este
microorganismo es responsable de una gran variacioacuten de cultivo en cultivo en
lo referente a la cantidad y la cineacutetica de formacioacuten del γ-PGA Birrer y
colaboradores (1994) encontraron que el empleo de ceacutelulas vegetativas
criogeacutenicamente congeladas permitiacutea alcanzar un crecimiento y produccioacuten de
poliacutemero consistente de cultivo en cultivo Asiacute mismo y en congruencia con
otros estudios previamente realizados se encontroacute que el crecimiento celular
ocurriacutea baacutesicamente durante las primeras 24 h la mayor productividad
volumeacutetrica de γ-PGA era de 012 gmiddotL-1middoth-1 y se alcanzaba entre los diacuteas 2 y 4
el pH caiacutea de 74 a aproximadamente 5 despueacutes de 42 horas de cultivo e
incrementaba levemente a cerca de 6 despueacutes de 96 horas de cultivo el
empleo de glicerol glutamato y citrato se reduciacutea de 80 a 45 gL 18 a 10 gL y
de 12 a 1 gL respectivamente la produccioacuten de aacutecido aceacutetico hasta un nivel
maacuteximo de 45 gL asiacute como la presencia de 23-butanediol como producto
secundario entre las 42 y las 96 h El estudio del consumo de las fuentes de
carbono resulta un poco sorprendente pues demuestra unas tasas de
consumo del aacutecido ciacutetrico y de glicerol relativamente altas sin embargo para el
caso del aacutecido glutaacutemico dicha tasa de consumo fue por mucho menor y muy
lejana del agotamiento completo de dicha fuente Asiacute mismo la remocioacuten del
aacutecido L-glutaacutemico del medio de cultivo E afectaba en poca medida el
rendimiento en γ-PGA mientras que la remocioacuten de las otras fuentes (glicerol y
aacutecido ciacutetrico) disminuye de manera draacutestica la produccioacuten de γ-PGA Estos
resultados son contradictorios a los encontrados inicialmente por Thorne y
colaboradores (1954) e indica que Bacillus licheniformis ATCC9945 no requiere
de aacutecido L-glutaacutemico para alcanzar altas productividades de γ-PGA Asiacute mismo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 29
la presencia de 23-butanediol es indicador que los niveles de oxiacutegeno en el
medio de cultivo despueacutes de 42 horas son incapaces de sostener un
metabolismo 100 aeroacutebico esto no es de sorprender pues el γ-PGA es un
poliacutemero extracelular extremadamente viscoso y tasas cada vez menores de
transporte de oxiacutegeno son esperables conforme va aumentado la viscosidad en
el medio a medida que la concentracioacuten de γ-PGA se incrementa
Un trabajo de Cromwick y Gross (1996) estudioacute el efecto del pH y la
aireacioacuten sobre la productividad en γ-PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a en condiciones de fermentacioacuten por lotes El pH fue controlado en
los valores de 55 65 74 y 825 y se determinoacute su efecto sobre el crecimiento
celular la utilizacioacuten de las fuentes de carbono la productividad en γ-PGA el
peso molecular y la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA El mayor
rendimiento en γ-PGA se obtuvo a un pH de 65 (15 gL 96 horas de cultivo) y
decrecioacute significativamente en 55 y 74 Esto coincide con el hecho que el
consumo de glicerol y de aacutecido L-glutaacutemico se mantuvo invariable en funcioacuten
del pH sin embargo la mayor tasa de consumo de aacutecido ciacutetrico se observoacute a un
pH de 65 en contraste con 55 y 74 lo cual parece indicar que el metabolismo
del aacutecido ciacutetrico juega un papel importante a dicho valor de pH Previamente
Cromwick y Gross (1995) encontraron que el aacutecido ciacutetrico es efectivamente un
precursor en la produccioacuten del poliacutemero presumiblemente a traveacutes del ciclo de
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De igual manera la alteracioacuten del pH no mostroacute
ninguacuten efecto importante en cuanto al peso molecular y la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA El efecto de la aireacioacuten fue evaluado incrementando
la velocidad de agitacioacuten entre 250 y 800 rpm y la tasa de aireacioacuten entre los
05 y los 20 Lmin a un pH de 65 observaacutendose un incremento en las tasas de
crecimiento y los rendimientos de γ-PGA conforme el suministro de oxiacutegeno
incrementaba
A pesar de la intensa investigacioacuten que se ha llevado a cabo en lo
referente a la produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a el
mecanismo y las viacuteas biosinteacuteticas especiacuteficas por las cuales el poliacutemero es
producido auacuten no han logrado ser dilucidadas con total claridad a pesar de que
no se cuestione le hecho de que efectivamente acontece a traveacutes del ciclo de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 30
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De las tres fuentes de carbono presentes en el medio
de cultivo E el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido L-glutaacutemico constituyen dos sustratos
precursores para la produccioacuten de dicho poliacutemero sin embargo en lo referente
al glicerol auacuten no queda claro como este incrementa la formacioacuten de poliacutemero
maacutes allaacute del hecho de que Troy (1973) encontroacute que el complejo enzimaacutetico
PGA-sintetasa responsable de la polimerizacioacuten del aacutecido L-glutaacutemico a γ-
PGA es estimulada por la presencia de glicerol Considerando que la viacutea de
biosiacutentesis del γ-PGA efectivamente involucra el ciclo de los aacutecidos
tricarboxiacutelicos cualquier fuente de carbono no relacionada directamente como
el glicerol o la glucosa podriacutean en principio ser una fuente primaria de carbono
para el crecimiento celular y la produccioacuten de γ-PGA Efectivamente el empleo
de glucosa como principal fuente de carbono y cantidades traza de aacutecido ciacutetrico
y aacutecido L-glutaacutemico (05 gL) permitieron alcanzar un rendimiento en γ-PGA de
12 gL en cultivos de Bacillus licheniformisATCC9945a (Ko amp Gross 1998) Sin
embargo y a pesar de este hecho Du y colaboradores (1995) encontraron otra
posible explicacioacuten al incremento del rendimiento en presencia de glicerol Ellos
encontraron que en Bacillus licheniformis ATCC9945a las altas
concentraciones de glicerol en el medio de cultivo conllevan a un cambio en la
composicioacuten de los fosfoliacutepidos de la membrana celular incrementando la
proporcioacuten de los fosfoliacutepidos C120 y C101 y reduciendo la de fosfoliacutepidos
C181 y C161 lo que parece favorecer la formacioacuten de una membrana celular
menos compacta lo que conlleva a una efectiva excrecioacuten del γ-PGA fuera de
la membrana celular
En lo referente a produccioacuten a gran escala y en buacutesqueda de la
aplicacioacuten comercial del γ-PGA en grandes cantidades resulta maacutes que
evidente la necesidad de incrementar la productividad Yoon y colaboradores
(2000) desarrollaron una estrategia para la produccioacuten de γ-PGA con un alto
rendimiento mediante cultivo en lote alimentado de Bacillus licheniformis
ATCC9945a Mediante el empleo de un bioreactor de 25 L conteniendo 1 L de
medio de cultivo y bajo condiciones de pH y temperatura de 65 y 37ordmC
respectivamente un 40 de saturacioacuten de oxiacutegeno y una velocidad de
agitacioacuten de 1000 rpm lograron alcanzar una concentracioacuten maacutexima de γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 31
de 35 gL suministrando aacutecido ciacutetrico y aacutecido L-glutaacutemico a una velocidad de
alimentacioacuten de 02 mLmin (144 gh de aacutecido ciacutetrico y 24 gh de aacutecido
glutaacutemico) por un periacuteodo de 3 h despueacutes del agotamiento del aacutecido ciacutetrico
inicial lo cual aconteciacutea alrededor de las 22 h La productividad alcanzada fue
de 1 gmiddotl-1middoth-1
425 Purificacioacuten del γshyPGA
Dado que la produccioacuten del γ-PGA es mayoritariamente extracelular en
concreto en la cepa de intereacutes para el presente estudio la de Bacillus
licheniformis ATCC9945a la purificacioacuten del poliacutemero es directa y consta de
manera general de tres pasos I) la remocioacuten de las ceacutelulas mediante
centrifugacioacuten o filtracioacuten 2) la precipitacioacuten del producto del medio libre de
ceacutelulas mediante metanol etanol o 1-propanol y 3) la diaacutelisis para la remocioacuten
de impurezas de pequentildeo peso molecular
Du y colaboradores (2001) desarrollaron una estrategia eficiente para la
separacioacuten y recuperacioacuten delγ-PGA de caldos altamente viscosos Esta
consiste en dos procesos I) Separar el γ-PGA del caldo de cultivo viscoso y II)
Concentrar la solucioacuten de PGA por ultrafiltracioacuten con el propoacutesito de reducir la
cantidad de alcohol requerida en el proceso de separacioacuten Las ceacutelulas
encapsuladas con γ-PGA poseen carga negativa cerca del valor neutro de pH
esto debido a la ionizacioacuten del grupo carboxilo en las moleacuteculas de γ-PGA Esta
carga negativa en sus superficies les confiere a las ceacutelulas una alta estabilidad
en el medio de cultivo lo que dificulta la sedimentacioacuten de las ceacutelulas durante el
proceso de separacioacuten Esta alta estabilidad asiacute como la elevada viscosidad del
caldo de cultivo son los dos principales problemas que se enfrentan cuando se
trata de separar las ceacutelulas y el γ-PGA del medio de cultivo por lo cual la
reduccioacuten de ambas es vital para una eficiente recuperacioacuten del γ-PGA
Mediante la disminucioacuten del pH es posible reducir el nuacutemero de cargas
negativas sobre la superficie de las ceacutelulas lo que favorece su faacutecil agregacioacuten
y precipitacioacuten Esto permite reducir en hasta un 17 la energiacutea requerida para
una adecuada centrifugacioacuten del caldo de cultivo a un pH de 5 En lo referente
a los requerimientos de alcohol es conocido que un 75-80 del mismo es
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 32
requerido para la precipitacioacuten del γ-PGA presente en un caldo libre de ceacutelulas
a una concentracioacuten de 1-2 Dado que la cantidad de alcohol requerida
disminuye a medida que la concentracioacuten de γ-PGA aumenta es necesaria y
ventajoso sino la concentracioacuten del γ-PGA presente en el medio de cultivo libre
de ceacutelulas a lo largo del proceso de recuperacioacuten Asiacute es posible reducir en un
25 el alcohol requerido para precipitar una solucioacuten de γ-PGA que fue
concentrada de 20 gL a 60 gL mediante ultrafiltracioacuten a un pH de 5
Asiacute mismo y dada la naturaleza anioacutenica del γ-PGA es posible que el
empleo de la cromatografiacutea de intercambio ioacutenica constituya una herramienta
importante para la purificacioacuten de este poliacutemero
426 Control del peso molecular y degradacioacuten del γshyPGA
El peso molecular es una caracteriacutestica importante del γ-PGA microbiano
debido al efecto que tiene el tamantildeo molecular en las propiedades del
poliacutemero El γ-PGA producido por bacterias del geacutenero Bacillus por lo general
presenta un relativamente alto peso molecular Un poliacutemero de alto peso
molecular es uacutetil como agente espesante pero no es uacutetil para otros usos
debido a la alta viscosidad que lo vuelve difiacutecil de modificar quiacutemicamente
mediante la adicioacuten de alguacuten reactivo quiacutemico De acuerdo con el uso que se
pretenda dar es necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso
molecular por ejemplo en lo referente al empleo del γ-PGA en sistemas de
liberacioacuten de faacutermacos o en el disentildeo de faacutermacos polimeacutericos resulta
necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso para controlar el nivel de
liberacioacuten en los distintos tejidos (Shih et al 2001) Es evidente entonces que el
control del peso molecular del γ-PGA no es solamente un asunto de
importancia fundamental o teoacuterica sino de importancia praacutectica para el
desarrollo de aplicaciones comerciales para este poliacutemero Entre los meacutetodos
que se han empleado para la obtencioacuten de γ-PGA con diferentes pesos
moleculares encontramos la hidroacutelisis alcalina la degradacioacuten ultrasoacutenica la
degradacioacuten microbiana o enzimaacutetica y la alteracioacuten de la composicioacuten del
medio de cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 33
En otro estudio Birrer y colaboradores (1994) encontraron que la
variacioacuten de la fuerza ioacutenica del medio de cultivo mediante la adicioacuten de un 4
(pv) de NaCl conllevaba a la formacioacuten de un γ-PGA de un peso molecular
relativamente mayor
A la fecha existen pocos estudios sobre la biodegradacioacuten microbiana o
enzimaacutetica del γ-PGA a moleacuteculas de menor peso molecular sin embargo es
importante sentildealar que en la mayoriacutea de estudios sobre siacutentesis de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a se sugiera la posible existencia de una
enzima ldquodespolimerasardquo responsable de la descomposicioacuten del γ-PGA Lo que
inicialmente se observaba como una reduccioacuten en la viscosidad del medio de
cultivo con el tiempo o bajo ciertas condiciones demostroacute ser una enzima
poliglutamil-γ -hidrolasa responsable de la ruptura hidroliacutetica del γ-PGA en esta
cepa de Bacillus (King et al 2000) Curiosamente la enzima mostroacute ser
activada por la presencia de iones Zn2+ y Ca2+ y tener una alta afinidad por el γ-
PGA
427 Aplicaciones del γshyPGA
Dada la naturaleza del γ-PGA al ser un poliacutemero no toacutexico
biodegradable y cuya produccioacuten puede ser no tan costosa se han sugerido
gran cantidad de aplicaciones durante la uacuteltima deacutecada El γ-PGA de alto peso
molecular es decir mayor a 106 Da es el preferible en gran parte de las
aplicaciones aunque si bien existen otra serie de aplicaciones que se
presentaran a continuacioacuten y que podriacutean demandar diferentes caracteriacutesticas
Es importante destacar eso siacute que salvo las aplicaciones meacutedicas el resto
considera como indiferente la proporcioacuten de aacutecido D-glutaacutemico y de aacutecido L-
glutaacutemico presente en el γ-PGA
Alimentos
Existe una amplia gama de aplicaciones para el γ-PGA en la industria de
alimentos y sus derivados En jugos y otras bebidas el γ-PGA colabora en el
mejoramiento del sabor y su potabilidad Otra aplicacioacuten importante existe en
alimentos soacutelidos a base de harina de trigo como por ejemplo pan pasteles o
pasta donde la adicioacuten de γ-PGA ha demostrado retrasar el envejecimiento y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 34
mejorar la textura asiacute como permitir una mayor conservacioacuten de la forma Para
estas aplicaciones el γ-PGA recomendable es el de alto peso molecular
Asiacute mismo el γ-PGA ha demostrado poseer propiedades
anticongelantes propiedad que se ve incrementada conforme el tamantildeo del
poliacutemero se reduce Esto permitiriacutea emplear el γ-PGA en la conservacioacuten de
alimentos microorganismos y enzimas Debido a que las sales de este
poliacutemero tienen poco sabor por siacute mismas pueden ser empleadas en mayores
concentraciones en comparacioacuten con otros agentes anticongelantes tales como
la glucosa Aunque esta aplicacioacuten es dependiente del tipo de sal del poliacutemero
empleada es independiente de la proporcioacuten de aacutecido L- y D-glutaacutemico
presente en el poliacutemero Asiacute mismo la adicioacuten de γ-PGA en productos
alimenticios que contengan sustancias activas bioloacutegicamente como por
ejemplo carotenoides vitaminas o polifenoles incrementa la absorcioacuten de
dichas sustancias en el intestino delgado
Fertilizante
Es posible producir grandes cantidades de biomasa y γ-PGA a partir de
medios liacutequidos con estieacutercol glicerol aacutecido ciacutetrico y otras sales inorgaacutenicas
resultando un producto que funciona como un fertilizante de liberacioacuten lenta
cuando es aplicado en los campos de cultivo Dado que el γ-PGA es
particularmente inerte a la gran mayoriacutea de las proteasas la liberacioacuten de
nitroacutegeno puede verse reducida auacuten maacutes Inclusive es posible producir dicho
fertilizante mediante fermentacioacuten en fase soacutelida lo que podriacutea resultar auacuten
maacutes ventajoso en ciertos casos pues permite utilizar como co-sustrato de
fermentacioacuten productos agriacutecolas tales salvado de trigo soya o maiacutez Es
importante sentildealar que para dicha aplicacioacuten la proporcioacuten de aacutecido L- y D-
glutaacutemico presente en el poliacutemero es indiferente
Tratamiento de aguas residuales
Debido a la actividad de floculacioacuten que este poliacutemero presenta el
empleo del γ-PGA en el tratamiento de aguas residuales ha sido investigado en
muacuteltiples estudios demostrando una gran capacidad de absorcioacuten y afinidad
por el Cu2+ Adicionalmente se ha demostrado el requerimiento de iones
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 35
multivalentes tales como el Ca2+ Fe3+ y Al3+ para mejorar su actividad
floculante bajo ciertas condiciones
Asiacute mismo tambieacuten se ha empleado el γ-PGA entrecruzado mediante
radiacioacuten γ el cual ha demostrado ser eficiente en la clarificacioacuten de agua
tuacuterbida a concentraciones tan bajas como 1 mgkg
Bioplaacutesticos
La posibilidad de emplear eacutesteres de γ-PGA como plaacutestico
biodegradable tambieacuten constituye otra aplicacioacuten interesante de este poliacutemero
a pesar de que por el momento su costo es todaviacutea muy elevado como para
asegurar el eacutexito comercial Mediante la modificacioacuten de los grupos eacutester es
posible disentildear un plaacutestico que cumpla los requisitos de muacuteltiples propoacutesitos
asiacute mismo los eacutesteres de γ-PGA han demostrado ser maacutes estables a altas
temperaturas que sus respectivas sales de sodio
Hidrogeles
La formacioacuten de hidrogeles por parte de γ-PGA con o sin la adicioacuten de
poliacutemeros adicionales da origen a una amplia gama de novedosas
aplicaciones ya que las propiedades fiacutesicas del gel pueden ser controladas
para cumplir una amplia variedad de necesidades
Mediante irradiacioacuten γ de 19 kGy es posible generar un hidrogel a base
de γ-PGA con un contenido especiacutefico de agua de 3500 Esto constituye un
meacutetodo conveniente y sencillo para gelificar el γ-PGA sin necesidad de
poliacutemeros o entrecruzadores
Los hidrogeles pueden ser empleados en muacuteltiples aplicaciones como en
la liberacioacuten controlada de faacutermacos el disentildeo de biosensores operaciones de
diagnoacutestico e inclusive hasta bioseparadores pueden ser obtenidos a partir de
γ-PGA y PEG-metacrilato Los hidrogeles obtenidos de esta forma poseen la
cineacutetica de liberacioacuten deseada para partiacuteculas de distinto tamantildeo tales como
pequentildeos peacuteptidos proteiacutenas o inclusive ceacutelulas completas (Bajaj amp Singhal
2011)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 36
Una manera sencilla de obtener hidrogeles de γ-PGA es a traveacutes de la
adicioacuten de peroacutexido como entrecruzador al caldo de fermentacioacuten crudo dicho
hidrogel puede emplearse como absorbente de agua en muacuteltiples aplicaciones
que incluyen agricultura horticultura y construccioacuten civil
De igual manera tambieacuten se ha demostrado que los hidrogeles pueden
ser empelados para la liberacioacuten lenta y controlada de faacutermacos en particular
aquellos formados por α-L-PGA y PEG-metacrilato Hidrogeles formados por un
72 deγ-PGA sulfonado y el resto en γ-PGA han demostrado resultados
promisorios en la liberacioacuten controlada de faacutermacos con una liberacioacuten
praacutecticamente nula a un pH de 74 sin embargo a un pH menor a 65 como el
observado en los tejidos inflamados la liberacioacuten del faacutermaco incrementaba
considerablemente
Transportador de faacutermacos
Dado a su biodegradabilidad y biocompatibilidad el γ-PGA constituye un
biopoliacutemero de particular intereacutes en el desarrollo de faacutermacos de liberacioacuten
controlada tal y como se ha sentildealado previamente Dada la presencia de
grupos carboxilo en las cadenas laterales del poliacutemero que pueden
interaccionar con los grupos funcionales presentes en otros agentes
quimioterapeacuteuticos el γ-PGA permite obtener faacutermacos maacutes solubles y faacuteciles
de administrar Inclusive el conjugado faacutermaco-γ-PGA puede ingresar a las
ceacutelulas diana e irse degradando lentamente mientras libera el agente
farmacoloacutegico y a la vez el aacutecido glutaacutemico producido durante su degradacioacuten
puede ingresar directamente al metabolismo celular o ser excretado a traveacutes
del rintildeoacuten (Bajaj amp Singhal 2011)
Uno de los conjugados maacutes prometedores y estudiados hasta el
momento ha sido con el agente anticanceriacutegeno Paclitaxel Dichos conjugados
Paclitaxel-γ-PGA han demostrado presentar un perfil farmacocineacutetico distinto
capaz de proveer una alternativa hidrosoluble a las formulaciones habituales de
este faacutermaco Tambieacuten estos conjugados han mostrado una respuesta
antitumoral marcadamente superior en comparacioacuten con el Paclitaxel soacutelo
tanto en tejidos murinos como humanos Asiacute mismo estos conjugados han
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 37
mostrado reducir la TCD50 (dosis letal media contra ceacutelulas canceriacutegenas) de
una sola irradiacioacuten de 539 Gy a 75 Gy sin afectar la respuesta radioloacutegica de
los tejidos normales sanos
Adhesivos bioloacutegicos
Los adhesivos bioloacutegicos son empleados para la adhesioacuten de tejidos
homeostasis y para el sellado de fugas de liacutequidos o aire en los tejidos durante
una cirugiacutea En la actualidad el adhesivo de mayor uso es la fibrina la cual
presenta un pobre adhesioacuten a los tejidos Un poliacutemero formado por el
entrecruzamiento del γ-PGA y gelatina ha demostrado un gran potencial para
ser empleado como adhesivo quiruacutergico y agente homeostaacutetico conservando la
capacidad de ser degradado lentamente por el cuerpo sin causar respuestas
inflamatorias severas y a la vez solidificando tan raacutepido como la fibrina pero con
una mayor adherencia a los tejidos Similares hallazgos se han obtenido con
poliacutemeros formados del entrecruzamiento de γ-PGA y colaacutegeno porcino (Bajaj
amp Singhal 2011)
Cosmeacuteticos
El γ-PGA puede ser empleado como componente de valor agregado en
la elaboracioacuten de cosmeacuteticos y productos para el cuidado personal tales como
humectantes exfoliantes y antiarrugas Dada sus propiedades quiacutemicas el γ-
PGA es homogeacuteneamente miscible asiacute como quiacutemicamente estable en la gran
mayoriacutea de los ingredientes tiacutepicamente empleados para la elaboracioacuten de
cremas faciales Asiacute mismo ciertas calidades de γ-PGA son capaces de
producir peliacuteculas suaves elaacutesticas humectantes y suaves sobre la piel Dado
que se trata de un humectante natural hidrofiacutelico formidable el γ-PGA ha
demostrado en combinacioacuten con extractos de Aloe vera promover la produccioacuten
natural de factores humectantes tales como aacutecido pirrolidona-carboxiacutelico aacutecido
laacutectico y aacutecido urocaacutenico A nivel microscoacutepico esto se explica por el hecho de
que los hidrogeles de γ-PGA son capaces de absorber hasta 5000 veces su
propio peso en humedad lo que permitiriacutea incrementar de gran manera las
propiedades humectantes de muchos productos cosmetoloacutegicos con la adicioacuten
de γ-PGA algunos electrolitos y el ajuste a un pH adecuado
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 38
Adyuvante en vacunas
El γ-PGA ha demostrado que es capaz de generar una mejor respuesta
inmune contra otros antiacutegenos presentes en una vacuna El γ-PGA de alto peso
molecular ha demostrado estimular la respuesta inmune contra antiacutegenos
virales en conejos y ratones
43 Disentildeo de procesos biotecnoloacutegicos y la transferencia de materia gasshyliquido
Cuando un microorganismo ha sido identificado como productor de un
compuesto de intereacutes existen una serie de consideraciones que deben ser
valoradas previamente antes de que un proceso productivo econoacutemicamente
viable pueda ser llevado a la praacutectica a escala industrial En aquellas
organizaciones e industrias con una soacutelida experiencia en el disentildeo y
escalamiento de procesos fermentativos los nuevos procesos son
incorporados de manera relativamente raacutepida
El desarrollo de un nuevo proceso fermentativo puede ser a groso modo
dividido en cuatro fases
La primera consiste en identificar el producto su potencial valor de
mercado su precio de venta asiacute como la vida uacutetil del mismo
La siguiente fase es seleccionar o disentildear la cepa que seraacute utilizada en
el proceso productivo y por consiguiente disentildear el proceso como tal Esto
involucra una adecuada seleccioacuten del medio de cultivo oacuteptimo y de las
condiciones idoacuteneas de proceso En este sentido la produccioacuten de γ-PGA a
partir de Bacillus licheniformis ATCC9945a ha sido fuertemente investigada en
torno a las condiciones ideales para su produccioacuten sin embargo algunos
reportes y resultados resultan ser incompletos contradictorios o discutibles Sin
embargo lo que si resulta comuacuten en todas las investigaciones en particular en
aquellas donde se han empleado voluacutemenes mayores de produccioacuten como por
ejemplo de 05 a 10 L es que la produccioacuten del γ-PGA se detiene al reducirse
la concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo problema que ha sido
abordado incrementando el caudal de oxiacutegeno yo incrementando la velocidad
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 39
de agitacioacuten sin que se reporten resultados consistentes o claros La
acumulacioacuten del γ-PGA a lo largo de la fermentacioacuten parece reducir
draacutesticamente la tasa de transferencia de oxiacutegeno lo que termina generando
condiciones anaeroacutebicas en tiempos tan cortos como 20 horas con
concentraciones de oxiacutegeno inferiores a 1 mgL
431 La transferencia de materia gasshyliacutequido
Un requisito primordial para la ocurrencia de una reaccioacuten quiacutemica
cualquiera es que los reactantes esteacuten presentes en el sitio de reaccioacuten En los
sistemas multifase los procesos de transporte son generalmente maacutes lentos
que las tasas maacuteximas de reaccioacuten intriacutenseca Este fenoacutemeno da como
resultado que las tasas de reaccioacuten reales sean menores que las que se
podriacutean esperar por efecto de la cineacutetica de reaccioacuten uacutenicamente
Los fundamentos fiacutesicos principales que determinan la transferencia de
materia son los mismos que aplican para la transferencia de calor y de
momento es decir conveccioacuten y difusioacuten
En los sistemas bioloacutegicos multifase como las fermentaciones en medio
sumergido la transferencia de masa ocurre entre dos fases una gaseosa y
otra liacutequida La mayor parte de los procesos fermentativos a gran escala con
excepcioacuten tal vez uacutenicamente de la produccioacuten de etanol y aacutecido laacutectico son
aeroacutebicos y tiacutepicamente son llevados a cabo en biorreactores aireados gas-
liacutequido En estos procesos aeroacutebicos como sucede con la produccioacuten de γ-
PGA por parte de Bacillus licheniformis ATCC9945a la transferencia de
oxiacutegeno desde la fase gaseosa a la fase liacutequida resulta vital para el eacutexito de
dicho bioproceso
En los bioprocesos aeroacutebicos el oxiacutegeno es un sustrato clave y debido
a su baja solubilidad en caldos y medios de cultivo resulta necesario su
continuo suministro La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deber ser
conocida e inclusive predicha con el propoacutesito de llevar a cabo un adecuado
disentildeo operacional del proceso y un correcto escalado de los biorreactores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 40
432 La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR)
El transporte de oxiacutegeno gas-liacutequido en los bioprocesos aeroacutebicos es el
principal proceso gas-liacutequido a considerar a la hora de disentildear un bioproceso
La solubilidad del oxiacutegeno en un medio liacutequido es baja la concentracioacuten de
saturacioacuten de oxiacutegeno es de cerca de 7-8 mgL en un proceso tiacutepico en
aireacioacuten por lo cual una transferencia de oxiacutegeno continua de la fase gaseosa
a la liacutequida es esencial para conservar un metabolismo celular completamente
oxidativo Por ejemplo unos pocos minutos sin aireacioacuten pueden impactar
severamente en la habilidad de Penicillium chrysogenum para producir
penicilina mientras que en organismos aeroacutebicos facultativos esto puede
generar cambios draacutesticos en el rendimiento y el tipo de producto generado en
condiciones de carencia de oxiacutegeno
La transferencia de oxiacutegeno desde una fase gaseosa hasta el interior de
una ceacutelula ocurre siguiendo una serie de pasos secuenciales que son
1) Difusioacuten del O2 desde la fase gaseoso a la interfase gas-liacutequido
2) Transporte a traveacutes de la interfase gas-liacutequido
3) Difusioacuten del O2 a traveacutes de una regioacuten relativamente inactiva del liacutequido
adyacente a la burbuja es decir de la interfase gas-liacutequido a la de
mezclado del liacutequido
4) Transporte del oxiacutegeno disuelto a la ceacutelula los conglomerados celulares
o al pellet de ceacutelulas inmovilizadas
5) Difusioacuten a traveacutes de la peliacutecula inactiva hasta la superficie de la ceacutelula
dentro de los conglomerados celulares o al interior del pellet de ceacutelulas
inmovilizadas
6) Transporte a traveacutes de la membrana celular
7) Transporte del O2 en el interior celular hacia el sitio de demanda
433 Descripcioacuten de la transferencia maacutesica con kLa
La tasa volumeacutetrica de transferencia de materia de un compuesto A (qtA)
en este caso oxiacutegeno (O2) puede ser descrita cuantitativamente como el
producto de un coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (kLa) y una
fuerza impulsora que consiste en la diferencia entre la concentracioacuten de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 41
saturacioacuten del compuesto (cA) y la concentracioacuten actual del compuesto en la
fase liacutequida (cA)
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (unidad s-1) el kLa
es normalmente referido como un coeficiente uacutenico pero en realidad consiste
de dos partes el coeficiente de transferencia de materia propiamente dicho (kL)
que estaacute vinculado con el flujo maacutesico (tasa de transferencia por unidad de
aacuterea) y el aacuterea de la superficie especiacutefica (a) que es el aacuterea de transferencia
por unidad de volumen
La tasa de transferencia de oxiacutegeno (referida como velocidad de
transferencia de oxiacutegeno en algunos casos) el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de materia (kLa) y la concentracioacuten de oxiacutegeno estaacuten
relacionados por la ecuacioacuten
NAa = OTR = kLa(cA- cA) (gm3s)
Noacutetese en la ecuacioacuten que para que la transferencia sea mayor interesa
tener una kLa alta pero ademaacutes (cA-cA) debe tener un valor elevado lo que
podriacutea llevar a plantear que cA sea lo menor posible Sin embargo se requiere
de una concentracioacuten miacutenima de oxiacutegeno para mantener una fermentacioacuten
aerobia Con respecto a dicha ecuacioacuten es importante sentildealar que
1) La concentracioacuten en fase liacutequida cA corresponde a la cantidad de
oxiacutegeno que hay en la fase acuosa y se determina mediante un
electrodo de oxiacutegeno disuelto Si al sistema se introduce aire a presioacuten
atmosfeacuterica dicho valor estaraacute entre los 0-10 mgL
2) La concentracioacuten de saturacioacuten cA corresponde a la solubilidad de
oxiacutegeno y es dependiente de la concentracioacuten de oxiacutegeno en la fase
gaseosa es decir de la presioacuten parcial de oxiacutegeno Una vez conocida la
presioacuten parcial de oxiacutegeno es posible calcular el valor de la solubilidad
mediante la ley de Henry En agua una forma de esta ecuacioacuten seriacutea
pAGcA = He
Donde He es la constante de Henry y cuyo valor (aproximadamente
entre 15-30 atm m3kg) es funcioacuten de la temperatura A partir de esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 42
ecuacioacuten es posible despejar el valor de cA = pAGHe El valor de He
cambia con la temperatura por ejemplo en agua pura a 25 ordmC para el
oxiacutegeno es de 2396 x 106 Pamiddotm3middotkg-1 El valor de cA es modificable si
se manipula
a) Presioacuten podemos aumentar la concentracioacuten de saturacioacuten si
aumentamos la presioacuten parcial de oxiacutegeno por ejemplo si
pasamos de 021 atm a 1 atm introduciendo al reactor oxiacutegeno
puro en vez de aire a presioacuten atmosfeacuterica lo que da por
resultado un aumento en alrededor de cinco veces su valor
Es posible tambieacuten alcanzar un mayor aumento de la
concentracioacuten de saturacioacuten si aumentamos la presioacuten
absoluta no obstante si hacemos fermentaciones con
oxiacutegeno a presioacuten resulta necesario disponer de un
fermentador capaz de resistir tales condiciones de presioacuten
resulta evidentemente maacutes costoso y tambieacuten pueden ocurrir
cambios importantes en el metabolismo de los
microorganismos que puedan afectar su crecimiento o su
rendimiento en producto
b) Temperatura la solubilidad del oxiacutegeno en agua disminuye al
aumentar la temperatura
c) Composicioacuten del liacutequido si en lugar de agua pura se tiene una
disolucioacuten como sucede con la mayoriacutea de los medios que
tiene una composicioacuten salina importante la solubilidad debe
corregirse pues dichos componentes afectan su valor y dicho
efecto estaacute influenciado tanto por los iones presentes como
por los componentes orgaacutenicos
44 Fermentaciones a presioacuten
La gran mayoriacutea de los estudios sobre fermentaciones son generalmente
llevados a cabo bajo condiciones de presioacuten ambiental maacutes allaacute del hecho de
que el fermentador por lo general suele encontrarse positivamente presurizado
Son pocos los ejemplos a excepcioacuten de la cerveza y algunos vinos donde las
fermentaciones son llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten positiva en el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 43
fermentador Esta leve presurizacioacuten suele deberse al proceso de aireacioacuten del
biorreactor debido a la formacioacuten de una presioacuten de vuelta debido a las
restricciones del respiradero de escape del fermentador
La presioacuten positiva en muchos casos puede resultar beneficiosa para los
procesos de fermentacioacuten no soacutelo por el hecho de incrementar la solubilidad del
oxiacutegeno en el caldo de cultivo sino tambieacuten porque reduce las oportunidades
de contaminacioacuten externa durante el proceso de fermentacioacuten Igualmente la
presioacuten puede tener efectos nocivos sobre los procesos fermentativos La
presioacuten tiene el efecto de influenciar las velocidades y la direccioacuten del
metabolismo de los microorganismos Esto es particularmente evidente en el
caso de productos o subproductos volaacutetiles que forman parte de distintas rutas
metaboacutelicas La presioacuten en el fermentador puede evitar la produccioacuten o
expulsioacuten de un producto gaseoso al medio circundante Este fenoacutemeno puede
tener el efecto de interferir con el equilibrio de varias reacciones bioquiacutemicas y
puede resultar en toxicidad al interior de la ceacutelula o en la divergencia de rutas
metaboacutelicas Lo significante de este impacto dependeraacute de la duracioacuten del
proceso asiacute como de la magnitud de la presioacuten a la cual se realice la
fermentacioacuten
De igual manera el efecto de la presioacuten sobre las macromoleacuteculas
guarda una gran semejanza con los efectos de la temperatura lo cual se
desprende del parecido de la forma de los diagramas de estabilidad de las
proteiacutenas y viabilidad de los microorganismos entre ambas variables
temperatura y presioacuten observacioacuten que tambieacuten permite concluir que las
proteiacutenas constituyen los primeros elementos estructurales en ser afectados
de manera negativa por el incremento de la presioacuten La presioacuten parece afectar
en mayor medida las interacciones proteiacutena-proteiacutena en comparacioacuten con la
estabilidad proteica por siacute misma por lo que es vaacutelido concluir que son estas
interacciones las primeras en verse afectadas por dicha variable La
conservacioacuten de la viabilidad en los microorganismos al ser sometidos a
presioacuten dependeraacute en gran medida de su capacidad para conservar una
membrana celular funcional aunque los mecanismos que emplean para tal fin
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 44
auacuten son desconocidos dada la vital importancia de las interacciones proteiacutena-
proteiacutena en las funciones de membrana
Lo maacutes importante es conocer con detalle como efectivamente la presioacuten
ejercida afecta el proceso de fermentacioacuten en particular la bioquiacutemica y la
fisiologiacutea del mismo de igual manera si es posible controlar la direccioacuten de la
fermentacioacuten manipulando la presioacuten o si la presioacuten estaacute generando el
desarrollo de reacciones secundarias indeseadas las respuestas a dichas
interrogantes soacutelo pueden ser dilucidadas mediante la experimentacioacuten praacutectica
del proceso fermentativo en estudio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 45
7 MATERIALES Y METODOLOGIacuteA
51 Informacioacuten de la cepa empleada
Se empleoacute la cepa Bacillus licheniformis ATCC9945a la cual se
encontraba conservada en estado vegetativo y bajo refrigeracioacuten en el
Laboratorio de Biopoliacutemeros del ETSEIB UPC Cataluntildea Con el propoacutesito de
seleccionar colonias altamente mucosas capaces de producir γ-PGA se
procedioacute a rallar la biomasa conservada en placas con Agar LB (pH 75) e
incubarlas por 24 horas a 37 ordmC Las colonias que mostraron una morfologiacutea
mucosa indicadora de la produccioacuten de γ-PGA fueron utilizadas para elaborar
los inoacuteculos empleados en las distintas fermentaciones
52 Medio de cultivo empleado
El medio de cultivo empleado para la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a fue el medio de cultivo E (Leonard et al 1958) con
algunas modificaciones seguacuten recomendado por Birrer y colaboradores (1994)
El detalle de la formulacioacuten se presenta en la tabla 5
Tabla 5 Formulacioacuten del medio de cultivo E empleado en el cultivo SmF de Bacillus
licheniformis ATCC9945a
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO43H2O 043 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 015 CaCl2 011 Glicerol 80 pH 75 Esterilizacioacuten por filtracioacuten (045 μm) Volumen 1 L
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 46
El medio de cultivo fue esterilizado por filtracioacuten (045 μm) y conservado
en refrigeracioacuten a 7 ordmC
53 Preparacioacuten de los inoacuteculos madre
Las colonias seleccionadas fueron inoculadas en matraces de 125 mL
con 25 mL de medio de cultivo E y cultivadas a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica
con varilla imantada a 650 rpm por 12 horas El caldo resultante fue
centrifugado a 8000 rpm por 25 minutos la biomasa recuperada fue
resuspendida en 10 mL de medio de cultivo E y 10 mL de una solucioacuten de
glicerol al 20 Dicha solucioacuten fue distribuida en voluacutemenes de 1 mL en tubos
eppendorf y congeladas a -80 ordmC
Posteriormente uno de estos tubos eppendorf fue empleado para
inocular matraces de 500 mL conteniendo 125 mL de medio de cultivo y fueron
cultivados a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica con varilla imantada a 650 rpm por
14 horas El caldo resultante fue centrifugado nuevamente a 8000 rpm por 25
minutos se recuperoacute la biomasa precipitada y se resuspendioacute en 25 mL de
medio de cultivo E y 25 mL de una solucioacuten de glicerol al 20 Dicha solucioacuten
fue distribuida en voluacutemenes de 2 mL en tubos eppendorf y posteriormente
fueron congelados a -80 ordmC Cada uno de estos eppendorf constituiacutea un inoacuteculo
de origen para una fermentacioacuten individual La absorbancia promedio de estos
inoacuteculos se encontraba cercana a 25
531 Conservacioacuten de la cepa en estado productivo
Los inoacuteculos deben conservarse en todo momento bajo congelacioacuten a
una temperatura inferior a -15 ordmC siendo preferible conservarlos a -80 ordmC La
condicioacuten de produccioacuten de γ-PGA es extremadamente fraacutegil y cambios de
temperatura o descongelamiento pueden conllevar la peacuterdida de dicha
capacidad La reutilizacioacuten de biomasa residual de fermentaciones previas
queda descartada
54 Montaje del biorreactor a presioacuten
En la actualidad los principales fabricantes de biorreactores para la
industria biotecnoloacutegica carecen de equipos de fermentacioacuten a escala
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 47
laboratorio que puedan operar bajo condiciones de presioacuten superiores a los 01
bares relativos Por este motivo se debioacute modificar un reactor quiacutemico a
presioacuten de modo tal que pudiese cumplir los requisitos necesarios para el
cultivo de microorganismos El modelo empleado fue el reactor quiacutemico a
presioacuten modelo 6425-214 de la casa AceGlass (Estados Unidos) de un
volumen total de 2 L Este reactor tiene la capacidad de operar hasta 35 psig
(241 bares relativos) a una temperatura de 100 ordmC y a una agitacioacuten de 300
rpm El mismo seguacuten su disentildeo original se presenta en la figura 6
Figura 6 Reactor quiacutemico a presioacuten modelo 6425-214 de AceGlass Co
Las dimensiones del frasco del reactor de forma ciliacutendrica y fondo
redondeado son las siguientes
Diaacutemetro de boca 95 mm
Diaacutemetro maacuteximo 120 mm
Profundidad 180 mm
Con el propoacutesito de adecuarlo al cultivo de microorganismos el reactor
fue ligeramente modificado en algunos de sus componentes y su distribucioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 48
Entre los principales cambios realizados al sistema se encuentran los
siguientes
1) Incorporacioacuten de una turbina de disco tipo Rushton al tratarse de una
fermentacioacuten aeroacutebica es necesario garantizar una adecuada aireacioacuten
del medio de cultivo mediante agitacioacuten efectiva La paleta de agitacioacuten
original del sistema no cumpliacutea con dicho requisito por lo cual se cambioacute
la misma por una turbina tipo Rushton cuyas dimensiones se muestran
en la figura 7
Dimensiones
A = 75 mm
B = 18 mm
C = 1mm
D = 20 mm
Figura 7 Dimensiones de la turbina tipo Rushton empleada
Esta turbina se encuentra en posicioacuten central a 3 cm del fondo del
reactor y a 6 mm de los deflectores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 49
2) Incorporacioacuten de deflectores se incorporaron dos laacuteminas deflectoras de
disentildeo propio de1 mm de ancho en una posicioacuten de 90 grados con
respecto a la superficie del reactor con el propoacutesito de reducir la
formacioacuten de voacutertice promover una agitacioacuten turbulenta y una mayor
formacioacuten de burbujas La geometriacutea de las laacuteminas deflectoras se
detalla en la Figura 8
Dimensiones
Ancho de laacutemina = 10 mm
Diaacutemetro = 95 mm
Longitud de laacutemina = 200 mm
Figura 8 Geometriacutea de las laacuteminas deflectoras
3) Cambio del motor de agitacioacuten se incorporoacute un motor IKA RW20 con
capacidad de hasta 2000 rpm en sustitucioacuten del motor original con que
A
B
C
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 50
disponiacutea el equipo (el sistema original trae un motor limitado a una
velocidad de agitacioacuten maacutexima de 330 rpm) con el propoacutesito de variar la
agitacioacuten del sistema y observar su efecto sobre el crecimiento y la
produccioacuten de poliacutemero
4) Reubicacioacuten de la vaacutelvula de seguridad de sobrepresioacuten con el
propoacutesito de garantizar una mayor seguridad del equipo maximizar la
vida uacutetil del cilindro de aire comprimido y evitar la sobrepresioacuten que
pueden generar el crecimiento del microorganismo (su metabolismo
puede liberar compuestos gaseosos o volaacutetiles) se trasladoacute la vaacutelvula de
seguridad del equipo de la tuberiacutea de llenado a la tapa del reactor
5) Eliminacioacuten de componentes dado que no resultaban uacutetiles para la
presente investigacioacuten se prescindioacute de instalar en la tapa del equipo el
condensado y el embudo de adicioacuten El disco de ruptura de la tuberiacutea de
llenado fue sustituido por una vaacutelvula de apertura manual con el
propoacutesito de permitir un mejor y maacutes raacutepido ajuste de la presioacuten durante
el establecimiento inicial de las condiciones de fermentacioacuten
55 Condiciones de fermentacioacuten
El detalle de las condiciones de temperatura presioacuten pH y agitacioacuten en
las cuales fueron establecidas las distintas fermentaciones asiacute como la
metodologiacutea de escalamiento empleada se presentan a continuacioacuten
551 Escalamiento
Inicialmente se procediacutea a inocular por duplicado 100 mL de medio de
cultivo con uno de los inoacuteculos madre (2 mL de ceacutelulas de Bacillus licheniformis
ATCC9945a conservados en tubos eppendorf a -20 ordmC) en matraces con
deflectores de 500 mL de capacidad A dichos matraces se les incorporaba una
pastilla de agitacioacuten magneacutetica de 25 cm de longitud y 07 cm de diaacutemetro y
eran colocados en agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm (agitador IKA C-MAG HS7)
por 8 horas a una temperatura aproximada de 30 ordmC
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 51
Posteriormente uno de los matraces (100 mL de cultivo) anteriormente
establecidos era utilizado para inocular 500 mL de medio de cultivo en el
biorreactor a presioacuten manteniendo una temperatura constante de 30 ordmC
aproximadamente Distintas presiones velocidades de agitacioacuten y densidades
oacutepticas del inoacuteculo fueron evaluadas El detalle del disentildeo experimental de
dichas pruebas se presenta a continuacioacuten en la tabla6
Tabla 6 Diferentes condiciones de presioacuten relativa agitacioacuten y absorbancia evaluadas en las
fermentaciones en biorreactor
CONDICIOacuteN
VALORES EVALUADOS
SOBREPRESIOacuteN
Agitacioacuten 300 rpm
Absorbancia del inoacuteculo 120
O bar (0 psig)
052 bar (75 psig)
103 bar (15 psig)
172 bar (25 psig)
241 bar (35 psig)
AGITACIOacuteN
Sobrepresioacuten 103 bar (15 psig)
Absorbancia del inoacuteculo 120
300 rpm
400 rpm
500 rpm
650 rpm
El tiempo de fermentacioacuten para cada uno de los ensayos evaluados fue
de 18 horas tiempo en el que el pH habiacutea descendido a un valor cercano pero
auacuten superior a 6 No se realizoacute ajuste alguno del pH a lo largo de la
fermentacioacuten Posteriormente se procediacutea a centrifugar el caldo de
fermentacioacuten a 8000 rpm por 25 minutos el sobrenadante recuperado era
almacenado para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA presente en
el mismo
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre
Con el propoacutesito de garantizar que el inoacuteculo madre era apto para la
produccioacuten de γ-PGA uno de los matraces inicialmente establecidos era
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 52
conservado bajo agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm y a 30 ordmC durante las 18 horas
que requeriacutea la fermentacioacuten en el biorreactor Posteriormente se determinaba
cualitativamente la produccioacuten de γ-PGA seguacuten la simbologiacutea que se presenta
en la tabla 7
Tabla 7 Simbologiacutea empleada para la medicioacuten cualitativa de la produccioacuten de γ-PGA en los
matraces de control
SIacuteMBOLO OBSERVACIOacuteN CUALITATIVA
- No produccioacuten de γ-PGA
+ Produccioacuten de γ-PGA
+++ Elevada produccioacuten de γ-PGA
56 Determinacioacuten del valor de kLa
Para la determinacioacuten del valor aproximado de kLa tanto en los
matraces coacutemo en el biorreactor se empleoacute el meacutetodo estaacutetico sin operacioacuten
del cultivo celular Dicho valor no fue determinado bajo condiciones de presioacuten
pues se careciacutea con la instrumentacioacuten adecuada sino soacutelo a presioacuten
atmosfeacuterica para ambos casos matraz y biorreactor
Este meacutetodo consiste en disminuir la concentracioacuten de oxiacutegeno hasta
una concentracioacuten de 1-25 mgL despueacutes el sistema es retornado a aireacioacuten
yo agitacioacuten y se mide como va aumentando la concentracioacuten de oxiacutegeno en la
fase liacutequida conforme transcurre el tiempo El objetivo es por tanto disminuir la
concentracioacuten de cA0 lo suficiente como para tener un cambio importante
obteniendo asiacute una curva de ascenso de las concentraciones de oxiacutegeno en el
tiempo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 53
561 Matraces de cultivo
A un matraz de cultivo en reposo conteniendo 100 mL de medio de
cultivo E se le agregoacute 001 g de sulfito de sodio (Na2SO3) y una punta de
espaacutetula de cloruro de cobalto (actuacutea como catalizador) y se agita
manualmente por 20 s Posteriormente se introdujo la sonda de oxiacutegeno
disuelto del medidor Hanna Oxi-check y se dejoacute descender el nivel de oxiacutegeno
disuelto hasta el valor miacutenimo posible entre 20-25 mgL Seguidamente se
activoacute la agitacioacuten magneacutetica y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto cada 10
segundos hasta alcanzar un punto maacuteximo que se repitiese al menos durante
2 minutos
562 Biorreactor
Se procedioacute a llenar el reactor con 600 mL de medio de cultivo y en
estado de reposo se le agregoacute 006 g de sulfito de sodio una punta de espaacutetula
de cloruro de cobalto y se agitoacute suavemente a 100 rpm por 20 segundos
Haciendo uso de la sonda de oxiacutegeno se determinoacute el menor nivel posible de
oxiacutegeno disuelto alrededor de 15-20 mgL Posteriormente se encendioacute la
agitacioacuten mecaacutenica a 300 rpm y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto en
intervalos de 10 segundos hasta alcanzar un valor maacuteximo de oxiacutegeno disuelto
sostenido en el tiempo es decir que se repitiese por al menos un minuto
563 Graficacioacuten
Con el propoacutesito de determinar el valor de kla a partir de la ecuacioacuten de
balance de oxiacutegeno
V(dCAdt) = VkLa(cA-cA)
Se tiene que integrando dicha ecuacioacuten con la concentracioacuten inicial cA0
se obtiene
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 54
Representado ln((cA - cA0)(c
A- cA)) contra el tiempo t se obtiene una
recta cuya pendiente es el valor de kLa
57 Determinacioacuten del contenido de γshyPGA en el caldo de fermentacioacuten
Con el propoacutesito de determinar la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo
post-fermentacioacuten se utilizoacute la teacutecnica analiacutetica llamada cromatografiacutea liacutequida
de alta eficiencia conocida normalmente por sus siglas en ingleacutes HPLC
especiacuteficamente la conocida como cromatografiacutea de permeacioacuten en gel (GPC)
uno de los tipos de cromatografiacutea de exclusioacuten molecular (SEC) maacutes
empleados en la separacioacuten de poliacutemeros
El equipo empleado fue el cromatoacutegrafo modelo 1260 Infinity de Agilent
Technologies La columna de separacioacuten empleada fue una columna PL
aquagel-OH de 8μm para cromatografiacutea GPC en fase acuosa El meacutetodo de
cromatografiacutea empleado consistioacute en eludir 25 μL de la muestra haciendo uso
de una solucioacuten tampoacuten fosfato 005 molL con un tiempo de elucioacuten de 15 min
por muestra El caudal de flujo del eluyente fue de 08 mLmin La deteccioacuten se
llevoacute a cabo a traveacutes de un detector de absorbancia UV-vis de longitud de onda
variable (VWD) a una longitud de onda de 220 nm y tambieacuten un detector de
iacutendice de refraccioacuten (RID) con polaridad positiva y una temperatura de la
unidad oacuteptica de 35 ordmC aunque los resultados reportados y empleados fueron
los obtenidos con el detector VWD El tiempo de retencioacuten de la fraccioacuten
polimeacuterica correspondiente al γ-PGA se encontroacute entre los 65 y los 90
minutos considerando el hecho de que el mismo se trata de una mezcla de
moleacuteculas polimeacutericas de distinta longitud y por ende distinto peso molecular
Para poder cuantificar la cantidad de poliacutemero presente en la muestra se
elaboroacute una curva de calibracioacuten inicial Se prepararon soluciones en agua
destilada de γ-PGA a concentraciones de 10 5 2 1 y 05 gL Las mismas
fueron analizadas mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva para el
pico correspondiente al γ-PGA para cada concentracioacuten Dichos valores fueron
empleados para la elaboracioacuten de la curva de calibracioacuten inicial del equipo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 55
Las muestras a analizar fueron preparadas de la siguiente manera 400
μL del caldo crudo se diluyeron en agua destilada hasta un volumen final de 2
mL (dilucioacuten 5x) y posteriormente fueron filtradas mediante jeringa haciendo
uso de filtros de 045 μm en viales de HPLC Las muestras fueron analizadas
mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva del pico correspondiente al
γ-PGA para cada una de las muestras
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
Con el propoacutesito de determinar el efecto del contenido de γ-PGA sobre la
solubilidad maacutexima de oxiacutegeno en el medio de cultivo en condiciones estaacuteticas
es decir sin crecimiento microbiano (consumo de oxiacutegeno de los
microorganismos nulo) se procedioacute a preparar soluciones de 100 mL de
volumen a concentraciones crecientes de poliacutemero (poliacutemero + biomasa) en
medio de cultivo y medir el nivel de oxiacutegeno disuelto en mgL haciendo uso de
un medidor de oxiacutegeno disuelto Hanna Oxi-check Dichas soluciones fueron
evaluadas en las mismas condiciones de fermentacioacuten empleadas en la
primera etapa de escalamiento matraces de 500 mL con deflectores y a una
agitacioacuten magneacutetica de 650 rpm Se evaluaron concentraciones de biopoliacutemero
de 0 7 14 21 36 54 y 71 gL
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano
Para determinar el crecimiento bacteriano se aprovechoacute el efecto que
dicho crecimiento genera sobre la turbidez del caldo a lo largo de la
fermentacioacuten Por ello se empleoacute la teacutecnica de espectrofotometriacutea
determinando la absorbancia del medio de cultivo inoculado y su incremento
con el tiempo Se empleoacute el coloriacutemetro modelo ZUSI 4200A a una longitud de
onda de 660 nm El equipo era inicialmente calibrado en 0 haciendo uso de
agua destilada acto seguido se determinaba el valor de absorbancia de la
muestra a analizar
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 56
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producido se determinoacute
mediante el meacutetodo desarrollado por Marfey (1984) para la determinacioacuten
cuantitativa de la composicioacuten enantiomeacuterica de aminoaacutecidos Dicho meacutetodo se
basa en la reaccioacuten del aacutecido glutaacutemico con el reactivo de Marfey (1-fluoro-24-
dinitrofenil-5-L-alanina) Dicho compuesto es oacutepticamente activo por lo que al
reaccionar con los enantioacutemeros D- y L- del aacutecido glutaacutemico forma dos
diasteroisoacutemeros que pueden separarse mediante cromatografiacutea HPLC con
tiempos de retencioacuten para el isoacutemero L- y el D- de 675 y 100 minutos
aproximadamente Para poder cuantificar la composicioacuten de manera efectiva
se realizoacute un calibrado previo con mezclas de concentracioacuten conocida de cada
isoacutemero
5101 Preparacioacuten de la muestras
Se introdujo 3 mg del γ-PGA a analizar en viales de 5 mL y se les
adicionoacute 2 mL de HCl 6 molL Se dejaron calentar a 100 ordmC en estufa por un
periacuteodo de 24 horas Posteriormente se trasfirioacute 100 μL de cada una de las
muestras a tubos eppendorf y se dejaron en desecador al vaciacuteo por un periacuteodo
de tres diacuteas empleando NaOH como desecante Seguidamente se disolvioacute los
productos en 100 μL de agua y se hicieron reaccionar con 200 μL de una
disolucioacuten con concentracioacuten de 5 mgmL de reactivo de Marfey en acetona con
20 μL de carbonato aacutecido de sodio (NaHCO3) durante una hora en estufa a 37
ordmC Al finalizar se neutralizoacute como 10 μL de HCl 2 molL y se dejoacute secar al vaciacuteo
por 3 diacuteas en el desecador a vaciacuteo con NaOH como desecante Finalmente se
diluyoacute la muestra en 350 μL de dimetilsulfoacutexido (DMSO) para cromatografiarla
por HPLC
La cromatografiacutea se llevoacute a cabo en el mismo equipo empleado para la
determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA pero con los siguientes cambios
1) Se empleoacute una columna de fase estacionaria reversa Spherisorb ODS2
de 5 μm de poro 25 cm de longitud y 046 cm de diaacutemetro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 57
2) El caudal de flujo del eluyente fue de 15 mLmin
3) El detector de longitud de onda variable (VWD) operaba a 340 nm y el
tiempo de elucioacuten era de 25 minutos
4) El eluyente empleado era una mezcla 8020 de fosfato de trietilamonio
50 mmolL a pH 3 y acetonitrilo El fosfato de trietilamonio se obteniacutea
haciendo reaccionar cantidades equimolares de trietilamina y aacutecido
fosfoacuterico
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual
La composicioacuten porcentual enantiomeacuterica del γ-PGA es decir el
contenido porcentual de aacutecido D- y L-glutaacutemico se determinoacute mediante
contraste de las aacutereas obtenidas en el cromatograma para cada uno de los
picos correspondientes a cada diasteroisoacutemero con el aacuterea total
correspondiente a los productos de reaccioacuten (sumatoria de ambos
diasteroisoacutemeros) La composicioacuten se reportoacute como un porcentaje de aacutecido D-
glutaacutemico y aacutecido L-glutaacutemico presente en la muestra analizada
511 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA Para la determinacioacuten del peso molecular del poliacutemero se procedioacute a
analizar los cromatogramas obtenidos para el caacutelculo de la concentracioacuten de γ-
PGA Se empleoacute el programa informaacutetico ChemStation for LC Systemsreg de
Agilent Technologies Dicho programa posee unas potentes herramientas de
anaacutelisis que permiten automaacuteticamente calcular el peso molecular de un
compuesto Para las muestras analizadas se determinoacute el peso molecular
promedio en nuacutemero (Mn) el peso molecular promedio en peso (Mw) la
polidispersidad y el peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) La recta de
calibrado fue obtenida previamente por Bou y colaboradores con estaacutendares de
polioacutexido de etileno (PEO)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 58
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 59
8 RESULTADOS
61 Montaje del biorreactor a presioacuten
El detalle final del biorreactor empleado puede observarse en la figura 8
Noacutetese que la temperatura es controlada por la accioacuten de una manta teacutermica
externa como sucede con el disentildeo original del reactor y no por el empleo de
un serpentiacuten interno caso de la gran mayoriacutea de biorreactores comerciales a
escala laboratorio El mismo permite operar en condiciones de agitacioacuten de 100
a 650 rpm y a presiones de hasta 24 bar de sobrepresioacuten (35 psig) El
biorreactor resultoacute apto para el crecimiento microbiano alcanzaacutendose valores
de absorbancia de hasta 37 similares a los observados en cultivos en
matraces
Figura 9 Biorreactor empleado para la produccioacuten de γ-PGA bajo presioacuten
62 Competencia del inoacuteculo madre
Mediante la metodologiacutea descrita previamente para la preparacioacuten del
inoacuteculo madre fue posible alcanzar en el 100 de los cultivos de control la
produccioacuten de γ-PGA en alta cantidad Aunque dichos resultados no se
muestran el empleo de inoacuteculos de otra naturaleza como reutilizacioacuten de
biomasa o inoacuteculos conservados a temperaturas superiores a -20 ordmC mostraron
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 60
ser ineficaces y poco reproducibles en cuanto a la produccioacuten de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a Los resultados de los cultivos control
pueden observarse en el graacutefico 10 bajo el nombre de Matraz
63 Determinacioacuten de los valores de kLa
631 Matraz
En lo referente al cultivo en matraz bajo las condiciones de agitacioacuten y
temperatura empleadas y en condiciones estaacuteticas (sin crecimiento
microbiano) se encontroacute un valor de kLa de 0026 s-1 En el graacutefico 1 y 2 se
muestran la curva de concentracioacuten de oxiacutegeno en funcioacuten del tiempo al
reiniciarse el proceso de agitacioacuten asiacute como el caacutelculo de dicho valor de
coeficiente mediante regresioacuten lineal respectivamente
Graacutefico 1 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concentracioacuten m
gL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 61
Graacutefico 2 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00257x ‐ 08809Rsup2 = 09966
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
Cuando se realizoacute la misma determinacioacuten pero a una velocidad de
agitacioacuten menor (430 rpm) el valor de kLa disminuyoacute significativamente En
dicho caso el valor de kLaobtenido fue de 0017 s-1 Estos resultados se
muestran en los graacuteficos 3 y 4
Como se puede observar en dichos graacuteficos el tiempo requerido para
alcanzar el valor maacuteximo estable se incrementoacute considerablemente en 60
segundos lo que indica una menor velocidad de transferencia producto de la
reduccioacuten de la intensidad de la agitacioacuten suministrada al cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 62
Graacutefico 3 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 430 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Graacutefico 4 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00168x ‐ 07551Rsup2 = 09835
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
ln Linear (ln)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 63
632 Biorreactor
Para el caso del biorreactor el valor de kLa determinado fue de 0025 s-1
esto bajo condiciones estaacuteticas (sin crecimiento microbiano) y en las
condiciones de temperatura y operacioacuten previamente descritas
Como se puede observar dicho valor es praacutecticamente igual al obtenido
para el caso del matraz lo que indica condiciones de transferencia de oxiacutegeno
gas-liacutequido muy similares en ambos casos El valor dekLa fue determinado en
un punto lateral del reactor 2 cm por debajo del nivel de medio de cultivo y
contiguo a uno de los deflectores punto donde la transferencia de materia
debiera en principio ser mayor Dichos resultados se presentan en los graacuteficos
5 y 6
Graacutefico 5 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten mecaacutenica del medio de cultivo en biorreactor a 300 rpm
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
560
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Concentracioacuten
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 64
Graacutefico 6 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00246x ‐ 03222Rsup2 = 09902
000
050
100
150
200
250
300
0 20 40 60 80 100 120 140
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
64 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En lo referente a los niveles de oxiacutegeno a distintas concentraciones de γ-
PGA en condiciones estaacuteticas sin crecimiento microbiano se observa una
draacutestica reduccioacuten de dicho nivel conforme se incrementa la concentracioacuten del
biopoliacutemero Dicho fenoacutemeno es esperable dada la alta viscosidad del γ-PGA
La concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo alcanza un valor inicial de
74 mgL el cual se reduce draacutesticamente a 52 mgL a un valor de
concentracioacuten de γ-PGA de 14 gL Esta reduccioacuten es uacutenicamente producto de
la presencia del γ-PGA en el medio de cultivo El graacutefico 7 muestra dicho
fenoacutemeno hasta un valor miacutenimo de oxiacutegeno disuelto de 25 mgL cuando la
concentracioacuten de poliacutemero alcanza un maacuteximo 71 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 65
Graacutefico 7 Efecto de la concentracioacuten de γ-PGA sobre el nivel maacuteximo de oxiacutegeno disuelto en el
medio de cultivo E
y = ‐00569x + 64671Rsup2 = 08709
000
100
200
300
400
500
600
700
800
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Oxiacutegeno disuelto m
gL
γ‐PGA gL
Solubilidad O2 (mgL) Linear (Solubilidad O2 (mgL))
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γshyPGA mediante GPC
La curva de calibracioacuten obtenida a partir de soluciones con
concentracioacuten conocida de γ-PGA se presenta en el graacutefico 8
Como se puede observar se obtuvo un valor del coeficiente de
determinacioacuten R2 de 09983 lo que indica un ajuste lineal suficiente y un valor
del coeficiente de correlacioacuten R de 09991 lo que indica una correlacioacuten
positiva entre los datos contrastados La concentracioacuten de γ-PGA estaacute
determinada entonces por la siguiente ecuacioacuten
Concentracioacuten γ-PGA (gL) = (00027 x Aacuterea) ndash 00916
Esta curva fue posteriormente empleada para determinar la
concentracioacuten de γ-PGA en los caldos de cultivo obtenidos despueacutes de cada
una de las fermentaciones realizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 66
Graacutefico 8 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA mediante
GPC
y = 00027x ‐ 00916Rsup2 = 09983
0
2
4
6
8
10
12
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Concentracioacuten gL
Aacuterea
Series1 Linear (Series1)
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γshyPGA
En lo referente al efecto de la presioacuten (relativa) sobre la productividad en
γ-PGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a se encontroacute un incremento de los
rendimientos fermentativos conforme se incrementaba la presioacuten hasta
alcanzar un valor maacuteximo de sobrepresioacuten de 103 bar (15 psig) una vez
superado dicho umbral la productividad se veiacutea reducida draacutesticamente A 103
bar la productividad en γ-PGA alcanzaba un valor de 1334 gL productividad
mayor a la obtenida en condiciones de aireacioacuten (2 Lmin) a presioacuten
atmosfeacuterica la cual fue de 508 gL Esta productividad maacutexima contrasta con
la obtenida a presioacuten atmosfeacuterica la cual fue miacutenima con un valor de 217 gL
Los graacuteficos 9 y 10 muestran los resultados anteriormente comentados Asiacute
mismo en la tabla 8 se presentan la totalidad de fermentaciones llevadas a
cabo las productividades obtenidas y el promedio de cada condicioacuten Es
importante destacar que cada condicioacuten de presioacuten fue evaluada por duplicado
no encontraacutendose diferencias importantes entre los resultados obtenidos para
ninguno de los casos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 67
Graacutefico 9 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748
617
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 05 1 15 2 25
PGGA (gL)
Presioacuten (bar)
RENDIMIENTO gL
Graacutefico 10 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten y la aireacioacuten a presioacuten atmosfeacuterica (0 relativa)
sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748617 508
4582
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
0 052 103 172 241 0 +Aireacioacuten
Matraz
Concentracioacuten γ‐PGA gL
Presioacuten
RENDIMIENTO gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 68
Tabla 8 Fermentaciones realizadas y concentraciones de γ-PGA obtenidas
Reactor Condiciones A D C (gL)AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10108 5 130
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10926 5 141
AHJC11 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 11753 5 152
AHJC11 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10186 5 131
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 95011 5 122
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 97936 5 126
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28706 3 20
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28194 3 20
AHJC14 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 33184 3 24
AHJC14 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 32866 3 23
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 68396 3 52
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 65871 3 50
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43692 5 54
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 46235 5 57
AHJC16 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 49809 5 62
AHJC16 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 58872 5 74
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 57321 5 72
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43021 5 53
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 57727 5 72
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 62398 5 78
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 60469 5 76
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 58335 5 73
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 6083 5 76
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 57897 5 72
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 51267 5 64
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 48407 5 60
= nuacutemero de muestra A = aacuterea D = dilucioacuten C = concentracioacuten y bar = bar relativo
Algunos de los cromatogramas realizados se muestran en las figuras 10
y 11 Como se puede observar la forma del pico de elucioacuten demuestra que el
biopoliacutemero estaacute compuesto por moleacuteculas de distinta longitud por lo cual
existen diferentes pesos moleculares Es importante destacar que para la gran
mayoriacutea de las fermentaciones realizadas el pico siempre presentoacute su maacutexima
altura al inicio lo que demuestra que la mayor parte de eacutel se trataba de un
poliacutemero de alto peso molecular Igualmente esto podriacutea indicar poca
degradacioacuten del biopoliacutemero durante las 18 horas de fermentacioacuten lo cual es
importante dada la capacidad de Bacillus licheniformis ATCC9945a de
hidrolizar enzimaacuteticamente el γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 69
Figura 10 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA analizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 70
Figura 11 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA (052-103-172 y 241 bar relativas)
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γshyPGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a
En lo referente al efecto de la intensidad de agitacioacuten en rpm sobre la
produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a a una presioacuten de
103 bar relativos (15 psig) se encontroacute un efecto negativo del aumento de la
agitacioacuten por encima de las 300 rpm lo que se demuestra con una importante
reduccioacuten en la concentracioacuten final de γ-PGA obtenida despueacutes de 18 horas de
fermentacioacuten Estos resultados se presentan en el graacutefico 11 Como se puede
observar una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm llega a ser tan perjudicial
para el microorganismo que la productividad en γ-PGA cae por debajo del valor
de 1 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 71
Graacutefico 11 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis
ATCC9945a a 103 bar (15 psig) a 30 ordmC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
300 350 400 450 500 550 600 650 700
Concentracioacuten gL
Agitacioacuten rpm
RENDIMIENTO (gL)
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica resultoacute afectada por las condiciones de
presioacuten Como demuestra el graacutefico 12 la proporcioacuten de aacutecido L-glutaacutemico en
las muestras correspondientes a fermentaciones bajo presioacuten resultoacute ser por
mucho mayor a las observadas en los cultivos control tanto en comparacioacuten
con el de matraz como con el sometido a aireacioacuten
La respectiva curva de calibracioacuten con las muestras conformadas por
mezclas con composicioacuten definida de ambos enantioacutemeros se presente en el
graacutefico 13 Como se puede observar los valores teoacutericos y los valores
experimentales obtenidos en el cromatograma coinciden en buena medida lo
que indica la validez de esta teacutecnica para la determinacioacuten de la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA
En dos casos para las fermentaciones llevada a cabo a 052 bar y 172
bar de sobrepresioacuten (75 y 25 psig respectivamente) la proporcioacuten de aacutecido D-
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 72
glutaacutemico fue de cero en contraste con el control en matraz donde dicha forma
del aacutecido glutaacutemico estaba presente mayoritariamente en un 87
De igual manera en lo que concierne a la fermentacioacuten llevada a cabo a
presioacuten atmosfeacuterica y bajo condiciones de aireacioacuten se observa tambieacuten que el
enantioacutemero mayoritariamente presente es el aacutecido D-glutaacutemico con un 83
en contraste con el aacutecido L-glutaacutemico con apenas un 17 Todas las
fermentaciones llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten presentan un
contenido de aacutecido L-glutaacutemico superior al 83
Aunque no fue posible encontrar una correlacioacuten directa entre la presioacuten
y la composicioacuten porcentual en aacutecido D-glutaacutemico si es posible observar como
las condiciones de presioacuten parecen limitar condicionar o disminuir la presencia
de esta forma del aacutecido glutaacutemico en el γ-PGA
Graacutefico 12 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica en aacutecido
L-glutaacutemico y aacutecido D-glutaacutemica del γ-PGA producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a
R11 (103bar)
R12 (103bar)
R15 (0 +aireacioacuten)
R16 (241bar)
R19 (172bar)
R22 (052bar)
MATRAZ
AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO 9518 8319 1736 10000 8347 10000 1285
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO 482 1681 8264 000 1653 000 8715
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 73
Graacutefico 13 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-
PGA mediante HPLC
000
2900
4700
7700
970010000
7100
5300
2300
300
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
100 L 75 L 25 D 50 L 50 D 25 L 75 D 100 D
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO
69 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA
Los resultados de los pesos moleculares de los poliacutemeros obtenidos en
los distintos ensayos se muestran en la tabla 9 El peso molecular promedio de
permeacioacuten (Mp) de todas las muestras se encontroacute entre los 269-307 x 107
gmol
Tabla 8 Valores de peso molecular promedio en nuacutemero (Mn) peso molecular promedio en
peso (Mw) peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) y polidispersidad (PD) delγ‐PGA
producido en los distintos ensayos evaluados
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
MATRAZ1 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 157 214 29 137
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
MATRAZ2 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 160 216 292 135
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar relativos
207 252 307 122 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 74
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
204 252 307 124 PRIMERO MAYOR
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
202 252 307 125 PRIMERO MAYOR
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
199 251 307 126 PRIMERO MAYOR
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 200 247 307 123
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 226 26 306 115
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 179 223 281 125
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 172 221 264 128
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
217 248 304 114 PRIMERO MAYOR
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
210 246 304 117 PRIMERO MAYOR
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
195 233 284 120 SEGUNDO MAYOR
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
178 225 269 126 SEGUNDO MAYOR
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
223 262 306 118 PRIMERO MAYOR
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
222 261 306 117 PRIMERO PAYOR
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
207 254 307 122 PRIMERO MAYOR
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
187 251 306 134 PRIMERO MAYOR
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
171 246 306 144 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
185 253 306 136 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
202 252 306 125 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 75
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
232 263 306 113 PRIMERO MAYOR
AHJC32-1-18HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
173 228 307 132 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-2-18HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
177 230 306 130 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-1-36HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
165 220 23 133 IGUALES
AHJC32-2-36HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
173 224 302 130 IGUALES
Los valores de polidispersidad estuvieron entre 113 y 144 Asiacute mismo
no se observan mayores diferencias entre los pesos moleculares obtenidos a
distintas presiones aunque la existencia de un segundo pico era maacutes evidente
en los cromatogramas correspondientes a γ-PGA producido en condiciones de
presioacuten relativa 0 Asiacute mismo dichas muestras presentan un peso molecular
levemente menor aunque dicha tendencia no es absoluta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 76
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 77
9 DISCUSIOacuteN
71 Cepa empleada
Bacillus licheniformis ATCC9945a es una cepa que ha sido empleada
con eacutexito en la produccioacuten de γ-PGA particularmente a escala laboratorio maacutes
no ha sido empleada a escala industrial donde otras cepas particularmente de
la especie Bacillus subtilis han sido las preferidas tanto por aspectos de
rendimiento como estabilidad productiva de la cepa El presente estudio
determinoacute una productividad promedio en condiciones de matraz de 4582 gL
despueacutes de 72 horas de cultivo Valores de productividad tan altos no habiacutean
sido reportado previamente para Bacillus licheniformis ATCC9945a donde
valores entre 17 y 23 gL de rendimiento han sido reportados por Troy (1973)
Cromwick y Gross (1996) 26 a 35 gL por Bajaj y colaboradores (2009) y 35
gL por Yoon y colaboradores (2000)
Los motivos de este mayor rendimiento aunque no son claros pueden
deberse a una mejor transferencia de oxiacutegeno en el sistema de agitacioacuten
magneacutetica en comparacioacuten con la agitacioacuten orbital estaacutendar Asiacute por ejemplo y
utilizando la ecuacioacuten simplificada para determinar en valor de kLa en agitacioacuten
orbital (Diacuteaz 2011) tenemos que a 20 ordmC
kLa = 139 x 10-3n (VTVL)084
Asiacute tenemos que para un sistema en agitacioacuten orbital a 250 rpm es decir
a una frecuencia de 417 s-1 con un volumen de medio de cultivo de 100 mL y
un volumen total del matraz 500 mL el valor de kLa es de aproximadamente
0020 s-1 inferior al valor de 0026 s-1 obtenido en el presente estudio para el
cultivo en agitacioacuten magneacutetica a 30 ordmC Dado que la difusividad disminuye al
aumentar la temperatura es de esperar que a 30 ordmC dicho valor de kLa teoacuterico
sea auacuten menor
Es importante sentildealar que en lo referente a la composicioacuten del medio de
cultivo el medio de cultivo E empleado en este estudio es el mismo empleado
previamente por otros autores para el estudio de la produccioacuten de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a por lo cual no se considera que la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 78
composicioacuten del medio de cultivo pueda ser la responsable de las diferencias
con los resultados reportados anteriormente por otros investigadores quienes
en particular tambieacuten emplearon dicho medio de cultivo en sus pruebas
Dicho valor de rendimiento promedio obtenido de 4582 gL (en matraz)
coloca a este cepa al mismo nivel de productividad de las cepas
industrialmente empleadas como sucede con Bacillus subtilis F02-1 con un
rendimiento reportado por Kubota y colaboradores (1993) de 50 gL pero con
una menor necesidad de aacutecido glutaacutemico (20 gL en contra de 80 gL) La
conveniencia del empleo de la cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis debe
entonces evaluarse entorno a su capacidad de escalamiento y conservacioacuten de
la competencia en la produccioacuten de γ-PGA y no entorno a su maacuteximo
rendimiento pues en este aspecto ha demostrado en condiciones oacuteptimas la
capacidad de producir γ-PGA en concentraciones extremadamente elevadas
Los resultados acaacute obtenidos refuerzan lo ya descrito por otros autores quienes
sentildealan precisamente estos aspectos (escalamiento y estabilidad) como los
principales retos para llevar a cabo la produccioacuten de γ-PGA mediante Bacillus
licheniformis ATCC9945a
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente
Uno de los principales problemas que se enfrentoacute a lo largo de la
presente investigacioacuten es la facilidad con la cual la cepa ATCC9945a de
Bacillus licheniformis revierte a formas incapaces de producir γ-PGA Este
fenoacutemeno puede ocurrir incluso con tan soacutelo una generacioacuten de cultivo por lo
cual el empleo de la biomasa generada en una fermentacioacuten previa es
indeseable pues seguramente no daraacute resultados positivos para la produccioacuten
de γ-PGA
Este fenoacutemeno es uno de los principales inconvenientes que se
enfrentan a la hora de evaluar el efecto de diversos paraacutemetros sobre la
productividad de γ-PGA en esta cepa pues la incapacidad de garantizar
resultados reproducibles imposibilita poder evaluar condiciones nutricionales
de agitacioacuten temperatura y demaacutes teniendo la certeza que las diferencias
encontradas solo se deberaacuten a los paraacutemetros bajo control
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 79
Cromwick y colaboradores (1994) reportaron el congelamiento con
nitroacutegeno liacutequido como una forma vaacutelida para la preservacioacuten de las ceacutelulas en
un estado consistente de alta productividad de γ-PGA En nuestro caso la
metodologiacutea empleada fue distinta Se incorporoacute el glicerol como crioprotector y
el congelamiento no se realizoacute mediante nitroacutegeno liacutequido sino que fue
congelamiento convencional utilizando un equipo de refrigeracioacuten con una
capacidad de enfriamiento de hasta -80 ordmC y voluacutemenes de inoacuteculo pequentildeos
de entre 1 y 2 mL cuyo congelamiento fuera particularmente raacutepido
Igualmente se observoacute que los cultivos que mejor comportamiento y
reproducibilidad dieron como inoacuteculo fueron aquellos cuyas ceacutelulas eran
recolectadas previo al inicio de la produccioacuten de γ-PGA Cultivos cuya edad
superaba las 10 horas y que ya presentaban presencia de γ-PGA aunque
podiacutean emplearse para la obtencioacuten de inoacuteculos madres los mismos no
resultaban tan eficientes como los anteriormente descritos
El empleo de esta metodologiacutea de conservacioacuten de la cepa permitioacute una
reproducibilidad del 100 en los ensayos obtenieacutendose poliacutemero en la
totalidad de los cultivos de control que se establecieron durante cada una de
las fermentaciones llevadas a cabo en el biorreactor Estos resultados indican
que dicha metodologiacutea es eficaz para la preservacioacuten a largo plazo de Bacillus
licheniformis ATCC9945a y como estrategia para un adecuado escalamiento
durante el proceso de produccioacuten a mayor escala De igual manera la
descripcioacuten detallada del proceso de conservacioacuten volumen de inoacuteculo
concentracioacuten de la muestra (por absorbancia) temperatura y demaacutes permite
una alta reproducibilidad del meacutetodo en contraposicioacuten con los reportes
existentes por otros autores que no brindaban mayor detalles sobre coacutemo llevar
a cabo este proceso de conservacioacuten
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten
Las fermentaciones a presiones superiores a la presioacuten atmosfeacuterica no
son habituales tanto a nivel de investigacioacuten como a nivel de proceso Dicha
afirmacioacuten queda particularmente ratificada cuando se analizan las opciones
comerciales existentes a escala laboratorio de biorreactores disentildeados para
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 80
operar a presioacuten la cual resulta praacutecticamente nula Por este motivo y para
poder llevar a cabo este estudio se requirioacute adaptar un reactor quiacutemico de
modo tal que permitiese trabajar a presioacuten y a la vez tuviese un control de
agitacioacuten y temperatura miacutenimo de modo tal que permitiese el cultivo de
microorganismos El biorreactor disentildeado fue exitoso pues permitiacutea un
crecimiento microbiano oacuteptimo y la produccioacuten de γ-PGA en un tiempo
relativamente corto de 18 horas
Las modificaciones realizadas en realidad fueron miacutenimas con respecto
a la estructura baacutesica del reactor quiacutemico convencional y con ellas se buscoacute
crear las condiciones que permitiesen incrementar la turbulencia en el sistema
de modo que existiese una mayor oxigenacioacuten y un mayor coeficiente
volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno (kLa) partiendo de antemano de la
hipoacutetesis inicial que sentildealaba al oxiacutegeno como uno de los componentes
limitantes de hecho el de mayor importancia para que este fermentacioacuten
ocurriese de la manera adecuada y con un alto rendimiento de γ-PGA
Se decidioacute emplear un reactor hecho de vidrio en lugar de uno metaacutelico
debido a que las condiciones de oxidacioacuten de la fermentacioacuten y la sensibilidad
de las enzimas involucradas a los iones metaacutelicos haciacutean deseable un material
inerte como sucede con el vidrio De igual manera al emplearse vidrio se tiene
una visioacuten del interior del fermentador las condiciones de agitacioacuten y formacioacuten
de burbujas son visibles asiacute como el crecimiento microbiano lo que permite un
mejor ajuste y correccioacuten de las condiciones de fermentacioacuten al menos durante
las etapas iniciales de investigacioacuten Para poder trabajar a mayores presiones
se hubiese requerido un reactor quiacutemico metaacutelico de un costo sumamente
elevado Los resultados experimentales demostraron que el rango de presioacuten
definido resultoacute ser el correcto para la investigacioacuten
La seleccioacuten de una turbina tipo Rushton radica en que este tipo de
agitador de pala plana se considera como el ideal para la realizacioacuten de
fermentaciones Dado que las paletas de heacutelices Rushton son planas y
colocadas verticalmente a lo largo del eje de agitacioacuten producen un flujo radial
unidireccional que permite una alta difusioacuten de un gas en un liacutequido por lo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 81
comuacuten son utilizadas en la fermentacioacuten de liacuteneas celulares que requieren altas
tasas de oxiacutegeno tales como las levaduras bacterias y algunos hongos
Las laacuteminas deflectoras fueron incorporadas pues aunque a velocidades
muy bajas un agitador de paletas produce una agitacioacuten suave inclusive en un
tanque sin laacuteminas deflectoras cuando son necesarias velocidades elevadas
se requiere la incorporacioacuten de dichas laacuteminas para aumentar la turbulencia de
lo contrario el liacutequido se mueve como un remolino que gira alrededor del
tanque con velocidad elevada pero con poco efecto de mezcla
74 Tiempo de fermentacioacuten
El tiempo de fermentacioacuten empleado en esta investigacioacuten es
significativamente inferior al empleado por otros autores que hablan de un
promedio de 72 horas Es importante sentildealar que 18 horas es el tiempo
suficiente para que el pH del medio de cultivo descienda a cerca de 60
Valores de pH inferiores a este han demostrado ser perjudiciales pues decae
el consumo de aacutecido ciacutetrico se detiene en gran medida la polimerizacioacuten del γ-
PGA y la concentracioacuten tiende a disminuir con el paso del tiempo
Para poder aumentar el periacuteodo de fermentacioacuten se requeririacutea un
sistema de ajuste de pH que opere bajo condiciones del presioacuten mismo que no
se tuvo disponible Es probable que si se prolongara el tiempo de fermentacioacuten
dentro del biorreactor los rendimientos al cabo de 48 o 72 horas seriacutean un
poco mayores siempre y cuando se ajuste el pH en el valor de 65 como
recomiendan Cromwick y colaboradores (1995)
En nuestro caso el incremento del tiempo de fermentacioacuten sin
regulacioacuten del pH de 18 horas a 36 horas mostroacute un incremento miacutenimo en la
productividad (de 025 gL) pero si un cambio en la composicioacuten del γ-PGA
pues el pico de elucioacuten del poliacutemero se desplazoacute levemente hacia un valor de
tiempo mayor lo que podriacutea indicar una degradacioacuten parcial del poliacutemero
inicialmente producido Dichos datos se presentan en la figura 12
Nuestros resultados contradicen lo sentildealado por otros autores quienes
obtienen los mayores rendimientos entre las 48 y 96 horas Birrer y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 82
colaboradores (1995) observaron que Bacillus licheniformis ATCC9945a
alcanza la fase estacionaria a las 24 horas tiempo en el cual muy poco γ-PGA
ha sido formado y por consiguiente la mayor formacioacuten de γ-PGA acontece
entre las 24 y las 96 horas Estos resultados coinciden con los reportados por
Troy (1973) pero difieren a los observados por Goto y Kunioka (1992) con
Bacillus subtilis IFO3335 donde el mayor rendimiento se obtuvo desde las 24 y
hasta las 40 horas Estas diferencias podriacutean deberse a aspectos maacutes
relacionados con los voluacutemenes de fermentacioacuten empleados Por ejemplo para
el caso de Yoon y colaboradores (2000) estos alcanzaron rendimientos de 35
gL con un periacuteodo de fermentacioacuten maacuteximo de 35 horas indicando un
agotamiento del aacutecido ciacutetrico a las 20 horas en su caso el volumen empleado
fue de 1 litro de medio de cultivo
Figura 12 Cromatograma a las 18 (a) y 36 (b) horas de fermentacioacuten con Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 83
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento
Un punto vital para una adecuada fermentacioacuten es la concentracioacuten de
inoacuteculo aspecto que es sentildealado por Troy Cromwick y colaboradores a lo
largo de sus investigaciones pero que no detallan ni cuantifican
adecuadamente o al menos no lo reportan En nuestro caso se empleoacute un
inoacuteculo madre con una absorbancia de 25 o mayor y un inoacuteculo del reactor con
un valor de absorbancia de 120 aproximadamente con el propoacutesito de asiacute
logran estandarizar las condiciones de inoacuteculo Aunque este aspecto no fue
cuantificado a manera cualitativa si se observoacute un importante efecto de este
aspecto (concentracioacuten inicial) sobre la cantidad de γ-PGA obtenido y el tiempo
requerido Esto puede resultarnos obvio teniendo en cuenta una descripcioacuten no
estructurada del crecimiento microbiano pero podriacutea resultar maacutes compleja de
analizar si consideramos que la produccioacuten del γ-PGA estaacute afectada por
paraacutemetros de otra naturaleza maacutes allaacute de la disposicioacuten de nutrientes como
por ejemplo de una estructura celular particular o una relacioacuten de percepcioacuten
de quoacuterum dada Debemos recordar que la percepcioacuten de quoacuterum es un
mecanismo de regulacioacuten de la expresioacuten geneacutetica en respuesta a la densidad
de poblacioacuten celular Las ceacutelulas involucradas producen y excretan sustancias
llamadas autoinductores que sirven de sentildeal quiacutemica para inducir la expresioacuten
geneacutetica colectiva De Vizio (2011) sentildeala que en Bacillus licheniformis NCIMB
8874 la produccioacuten de lichenysin γ-PGA y algunas proteasas extracelulares
estaacute vinculado con los genes comQXPA mismo operoacuten que regula la
percepcioacuten de quoacuterum en Bacillus subtilis
De igual manera la relacioacuten de escalamiento aplicada fue de 16
ligeramente inferior a la que teoacutericamente se utiliza con mayor frecuencia de
110 Aunque este iacutendice no fue objeto de estudio su ajuste tambieacuten afecta de
manera directa los rendimientos obtenidos
La optimizacioacuten de la concentracioacuten del inoacuteculo la relacioacuten de
escalamiento y su frecuencia constituyen aspectos que deben estudiarse con
mayor profundidad para su propia optimizacioacuten pues su efecto sobre esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 84
fermentacioacuten y su rendimiento es bastante significativo Esta afirmacioacuten
adquiere validez cuando vemos que la produccioacuten del γ-PGA no es un
metabolito primario que se forme durante la fase de crecimiento exponencial
sino maacutes bien al inicio de la etapa estacionaria como indica Goto y Kunioka
(antildeo) o durante toda la etapa estacionaria tal y como lo sentildealan tanto Troy
(antildeo) como Birrer y colaboradores (1994) A esto debemos agregarle tambieacuten
lo anteriormente sentildealado referente a la concentracioacuten idoacutenea que produce la
percepcioacuten de quoacuterum responsable de direccionar el metabolismo de la
comunidad microbiana hacia la siacutentesis del γ-PGA
Conociendo la dependencia de esta biosiacutentesis de la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio y partiendo del hecho de que al inicio de la fase
estacionaria la concentracioacuten celular seraacute lo suficientemente alta para poner el
riesgo el mantenimiento de las condiciones aeroacutebicas en el biorreactor pero lo
justa para una adecuada siacutentesis del γ-PGA un inoacuteculo con una alta
concentracioacuten inicial de ceacutelulas podriacutea ayudar a obtener un mayor rendimiento
en un tiempo de fermentacioacuten menor o producir la respuesta de percepcioacuten de
quoacuterum (generalmente se trata de la liberacioacuten de un polipeacuteptido sentildeal) en un
tiempo menor con la consiguiente produccioacuten del γ-PGA
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa es un valor de
suma importancia para el escalamiento de bioprocesos en particular cuando
nos referimos a fermentaciones aeroacutebicas o cultivos de organismos o ceacutelulas
en condiciones de metabolismo aeroacutebico En nuestro caso un adecuado
coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno es garantiacutea que las
condiciones aeroacutebicas se sostendraacuten a lo largo del proceso de fermentacioacuten de
modo que no se produzcan desviacuteos metaboacutelicos indeseados o en el peor de
los casos el inicio del metabolismo anaerobio y la consecuente produccioacuten de
aacutecido aceacutetico
Los valores de kla obtenidos fueron de 0026 s-1 y 0025 s-1 para el
matraz y el bioreactor respectivamente Dichos valores por si mismos nos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 85
indican poco si no determinamos la tasa de consumo de oxiacutegeno requerida
para el cultivo aeroacutebico de Bacillus licheniformis Doran (1995) reporta una
velocidad de consumo de oxiacutegeno m02 para el cultivo aeroacutebico de Bacillus
licheniformis de 231 x 10-5 gO2 g-1cel s
-1 si la concentracioacuten de ceacutelulas X en el
reactor es de 20 gL (determinado experimentalmente como el valor final
alcanzado en matraces con alta concentracioacuten de γ-PGA) la tasa de consumo
de oxiacutegeno (OUR) MO2 seraacute igual a Xm02 es decir 46 x 10-4 mgO2mL-1s-1 A
partir de estos datos y conociendo que kla = MO2ΔcA ΔcA = cA ndash cA sabiendo
que presioacuten atmosfeacuterica cA = 801 mgL a 30 ordmC y el valor cA en el biorreactor
a 30 ordmC es 74 mgL obtenemos un valor de kla del orden de 0062 s-1 Dicho
valor corresponde al valor teoacuterico que seriacutea necesario para mantener el cultivo
con el suministro adecuado y suficiente de oxiacutegeno y que como puede verse
es 25 veces mayor al kla real lo que indica que cuando el cultivo alcance la
maacutexima concentracioacuten celular de 20 gL las condiciones del cultivo no seraacuten
suficientes para un metabolismo cien por ciento aeroacutebico
Tiene sentido entonces que los rendimientos alcanzados en matraz sean
significativamente mayores que los mejores rendimientos obtenidos en
bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica Dado que el cultivo en matraz incorporaba
uacutenicamente 100 mL de medio de cultivo el microorganismo es capaz de
alcanzar una mayor concentracioacuten en una menor unidad de tiempo lo que le
permite alcanzar una mayor concentracioacuten de poliacutemero durante las 26 horas de
cultivo (8 iniciales + 18)
Por su parte para el caso del biorreactor el crecimiento oacuteptimo
probablemente demore maacutes en alcanzarse por lo cual el tiempo que transcurre
entre el alcance de la concentracioacuten limitante de 8 gL (concentracioacuten a la cual
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y la tasa de consumo de oxiacutegeno
(OUR) se igualan) y la concentracioacuten oacuteptima es lo suficiente como para afectar
los rendimientos de γ-PGA Esto resulta evidente al comparar los resultados de
matraz con los de bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica (0 bar relativos) donde la
diferencia en productividad entre ambos es de 43 gL de γ-PGA Dicha
diferencia se explica porque mientras que la concentracioacuten del inoacuteculo madre
mostraba una absorbancia promedio de 25 la del inoacuteculo empleado para el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 86
biorreactor era de 120 (100 ml de medio + inoacuteculo madre creciendo durante 8
horas) es decir praacutecticamente la mitad por lo cual la concentracioacuten inicial de
ceacutelulas era significativamente menor para el biorreactor en comparacioacuten con el
matraz
77 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En condiciones estaacuteticas el contenido de γ-PGAdemostroacute reducir
considerablemente la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
pasando de 74 mgL a 440 mgL a una concentracioacuten del 20 en γ-PGA
Este fenoacutemeno puede deberse al incremento de la viscosidad por la
presencia del poliacutemero en el caldo de cultivo Dicha apreciacioacuten seguramente
afecta de manera negativa la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) pues
reduce tanto cA como cA sin embargo la determinacioacuten del valor de c
A de una
solucioacuten compuesta por sales γ-PGA y productos del metabolismo microbiano
es imposible de determinar teoacutericamente con certeza como para poder
cuantificar la magnitud de reduccioacuten de la OTR numeacutericamente De igual
manera el valor de kLa tambieacuten se ve afectado pues es sabido que a mayor
viscosidad mayor resistencia a la transferencia lo que reduce el valor de este
coeficiente
Asiacute mismo esta reduccioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
podriacutea deberse en parte a la naturaleza anioacutenica del poliacutemero y no solamente
al incremento de la viscosidad La solubilidad se ve afectada por la fuerza
ioacutenica por lo cual una solucioacuten con una concentracioacuten elevada de un poliacutemero
polianioacutenico como el γ-PGA probablemente muestre una importante reduccioacuten
en la solubilidad maacutexima (concentracioacuten de saturacioacuten) del oxiacutegeno en la
misma(Schumpe et al 1978)
Queda claro que dada esta reduccioacuten en la solubilidad de oxiacutegeno al
incrementar el contenido de γ-PGA durante la fermentacioacuten ya sea por la
naturaleza viscosa del biopoliacutemero o por su caraacutecter polianioacutenico la tasa de
transferencia de oxiacutegeno inicial y el valor de kLa se van reduciendo a lo largo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 87
del tiempo lo que dificulta auacuten maacutes garantizar las condiciones de oxigenacioacuten
oacuteptimas para este bioproceso Esto lo podemos explicar pues si tenemos que
OTR = kLa(cA-cA)
dado que al aumentar el contenido de γ-PGA ocurre una reduccioacuten en el valor
de kLa por accioacuten del incremento de la viscosidad (hecho que es
completamente cierto) y al aumentar la concentracioacuten de γ-PGA tambieacuten se
reduce tanto el valor de cA como el de cA (ya sea por efecto de la viscosidad o
de la naturaleza anioacutenico del poliacutemero) la OTR ve su magnitud evidente e
inevitablemente reducida dado que la misma es una relacioacuten de producto entre
ambos factores kLa y (cA ndashcA) Esto podriacutea explicar porque a voluacutemenes de
cultivo de 600 mL (en biorreactor) los rendimientos son mucho menores que en
voluacutemenes de cultivo de 100 ml (matraz) pues probablemente esta caiacuteda en la
OTR sea maacutes acentuada y criacutetica para los microorganismos cuando sucede a
voluacutemenes mayores donde mantener las condiciones de mezcla perfecta y una
alta concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto resultan maacutes dificultosas por lo que el
microorganismo es incapaz de crecer y alcanzar la concentracioacuten idoacutenea para
una maacutexima produccioacuten
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γshyPGA
La concentracioacuten de γ-PGA alcanzada al final de las 18 horas de
fermentacioacuten se vio afectada por la presioacuten Asiacute hasta los 103 bar a mayor
presioacuten mayor concentracioacuten de γ-PGA por encima de este valor de presioacuten la
concentracioacuten de γ-PGA disminuye
Esto puede explicarse por dos factores 1) el efecto de la presioacuten sobre
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y 2) impacto sobre la integridad y
viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γ-PGA
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR
La OTR se ve afectada tanto por el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de oxiacutegeno kLa asiacute como por la diferencia entre la concentracioacuten
de saturacioacuten y la concentracioacuten real en la fase liacutequida (cA-cA) El coeficiente kL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 88
es empiacuterico y su valor depende principalmente de factores tales como la
hidrodinaacutemica del sistema la turbulencia y su geometriacutea
Teoacutericamente kL se puede definir como kL = DABδ donde DAB es la
difusividad de A en B y δ es el espesor de la peliacutecula estancada seguacuten la
teoriacutea de peliacutecula para la transferencia de materia La difusividad en liacutequidos
depende en gran medida de la temperatura (afecta el coeficiente de difusioacuten) y
la concentracioacuten de solutos pero muy poco de la presioacuten (Diacuteaz 2011) En
nuestro caso podriacuteamos suponer que la presioacuten tiene poco efecto sobre kLa
pues tampoco es de esperar un cambio producto de la presioacuten en el aacuterea de
burbujas (a) producida por la agitacioacuten mecaacutenica auacuten maacutes cuando vemos el
hecho de que los ensayos llevados a cabo no contaron con un sistema de
aireacioacuten o burbujeo especiacutefico salvo aquel llevado a presioacuten atmosfeacuterica (0
bar relativa) y debidamente identificado como Aireacioacuten
Asiacute entonces tenemos en el segundo componente de la foacutermula la
diferencia (cA-cA) un punto de particular intereacutes pues efectivamente la
concentracioacuten de saturacioacuten y la concentracioacuten real variacutean con la presioacuten A
pesar de carecer de una sonda de oxiacutegeno disuelto directamente incorporada
al biorreactor y capaz de operar a presioacuten se determinoacute mediante transferencia
(con el sistema cerrado) la concentracioacuten real de oxiacutegeno en el medio de
cultivo a distintas presiones Tales concentraciones y las concentraciones de
saturacioacuten a cada presioacuten se presentan en el graacutefico 14
Para determinar el valor de las distintas concentraciones de saturacioacuten
al trabajar a presiones distintas a la atmosfeacuterica se realizoacute la siguiente
correccioacuten (Montoya amp Bermuacutedez 2003) para el valor de la solubilidad del
oxiacutegeno en agua
Ley de Henry
a 1 atm
Para una presioacuten P distinta a 1 atm tenemos que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 89
en mgL
Donde
C(S) = valor de solubilidad a 1 atm (mgL)
P = presioacuten de operacioacuten (atm)
T = temperatura de operacioacuten (K)
Graacutefico 14 Concentraciones de oxiacutegeno de saturacioacuten y en fas liacutequida a diferentes presiones
en medio de cultivo E sin crecimiento bacteriano
80
153
227
324
422
6681
141154
178
141
724857
1703
2438
y = 48525x + 68875
y = 14191x + 80039
y = 93382x + 11163
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
00
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 05 1 15 2 25 3
Concentracioacuten
Presioacuten (bar)
CONCENTRACIOacuteN DE SATURACIOacuteN CONCENTRACIOacuteN EN FASE LIacuteQUIDA DIFERENCIA
Aunque estos valores deben repetirse con una sonda de oxiacutegeno
disuelto interna (dentro del biorreactor) y bajo una metodologiacutea maacutes pertinente
preliminarmente puede observarse que la diferencia (cA-cA) aumenta al
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 90
aumentar la presioacuten y dado que OTR = kLa(cA-cA) al aumentar dicha
diferencia la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deberiacutea ser mayor Este
incremento de la OTR podriacutea explicar el porqueacute del raacutepido crecimiento
microbiano y la produccioacuten precoz de γ-PGA despueacutes de 18 horas de cultivo
en comparacioacuten con las entre 48 y 96 horas reportadas por otros autores asiacute
como el aumento del rendimiento al aumentar la presioacuten de los 0 bar relativos
(a presioacuten atmosfeacuterica) hasta los 103 bar relativos
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γshyPGA
Al superar los 103 bar relativos el rendimiento en γ-PGA decae
nuevamente Si consideramos un efecto positivo de la presioacuten sobre la OTR
como sentildealamos anteriormente esto no deberiacutea ocurrir Sin embargo al
someter las ceacutelulas a condiciones de presioacuten desconocemos el efecto que
dicha presioacuten puede ejercer sobre los microorganismos y sus rutas
metaboacutelicas asiacute como sobre la estructura de algunas biomoleacuteculas como por
ejemplo proteiacutenas
Meersman y Heremans (2008) sentildealan que el efecto de la presioacuten sobre
el crecimiento de los microorganismos puede explicarse por tres efectos
principales 1) Variaciones en el plegamiento y agregacioacuten de las proteiacutenas 2)
Variaciones en el estado de la membrana celular y 3) Variaciones en el
contenido de proteiacutenas asociadas a la membrana celular Estos aspectos son
de peculiar consideracioacuten pues la γ-PGA sintetasa es un complejo enzimaacutetico
formado por al menos tres unidades enzimaacuteticas distintas y que se encuentra
asociado a la membrana celular de Bacillus licheniformis
En lo referente a las proteiacutenas se sabe que su desnaturalizacioacuten se
produce por efecto de una reduccioacuten en su volumen producto de un cambio
configuracional probablemente de la estructura terciaria Asiacute tenemos que si el
volumen inicial de una proteiacutena viene dado por Vi = Vatomos + Vcavidades +
Vhidratacioacuten si en condiciones de presioacuten ocurre un cambio en el volumen de la
proteiacutena tal que ΔV = ΔVcavidades + ΔΔVhidratacioacuten(el volumen de los aacutetomos no
tiene por queacute variar con la presioacuten) la exposicioacuten de los grupos cargados o
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 91
hidrofoacutebicos de la proteiacutena al agua pueden conllevar a un cambio en la
estructura secundaria y terciaria de modo que la actividad de la proteiacutena se
vea perjudicada parcial o totalmente Esto se debe a que un aumento en la
presioacuten rompe las interacciones hidrofoacutebicas donde las interacciones proteiacutena-
proteiacutena son sustituidas por interacciones proteiacutena-agua particularmente
mediante puente de hidroacutegeno El incremento de la presioacuten podriacutea afectar la
conformacioacuten de alguno o algunos de los componentes del complejo
enzimaacutetico γ-PGA sintetasa lo que sin duda alguna se traduciriacutea en un menor
rendimiento en γ-PGA durante la fermentacioacuten Este posible efecto negativo de
la presioacuten sobre una de las enzimas involucradas en el proceso de biosiacutentesis
del γ-PGA se reafirma cuando vemos como variacutea la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA al aumentar la presioacuten aspecto que se discutiraacute con mayor detalle
maacutes adelante De hecho Ashiuchi y colaboradores (2004) sentildealan que el
complejo enzimaacutetico PgsBCA (γ-PGA sintetasa) es imposible de aislar en su
estado activo debido precisamente a su alta inestabilidad y elevada
hidrofobicidad
Por su parte la membrana celular al tratarse de una bicapa fosfolipiacutedica
es susceptible a sufrir cambios de fase producto de la temperatura o la presioacuten
como por ejemplo la transicioacuten gel-liacutequido El incremento de la presioacuten al igual
que sucede con la temperatura concede mayor fluidez a las bicapas lipiacutedicas
Asiacute en nuestro caso un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea permitir
una mayor difusioacuten de oxiacutegeno al interior celular lo que podriacutea afectar el
crecimiento bacteriano si por ejemplo se formase maacutes especies reactivas
toacutexicas de oxiacutegeno en el interior celular o si cierta maquinaria celular como la
misma γ-PGA sintetasa no fuese capaz de acoplarse adecuadamente en una
membrana con mayor fluidez
En lo referente a la interaccioacuten membrana celular-proteiacutenas es
importante destacar que entre el 20 y el 40 de las proteiacutenas de una ceacutelula
bacteriana suelen estar asociadas a esta estructura Como indicamos
anteriormente un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea afectar el
contenido concentracioacuten y capacidad de anclaje de las proteiacutenas a la
membrana celular El complejo enzimaacutetico γ-PGA sintetasa al tratarse de una
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 92
proteiacutena de membrana podriacutea no acoplarse de manera efectiva a la membrana
celular modificada bajo condiciones de presioacuten o ser liberada al medio de
cultivo lo que afectariacutea negativamente la produccioacuten de γ-PGA Estas
suposiciones podriacutean explicar el porqueacute de la gran cantidad de espuma
generada durante algunas fermentaciones a presioacuten (concretamente en
aquellas a una presioacuten superior a los 103 bar) a pesar de su menor
concentracioacuten de γ-PGA y teniendo presente que en las fermentaciones
microbianas la espuma suele estar constituida mayoritariamente por proteiacutenas
la presioacuten podriacutea estar favoreciendo la liberacioacuten de estas proteiacutenas al caldo de
cultivo y la consecuente formacioacuten abundante de espuma Este fenoacutemeno ya
ha sido reportado en otros microorganismos como Salmonella enterica donde
el tratamiento con presioacuten conllevaba a la peacuterdida de gran parte de sus
proteiacutenas de membrana y su consecuente liberacioacuten al medio de cultivo
(Meersman amp Heremans 2008) Esto se ve respaldado con las observaciones
de Ashiuchi y colaboradores (2004) quienes adicionaron detergentes como el
Tween20 y Triton X-114 (que modifican la estabilidad de la membrana celular y
favorece la liberacioacuten de las proteiacutenas asociadas a ella) a cultivos de Bacillus
spp productores de γ-PGA Ellos observaron una peacuterdida total de la capacidad
de siacutentesis del γ-PGA capacidad que no se recuperaba ni siquiera removiendo
la totalidad de dichos detergentes mediante diaacutelisis con lo cual concluyeron
que es indispensable que el complejo γ-PGA sintetasa se encuentre asociado a
la membrana celular para ser bioloacutegicamente activo
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γshyPGA
Un incremento de la intensidad de agitacioacuten afectariacutea positivamente el
valor de kLa incrementaacutendolo al aumentar el aacuterea de intercambio mediante una
mayor ruptura de las burbujas lo que aumenta el aacuterea de intercambio por
unidad de volumen Sin embargo existen liacutemites para la velocidad de agitacioacuten
esto debido al dantildeo ocasionado a los organismos debido a un esfuerzo
cortante excesivo A pesar de que la turbina Rushton es el impulsor de flujo
axial maacutes recomendado y maacutes eficiente para generar una mezcla perfecta de
alto perfil hidrodinaacutemico un bajo esfuerzo cortante y una alta distribucioacuten un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 93
exceso de agitacioacuten bajo condiciones de presioacuten es evidentemente perjudicial
Es probable que al aplicar presioacuten positiva sobre el cultivo la membrana celular
se encuentre en un estado de fluidez mayor al que presentariacutea a presioacuten
atmosfeacuterica asiacute mismo la presencia de glicerol en el medio de cultivo modifica
la composicioacuten lipiacutedica de la membrana favoreciendo la salida del γ-PGA al
exterior celular al aumentar de igual manera su fluidez Esto queda demostrado
por nuestros resultados a velocidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm
donde ocurre una reduccioacuten de la productividad conforme se aumenta la
agitacioacuten De igual manera la excesiva formacioacuten de espuma que se genera a
intensidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm podriacutea indicar la ruptura celular
y la liberacioacuten de componentes celulares y macromoleacuteculas al caldo de
fermentacioacuten Estas observaciones contradicen lo reportado por otros autores
(Yoon et al 2000) quienes indican velocidades de agitacioacuten oacuteptimas de hasta
1000 rpm a presioacuten atmosfeacuterica para un biorreactor de 24 L y un volumen
efectivo de cultivo de 1 L aunque no se brindan mayor detalle en lo referente al
tipo de turbina empleada
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
El cambio de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producto de la
presioacuten fue un resultado inesperado pues tradicionalmente se habiacutea sentildealado
a la concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo como el principal
responsable de controlar este aspecto Es importante destacar el hecho que
dicho cambio en la composicioacuten no es parcial o escalonado sino que por el
contrario el hecho de aplicar presioacuten durante la fermentacioacuten invierte
praacutecticamente los contenidos de aacutecido D-glutaacutemico y aacutecido L-glutamico de 87
y 13 respectivamente a presioacuten atmosfeacuterica (cultivo en matraz) a 17 y 83
respectivamente a una presioacuten relativa de 103 bar En algunos casos el
contenido de aacutecido D-glutaacutemico fue praacutecticamente 0
Efectivamente se sabe que el complejo γ-PGA sintetasa es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico aunque todaviacutea se
desconoce la arquitectura bioloacutegica de esta sintetasa Igualmente se sabe que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 94
es el componente PgsB el mayormente responsable de la cataacutelisis enzimaacutetica
(reaccioacuten de elongacioacuten del γ-PGA) (Ashiuchi 2010) Una hipoacutetesis que podriacutea
explicar estos resultados es que bajo presioacuten la estructura de esta proteiacutena se
modifique parcialmente (tanto la estructura de la proteiacutena propiamente dicha
como la estructura en funcioacuten de su anclaje a la membrana celular) lo
suficiente como para reducir su afinidad por el aacutecido D-glutaacutemico pero sin
afectar su afinidad por el aacutecido L-glutaacutemico ni conllevar a una
desnaturalizacioacuten de la proteiacutena y la consiguiente peacuterdida total de la actividad
enzimaacutetica Dado que es poco lo que se conoce de la estructura y mecanismo
de accioacuten de esta proteiacutena PgsB es imposible poder determinar con mayor
detalle el coacutemo pueden darse este cambio en la proteiacutena aunque casos
similares se observan durante la desnaturalizacioacuten de proteiacutenas por
temperatura donde las enzimas que operan sobre muacuteltiples sustratos no
pierden su capacidad enzimaacutetica de manera total sobre todos ellos sino que
inicialmente acontece una peacuterdida de afinidad diferenciada seguacuten el sustrato
hasta llegar al punto de desnaturalizacioacuten total donde se pierde toda actividad
enzimaacutetica para todos los sustratos
De igual manera es conocido que existe en Bacillus licheniformis una
enzima racemasa de naturaleza citosoacutelica responsable de transformar el aacutecido
L-glutaacutemico en aacutecido D-glutaacutemico podriacutea entonces tambieacuten asumirse alguacuten
efecto de la presioacuten sobre la actividad de la misma Sin embargo el hecho de
que esta enzima no esteacute asociada a una membrana celular (las proteiacutenas
asociadas a membrana celular tienden a ser maacutes vulnerables a los cambios de
presioacuten por la complejidad e indispensabilidad de su estructura terciaria sobre
su funcioacuten y su anclaje) sea una enzima de un uacutenico dominio y a que
experimentalmente el contenido de aacutecido D-glutaacutemico inclusive a la maacutexima
presioacuten (241 bar) no es cero hacen suponer que la misma se encuentra
bioloacutegicamente activa bajo las condiciones de presioacuten evaluadas
Estos resultados son de suma importancia pues para aplicaciones
biomeacutedicas y farmaceacuteuticas es necesario que el γ-PGA presente un alto
contenido en aacutecido L-glutaacutemico isoacutemero que es reconocido por el organismo
humano El efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre esta composicioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 95
enantiomeacuterica constituye un descubrimiento que pueda facilitar el empleo del γ-
PGA en medicina y que puede ser clave en el disentildeo de un proceso productivo
optimizado para tal fin
711 Peso molecular del γshyPGA En lo correspondiente al peso molecular del γ-PGA se observa que el
tamantildeo del poliacutemero es grande aunque no se observa ninguna tendencia en
los datos que pueda suponer alguacuten efecto de la presioacuten sobre el peso
molecular del poliacutemero Es importante sentildealar que la columna cromatograacutefica
empleada es incapaz de resolver moleacuteculas del alto peso molecular por lo
cual aunque si bien los resultados obtenidos resulten uacutetiles a nivel
comparativo dichos resultados deben tomarse con precaucioacuten Para un mejor
anaacutelisis seriacutea necesario emplear una columna capaz de resolver altos pesos
moleculares
Es importa sentildealar ademaacutes que tal y como se comentoacute anteriormente y
como se muestra en la figura 12 se observa una reduccioacuten del peso molecular
al prolongar el tiempo de fermentacioacuten hasta las 36 horas Para el caso del
reactor AHCJ32 al prolongar el tiempo de fermentacioacuten por 18 horas maacutes se
nota una reduccioacuten en la fraccioacuten de mayor peso molecular y un incremento en
la de menor sin que haya un cambio importante en el rendimiento global Esto
podriacutea deberse a que Bacillus licheniformis ATCC9945a posee enzimas
capaces de hidrolizar el γ-PGA y emplearlo como fuente de carbono Asiacute
mismo dicha observacioacuten sentildeala que si es necesario prolongar el tiempo de
fermentacioacuten es requerido realizar ajustes pues parece ser que la prolongacioacuten
por siacute misma uacutenicamente no es garantiacutea de una mejora en el rendimiento del
proceso fermentativo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 96
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 97
10 CONCLUSIONES
De la elaboracioacuten de la presente investigacioacuten se pueden extraer las
siguientes conclusiones principales
1) El rendimiento promedio en γ-PGA para el cultivo en matraz fue
superior a los 45 gL Dicho rendimiento es el mayor que se haya
reportado hasta la fecha para Bacillus licheniformis ATCC9945a lo
que convierte a esta cepa en una de las que mejor rendimiento
maacuteximo reporta para la biosiacutentesis de dicho poliacutemero natural
2) Un mecanismo eficiente para la conservacioacuten de cultivos de Bacillus
licheniformis ATCC9945a en un estado competente de produccioacuten
de γ-PGA es el congelamiento de ceacutelulas vegetativas a una
temperatura de -80 ordmC Es importante que la absorbancia de las
muestras congeladas sea superior a 25 lo que garantiza una alta
concentracioacuten de ceacutelulas
3) Dada la naturaleza del γ-PGA y su viscosidad el aumento de su
concentracioacuten en el caldo de cultivo a lo largo del tiempo de
fermentacioacuten afecta de manera negativa la tasa de transferencia de
oxiacutegeno disminuyeacutendola paulatinamente El cambio a condiciones
anaeroacutebicas conlleva a la detencioacuten de la biosiacutentesis del γ-PGA y el
consecuente inicio de un metabolismo netamente anaeroacutebico
4) Bacillus licheniformis ATCC9945a es capaz de crecer eficientemente
a presiones de hasta 242 bar relativos no vieacutendose afectado desde
el punto de vista de viabilidad por el incremento de la variable
presioacuten de fermentacioacuten
5) La presioacuten de fermentacioacuten afecta de manera significativa la
productividad de Bacillus licheniformis ATCC9945a en γ-PGA
6) El incremento de la presioacuten de fermentacioacuten hasta los 103 bar
relativos aumenta la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo de cultivo
seis veces (de 218 gL a 1334 gL) en comparacioacuten a los
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 98
rendimientos obtenidos a presioacuten atmosfeacuterica para un periacuteodo de
proceso de 18 horas
7) A presiones de fermentacioacuten superiores a los 103 bar la
productividad decae en comparacioacuten a la obtenida a dicha presioacuten
sin embargo la misma sigue siendo superior a la obtenida a presioacuten
atmosfeacuterica para un periacuteodo de proceso de 18 horas
8) El aumento de la presioacuten probablemente incremente la tasa de
transferencia de oxiacutegeno al incrementar la concentracioacuten de
saturacioacuten del mismo en el medio de cultivo lo que genera un
gradiente de concentracioacuten que permite una mayor transferencia
9) Presiones superiores a 103 bar probablemente afecten estructuras
celulares o biomoleacuteculas tales como las membranas celulares y las
proteiacutenas (γ-PGA sintasa) lo que tiene un efecto perjudicial sobre la
biosiacutentesis de γ-PGA
10) A una temperatura de 30 ordmC y a una presioacuten de 103 bar la
intensidad de agitacioacuten oacuteptima es de 300 rpm Una magnitud de
agitacioacuten mayor produce el dantildeo celular posiblemente por un exceso
de tensioacuten cortante
11) La presioacuten de fermentacioacuten modifica la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA A presioacuten atmosfeacuterica el γ-PGA estaacute compuesto
mayoritariamente por aacutecido D-glutaacutemico A presiones entre 052 y
242 bar dicha composicioacuten se revierte siendo el aacutecido L-glutaacutemico
el isoacutemero maacutes comuacutenmente presente en el γ-PGA
12) La biosiacutentesis de γ-PGA a presioacuten constituye una forma eficiente de
producir un biopoliacutemero mayoritariamente conformado por residuos
de aacutecido L-glutaacutemico aspecto de vital importancia para su aplicacioacuten
biomeacutedica dado que es este isoacutemero del aacutecido glutaacutemico es que es
reconocido y asimilado por el organismo humano
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 99
13) Aunque la modificacioacuten de la presioacuten de fermentacioacuten nunca ha sido
una variable importante en el estudio de los rendimientos para
distintos bioprocesos la presente investigacioacuten demuestra que la
modificacioacuten de dicha variable no soacutelo permite mejorar el
rendimiento global del proceso sino que tambieacuten puede conllevar a
la modificacioacuten del producto final lo que significariacutea una nueva rama
para la investigacioacuten en el disentildeo de bioprocesos de intereacutes
industrial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 100
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 101
11 AGRADECIMIENTOS
Un agradecimiento especial al profesor Jordi Bou por brindarme la
oportunidad de trabajar a su lado en este proyecto por el seguimiento y
asesoriacutea brindada a lo largo del mismo que nos permitioacute alcanzar nuestros
planteamientos y objetivos Espero que los aportes brindados con la presente
investigacioacuten permitan un mejor desarrollo en el futuro de estas temaacuteticas tan
novedosas biopoliacutemeros y fermentaciones bajo condiciones de presioacuten
positiva
Igualmente a la Ing Alejandra Hernaacutendez por la colaboracioacuten y asistencia
brindada durante esta investigacioacuten fue un apoyo importante durante el
desarrollo de las metodologiacuteas y distintas pruebas que se requirieron a lo largo
de esta investigacioacuten
A la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el Desarrollo
(AECID) y a Casa Ameacuterica Cataluntildea que me brindaron la oportunidad de cursar
este programa de maacutester a traveacutes de su programa de extensioacuten de becas a
ciudadanos extranjeros ha sido una oportunidad de crecimiento personal y
profesional que alcanza su punto maacuteximo con la elaboracioacuten de la presente
investigacioacuten El conocimiento adquirido sin duda alguna seraacute un valioso
compantildeero en mi desempentildeo profesional futuro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 102
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 103
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Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 7
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa 84
77 Efecto de la concentracioacuten de γ‐PGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto 86
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γ‐PGA 87
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR 87
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la
biosiacutentesis del γ‐PGA 90
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γ‐PGA 92
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γ‐PGA 93
711 Peso molecular del γ‐PGA 95
10 CONCLUSIONES 97
11 AGRADECIMIENTOS 101
12 BIBLIOGRAFIacuteA 103
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 8
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 9
3 GLOSARIO
Bacillus Es un geacutenero de bacterias en forma de bastoacuten y Gram positiva El
geacutenero Bacillus pertenece a la divisioacuten Firmicutes Son aerobios estrictos o
anaerobios facultativos En condiciones estresantes forman una endospora de
ubicacioacuten central Dicha forma esporulada es resistente a las altas
temperaturas y a los desinfectantes quiacutemicos corrientes
γ-PGA Aacutecido gamma-poliglutaacutemico
ATCC American Type Culture Collection coleccioacuten y depositario de microorganismos
de importancia industrial y cientiacutefica
Biorreactor Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente
bioloacutegicamente activo En algunos casos un biorreactor es un recipiente en el
que se lleva a cabo un proceso quiacutemico que involucra organismos o
sustancias bioquiacutemicamente activas derivadas de dichos organismos Este
proceso puede ser aeroacutebico o anaeroacutebico Estos biorreactores son
comuacutenmente ciliacutendricos variando en tamantildeo desde algunos mililitros hasta
metros cuacutebicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable
OTR Tasa de transferencia de oxiacutegeno
OUR Tasa de consume de oxiacutegeno por parte de un microorganismo
kL Coeficiente de transferencia maacutesica
a Aacuterea de transferencia de materia por unidad de volumen
kLa Coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 10
cA
Concentracioacuten de saturacioacuten de oxiacutegeno Maacutexima concentracioacuten de oxiacutegeno que pueda estar disuelto en una fase liacutequida perfectamente mezclada
cA Concentracioacuten de oxiacutegeno en el liacutequido o concentracioacuten real Es determinada experimentalmente haciendo uso de una sonda de oxiacutegeno disuelto
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 11
4 PREFACIO
21 Origen del proyecto
Este proyecto forma parte de una serie de estudios llevados a cabo en
el ETSEIB referentes al empleo y produccioacuten de biopoliacutemeros en Cataluntildea
Anteriormente no solo se ha investigado en torno a la produccioacuten mediante
fermentacioacuten del biopoliacutemero aacutecido poliglutaacutemico sino tambieacuten sobre la
produccioacuten de aacutecido polilaacutectico y su biodegradabilidad entre otros
Una de las principales limitantes que han encontrado los estudios
previos sobre produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico en medio liacutequido mediante
fermentacioacuten sumergida es la dificultad del escalamiento muy probablemente
debido a la reduccioacuten en la tasa de transferencia de oxiacutegeno al aumentar los
voluacutemenes de cultivo lo que conlleva a rendimientos pobres o a la generacioacuten
de un poliacutemero de bajo peso molecular Asiacute mismo la reproducibilidad de los
resultados es pobre en parte por muacuteltiples factores que fueron estudiados con
mayor detalle en este trabajo
Con el propoacutesito de dar solucioacuten a este problema el presente proyecto
plantea una forma diferente y creativa al menos no es la comuacuten en el aacutembito
microbioloacutegico de abordar la limitacioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
durante la fermentacioacuten y que podriacutea ser la responsable de la reduccioacuten en los
rendimientos Asiacute mediante la aplicacioacuten de condiciones de presioacuten positiva se
plantea una posible viacutea de mejora de los rendimientos fermentativos en la
produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico esperando que sus efectos sobre la
viabilidad microbiana sean los menores posibles
22 Motivacioacuten
En la sociedad actual existe una creciente buacutesqueda de soluciones
bioloacutegicas para los problemas que anteriormente abordaacutebamos desde una
percepcioacuten uacutenicamente quiacutemica Asiacute hoy en diacutea con el propoacutesito de garantizar
la preservacioacuten del medio ambiente reducir el impacto de la actividad humana
sobre las especies animales y vegetales y garantizar un planeta a las futuras
generaciones la palabra biopoliacutemero y bioplaacutestico se han vuelto maacutes y maacutes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 12
comunes tanto en el argot popular como en el aacutembito del conocimiento
cientiacutefico donde diacutea con diacutea son maacutes las investigaciones orientadas a este tipo
de productos de naturaleza bioloacutegica y por consiguiente biodegradable
El aacutecido poliglutaacutemico por sus caracteriacutesticas constituye un poliacutemero
natural que ofrece una amplia gama de aplicaciones industriales donde puede
ser empleado tanto como agente espesante o floculador hasta aplicaciones
maacutes novedosas relacionadas con la medicina y la farmacia
En este contexto de buacutesqueda de soluciones amigables con el ambiente
es donde surge la principal motivacioacuten para investigar sobre el aacutecido
poliglutaacutemico en particular sobre coacutemo aumentar la productividad del proceso
fermentativo a partir del cual se realiza su siacutentesis de modo que las ventajas
teoacutericas que ofrece este producto pronto esteacuten disponibles tanto para el
consumidor como para la industria Tristemente los productos biotecnoloacutegicos
casi siempre tienen como principal inconveniente la valoracioacuten econoacutemica
pues tienden a ser difiacuteciles de producir por lo que tienen altos costos
asociados o sus rendimientos son menores a los deseados para hacerlos
econoacutemicamente rentables Por este motivo las investigaciones deben
procurar al menos orientarse a ofrecer soluciones que alguacuten diacutea puedan ser
llevadas a la praacutectica o como sucede con esta investigacioacuten procurar dar
respuesta a los problemas que se enfrentan cuando se trata de llevar un
producto biotecnoloacutegico a la realidad
La importancia de la investigacioacuten biotecnoloacutegica en el campo de los
materiales radica en que en un mundo con materias primas limitadas
particularmente las fuentes foacutesiles los materiales del futuro tendraacuten un origen
maacutes bioloacutegico que mineral o extractivo por lo que la mejora de los procesos
productivos relacionados con estos productos son prioritarios para cualquier
paiacutes que desee mantenerse competitivo en el aacutembito econoacutemico y tecnoloacutegico
mundial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 13
5 INTRODUCCIOacuteN
En la actualidad el desarrollo de biomateriales constituye uno de los
principales ejes de investigacioacuten en el mundo de la ciencia Dentro de estos
biomateriales los biopoliacutemeros han logrado un particularmente alto grado de
atencioacuten especialmente en los uacuteltimos 30 antildeos debidos a sus muacuteltiples
aplicaciones industriales biomeacutedicas y farmaceacuteuticas que estaacuten aportando una
amplia gama de opciones y soluciones a problemas ambientales y en la
formulacioacuten de nuevas preparaciones biomeacutedicas y farmaceacuteuticas
Los biopoliacutemeros son materiales polimeacutericos o macromoleculares que
son sintetizados por seres vivos Debido en gran parte al precio creciente la
viabilidad declinante de las fuentes foacutesiles como materias primas asiacute como el
ritmo crecimiento de la poblacioacuten mundial han propiciado el desarrollo de
fuentes alternativas renovables capaces de suministrar las necesidades
mundiales crecientes en material de energiacutea y produccioacuten quiacutemica Esta
necesidad de nuevas fuentes alternativas ha permitido que la mirada cientiacutefica
se halle puesta sobre la diversidad microbiana que habita el planeta pues los
microorganismos siempre han demostrado ser una fuente importante de
materiales novedosos con la ventaja que en la actualidad se dispone de la
tecnologiacutea necesaria para crecer los microorganismos de manera masiva y
segura Este nuevo modelo conocido como la estrategia de las biorefineriacuteas
ha cambiado la concepcioacuten de la industria quiacutemica moderna y ha sido
empleada exitosamente en la produccioacuten convencional a granel de diversos
productos quiacutemicos como por ejemplo etanol glutamato y aacutecido ciacutetrico
En el presente la produccioacuten de poliacutemeros o monoacutemeros tales como el
13-propanediol el aacutecido polilaacutectico y los polihidroxialcanoatos ha sido uno de
los principales objetivos de mayor investigacioacuten Dentro de estos nuevos
materiales encontramos los poliaminoaacutecidos poliamidas de naturaleza
polimeacuterica cuyos constituyentes estaacuten unidos por enlaces del tipo amida El
aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) es uno de estos poliaminoaacutecidos un poliacutemero
biodegradable constituido por unidades de D- y L-aacutecido glutaacutemico y que es
producido de manera natural en algunas bacterias
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 14
El presente trabajo procura investigar sobre algunas de las condiciones
involucradas en la produccioacuten bacteriana de γ-PGA y que constituyen las
principales barreras que impiden alcanzar los rendimientos necesarios para
que la produccioacuten bioloacutegica de este poliacutemero sea viable tanto desde el punto de
vista bioloacutegico como econoacutemico
31 Objetivos
El objetivo general a partir del cual se estructura el desarrollo de la
presente investigacioacuten es
Estudiar la produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a y el efecto que tiene sobre el rendimiento y estructura del
producto factores propios de la ingenieriacutea quiacutemica como lo son la
presioacuten y la intensidad de agitacioacuten
Los objetivos especiacuteficos que se plantearon alcanzar en el siguiente
proyecto son los siguientes
Disentildear un biorreactor que permita realizar fermentaciones a presioacuten
positiva de hasta 4 bar absolutos
Describir las condiciones baacutesicas requeridas para lograr reproducibilidad
en la produccioacuten deaacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre el rendimiento de
produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico en gL por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre la composicioacuten
enantiomeacuterica y el peso molecular del aacutecido γ-poliglutaacutemico
Establecer el posible efecto de la presioacuten positiva sobre la tasa de
transferencia de oxiacutegeno en el biorreactor
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 15
6 MARCO TEOacuteRICO
41 Los poliaminoaacutecidos
Los poliaminoaacutecidos son poliamidas formadas por un uacutenico aminoaacutecido
y difieren de las proteiacutenas en muacuteltiples aspectos Las proteiacutenas son
biomoleacuteculas compuestas por una amplia gama de aminoaacutecidos mientras que
los poliaminoaacutecidos estaacuten compuestos uacutenicamente por un solo tipo de
aminoaacutecido al menos en su eje central La siacutentesis de proteiacutenas estaacute dirigida
por el ADN que controla la secuencia especiacutefica de aminoaacutecidos que termina
formando una moleacutecula de una proteiacutena en particular Por su parte los
poliaminoaacutecidos son sintetizados por una ruta metaboacutelica de los organismos
completamente distinta En enlace amida en las proteiacutenas acontece
uacutenicamente entre los grupos α-amino y α-carboxilo mientras que en los
poliaminoaacutecidos pueden verse involucradas otras cadenas laterales
funcionales como por ejemplo los grupos β- y γ-carboxiloy ε-amino(Bajaj amp
Singhal 2011)
Existen mayoritariamente tres poliaminoaacutecidos presentes en la
naturaleza el aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina En
el aacutecido γ-poliglutaacutemico los enlaces amida se forman entre el grupo α-amino y
el γ-carboxilo en el eje central La poli ε-lisina presenta monoacutemeros de lisina
unidos por los grupos α-carboxilo y ε-amino La cianoficina consiste en residuos
de aacutecido α-aspaacutertico que contienen residuos de arginina que penden unidos al
grupo β-carboxilo Las foacutermulas de dichos compuestos se presentan en la
figura 1
42 El aacutecido γshypoliglutaacutemico (γshyPGA)
El aacutecido γ-poliglutaacutemico (de ahora en adelante referido como γ-PGA) es
un poliacutemero inusual que acontece de forma natural anioacutenico soluble en agua
biodegradable comestible y que no resulta toacutexico ni para el ser humano ni para
el ambiente que en la naturaleza es producido por algunas bacterias todas
Gram-positivas una archea e inclusive en eucariotas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 16
Fue primeramente descubierto por Ivaacutenovics y colaboradores como
componente de la caacutepsula de la bacteria Bacillus anthracis despueacutes que se
liberara al medio producto tanto del proceso de autoclavado como por el
envejecimiento y lisis natural de los cultivos La comida tradicional japonesa
ldquoNattordquo estaacute constituida por una mezcla de γ-PGA y fructanos que son
producidos por la bacteria Bacillus natto (Bajaj amp Singhal 2011)
Figura 1 Foacutermula y estructura del aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina
(Fuente Feng et al 2007)
421 Propiedades quiacutemicas y bioquiacutemicas del γshyPGA
El γ-PGA es un poliacutemero polianioacutenico que puede estar compuesto
uacutenicamente por D- L- o por ambos enantioacutemeros del aacutecido glutaacutemico Como se
ha comentado ya es altamente soluble en agua El γ-PGA probablemente
pueda adoptar diferentes estructuras La estructura del γ-PGA ha sido predicha
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 17
asumiendo poliaminoaacutecidos constituidos por 10 o 25 moleacuteculas de aacutecido
glutaacutemico Este modelo teoacuterico calculado para una moleacutecula en solucioacuten
acuosa muestra que el γ-PGA consiste de una heacutelice levoacutegira estabilizada por
enlaces de hidroacutegeno intramoleculares Sin embargo otro estudio realizado a
partir de γ-PGA obtenido de Bacillus licheniformis mostroacute que la conformacioacuten
es realmente flexible y depende de la concentracioacuten de γ-PGA y el pH de la
disolucioacuten A bajas concentraciones (01 wv) y a un pH inferior a 7 el γ-PGA
adopta una conformacioacuten basada mayoritariamente en heacutelices del tipo α
mientras que la conformacioacuten tipo hojas β predomina a pH superiores pues
esta conformacioacuten permite una mejor exposicioacuten de las cargas negativas del γ-
PGA (Candelaamp Fouet 2006) Recientemente mediamente experimentos de
dicroiacutesmo circular se ha reportado una estructura desordenada (Joyce et al
2006 Candela amp Fouet 2006) pero sin detallar las condiciones de trabajo de
los experimentos en particular de pH
El peso molecular del γ-PGA parece variar seguacuten sea el organismo que
produce la moleacutecula sin embargo estas diferencias podriacutean deberse a
diferencias en torno a la degradacioacuten natural que acontece con el poliacutemero o a
los meacutetodos de purificacioacuten y anaacutelisis utilizados mismos que puedan afectar el
tamantildeo del γ-PGA Por ejemplo para el caso de Bacillus subtilis el peso
molecular del γ-PGA variacutea entre 160kDa hasta 1500 kDa las cadenas de γ-
PGA consisten entonces de coacutemo miacutenimo 1000 residuos de aacutecido glutaacutemico
Diferentes estudios enfocados en la siacutentesis microbioloacutegica de γ-PGA han
demostrado que el peso molecular de este poliacutemero es dependiente tanto de
las diversas cepas bacterianas que se empleen asiacute como de los componentes
del medio y las condiciones del medio de cultivo e inclusive de razones auacuten no
dilucidadas De alliacute que exista una gran dificultad para obtener un γ-PGA
altamente homogeacuteneo a partir de cultivos bacterianos esto en gran parte
debido a esta inestabilidad descrita asiacute como a la complejidad molecular
involucrada en su biosiacutentesis
Asiacute mismo el γ-PGA puede contener soacutelo aacutecido D-glutaacutemico soacutelo aacutecido
L-glutaacutemico o una mezcla de ambos enantioacutemeros De alliacute que los filamentos
puedan ser de aacutecido γ-poli-L-glutaacutemico (γ-PLGA) de aacutecido γ-poli-D-glutaacutemico
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 18
(γ-PDGA) o de aacutecido γ-poli-L-D-glutaacutemico (γ-PLDGA) La disposicioacuten de los
residuos en el PLGDA requiere un especial anaacutelisis ya que si bien tanto el
PLGA y el PDGA son ambos solubles en etanol cuando ambos se mezclan en
proporcioacuten equimolar precipitan en etanol Esta observacioacuten es utilizada para
demostrar que el γ-PGA producido por Bacillus licheniformis estaacute compuesto
por cadenas tanto de PLGA como de PDGA Asiacute mismo la digestioacuten con L-
glutamilhidrolasa ha demostrado que el γ-PGA de Bacillus subtilis consiste en
una mezcla de isoacutemeros PLGA y PLDGA
422 Siacutentesis microbioloacutegica de γshyPGA
Distribucioacuten en los microorganismos
Inicialmente el γ-PGA fue detectado como un componente de la pared
capsular de la altamente patogeacutenica bacteria Gram-positiva Bacillus anthracis
Posteriormente este poliacutemero seriacutea nuevamente encontrado presente alrededor
de ceacutelulas de otras bacterias Gram-positivas no patogeacutenicas particularmente
del geacutenero Bacillus Gracias a estos descubrimientos fue posible aislar a inicios
del siglo pasado una cepa de Bacillus capaz de producir grandes cantidades de
γ-PGA
Posteriormente y de manera adicional a estas bacterias formadoras de
endosporas del geacutenero Bacillus el γ-PGA fue encontrado en las eubacterias
haloacutefilas Sporosarcina halophila y Planococcus halophilus y en la
archeobacteria haloacutefila Natrialba aegyptiaca Asiacute mismo γ-PGA fue tambieacuten
detectado en cantidades significativas en nematocistos de Cnidaria (eucariota)
En la tabla 1 se presentan los principales organismos productores de γ-
PGA y algunas de las caracteriacutesticas del γ-PGA producido
Ruta de biosiacutentesis
La conversioacuten de glucosa a γ-PGA sugiere que la siacutentesis del poliacutemero
acontece durante la glicoacutelisis y el ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos (ciclo de
Krebs o del aacutecido ciacutetrico) hasta el 2-oxoglurato (α-cetoglutarato) que es un
precursor directo del aacutecido L-glutaacutemico Durante su crecimiento en un medio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 19
Tabla 1 Organismos que han sido reportados como productores de γ-PGA
ORGANISMO CONFORMACIOacuteN CONFORMACIOacuteN DEL FILAMENTO
Bacillus anthracis D D
Bacillus mesentericus D D
Bacillus licheniformis D y L D y L
Bacillus megaterium D y L D + L
Bacillus pumilus D y L ND
Bacillus subtilis D y L L y D+L
Planococcus halophilus D D
Sporosarcina halophila D D
Staphylococcus
epidermidis
D y L ND
Natrialba aegyptiaca L L
Hydra ND ND
Fuente (Candela amp Fouet 2006)
nutritivo Bacillus licheniformis expresa dos enzimas capaces de sintetizar el
aacutecido L-glutaacutemico la glutamato sintasa y la glutamato deshidrogenasa Ambas
enzimas son praacutecticamente insensibles a la inhibicioacuten por producto lo que
permite alcanzar altas concentraciones intracelulares de aacutecido L-glutaacutemico el
cual es entonces direccionado a la siacutentesis de γ-PGA Los estudios maacutes
detallados relacionados con la polimerizacioacuten del γ-PGA se han realizado con
Bacillus anthracis Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis especialmente
Bacillus licheniformis ATCC9945a lo que ha permitido la identificacioacuten de un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 20
sistema enzimaacutetico anclado a la membrada y denominado como PGA-
sintetasa Este sistema enzimaacutetico estaacute constituido por al menos tres
componentes con actividad enzimaacutetica y se presume que cataliza la siguiente
secuencia de reacciones (Troy 1973) (figura 2)
Aacutecido L-glutaacutemico + ATP ɣ-L-glutamil-AMP + PPi (a)
ɣ-L-glutamil-AMP + SH-enzima ɣ-X-glutamil-S-enzima + AMP (b)
ɣ-X-glutamil-S-enzimaɣ-D-glutamil-S-enzima (c)
ɣ-D-glutamil-S-enzima + [ɣ-D-glutamil]n[ɣ-D-glutamil]n+1 + SH-enzima (d)
Figura 2 Posible mecanismo enzimaacutetico de siacutentesis del γ-PGA (Fuente Ashiuchi 2010)
De acuerdo con este modelo solamente el aacutecido L-glutaacutemico es activado
en el paso (a) mediante fosforilacioacuten lo que significa que la biosiacutentesis del γ-
PGA requiere el suministro de energiacutea para la formacioacuten del enlace amida Maacutes
recientemente un segundo mecanismo ha sido descrito por Ashiuchi (2001) e
involucra un complejo enzimaacutetico denominado PgsBCA el cual es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico y donde la
polimerizacioacuten ocurre por un mecanismo de ligacioacuten tipo amida (figura 3)
Inicialmente se habiacutea descrito que el complejo enzimaacutetico era el responsable
de racemizar y polimerizar el aacutecido glutaacutemico sin embargo estas nuevas
evidencias parecen demostrar que el complejo enzimaacutetico involucrado en la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 21
siacutentesis de γ-PGA carece de actividad racemasa y que la formacioacuten del aacutecido
D-glutaacutemico es responsabilidad de una enzima citosoacutelica denominada aacutecido
glutaacutemico racemasa Glr que presenta una alta selectividad por el aacutecido
glutaacutemico y una mayor preferencia por el aacutecido L-glutaacutemico Un modelo de la
viacutea metaboacutelica mayoritariamente aceptada para la siacutentesis de γ-PGA se
presente en la figura 4
Figura 3 Mecanismo propuesto de biosiacutentesis del γ-PGA mediante ligacioacuten tipo amida
(Fuente Ashiuchi 2001)
Figura 4 Viacutea metaboacutelica de biosiacutentesis del γ-PGA (Fuente Buescher amp Margaritis 2007)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 22
Organizacioacuten geneacutetica
Solamente unas pocas bacterias la mayoriacutea dentro del geacutenero Bacillus
han sido reportadas como capaces de producir γ-PGA Asiacute mismo la
produccioacuten de γ-PGA no es uniforme en estos individuos inesperadamente
variacutea inclusive bajo condiciones de cultivo altamente estrictas De alliacute que la
identificacioacuten del sistema regulatorio y los genes involucrados en dicho sistema
es vital para dar solucioacuten a estos problemas de uniformidad y rendimiento El
complejo PGA-sintetasa estaacute codificado por cuatro loci que son denominados
pgs Los cuatro genes pgs son pgsB pgsC pgsAA y pgsE y se les denomina
en conjunto pgsBCA Todos estos genes son necesarios y suficientes para la
produccioacuten de γ-PGA in vivo La figura 5 muestra los elementos geneacuteticos
requeridos para la produccioacuten de γ-PGA en diferentes especies del genero
Bacillus
Figura 5 Elementos geneacuteticos necesarios para la siacutentesis de γ-PGA (Fuente Candela amp
Fouet 2006)
423 Produccioacuten fermentativa de γshyPGA
Diferentes cepas de bacterias del geacutenero Bacillus son capaces de
producir elγ-PGA ya sea como material viscoso extracelular o como
componente capsular En termino industrial estas cepas han sido las maacutes
utilizadas y por ende las maacutes estudiadas hasta el momento La mayor parte de
los estudios han estado orientados a determinar los requerimientos
nutricionales para el adecuado crecimiento celular asiacute como mejorar la
productividad de γ-PGA y la variacioacuten en la composicioacuten de su estructura en lo
referente al contenido de aacutecido L- y D-glutaacutemico Estos estudios como los
realizados por Troy (1973) Cromwicket al (1995) y Kunioka (1997) han
permitido determinar que los requerimientos nutricionales para la produccioacuten de
γ-PGA variacutean seguacuten sea la cepa que se emplea
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 23
De acuerdo a estos requerimientos nutricionales las cepas productoras
de γ-PGA se han dividido en dos grupos uno que requiere la adicioacuten de aacutecido
L-glutaacutemico al medio de cultivo para estimular la produccioacuten de γ-PGA y el
crecimiento celular y otro que no requiere de aacutecido L-glutaacutemico para la
produccioacuten de γ-PGA
Dentro de las bacterias dependientes de aacutecido L-glutaacutemico las cepas
maacutes promisorias han sido B anthracis B licheniformis ATCC9945a B subtilis
IFO3335 y B subtilis F-2-01 Por su parte dentro de las bacterias
independientes de aacutecido L-glutaacutemico encontramos mayoritariamente los caso s
de B subtilis 5E B subtilis TAM-4 y B licheniformis A35 B subtilis 5E puede
producir γ-PGA a partir de L-prolina como uacutenica fuente de carbono
complementado con una fuente de nitroacutegeno en un medio mineral B
licheniformis A35 produce γ-PGA a partir de glucosa y cloruro de amonio en
condiciones desnitrificantes y B subtilis TAM-4 produce grandes cantidades de
γ-PGA cuando crece en un medio de cultivo con una sal de amonio y azuacutecar
como fuentes de nitroacutegeno y carbono respectivamente Asiacute mismo ademaacutes de
la fuente de carbono y nitroacutegeno existen otra serie de factores tales como
fuerza ioacutenica del medio de cultivo pH del medio de cultivo aireacioacuten entre
otros que afectan en gran medida la productividad y calidad del γ-PGA
De primera impresioacuten pareciera conveniente el empleo de las cepas
independientes de aacutecido L-glutaacutemico para la produccioacuten industrial de γ-PGA
sin embargo la informacioacuten disponible en lo referente a la ruta biosinteacutetica el
mecanismo de formacioacuten del γ-PGA y los factores que afectan la productividad
es praacutecticamente nula para estas cepas A partir de los trabajos de
investigacioacuten y los estudios de aplicaciones industriales la produccioacuten de γ-
PGA se ha llevado a cabo mayoritariamente a partir de cepas dependientes de
aacutecido L-glutaacutemico
En la tabla 2 se presentan algunas de las principales cepas bacterianas
empleadas para la produccioacuten de γ-PGA los nutrientes las condiciones de
cultivo el rendimiento obtenido asiacute como los voluacutemenes de cultivo en que se
basan dichos reportes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 24
Tabla 2 Principales bacterias productoras de γ-PGA (Shih amp Van 2001)
CEPA
NUTRIENTES
CONDICIONES DE CULTIVO
RENDIMIENTO
VOLUMEN DE
TRABAJO B licheniformis ATCC9945a
Aacutecido glutaacutemico (20 gL) aacutecido ciacutetrico (12 gL) NH4Cl (7 gL)
30ordmC 4 diacuteas 17-23 gL 100 mL
B subtilis IFO 3335
Aacutecido glutaacutemico (30 gL) aacutecido ciacutetrico (20 gL)
37ordmC 2 diacuteas 10-20 gL 125 mL
B subtilis TAM-4
Fructosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 4 diacuteas 20 gL 100 mL
B licheniformis A35
Glucosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 3-5 diacuteas 8-12 gL 100 mL
B subtilis F02-1
Aacutecido glutaacutemico(70 gL) glucosa (1 gL)
30ordmC 2-3 diacuteas 50 gL 200 mL
B subtilis (natto)
Maltosa (60 gL) salsa de soya (70 gL) glutamato soacutedico (30 gL)
40 ordmC 3-4 diacuteas 35 gL 125 mL
Fuente Shih amp Van 2001
424 Produccioacuten de γshyPGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a
Generalidades de la bacteria Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis es una bacteria comuacutenmente encontrada en el
suelo y en las plumas de las aves Es gram-positiva de forma oval y mesoacutefila
Su temperatura oacuteptima de crecimiento se encuentra alrededor de los 30 ordmC
aunque es capaz de sobrevivir a temperaturas mucho mayores La temperatura
oacuteptima para la secrecioacuten de enzimas es de 37 ordmC Esta bacteria puede existir
como espora cuando las condiciones son inadecuadas o en estado vegetativo
cuando las condiciones le son maacutes favorables (Wecke et al 2006)
Bacillus licheniformis forma parte del grupo Subtilis junto con Bacillus
subtilis y Bacillus pumilus Estas bacterias son conocidas por ser
contaminantes comunes de alimentos asiacute como favorecer su descomposicioacuten
aunque no se consideran patoacutegenos de importancia para el ser humano
(Wecke et al 2006)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 25
La cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis y la siacutentesis de γ-PGA
La produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a fue
primeramente estudiada por Bovarnick en 1942 sin embargo no fue sino a
partir de 1954 cuando Thorne y colaboradores iniciaron una serie de estudios
sistemaacuteticos orientados a investigar los factores que afectan la produccioacuten de
γ-PGA lo que permitioacute determinar algunos factores y condiciones necesarios
para lograr mayores rendimientos Factores tales como presencia de ciertas
sales inorgaacutenicas aacutecido glutaacutemico aacutecido ciacutetrico glicerol y el tamantildeo del inoacuteculo
demostraron tener efectos importantes sobre el rendimiento de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a tanto en condiciones estaacuteticas como cultivos
bajo agitacioacuten Se encontroacute que los mejores rendimientos se produciacutean cuando
el microorganismo era cultivado en agitacioacuten orbital en un medio de cultivo
denominado como medio C (tabla 3) alcanzando una productividad de hasta
15 gL en un periacuteodo de 3-4 diacuteas Asiacute mismo la mayor produccioacuten de poliacutemero
soacutelo se alcanzaba cuando se empleaba agua de grifo y un lote especiacutefico de
FeCl3 Posteriormente se determinariacutea que dicho lote de FeCl3 estaba
contaminado con trazas de Mn2+ y que el agua de grifo conteniacutea cantidades
significativas de Ca2+ Posteriormente Leonard y colaboradores (1958) se
encargariacutean de comprobar la funcioacuten y concentracioacuten oacuteptima de ambos
elementos quiacutemicos mediante la elaboracioacuten de un medio de cultivo
quiacutemicamente definido tomando como base el medio C de Thorne
Tabla 3 Composicioacuten del medio de cultivo C (Thorne et al 1954)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua de grifo
Fuente Shih amp Van 2001
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 26
Leonard y colaboradores encontraron que aunque solamente se requeriacutea
de 15 x 10-7 moles por litro de Mn2+ para alcanzar el maacuteximo crecimiento
concentraciones mayores de Mn2+ mostraban un marcado efecto prolongando
la viabilidad celular y por consiguiente incrementando la productividad de γ-
PGA Un incremento de hasta 615 x 10-4 molL en la concentracioacuten de Mn2+
permitiacutea alcanzar los mayores rendimientos de γ-PGA De igual manera la
adicioacuten de 102 x 10-3 moles por litro de Ca2+ en presencia de 15 x 10-7 moles
por litro de Mn2+ permitiacutea alcanzar auacuten mayores rendimientos deγ-PGA en
comparacioacuten a los valores oacuteptimos de produccioacuten de poliacutemero obtenidos en
ausencia de este elemento El γ-PGA producido consistiacutea en un homopoliacutemero
de unidades repetidas de aacutecido D- y L-glutaacutemico con una concentracioacuten de
aacutecido D-glutaacutemico que variaba entre el 38 y el 86 seguacuten incrementaba la
concentracioacuten de Mn2+ entre 154 x 10-7 y 246 x 10-3 molL siendo esta
observacioacuten independiente de la concentracioacuten presente en el medio de cultivo
de Ca2+
Tabla 4 Composicioacuten del medio E revisado (Leonard et al 1958)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 0000026 a
042 CaCl22H2O 015 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua destilada
Fuente Shih amp Van 2001
A partir de estos resultados Leonard y colaboradores elaboraron el
medio de cultivo denominado Medio E (tabla 4) que es baacutesicamente el medio
original C exceptuando el hecho de que cantidades definidas de Mn2+ y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 27
Ca2+fueron agregadas El Ca2+ fue adicionado con el propoacutesito de asegurar
altas productividades de poliacutemero a cualquier concentracioacuten de Mn2+ que se
empleara mientras que la variacioacuten de la concentracioacuten de este uacuteltimo
elemento permitiriacutea alcanzar el contenido enantiomeacuterico deseado en el
poliacutemero tal y como se comentoacute anteriormente
La estereoquiacutemica del poliacutemero es decir el contenido enantiomeacuterico del
γ-PGA ha sido desde el inicio de las investigaciones uno de los problemas maacutes
complejos y de difiacutecil solucioacuten y de una importancia tanto fundamental como
praacutectica en lo que se refiere al estudio de la produccioacuten de γ-PGA en bacterias
A lo largo de todos estos antildeos han existido numerosas contradicciones entre
los investigadores en cuanto a si el contenido enantiomeacuterico del γ-PGA
producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a estaacute o no afectado por la
concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo Cromwick y Gross (1995)
realizaron un estudio profundo sobre los factores que influenciaban la
produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a Dicho estudio
encontroacute que el porcentaje de aacutecido L-glutaacutemico presente en el γ-PGA variaba
entre 59 y 10 cuando las concentraciones de Mn2+ variaban entre 0 y 615
μmolL asiacute mismo el rendimiento incrementaba desde los 5 hasta los 17 gL en
dicho intervalo de concentracioacuten de Mn2+
Cromwick y Gross (1995) encontraron en este mismo estudio que la
incorporacioacuten de Mn2+ al medio de cultivo es un factor criacutetico para la
conservacioacuten de la viabilidad celular durante periodos de cultivo prolongados
El nuacutemero de ceacutelulas viables se incrementaba del orden de 105 a 109 unidades
formadoras de colonias (ufc) para todas las concentraciones de Mn2+ hasta el
inicio de la fase estacionaria aproximadamente a las 24 horas Sin embargo
despueacutes de 50 horas de cultivo la viabilidad celular se veiacutea reducida
draacutesticamente para aquellas concentraciones de Mn2+ relativamente menores
(0 a 0615 μmolL) mientras que para las concentraciones mayores (338 a 615
μmolL) el nuacutemero de ceacutelulas viables se manteniacutea en el orden de 107-109
inclusive despueacutes de 140 horas de cultivo Asiacute mismo la presencia de Mn2+ en
concentraciones entre 338 y 615 μ incrementaba la utilizacioacuten de las fuentes
de carbono en gran medida cultivos que conteniacutean 615 μmolL de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 28
Mn2+utilizaban el 37 54 y 93 del aacutecido glutaacutemico el glicerol y el aacutecido
ciacutetrico respectivamente en comparacioacuten a aquellos cultivos que no
incorporaban el Mn2+ los cuales solo utilizaban el 19 10 y 17 del aacutecido
glutaacutemico el glicerol y el aacutecido ciacutetrico respectivamente
Uno de los problemas maacutes prolongados en torno a los estudios referidos
a la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC994a es el hecho de
que el microorganismo termina degenerando en una cepa incapaz de producir
γ-PGA despueacutes de cultivo repetitivo Esta inestabilidad exhibida por este
microorganismo es responsable de una gran variacioacuten de cultivo en cultivo en
lo referente a la cantidad y la cineacutetica de formacioacuten del γ-PGA Birrer y
colaboradores (1994) encontraron que el empleo de ceacutelulas vegetativas
criogeacutenicamente congeladas permitiacutea alcanzar un crecimiento y produccioacuten de
poliacutemero consistente de cultivo en cultivo Asiacute mismo y en congruencia con
otros estudios previamente realizados se encontroacute que el crecimiento celular
ocurriacutea baacutesicamente durante las primeras 24 h la mayor productividad
volumeacutetrica de γ-PGA era de 012 gmiddotL-1middoth-1 y se alcanzaba entre los diacuteas 2 y 4
el pH caiacutea de 74 a aproximadamente 5 despueacutes de 42 horas de cultivo e
incrementaba levemente a cerca de 6 despueacutes de 96 horas de cultivo el
empleo de glicerol glutamato y citrato se reduciacutea de 80 a 45 gL 18 a 10 gL y
de 12 a 1 gL respectivamente la produccioacuten de aacutecido aceacutetico hasta un nivel
maacuteximo de 45 gL asiacute como la presencia de 23-butanediol como producto
secundario entre las 42 y las 96 h El estudio del consumo de las fuentes de
carbono resulta un poco sorprendente pues demuestra unas tasas de
consumo del aacutecido ciacutetrico y de glicerol relativamente altas sin embargo para el
caso del aacutecido glutaacutemico dicha tasa de consumo fue por mucho menor y muy
lejana del agotamiento completo de dicha fuente Asiacute mismo la remocioacuten del
aacutecido L-glutaacutemico del medio de cultivo E afectaba en poca medida el
rendimiento en γ-PGA mientras que la remocioacuten de las otras fuentes (glicerol y
aacutecido ciacutetrico) disminuye de manera draacutestica la produccioacuten de γ-PGA Estos
resultados son contradictorios a los encontrados inicialmente por Thorne y
colaboradores (1954) e indica que Bacillus licheniformis ATCC9945 no requiere
de aacutecido L-glutaacutemico para alcanzar altas productividades de γ-PGA Asiacute mismo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 29
la presencia de 23-butanediol es indicador que los niveles de oxiacutegeno en el
medio de cultivo despueacutes de 42 horas son incapaces de sostener un
metabolismo 100 aeroacutebico esto no es de sorprender pues el γ-PGA es un
poliacutemero extracelular extremadamente viscoso y tasas cada vez menores de
transporte de oxiacutegeno son esperables conforme va aumentado la viscosidad en
el medio a medida que la concentracioacuten de γ-PGA se incrementa
Un trabajo de Cromwick y Gross (1996) estudioacute el efecto del pH y la
aireacioacuten sobre la productividad en γ-PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a en condiciones de fermentacioacuten por lotes El pH fue controlado en
los valores de 55 65 74 y 825 y se determinoacute su efecto sobre el crecimiento
celular la utilizacioacuten de las fuentes de carbono la productividad en γ-PGA el
peso molecular y la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA El mayor
rendimiento en γ-PGA se obtuvo a un pH de 65 (15 gL 96 horas de cultivo) y
decrecioacute significativamente en 55 y 74 Esto coincide con el hecho que el
consumo de glicerol y de aacutecido L-glutaacutemico se mantuvo invariable en funcioacuten
del pH sin embargo la mayor tasa de consumo de aacutecido ciacutetrico se observoacute a un
pH de 65 en contraste con 55 y 74 lo cual parece indicar que el metabolismo
del aacutecido ciacutetrico juega un papel importante a dicho valor de pH Previamente
Cromwick y Gross (1995) encontraron que el aacutecido ciacutetrico es efectivamente un
precursor en la produccioacuten del poliacutemero presumiblemente a traveacutes del ciclo de
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De igual manera la alteracioacuten del pH no mostroacute
ninguacuten efecto importante en cuanto al peso molecular y la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA El efecto de la aireacioacuten fue evaluado incrementando
la velocidad de agitacioacuten entre 250 y 800 rpm y la tasa de aireacioacuten entre los
05 y los 20 Lmin a un pH de 65 observaacutendose un incremento en las tasas de
crecimiento y los rendimientos de γ-PGA conforme el suministro de oxiacutegeno
incrementaba
A pesar de la intensa investigacioacuten que se ha llevado a cabo en lo
referente a la produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a el
mecanismo y las viacuteas biosinteacuteticas especiacuteficas por las cuales el poliacutemero es
producido auacuten no han logrado ser dilucidadas con total claridad a pesar de que
no se cuestione le hecho de que efectivamente acontece a traveacutes del ciclo de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 30
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De las tres fuentes de carbono presentes en el medio
de cultivo E el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido L-glutaacutemico constituyen dos sustratos
precursores para la produccioacuten de dicho poliacutemero sin embargo en lo referente
al glicerol auacuten no queda claro como este incrementa la formacioacuten de poliacutemero
maacutes allaacute del hecho de que Troy (1973) encontroacute que el complejo enzimaacutetico
PGA-sintetasa responsable de la polimerizacioacuten del aacutecido L-glutaacutemico a γ-
PGA es estimulada por la presencia de glicerol Considerando que la viacutea de
biosiacutentesis del γ-PGA efectivamente involucra el ciclo de los aacutecidos
tricarboxiacutelicos cualquier fuente de carbono no relacionada directamente como
el glicerol o la glucosa podriacutean en principio ser una fuente primaria de carbono
para el crecimiento celular y la produccioacuten de γ-PGA Efectivamente el empleo
de glucosa como principal fuente de carbono y cantidades traza de aacutecido ciacutetrico
y aacutecido L-glutaacutemico (05 gL) permitieron alcanzar un rendimiento en γ-PGA de
12 gL en cultivos de Bacillus licheniformisATCC9945a (Ko amp Gross 1998) Sin
embargo y a pesar de este hecho Du y colaboradores (1995) encontraron otra
posible explicacioacuten al incremento del rendimiento en presencia de glicerol Ellos
encontraron que en Bacillus licheniformis ATCC9945a las altas
concentraciones de glicerol en el medio de cultivo conllevan a un cambio en la
composicioacuten de los fosfoliacutepidos de la membrana celular incrementando la
proporcioacuten de los fosfoliacutepidos C120 y C101 y reduciendo la de fosfoliacutepidos
C181 y C161 lo que parece favorecer la formacioacuten de una membrana celular
menos compacta lo que conlleva a una efectiva excrecioacuten del γ-PGA fuera de
la membrana celular
En lo referente a produccioacuten a gran escala y en buacutesqueda de la
aplicacioacuten comercial del γ-PGA en grandes cantidades resulta maacutes que
evidente la necesidad de incrementar la productividad Yoon y colaboradores
(2000) desarrollaron una estrategia para la produccioacuten de γ-PGA con un alto
rendimiento mediante cultivo en lote alimentado de Bacillus licheniformis
ATCC9945a Mediante el empleo de un bioreactor de 25 L conteniendo 1 L de
medio de cultivo y bajo condiciones de pH y temperatura de 65 y 37ordmC
respectivamente un 40 de saturacioacuten de oxiacutegeno y una velocidad de
agitacioacuten de 1000 rpm lograron alcanzar una concentracioacuten maacutexima de γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 31
de 35 gL suministrando aacutecido ciacutetrico y aacutecido L-glutaacutemico a una velocidad de
alimentacioacuten de 02 mLmin (144 gh de aacutecido ciacutetrico y 24 gh de aacutecido
glutaacutemico) por un periacuteodo de 3 h despueacutes del agotamiento del aacutecido ciacutetrico
inicial lo cual aconteciacutea alrededor de las 22 h La productividad alcanzada fue
de 1 gmiddotl-1middoth-1
425 Purificacioacuten del γshyPGA
Dado que la produccioacuten del γ-PGA es mayoritariamente extracelular en
concreto en la cepa de intereacutes para el presente estudio la de Bacillus
licheniformis ATCC9945a la purificacioacuten del poliacutemero es directa y consta de
manera general de tres pasos I) la remocioacuten de las ceacutelulas mediante
centrifugacioacuten o filtracioacuten 2) la precipitacioacuten del producto del medio libre de
ceacutelulas mediante metanol etanol o 1-propanol y 3) la diaacutelisis para la remocioacuten
de impurezas de pequentildeo peso molecular
Du y colaboradores (2001) desarrollaron una estrategia eficiente para la
separacioacuten y recuperacioacuten delγ-PGA de caldos altamente viscosos Esta
consiste en dos procesos I) Separar el γ-PGA del caldo de cultivo viscoso y II)
Concentrar la solucioacuten de PGA por ultrafiltracioacuten con el propoacutesito de reducir la
cantidad de alcohol requerida en el proceso de separacioacuten Las ceacutelulas
encapsuladas con γ-PGA poseen carga negativa cerca del valor neutro de pH
esto debido a la ionizacioacuten del grupo carboxilo en las moleacuteculas de γ-PGA Esta
carga negativa en sus superficies les confiere a las ceacutelulas una alta estabilidad
en el medio de cultivo lo que dificulta la sedimentacioacuten de las ceacutelulas durante el
proceso de separacioacuten Esta alta estabilidad asiacute como la elevada viscosidad del
caldo de cultivo son los dos principales problemas que se enfrentan cuando se
trata de separar las ceacutelulas y el γ-PGA del medio de cultivo por lo cual la
reduccioacuten de ambas es vital para una eficiente recuperacioacuten del γ-PGA
Mediante la disminucioacuten del pH es posible reducir el nuacutemero de cargas
negativas sobre la superficie de las ceacutelulas lo que favorece su faacutecil agregacioacuten
y precipitacioacuten Esto permite reducir en hasta un 17 la energiacutea requerida para
una adecuada centrifugacioacuten del caldo de cultivo a un pH de 5 En lo referente
a los requerimientos de alcohol es conocido que un 75-80 del mismo es
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 32
requerido para la precipitacioacuten del γ-PGA presente en un caldo libre de ceacutelulas
a una concentracioacuten de 1-2 Dado que la cantidad de alcohol requerida
disminuye a medida que la concentracioacuten de γ-PGA aumenta es necesaria y
ventajoso sino la concentracioacuten del γ-PGA presente en el medio de cultivo libre
de ceacutelulas a lo largo del proceso de recuperacioacuten Asiacute es posible reducir en un
25 el alcohol requerido para precipitar una solucioacuten de γ-PGA que fue
concentrada de 20 gL a 60 gL mediante ultrafiltracioacuten a un pH de 5
Asiacute mismo y dada la naturaleza anioacutenica del γ-PGA es posible que el
empleo de la cromatografiacutea de intercambio ioacutenica constituya una herramienta
importante para la purificacioacuten de este poliacutemero
426 Control del peso molecular y degradacioacuten del γshyPGA
El peso molecular es una caracteriacutestica importante del γ-PGA microbiano
debido al efecto que tiene el tamantildeo molecular en las propiedades del
poliacutemero El γ-PGA producido por bacterias del geacutenero Bacillus por lo general
presenta un relativamente alto peso molecular Un poliacutemero de alto peso
molecular es uacutetil como agente espesante pero no es uacutetil para otros usos
debido a la alta viscosidad que lo vuelve difiacutecil de modificar quiacutemicamente
mediante la adicioacuten de alguacuten reactivo quiacutemico De acuerdo con el uso que se
pretenda dar es necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso
molecular por ejemplo en lo referente al empleo del γ-PGA en sistemas de
liberacioacuten de faacutermacos o en el disentildeo de faacutermacos polimeacutericos resulta
necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso para controlar el nivel de
liberacioacuten en los distintos tejidos (Shih et al 2001) Es evidente entonces que el
control del peso molecular del γ-PGA no es solamente un asunto de
importancia fundamental o teoacuterica sino de importancia praacutectica para el
desarrollo de aplicaciones comerciales para este poliacutemero Entre los meacutetodos
que se han empleado para la obtencioacuten de γ-PGA con diferentes pesos
moleculares encontramos la hidroacutelisis alcalina la degradacioacuten ultrasoacutenica la
degradacioacuten microbiana o enzimaacutetica y la alteracioacuten de la composicioacuten del
medio de cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 33
En otro estudio Birrer y colaboradores (1994) encontraron que la
variacioacuten de la fuerza ioacutenica del medio de cultivo mediante la adicioacuten de un 4
(pv) de NaCl conllevaba a la formacioacuten de un γ-PGA de un peso molecular
relativamente mayor
A la fecha existen pocos estudios sobre la biodegradacioacuten microbiana o
enzimaacutetica del γ-PGA a moleacuteculas de menor peso molecular sin embargo es
importante sentildealar que en la mayoriacutea de estudios sobre siacutentesis de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a se sugiera la posible existencia de una
enzima ldquodespolimerasardquo responsable de la descomposicioacuten del γ-PGA Lo que
inicialmente se observaba como una reduccioacuten en la viscosidad del medio de
cultivo con el tiempo o bajo ciertas condiciones demostroacute ser una enzima
poliglutamil-γ -hidrolasa responsable de la ruptura hidroliacutetica del γ-PGA en esta
cepa de Bacillus (King et al 2000) Curiosamente la enzima mostroacute ser
activada por la presencia de iones Zn2+ y Ca2+ y tener una alta afinidad por el γ-
PGA
427 Aplicaciones del γshyPGA
Dada la naturaleza del γ-PGA al ser un poliacutemero no toacutexico
biodegradable y cuya produccioacuten puede ser no tan costosa se han sugerido
gran cantidad de aplicaciones durante la uacuteltima deacutecada El γ-PGA de alto peso
molecular es decir mayor a 106 Da es el preferible en gran parte de las
aplicaciones aunque si bien existen otra serie de aplicaciones que se
presentaran a continuacioacuten y que podriacutean demandar diferentes caracteriacutesticas
Es importante destacar eso siacute que salvo las aplicaciones meacutedicas el resto
considera como indiferente la proporcioacuten de aacutecido D-glutaacutemico y de aacutecido L-
glutaacutemico presente en el γ-PGA
Alimentos
Existe una amplia gama de aplicaciones para el γ-PGA en la industria de
alimentos y sus derivados En jugos y otras bebidas el γ-PGA colabora en el
mejoramiento del sabor y su potabilidad Otra aplicacioacuten importante existe en
alimentos soacutelidos a base de harina de trigo como por ejemplo pan pasteles o
pasta donde la adicioacuten de γ-PGA ha demostrado retrasar el envejecimiento y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 34
mejorar la textura asiacute como permitir una mayor conservacioacuten de la forma Para
estas aplicaciones el γ-PGA recomendable es el de alto peso molecular
Asiacute mismo el γ-PGA ha demostrado poseer propiedades
anticongelantes propiedad que se ve incrementada conforme el tamantildeo del
poliacutemero se reduce Esto permitiriacutea emplear el γ-PGA en la conservacioacuten de
alimentos microorganismos y enzimas Debido a que las sales de este
poliacutemero tienen poco sabor por siacute mismas pueden ser empleadas en mayores
concentraciones en comparacioacuten con otros agentes anticongelantes tales como
la glucosa Aunque esta aplicacioacuten es dependiente del tipo de sal del poliacutemero
empleada es independiente de la proporcioacuten de aacutecido L- y D-glutaacutemico
presente en el poliacutemero Asiacute mismo la adicioacuten de γ-PGA en productos
alimenticios que contengan sustancias activas bioloacutegicamente como por
ejemplo carotenoides vitaminas o polifenoles incrementa la absorcioacuten de
dichas sustancias en el intestino delgado
Fertilizante
Es posible producir grandes cantidades de biomasa y γ-PGA a partir de
medios liacutequidos con estieacutercol glicerol aacutecido ciacutetrico y otras sales inorgaacutenicas
resultando un producto que funciona como un fertilizante de liberacioacuten lenta
cuando es aplicado en los campos de cultivo Dado que el γ-PGA es
particularmente inerte a la gran mayoriacutea de las proteasas la liberacioacuten de
nitroacutegeno puede verse reducida auacuten maacutes Inclusive es posible producir dicho
fertilizante mediante fermentacioacuten en fase soacutelida lo que podriacutea resultar auacuten
maacutes ventajoso en ciertos casos pues permite utilizar como co-sustrato de
fermentacioacuten productos agriacutecolas tales salvado de trigo soya o maiacutez Es
importante sentildealar que para dicha aplicacioacuten la proporcioacuten de aacutecido L- y D-
glutaacutemico presente en el poliacutemero es indiferente
Tratamiento de aguas residuales
Debido a la actividad de floculacioacuten que este poliacutemero presenta el
empleo del γ-PGA en el tratamiento de aguas residuales ha sido investigado en
muacuteltiples estudios demostrando una gran capacidad de absorcioacuten y afinidad
por el Cu2+ Adicionalmente se ha demostrado el requerimiento de iones
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 35
multivalentes tales como el Ca2+ Fe3+ y Al3+ para mejorar su actividad
floculante bajo ciertas condiciones
Asiacute mismo tambieacuten se ha empleado el γ-PGA entrecruzado mediante
radiacioacuten γ el cual ha demostrado ser eficiente en la clarificacioacuten de agua
tuacuterbida a concentraciones tan bajas como 1 mgkg
Bioplaacutesticos
La posibilidad de emplear eacutesteres de γ-PGA como plaacutestico
biodegradable tambieacuten constituye otra aplicacioacuten interesante de este poliacutemero
a pesar de que por el momento su costo es todaviacutea muy elevado como para
asegurar el eacutexito comercial Mediante la modificacioacuten de los grupos eacutester es
posible disentildear un plaacutestico que cumpla los requisitos de muacuteltiples propoacutesitos
asiacute mismo los eacutesteres de γ-PGA han demostrado ser maacutes estables a altas
temperaturas que sus respectivas sales de sodio
Hidrogeles
La formacioacuten de hidrogeles por parte de γ-PGA con o sin la adicioacuten de
poliacutemeros adicionales da origen a una amplia gama de novedosas
aplicaciones ya que las propiedades fiacutesicas del gel pueden ser controladas
para cumplir una amplia variedad de necesidades
Mediante irradiacioacuten γ de 19 kGy es posible generar un hidrogel a base
de γ-PGA con un contenido especiacutefico de agua de 3500 Esto constituye un
meacutetodo conveniente y sencillo para gelificar el γ-PGA sin necesidad de
poliacutemeros o entrecruzadores
Los hidrogeles pueden ser empleados en muacuteltiples aplicaciones como en
la liberacioacuten controlada de faacutermacos el disentildeo de biosensores operaciones de
diagnoacutestico e inclusive hasta bioseparadores pueden ser obtenidos a partir de
γ-PGA y PEG-metacrilato Los hidrogeles obtenidos de esta forma poseen la
cineacutetica de liberacioacuten deseada para partiacuteculas de distinto tamantildeo tales como
pequentildeos peacuteptidos proteiacutenas o inclusive ceacutelulas completas (Bajaj amp Singhal
2011)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 36
Una manera sencilla de obtener hidrogeles de γ-PGA es a traveacutes de la
adicioacuten de peroacutexido como entrecruzador al caldo de fermentacioacuten crudo dicho
hidrogel puede emplearse como absorbente de agua en muacuteltiples aplicaciones
que incluyen agricultura horticultura y construccioacuten civil
De igual manera tambieacuten se ha demostrado que los hidrogeles pueden
ser empelados para la liberacioacuten lenta y controlada de faacutermacos en particular
aquellos formados por α-L-PGA y PEG-metacrilato Hidrogeles formados por un
72 deγ-PGA sulfonado y el resto en γ-PGA han demostrado resultados
promisorios en la liberacioacuten controlada de faacutermacos con una liberacioacuten
praacutecticamente nula a un pH de 74 sin embargo a un pH menor a 65 como el
observado en los tejidos inflamados la liberacioacuten del faacutermaco incrementaba
considerablemente
Transportador de faacutermacos
Dado a su biodegradabilidad y biocompatibilidad el γ-PGA constituye un
biopoliacutemero de particular intereacutes en el desarrollo de faacutermacos de liberacioacuten
controlada tal y como se ha sentildealado previamente Dada la presencia de
grupos carboxilo en las cadenas laterales del poliacutemero que pueden
interaccionar con los grupos funcionales presentes en otros agentes
quimioterapeacuteuticos el γ-PGA permite obtener faacutermacos maacutes solubles y faacuteciles
de administrar Inclusive el conjugado faacutermaco-γ-PGA puede ingresar a las
ceacutelulas diana e irse degradando lentamente mientras libera el agente
farmacoloacutegico y a la vez el aacutecido glutaacutemico producido durante su degradacioacuten
puede ingresar directamente al metabolismo celular o ser excretado a traveacutes
del rintildeoacuten (Bajaj amp Singhal 2011)
Uno de los conjugados maacutes prometedores y estudiados hasta el
momento ha sido con el agente anticanceriacutegeno Paclitaxel Dichos conjugados
Paclitaxel-γ-PGA han demostrado presentar un perfil farmacocineacutetico distinto
capaz de proveer una alternativa hidrosoluble a las formulaciones habituales de
este faacutermaco Tambieacuten estos conjugados han mostrado una respuesta
antitumoral marcadamente superior en comparacioacuten con el Paclitaxel soacutelo
tanto en tejidos murinos como humanos Asiacute mismo estos conjugados han
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 37
mostrado reducir la TCD50 (dosis letal media contra ceacutelulas canceriacutegenas) de
una sola irradiacioacuten de 539 Gy a 75 Gy sin afectar la respuesta radioloacutegica de
los tejidos normales sanos
Adhesivos bioloacutegicos
Los adhesivos bioloacutegicos son empleados para la adhesioacuten de tejidos
homeostasis y para el sellado de fugas de liacutequidos o aire en los tejidos durante
una cirugiacutea En la actualidad el adhesivo de mayor uso es la fibrina la cual
presenta un pobre adhesioacuten a los tejidos Un poliacutemero formado por el
entrecruzamiento del γ-PGA y gelatina ha demostrado un gran potencial para
ser empleado como adhesivo quiruacutergico y agente homeostaacutetico conservando la
capacidad de ser degradado lentamente por el cuerpo sin causar respuestas
inflamatorias severas y a la vez solidificando tan raacutepido como la fibrina pero con
una mayor adherencia a los tejidos Similares hallazgos se han obtenido con
poliacutemeros formados del entrecruzamiento de γ-PGA y colaacutegeno porcino (Bajaj
amp Singhal 2011)
Cosmeacuteticos
El γ-PGA puede ser empleado como componente de valor agregado en
la elaboracioacuten de cosmeacuteticos y productos para el cuidado personal tales como
humectantes exfoliantes y antiarrugas Dada sus propiedades quiacutemicas el γ-
PGA es homogeacuteneamente miscible asiacute como quiacutemicamente estable en la gran
mayoriacutea de los ingredientes tiacutepicamente empleados para la elaboracioacuten de
cremas faciales Asiacute mismo ciertas calidades de γ-PGA son capaces de
producir peliacuteculas suaves elaacutesticas humectantes y suaves sobre la piel Dado
que se trata de un humectante natural hidrofiacutelico formidable el γ-PGA ha
demostrado en combinacioacuten con extractos de Aloe vera promover la produccioacuten
natural de factores humectantes tales como aacutecido pirrolidona-carboxiacutelico aacutecido
laacutectico y aacutecido urocaacutenico A nivel microscoacutepico esto se explica por el hecho de
que los hidrogeles de γ-PGA son capaces de absorber hasta 5000 veces su
propio peso en humedad lo que permitiriacutea incrementar de gran manera las
propiedades humectantes de muchos productos cosmetoloacutegicos con la adicioacuten
de γ-PGA algunos electrolitos y el ajuste a un pH adecuado
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 38
Adyuvante en vacunas
El γ-PGA ha demostrado que es capaz de generar una mejor respuesta
inmune contra otros antiacutegenos presentes en una vacuna El γ-PGA de alto peso
molecular ha demostrado estimular la respuesta inmune contra antiacutegenos
virales en conejos y ratones
43 Disentildeo de procesos biotecnoloacutegicos y la transferencia de materia gasshyliquido
Cuando un microorganismo ha sido identificado como productor de un
compuesto de intereacutes existen una serie de consideraciones que deben ser
valoradas previamente antes de que un proceso productivo econoacutemicamente
viable pueda ser llevado a la praacutectica a escala industrial En aquellas
organizaciones e industrias con una soacutelida experiencia en el disentildeo y
escalamiento de procesos fermentativos los nuevos procesos son
incorporados de manera relativamente raacutepida
El desarrollo de un nuevo proceso fermentativo puede ser a groso modo
dividido en cuatro fases
La primera consiste en identificar el producto su potencial valor de
mercado su precio de venta asiacute como la vida uacutetil del mismo
La siguiente fase es seleccionar o disentildear la cepa que seraacute utilizada en
el proceso productivo y por consiguiente disentildear el proceso como tal Esto
involucra una adecuada seleccioacuten del medio de cultivo oacuteptimo y de las
condiciones idoacuteneas de proceso En este sentido la produccioacuten de γ-PGA a
partir de Bacillus licheniformis ATCC9945a ha sido fuertemente investigada en
torno a las condiciones ideales para su produccioacuten sin embargo algunos
reportes y resultados resultan ser incompletos contradictorios o discutibles Sin
embargo lo que si resulta comuacuten en todas las investigaciones en particular en
aquellas donde se han empleado voluacutemenes mayores de produccioacuten como por
ejemplo de 05 a 10 L es que la produccioacuten del γ-PGA se detiene al reducirse
la concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo problema que ha sido
abordado incrementando el caudal de oxiacutegeno yo incrementando la velocidad
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 39
de agitacioacuten sin que se reporten resultados consistentes o claros La
acumulacioacuten del γ-PGA a lo largo de la fermentacioacuten parece reducir
draacutesticamente la tasa de transferencia de oxiacutegeno lo que termina generando
condiciones anaeroacutebicas en tiempos tan cortos como 20 horas con
concentraciones de oxiacutegeno inferiores a 1 mgL
431 La transferencia de materia gasshyliacutequido
Un requisito primordial para la ocurrencia de una reaccioacuten quiacutemica
cualquiera es que los reactantes esteacuten presentes en el sitio de reaccioacuten En los
sistemas multifase los procesos de transporte son generalmente maacutes lentos
que las tasas maacuteximas de reaccioacuten intriacutenseca Este fenoacutemeno da como
resultado que las tasas de reaccioacuten reales sean menores que las que se
podriacutean esperar por efecto de la cineacutetica de reaccioacuten uacutenicamente
Los fundamentos fiacutesicos principales que determinan la transferencia de
materia son los mismos que aplican para la transferencia de calor y de
momento es decir conveccioacuten y difusioacuten
En los sistemas bioloacutegicos multifase como las fermentaciones en medio
sumergido la transferencia de masa ocurre entre dos fases una gaseosa y
otra liacutequida La mayor parte de los procesos fermentativos a gran escala con
excepcioacuten tal vez uacutenicamente de la produccioacuten de etanol y aacutecido laacutectico son
aeroacutebicos y tiacutepicamente son llevados a cabo en biorreactores aireados gas-
liacutequido En estos procesos aeroacutebicos como sucede con la produccioacuten de γ-
PGA por parte de Bacillus licheniformis ATCC9945a la transferencia de
oxiacutegeno desde la fase gaseosa a la fase liacutequida resulta vital para el eacutexito de
dicho bioproceso
En los bioprocesos aeroacutebicos el oxiacutegeno es un sustrato clave y debido
a su baja solubilidad en caldos y medios de cultivo resulta necesario su
continuo suministro La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deber ser
conocida e inclusive predicha con el propoacutesito de llevar a cabo un adecuado
disentildeo operacional del proceso y un correcto escalado de los biorreactores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 40
432 La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR)
El transporte de oxiacutegeno gas-liacutequido en los bioprocesos aeroacutebicos es el
principal proceso gas-liacutequido a considerar a la hora de disentildear un bioproceso
La solubilidad del oxiacutegeno en un medio liacutequido es baja la concentracioacuten de
saturacioacuten de oxiacutegeno es de cerca de 7-8 mgL en un proceso tiacutepico en
aireacioacuten por lo cual una transferencia de oxiacutegeno continua de la fase gaseosa
a la liacutequida es esencial para conservar un metabolismo celular completamente
oxidativo Por ejemplo unos pocos minutos sin aireacioacuten pueden impactar
severamente en la habilidad de Penicillium chrysogenum para producir
penicilina mientras que en organismos aeroacutebicos facultativos esto puede
generar cambios draacutesticos en el rendimiento y el tipo de producto generado en
condiciones de carencia de oxiacutegeno
La transferencia de oxiacutegeno desde una fase gaseosa hasta el interior de
una ceacutelula ocurre siguiendo una serie de pasos secuenciales que son
1) Difusioacuten del O2 desde la fase gaseoso a la interfase gas-liacutequido
2) Transporte a traveacutes de la interfase gas-liacutequido
3) Difusioacuten del O2 a traveacutes de una regioacuten relativamente inactiva del liacutequido
adyacente a la burbuja es decir de la interfase gas-liacutequido a la de
mezclado del liacutequido
4) Transporte del oxiacutegeno disuelto a la ceacutelula los conglomerados celulares
o al pellet de ceacutelulas inmovilizadas
5) Difusioacuten a traveacutes de la peliacutecula inactiva hasta la superficie de la ceacutelula
dentro de los conglomerados celulares o al interior del pellet de ceacutelulas
inmovilizadas
6) Transporte a traveacutes de la membrana celular
7) Transporte del O2 en el interior celular hacia el sitio de demanda
433 Descripcioacuten de la transferencia maacutesica con kLa
La tasa volumeacutetrica de transferencia de materia de un compuesto A (qtA)
en este caso oxiacutegeno (O2) puede ser descrita cuantitativamente como el
producto de un coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (kLa) y una
fuerza impulsora que consiste en la diferencia entre la concentracioacuten de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 41
saturacioacuten del compuesto (cA) y la concentracioacuten actual del compuesto en la
fase liacutequida (cA)
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (unidad s-1) el kLa
es normalmente referido como un coeficiente uacutenico pero en realidad consiste
de dos partes el coeficiente de transferencia de materia propiamente dicho (kL)
que estaacute vinculado con el flujo maacutesico (tasa de transferencia por unidad de
aacuterea) y el aacuterea de la superficie especiacutefica (a) que es el aacuterea de transferencia
por unidad de volumen
La tasa de transferencia de oxiacutegeno (referida como velocidad de
transferencia de oxiacutegeno en algunos casos) el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de materia (kLa) y la concentracioacuten de oxiacutegeno estaacuten
relacionados por la ecuacioacuten
NAa = OTR = kLa(cA- cA) (gm3s)
Noacutetese en la ecuacioacuten que para que la transferencia sea mayor interesa
tener una kLa alta pero ademaacutes (cA-cA) debe tener un valor elevado lo que
podriacutea llevar a plantear que cA sea lo menor posible Sin embargo se requiere
de una concentracioacuten miacutenima de oxiacutegeno para mantener una fermentacioacuten
aerobia Con respecto a dicha ecuacioacuten es importante sentildealar que
1) La concentracioacuten en fase liacutequida cA corresponde a la cantidad de
oxiacutegeno que hay en la fase acuosa y se determina mediante un
electrodo de oxiacutegeno disuelto Si al sistema se introduce aire a presioacuten
atmosfeacuterica dicho valor estaraacute entre los 0-10 mgL
2) La concentracioacuten de saturacioacuten cA corresponde a la solubilidad de
oxiacutegeno y es dependiente de la concentracioacuten de oxiacutegeno en la fase
gaseosa es decir de la presioacuten parcial de oxiacutegeno Una vez conocida la
presioacuten parcial de oxiacutegeno es posible calcular el valor de la solubilidad
mediante la ley de Henry En agua una forma de esta ecuacioacuten seriacutea
pAGcA = He
Donde He es la constante de Henry y cuyo valor (aproximadamente
entre 15-30 atm m3kg) es funcioacuten de la temperatura A partir de esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 42
ecuacioacuten es posible despejar el valor de cA = pAGHe El valor de He
cambia con la temperatura por ejemplo en agua pura a 25 ordmC para el
oxiacutegeno es de 2396 x 106 Pamiddotm3middotkg-1 El valor de cA es modificable si
se manipula
a) Presioacuten podemos aumentar la concentracioacuten de saturacioacuten si
aumentamos la presioacuten parcial de oxiacutegeno por ejemplo si
pasamos de 021 atm a 1 atm introduciendo al reactor oxiacutegeno
puro en vez de aire a presioacuten atmosfeacuterica lo que da por
resultado un aumento en alrededor de cinco veces su valor
Es posible tambieacuten alcanzar un mayor aumento de la
concentracioacuten de saturacioacuten si aumentamos la presioacuten
absoluta no obstante si hacemos fermentaciones con
oxiacutegeno a presioacuten resulta necesario disponer de un
fermentador capaz de resistir tales condiciones de presioacuten
resulta evidentemente maacutes costoso y tambieacuten pueden ocurrir
cambios importantes en el metabolismo de los
microorganismos que puedan afectar su crecimiento o su
rendimiento en producto
b) Temperatura la solubilidad del oxiacutegeno en agua disminuye al
aumentar la temperatura
c) Composicioacuten del liacutequido si en lugar de agua pura se tiene una
disolucioacuten como sucede con la mayoriacutea de los medios que
tiene una composicioacuten salina importante la solubilidad debe
corregirse pues dichos componentes afectan su valor y dicho
efecto estaacute influenciado tanto por los iones presentes como
por los componentes orgaacutenicos
44 Fermentaciones a presioacuten
La gran mayoriacutea de los estudios sobre fermentaciones son generalmente
llevados a cabo bajo condiciones de presioacuten ambiental maacutes allaacute del hecho de
que el fermentador por lo general suele encontrarse positivamente presurizado
Son pocos los ejemplos a excepcioacuten de la cerveza y algunos vinos donde las
fermentaciones son llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten positiva en el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 43
fermentador Esta leve presurizacioacuten suele deberse al proceso de aireacioacuten del
biorreactor debido a la formacioacuten de una presioacuten de vuelta debido a las
restricciones del respiradero de escape del fermentador
La presioacuten positiva en muchos casos puede resultar beneficiosa para los
procesos de fermentacioacuten no soacutelo por el hecho de incrementar la solubilidad del
oxiacutegeno en el caldo de cultivo sino tambieacuten porque reduce las oportunidades
de contaminacioacuten externa durante el proceso de fermentacioacuten Igualmente la
presioacuten puede tener efectos nocivos sobre los procesos fermentativos La
presioacuten tiene el efecto de influenciar las velocidades y la direccioacuten del
metabolismo de los microorganismos Esto es particularmente evidente en el
caso de productos o subproductos volaacutetiles que forman parte de distintas rutas
metaboacutelicas La presioacuten en el fermentador puede evitar la produccioacuten o
expulsioacuten de un producto gaseoso al medio circundante Este fenoacutemeno puede
tener el efecto de interferir con el equilibrio de varias reacciones bioquiacutemicas y
puede resultar en toxicidad al interior de la ceacutelula o en la divergencia de rutas
metaboacutelicas Lo significante de este impacto dependeraacute de la duracioacuten del
proceso asiacute como de la magnitud de la presioacuten a la cual se realice la
fermentacioacuten
De igual manera el efecto de la presioacuten sobre las macromoleacuteculas
guarda una gran semejanza con los efectos de la temperatura lo cual se
desprende del parecido de la forma de los diagramas de estabilidad de las
proteiacutenas y viabilidad de los microorganismos entre ambas variables
temperatura y presioacuten observacioacuten que tambieacuten permite concluir que las
proteiacutenas constituyen los primeros elementos estructurales en ser afectados
de manera negativa por el incremento de la presioacuten La presioacuten parece afectar
en mayor medida las interacciones proteiacutena-proteiacutena en comparacioacuten con la
estabilidad proteica por siacute misma por lo que es vaacutelido concluir que son estas
interacciones las primeras en verse afectadas por dicha variable La
conservacioacuten de la viabilidad en los microorganismos al ser sometidos a
presioacuten dependeraacute en gran medida de su capacidad para conservar una
membrana celular funcional aunque los mecanismos que emplean para tal fin
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 44
auacuten son desconocidos dada la vital importancia de las interacciones proteiacutena-
proteiacutena en las funciones de membrana
Lo maacutes importante es conocer con detalle como efectivamente la presioacuten
ejercida afecta el proceso de fermentacioacuten en particular la bioquiacutemica y la
fisiologiacutea del mismo de igual manera si es posible controlar la direccioacuten de la
fermentacioacuten manipulando la presioacuten o si la presioacuten estaacute generando el
desarrollo de reacciones secundarias indeseadas las respuestas a dichas
interrogantes soacutelo pueden ser dilucidadas mediante la experimentacioacuten praacutectica
del proceso fermentativo en estudio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 45
7 MATERIALES Y METODOLOGIacuteA
51 Informacioacuten de la cepa empleada
Se empleoacute la cepa Bacillus licheniformis ATCC9945a la cual se
encontraba conservada en estado vegetativo y bajo refrigeracioacuten en el
Laboratorio de Biopoliacutemeros del ETSEIB UPC Cataluntildea Con el propoacutesito de
seleccionar colonias altamente mucosas capaces de producir γ-PGA se
procedioacute a rallar la biomasa conservada en placas con Agar LB (pH 75) e
incubarlas por 24 horas a 37 ordmC Las colonias que mostraron una morfologiacutea
mucosa indicadora de la produccioacuten de γ-PGA fueron utilizadas para elaborar
los inoacuteculos empleados en las distintas fermentaciones
52 Medio de cultivo empleado
El medio de cultivo empleado para la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a fue el medio de cultivo E (Leonard et al 1958) con
algunas modificaciones seguacuten recomendado por Birrer y colaboradores (1994)
El detalle de la formulacioacuten se presenta en la tabla 5
Tabla 5 Formulacioacuten del medio de cultivo E empleado en el cultivo SmF de Bacillus
licheniformis ATCC9945a
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO43H2O 043 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 015 CaCl2 011 Glicerol 80 pH 75 Esterilizacioacuten por filtracioacuten (045 μm) Volumen 1 L
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 46
El medio de cultivo fue esterilizado por filtracioacuten (045 μm) y conservado
en refrigeracioacuten a 7 ordmC
53 Preparacioacuten de los inoacuteculos madre
Las colonias seleccionadas fueron inoculadas en matraces de 125 mL
con 25 mL de medio de cultivo E y cultivadas a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica
con varilla imantada a 650 rpm por 12 horas El caldo resultante fue
centrifugado a 8000 rpm por 25 minutos la biomasa recuperada fue
resuspendida en 10 mL de medio de cultivo E y 10 mL de una solucioacuten de
glicerol al 20 Dicha solucioacuten fue distribuida en voluacutemenes de 1 mL en tubos
eppendorf y congeladas a -80 ordmC
Posteriormente uno de estos tubos eppendorf fue empleado para
inocular matraces de 500 mL conteniendo 125 mL de medio de cultivo y fueron
cultivados a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica con varilla imantada a 650 rpm por
14 horas El caldo resultante fue centrifugado nuevamente a 8000 rpm por 25
minutos se recuperoacute la biomasa precipitada y se resuspendioacute en 25 mL de
medio de cultivo E y 25 mL de una solucioacuten de glicerol al 20 Dicha solucioacuten
fue distribuida en voluacutemenes de 2 mL en tubos eppendorf y posteriormente
fueron congelados a -80 ordmC Cada uno de estos eppendorf constituiacutea un inoacuteculo
de origen para una fermentacioacuten individual La absorbancia promedio de estos
inoacuteculos se encontraba cercana a 25
531 Conservacioacuten de la cepa en estado productivo
Los inoacuteculos deben conservarse en todo momento bajo congelacioacuten a
una temperatura inferior a -15 ordmC siendo preferible conservarlos a -80 ordmC La
condicioacuten de produccioacuten de γ-PGA es extremadamente fraacutegil y cambios de
temperatura o descongelamiento pueden conllevar la peacuterdida de dicha
capacidad La reutilizacioacuten de biomasa residual de fermentaciones previas
queda descartada
54 Montaje del biorreactor a presioacuten
En la actualidad los principales fabricantes de biorreactores para la
industria biotecnoloacutegica carecen de equipos de fermentacioacuten a escala
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 47
laboratorio que puedan operar bajo condiciones de presioacuten superiores a los 01
bares relativos Por este motivo se debioacute modificar un reactor quiacutemico a
presioacuten de modo tal que pudiese cumplir los requisitos necesarios para el
cultivo de microorganismos El modelo empleado fue el reactor quiacutemico a
presioacuten modelo 6425-214 de la casa AceGlass (Estados Unidos) de un
volumen total de 2 L Este reactor tiene la capacidad de operar hasta 35 psig
(241 bares relativos) a una temperatura de 100 ordmC y a una agitacioacuten de 300
rpm El mismo seguacuten su disentildeo original se presenta en la figura 6
Figura 6 Reactor quiacutemico a presioacuten modelo 6425-214 de AceGlass Co
Las dimensiones del frasco del reactor de forma ciliacutendrica y fondo
redondeado son las siguientes
Diaacutemetro de boca 95 mm
Diaacutemetro maacuteximo 120 mm
Profundidad 180 mm
Con el propoacutesito de adecuarlo al cultivo de microorganismos el reactor
fue ligeramente modificado en algunos de sus componentes y su distribucioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 48
Entre los principales cambios realizados al sistema se encuentran los
siguientes
1) Incorporacioacuten de una turbina de disco tipo Rushton al tratarse de una
fermentacioacuten aeroacutebica es necesario garantizar una adecuada aireacioacuten
del medio de cultivo mediante agitacioacuten efectiva La paleta de agitacioacuten
original del sistema no cumpliacutea con dicho requisito por lo cual se cambioacute
la misma por una turbina tipo Rushton cuyas dimensiones se muestran
en la figura 7
Dimensiones
A = 75 mm
B = 18 mm
C = 1mm
D = 20 mm
Figura 7 Dimensiones de la turbina tipo Rushton empleada
Esta turbina se encuentra en posicioacuten central a 3 cm del fondo del
reactor y a 6 mm de los deflectores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 49
2) Incorporacioacuten de deflectores se incorporaron dos laacuteminas deflectoras de
disentildeo propio de1 mm de ancho en una posicioacuten de 90 grados con
respecto a la superficie del reactor con el propoacutesito de reducir la
formacioacuten de voacutertice promover una agitacioacuten turbulenta y una mayor
formacioacuten de burbujas La geometriacutea de las laacuteminas deflectoras se
detalla en la Figura 8
Dimensiones
Ancho de laacutemina = 10 mm
Diaacutemetro = 95 mm
Longitud de laacutemina = 200 mm
Figura 8 Geometriacutea de las laacuteminas deflectoras
3) Cambio del motor de agitacioacuten se incorporoacute un motor IKA RW20 con
capacidad de hasta 2000 rpm en sustitucioacuten del motor original con que
A
B
C
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 50
disponiacutea el equipo (el sistema original trae un motor limitado a una
velocidad de agitacioacuten maacutexima de 330 rpm) con el propoacutesito de variar la
agitacioacuten del sistema y observar su efecto sobre el crecimiento y la
produccioacuten de poliacutemero
4) Reubicacioacuten de la vaacutelvula de seguridad de sobrepresioacuten con el
propoacutesito de garantizar una mayor seguridad del equipo maximizar la
vida uacutetil del cilindro de aire comprimido y evitar la sobrepresioacuten que
pueden generar el crecimiento del microorganismo (su metabolismo
puede liberar compuestos gaseosos o volaacutetiles) se trasladoacute la vaacutelvula de
seguridad del equipo de la tuberiacutea de llenado a la tapa del reactor
5) Eliminacioacuten de componentes dado que no resultaban uacutetiles para la
presente investigacioacuten se prescindioacute de instalar en la tapa del equipo el
condensado y el embudo de adicioacuten El disco de ruptura de la tuberiacutea de
llenado fue sustituido por una vaacutelvula de apertura manual con el
propoacutesito de permitir un mejor y maacutes raacutepido ajuste de la presioacuten durante
el establecimiento inicial de las condiciones de fermentacioacuten
55 Condiciones de fermentacioacuten
El detalle de las condiciones de temperatura presioacuten pH y agitacioacuten en
las cuales fueron establecidas las distintas fermentaciones asiacute como la
metodologiacutea de escalamiento empleada se presentan a continuacioacuten
551 Escalamiento
Inicialmente se procediacutea a inocular por duplicado 100 mL de medio de
cultivo con uno de los inoacuteculos madre (2 mL de ceacutelulas de Bacillus licheniformis
ATCC9945a conservados en tubos eppendorf a -20 ordmC) en matraces con
deflectores de 500 mL de capacidad A dichos matraces se les incorporaba una
pastilla de agitacioacuten magneacutetica de 25 cm de longitud y 07 cm de diaacutemetro y
eran colocados en agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm (agitador IKA C-MAG HS7)
por 8 horas a una temperatura aproximada de 30 ordmC
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 51
Posteriormente uno de los matraces (100 mL de cultivo) anteriormente
establecidos era utilizado para inocular 500 mL de medio de cultivo en el
biorreactor a presioacuten manteniendo una temperatura constante de 30 ordmC
aproximadamente Distintas presiones velocidades de agitacioacuten y densidades
oacutepticas del inoacuteculo fueron evaluadas El detalle del disentildeo experimental de
dichas pruebas se presenta a continuacioacuten en la tabla6
Tabla 6 Diferentes condiciones de presioacuten relativa agitacioacuten y absorbancia evaluadas en las
fermentaciones en biorreactor
CONDICIOacuteN
VALORES EVALUADOS
SOBREPRESIOacuteN
Agitacioacuten 300 rpm
Absorbancia del inoacuteculo 120
O bar (0 psig)
052 bar (75 psig)
103 bar (15 psig)
172 bar (25 psig)
241 bar (35 psig)
AGITACIOacuteN
Sobrepresioacuten 103 bar (15 psig)
Absorbancia del inoacuteculo 120
300 rpm
400 rpm
500 rpm
650 rpm
El tiempo de fermentacioacuten para cada uno de los ensayos evaluados fue
de 18 horas tiempo en el que el pH habiacutea descendido a un valor cercano pero
auacuten superior a 6 No se realizoacute ajuste alguno del pH a lo largo de la
fermentacioacuten Posteriormente se procediacutea a centrifugar el caldo de
fermentacioacuten a 8000 rpm por 25 minutos el sobrenadante recuperado era
almacenado para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA presente en
el mismo
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre
Con el propoacutesito de garantizar que el inoacuteculo madre era apto para la
produccioacuten de γ-PGA uno de los matraces inicialmente establecidos era
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 52
conservado bajo agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm y a 30 ordmC durante las 18 horas
que requeriacutea la fermentacioacuten en el biorreactor Posteriormente se determinaba
cualitativamente la produccioacuten de γ-PGA seguacuten la simbologiacutea que se presenta
en la tabla 7
Tabla 7 Simbologiacutea empleada para la medicioacuten cualitativa de la produccioacuten de γ-PGA en los
matraces de control
SIacuteMBOLO OBSERVACIOacuteN CUALITATIVA
- No produccioacuten de γ-PGA
+ Produccioacuten de γ-PGA
+++ Elevada produccioacuten de γ-PGA
56 Determinacioacuten del valor de kLa
Para la determinacioacuten del valor aproximado de kLa tanto en los
matraces coacutemo en el biorreactor se empleoacute el meacutetodo estaacutetico sin operacioacuten
del cultivo celular Dicho valor no fue determinado bajo condiciones de presioacuten
pues se careciacutea con la instrumentacioacuten adecuada sino soacutelo a presioacuten
atmosfeacuterica para ambos casos matraz y biorreactor
Este meacutetodo consiste en disminuir la concentracioacuten de oxiacutegeno hasta
una concentracioacuten de 1-25 mgL despueacutes el sistema es retornado a aireacioacuten
yo agitacioacuten y se mide como va aumentando la concentracioacuten de oxiacutegeno en la
fase liacutequida conforme transcurre el tiempo El objetivo es por tanto disminuir la
concentracioacuten de cA0 lo suficiente como para tener un cambio importante
obteniendo asiacute una curva de ascenso de las concentraciones de oxiacutegeno en el
tiempo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 53
561 Matraces de cultivo
A un matraz de cultivo en reposo conteniendo 100 mL de medio de
cultivo E se le agregoacute 001 g de sulfito de sodio (Na2SO3) y una punta de
espaacutetula de cloruro de cobalto (actuacutea como catalizador) y se agita
manualmente por 20 s Posteriormente se introdujo la sonda de oxiacutegeno
disuelto del medidor Hanna Oxi-check y se dejoacute descender el nivel de oxiacutegeno
disuelto hasta el valor miacutenimo posible entre 20-25 mgL Seguidamente se
activoacute la agitacioacuten magneacutetica y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto cada 10
segundos hasta alcanzar un punto maacuteximo que se repitiese al menos durante
2 minutos
562 Biorreactor
Se procedioacute a llenar el reactor con 600 mL de medio de cultivo y en
estado de reposo se le agregoacute 006 g de sulfito de sodio una punta de espaacutetula
de cloruro de cobalto y se agitoacute suavemente a 100 rpm por 20 segundos
Haciendo uso de la sonda de oxiacutegeno se determinoacute el menor nivel posible de
oxiacutegeno disuelto alrededor de 15-20 mgL Posteriormente se encendioacute la
agitacioacuten mecaacutenica a 300 rpm y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto en
intervalos de 10 segundos hasta alcanzar un valor maacuteximo de oxiacutegeno disuelto
sostenido en el tiempo es decir que se repitiese por al menos un minuto
563 Graficacioacuten
Con el propoacutesito de determinar el valor de kla a partir de la ecuacioacuten de
balance de oxiacutegeno
V(dCAdt) = VkLa(cA-cA)
Se tiene que integrando dicha ecuacioacuten con la concentracioacuten inicial cA0
se obtiene
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 54
Representado ln((cA - cA0)(c
A- cA)) contra el tiempo t se obtiene una
recta cuya pendiente es el valor de kLa
57 Determinacioacuten del contenido de γshyPGA en el caldo de fermentacioacuten
Con el propoacutesito de determinar la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo
post-fermentacioacuten se utilizoacute la teacutecnica analiacutetica llamada cromatografiacutea liacutequida
de alta eficiencia conocida normalmente por sus siglas en ingleacutes HPLC
especiacuteficamente la conocida como cromatografiacutea de permeacioacuten en gel (GPC)
uno de los tipos de cromatografiacutea de exclusioacuten molecular (SEC) maacutes
empleados en la separacioacuten de poliacutemeros
El equipo empleado fue el cromatoacutegrafo modelo 1260 Infinity de Agilent
Technologies La columna de separacioacuten empleada fue una columna PL
aquagel-OH de 8μm para cromatografiacutea GPC en fase acuosa El meacutetodo de
cromatografiacutea empleado consistioacute en eludir 25 μL de la muestra haciendo uso
de una solucioacuten tampoacuten fosfato 005 molL con un tiempo de elucioacuten de 15 min
por muestra El caudal de flujo del eluyente fue de 08 mLmin La deteccioacuten se
llevoacute a cabo a traveacutes de un detector de absorbancia UV-vis de longitud de onda
variable (VWD) a una longitud de onda de 220 nm y tambieacuten un detector de
iacutendice de refraccioacuten (RID) con polaridad positiva y una temperatura de la
unidad oacuteptica de 35 ordmC aunque los resultados reportados y empleados fueron
los obtenidos con el detector VWD El tiempo de retencioacuten de la fraccioacuten
polimeacuterica correspondiente al γ-PGA se encontroacute entre los 65 y los 90
minutos considerando el hecho de que el mismo se trata de una mezcla de
moleacuteculas polimeacutericas de distinta longitud y por ende distinto peso molecular
Para poder cuantificar la cantidad de poliacutemero presente en la muestra se
elaboroacute una curva de calibracioacuten inicial Se prepararon soluciones en agua
destilada de γ-PGA a concentraciones de 10 5 2 1 y 05 gL Las mismas
fueron analizadas mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva para el
pico correspondiente al γ-PGA para cada concentracioacuten Dichos valores fueron
empleados para la elaboracioacuten de la curva de calibracioacuten inicial del equipo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 55
Las muestras a analizar fueron preparadas de la siguiente manera 400
μL del caldo crudo se diluyeron en agua destilada hasta un volumen final de 2
mL (dilucioacuten 5x) y posteriormente fueron filtradas mediante jeringa haciendo
uso de filtros de 045 μm en viales de HPLC Las muestras fueron analizadas
mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva del pico correspondiente al
γ-PGA para cada una de las muestras
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
Con el propoacutesito de determinar el efecto del contenido de γ-PGA sobre la
solubilidad maacutexima de oxiacutegeno en el medio de cultivo en condiciones estaacuteticas
es decir sin crecimiento microbiano (consumo de oxiacutegeno de los
microorganismos nulo) se procedioacute a preparar soluciones de 100 mL de
volumen a concentraciones crecientes de poliacutemero (poliacutemero + biomasa) en
medio de cultivo y medir el nivel de oxiacutegeno disuelto en mgL haciendo uso de
un medidor de oxiacutegeno disuelto Hanna Oxi-check Dichas soluciones fueron
evaluadas en las mismas condiciones de fermentacioacuten empleadas en la
primera etapa de escalamiento matraces de 500 mL con deflectores y a una
agitacioacuten magneacutetica de 650 rpm Se evaluaron concentraciones de biopoliacutemero
de 0 7 14 21 36 54 y 71 gL
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano
Para determinar el crecimiento bacteriano se aprovechoacute el efecto que
dicho crecimiento genera sobre la turbidez del caldo a lo largo de la
fermentacioacuten Por ello se empleoacute la teacutecnica de espectrofotometriacutea
determinando la absorbancia del medio de cultivo inoculado y su incremento
con el tiempo Se empleoacute el coloriacutemetro modelo ZUSI 4200A a una longitud de
onda de 660 nm El equipo era inicialmente calibrado en 0 haciendo uso de
agua destilada acto seguido se determinaba el valor de absorbancia de la
muestra a analizar
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 56
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producido se determinoacute
mediante el meacutetodo desarrollado por Marfey (1984) para la determinacioacuten
cuantitativa de la composicioacuten enantiomeacuterica de aminoaacutecidos Dicho meacutetodo se
basa en la reaccioacuten del aacutecido glutaacutemico con el reactivo de Marfey (1-fluoro-24-
dinitrofenil-5-L-alanina) Dicho compuesto es oacutepticamente activo por lo que al
reaccionar con los enantioacutemeros D- y L- del aacutecido glutaacutemico forma dos
diasteroisoacutemeros que pueden separarse mediante cromatografiacutea HPLC con
tiempos de retencioacuten para el isoacutemero L- y el D- de 675 y 100 minutos
aproximadamente Para poder cuantificar la composicioacuten de manera efectiva
se realizoacute un calibrado previo con mezclas de concentracioacuten conocida de cada
isoacutemero
5101 Preparacioacuten de la muestras
Se introdujo 3 mg del γ-PGA a analizar en viales de 5 mL y se les
adicionoacute 2 mL de HCl 6 molL Se dejaron calentar a 100 ordmC en estufa por un
periacuteodo de 24 horas Posteriormente se trasfirioacute 100 μL de cada una de las
muestras a tubos eppendorf y se dejaron en desecador al vaciacuteo por un periacuteodo
de tres diacuteas empleando NaOH como desecante Seguidamente se disolvioacute los
productos en 100 μL de agua y se hicieron reaccionar con 200 μL de una
disolucioacuten con concentracioacuten de 5 mgmL de reactivo de Marfey en acetona con
20 μL de carbonato aacutecido de sodio (NaHCO3) durante una hora en estufa a 37
ordmC Al finalizar se neutralizoacute como 10 μL de HCl 2 molL y se dejoacute secar al vaciacuteo
por 3 diacuteas en el desecador a vaciacuteo con NaOH como desecante Finalmente se
diluyoacute la muestra en 350 μL de dimetilsulfoacutexido (DMSO) para cromatografiarla
por HPLC
La cromatografiacutea se llevoacute a cabo en el mismo equipo empleado para la
determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA pero con los siguientes cambios
1) Se empleoacute una columna de fase estacionaria reversa Spherisorb ODS2
de 5 μm de poro 25 cm de longitud y 046 cm de diaacutemetro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 57
2) El caudal de flujo del eluyente fue de 15 mLmin
3) El detector de longitud de onda variable (VWD) operaba a 340 nm y el
tiempo de elucioacuten era de 25 minutos
4) El eluyente empleado era una mezcla 8020 de fosfato de trietilamonio
50 mmolL a pH 3 y acetonitrilo El fosfato de trietilamonio se obteniacutea
haciendo reaccionar cantidades equimolares de trietilamina y aacutecido
fosfoacuterico
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual
La composicioacuten porcentual enantiomeacuterica del γ-PGA es decir el
contenido porcentual de aacutecido D- y L-glutaacutemico se determinoacute mediante
contraste de las aacutereas obtenidas en el cromatograma para cada uno de los
picos correspondientes a cada diasteroisoacutemero con el aacuterea total
correspondiente a los productos de reaccioacuten (sumatoria de ambos
diasteroisoacutemeros) La composicioacuten se reportoacute como un porcentaje de aacutecido D-
glutaacutemico y aacutecido L-glutaacutemico presente en la muestra analizada
511 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA Para la determinacioacuten del peso molecular del poliacutemero se procedioacute a
analizar los cromatogramas obtenidos para el caacutelculo de la concentracioacuten de γ-
PGA Se empleoacute el programa informaacutetico ChemStation for LC Systemsreg de
Agilent Technologies Dicho programa posee unas potentes herramientas de
anaacutelisis que permiten automaacuteticamente calcular el peso molecular de un
compuesto Para las muestras analizadas se determinoacute el peso molecular
promedio en nuacutemero (Mn) el peso molecular promedio en peso (Mw) la
polidispersidad y el peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) La recta de
calibrado fue obtenida previamente por Bou y colaboradores con estaacutendares de
polioacutexido de etileno (PEO)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 58
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 59
8 RESULTADOS
61 Montaje del biorreactor a presioacuten
El detalle final del biorreactor empleado puede observarse en la figura 8
Noacutetese que la temperatura es controlada por la accioacuten de una manta teacutermica
externa como sucede con el disentildeo original del reactor y no por el empleo de
un serpentiacuten interno caso de la gran mayoriacutea de biorreactores comerciales a
escala laboratorio El mismo permite operar en condiciones de agitacioacuten de 100
a 650 rpm y a presiones de hasta 24 bar de sobrepresioacuten (35 psig) El
biorreactor resultoacute apto para el crecimiento microbiano alcanzaacutendose valores
de absorbancia de hasta 37 similares a los observados en cultivos en
matraces
Figura 9 Biorreactor empleado para la produccioacuten de γ-PGA bajo presioacuten
62 Competencia del inoacuteculo madre
Mediante la metodologiacutea descrita previamente para la preparacioacuten del
inoacuteculo madre fue posible alcanzar en el 100 de los cultivos de control la
produccioacuten de γ-PGA en alta cantidad Aunque dichos resultados no se
muestran el empleo de inoacuteculos de otra naturaleza como reutilizacioacuten de
biomasa o inoacuteculos conservados a temperaturas superiores a -20 ordmC mostraron
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 60
ser ineficaces y poco reproducibles en cuanto a la produccioacuten de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a Los resultados de los cultivos control
pueden observarse en el graacutefico 10 bajo el nombre de Matraz
63 Determinacioacuten de los valores de kLa
631 Matraz
En lo referente al cultivo en matraz bajo las condiciones de agitacioacuten y
temperatura empleadas y en condiciones estaacuteticas (sin crecimiento
microbiano) se encontroacute un valor de kLa de 0026 s-1 En el graacutefico 1 y 2 se
muestran la curva de concentracioacuten de oxiacutegeno en funcioacuten del tiempo al
reiniciarse el proceso de agitacioacuten asiacute como el caacutelculo de dicho valor de
coeficiente mediante regresioacuten lineal respectivamente
Graacutefico 1 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concentracioacuten m
gL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 61
Graacutefico 2 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00257x ‐ 08809Rsup2 = 09966
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
Cuando se realizoacute la misma determinacioacuten pero a una velocidad de
agitacioacuten menor (430 rpm) el valor de kLa disminuyoacute significativamente En
dicho caso el valor de kLaobtenido fue de 0017 s-1 Estos resultados se
muestran en los graacuteficos 3 y 4
Como se puede observar en dichos graacuteficos el tiempo requerido para
alcanzar el valor maacuteximo estable se incrementoacute considerablemente en 60
segundos lo que indica una menor velocidad de transferencia producto de la
reduccioacuten de la intensidad de la agitacioacuten suministrada al cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 62
Graacutefico 3 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 430 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Graacutefico 4 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00168x ‐ 07551Rsup2 = 09835
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
ln Linear (ln)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 63
632 Biorreactor
Para el caso del biorreactor el valor de kLa determinado fue de 0025 s-1
esto bajo condiciones estaacuteticas (sin crecimiento microbiano) y en las
condiciones de temperatura y operacioacuten previamente descritas
Como se puede observar dicho valor es praacutecticamente igual al obtenido
para el caso del matraz lo que indica condiciones de transferencia de oxiacutegeno
gas-liacutequido muy similares en ambos casos El valor dekLa fue determinado en
un punto lateral del reactor 2 cm por debajo del nivel de medio de cultivo y
contiguo a uno de los deflectores punto donde la transferencia de materia
debiera en principio ser mayor Dichos resultados se presentan en los graacuteficos
5 y 6
Graacutefico 5 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten mecaacutenica del medio de cultivo en biorreactor a 300 rpm
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
560
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Concentracioacuten
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 64
Graacutefico 6 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00246x ‐ 03222Rsup2 = 09902
000
050
100
150
200
250
300
0 20 40 60 80 100 120 140
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
64 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En lo referente a los niveles de oxiacutegeno a distintas concentraciones de γ-
PGA en condiciones estaacuteticas sin crecimiento microbiano se observa una
draacutestica reduccioacuten de dicho nivel conforme se incrementa la concentracioacuten del
biopoliacutemero Dicho fenoacutemeno es esperable dada la alta viscosidad del γ-PGA
La concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo alcanza un valor inicial de
74 mgL el cual se reduce draacutesticamente a 52 mgL a un valor de
concentracioacuten de γ-PGA de 14 gL Esta reduccioacuten es uacutenicamente producto de
la presencia del γ-PGA en el medio de cultivo El graacutefico 7 muestra dicho
fenoacutemeno hasta un valor miacutenimo de oxiacutegeno disuelto de 25 mgL cuando la
concentracioacuten de poliacutemero alcanza un maacuteximo 71 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 65
Graacutefico 7 Efecto de la concentracioacuten de γ-PGA sobre el nivel maacuteximo de oxiacutegeno disuelto en el
medio de cultivo E
y = ‐00569x + 64671Rsup2 = 08709
000
100
200
300
400
500
600
700
800
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Oxiacutegeno disuelto m
gL
γ‐PGA gL
Solubilidad O2 (mgL) Linear (Solubilidad O2 (mgL))
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γshyPGA mediante GPC
La curva de calibracioacuten obtenida a partir de soluciones con
concentracioacuten conocida de γ-PGA se presenta en el graacutefico 8
Como se puede observar se obtuvo un valor del coeficiente de
determinacioacuten R2 de 09983 lo que indica un ajuste lineal suficiente y un valor
del coeficiente de correlacioacuten R de 09991 lo que indica una correlacioacuten
positiva entre los datos contrastados La concentracioacuten de γ-PGA estaacute
determinada entonces por la siguiente ecuacioacuten
Concentracioacuten γ-PGA (gL) = (00027 x Aacuterea) ndash 00916
Esta curva fue posteriormente empleada para determinar la
concentracioacuten de γ-PGA en los caldos de cultivo obtenidos despueacutes de cada
una de las fermentaciones realizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 66
Graacutefico 8 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA mediante
GPC
y = 00027x ‐ 00916Rsup2 = 09983
0
2
4
6
8
10
12
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Concentracioacuten gL
Aacuterea
Series1 Linear (Series1)
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γshyPGA
En lo referente al efecto de la presioacuten (relativa) sobre la productividad en
γ-PGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a se encontroacute un incremento de los
rendimientos fermentativos conforme se incrementaba la presioacuten hasta
alcanzar un valor maacuteximo de sobrepresioacuten de 103 bar (15 psig) una vez
superado dicho umbral la productividad se veiacutea reducida draacutesticamente A 103
bar la productividad en γ-PGA alcanzaba un valor de 1334 gL productividad
mayor a la obtenida en condiciones de aireacioacuten (2 Lmin) a presioacuten
atmosfeacuterica la cual fue de 508 gL Esta productividad maacutexima contrasta con
la obtenida a presioacuten atmosfeacuterica la cual fue miacutenima con un valor de 217 gL
Los graacuteficos 9 y 10 muestran los resultados anteriormente comentados Asiacute
mismo en la tabla 8 se presentan la totalidad de fermentaciones llevadas a
cabo las productividades obtenidas y el promedio de cada condicioacuten Es
importante destacar que cada condicioacuten de presioacuten fue evaluada por duplicado
no encontraacutendose diferencias importantes entre los resultados obtenidos para
ninguno de los casos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 67
Graacutefico 9 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748
617
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 05 1 15 2 25
PGGA (gL)
Presioacuten (bar)
RENDIMIENTO gL
Graacutefico 10 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten y la aireacioacuten a presioacuten atmosfeacuterica (0 relativa)
sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748617 508
4582
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
0 052 103 172 241 0 +Aireacioacuten
Matraz
Concentracioacuten γ‐PGA gL
Presioacuten
RENDIMIENTO gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 68
Tabla 8 Fermentaciones realizadas y concentraciones de γ-PGA obtenidas
Reactor Condiciones A D C (gL)AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10108 5 130
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10926 5 141
AHJC11 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 11753 5 152
AHJC11 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10186 5 131
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 95011 5 122
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 97936 5 126
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28706 3 20
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28194 3 20
AHJC14 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 33184 3 24
AHJC14 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 32866 3 23
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 68396 3 52
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 65871 3 50
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43692 5 54
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 46235 5 57
AHJC16 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 49809 5 62
AHJC16 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 58872 5 74
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 57321 5 72
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43021 5 53
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 57727 5 72
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 62398 5 78
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 60469 5 76
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 58335 5 73
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 6083 5 76
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 57897 5 72
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 51267 5 64
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 48407 5 60
= nuacutemero de muestra A = aacuterea D = dilucioacuten C = concentracioacuten y bar = bar relativo
Algunos de los cromatogramas realizados se muestran en las figuras 10
y 11 Como se puede observar la forma del pico de elucioacuten demuestra que el
biopoliacutemero estaacute compuesto por moleacuteculas de distinta longitud por lo cual
existen diferentes pesos moleculares Es importante destacar que para la gran
mayoriacutea de las fermentaciones realizadas el pico siempre presentoacute su maacutexima
altura al inicio lo que demuestra que la mayor parte de eacutel se trataba de un
poliacutemero de alto peso molecular Igualmente esto podriacutea indicar poca
degradacioacuten del biopoliacutemero durante las 18 horas de fermentacioacuten lo cual es
importante dada la capacidad de Bacillus licheniformis ATCC9945a de
hidrolizar enzimaacuteticamente el γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 69
Figura 10 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA analizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 70
Figura 11 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA (052-103-172 y 241 bar relativas)
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γshyPGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a
En lo referente al efecto de la intensidad de agitacioacuten en rpm sobre la
produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a a una presioacuten de
103 bar relativos (15 psig) se encontroacute un efecto negativo del aumento de la
agitacioacuten por encima de las 300 rpm lo que se demuestra con una importante
reduccioacuten en la concentracioacuten final de γ-PGA obtenida despueacutes de 18 horas de
fermentacioacuten Estos resultados se presentan en el graacutefico 11 Como se puede
observar una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm llega a ser tan perjudicial
para el microorganismo que la productividad en γ-PGA cae por debajo del valor
de 1 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 71
Graacutefico 11 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis
ATCC9945a a 103 bar (15 psig) a 30 ordmC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
300 350 400 450 500 550 600 650 700
Concentracioacuten gL
Agitacioacuten rpm
RENDIMIENTO (gL)
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica resultoacute afectada por las condiciones de
presioacuten Como demuestra el graacutefico 12 la proporcioacuten de aacutecido L-glutaacutemico en
las muestras correspondientes a fermentaciones bajo presioacuten resultoacute ser por
mucho mayor a las observadas en los cultivos control tanto en comparacioacuten
con el de matraz como con el sometido a aireacioacuten
La respectiva curva de calibracioacuten con las muestras conformadas por
mezclas con composicioacuten definida de ambos enantioacutemeros se presente en el
graacutefico 13 Como se puede observar los valores teoacutericos y los valores
experimentales obtenidos en el cromatograma coinciden en buena medida lo
que indica la validez de esta teacutecnica para la determinacioacuten de la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA
En dos casos para las fermentaciones llevada a cabo a 052 bar y 172
bar de sobrepresioacuten (75 y 25 psig respectivamente) la proporcioacuten de aacutecido D-
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 72
glutaacutemico fue de cero en contraste con el control en matraz donde dicha forma
del aacutecido glutaacutemico estaba presente mayoritariamente en un 87
De igual manera en lo que concierne a la fermentacioacuten llevada a cabo a
presioacuten atmosfeacuterica y bajo condiciones de aireacioacuten se observa tambieacuten que el
enantioacutemero mayoritariamente presente es el aacutecido D-glutaacutemico con un 83
en contraste con el aacutecido L-glutaacutemico con apenas un 17 Todas las
fermentaciones llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten presentan un
contenido de aacutecido L-glutaacutemico superior al 83
Aunque no fue posible encontrar una correlacioacuten directa entre la presioacuten
y la composicioacuten porcentual en aacutecido D-glutaacutemico si es posible observar como
las condiciones de presioacuten parecen limitar condicionar o disminuir la presencia
de esta forma del aacutecido glutaacutemico en el γ-PGA
Graacutefico 12 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica en aacutecido
L-glutaacutemico y aacutecido D-glutaacutemica del γ-PGA producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a
R11 (103bar)
R12 (103bar)
R15 (0 +aireacioacuten)
R16 (241bar)
R19 (172bar)
R22 (052bar)
MATRAZ
AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO 9518 8319 1736 10000 8347 10000 1285
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO 482 1681 8264 000 1653 000 8715
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 73
Graacutefico 13 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-
PGA mediante HPLC
000
2900
4700
7700
970010000
7100
5300
2300
300
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
100 L 75 L 25 D 50 L 50 D 25 L 75 D 100 D
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO
69 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA
Los resultados de los pesos moleculares de los poliacutemeros obtenidos en
los distintos ensayos se muestran en la tabla 9 El peso molecular promedio de
permeacioacuten (Mp) de todas las muestras se encontroacute entre los 269-307 x 107
gmol
Tabla 8 Valores de peso molecular promedio en nuacutemero (Mn) peso molecular promedio en
peso (Mw) peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) y polidispersidad (PD) delγ‐PGA
producido en los distintos ensayos evaluados
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
MATRAZ1 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 157 214 29 137
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
MATRAZ2 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 160 216 292 135
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar relativos
207 252 307 122 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 74
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
204 252 307 124 PRIMERO MAYOR
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
202 252 307 125 PRIMERO MAYOR
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
199 251 307 126 PRIMERO MAYOR
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 200 247 307 123
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 226 26 306 115
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 179 223 281 125
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 172 221 264 128
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
217 248 304 114 PRIMERO MAYOR
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
210 246 304 117 PRIMERO MAYOR
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
195 233 284 120 SEGUNDO MAYOR
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
178 225 269 126 SEGUNDO MAYOR
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
223 262 306 118 PRIMERO MAYOR
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
222 261 306 117 PRIMERO PAYOR
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
207 254 307 122 PRIMERO MAYOR
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
187 251 306 134 PRIMERO MAYOR
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
171 246 306 144 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
185 253 306 136 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
202 252 306 125 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 75
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
232 263 306 113 PRIMERO MAYOR
AHJC32-1-18HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
173 228 307 132 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-2-18HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
177 230 306 130 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-1-36HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
165 220 23 133 IGUALES
AHJC32-2-36HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
173 224 302 130 IGUALES
Los valores de polidispersidad estuvieron entre 113 y 144 Asiacute mismo
no se observan mayores diferencias entre los pesos moleculares obtenidos a
distintas presiones aunque la existencia de un segundo pico era maacutes evidente
en los cromatogramas correspondientes a γ-PGA producido en condiciones de
presioacuten relativa 0 Asiacute mismo dichas muestras presentan un peso molecular
levemente menor aunque dicha tendencia no es absoluta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 76
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 77
9 DISCUSIOacuteN
71 Cepa empleada
Bacillus licheniformis ATCC9945a es una cepa que ha sido empleada
con eacutexito en la produccioacuten de γ-PGA particularmente a escala laboratorio maacutes
no ha sido empleada a escala industrial donde otras cepas particularmente de
la especie Bacillus subtilis han sido las preferidas tanto por aspectos de
rendimiento como estabilidad productiva de la cepa El presente estudio
determinoacute una productividad promedio en condiciones de matraz de 4582 gL
despueacutes de 72 horas de cultivo Valores de productividad tan altos no habiacutean
sido reportado previamente para Bacillus licheniformis ATCC9945a donde
valores entre 17 y 23 gL de rendimiento han sido reportados por Troy (1973)
Cromwick y Gross (1996) 26 a 35 gL por Bajaj y colaboradores (2009) y 35
gL por Yoon y colaboradores (2000)
Los motivos de este mayor rendimiento aunque no son claros pueden
deberse a una mejor transferencia de oxiacutegeno en el sistema de agitacioacuten
magneacutetica en comparacioacuten con la agitacioacuten orbital estaacutendar Asiacute por ejemplo y
utilizando la ecuacioacuten simplificada para determinar en valor de kLa en agitacioacuten
orbital (Diacuteaz 2011) tenemos que a 20 ordmC
kLa = 139 x 10-3n (VTVL)084
Asiacute tenemos que para un sistema en agitacioacuten orbital a 250 rpm es decir
a una frecuencia de 417 s-1 con un volumen de medio de cultivo de 100 mL y
un volumen total del matraz 500 mL el valor de kLa es de aproximadamente
0020 s-1 inferior al valor de 0026 s-1 obtenido en el presente estudio para el
cultivo en agitacioacuten magneacutetica a 30 ordmC Dado que la difusividad disminuye al
aumentar la temperatura es de esperar que a 30 ordmC dicho valor de kLa teoacuterico
sea auacuten menor
Es importante sentildealar que en lo referente a la composicioacuten del medio de
cultivo el medio de cultivo E empleado en este estudio es el mismo empleado
previamente por otros autores para el estudio de la produccioacuten de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a por lo cual no se considera que la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 78
composicioacuten del medio de cultivo pueda ser la responsable de las diferencias
con los resultados reportados anteriormente por otros investigadores quienes
en particular tambieacuten emplearon dicho medio de cultivo en sus pruebas
Dicho valor de rendimiento promedio obtenido de 4582 gL (en matraz)
coloca a este cepa al mismo nivel de productividad de las cepas
industrialmente empleadas como sucede con Bacillus subtilis F02-1 con un
rendimiento reportado por Kubota y colaboradores (1993) de 50 gL pero con
una menor necesidad de aacutecido glutaacutemico (20 gL en contra de 80 gL) La
conveniencia del empleo de la cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis debe
entonces evaluarse entorno a su capacidad de escalamiento y conservacioacuten de
la competencia en la produccioacuten de γ-PGA y no entorno a su maacuteximo
rendimiento pues en este aspecto ha demostrado en condiciones oacuteptimas la
capacidad de producir γ-PGA en concentraciones extremadamente elevadas
Los resultados acaacute obtenidos refuerzan lo ya descrito por otros autores quienes
sentildealan precisamente estos aspectos (escalamiento y estabilidad) como los
principales retos para llevar a cabo la produccioacuten de γ-PGA mediante Bacillus
licheniformis ATCC9945a
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente
Uno de los principales problemas que se enfrentoacute a lo largo de la
presente investigacioacuten es la facilidad con la cual la cepa ATCC9945a de
Bacillus licheniformis revierte a formas incapaces de producir γ-PGA Este
fenoacutemeno puede ocurrir incluso con tan soacutelo una generacioacuten de cultivo por lo
cual el empleo de la biomasa generada en una fermentacioacuten previa es
indeseable pues seguramente no daraacute resultados positivos para la produccioacuten
de γ-PGA
Este fenoacutemeno es uno de los principales inconvenientes que se
enfrentan a la hora de evaluar el efecto de diversos paraacutemetros sobre la
productividad de γ-PGA en esta cepa pues la incapacidad de garantizar
resultados reproducibles imposibilita poder evaluar condiciones nutricionales
de agitacioacuten temperatura y demaacutes teniendo la certeza que las diferencias
encontradas solo se deberaacuten a los paraacutemetros bajo control
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 79
Cromwick y colaboradores (1994) reportaron el congelamiento con
nitroacutegeno liacutequido como una forma vaacutelida para la preservacioacuten de las ceacutelulas en
un estado consistente de alta productividad de γ-PGA En nuestro caso la
metodologiacutea empleada fue distinta Se incorporoacute el glicerol como crioprotector y
el congelamiento no se realizoacute mediante nitroacutegeno liacutequido sino que fue
congelamiento convencional utilizando un equipo de refrigeracioacuten con una
capacidad de enfriamiento de hasta -80 ordmC y voluacutemenes de inoacuteculo pequentildeos
de entre 1 y 2 mL cuyo congelamiento fuera particularmente raacutepido
Igualmente se observoacute que los cultivos que mejor comportamiento y
reproducibilidad dieron como inoacuteculo fueron aquellos cuyas ceacutelulas eran
recolectadas previo al inicio de la produccioacuten de γ-PGA Cultivos cuya edad
superaba las 10 horas y que ya presentaban presencia de γ-PGA aunque
podiacutean emplearse para la obtencioacuten de inoacuteculos madres los mismos no
resultaban tan eficientes como los anteriormente descritos
El empleo de esta metodologiacutea de conservacioacuten de la cepa permitioacute una
reproducibilidad del 100 en los ensayos obtenieacutendose poliacutemero en la
totalidad de los cultivos de control que se establecieron durante cada una de
las fermentaciones llevadas a cabo en el biorreactor Estos resultados indican
que dicha metodologiacutea es eficaz para la preservacioacuten a largo plazo de Bacillus
licheniformis ATCC9945a y como estrategia para un adecuado escalamiento
durante el proceso de produccioacuten a mayor escala De igual manera la
descripcioacuten detallada del proceso de conservacioacuten volumen de inoacuteculo
concentracioacuten de la muestra (por absorbancia) temperatura y demaacutes permite
una alta reproducibilidad del meacutetodo en contraposicioacuten con los reportes
existentes por otros autores que no brindaban mayor detalles sobre coacutemo llevar
a cabo este proceso de conservacioacuten
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten
Las fermentaciones a presiones superiores a la presioacuten atmosfeacuterica no
son habituales tanto a nivel de investigacioacuten como a nivel de proceso Dicha
afirmacioacuten queda particularmente ratificada cuando se analizan las opciones
comerciales existentes a escala laboratorio de biorreactores disentildeados para
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 80
operar a presioacuten la cual resulta praacutecticamente nula Por este motivo y para
poder llevar a cabo este estudio se requirioacute adaptar un reactor quiacutemico de
modo tal que permitiese trabajar a presioacuten y a la vez tuviese un control de
agitacioacuten y temperatura miacutenimo de modo tal que permitiese el cultivo de
microorganismos El biorreactor disentildeado fue exitoso pues permitiacutea un
crecimiento microbiano oacuteptimo y la produccioacuten de γ-PGA en un tiempo
relativamente corto de 18 horas
Las modificaciones realizadas en realidad fueron miacutenimas con respecto
a la estructura baacutesica del reactor quiacutemico convencional y con ellas se buscoacute
crear las condiciones que permitiesen incrementar la turbulencia en el sistema
de modo que existiese una mayor oxigenacioacuten y un mayor coeficiente
volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno (kLa) partiendo de antemano de la
hipoacutetesis inicial que sentildealaba al oxiacutegeno como uno de los componentes
limitantes de hecho el de mayor importancia para que este fermentacioacuten
ocurriese de la manera adecuada y con un alto rendimiento de γ-PGA
Se decidioacute emplear un reactor hecho de vidrio en lugar de uno metaacutelico
debido a que las condiciones de oxidacioacuten de la fermentacioacuten y la sensibilidad
de las enzimas involucradas a los iones metaacutelicos haciacutean deseable un material
inerte como sucede con el vidrio De igual manera al emplearse vidrio se tiene
una visioacuten del interior del fermentador las condiciones de agitacioacuten y formacioacuten
de burbujas son visibles asiacute como el crecimiento microbiano lo que permite un
mejor ajuste y correccioacuten de las condiciones de fermentacioacuten al menos durante
las etapas iniciales de investigacioacuten Para poder trabajar a mayores presiones
se hubiese requerido un reactor quiacutemico metaacutelico de un costo sumamente
elevado Los resultados experimentales demostraron que el rango de presioacuten
definido resultoacute ser el correcto para la investigacioacuten
La seleccioacuten de una turbina tipo Rushton radica en que este tipo de
agitador de pala plana se considera como el ideal para la realizacioacuten de
fermentaciones Dado que las paletas de heacutelices Rushton son planas y
colocadas verticalmente a lo largo del eje de agitacioacuten producen un flujo radial
unidireccional que permite una alta difusioacuten de un gas en un liacutequido por lo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 81
comuacuten son utilizadas en la fermentacioacuten de liacuteneas celulares que requieren altas
tasas de oxiacutegeno tales como las levaduras bacterias y algunos hongos
Las laacuteminas deflectoras fueron incorporadas pues aunque a velocidades
muy bajas un agitador de paletas produce una agitacioacuten suave inclusive en un
tanque sin laacuteminas deflectoras cuando son necesarias velocidades elevadas
se requiere la incorporacioacuten de dichas laacuteminas para aumentar la turbulencia de
lo contrario el liacutequido se mueve como un remolino que gira alrededor del
tanque con velocidad elevada pero con poco efecto de mezcla
74 Tiempo de fermentacioacuten
El tiempo de fermentacioacuten empleado en esta investigacioacuten es
significativamente inferior al empleado por otros autores que hablan de un
promedio de 72 horas Es importante sentildealar que 18 horas es el tiempo
suficiente para que el pH del medio de cultivo descienda a cerca de 60
Valores de pH inferiores a este han demostrado ser perjudiciales pues decae
el consumo de aacutecido ciacutetrico se detiene en gran medida la polimerizacioacuten del γ-
PGA y la concentracioacuten tiende a disminuir con el paso del tiempo
Para poder aumentar el periacuteodo de fermentacioacuten se requeririacutea un
sistema de ajuste de pH que opere bajo condiciones del presioacuten mismo que no
se tuvo disponible Es probable que si se prolongara el tiempo de fermentacioacuten
dentro del biorreactor los rendimientos al cabo de 48 o 72 horas seriacutean un
poco mayores siempre y cuando se ajuste el pH en el valor de 65 como
recomiendan Cromwick y colaboradores (1995)
En nuestro caso el incremento del tiempo de fermentacioacuten sin
regulacioacuten del pH de 18 horas a 36 horas mostroacute un incremento miacutenimo en la
productividad (de 025 gL) pero si un cambio en la composicioacuten del γ-PGA
pues el pico de elucioacuten del poliacutemero se desplazoacute levemente hacia un valor de
tiempo mayor lo que podriacutea indicar una degradacioacuten parcial del poliacutemero
inicialmente producido Dichos datos se presentan en la figura 12
Nuestros resultados contradicen lo sentildealado por otros autores quienes
obtienen los mayores rendimientos entre las 48 y 96 horas Birrer y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 82
colaboradores (1995) observaron que Bacillus licheniformis ATCC9945a
alcanza la fase estacionaria a las 24 horas tiempo en el cual muy poco γ-PGA
ha sido formado y por consiguiente la mayor formacioacuten de γ-PGA acontece
entre las 24 y las 96 horas Estos resultados coinciden con los reportados por
Troy (1973) pero difieren a los observados por Goto y Kunioka (1992) con
Bacillus subtilis IFO3335 donde el mayor rendimiento se obtuvo desde las 24 y
hasta las 40 horas Estas diferencias podriacutean deberse a aspectos maacutes
relacionados con los voluacutemenes de fermentacioacuten empleados Por ejemplo para
el caso de Yoon y colaboradores (2000) estos alcanzaron rendimientos de 35
gL con un periacuteodo de fermentacioacuten maacuteximo de 35 horas indicando un
agotamiento del aacutecido ciacutetrico a las 20 horas en su caso el volumen empleado
fue de 1 litro de medio de cultivo
Figura 12 Cromatograma a las 18 (a) y 36 (b) horas de fermentacioacuten con Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 83
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento
Un punto vital para una adecuada fermentacioacuten es la concentracioacuten de
inoacuteculo aspecto que es sentildealado por Troy Cromwick y colaboradores a lo
largo de sus investigaciones pero que no detallan ni cuantifican
adecuadamente o al menos no lo reportan En nuestro caso se empleoacute un
inoacuteculo madre con una absorbancia de 25 o mayor y un inoacuteculo del reactor con
un valor de absorbancia de 120 aproximadamente con el propoacutesito de asiacute
logran estandarizar las condiciones de inoacuteculo Aunque este aspecto no fue
cuantificado a manera cualitativa si se observoacute un importante efecto de este
aspecto (concentracioacuten inicial) sobre la cantidad de γ-PGA obtenido y el tiempo
requerido Esto puede resultarnos obvio teniendo en cuenta una descripcioacuten no
estructurada del crecimiento microbiano pero podriacutea resultar maacutes compleja de
analizar si consideramos que la produccioacuten del γ-PGA estaacute afectada por
paraacutemetros de otra naturaleza maacutes allaacute de la disposicioacuten de nutrientes como
por ejemplo de una estructura celular particular o una relacioacuten de percepcioacuten
de quoacuterum dada Debemos recordar que la percepcioacuten de quoacuterum es un
mecanismo de regulacioacuten de la expresioacuten geneacutetica en respuesta a la densidad
de poblacioacuten celular Las ceacutelulas involucradas producen y excretan sustancias
llamadas autoinductores que sirven de sentildeal quiacutemica para inducir la expresioacuten
geneacutetica colectiva De Vizio (2011) sentildeala que en Bacillus licheniformis NCIMB
8874 la produccioacuten de lichenysin γ-PGA y algunas proteasas extracelulares
estaacute vinculado con los genes comQXPA mismo operoacuten que regula la
percepcioacuten de quoacuterum en Bacillus subtilis
De igual manera la relacioacuten de escalamiento aplicada fue de 16
ligeramente inferior a la que teoacutericamente se utiliza con mayor frecuencia de
110 Aunque este iacutendice no fue objeto de estudio su ajuste tambieacuten afecta de
manera directa los rendimientos obtenidos
La optimizacioacuten de la concentracioacuten del inoacuteculo la relacioacuten de
escalamiento y su frecuencia constituyen aspectos que deben estudiarse con
mayor profundidad para su propia optimizacioacuten pues su efecto sobre esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 84
fermentacioacuten y su rendimiento es bastante significativo Esta afirmacioacuten
adquiere validez cuando vemos que la produccioacuten del γ-PGA no es un
metabolito primario que se forme durante la fase de crecimiento exponencial
sino maacutes bien al inicio de la etapa estacionaria como indica Goto y Kunioka
(antildeo) o durante toda la etapa estacionaria tal y como lo sentildealan tanto Troy
(antildeo) como Birrer y colaboradores (1994) A esto debemos agregarle tambieacuten
lo anteriormente sentildealado referente a la concentracioacuten idoacutenea que produce la
percepcioacuten de quoacuterum responsable de direccionar el metabolismo de la
comunidad microbiana hacia la siacutentesis del γ-PGA
Conociendo la dependencia de esta biosiacutentesis de la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio y partiendo del hecho de que al inicio de la fase
estacionaria la concentracioacuten celular seraacute lo suficientemente alta para poner el
riesgo el mantenimiento de las condiciones aeroacutebicas en el biorreactor pero lo
justa para una adecuada siacutentesis del γ-PGA un inoacuteculo con una alta
concentracioacuten inicial de ceacutelulas podriacutea ayudar a obtener un mayor rendimiento
en un tiempo de fermentacioacuten menor o producir la respuesta de percepcioacuten de
quoacuterum (generalmente se trata de la liberacioacuten de un polipeacuteptido sentildeal) en un
tiempo menor con la consiguiente produccioacuten del γ-PGA
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa es un valor de
suma importancia para el escalamiento de bioprocesos en particular cuando
nos referimos a fermentaciones aeroacutebicas o cultivos de organismos o ceacutelulas
en condiciones de metabolismo aeroacutebico En nuestro caso un adecuado
coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno es garantiacutea que las
condiciones aeroacutebicas se sostendraacuten a lo largo del proceso de fermentacioacuten de
modo que no se produzcan desviacuteos metaboacutelicos indeseados o en el peor de
los casos el inicio del metabolismo anaerobio y la consecuente produccioacuten de
aacutecido aceacutetico
Los valores de kla obtenidos fueron de 0026 s-1 y 0025 s-1 para el
matraz y el bioreactor respectivamente Dichos valores por si mismos nos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 85
indican poco si no determinamos la tasa de consumo de oxiacutegeno requerida
para el cultivo aeroacutebico de Bacillus licheniformis Doran (1995) reporta una
velocidad de consumo de oxiacutegeno m02 para el cultivo aeroacutebico de Bacillus
licheniformis de 231 x 10-5 gO2 g-1cel s
-1 si la concentracioacuten de ceacutelulas X en el
reactor es de 20 gL (determinado experimentalmente como el valor final
alcanzado en matraces con alta concentracioacuten de γ-PGA) la tasa de consumo
de oxiacutegeno (OUR) MO2 seraacute igual a Xm02 es decir 46 x 10-4 mgO2mL-1s-1 A
partir de estos datos y conociendo que kla = MO2ΔcA ΔcA = cA ndash cA sabiendo
que presioacuten atmosfeacuterica cA = 801 mgL a 30 ordmC y el valor cA en el biorreactor
a 30 ordmC es 74 mgL obtenemos un valor de kla del orden de 0062 s-1 Dicho
valor corresponde al valor teoacuterico que seriacutea necesario para mantener el cultivo
con el suministro adecuado y suficiente de oxiacutegeno y que como puede verse
es 25 veces mayor al kla real lo que indica que cuando el cultivo alcance la
maacutexima concentracioacuten celular de 20 gL las condiciones del cultivo no seraacuten
suficientes para un metabolismo cien por ciento aeroacutebico
Tiene sentido entonces que los rendimientos alcanzados en matraz sean
significativamente mayores que los mejores rendimientos obtenidos en
bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica Dado que el cultivo en matraz incorporaba
uacutenicamente 100 mL de medio de cultivo el microorganismo es capaz de
alcanzar una mayor concentracioacuten en una menor unidad de tiempo lo que le
permite alcanzar una mayor concentracioacuten de poliacutemero durante las 26 horas de
cultivo (8 iniciales + 18)
Por su parte para el caso del biorreactor el crecimiento oacuteptimo
probablemente demore maacutes en alcanzarse por lo cual el tiempo que transcurre
entre el alcance de la concentracioacuten limitante de 8 gL (concentracioacuten a la cual
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y la tasa de consumo de oxiacutegeno
(OUR) se igualan) y la concentracioacuten oacuteptima es lo suficiente como para afectar
los rendimientos de γ-PGA Esto resulta evidente al comparar los resultados de
matraz con los de bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica (0 bar relativos) donde la
diferencia en productividad entre ambos es de 43 gL de γ-PGA Dicha
diferencia se explica porque mientras que la concentracioacuten del inoacuteculo madre
mostraba una absorbancia promedio de 25 la del inoacuteculo empleado para el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 86
biorreactor era de 120 (100 ml de medio + inoacuteculo madre creciendo durante 8
horas) es decir praacutecticamente la mitad por lo cual la concentracioacuten inicial de
ceacutelulas era significativamente menor para el biorreactor en comparacioacuten con el
matraz
77 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En condiciones estaacuteticas el contenido de γ-PGAdemostroacute reducir
considerablemente la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
pasando de 74 mgL a 440 mgL a una concentracioacuten del 20 en γ-PGA
Este fenoacutemeno puede deberse al incremento de la viscosidad por la
presencia del poliacutemero en el caldo de cultivo Dicha apreciacioacuten seguramente
afecta de manera negativa la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) pues
reduce tanto cA como cA sin embargo la determinacioacuten del valor de c
A de una
solucioacuten compuesta por sales γ-PGA y productos del metabolismo microbiano
es imposible de determinar teoacutericamente con certeza como para poder
cuantificar la magnitud de reduccioacuten de la OTR numeacutericamente De igual
manera el valor de kLa tambieacuten se ve afectado pues es sabido que a mayor
viscosidad mayor resistencia a la transferencia lo que reduce el valor de este
coeficiente
Asiacute mismo esta reduccioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
podriacutea deberse en parte a la naturaleza anioacutenica del poliacutemero y no solamente
al incremento de la viscosidad La solubilidad se ve afectada por la fuerza
ioacutenica por lo cual una solucioacuten con una concentracioacuten elevada de un poliacutemero
polianioacutenico como el γ-PGA probablemente muestre una importante reduccioacuten
en la solubilidad maacutexima (concentracioacuten de saturacioacuten) del oxiacutegeno en la
misma(Schumpe et al 1978)
Queda claro que dada esta reduccioacuten en la solubilidad de oxiacutegeno al
incrementar el contenido de γ-PGA durante la fermentacioacuten ya sea por la
naturaleza viscosa del biopoliacutemero o por su caraacutecter polianioacutenico la tasa de
transferencia de oxiacutegeno inicial y el valor de kLa se van reduciendo a lo largo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 87
del tiempo lo que dificulta auacuten maacutes garantizar las condiciones de oxigenacioacuten
oacuteptimas para este bioproceso Esto lo podemos explicar pues si tenemos que
OTR = kLa(cA-cA)
dado que al aumentar el contenido de γ-PGA ocurre una reduccioacuten en el valor
de kLa por accioacuten del incremento de la viscosidad (hecho que es
completamente cierto) y al aumentar la concentracioacuten de γ-PGA tambieacuten se
reduce tanto el valor de cA como el de cA (ya sea por efecto de la viscosidad o
de la naturaleza anioacutenico del poliacutemero) la OTR ve su magnitud evidente e
inevitablemente reducida dado que la misma es una relacioacuten de producto entre
ambos factores kLa y (cA ndashcA) Esto podriacutea explicar porque a voluacutemenes de
cultivo de 600 mL (en biorreactor) los rendimientos son mucho menores que en
voluacutemenes de cultivo de 100 ml (matraz) pues probablemente esta caiacuteda en la
OTR sea maacutes acentuada y criacutetica para los microorganismos cuando sucede a
voluacutemenes mayores donde mantener las condiciones de mezcla perfecta y una
alta concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto resultan maacutes dificultosas por lo que el
microorganismo es incapaz de crecer y alcanzar la concentracioacuten idoacutenea para
una maacutexima produccioacuten
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γshyPGA
La concentracioacuten de γ-PGA alcanzada al final de las 18 horas de
fermentacioacuten se vio afectada por la presioacuten Asiacute hasta los 103 bar a mayor
presioacuten mayor concentracioacuten de γ-PGA por encima de este valor de presioacuten la
concentracioacuten de γ-PGA disminuye
Esto puede explicarse por dos factores 1) el efecto de la presioacuten sobre
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y 2) impacto sobre la integridad y
viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γ-PGA
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR
La OTR se ve afectada tanto por el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de oxiacutegeno kLa asiacute como por la diferencia entre la concentracioacuten
de saturacioacuten y la concentracioacuten real en la fase liacutequida (cA-cA) El coeficiente kL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 88
es empiacuterico y su valor depende principalmente de factores tales como la
hidrodinaacutemica del sistema la turbulencia y su geometriacutea
Teoacutericamente kL se puede definir como kL = DABδ donde DAB es la
difusividad de A en B y δ es el espesor de la peliacutecula estancada seguacuten la
teoriacutea de peliacutecula para la transferencia de materia La difusividad en liacutequidos
depende en gran medida de la temperatura (afecta el coeficiente de difusioacuten) y
la concentracioacuten de solutos pero muy poco de la presioacuten (Diacuteaz 2011) En
nuestro caso podriacuteamos suponer que la presioacuten tiene poco efecto sobre kLa
pues tampoco es de esperar un cambio producto de la presioacuten en el aacuterea de
burbujas (a) producida por la agitacioacuten mecaacutenica auacuten maacutes cuando vemos el
hecho de que los ensayos llevados a cabo no contaron con un sistema de
aireacioacuten o burbujeo especiacutefico salvo aquel llevado a presioacuten atmosfeacuterica (0
bar relativa) y debidamente identificado como Aireacioacuten
Asiacute entonces tenemos en el segundo componente de la foacutermula la
diferencia (cA-cA) un punto de particular intereacutes pues efectivamente la
concentracioacuten de saturacioacuten y la concentracioacuten real variacutean con la presioacuten A
pesar de carecer de una sonda de oxiacutegeno disuelto directamente incorporada
al biorreactor y capaz de operar a presioacuten se determinoacute mediante transferencia
(con el sistema cerrado) la concentracioacuten real de oxiacutegeno en el medio de
cultivo a distintas presiones Tales concentraciones y las concentraciones de
saturacioacuten a cada presioacuten se presentan en el graacutefico 14
Para determinar el valor de las distintas concentraciones de saturacioacuten
al trabajar a presiones distintas a la atmosfeacuterica se realizoacute la siguiente
correccioacuten (Montoya amp Bermuacutedez 2003) para el valor de la solubilidad del
oxiacutegeno en agua
Ley de Henry
a 1 atm
Para una presioacuten P distinta a 1 atm tenemos que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 89
en mgL
Donde
C(S) = valor de solubilidad a 1 atm (mgL)
P = presioacuten de operacioacuten (atm)
T = temperatura de operacioacuten (K)
Graacutefico 14 Concentraciones de oxiacutegeno de saturacioacuten y en fas liacutequida a diferentes presiones
en medio de cultivo E sin crecimiento bacteriano
80
153
227
324
422
6681
141154
178
141
724857
1703
2438
y = 48525x + 68875
y = 14191x + 80039
y = 93382x + 11163
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
00
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 05 1 15 2 25 3
Concentracioacuten
Presioacuten (bar)
CONCENTRACIOacuteN DE SATURACIOacuteN CONCENTRACIOacuteN EN FASE LIacuteQUIDA DIFERENCIA
Aunque estos valores deben repetirse con una sonda de oxiacutegeno
disuelto interna (dentro del biorreactor) y bajo una metodologiacutea maacutes pertinente
preliminarmente puede observarse que la diferencia (cA-cA) aumenta al
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 90
aumentar la presioacuten y dado que OTR = kLa(cA-cA) al aumentar dicha
diferencia la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deberiacutea ser mayor Este
incremento de la OTR podriacutea explicar el porqueacute del raacutepido crecimiento
microbiano y la produccioacuten precoz de γ-PGA despueacutes de 18 horas de cultivo
en comparacioacuten con las entre 48 y 96 horas reportadas por otros autores asiacute
como el aumento del rendimiento al aumentar la presioacuten de los 0 bar relativos
(a presioacuten atmosfeacuterica) hasta los 103 bar relativos
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γshyPGA
Al superar los 103 bar relativos el rendimiento en γ-PGA decae
nuevamente Si consideramos un efecto positivo de la presioacuten sobre la OTR
como sentildealamos anteriormente esto no deberiacutea ocurrir Sin embargo al
someter las ceacutelulas a condiciones de presioacuten desconocemos el efecto que
dicha presioacuten puede ejercer sobre los microorganismos y sus rutas
metaboacutelicas asiacute como sobre la estructura de algunas biomoleacuteculas como por
ejemplo proteiacutenas
Meersman y Heremans (2008) sentildealan que el efecto de la presioacuten sobre
el crecimiento de los microorganismos puede explicarse por tres efectos
principales 1) Variaciones en el plegamiento y agregacioacuten de las proteiacutenas 2)
Variaciones en el estado de la membrana celular y 3) Variaciones en el
contenido de proteiacutenas asociadas a la membrana celular Estos aspectos son
de peculiar consideracioacuten pues la γ-PGA sintetasa es un complejo enzimaacutetico
formado por al menos tres unidades enzimaacuteticas distintas y que se encuentra
asociado a la membrana celular de Bacillus licheniformis
En lo referente a las proteiacutenas se sabe que su desnaturalizacioacuten se
produce por efecto de una reduccioacuten en su volumen producto de un cambio
configuracional probablemente de la estructura terciaria Asiacute tenemos que si el
volumen inicial de una proteiacutena viene dado por Vi = Vatomos + Vcavidades +
Vhidratacioacuten si en condiciones de presioacuten ocurre un cambio en el volumen de la
proteiacutena tal que ΔV = ΔVcavidades + ΔΔVhidratacioacuten(el volumen de los aacutetomos no
tiene por queacute variar con la presioacuten) la exposicioacuten de los grupos cargados o
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 91
hidrofoacutebicos de la proteiacutena al agua pueden conllevar a un cambio en la
estructura secundaria y terciaria de modo que la actividad de la proteiacutena se
vea perjudicada parcial o totalmente Esto se debe a que un aumento en la
presioacuten rompe las interacciones hidrofoacutebicas donde las interacciones proteiacutena-
proteiacutena son sustituidas por interacciones proteiacutena-agua particularmente
mediante puente de hidroacutegeno El incremento de la presioacuten podriacutea afectar la
conformacioacuten de alguno o algunos de los componentes del complejo
enzimaacutetico γ-PGA sintetasa lo que sin duda alguna se traduciriacutea en un menor
rendimiento en γ-PGA durante la fermentacioacuten Este posible efecto negativo de
la presioacuten sobre una de las enzimas involucradas en el proceso de biosiacutentesis
del γ-PGA se reafirma cuando vemos como variacutea la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA al aumentar la presioacuten aspecto que se discutiraacute con mayor detalle
maacutes adelante De hecho Ashiuchi y colaboradores (2004) sentildealan que el
complejo enzimaacutetico PgsBCA (γ-PGA sintetasa) es imposible de aislar en su
estado activo debido precisamente a su alta inestabilidad y elevada
hidrofobicidad
Por su parte la membrana celular al tratarse de una bicapa fosfolipiacutedica
es susceptible a sufrir cambios de fase producto de la temperatura o la presioacuten
como por ejemplo la transicioacuten gel-liacutequido El incremento de la presioacuten al igual
que sucede con la temperatura concede mayor fluidez a las bicapas lipiacutedicas
Asiacute en nuestro caso un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea permitir
una mayor difusioacuten de oxiacutegeno al interior celular lo que podriacutea afectar el
crecimiento bacteriano si por ejemplo se formase maacutes especies reactivas
toacutexicas de oxiacutegeno en el interior celular o si cierta maquinaria celular como la
misma γ-PGA sintetasa no fuese capaz de acoplarse adecuadamente en una
membrana con mayor fluidez
En lo referente a la interaccioacuten membrana celular-proteiacutenas es
importante destacar que entre el 20 y el 40 de las proteiacutenas de una ceacutelula
bacteriana suelen estar asociadas a esta estructura Como indicamos
anteriormente un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea afectar el
contenido concentracioacuten y capacidad de anclaje de las proteiacutenas a la
membrana celular El complejo enzimaacutetico γ-PGA sintetasa al tratarse de una
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 92
proteiacutena de membrana podriacutea no acoplarse de manera efectiva a la membrana
celular modificada bajo condiciones de presioacuten o ser liberada al medio de
cultivo lo que afectariacutea negativamente la produccioacuten de γ-PGA Estas
suposiciones podriacutean explicar el porqueacute de la gran cantidad de espuma
generada durante algunas fermentaciones a presioacuten (concretamente en
aquellas a una presioacuten superior a los 103 bar) a pesar de su menor
concentracioacuten de γ-PGA y teniendo presente que en las fermentaciones
microbianas la espuma suele estar constituida mayoritariamente por proteiacutenas
la presioacuten podriacutea estar favoreciendo la liberacioacuten de estas proteiacutenas al caldo de
cultivo y la consecuente formacioacuten abundante de espuma Este fenoacutemeno ya
ha sido reportado en otros microorganismos como Salmonella enterica donde
el tratamiento con presioacuten conllevaba a la peacuterdida de gran parte de sus
proteiacutenas de membrana y su consecuente liberacioacuten al medio de cultivo
(Meersman amp Heremans 2008) Esto se ve respaldado con las observaciones
de Ashiuchi y colaboradores (2004) quienes adicionaron detergentes como el
Tween20 y Triton X-114 (que modifican la estabilidad de la membrana celular y
favorece la liberacioacuten de las proteiacutenas asociadas a ella) a cultivos de Bacillus
spp productores de γ-PGA Ellos observaron una peacuterdida total de la capacidad
de siacutentesis del γ-PGA capacidad que no se recuperaba ni siquiera removiendo
la totalidad de dichos detergentes mediante diaacutelisis con lo cual concluyeron
que es indispensable que el complejo γ-PGA sintetasa se encuentre asociado a
la membrana celular para ser bioloacutegicamente activo
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γshyPGA
Un incremento de la intensidad de agitacioacuten afectariacutea positivamente el
valor de kLa incrementaacutendolo al aumentar el aacuterea de intercambio mediante una
mayor ruptura de las burbujas lo que aumenta el aacuterea de intercambio por
unidad de volumen Sin embargo existen liacutemites para la velocidad de agitacioacuten
esto debido al dantildeo ocasionado a los organismos debido a un esfuerzo
cortante excesivo A pesar de que la turbina Rushton es el impulsor de flujo
axial maacutes recomendado y maacutes eficiente para generar una mezcla perfecta de
alto perfil hidrodinaacutemico un bajo esfuerzo cortante y una alta distribucioacuten un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 93
exceso de agitacioacuten bajo condiciones de presioacuten es evidentemente perjudicial
Es probable que al aplicar presioacuten positiva sobre el cultivo la membrana celular
se encuentre en un estado de fluidez mayor al que presentariacutea a presioacuten
atmosfeacuterica asiacute mismo la presencia de glicerol en el medio de cultivo modifica
la composicioacuten lipiacutedica de la membrana favoreciendo la salida del γ-PGA al
exterior celular al aumentar de igual manera su fluidez Esto queda demostrado
por nuestros resultados a velocidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm
donde ocurre una reduccioacuten de la productividad conforme se aumenta la
agitacioacuten De igual manera la excesiva formacioacuten de espuma que se genera a
intensidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm podriacutea indicar la ruptura celular
y la liberacioacuten de componentes celulares y macromoleacuteculas al caldo de
fermentacioacuten Estas observaciones contradicen lo reportado por otros autores
(Yoon et al 2000) quienes indican velocidades de agitacioacuten oacuteptimas de hasta
1000 rpm a presioacuten atmosfeacuterica para un biorreactor de 24 L y un volumen
efectivo de cultivo de 1 L aunque no se brindan mayor detalle en lo referente al
tipo de turbina empleada
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
El cambio de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producto de la
presioacuten fue un resultado inesperado pues tradicionalmente se habiacutea sentildealado
a la concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo como el principal
responsable de controlar este aspecto Es importante destacar el hecho que
dicho cambio en la composicioacuten no es parcial o escalonado sino que por el
contrario el hecho de aplicar presioacuten durante la fermentacioacuten invierte
praacutecticamente los contenidos de aacutecido D-glutaacutemico y aacutecido L-glutamico de 87
y 13 respectivamente a presioacuten atmosfeacuterica (cultivo en matraz) a 17 y 83
respectivamente a una presioacuten relativa de 103 bar En algunos casos el
contenido de aacutecido D-glutaacutemico fue praacutecticamente 0
Efectivamente se sabe que el complejo γ-PGA sintetasa es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico aunque todaviacutea se
desconoce la arquitectura bioloacutegica de esta sintetasa Igualmente se sabe que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 94
es el componente PgsB el mayormente responsable de la cataacutelisis enzimaacutetica
(reaccioacuten de elongacioacuten del γ-PGA) (Ashiuchi 2010) Una hipoacutetesis que podriacutea
explicar estos resultados es que bajo presioacuten la estructura de esta proteiacutena se
modifique parcialmente (tanto la estructura de la proteiacutena propiamente dicha
como la estructura en funcioacuten de su anclaje a la membrana celular) lo
suficiente como para reducir su afinidad por el aacutecido D-glutaacutemico pero sin
afectar su afinidad por el aacutecido L-glutaacutemico ni conllevar a una
desnaturalizacioacuten de la proteiacutena y la consiguiente peacuterdida total de la actividad
enzimaacutetica Dado que es poco lo que se conoce de la estructura y mecanismo
de accioacuten de esta proteiacutena PgsB es imposible poder determinar con mayor
detalle el coacutemo pueden darse este cambio en la proteiacutena aunque casos
similares se observan durante la desnaturalizacioacuten de proteiacutenas por
temperatura donde las enzimas que operan sobre muacuteltiples sustratos no
pierden su capacidad enzimaacutetica de manera total sobre todos ellos sino que
inicialmente acontece una peacuterdida de afinidad diferenciada seguacuten el sustrato
hasta llegar al punto de desnaturalizacioacuten total donde se pierde toda actividad
enzimaacutetica para todos los sustratos
De igual manera es conocido que existe en Bacillus licheniformis una
enzima racemasa de naturaleza citosoacutelica responsable de transformar el aacutecido
L-glutaacutemico en aacutecido D-glutaacutemico podriacutea entonces tambieacuten asumirse alguacuten
efecto de la presioacuten sobre la actividad de la misma Sin embargo el hecho de
que esta enzima no esteacute asociada a una membrana celular (las proteiacutenas
asociadas a membrana celular tienden a ser maacutes vulnerables a los cambios de
presioacuten por la complejidad e indispensabilidad de su estructura terciaria sobre
su funcioacuten y su anclaje) sea una enzima de un uacutenico dominio y a que
experimentalmente el contenido de aacutecido D-glutaacutemico inclusive a la maacutexima
presioacuten (241 bar) no es cero hacen suponer que la misma se encuentra
bioloacutegicamente activa bajo las condiciones de presioacuten evaluadas
Estos resultados son de suma importancia pues para aplicaciones
biomeacutedicas y farmaceacuteuticas es necesario que el γ-PGA presente un alto
contenido en aacutecido L-glutaacutemico isoacutemero que es reconocido por el organismo
humano El efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre esta composicioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 95
enantiomeacuterica constituye un descubrimiento que pueda facilitar el empleo del γ-
PGA en medicina y que puede ser clave en el disentildeo de un proceso productivo
optimizado para tal fin
711 Peso molecular del γshyPGA En lo correspondiente al peso molecular del γ-PGA se observa que el
tamantildeo del poliacutemero es grande aunque no se observa ninguna tendencia en
los datos que pueda suponer alguacuten efecto de la presioacuten sobre el peso
molecular del poliacutemero Es importante sentildealar que la columna cromatograacutefica
empleada es incapaz de resolver moleacuteculas del alto peso molecular por lo
cual aunque si bien los resultados obtenidos resulten uacutetiles a nivel
comparativo dichos resultados deben tomarse con precaucioacuten Para un mejor
anaacutelisis seriacutea necesario emplear una columna capaz de resolver altos pesos
moleculares
Es importa sentildealar ademaacutes que tal y como se comentoacute anteriormente y
como se muestra en la figura 12 se observa una reduccioacuten del peso molecular
al prolongar el tiempo de fermentacioacuten hasta las 36 horas Para el caso del
reactor AHCJ32 al prolongar el tiempo de fermentacioacuten por 18 horas maacutes se
nota una reduccioacuten en la fraccioacuten de mayor peso molecular y un incremento en
la de menor sin que haya un cambio importante en el rendimiento global Esto
podriacutea deberse a que Bacillus licheniformis ATCC9945a posee enzimas
capaces de hidrolizar el γ-PGA y emplearlo como fuente de carbono Asiacute
mismo dicha observacioacuten sentildeala que si es necesario prolongar el tiempo de
fermentacioacuten es requerido realizar ajustes pues parece ser que la prolongacioacuten
por siacute misma uacutenicamente no es garantiacutea de una mejora en el rendimiento del
proceso fermentativo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 96
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 97
10 CONCLUSIONES
De la elaboracioacuten de la presente investigacioacuten se pueden extraer las
siguientes conclusiones principales
1) El rendimiento promedio en γ-PGA para el cultivo en matraz fue
superior a los 45 gL Dicho rendimiento es el mayor que se haya
reportado hasta la fecha para Bacillus licheniformis ATCC9945a lo
que convierte a esta cepa en una de las que mejor rendimiento
maacuteximo reporta para la biosiacutentesis de dicho poliacutemero natural
2) Un mecanismo eficiente para la conservacioacuten de cultivos de Bacillus
licheniformis ATCC9945a en un estado competente de produccioacuten
de γ-PGA es el congelamiento de ceacutelulas vegetativas a una
temperatura de -80 ordmC Es importante que la absorbancia de las
muestras congeladas sea superior a 25 lo que garantiza una alta
concentracioacuten de ceacutelulas
3) Dada la naturaleza del γ-PGA y su viscosidad el aumento de su
concentracioacuten en el caldo de cultivo a lo largo del tiempo de
fermentacioacuten afecta de manera negativa la tasa de transferencia de
oxiacutegeno disminuyeacutendola paulatinamente El cambio a condiciones
anaeroacutebicas conlleva a la detencioacuten de la biosiacutentesis del γ-PGA y el
consecuente inicio de un metabolismo netamente anaeroacutebico
4) Bacillus licheniformis ATCC9945a es capaz de crecer eficientemente
a presiones de hasta 242 bar relativos no vieacutendose afectado desde
el punto de vista de viabilidad por el incremento de la variable
presioacuten de fermentacioacuten
5) La presioacuten de fermentacioacuten afecta de manera significativa la
productividad de Bacillus licheniformis ATCC9945a en γ-PGA
6) El incremento de la presioacuten de fermentacioacuten hasta los 103 bar
relativos aumenta la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo de cultivo
seis veces (de 218 gL a 1334 gL) en comparacioacuten a los
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 98
rendimientos obtenidos a presioacuten atmosfeacuterica para un periacuteodo de
proceso de 18 horas
7) A presiones de fermentacioacuten superiores a los 103 bar la
productividad decae en comparacioacuten a la obtenida a dicha presioacuten
sin embargo la misma sigue siendo superior a la obtenida a presioacuten
atmosfeacuterica para un periacuteodo de proceso de 18 horas
8) El aumento de la presioacuten probablemente incremente la tasa de
transferencia de oxiacutegeno al incrementar la concentracioacuten de
saturacioacuten del mismo en el medio de cultivo lo que genera un
gradiente de concentracioacuten que permite una mayor transferencia
9) Presiones superiores a 103 bar probablemente afecten estructuras
celulares o biomoleacuteculas tales como las membranas celulares y las
proteiacutenas (γ-PGA sintasa) lo que tiene un efecto perjudicial sobre la
biosiacutentesis de γ-PGA
10) A una temperatura de 30 ordmC y a una presioacuten de 103 bar la
intensidad de agitacioacuten oacuteptima es de 300 rpm Una magnitud de
agitacioacuten mayor produce el dantildeo celular posiblemente por un exceso
de tensioacuten cortante
11) La presioacuten de fermentacioacuten modifica la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA A presioacuten atmosfeacuterica el γ-PGA estaacute compuesto
mayoritariamente por aacutecido D-glutaacutemico A presiones entre 052 y
242 bar dicha composicioacuten se revierte siendo el aacutecido L-glutaacutemico
el isoacutemero maacutes comuacutenmente presente en el γ-PGA
12) La biosiacutentesis de γ-PGA a presioacuten constituye una forma eficiente de
producir un biopoliacutemero mayoritariamente conformado por residuos
de aacutecido L-glutaacutemico aspecto de vital importancia para su aplicacioacuten
biomeacutedica dado que es este isoacutemero del aacutecido glutaacutemico es que es
reconocido y asimilado por el organismo humano
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 99
13) Aunque la modificacioacuten de la presioacuten de fermentacioacuten nunca ha sido
una variable importante en el estudio de los rendimientos para
distintos bioprocesos la presente investigacioacuten demuestra que la
modificacioacuten de dicha variable no soacutelo permite mejorar el
rendimiento global del proceso sino que tambieacuten puede conllevar a
la modificacioacuten del producto final lo que significariacutea una nueva rama
para la investigacioacuten en el disentildeo de bioprocesos de intereacutes
industrial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 100
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 101
11 AGRADECIMIENTOS
Un agradecimiento especial al profesor Jordi Bou por brindarme la
oportunidad de trabajar a su lado en este proyecto por el seguimiento y
asesoriacutea brindada a lo largo del mismo que nos permitioacute alcanzar nuestros
planteamientos y objetivos Espero que los aportes brindados con la presente
investigacioacuten permitan un mejor desarrollo en el futuro de estas temaacuteticas tan
novedosas biopoliacutemeros y fermentaciones bajo condiciones de presioacuten
positiva
Igualmente a la Ing Alejandra Hernaacutendez por la colaboracioacuten y asistencia
brindada durante esta investigacioacuten fue un apoyo importante durante el
desarrollo de las metodologiacuteas y distintas pruebas que se requirieron a lo largo
de esta investigacioacuten
A la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el Desarrollo
(AECID) y a Casa Ameacuterica Cataluntildea que me brindaron la oportunidad de cursar
este programa de maacutester a traveacutes de su programa de extensioacuten de becas a
ciudadanos extranjeros ha sido una oportunidad de crecimiento personal y
profesional que alcanza su punto maacuteximo con la elaboracioacuten de la presente
investigacioacuten El conocimiento adquirido sin duda alguna seraacute un valioso
compantildeero en mi desempentildeo profesional futuro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 102
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 103
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capsule in Bacillus licheniformis J Biol Chem 248305ndash316
Wecke T Veith B Ehrenreich A Mascher T (2006) Cell envelope stress response in Bacillus licheniformis integrating comparative genomics transcriptional profiling and regulon mining to decipher a complex regulatory network J Bacteriol Nov188(21)7500-11
Yoon HY Do JH Lee SY Chang HN (2000) Production of poly-γ-
glutamic acid by fed-batch culture of Bacillus licheniformisBiotechnolLett 22585-588
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 8
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 9
3 GLOSARIO
Bacillus Es un geacutenero de bacterias en forma de bastoacuten y Gram positiva El
geacutenero Bacillus pertenece a la divisioacuten Firmicutes Son aerobios estrictos o
anaerobios facultativos En condiciones estresantes forman una endospora de
ubicacioacuten central Dicha forma esporulada es resistente a las altas
temperaturas y a los desinfectantes quiacutemicos corrientes
γ-PGA Aacutecido gamma-poliglutaacutemico
ATCC American Type Culture Collection coleccioacuten y depositario de microorganismos
de importancia industrial y cientiacutefica
Biorreactor Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente
bioloacutegicamente activo En algunos casos un biorreactor es un recipiente en el
que se lleva a cabo un proceso quiacutemico que involucra organismos o
sustancias bioquiacutemicamente activas derivadas de dichos organismos Este
proceso puede ser aeroacutebico o anaeroacutebico Estos biorreactores son
comuacutenmente ciliacutendricos variando en tamantildeo desde algunos mililitros hasta
metros cuacutebicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable
OTR Tasa de transferencia de oxiacutegeno
OUR Tasa de consume de oxiacutegeno por parte de un microorganismo
kL Coeficiente de transferencia maacutesica
a Aacuterea de transferencia de materia por unidad de volumen
kLa Coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 10
cA
Concentracioacuten de saturacioacuten de oxiacutegeno Maacutexima concentracioacuten de oxiacutegeno que pueda estar disuelto en una fase liacutequida perfectamente mezclada
cA Concentracioacuten de oxiacutegeno en el liacutequido o concentracioacuten real Es determinada experimentalmente haciendo uso de una sonda de oxiacutegeno disuelto
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 11
4 PREFACIO
21 Origen del proyecto
Este proyecto forma parte de una serie de estudios llevados a cabo en
el ETSEIB referentes al empleo y produccioacuten de biopoliacutemeros en Cataluntildea
Anteriormente no solo se ha investigado en torno a la produccioacuten mediante
fermentacioacuten del biopoliacutemero aacutecido poliglutaacutemico sino tambieacuten sobre la
produccioacuten de aacutecido polilaacutectico y su biodegradabilidad entre otros
Una de las principales limitantes que han encontrado los estudios
previos sobre produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico en medio liacutequido mediante
fermentacioacuten sumergida es la dificultad del escalamiento muy probablemente
debido a la reduccioacuten en la tasa de transferencia de oxiacutegeno al aumentar los
voluacutemenes de cultivo lo que conlleva a rendimientos pobres o a la generacioacuten
de un poliacutemero de bajo peso molecular Asiacute mismo la reproducibilidad de los
resultados es pobre en parte por muacuteltiples factores que fueron estudiados con
mayor detalle en este trabajo
Con el propoacutesito de dar solucioacuten a este problema el presente proyecto
plantea una forma diferente y creativa al menos no es la comuacuten en el aacutembito
microbioloacutegico de abordar la limitacioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
durante la fermentacioacuten y que podriacutea ser la responsable de la reduccioacuten en los
rendimientos Asiacute mediante la aplicacioacuten de condiciones de presioacuten positiva se
plantea una posible viacutea de mejora de los rendimientos fermentativos en la
produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico esperando que sus efectos sobre la
viabilidad microbiana sean los menores posibles
22 Motivacioacuten
En la sociedad actual existe una creciente buacutesqueda de soluciones
bioloacutegicas para los problemas que anteriormente abordaacutebamos desde una
percepcioacuten uacutenicamente quiacutemica Asiacute hoy en diacutea con el propoacutesito de garantizar
la preservacioacuten del medio ambiente reducir el impacto de la actividad humana
sobre las especies animales y vegetales y garantizar un planeta a las futuras
generaciones la palabra biopoliacutemero y bioplaacutestico se han vuelto maacutes y maacutes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 12
comunes tanto en el argot popular como en el aacutembito del conocimiento
cientiacutefico donde diacutea con diacutea son maacutes las investigaciones orientadas a este tipo
de productos de naturaleza bioloacutegica y por consiguiente biodegradable
El aacutecido poliglutaacutemico por sus caracteriacutesticas constituye un poliacutemero
natural que ofrece una amplia gama de aplicaciones industriales donde puede
ser empleado tanto como agente espesante o floculador hasta aplicaciones
maacutes novedosas relacionadas con la medicina y la farmacia
En este contexto de buacutesqueda de soluciones amigables con el ambiente
es donde surge la principal motivacioacuten para investigar sobre el aacutecido
poliglutaacutemico en particular sobre coacutemo aumentar la productividad del proceso
fermentativo a partir del cual se realiza su siacutentesis de modo que las ventajas
teoacutericas que ofrece este producto pronto esteacuten disponibles tanto para el
consumidor como para la industria Tristemente los productos biotecnoloacutegicos
casi siempre tienen como principal inconveniente la valoracioacuten econoacutemica
pues tienden a ser difiacuteciles de producir por lo que tienen altos costos
asociados o sus rendimientos son menores a los deseados para hacerlos
econoacutemicamente rentables Por este motivo las investigaciones deben
procurar al menos orientarse a ofrecer soluciones que alguacuten diacutea puedan ser
llevadas a la praacutectica o como sucede con esta investigacioacuten procurar dar
respuesta a los problemas que se enfrentan cuando se trata de llevar un
producto biotecnoloacutegico a la realidad
La importancia de la investigacioacuten biotecnoloacutegica en el campo de los
materiales radica en que en un mundo con materias primas limitadas
particularmente las fuentes foacutesiles los materiales del futuro tendraacuten un origen
maacutes bioloacutegico que mineral o extractivo por lo que la mejora de los procesos
productivos relacionados con estos productos son prioritarios para cualquier
paiacutes que desee mantenerse competitivo en el aacutembito econoacutemico y tecnoloacutegico
mundial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 13
5 INTRODUCCIOacuteN
En la actualidad el desarrollo de biomateriales constituye uno de los
principales ejes de investigacioacuten en el mundo de la ciencia Dentro de estos
biomateriales los biopoliacutemeros han logrado un particularmente alto grado de
atencioacuten especialmente en los uacuteltimos 30 antildeos debidos a sus muacuteltiples
aplicaciones industriales biomeacutedicas y farmaceacuteuticas que estaacuten aportando una
amplia gama de opciones y soluciones a problemas ambientales y en la
formulacioacuten de nuevas preparaciones biomeacutedicas y farmaceacuteuticas
Los biopoliacutemeros son materiales polimeacutericos o macromoleculares que
son sintetizados por seres vivos Debido en gran parte al precio creciente la
viabilidad declinante de las fuentes foacutesiles como materias primas asiacute como el
ritmo crecimiento de la poblacioacuten mundial han propiciado el desarrollo de
fuentes alternativas renovables capaces de suministrar las necesidades
mundiales crecientes en material de energiacutea y produccioacuten quiacutemica Esta
necesidad de nuevas fuentes alternativas ha permitido que la mirada cientiacutefica
se halle puesta sobre la diversidad microbiana que habita el planeta pues los
microorganismos siempre han demostrado ser una fuente importante de
materiales novedosos con la ventaja que en la actualidad se dispone de la
tecnologiacutea necesaria para crecer los microorganismos de manera masiva y
segura Este nuevo modelo conocido como la estrategia de las biorefineriacuteas
ha cambiado la concepcioacuten de la industria quiacutemica moderna y ha sido
empleada exitosamente en la produccioacuten convencional a granel de diversos
productos quiacutemicos como por ejemplo etanol glutamato y aacutecido ciacutetrico
En el presente la produccioacuten de poliacutemeros o monoacutemeros tales como el
13-propanediol el aacutecido polilaacutectico y los polihidroxialcanoatos ha sido uno de
los principales objetivos de mayor investigacioacuten Dentro de estos nuevos
materiales encontramos los poliaminoaacutecidos poliamidas de naturaleza
polimeacuterica cuyos constituyentes estaacuten unidos por enlaces del tipo amida El
aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) es uno de estos poliaminoaacutecidos un poliacutemero
biodegradable constituido por unidades de D- y L-aacutecido glutaacutemico y que es
producido de manera natural en algunas bacterias
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 14
El presente trabajo procura investigar sobre algunas de las condiciones
involucradas en la produccioacuten bacteriana de γ-PGA y que constituyen las
principales barreras que impiden alcanzar los rendimientos necesarios para
que la produccioacuten bioloacutegica de este poliacutemero sea viable tanto desde el punto de
vista bioloacutegico como econoacutemico
31 Objetivos
El objetivo general a partir del cual se estructura el desarrollo de la
presente investigacioacuten es
Estudiar la produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a y el efecto que tiene sobre el rendimiento y estructura del
producto factores propios de la ingenieriacutea quiacutemica como lo son la
presioacuten y la intensidad de agitacioacuten
Los objetivos especiacuteficos que se plantearon alcanzar en el siguiente
proyecto son los siguientes
Disentildear un biorreactor que permita realizar fermentaciones a presioacuten
positiva de hasta 4 bar absolutos
Describir las condiciones baacutesicas requeridas para lograr reproducibilidad
en la produccioacuten deaacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre el rendimiento de
produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico en gL por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre la composicioacuten
enantiomeacuterica y el peso molecular del aacutecido γ-poliglutaacutemico
Establecer el posible efecto de la presioacuten positiva sobre la tasa de
transferencia de oxiacutegeno en el biorreactor
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 15
6 MARCO TEOacuteRICO
41 Los poliaminoaacutecidos
Los poliaminoaacutecidos son poliamidas formadas por un uacutenico aminoaacutecido
y difieren de las proteiacutenas en muacuteltiples aspectos Las proteiacutenas son
biomoleacuteculas compuestas por una amplia gama de aminoaacutecidos mientras que
los poliaminoaacutecidos estaacuten compuestos uacutenicamente por un solo tipo de
aminoaacutecido al menos en su eje central La siacutentesis de proteiacutenas estaacute dirigida
por el ADN que controla la secuencia especiacutefica de aminoaacutecidos que termina
formando una moleacutecula de una proteiacutena en particular Por su parte los
poliaminoaacutecidos son sintetizados por una ruta metaboacutelica de los organismos
completamente distinta En enlace amida en las proteiacutenas acontece
uacutenicamente entre los grupos α-amino y α-carboxilo mientras que en los
poliaminoaacutecidos pueden verse involucradas otras cadenas laterales
funcionales como por ejemplo los grupos β- y γ-carboxiloy ε-amino(Bajaj amp
Singhal 2011)
Existen mayoritariamente tres poliaminoaacutecidos presentes en la
naturaleza el aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina En
el aacutecido γ-poliglutaacutemico los enlaces amida se forman entre el grupo α-amino y
el γ-carboxilo en el eje central La poli ε-lisina presenta monoacutemeros de lisina
unidos por los grupos α-carboxilo y ε-amino La cianoficina consiste en residuos
de aacutecido α-aspaacutertico que contienen residuos de arginina que penden unidos al
grupo β-carboxilo Las foacutermulas de dichos compuestos se presentan en la
figura 1
42 El aacutecido γshypoliglutaacutemico (γshyPGA)
El aacutecido γ-poliglutaacutemico (de ahora en adelante referido como γ-PGA) es
un poliacutemero inusual que acontece de forma natural anioacutenico soluble en agua
biodegradable comestible y que no resulta toacutexico ni para el ser humano ni para
el ambiente que en la naturaleza es producido por algunas bacterias todas
Gram-positivas una archea e inclusive en eucariotas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 16
Fue primeramente descubierto por Ivaacutenovics y colaboradores como
componente de la caacutepsula de la bacteria Bacillus anthracis despueacutes que se
liberara al medio producto tanto del proceso de autoclavado como por el
envejecimiento y lisis natural de los cultivos La comida tradicional japonesa
ldquoNattordquo estaacute constituida por una mezcla de γ-PGA y fructanos que son
producidos por la bacteria Bacillus natto (Bajaj amp Singhal 2011)
Figura 1 Foacutermula y estructura del aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina
(Fuente Feng et al 2007)
421 Propiedades quiacutemicas y bioquiacutemicas del γshyPGA
El γ-PGA es un poliacutemero polianioacutenico que puede estar compuesto
uacutenicamente por D- L- o por ambos enantioacutemeros del aacutecido glutaacutemico Como se
ha comentado ya es altamente soluble en agua El γ-PGA probablemente
pueda adoptar diferentes estructuras La estructura del γ-PGA ha sido predicha
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 17
asumiendo poliaminoaacutecidos constituidos por 10 o 25 moleacuteculas de aacutecido
glutaacutemico Este modelo teoacuterico calculado para una moleacutecula en solucioacuten
acuosa muestra que el γ-PGA consiste de una heacutelice levoacutegira estabilizada por
enlaces de hidroacutegeno intramoleculares Sin embargo otro estudio realizado a
partir de γ-PGA obtenido de Bacillus licheniformis mostroacute que la conformacioacuten
es realmente flexible y depende de la concentracioacuten de γ-PGA y el pH de la
disolucioacuten A bajas concentraciones (01 wv) y a un pH inferior a 7 el γ-PGA
adopta una conformacioacuten basada mayoritariamente en heacutelices del tipo α
mientras que la conformacioacuten tipo hojas β predomina a pH superiores pues
esta conformacioacuten permite una mejor exposicioacuten de las cargas negativas del γ-
PGA (Candelaamp Fouet 2006) Recientemente mediamente experimentos de
dicroiacutesmo circular se ha reportado una estructura desordenada (Joyce et al
2006 Candela amp Fouet 2006) pero sin detallar las condiciones de trabajo de
los experimentos en particular de pH
El peso molecular del γ-PGA parece variar seguacuten sea el organismo que
produce la moleacutecula sin embargo estas diferencias podriacutean deberse a
diferencias en torno a la degradacioacuten natural que acontece con el poliacutemero o a
los meacutetodos de purificacioacuten y anaacutelisis utilizados mismos que puedan afectar el
tamantildeo del γ-PGA Por ejemplo para el caso de Bacillus subtilis el peso
molecular del γ-PGA variacutea entre 160kDa hasta 1500 kDa las cadenas de γ-
PGA consisten entonces de coacutemo miacutenimo 1000 residuos de aacutecido glutaacutemico
Diferentes estudios enfocados en la siacutentesis microbioloacutegica de γ-PGA han
demostrado que el peso molecular de este poliacutemero es dependiente tanto de
las diversas cepas bacterianas que se empleen asiacute como de los componentes
del medio y las condiciones del medio de cultivo e inclusive de razones auacuten no
dilucidadas De alliacute que exista una gran dificultad para obtener un γ-PGA
altamente homogeacuteneo a partir de cultivos bacterianos esto en gran parte
debido a esta inestabilidad descrita asiacute como a la complejidad molecular
involucrada en su biosiacutentesis
Asiacute mismo el γ-PGA puede contener soacutelo aacutecido D-glutaacutemico soacutelo aacutecido
L-glutaacutemico o una mezcla de ambos enantioacutemeros De alliacute que los filamentos
puedan ser de aacutecido γ-poli-L-glutaacutemico (γ-PLGA) de aacutecido γ-poli-D-glutaacutemico
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 18
(γ-PDGA) o de aacutecido γ-poli-L-D-glutaacutemico (γ-PLDGA) La disposicioacuten de los
residuos en el PLGDA requiere un especial anaacutelisis ya que si bien tanto el
PLGA y el PDGA son ambos solubles en etanol cuando ambos se mezclan en
proporcioacuten equimolar precipitan en etanol Esta observacioacuten es utilizada para
demostrar que el γ-PGA producido por Bacillus licheniformis estaacute compuesto
por cadenas tanto de PLGA como de PDGA Asiacute mismo la digestioacuten con L-
glutamilhidrolasa ha demostrado que el γ-PGA de Bacillus subtilis consiste en
una mezcla de isoacutemeros PLGA y PLDGA
422 Siacutentesis microbioloacutegica de γshyPGA
Distribucioacuten en los microorganismos
Inicialmente el γ-PGA fue detectado como un componente de la pared
capsular de la altamente patogeacutenica bacteria Gram-positiva Bacillus anthracis
Posteriormente este poliacutemero seriacutea nuevamente encontrado presente alrededor
de ceacutelulas de otras bacterias Gram-positivas no patogeacutenicas particularmente
del geacutenero Bacillus Gracias a estos descubrimientos fue posible aislar a inicios
del siglo pasado una cepa de Bacillus capaz de producir grandes cantidades de
γ-PGA
Posteriormente y de manera adicional a estas bacterias formadoras de
endosporas del geacutenero Bacillus el γ-PGA fue encontrado en las eubacterias
haloacutefilas Sporosarcina halophila y Planococcus halophilus y en la
archeobacteria haloacutefila Natrialba aegyptiaca Asiacute mismo γ-PGA fue tambieacuten
detectado en cantidades significativas en nematocistos de Cnidaria (eucariota)
En la tabla 1 se presentan los principales organismos productores de γ-
PGA y algunas de las caracteriacutesticas del γ-PGA producido
Ruta de biosiacutentesis
La conversioacuten de glucosa a γ-PGA sugiere que la siacutentesis del poliacutemero
acontece durante la glicoacutelisis y el ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos (ciclo de
Krebs o del aacutecido ciacutetrico) hasta el 2-oxoglurato (α-cetoglutarato) que es un
precursor directo del aacutecido L-glutaacutemico Durante su crecimiento en un medio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 19
Tabla 1 Organismos que han sido reportados como productores de γ-PGA
ORGANISMO CONFORMACIOacuteN CONFORMACIOacuteN DEL FILAMENTO
Bacillus anthracis D D
Bacillus mesentericus D D
Bacillus licheniformis D y L D y L
Bacillus megaterium D y L D + L
Bacillus pumilus D y L ND
Bacillus subtilis D y L L y D+L
Planococcus halophilus D D
Sporosarcina halophila D D
Staphylococcus
epidermidis
D y L ND
Natrialba aegyptiaca L L
Hydra ND ND
Fuente (Candela amp Fouet 2006)
nutritivo Bacillus licheniformis expresa dos enzimas capaces de sintetizar el
aacutecido L-glutaacutemico la glutamato sintasa y la glutamato deshidrogenasa Ambas
enzimas son praacutecticamente insensibles a la inhibicioacuten por producto lo que
permite alcanzar altas concentraciones intracelulares de aacutecido L-glutaacutemico el
cual es entonces direccionado a la siacutentesis de γ-PGA Los estudios maacutes
detallados relacionados con la polimerizacioacuten del γ-PGA se han realizado con
Bacillus anthracis Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis especialmente
Bacillus licheniformis ATCC9945a lo que ha permitido la identificacioacuten de un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 20
sistema enzimaacutetico anclado a la membrada y denominado como PGA-
sintetasa Este sistema enzimaacutetico estaacute constituido por al menos tres
componentes con actividad enzimaacutetica y se presume que cataliza la siguiente
secuencia de reacciones (Troy 1973) (figura 2)
Aacutecido L-glutaacutemico + ATP ɣ-L-glutamil-AMP + PPi (a)
ɣ-L-glutamil-AMP + SH-enzima ɣ-X-glutamil-S-enzima + AMP (b)
ɣ-X-glutamil-S-enzimaɣ-D-glutamil-S-enzima (c)
ɣ-D-glutamil-S-enzima + [ɣ-D-glutamil]n[ɣ-D-glutamil]n+1 + SH-enzima (d)
Figura 2 Posible mecanismo enzimaacutetico de siacutentesis del γ-PGA (Fuente Ashiuchi 2010)
De acuerdo con este modelo solamente el aacutecido L-glutaacutemico es activado
en el paso (a) mediante fosforilacioacuten lo que significa que la biosiacutentesis del γ-
PGA requiere el suministro de energiacutea para la formacioacuten del enlace amida Maacutes
recientemente un segundo mecanismo ha sido descrito por Ashiuchi (2001) e
involucra un complejo enzimaacutetico denominado PgsBCA el cual es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico y donde la
polimerizacioacuten ocurre por un mecanismo de ligacioacuten tipo amida (figura 3)
Inicialmente se habiacutea descrito que el complejo enzimaacutetico era el responsable
de racemizar y polimerizar el aacutecido glutaacutemico sin embargo estas nuevas
evidencias parecen demostrar que el complejo enzimaacutetico involucrado en la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 21
siacutentesis de γ-PGA carece de actividad racemasa y que la formacioacuten del aacutecido
D-glutaacutemico es responsabilidad de una enzima citosoacutelica denominada aacutecido
glutaacutemico racemasa Glr que presenta una alta selectividad por el aacutecido
glutaacutemico y una mayor preferencia por el aacutecido L-glutaacutemico Un modelo de la
viacutea metaboacutelica mayoritariamente aceptada para la siacutentesis de γ-PGA se
presente en la figura 4
Figura 3 Mecanismo propuesto de biosiacutentesis del γ-PGA mediante ligacioacuten tipo amida
(Fuente Ashiuchi 2001)
Figura 4 Viacutea metaboacutelica de biosiacutentesis del γ-PGA (Fuente Buescher amp Margaritis 2007)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 22
Organizacioacuten geneacutetica
Solamente unas pocas bacterias la mayoriacutea dentro del geacutenero Bacillus
han sido reportadas como capaces de producir γ-PGA Asiacute mismo la
produccioacuten de γ-PGA no es uniforme en estos individuos inesperadamente
variacutea inclusive bajo condiciones de cultivo altamente estrictas De alliacute que la
identificacioacuten del sistema regulatorio y los genes involucrados en dicho sistema
es vital para dar solucioacuten a estos problemas de uniformidad y rendimiento El
complejo PGA-sintetasa estaacute codificado por cuatro loci que son denominados
pgs Los cuatro genes pgs son pgsB pgsC pgsAA y pgsE y se les denomina
en conjunto pgsBCA Todos estos genes son necesarios y suficientes para la
produccioacuten de γ-PGA in vivo La figura 5 muestra los elementos geneacuteticos
requeridos para la produccioacuten de γ-PGA en diferentes especies del genero
Bacillus
Figura 5 Elementos geneacuteticos necesarios para la siacutentesis de γ-PGA (Fuente Candela amp
Fouet 2006)
423 Produccioacuten fermentativa de γshyPGA
Diferentes cepas de bacterias del geacutenero Bacillus son capaces de
producir elγ-PGA ya sea como material viscoso extracelular o como
componente capsular En termino industrial estas cepas han sido las maacutes
utilizadas y por ende las maacutes estudiadas hasta el momento La mayor parte de
los estudios han estado orientados a determinar los requerimientos
nutricionales para el adecuado crecimiento celular asiacute como mejorar la
productividad de γ-PGA y la variacioacuten en la composicioacuten de su estructura en lo
referente al contenido de aacutecido L- y D-glutaacutemico Estos estudios como los
realizados por Troy (1973) Cromwicket al (1995) y Kunioka (1997) han
permitido determinar que los requerimientos nutricionales para la produccioacuten de
γ-PGA variacutean seguacuten sea la cepa que se emplea
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 23
De acuerdo a estos requerimientos nutricionales las cepas productoras
de γ-PGA se han dividido en dos grupos uno que requiere la adicioacuten de aacutecido
L-glutaacutemico al medio de cultivo para estimular la produccioacuten de γ-PGA y el
crecimiento celular y otro que no requiere de aacutecido L-glutaacutemico para la
produccioacuten de γ-PGA
Dentro de las bacterias dependientes de aacutecido L-glutaacutemico las cepas
maacutes promisorias han sido B anthracis B licheniformis ATCC9945a B subtilis
IFO3335 y B subtilis F-2-01 Por su parte dentro de las bacterias
independientes de aacutecido L-glutaacutemico encontramos mayoritariamente los caso s
de B subtilis 5E B subtilis TAM-4 y B licheniformis A35 B subtilis 5E puede
producir γ-PGA a partir de L-prolina como uacutenica fuente de carbono
complementado con una fuente de nitroacutegeno en un medio mineral B
licheniformis A35 produce γ-PGA a partir de glucosa y cloruro de amonio en
condiciones desnitrificantes y B subtilis TAM-4 produce grandes cantidades de
γ-PGA cuando crece en un medio de cultivo con una sal de amonio y azuacutecar
como fuentes de nitroacutegeno y carbono respectivamente Asiacute mismo ademaacutes de
la fuente de carbono y nitroacutegeno existen otra serie de factores tales como
fuerza ioacutenica del medio de cultivo pH del medio de cultivo aireacioacuten entre
otros que afectan en gran medida la productividad y calidad del γ-PGA
De primera impresioacuten pareciera conveniente el empleo de las cepas
independientes de aacutecido L-glutaacutemico para la produccioacuten industrial de γ-PGA
sin embargo la informacioacuten disponible en lo referente a la ruta biosinteacutetica el
mecanismo de formacioacuten del γ-PGA y los factores que afectan la productividad
es praacutecticamente nula para estas cepas A partir de los trabajos de
investigacioacuten y los estudios de aplicaciones industriales la produccioacuten de γ-
PGA se ha llevado a cabo mayoritariamente a partir de cepas dependientes de
aacutecido L-glutaacutemico
En la tabla 2 se presentan algunas de las principales cepas bacterianas
empleadas para la produccioacuten de γ-PGA los nutrientes las condiciones de
cultivo el rendimiento obtenido asiacute como los voluacutemenes de cultivo en que se
basan dichos reportes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 24
Tabla 2 Principales bacterias productoras de γ-PGA (Shih amp Van 2001)
CEPA
NUTRIENTES
CONDICIONES DE CULTIVO
RENDIMIENTO
VOLUMEN DE
TRABAJO B licheniformis ATCC9945a
Aacutecido glutaacutemico (20 gL) aacutecido ciacutetrico (12 gL) NH4Cl (7 gL)
30ordmC 4 diacuteas 17-23 gL 100 mL
B subtilis IFO 3335
Aacutecido glutaacutemico (30 gL) aacutecido ciacutetrico (20 gL)
37ordmC 2 diacuteas 10-20 gL 125 mL
B subtilis TAM-4
Fructosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 4 diacuteas 20 gL 100 mL
B licheniformis A35
Glucosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 3-5 diacuteas 8-12 gL 100 mL
B subtilis F02-1
Aacutecido glutaacutemico(70 gL) glucosa (1 gL)
30ordmC 2-3 diacuteas 50 gL 200 mL
B subtilis (natto)
Maltosa (60 gL) salsa de soya (70 gL) glutamato soacutedico (30 gL)
40 ordmC 3-4 diacuteas 35 gL 125 mL
Fuente Shih amp Van 2001
424 Produccioacuten de γshyPGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a
Generalidades de la bacteria Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis es una bacteria comuacutenmente encontrada en el
suelo y en las plumas de las aves Es gram-positiva de forma oval y mesoacutefila
Su temperatura oacuteptima de crecimiento se encuentra alrededor de los 30 ordmC
aunque es capaz de sobrevivir a temperaturas mucho mayores La temperatura
oacuteptima para la secrecioacuten de enzimas es de 37 ordmC Esta bacteria puede existir
como espora cuando las condiciones son inadecuadas o en estado vegetativo
cuando las condiciones le son maacutes favorables (Wecke et al 2006)
Bacillus licheniformis forma parte del grupo Subtilis junto con Bacillus
subtilis y Bacillus pumilus Estas bacterias son conocidas por ser
contaminantes comunes de alimentos asiacute como favorecer su descomposicioacuten
aunque no se consideran patoacutegenos de importancia para el ser humano
(Wecke et al 2006)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 25
La cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis y la siacutentesis de γ-PGA
La produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a fue
primeramente estudiada por Bovarnick en 1942 sin embargo no fue sino a
partir de 1954 cuando Thorne y colaboradores iniciaron una serie de estudios
sistemaacuteticos orientados a investigar los factores que afectan la produccioacuten de
γ-PGA lo que permitioacute determinar algunos factores y condiciones necesarios
para lograr mayores rendimientos Factores tales como presencia de ciertas
sales inorgaacutenicas aacutecido glutaacutemico aacutecido ciacutetrico glicerol y el tamantildeo del inoacuteculo
demostraron tener efectos importantes sobre el rendimiento de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a tanto en condiciones estaacuteticas como cultivos
bajo agitacioacuten Se encontroacute que los mejores rendimientos se produciacutean cuando
el microorganismo era cultivado en agitacioacuten orbital en un medio de cultivo
denominado como medio C (tabla 3) alcanzando una productividad de hasta
15 gL en un periacuteodo de 3-4 diacuteas Asiacute mismo la mayor produccioacuten de poliacutemero
soacutelo se alcanzaba cuando se empleaba agua de grifo y un lote especiacutefico de
FeCl3 Posteriormente se determinariacutea que dicho lote de FeCl3 estaba
contaminado con trazas de Mn2+ y que el agua de grifo conteniacutea cantidades
significativas de Ca2+ Posteriormente Leonard y colaboradores (1958) se
encargariacutean de comprobar la funcioacuten y concentracioacuten oacuteptima de ambos
elementos quiacutemicos mediante la elaboracioacuten de un medio de cultivo
quiacutemicamente definido tomando como base el medio C de Thorne
Tabla 3 Composicioacuten del medio de cultivo C (Thorne et al 1954)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua de grifo
Fuente Shih amp Van 2001
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 26
Leonard y colaboradores encontraron que aunque solamente se requeriacutea
de 15 x 10-7 moles por litro de Mn2+ para alcanzar el maacuteximo crecimiento
concentraciones mayores de Mn2+ mostraban un marcado efecto prolongando
la viabilidad celular y por consiguiente incrementando la productividad de γ-
PGA Un incremento de hasta 615 x 10-4 molL en la concentracioacuten de Mn2+
permitiacutea alcanzar los mayores rendimientos de γ-PGA De igual manera la
adicioacuten de 102 x 10-3 moles por litro de Ca2+ en presencia de 15 x 10-7 moles
por litro de Mn2+ permitiacutea alcanzar auacuten mayores rendimientos deγ-PGA en
comparacioacuten a los valores oacuteptimos de produccioacuten de poliacutemero obtenidos en
ausencia de este elemento El γ-PGA producido consistiacutea en un homopoliacutemero
de unidades repetidas de aacutecido D- y L-glutaacutemico con una concentracioacuten de
aacutecido D-glutaacutemico que variaba entre el 38 y el 86 seguacuten incrementaba la
concentracioacuten de Mn2+ entre 154 x 10-7 y 246 x 10-3 molL siendo esta
observacioacuten independiente de la concentracioacuten presente en el medio de cultivo
de Ca2+
Tabla 4 Composicioacuten del medio E revisado (Leonard et al 1958)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 0000026 a
042 CaCl22H2O 015 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua destilada
Fuente Shih amp Van 2001
A partir de estos resultados Leonard y colaboradores elaboraron el
medio de cultivo denominado Medio E (tabla 4) que es baacutesicamente el medio
original C exceptuando el hecho de que cantidades definidas de Mn2+ y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 27
Ca2+fueron agregadas El Ca2+ fue adicionado con el propoacutesito de asegurar
altas productividades de poliacutemero a cualquier concentracioacuten de Mn2+ que se
empleara mientras que la variacioacuten de la concentracioacuten de este uacuteltimo
elemento permitiriacutea alcanzar el contenido enantiomeacuterico deseado en el
poliacutemero tal y como se comentoacute anteriormente
La estereoquiacutemica del poliacutemero es decir el contenido enantiomeacuterico del
γ-PGA ha sido desde el inicio de las investigaciones uno de los problemas maacutes
complejos y de difiacutecil solucioacuten y de una importancia tanto fundamental como
praacutectica en lo que se refiere al estudio de la produccioacuten de γ-PGA en bacterias
A lo largo de todos estos antildeos han existido numerosas contradicciones entre
los investigadores en cuanto a si el contenido enantiomeacuterico del γ-PGA
producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a estaacute o no afectado por la
concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo Cromwick y Gross (1995)
realizaron un estudio profundo sobre los factores que influenciaban la
produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a Dicho estudio
encontroacute que el porcentaje de aacutecido L-glutaacutemico presente en el γ-PGA variaba
entre 59 y 10 cuando las concentraciones de Mn2+ variaban entre 0 y 615
μmolL asiacute mismo el rendimiento incrementaba desde los 5 hasta los 17 gL en
dicho intervalo de concentracioacuten de Mn2+
Cromwick y Gross (1995) encontraron en este mismo estudio que la
incorporacioacuten de Mn2+ al medio de cultivo es un factor criacutetico para la
conservacioacuten de la viabilidad celular durante periodos de cultivo prolongados
El nuacutemero de ceacutelulas viables se incrementaba del orden de 105 a 109 unidades
formadoras de colonias (ufc) para todas las concentraciones de Mn2+ hasta el
inicio de la fase estacionaria aproximadamente a las 24 horas Sin embargo
despueacutes de 50 horas de cultivo la viabilidad celular se veiacutea reducida
draacutesticamente para aquellas concentraciones de Mn2+ relativamente menores
(0 a 0615 μmolL) mientras que para las concentraciones mayores (338 a 615
μmolL) el nuacutemero de ceacutelulas viables se manteniacutea en el orden de 107-109
inclusive despueacutes de 140 horas de cultivo Asiacute mismo la presencia de Mn2+ en
concentraciones entre 338 y 615 μ incrementaba la utilizacioacuten de las fuentes
de carbono en gran medida cultivos que conteniacutean 615 μmolL de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 28
Mn2+utilizaban el 37 54 y 93 del aacutecido glutaacutemico el glicerol y el aacutecido
ciacutetrico respectivamente en comparacioacuten a aquellos cultivos que no
incorporaban el Mn2+ los cuales solo utilizaban el 19 10 y 17 del aacutecido
glutaacutemico el glicerol y el aacutecido ciacutetrico respectivamente
Uno de los problemas maacutes prolongados en torno a los estudios referidos
a la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC994a es el hecho de
que el microorganismo termina degenerando en una cepa incapaz de producir
γ-PGA despueacutes de cultivo repetitivo Esta inestabilidad exhibida por este
microorganismo es responsable de una gran variacioacuten de cultivo en cultivo en
lo referente a la cantidad y la cineacutetica de formacioacuten del γ-PGA Birrer y
colaboradores (1994) encontraron que el empleo de ceacutelulas vegetativas
criogeacutenicamente congeladas permitiacutea alcanzar un crecimiento y produccioacuten de
poliacutemero consistente de cultivo en cultivo Asiacute mismo y en congruencia con
otros estudios previamente realizados se encontroacute que el crecimiento celular
ocurriacutea baacutesicamente durante las primeras 24 h la mayor productividad
volumeacutetrica de γ-PGA era de 012 gmiddotL-1middoth-1 y se alcanzaba entre los diacuteas 2 y 4
el pH caiacutea de 74 a aproximadamente 5 despueacutes de 42 horas de cultivo e
incrementaba levemente a cerca de 6 despueacutes de 96 horas de cultivo el
empleo de glicerol glutamato y citrato se reduciacutea de 80 a 45 gL 18 a 10 gL y
de 12 a 1 gL respectivamente la produccioacuten de aacutecido aceacutetico hasta un nivel
maacuteximo de 45 gL asiacute como la presencia de 23-butanediol como producto
secundario entre las 42 y las 96 h El estudio del consumo de las fuentes de
carbono resulta un poco sorprendente pues demuestra unas tasas de
consumo del aacutecido ciacutetrico y de glicerol relativamente altas sin embargo para el
caso del aacutecido glutaacutemico dicha tasa de consumo fue por mucho menor y muy
lejana del agotamiento completo de dicha fuente Asiacute mismo la remocioacuten del
aacutecido L-glutaacutemico del medio de cultivo E afectaba en poca medida el
rendimiento en γ-PGA mientras que la remocioacuten de las otras fuentes (glicerol y
aacutecido ciacutetrico) disminuye de manera draacutestica la produccioacuten de γ-PGA Estos
resultados son contradictorios a los encontrados inicialmente por Thorne y
colaboradores (1954) e indica que Bacillus licheniformis ATCC9945 no requiere
de aacutecido L-glutaacutemico para alcanzar altas productividades de γ-PGA Asiacute mismo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 29
la presencia de 23-butanediol es indicador que los niveles de oxiacutegeno en el
medio de cultivo despueacutes de 42 horas son incapaces de sostener un
metabolismo 100 aeroacutebico esto no es de sorprender pues el γ-PGA es un
poliacutemero extracelular extremadamente viscoso y tasas cada vez menores de
transporte de oxiacutegeno son esperables conforme va aumentado la viscosidad en
el medio a medida que la concentracioacuten de γ-PGA se incrementa
Un trabajo de Cromwick y Gross (1996) estudioacute el efecto del pH y la
aireacioacuten sobre la productividad en γ-PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a en condiciones de fermentacioacuten por lotes El pH fue controlado en
los valores de 55 65 74 y 825 y se determinoacute su efecto sobre el crecimiento
celular la utilizacioacuten de las fuentes de carbono la productividad en γ-PGA el
peso molecular y la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA El mayor
rendimiento en γ-PGA se obtuvo a un pH de 65 (15 gL 96 horas de cultivo) y
decrecioacute significativamente en 55 y 74 Esto coincide con el hecho que el
consumo de glicerol y de aacutecido L-glutaacutemico se mantuvo invariable en funcioacuten
del pH sin embargo la mayor tasa de consumo de aacutecido ciacutetrico se observoacute a un
pH de 65 en contraste con 55 y 74 lo cual parece indicar que el metabolismo
del aacutecido ciacutetrico juega un papel importante a dicho valor de pH Previamente
Cromwick y Gross (1995) encontraron que el aacutecido ciacutetrico es efectivamente un
precursor en la produccioacuten del poliacutemero presumiblemente a traveacutes del ciclo de
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De igual manera la alteracioacuten del pH no mostroacute
ninguacuten efecto importante en cuanto al peso molecular y la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA El efecto de la aireacioacuten fue evaluado incrementando
la velocidad de agitacioacuten entre 250 y 800 rpm y la tasa de aireacioacuten entre los
05 y los 20 Lmin a un pH de 65 observaacutendose un incremento en las tasas de
crecimiento y los rendimientos de γ-PGA conforme el suministro de oxiacutegeno
incrementaba
A pesar de la intensa investigacioacuten que se ha llevado a cabo en lo
referente a la produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a el
mecanismo y las viacuteas biosinteacuteticas especiacuteficas por las cuales el poliacutemero es
producido auacuten no han logrado ser dilucidadas con total claridad a pesar de que
no se cuestione le hecho de que efectivamente acontece a traveacutes del ciclo de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 30
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De las tres fuentes de carbono presentes en el medio
de cultivo E el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido L-glutaacutemico constituyen dos sustratos
precursores para la produccioacuten de dicho poliacutemero sin embargo en lo referente
al glicerol auacuten no queda claro como este incrementa la formacioacuten de poliacutemero
maacutes allaacute del hecho de que Troy (1973) encontroacute que el complejo enzimaacutetico
PGA-sintetasa responsable de la polimerizacioacuten del aacutecido L-glutaacutemico a γ-
PGA es estimulada por la presencia de glicerol Considerando que la viacutea de
biosiacutentesis del γ-PGA efectivamente involucra el ciclo de los aacutecidos
tricarboxiacutelicos cualquier fuente de carbono no relacionada directamente como
el glicerol o la glucosa podriacutean en principio ser una fuente primaria de carbono
para el crecimiento celular y la produccioacuten de γ-PGA Efectivamente el empleo
de glucosa como principal fuente de carbono y cantidades traza de aacutecido ciacutetrico
y aacutecido L-glutaacutemico (05 gL) permitieron alcanzar un rendimiento en γ-PGA de
12 gL en cultivos de Bacillus licheniformisATCC9945a (Ko amp Gross 1998) Sin
embargo y a pesar de este hecho Du y colaboradores (1995) encontraron otra
posible explicacioacuten al incremento del rendimiento en presencia de glicerol Ellos
encontraron que en Bacillus licheniformis ATCC9945a las altas
concentraciones de glicerol en el medio de cultivo conllevan a un cambio en la
composicioacuten de los fosfoliacutepidos de la membrana celular incrementando la
proporcioacuten de los fosfoliacutepidos C120 y C101 y reduciendo la de fosfoliacutepidos
C181 y C161 lo que parece favorecer la formacioacuten de una membrana celular
menos compacta lo que conlleva a una efectiva excrecioacuten del γ-PGA fuera de
la membrana celular
En lo referente a produccioacuten a gran escala y en buacutesqueda de la
aplicacioacuten comercial del γ-PGA en grandes cantidades resulta maacutes que
evidente la necesidad de incrementar la productividad Yoon y colaboradores
(2000) desarrollaron una estrategia para la produccioacuten de γ-PGA con un alto
rendimiento mediante cultivo en lote alimentado de Bacillus licheniformis
ATCC9945a Mediante el empleo de un bioreactor de 25 L conteniendo 1 L de
medio de cultivo y bajo condiciones de pH y temperatura de 65 y 37ordmC
respectivamente un 40 de saturacioacuten de oxiacutegeno y una velocidad de
agitacioacuten de 1000 rpm lograron alcanzar una concentracioacuten maacutexima de γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 31
de 35 gL suministrando aacutecido ciacutetrico y aacutecido L-glutaacutemico a una velocidad de
alimentacioacuten de 02 mLmin (144 gh de aacutecido ciacutetrico y 24 gh de aacutecido
glutaacutemico) por un periacuteodo de 3 h despueacutes del agotamiento del aacutecido ciacutetrico
inicial lo cual aconteciacutea alrededor de las 22 h La productividad alcanzada fue
de 1 gmiddotl-1middoth-1
425 Purificacioacuten del γshyPGA
Dado que la produccioacuten del γ-PGA es mayoritariamente extracelular en
concreto en la cepa de intereacutes para el presente estudio la de Bacillus
licheniformis ATCC9945a la purificacioacuten del poliacutemero es directa y consta de
manera general de tres pasos I) la remocioacuten de las ceacutelulas mediante
centrifugacioacuten o filtracioacuten 2) la precipitacioacuten del producto del medio libre de
ceacutelulas mediante metanol etanol o 1-propanol y 3) la diaacutelisis para la remocioacuten
de impurezas de pequentildeo peso molecular
Du y colaboradores (2001) desarrollaron una estrategia eficiente para la
separacioacuten y recuperacioacuten delγ-PGA de caldos altamente viscosos Esta
consiste en dos procesos I) Separar el γ-PGA del caldo de cultivo viscoso y II)
Concentrar la solucioacuten de PGA por ultrafiltracioacuten con el propoacutesito de reducir la
cantidad de alcohol requerida en el proceso de separacioacuten Las ceacutelulas
encapsuladas con γ-PGA poseen carga negativa cerca del valor neutro de pH
esto debido a la ionizacioacuten del grupo carboxilo en las moleacuteculas de γ-PGA Esta
carga negativa en sus superficies les confiere a las ceacutelulas una alta estabilidad
en el medio de cultivo lo que dificulta la sedimentacioacuten de las ceacutelulas durante el
proceso de separacioacuten Esta alta estabilidad asiacute como la elevada viscosidad del
caldo de cultivo son los dos principales problemas que se enfrentan cuando se
trata de separar las ceacutelulas y el γ-PGA del medio de cultivo por lo cual la
reduccioacuten de ambas es vital para una eficiente recuperacioacuten del γ-PGA
Mediante la disminucioacuten del pH es posible reducir el nuacutemero de cargas
negativas sobre la superficie de las ceacutelulas lo que favorece su faacutecil agregacioacuten
y precipitacioacuten Esto permite reducir en hasta un 17 la energiacutea requerida para
una adecuada centrifugacioacuten del caldo de cultivo a un pH de 5 En lo referente
a los requerimientos de alcohol es conocido que un 75-80 del mismo es
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 32
requerido para la precipitacioacuten del γ-PGA presente en un caldo libre de ceacutelulas
a una concentracioacuten de 1-2 Dado que la cantidad de alcohol requerida
disminuye a medida que la concentracioacuten de γ-PGA aumenta es necesaria y
ventajoso sino la concentracioacuten del γ-PGA presente en el medio de cultivo libre
de ceacutelulas a lo largo del proceso de recuperacioacuten Asiacute es posible reducir en un
25 el alcohol requerido para precipitar una solucioacuten de γ-PGA que fue
concentrada de 20 gL a 60 gL mediante ultrafiltracioacuten a un pH de 5
Asiacute mismo y dada la naturaleza anioacutenica del γ-PGA es posible que el
empleo de la cromatografiacutea de intercambio ioacutenica constituya una herramienta
importante para la purificacioacuten de este poliacutemero
426 Control del peso molecular y degradacioacuten del γshyPGA
El peso molecular es una caracteriacutestica importante del γ-PGA microbiano
debido al efecto que tiene el tamantildeo molecular en las propiedades del
poliacutemero El γ-PGA producido por bacterias del geacutenero Bacillus por lo general
presenta un relativamente alto peso molecular Un poliacutemero de alto peso
molecular es uacutetil como agente espesante pero no es uacutetil para otros usos
debido a la alta viscosidad que lo vuelve difiacutecil de modificar quiacutemicamente
mediante la adicioacuten de alguacuten reactivo quiacutemico De acuerdo con el uso que se
pretenda dar es necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso
molecular por ejemplo en lo referente al empleo del γ-PGA en sistemas de
liberacioacuten de faacutermacos o en el disentildeo de faacutermacos polimeacutericos resulta
necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso para controlar el nivel de
liberacioacuten en los distintos tejidos (Shih et al 2001) Es evidente entonces que el
control del peso molecular del γ-PGA no es solamente un asunto de
importancia fundamental o teoacuterica sino de importancia praacutectica para el
desarrollo de aplicaciones comerciales para este poliacutemero Entre los meacutetodos
que se han empleado para la obtencioacuten de γ-PGA con diferentes pesos
moleculares encontramos la hidroacutelisis alcalina la degradacioacuten ultrasoacutenica la
degradacioacuten microbiana o enzimaacutetica y la alteracioacuten de la composicioacuten del
medio de cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 33
En otro estudio Birrer y colaboradores (1994) encontraron que la
variacioacuten de la fuerza ioacutenica del medio de cultivo mediante la adicioacuten de un 4
(pv) de NaCl conllevaba a la formacioacuten de un γ-PGA de un peso molecular
relativamente mayor
A la fecha existen pocos estudios sobre la biodegradacioacuten microbiana o
enzimaacutetica del γ-PGA a moleacuteculas de menor peso molecular sin embargo es
importante sentildealar que en la mayoriacutea de estudios sobre siacutentesis de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a se sugiera la posible existencia de una
enzima ldquodespolimerasardquo responsable de la descomposicioacuten del γ-PGA Lo que
inicialmente se observaba como una reduccioacuten en la viscosidad del medio de
cultivo con el tiempo o bajo ciertas condiciones demostroacute ser una enzima
poliglutamil-γ -hidrolasa responsable de la ruptura hidroliacutetica del γ-PGA en esta
cepa de Bacillus (King et al 2000) Curiosamente la enzima mostroacute ser
activada por la presencia de iones Zn2+ y Ca2+ y tener una alta afinidad por el γ-
PGA
427 Aplicaciones del γshyPGA
Dada la naturaleza del γ-PGA al ser un poliacutemero no toacutexico
biodegradable y cuya produccioacuten puede ser no tan costosa se han sugerido
gran cantidad de aplicaciones durante la uacuteltima deacutecada El γ-PGA de alto peso
molecular es decir mayor a 106 Da es el preferible en gran parte de las
aplicaciones aunque si bien existen otra serie de aplicaciones que se
presentaran a continuacioacuten y que podriacutean demandar diferentes caracteriacutesticas
Es importante destacar eso siacute que salvo las aplicaciones meacutedicas el resto
considera como indiferente la proporcioacuten de aacutecido D-glutaacutemico y de aacutecido L-
glutaacutemico presente en el γ-PGA
Alimentos
Existe una amplia gama de aplicaciones para el γ-PGA en la industria de
alimentos y sus derivados En jugos y otras bebidas el γ-PGA colabora en el
mejoramiento del sabor y su potabilidad Otra aplicacioacuten importante existe en
alimentos soacutelidos a base de harina de trigo como por ejemplo pan pasteles o
pasta donde la adicioacuten de γ-PGA ha demostrado retrasar el envejecimiento y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 34
mejorar la textura asiacute como permitir una mayor conservacioacuten de la forma Para
estas aplicaciones el γ-PGA recomendable es el de alto peso molecular
Asiacute mismo el γ-PGA ha demostrado poseer propiedades
anticongelantes propiedad que se ve incrementada conforme el tamantildeo del
poliacutemero se reduce Esto permitiriacutea emplear el γ-PGA en la conservacioacuten de
alimentos microorganismos y enzimas Debido a que las sales de este
poliacutemero tienen poco sabor por siacute mismas pueden ser empleadas en mayores
concentraciones en comparacioacuten con otros agentes anticongelantes tales como
la glucosa Aunque esta aplicacioacuten es dependiente del tipo de sal del poliacutemero
empleada es independiente de la proporcioacuten de aacutecido L- y D-glutaacutemico
presente en el poliacutemero Asiacute mismo la adicioacuten de γ-PGA en productos
alimenticios que contengan sustancias activas bioloacutegicamente como por
ejemplo carotenoides vitaminas o polifenoles incrementa la absorcioacuten de
dichas sustancias en el intestino delgado
Fertilizante
Es posible producir grandes cantidades de biomasa y γ-PGA a partir de
medios liacutequidos con estieacutercol glicerol aacutecido ciacutetrico y otras sales inorgaacutenicas
resultando un producto que funciona como un fertilizante de liberacioacuten lenta
cuando es aplicado en los campos de cultivo Dado que el γ-PGA es
particularmente inerte a la gran mayoriacutea de las proteasas la liberacioacuten de
nitroacutegeno puede verse reducida auacuten maacutes Inclusive es posible producir dicho
fertilizante mediante fermentacioacuten en fase soacutelida lo que podriacutea resultar auacuten
maacutes ventajoso en ciertos casos pues permite utilizar como co-sustrato de
fermentacioacuten productos agriacutecolas tales salvado de trigo soya o maiacutez Es
importante sentildealar que para dicha aplicacioacuten la proporcioacuten de aacutecido L- y D-
glutaacutemico presente en el poliacutemero es indiferente
Tratamiento de aguas residuales
Debido a la actividad de floculacioacuten que este poliacutemero presenta el
empleo del γ-PGA en el tratamiento de aguas residuales ha sido investigado en
muacuteltiples estudios demostrando una gran capacidad de absorcioacuten y afinidad
por el Cu2+ Adicionalmente se ha demostrado el requerimiento de iones
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 35
multivalentes tales como el Ca2+ Fe3+ y Al3+ para mejorar su actividad
floculante bajo ciertas condiciones
Asiacute mismo tambieacuten se ha empleado el γ-PGA entrecruzado mediante
radiacioacuten γ el cual ha demostrado ser eficiente en la clarificacioacuten de agua
tuacuterbida a concentraciones tan bajas como 1 mgkg
Bioplaacutesticos
La posibilidad de emplear eacutesteres de γ-PGA como plaacutestico
biodegradable tambieacuten constituye otra aplicacioacuten interesante de este poliacutemero
a pesar de que por el momento su costo es todaviacutea muy elevado como para
asegurar el eacutexito comercial Mediante la modificacioacuten de los grupos eacutester es
posible disentildear un plaacutestico que cumpla los requisitos de muacuteltiples propoacutesitos
asiacute mismo los eacutesteres de γ-PGA han demostrado ser maacutes estables a altas
temperaturas que sus respectivas sales de sodio
Hidrogeles
La formacioacuten de hidrogeles por parte de γ-PGA con o sin la adicioacuten de
poliacutemeros adicionales da origen a una amplia gama de novedosas
aplicaciones ya que las propiedades fiacutesicas del gel pueden ser controladas
para cumplir una amplia variedad de necesidades
Mediante irradiacioacuten γ de 19 kGy es posible generar un hidrogel a base
de γ-PGA con un contenido especiacutefico de agua de 3500 Esto constituye un
meacutetodo conveniente y sencillo para gelificar el γ-PGA sin necesidad de
poliacutemeros o entrecruzadores
Los hidrogeles pueden ser empleados en muacuteltiples aplicaciones como en
la liberacioacuten controlada de faacutermacos el disentildeo de biosensores operaciones de
diagnoacutestico e inclusive hasta bioseparadores pueden ser obtenidos a partir de
γ-PGA y PEG-metacrilato Los hidrogeles obtenidos de esta forma poseen la
cineacutetica de liberacioacuten deseada para partiacuteculas de distinto tamantildeo tales como
pequentildeos peacuteptidos proteiacutenas o inclusive ceacutelulas completas (Bajaj amp Singhal
2011)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 36
Una manera sencilla de obtener hidrogeles de γ-PGA es a traveacutes de la
adicioacuten de peroacutexido como entrecruzador al caldo de fermentacioacuten crudo dicho
hidrogel puede emplearse como absorbente de agua en muacuteltiples aplicaciones
que incluyen agricultura horticultura y construccioacuten civil
De igual manera tambieacuten se ha demostrado que los hidrogeles pueden
ser empelados para la liberacioacuten lenta y controlada de faacutermacos en particular
aquellos formados por α-L-PGA y PEG-metacrilato Hidrogeles formados por un
72 deγ-PGA sulfonado y el resto en γ-PGA han demostrado resultados
promisorios en la liberacioacuten controlada de faacutermacos con una liberacioacuten
praacutecticamente nula a un pH de 74 sin embargo a un pH menor a 65 como el
observado en los tejidos inflamados la liberacioacuten del faacutermaco incrementaba
considerablemente
Transportador de faacutermacos
Dado a su biodegradabilidad y biocompatibilidad el γ-PGA constituye un
biopoliacutemero de particular intereacutes en el desarrollo de faacutermacos de liberacioacuten
controlada tal y como se ha sentildealado previamente Dada la presencia de
grupos carboxilo en las cadenas laterales del poliacutemero que pueden
interaccionar con los grupos funcionales presentes en otros agentes
quimioterapeacuteuticos el γ-PGA permite obtener faacutermacos maacutes solubles y faacuteciles
de administrar Inclusive el conjugado faacutermaco-γ-PGA puede ingresar a las
ceacutelulas diana e irse degradando lentamente mientras libera el agente
farmacoloacutegico y a la vez el aacutecido glutaacutemico producido durante su degradacioacuten
puede ingresar directamente al metabolismo celular o ser excretado a traveacutes
del rintildeoacuten (Bajaj amp Singhal 2011)
Uno de los conjugados maacutes prometedores y estudiados hasta el
momento ha sido con el agente anticanceriacutegeno Paclitaxel Dichos conjugados
Paclitaxel-γ-PGA han demostrado presentar un perfil farmacocineacutetico distinto
capaz de proveer una alternativa hidrosoluble a las formulaciones habituales de
este faacutermaco Tambieacuten estos conjugados han mostrado una respuesta
antitumoral marcadamente superior en comparacioacuten con el Paclitaxel soacutelo
tanto en tejidos murinos como humanos Asiacute mismo estos conjugados han
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 37
mostrado reducir la TCD50 (dosis letal media contra ceacutelulas canceriacutegenas) de
una sola irradiacioacuten de 539 Gy a 75 Gy sin afectar la respuesta radioloacutegica de
los tejidos normales sanos
Adhesivos bioloacutegicos
Los adhesivos bioloacutegicos son empleados para la adhesioacuten de tejidos
homeostasis y para el sellado de fugas de liacutequidos o aire en los tejidos durante
una cirugiacutea En la actualidad el adhesivo de mayor uso es la fibrina la cual
presenta un pobre adhesioacuten a los tejidos Un poliacutemero formado por el
entrecruzamiento del γ-PGA y gelatina ha demostrado un gran potencial para
ser empleado como adhesivo quiruacutergico y agente homeostaacutetico conservando la
capacidad de ser degradado lentamente por el cuerpo sin causar respuestas
inflamatorias severas y a la vez solidificando tan raacutepido como la fibrina pero con
una mayor adherencia a los tejidos Similares hallazgos se han obtenido con
poliacutemeros formados del entrecruzamiento de γ-PGA y colaacutegeno porcino (Bajaj
amp Singhal 2011)
Cosmeacuteticos
El γ-PGA puede ser empleado como componente de valor agregado en
la elaboracioacuten de cosmeacuteticos y productos para el cuidado personal tales como
humectantes exfoliantes y antiarrugas Dada sus propiedades quiacutemicas el γ-
PGA es homogeacuteneamente miscible asiacute como quiacutemicamente estable en la gran
mayoriacutea de los ingredientes tiacutepicamente empleados para la elaboracioacuten de
cremas faciales Asiacute mismo ciertas calidades de γ-PGA son capaces de
producir peliacuteculas suaves elaacutesticas humectantes y suaves sobre la piel Dado
que se trata de un humectante natural hidrofiacutelico formidable el γ-PGA ha
demostrado en combinacioacuten con extractos de Aloe vera promover la produccioacuten
natural de factores humectantes tales como aacutecido pirrolidona-carboxiacutelico aacutecido
laacutectico y aacutecido urocaacutenico A nivel microscoacutepico esto se explica por el hecho de
que los hidrogeles de γ-PGA son capaces de absorber hasta 5000 veces su
propio peso en humedad lo que permitiriacutea incrementar de gran manera las
propiedades humectantes de muchos productos cosmetoloacutegicos con la adicioacuten
de γ-PGA algunos electrolitos y el ajuste a un pH adecuado
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 38
Adyuvante en vacunas
El γ-PGA ha demostrado que es capaz de generar una mejor respuesta
inmune contra otros antiacutegenos presentes en una vacuna El γ-PGA de alto peso
molecular ha demostrado estimular la respuesta inmune contra antiacutegenos
virales en conejos y ratones
43 Disentildeo de procesos biotecnoloacutegicos y la transferencia de materia gasshyliquido
Cuando un microorganismo ha sido identificado como productor de un
compuesto de intereacutes existen una serie de consideraciones que deben ser
valoradas previamente antes de que un proceso productivo econoacutemicamente
viable pueda ser llevado a la praacutectica a escala industrial En aquellas
organizaciones e industrias con una soacutelida experiencia en el disentildeo y
escalamiento de procesos fermentativos los nuevos procesos son
incorporados de manera relativamente raacutepida
El desarrollo de un nuevo proceso fermentativo puede ser a groso modo
dividido en cuatro fases
La primera consiste en identificar el producto su potencial valor de
mercado su precio de venta asiacute como la vida uacutetil del mismo
La siguiente fase es seleccionar o disentildear la cepa que seraacute utilizada en
el proceso productivo y por consiguiente disentildear el proceso como tal Esto
involucra una adecuada seleccioacuten del medio de cultivo oacuteptimo y de las
condiciones idoacuteneas de proceso En este sentido la produccioacuten de γ-PGA a
partir de Bacillus licheniformis ATCC9945a ha sido fuertemente investigada en
torno a las condiciones ideales para su produccioacuten sin embargo algunos
reportes y resultados resultan ser incompletos contradictorios o discutibles Sin
embargo lo que si resulta comuacuten en todas las investigaciones en particular en
aquellas donde se han empleado voluacutemenes mayores de produccioacuten como por
ejemplo de 05 a 10 L es que la produccioacuten del γ-PGA se detiene al reducirse
la concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo problema que ha sido
abordado incrementando el caudal de oxiacutegeno yo incrementando la velocidad
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 39
de agitacioacuten sin que se reporten resultados consistentes o claros La
acumulacioacuten del γ-PGA a lo largo de la fermentacioacuten parece reducir
draacutesticamente la tasa de transferencia de oxiacutegeno lo que termina generando
condiciones anaeroacutebicas en tiempos tan cortos como 20 horas con
concentraciones de oxiacutegeno inferiores a 1 mgL
431 La transferencia de materia gasshyliacutequido
Un requisito primordial para la ocurrencia de una reaccioacuten quiacutemica
cualquiera es que los reactantes esteacuten presentes en el sitio de reaccioacuten En los
sistemas multifase los procesos de transporte son generalmente maacutes lentos
que las tasas maacuteximas de reaccioacuten intriacutenseca Este fenoacutemeno da como
resultado que las tasas de reaccioacuten reales sean menores que las que se
podriacutean esperar por efecto de la cineacutetica de reaccioacuten uacutenicamente
Los fundamentos fiacutesicos principales que determinan la transferencia de
materia son los mismos que aplican para la transferencia de calor y de
momento es decir conveccioacuten y difusioacuten
En los sistemas bioloacutegicos multifase como las fermentaciones en medio
sumergido la transferencia de masa ocurre entre dos fases una gaseosa y
otra liacutequida La mayor parte de los procesos fermentativos a gran escala con
excepcioacuten tal vez uacutenicamente de la produccioacuten de etanol y aacutecido laacutectico son
aeroacutebicos y tiacutepicamente son llevados a cabo en biorreactores aireados gas-
liacutequido En estos procesos aeroacutebicos como sucede con la produccioacuten de γ-
PGA por parte de Bacillus licheniformis ATCC9945a la transferencia de
oxiacutegeno desde la fase gaseosa a la fase liacutequida resulta vital para el eacutexito de
dicho bioproceso
En los bioprocesos aeroacutebicos el oxiacutegeno es un sustrato clave y debido
a su baja solubilidad en caldos y medios de cultivo resulta necesario su
continuo suministro La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deber ser
conocida e inclusive predicha con el propoacutesito de llevar a cabo un adecuado
disentildeo operacional del proceso y un correcto escalado de los biorreactores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 40
432 La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR)
El transporte de oxiacutegeno gas-liacutequido en los bioprocesos aeroacutebicos es el
principal proceso gas-liacutequido a considerar a la hora de disentildear un bioproceso
La solubilidad del oxiacutegeno en un medio liacutequido es baja la concentracioacuten de
saturacioacuten de oxiacutegeno es de cerca de 7-8 mgL en un proceso tiacutepico en
aireacioacuten por lo cual una transferencia de oxiacutegeno continua de la fase gaseosa
a la liacutequida es esencial para conservar un metabolismo celular completamente
oxidativo Por ejemplo unos pocos minutos sin aireacioacuten pueden impactar
severamente en la habilidad de Penicillium chrysogenum para producir
penicilina mientras que en organismos aeroacutebicos facultativos esto puede
generar cambios draacutesticos en el rendimiento y el tipo de producto generado en
condiciones de carencia de oxiacutegeno
La transferencia de oxiacutegeno desde una fase gaseosa hasta el interior de
una ceacutelula ocurre siguiendo una serie de pasos secuenciales que son
1) Difusioacuten del O2 desde la fase gaseoso a la interfase gas-liacutequido
2) Transporte a traveacutes de la interfase gas-liacutequido
3) Difusioacuten del O2 a traveacutes de una regioacuten relativamente inactiva del liacutequido
adyacente a la burbuja es decir de la interfase gas-liacutequido a la de
mezclado del liacutequido
4) Transporte del oxiacutegeno disuelto a la ceacutelula los conglomerados celulares
o al pellet de ceacutelulas inmovilizadas
5) Difusioacuten a traveacutes de la peliacutecula inactiva hasta la superficie de la ceacutelula
dentro de los conglomerados celulares o al interior del pellet de ceacutelulas
inmovilizadas
6) Transporte a traveacutes de la membrana celular
7) Transporte del O2 en el interior celular hacia el sitio de demanda
433 Descripcioacuten de la transferencia maacutesica con kLa
La tasa volumeacutetrica de transferencia de materia de un compuesto A (qtA)
en este caso oxiacutegeno (O2) puede ser descrita cuantitativamente como el
producto de un coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (kLa) y una
fuerza impulsora que consiste en la diferencia entre la concentracioacuten de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 41
saturacioacuten del compuesto (cA) y la concentracioacuten actual del compuesto en la
fase liacutequida (cA)
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (unidad s-1) el kLa
es normalmente referido como un coeficiente uacutenico pero en realidad consiste
de dos partes el coeficiente de transferencia de materia propiamente dicho (kL)
que estaacute vinculado con el flujo maacutesico (tasa de transferencia por unidad de
aacuterea) y el aacuterea de la superficie especiacutefica (a) que es el aacuterea de transferencia
por unidad de volumen
La tasa de transferencia de oxiacutegeno (referida como velocidad de
transferencia de oxiacutegeno en algunos casos) el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de materia (kLa) y la concentracioacuten de oxiacutegeno estaacuten
relacionados por la ecuacioacuten
NAa = OTR = kLa(cA- cA) (gm3s)
Noacutetese en la ecuacioacuten que para que la transferencia sea mayor interesa
tener una kLa alta pero ademaacutes (cA-cA) debe tener un valor elevado lo que
podriacutea llevar a plantear que cA sea lo menor posible Sin embargo se requiere
de una concentracioacuten miacutenima de oxiacutegeno para mantener una fermentacioacuten
aerobia Con respecto a dicha ecuacioacuten es importante sentildealar que
1) La concentracioacuten en fase liacutequida cA corresponde a la cantidad de
oxiacutegeno que hay en la fase acuosa y se determina mediante un
electrodo de oxiacutegeno disuelto Si al sistema se introduce aire a presioacuten
atmosfeacuterica dicho valor estaraacute entre los 0-10 mgL
2) La concentracioacuten de saturacioacuten cA corresponde a la solubilidad de
oxiacutegeno y es dependiente de la concentracioacuten de oxiacutegeno en la fase
gaseosa es decir de la presioacuten parcial de oxiacutegeno Una vez conocida la
presioacuten parcial de oxiacutegeno es posible calcular el valor de la solubilidad
mediante la ley de Henry En agua una forma de esta ecuacioacuten seriacutea
pAGcA = He
Donde He es la constante de Henry y cuyo valor (aproximadamente
entre 15-30 atm m3kg) es funcioacuten de la temperatura A partir de esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 42
ecuacioacuten es posible despejar el valor de cA = pAGHe El valor de He
cambia con la temperatura por ejemplo en agua pura a 25 ordmC para el
oxiacutegeno es de 2396 x 106 Pamiddotm3middotkg-1 El valor de cA es modificable si
se manipula
a) Presioacuten podemos aumentar la concentracioacuten de saturacioacuten si
aumentamos la presioacuten parcial de oxiacutegeno por ejemplo si
pasamos de 021 atm a 1 atm introduciendo al reactor oxiacutegeno
puro en vez de aire a presioacuten atmosfeacuterica lo que da por
resultado un aumento en alrededor de cinco veces su valor
Es posible tambieacuten alcanzar un mayor aumento de la
concentracioacuten de saturacioacuten si aumentamos la presioacuten
absoluta no obstante si hacemos fermentaciones con
oxiacutegeno a presioacuten resulta necesario disponer de un
fermentador capaz de resistir tales condiciones de presioacuten
resulta evidentemente maacutes costoso y tambieacuten pueden ocurrir
cambios importantes en el metabolismo de los
microorganismos que puedan afectar su crecimiento o su
rendimiento en producto
b) Temperatura la solubilidad del oxiacutegeno en agua disminuye al
aumentar la temperatura
c) Composicioacuten del liacutequido si en lugar de agua pura se tiene una
disolucioacuten como sucede con la mayoriacutea de los medios que
tiene una composicioacuten salina importante la solubilidad debe
corregirse pues dichos componentes afectan su valor y dicho
efecto estaacute influenciado tanto por los iones presentes como
por los componentes orgaacutenicos
44 Fermentaciones a presioacuten
La gran mayoriacutea de los estudios sobre fermentaciones son generalmente
llevados a cabo bajo condiciones de presioacuten ambiental maacutes allaacute del hecho de
que el fermentador por lo general suele encontrarse positivamente presurizado
Son pocos los ejemplos a excepcioacuten de la cerveza y algunos vinos donde las
fermentaciones son llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten positiva en el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 43
fermentador Esta leve presurizacioacuten suele deberse al proceso de aireacioacuten del
biorreactor debido a la formacioacuten de una presioacuten de vuelta debido a las
restricciones del respiradero de escape del fermentador
La presioacuten positiva en muchos casos puede resultar beneficiosa para los
procesos de fermentacioacuten no soacutelo por el hecho de incrementar la solubilidad del
oxiacutegeno en el caldo de cultivo sino tambieacuten porque reduce las oportunidades
de contaminacioacuten externa durante el proceso de fermentacioacuten Igualmente la
presioacuten puede tener efectos nocivos sobre los procesos fermentativos La
presioacuten tiene el efecto de influenciar las velocidades y la direccioacuten del
metabolismo de los microorganismos Esto es particularmente evidente en el
caso de productos o subproductos volaacutetiles que forman parte de distintas rutas
metaboacutelicas La presioacuten en el fermentador puede evitar la produccioacuten o
expulsioacuten de un producto gaseoso al medio circundante Este fenoacutemeno puede
tener el efecto de interferir con el equilibrio de varias reacciones bioquiacutemicas y
puede resultar en toxicidad al interior de la ceacutelula o en la divergencia de rutas
metaboacutelicas Lo significante de este impacto dependeraacute de la duracioacuten del
proceso asiacute como de la magnitud de la presioacuten a la cual se realice la
fermentacioacuten
De igual manera el efecto de la presioacuten sobre las macromoleacuteculas
guarda una gran semejanza con los efectos de la temperatura lo cual se
desprende del parecido de la forma de los diagramas de estabilidad de las
proteiacutenas y viabilidad de los microorganismos entre ambas variables
temperatura y presioacuten observacioacuten que tambieacuten permite concluir que las
proteiacutenas constituyen los primeros elementos estructurales en ser afectados
de manera negativa por el incremento de la presioacuten La presioacuten parece afectar
en mayor medida las interacciones proteiacutena-proteiacutena en comparacioacuten con la
estabilidad proteica por siacute misma por lo que es vaacutelido concluir que son estas
interacciones las primeras en verse afectadas por dicha variable La
conservacioacuten de la viabilidad en los microorganismos al ser sometidos a
presioacuten dependeraacute en gran medida de su capacidad para conservar una
membrana celular funcional aunque los mecanismos que emplean para tal fin
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 44
auacuten son desconocidos dada la vital importancia de las interacciones proteiacutena-
proteiacutena en las funciones de membrana
Lo maacutes importante es conocer con detalle como efectivamente la presioacuten
ejercida afecta el proceso de fermentacioacuten en particular la bioquiacutemica y la
fisiologiacutea del mismo de igual manera si es posible controlar la direccioacuten de la
fermentacioacuten manipulando la presioacuten o si la presioacuten estaacute generando el
desarrollo de reacciones secundarias indeseadas las respuestas a dichas
interrogantes soacutelo pueden ser dilucidadas mediante la experimentacioacuten praacutectica
del proceso fermentativo en estudio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 45
7 MATERIALES Y METODOLOGIacuteA
51 Informacioacuten de la cepa empleada
Se empleoacute la cepa Bacillus licheniformis ATCC9945a la cual se
encontraba conservada en estado vegetativo y bajo refrigeracioacuten en el
Laboratorio de Biopoliacutemeros del ETSEIB UPC Cataluntildea Con el propoacutesito de
seleccionar colonias altamente mucosas capaces de producir γ-PGA se
procedioacute a rallar la biomasa conservada en placas con Agar LB (pH 75) e
incubarlas por 24 horas a 37 ordmC Las colonias que mostraron una morfologiacutea
mucosa indicadora de la produccioacuten de γ-PGA fueron utilizadas para elaborar
los inoacuteculos empleados en las distintas fermentaciones
52 Medio de cultivo empleado
El medio de cultivo empleado para la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a fue el medio de cultivo E (Leonard et al 1958) con
algunas modificaciones seguacuten recomendado por Birrer y colaboradores (1994)
El detalle de la formulacioacuten se presenta en la tabla 5
Tabla 5 Formulacioacuten del medio de cultivo E empleado en el cultivo SmF de Bacillus
licheniformis ATCC9945a
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO43H2O 043 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 015 CaCl2 011 Glicerol 80 pH 75 Esterilizacioacuten por filtracioacuten (045 μm) Volumen 1 L
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 46
El medio de cultivo fue esterilizado por filtracioacuten (045 μm) y conservado
en refrigeracioacuten a 7 ordmC
53 Preparacioacuten de los inoacuteculos madre
Las colonias seleccionadas fueron inoculadas en matraces de 125 mL
con 25 mL de medio de cultivo E y cultivadas a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica
con varilla imantada a 650 rpm por 12 horas El caldo resultante fue
centrifugado a 8000 rpm por 25 minutos la biomasa recuperada fue
resuspendida en 10 mL de medio de cultivo E y 10 mL de una solucioacuten de
glicerol al 20 Dicha solucioacuten fue distribuida en voluacutemenes de 1 mL en tubos
eppendorf y congeladas a -80 ordmC
Posteriormente uno de estos tubos eppendorf fue empleado para
inocular matraces de 500 mL conteniendo 125 mL de medio de cultivo y fueron
cultivados a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica con varilla imantada a 650 rpm por
14 horas El caldo resultante fue centrifugado nuevamente a 8000 rpm por 25
minutos se recuperoacute la biomasa precipitada y se resuspendioacute en 25 mL de
medio de cultivo E y 25 mL de una solucioacuten de glicerol al 20 Dicha solucioacuten
fue distribuida en voluacutemenes de 2 mL en tubos eppendorf y posteriormente
fueron congelados a -80 ordmC Cada uno de estos eppendorf constituiacutea un inoacuteculo
de origen para una fermentacioacuten individual La absorbancia promedio de estos
inoacuteculos se encontraba cercana a 25
531 Conservacioacuten de la cepa en estado productivo
Los inoacuteculos deben conservarse en todo momento bajo congelacioacuten a
una temperatura inferior a -15 ordmC siendo preferible conservarlos a -80 ordmC La
condicioacuten de produccioacuten de γ-PGA es extremadamente fraacutegil y cambios de
temperatura o descongelamiento pueden conllevar la peacuterdida de dicha
capacidad La reutilizacioacuten de biomasa residual de fermentaciones previas
queda descartada
54 Montaje del biorreactor a presioacuten
En la actualidad los principales fabricantes de biorreactores para la
industria biotecnoloacutegica carecen de equipos de fermentacioacuten a escala
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 47
laboratorio que puedan operar bajo condiciones de presioacuten superiores a los 01
bares relativos Por este motivo se debioacute modificar un reactor quiacutemico a
presioacuten de modo tal que pudiese cumplir los requisitos necesarios para el
cultivo de microorganismos El modelo empleado fue el reactor quiacutemico a
presioacuten modelo 6425-214 de la casa AceGlass (Estados Unidos) de un
volumen total de 2 L Este reactor tiene la capacidad de operar hasta 35 psig
(241 bares relativos) a una temperatura de 100 ordmC y a una agitacioacuten de 300
rpm El mismo seguacuten su disentildeo original se presenta en la figura 6
Figura 6 Reactor quiacutemico a presioacuten modelo 6425-214 de AceGlass Co
Las dimensiones del frasco del reactor de forma ciliacutendrica y fondo
redondeado son las siguientes
Diaacutemetro de boca 95 mm
Diaacutemetro maacuteximo 120 mm
Profundidad 180 mm
Con el propoacutesito de adecuarlo al cultivo de microorganismos el reactor
fue ligeramente modificado en algunos de sus componentes y su distribucioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 48
Entre los principales cambios realizados al sistema se encuentran los
siguientes
1) Incorporacioacuten de una turbina de disco tipo Rushton al tratarse de una
fermentacioacuten aeroacutebica es necesario garantizar una adecuada aireacioacuten
del medio de cultivo mediante agitacioacuten efectiva La paleta de agitacioacuten
original del sistema no cumpliacutea con dicho requisito por lo cual se cambioacute
la misma por una turbina tipo Rushton cuyas dimensiones se muestran
en la figura 7
Dimensiones
A = 75 mm
B = 18 mm
C = 1mm
D = 20 mm
Figura 7 Dimensiones de la turbina tipo Rushton empleada
Esta turbina se encuentra en posicioacuten central a 3 cm del fondo del
reactor y a 6 mm de los deflectores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 49
2) Incorporacioacuten de deflectores se incorporaron dos laacuteminas deflectoras de
disentildeo propio de1 mm de ancho en una posicioacuten de 90 grados con
respecto a la superficie del reactor con el propoacutesito de reducir la
formacioacuten de voacutertice promover una agitacioacuten turbulenta y una mayor
formacioacuten de burbujas La geometriacutea de las laacuteminas deflectoras se
detalla en la Figura 8
Dimensiones
Ancho de laacutemina = 10 mm
Diaacutemetro = 95 mm
Longitud de laacutemina = 200 mm
Figura 8 Geometriacutea de las laacuteminas deflectoras
3) Cambio del motor de agitacioacuten se incorporoacute un motor IKA RW20 con
capacidad de hasta 2000 rpm en sustitucioacuten del motor original con que
A
B
C
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 50
disponiacutea el equipo (el sistema original trae un motor limitado a una
velocidad de agitacioacuten maacutexima de 330 rpm) con el propoacutesito de variar la
agitacioacuten del sistema y observar su efecto sobre el crecimiento y la
produccioacuten de poliacutemero
4) Reubicacioacuten de la vaacutelvula de seguridad de sobrepresioacuten con el
propoacutesito de garantizar una mayor seguridad del equipo maximizar la
vida uacutetil del cilindro de aire comprimido y evitar la sobrepresioacuten que
pueden generar el crecimiento del microorganismo (su metabolismo
puede liberar compuestos gaseosos o volaacutetiles) se trasladoacute la vaacutelvula de
seguridad del equipo de la tuberiacutea de llenado a la tapa del reactor
5) Eliminacioacuten de componentes dado que no resultaban uacutetiles para la
presente investigacioacuten se prescindioacute de instalar en la tapa del equipo el
condensado y el embudo de adicioacuten El disco de ruptura de la tuberiacutea de
llenado fue sustituido por una vaacutelvula de apertura manual con el
propoacutesito de permitir un mejor y maacutes raacutepido ajuste de la presioacuten durante
el establecimiento inicial de las condiciones de fermentacioacuten
55 Condiciones de fermentacioacuten
El detalle de las condiciones de temperatura presioacuten pH y agitacioacuten en
las cuales fueron establecidas las distintas fermentaciones asiacute como la
metodologiacutea de escalamiento empleada se presentan a continuacioacuten
551 Escalamiento
Inicialmente se procediacutea a inocular por duplicado 100 mL de medio de
cultivo con uno de los inoacuteculos madre (2 mL de ceacutelulas de Bacillus licheniformis
ATCC9945a conservados en tubos eppendorf a -20 ordmC) en matraces con
deflectores de 500 mL de capacidad A dichos matraces se les incorporaba una
pastilla de agitacioacuten magneacutetica de 25 cm de longitud y 07 cm de diaacutemetro y
eran colocados en agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm (agitador IKA C-MAG HS7)
por 8 horas a una temperatura aproximada de 30 ordmC
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 51
Posteriormente uno de los matraces (100 mL de cultivo) anteriormente
establecidos era utilizado para inocular 500 mL de medio de cultivo en el
biorreactor a presioacuten manteniendo una temperatura constante de 30 ordmC
aproximadamente Distintas presiones velocidades de agitacioacuten y densidades
oacutepticas del inoacuteculo fueron evaluadas El detalle del disentildeo experimental de
dichas pruebas se presenta a continuacioacuten en la tabla6
Tabla 6 Diferentes condiciones de presioacuten relativa agitacioacuten y absorbancia evaluadas en las
fermentaciones en biorreactor
CONDICIOacuteN
VALORES EVALUADOS
SOBREPRESIOacuteN
Agitacioacuten 300 rpm
Absorbancia del inoacuteculo 120
O bar (0 psig)
052 bar (75 psig)
103 bar (15 psig)
172 bar (25 psig)
241 bar (35 psig)
AGITACIOacuteN
Sobrepresioacuten 103 bar (15 psig)
Absorbancia del inoacuteculo 120
300 rpm
400 rpm
500 rpm
650 rpm
El tiempo de fermentacioacuten para cada uno de los ensayos evaluados fue
de 18 horas tiempo en el que el pH habiacutea descendido a un valor cercano pero
auacuten superior a 6 No se realizoacute ajuste alguno del pH a lo largo de la
fermentacioacuten Posteriormente se procediacutea a centrifugar el caldo de
fermentacioacuten a 8000 rpm por 25 minutos el sobrenadante recuperado era
almacenado para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA presente en
el mismo
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre
Con el propoacutesito de garantizar que el inoacuteculo madre era apto para la
produccioacuten de γ-PGA uno de los matraces inicialmente establecidos era
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 52
conservado bajo agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm y a 30 ordmC durante las 18 horas
que requeriacutea la fermentacioacuten en el biorreactor Posteriormente se determinaba
cualitativamente la produccioacuten de γ-PGA seguacuten la simbologiacutea que se presenta
en la tabla 7
Tabla 7 Simbologiacutea empleada para la medicioacuten cualitativa de la produccioacuten de γ-PGA en los
matraces de control
SIacuteMBOLO OBSERVACIOacuteN CUALITATIVA
- No produccioacuten de γ-PGA
+ Produccioacuten de γ-PGA
+++ Elevada produccioacuten de γ-PGA
56 Determinacioacuten del valor de kLa
Para la determinacioacuten del valor aproximado de kLa tanto en los
matraces coacutemo en el biorreactor se empleoacute el meacutetodo estaacutetico sin operacioacuten
del cultivo celular Dicho valor no fue determinado bajo condiciones de presioacuten
pues se careciacutea con la instrumentacioacuten adecuada sino soacutelo a presioacuten
atmosfeacuterica para ambos casos matraz y biorreactor
Este meacutetodo consiste en disminuir la concentracioacuten de oxiacutegeno hasta
una concentracioacuten de 1-25 mgL despueacutes el sistema es retornado a aireacioacuten
yo agitacioacuten y se mide como va aumentando la concentracioacuten de oxiacutegeno en la
fase liacutequida conforme transcurre el tiempo El objetivo es por tanto disminuir la
concentracioacuten de cA0 lo suficiente como para tener un cambio importante
obteniendo asiacute una curva de ascenso de las concentraciones de oxiacutegeno en el
tiempo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 53
561 Matraces de cultivo
A un matraz de cultivo en reposo conteniendo 100 mL de medio de
cultivo E se le agregoacute 001 g de sulfito de sodio (Na2SO3) y una punta de
espaacutetula de cloruro de cobalto (actuacutea como catalizador) y se agita
manualmente por 20 s Posteriormente se introdujo la sonda de oxiacutegeno
disuelto del medidor Hanna Oxi-check y se dejoacute descender el nivel de oxiacutegeno
disuelto hasta el valor miacutenimo posible entre 20-25 mgL Seguidamente se
activoacute la agitacioacuten magneacutetica y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto cada 10
segundos hasta alcanzar un punto maacuteximo que se repitiese al menos durante
2 minutos
562 Biorreactor
Se procedioacute a llenar el reactor con 600 mL de medio de cultivo y en
estado de reposo se le agregoacute 006 g de sulfito de sodio una punta de espaacutetula
de cloruro de cobalto y se agitoacute suavemente a 100 rpm por 20 segundos
Haciendo uso de la sonda de oxiacutegeno se determinoacute el menor nivel posible de
oxiacutegeno disuelto alrededor de 15-20 mgL Posteriormente se encendioacute la
agitacioacuten mecaacutenica a 300 rpm y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto en
intervalos de 10 segundos hasta alcanzar un valor maacuteximo de oxiacutegeno disuelto
sostenido en el tiempo es decir que se repitiese por al menos un minuto
563 Graficacioacuten
Con el propoacutesito de determinar el valor de kla a partir de la ecuacioacuten de
balance de oxiacutegeno
V(dCAdt) = VkLa(cA-cA)
Se tiene que integrando dicha ecuacioacuten con la concentracioacuten inicial cA0
se obtiene
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 54
Representado ln((cA - cA0)(c
A- cA)) contra el tiempo t se obtiene una
recta cuya pendiente es el valor de kLa
57 Determinacioacuten del contenido de γshyPGA en el caldo de fermentacioacuten
Con el propoacutesito de determinar la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo
post-fermentacioacuten se utilizoacute la teacutecnica analiacutetica llamada cromatografiacutea liacutequida
de alta eficiencia conocida normalmente por sus siglas en ingleacutes HPLC
especiacuteficamente la conocida como cromatografiacutea de permeacioacuten en gel (GPC)
uno de los tipos de cromatografiacutea de exclusioacuten molecular (SEC) maacutes
empleados en la separacioacuten de poliacutemeros
El equipo empleado fue el cromatoacutegrafo modelo 1260 Infinity de Agilent
Technologies La columna de separacioacuten empleada fue una columna PL
aquagel-OH de 8μm para cromatografiacutea GPC en fase acuosa El meacutetodo de
cromatografiacutea empleado consistioacute en eludir 25 μL de la muestra haciendo uso
de una solucioacuten tampoacuten fosfato 005 molL con un tiempo de elucioacuten de 15 min
por muestra El caudal de flujo del eluyente fue de 08 mLmin La deteccioacuten se
llevoacute a cabo a traveacutes de un detector de absorbancia UV-vis de longitud de onda
variable (VWD) a una longitud de onda de 220 nm y tambieacuten un detector de
iacutendice de refraccioacuten (RID) con polaridad positiva y una temperatura de la
unidad oacuteptica de 35 ordmC aunque los resultados reportados y empleados fueron
los obtenidos con el detector VWD El tiempo de retencioacuten de la fraccioacuten
polimeacuterica correspondiente al γ-PGA se encontroacute entre los 65 y los 90
minutos considerando el hecho de que el mismo se trata de una mezcla de
moleacuteculas polimeacutericas de distinta longitud y por ende distinto peso molecular
Para poder cuantificar la cantidad de poliacutemero presente en la muestra se
elaboroacute una curva de calibracioacuten inicial Se prepararon soluciones en agua
destilada de γ-PGA a concentraciones de 10 5 2 1 y 05 gL Las mismas
fueron analizadas mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva para el
pico correspondiente al γ-PGA para cada concentracioacuten Dichos valores fueron
empleados para la elaboracioacuten de la curva de calibracioacuten inicial del equipo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 55
Las muestras a analizar fueron preparadas de la siguiente manera 400
μL del caldo crudo se diluyeron en agua destilada hasta un volumen final de 2
mL (dilucioacuten 5x) y posteriormente fueron filtradas mediante jeringa haciendo
uso de filtros de 045 μm en viales de HPLC Las muestras fueron analizadas
mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva del pico correspondiente al
γ-PGA para cada una de las muestras
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
Con el propoacutesito de determinar el efecto del contenido de γ-PGA sobre la
solubilidad maacutexima de oxiacutegeno en el medio de cultivo en condiciones estaacuteticas
es decir sin crecimiento microbiano (consumo de oxiacutegeno de los
microorganismos nulo) se procedioacute a preparar soluciones de 100 mL de
volumen a concentraciones crecientes de poliacutemero (poliacutemero + biomasa) en
medio de cultivo y medir el nivel de oxiacutegeno disuelto en mgL haciendo uso de
un medidor de oxiacutegeno disuelto Hanna Oxi-check Dichas soluciones fueron
evaluadas en las mismas condiciones de fermentacioacuten empleadas en la
primera etapa de escalamiento matraces de 500 mL con deflectores y a una
agitacioacuten magneacutetica de 650 rpm Se evaluaron concentraciones de biopoliacutemero
de 0 7 14 21 36 54 y 71 gL
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano
Para determinar el crecimiento bacteriano se aprovechoacute el efecto que
dicho crecimiento genera sobre la turbidez del caldo a lo largo de la
fermentacioacuten Por ello se empleoacute la teacutecnica de espectrofotometriacutea
determinando la absorbancia del medio de cultivo inoculado y su incremento
con el tiempo Se empleoacute el coloriacutemetro modelo ZUSI 4200A a una longitud de
onda de 660 nm El equipo era inicialmente calibrado en 0 haciendo uso de
agua destilada acto seguido se determinaba el valor de absorbancia de la
muestra a analizar
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 56
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producido se determinoacute
mediante el meacutetodo desarrollado por Marfey (1984) para la determinacioacuten
cuantitativa de la composicioacuten enantiomeacuterica de aminoaacutecidos Dicho meacutetodo se
basa en la reaccioacuten del aacutecido glutaacutemico con el reactivo de Marfey (1-fluoro-24-
dinitrofenil-5-L-alanina) Dicho compuesto es oacutepticamente activo por lo que al
reaccionar con los enantioacutemeros D- y L- del aacutecido glutaacutemico forma dos
diasteroisoacutemeros que pueden separarse mediante cromatografiacutea HPLC con
tiempos de retencioacuten para el isoacutemero L- y el D- de 675 y 100 minutos
aproximadamente Para poder cuantificar la composicioacuten de manera efectiva
se realizoacute un calibrado previo con mezclas de concentracioacuten conocida de cada
isoacutemero
5101 Preparacioacuten de la muestras
Se introdujo 3 mg del γ-PGA a analizar en viales de 5 mL y se les
adicionoacute 2 mL de HCl 6 molL Se dejaron calentar a 100 ordmC en estufa por un
periacuteodo de 24 horas Posteriormente se trasfirioacute 100 μL de cada una de las
muestras a tubos eppendorf y se dejaron en desecador al vaciacuteo por un periacuteodo
de tres diacuteas empleando NaOH como desecante Seguidamente se disolvioacute los
productos en 100 μL de agua y se hicieron reaccionar con 200 μL de una
disolucioacuten con concentracioacuten de 5 mgmL de reactivo de Marfey en acetona con
20 μL de carbonato aacutecido de sodio (NaHCO3) durante una hora en estufa a 37
ordmC Al finalizar se neutralizoacute como 10 μL de HCl 2 molL y se dejoacute secar al vaciacuteo
por 3 diacuteas en el desecador a vaciacuteo con NaOH como desecante Finalmente se
diluyoacute la muestra en 350 μL de dimetilsulfoacutexido (DMSO) para cromatografiarla
por HPLC
La cromatografiacutea se llevoacute a cabo en el mismo equipo empleado para la
determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA pero con los siguientes cambios
1) Se empleoacute una columna de fase estacionaria reversa Spherisorb ODS2
de 5 μm de poro 25 cm de longitud y 046 cm de diaacutemetro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 57
2) El caudal de flujo del eluyente fue de 15 mLmin
3) El detector de longitud de onda variable (VWD) operaba a 340 nm y el
tiempo de elucioacuten era de 25 minutos
4) El eluyente empleado era una mezcla 8020 de fosfato de trietilamonio
50 mmolL a pH 3 y acetonitrilo El fosfato de trietilamonio se obteniacutea
haciendo reaccionar cantidades equimolares de trietilamina y aacutecido
fosfoacuterico
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual
La composicioacuten porcentual enantiomeacuterica del γ-PGA es decir el
contenido porcentual de aacutecido D- y L-glutaacutemico se determinoacute mediante
contraste de las aacutereas obtenidas en el cromatograma para cada uno de los
picos correspondientes a cada diasteroisoacutemero con el aacuterea total
correspondiente a los productos de reaccioacuten (sumatoria de ambos
diasteroisoacutemeros) La composicioacuten se reportoacute como un porcentaje de aacutecido D-
glutaacutemico y aacutecido L-glutaacutemico presente en la muestra analizada
511 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA Para la determinacioacuten del peso molecular del poliacutemero se procedioacute a
analizar los cromatogramas obtenidos para el caacutelculo de la concentracioacuten de γ-
PGA Se empleoacute el programa informaacutetico ChemStation for LC Systemsreg de
Agilent Technologies Dicho programa posee unas potentes herramientas de
anaacutelisis que permiten automaacuteticamente calcular el peso molecular de un
compuesto Para las muestras analizadas se determinoacute el peso molecular
promedio en nuacutemero (Mn) el peso molecular promedio en peso (Mw) la
polidispersidad y el peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) La recta de
calibrado fue obtenida previamente por Bou y colaboradores con estaacutendares de
polioacutexido de etileno (PEO)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 58
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 59
8 RESULTADOS
61 Montaje del biorreactor a presioacuten
El detalle final del biorreactor empleado puede observarse en la figura 8
Noacutetese que la temperatura es controlada por la accioacuten de una manta teacutermica
externa como sucede con el disentildeo original del reactor y no por el empleo de
un serpentiacuten interno caso de la gran mayoriacutea de biorreactores comerciales a
escala laboratorio El mismo permite operar en condiciones de agitacioacuten de 100
a 650 rpm y a presiones de hasta 24 bar de sobrepresioacuten (35 psig) El
biorreactor resultoacute apto para el crecimiento microbiano alcanzaacutendose valores
de absorbancia de hasta 37 similares a los observados en cultivos en
matraces
Figura 9 Biorreactor empleado para la produccioacuten de γ-PGA bajo presioacuten
62 Competencia del inoacuteculo madre
Mediante la metodologiacutea descrita previamente para la preparacioacuten del
inoacuteculo madre fue posible alcanzar en el 100 de los cultivos de control la
produccioacuten de γ-PGA en alta cantidad Aunque dichos resultados no se
muestran el empleo de inoacuteculos de otra naturaleza como reutilizacioacuten de
biomasa o inoacuteculos conservados a temperaturas superiores a -20 ordmC mostraron
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 60
ser ineficaces y poco reproducibles en cuanto a la produccioacuten de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a Los resultados de los cultivos control
pueden observarse en el graacutefico 10 bajo el nombre de Matraz
63 Determinacioacuten de los valores de kLa
631 Matraz
En lo referente al cultivo en matraz bajo las condiciones de agitacioacuten y
temperatura empleadas y en condiciones estaacuteticas (sin crecimiento
microbiano) se encontroacute un valor de kLa de 0026 s-1 En el graacutefico 1 y 2 se
muestran la curva de concentracioacuten de oxiacutegeno en funcioacuten del tiempo al
reiniciarse el proceso de agitacioacuten asiacute como el caacutelculo de dicho valor de
coeficiente mediante regresioacuten lineal respectivamente
Graacutefico 1 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concentracioacuten m
gL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 61
Graacutefico 2 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00257x ‐ 08809Rsup2 = 09966
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
Cuando se realizoacute la misma determinacioacuten pero a una velocidad de
agitacioacuten menor (430 rpm) el valor de kLa disminuyoacute significativamente En
dicho caso el valor de kLaobtenido fue de 0017 s-1 Estos resultados se
muestran en los graacuteficos 3 y 4
Como se puede observar en dichos graacuteficos el tiempo requerido para
alcanzar el valor maacuteximo estable se incrementoacute considerablemente en 60
segundos lo que indica una menor velocidad de transferencia producto de la
reduccioacuten de la intensidad de la agitacioacuten suministrada al cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 62
Graacutefico 3 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 430 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Graacutefico 4 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00168x ‐ 07551Rsup2 = 09835
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
ln Linear (ln)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 63
632 Biorreactor
Para el caso del biorreactor el valor de kLa determinado fue de 0025 s-1
esto bajo condiciones estaacuteticas (sin crecimiento microbiano) y en las
condiciones de temperatura y operacioacuten previamente descritas
Como se puede observar dicho valor es praacutecticamente igual al obtenido
para el caso del matraz lo que indica condiciones de transferencia de oxiacutegeno
gas-liacutequido muy similares en ambos casos El valor dekLa fue determinado en
un punto lateral del reactor 2 cm por debajo del nivel de medio de cultivo y
contiguo a uno de los deflectores punto donde la transferencia de materia
debiera en principio ser mayor Dichos resultados se presentan en los graacuteficos
5 y 6
Graacutefico 5 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten mecaacutenica del medio de cultivo en biorreactor a 300 rpm
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
560
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Concentracioacuten
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 64
Graacutefico 6 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00246x ‐ 03222Rsup2 = 09902
000
050
100
150
200
250
300
0 20 40 60 80 100 120 140
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
64 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En lo referente a los niveles de oxiacutegeno a distintas concentraciones de γ-
PGA en condiciones estaacuteticas sin crecimiento microbiano se observa una
draacutestica reduccioacuten de dicho nivel conforme se incrementa la concentracioacuten del
biopoliacutemero Dicho fenoacutemeno es esperable dada la alta viscosidad del γ-PGA
La concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo alcanza un valor inicial de
74 mgL el cual se reduce draacutesticamente a 52 mgL a un valor de
concentracioacuten de γ-PGA de 14 gL Esta reduccioacuten es uacutenicamente producto de
la presencia del γ-PGA en el medio de cultivo El graacutefico 7 muestra dicho
fenoacutemeno hasta un valor miacutenimo de oxiacutegeno disuelto de 25 mgL cuando la
concentracioacuten de poliacutemero alcanza un maacuteximo 71 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 65
Graacutefico 7 Efecto de la concentracioacuten de γ-PGA sobre el nivel maacuteximo de oxiacutegeno disuelto en el
medio de cultivo E
y = ‐00569x + 64671Rsup2 = 08709
000
100
200
300
400
500
600
700
800
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Oxiacutegeno disuelto m
gL
γ‐PGA gL
Solubilidad O2 (mgL) Linear (Solubilidad O2 (mgL))
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γshyPGA mediante GPC
La curva de calibracioacuten obtenida a partir de soluciones con
concentracioacuten conocida de γ-PGA se presenta en el graacutefico 8
Como se puede observar se obtuvo un valor del coeficiente de
determinacioacuten R2 de 09983 lo que indica un ajuste lineal suficiente y un valor
del coeficiente de correlacioacuten R de 09991 lo que indica una correlacioacuten
positiva entre los datos contrastados La concentracioacuten de γ-PGA estaacute
determinada entonces por la siguiente ecuacioacuten
Concentracioacuten γ-PGA (gL) = (00027 x Aacuterea) ndash 00916
Esta curva fue posteriormente empleada para determinar la
concentracioacuten de γ-PGA en los caldos de cultivo obtenidos despueacutes de cada
una de las fermentaciones realizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 66
Graacutefico 8 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA mediante
GPC
y = 00027x ‐ 00916Rsup2 = 09983
0
2
4
6
8
10
12
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Concentracioacuten gL
Aacuterea
Series1 Linear (Series1)
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γshyPGA
En lo referente al efecto de la presioacuten (relativa) sobre la productividad en
γ-PGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a se encontroacute un incremento de los
rendimientos fermentativos conforme se incrementaba la presioacuten hasta
alcanzar un valor maacuteximo de sobrepresioacuten de 103 bar (15 psig) una vez
superado dicho umbral la productividad se veiacutea reducida draacutesticamente A 103
bar la productividad en γ-PGA alcanzaba un valor de 1334 gL productividad
mayor a la obtenida en condiciones de aireacioacuten (2 Lmin) a presioacuten
atmosfeacuterica la cual fue de 508 gL Esta productividad maacutexima contrasta con
la obtenida a presioacuten atmosfeacuterica la cual fue miacutenima con un valor de 217 gL
Los graacuteficos 9 y 10 muestran los resultados anteriormente comentados Asiacute
mismo en la tabla 8 se presentan la totalidad de fermentaciones llevadas a
cabo las productividades obtenidas y el promedio de cada condicioacuten Es
importante destacar que cada condicioacuten de presioacuten fue evaluada por duplicado
no encontraacutendose diferencias importantes entre los resultados obtenidos para
ninguno de los casos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 67
Graacutefico 9 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748
617
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 05 1 15 2 25
PGGA (gL)
Presioacuten (bar)
RENDIMIENTO gL
Graacutefico 10 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten y la aireacioacuten a presioacuten atmosfeacuterica (0 relativa)
sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748617 508
4582
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
0 052 103 172 241 0 +Aireacioacuten
Matraz
Concentracioacuten γ‐PGA gL
Presioacuten
RENDIMIENTO gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 68
Tabla 8 Fermentaciones realizadas y concentraciones de γ-PGA obtenidas
Reactor Condiciones A D C (gL)AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10108 5 130
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10926 5 141
AHJC11 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 11753 5 152
AHJC11 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10186 5 131
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 95011 5 122
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 97936 5 126
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28706 3 20
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28194 3 20
AHJC14 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 33184 3 24
AHJC14 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 32866 3 23
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 68396 3 52
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 65871 3 50
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43692 5 54
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 46235 5 57
AHJC16 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 49809 5 62
AHJC16 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 58872 5 74
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 57321 5 72
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43021 5 53
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 57727 5 72
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 62398 5 78
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 60469 5 76
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 58335 5 73
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 6083 5 76
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 57897 5 72
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 51267 5 64
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 48407 5 60
= nuacutemero de muestra A = aacuterea D = dilucioacuten C = concentracioacuten y bar = bar relativo
Algunos de los cromatogramas realizados se muestran en las figuras 10
y 11 Como se puede observar la forma del pico de elucioacuten demuestra que el
biopoliacutemero estaacute compuesto por moleacuteculas de distinta longitud por lo cual
existen diferentes pesos moleculares Es importante destacar que para la gran
mayoriacutea de las fermentaciones realizadas el pico siempre presentoacute su maacutexima
altura al inicio lo que demuestra que la mayor parte de eacutel se trataba de un
poliacutemero de alto peso molecular Igualmente esto podriacutea indicar poca
degradacioacuten del biopoliacutemero durante las 18 horas de fermentacioacuten lo cual es
importante dada la capacidad de Bacillus licheniformis ATCC9945a de
hidrolizar enzimaacuteticamente el γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 69
Figura 10 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA analizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 70
Figura 11 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA (052-103-172 y 241 bar relativas)
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γshyPGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a
En lo referente al efecto de la intensidad de agitacioacuten en rpm sobre la
produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a a una presioacuten de
103 bar relativos (15 psig) se encontroacute un efecto negativo del aumento de la
agitacioacuten por encima de las 300 rpm lo que se demuestra con una importante
reduccioacuten en la concentracioacuten final de γ-PGA obtenida despueacutes de 18 horas de
fermentacioacuten Estos resultados se presentan en el graacutefico 11 Como se puede
observar una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm llega a ser tan perjudicial
para el microorganismo que la productividad en γ-PGA cae por debajo del valor
de 1 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 71
Graacutefico 11 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis
ATCC9945a a 103 bar (15 psig) a 30 ordmC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
300 350 400 450 500 550 600 650 700
Concentracioacuten gL
Agitacioacuten rpm
RENDIMIENTO (gL)
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica resultoacute afectada por las condiciones de
presioacuten Como demuestra el graacutefico 12 la proporcioacuten de aacutecido L-glutaacutemico en
las muestras correspondientes a fermentaciones bajo presioacuten resultoacute ser por
mucho mayor a las observadas en los cultivos control tanto en comparacioacuten
con el de matraz como con el sometido a aireacioacuten
La respectiva curva de calibracioacuten con las muestras conformadas por
mezclas con composicioacuten definida de ambos enantioacutemeros se presente en el
graacutefico 13 Como se puede observar los valores teoacutericos y los valores
experimentales obtenidos en el cromatograma coinciden en buena medida lo
que indica la validez de esta teacutecnica para la determinacioacuten de la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA
En dos casos para las fermentaciones llevada a cabo a 052 bar y 172
bar de sobrepresioacuten (75 y 25 psig respectivamente) la proporcioacuten de aacutecido D-
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 72
glutaacutemico fue de cero en contraste con el control en matraz donde dicha forma
del aacutecido glutaacutemico estaba presente mayoritariamente en un 87
De igual manera en lo que concierne a la fermentacioacuten llevada a cabo a
presioacuten atmosfeacuterica y bajo condiciones de aireacioacuten se observa tambieacuten que el
enantioacutemero mayoritariamente presente es el aacutecido D-glutaacutemico con un 83
en contraste con el aacutecido L-glutaacutemico con apenas un 17 Todas las
fermentaciones llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten presentan un
contenido de aacutecido L-glutaacutemico superior al 83
Aunque no fue posible encontrar una correlacioacuten directa entre la presioacuten
y la composicioacuten porcentual en aacutecido D-glutaacutemico si es posible observar como
las condiciones de presioacuten parecen limitar condicionar o disminuir la presencia
de esta forma del aacutecido glutaacutemico en el γ-PGA
Graacutefico 12 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica en aacutecido
L-glutaacutemico y aacutecido D-glutaacutemica del γ-PGA producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a
R11 (103bar)
R12 (103bar)
R15 (0 +aireacioacuten)
R16 (241bar)
R19 (172bar)
R22 (052bar)
MATRAZ
AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO 9518 8319 1736 10000 8347 10000 1285
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO 482 1681 8264 000 1653 000 8715
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 73
Graacutefico 13 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-
PGA mediante HPLC
000
2900
4700
7700
970010000
7100
5300
2300
300
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
100 L 75 L 25 D 50 L 50 D 25 L 75 D 100 D
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO
69 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA
Los resultados de los pesos moleculares de los poliacutemeros obtenidos en
los distintos ensayos se muestran en la tabla 9 El peso molecular promedio de
permeacioacuten (Mp) de todas las muestras se encontroacute entre los 269-307 x 107
gmol
Tabla 8 Valores de peso molecular promedio en nuacutemero (Mn) peso molecular promedio en
peso (Mw) peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) y polidispersidad (PD) delγ‐PGA
producido en los distintos ensayos evaluados
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
MATRAZ1 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 157 214 29 137
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
MATRAZ2 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 160 216 292 135
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar relativos
207 252 307 122 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 74
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
204 252 307 124 PRIMERO MAYOR
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
202 252 307 125 PRIMERO MAYOR
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
199 251 307 126 PRIMERO MAYOR
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 200 247 307 123
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 226 26 306 115
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 179 223 281 125
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 172 221 264 128
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
217 248 304 114 PRIMERO MAYOR
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
210 246 304 117 PRIMERO MAYOR
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
195 233 284 120 SEGUNDO MAYOR
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
178 225 269 126 SEGUNDO MAYOR
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
223 262 306 118 PRIMERO MAYOR
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
222 261 306 117 PRIMERO PAYOR
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
207 254 307 122 PRIMERO MAYOR
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
187 251 306 134 PRIMERO MAYOR
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
171 246 306 144 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
185 253 306 136 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
202 252 306 125 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 75
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
232 263 306 113 PRIMERO MAYOR
AHJC32-1-18HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
173 228 307 132 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-2-18HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
177 230 306 130 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-1-36HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
165 220 23 133 IGUALES
AHJC32-2-36HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
173 224 302 130 IGUALES
Los valores de polidispersidad estuvieron entre 113 y 144 Asiacute mismo
no se observan mayores diferencias entre los pesos moleculares obtenidos a
distintas presiones aunque la existencia de un segundo pico era maacutes evidente
en los cromatogramas correspondientes a γ-PGA producido en condiciones de
presioacuten relativa 0 Asiacute mismo dichas muestras presentan un peso molecular
levemente menor aunque dicha tendencia no es absoluta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 76
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 77
9 DISCUSIOacuteN
71 Cepa empleada
Bacillus licheniformis ATCC9945a es una cepa que ha sido empleada
con eacutexito en la produccioacuten de γ-PGA particularmente a escala laboratorio maacutes
no ha sido empleada a escala industrial donde otras cepas particularmente de
la especie Bacillus subtilis han sido las preferidas tanto por aspectos de
rendimiento como estabilidad productiva de la cepa El presente estudio
determinoacute una productividad promedio en condiciones de matraz de 4582 gL
despueacutes de 72 horas de cultivo Valores de productividad tan altos no habiacutean
sido reportado previamente para Bacillus licheniformis ATCC9945a donde
valores entre 17 y 23 gL de rendimiento han sido reportados por Troy (1973)
Cromwick y Gross (1996) 26 a 35 gL por Bajaj y colaboradores (2009) y 35
gL por Yoon y colaboradores (2000)
Los motivos de este mayor rendimiento aunque no son claros pueden
deberse a una mejor transferencia de oxiacutegeno en el sistema de agitacioacuten
magneacutetica en comparacioacuten con la agitacioacuten orbital estaacutendar Asiacute por ejemplo y
utilizando la ecuacioacuten simplificada para determinar en valor de kLa en agitacioacuten
orbital (Diacuteaz 2011) tenemos que a 20 ordmC
kLa = 139 x 10-3n (VTVL)084
Asiacute tenemos que para un sistema en agitacioacuten orbital a 250 rpm es decir
a una frecuencia de 417 s-1 con un volumen de medio de cultivo de 100 mL y
un volumen total del matraz 500 mL el valor de kLa es de aproximadamente
0020 s-1 inferior al valor de 0026 s-1 obtenido en el presente estudio para el
cultivo en agitacioacuten magneacutetica a 30 ordmC Dado que la difusividad disminuye al
aumentar la temperatura es de esperar que a 30 ordmC dicho valor de kLa teoacuterico
sea auacuten menor
Es importante sentildealar que en lo referente a la composicioacuten del medio de
cultivo el medio de cultivo E empleado en este estudio es el mismo empleado
previamente por otros autores para el estudio de la produccioacuten de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a por lo cual no se considera que la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 78
composicioacuten del medio de cultivo pueda ser la responsable de las diferencias
con los resultados reportados anteriormente por otros investigadores quienes
en particular tambieacuten emplearon dicho medio de cultivo en sus pruebas
Dicho valor de rendimiento promedio obtenido de 4582 gL (en matraz)
coloca a este cepa al mismo nivel de productividad de las cepas
industrialmente empleadas como sucede con Bacillus subtilis F02-1 con un
rendimiento reportado por Kubota y colaboradores (1993) de 50 gL pero con
una menor necesidad de aacutecido glutaacutemico (20 gL en contra de 80 gL) La
conveniencia del empleo de la cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis debe
entonces evaluarse entorno a su capacidad de escalamiento y conservacioacuten de
la competencia en la produccioacuten de γ-PGA y no entorno a su maacuteximo
rendimiento pues en este aspecto ha demostrado en condiciones oacuteptimas la
capacidad de producir γ-PGA en concentraciones extremadamente elevadas
Los resultados acaacute obtenidos refuerzan lo ya descrito por otros autores quienes
sentildealan precisamente estos aspectos (escalamiento y estabilidad) como los
principales retos para llevar a cabo la produccioacuten de γ-PGA mediante Bacillus
licheniformis ATCC9945a
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente
Uno de los principales problemas que se enfrentoacute a lo largo de la
presente investigacioacuten es la facilidad con la cual la cepa ATCC9945a de
Bacillus licheniformis revierte a formas incapaces de producir γ-PGA Este
fenoacutemeno puede ocurrir incluso con tan soacutelo una generacioacuten de cultivo por lo
cual el empleo de la biomasa generada en una fermentacioacuten previa es
indeseable pues seguramente no daraacute resultados positivos para la produccioacuten
de γ-PGA
Este fenoacutemeno es uno de los principales inconvenientes que se
enfrentan a la hora de evaluar el efecto de diversos paraacutemetros sobre la
productividad de γ-PGA en esta cepa pues la incapacidad de garantizar
resultados reproducibles imposibilita poder evaluar condiciones nutricionales
de agitacioacuten temperatura y demaacutes teniendo la certeza que las diferencias
encontradas solo se deberaacuten a los paraacutemetros bajo control
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 79
Cromwick y colaboradores (1994) reportaron el congelamiento con
nitroacutegeno liacutequido como una forma vaacutelida para la preservacioacuten de las ceacutelulas en
un estado consistente de alta productividad de γ-PGA En nuestro caso la
metodologiacutea empleada fue distinta Se incorporoacute el glicerol como crioprotector y
el congelamiento no se realizoacute mediante nitroacutegeno liacutequido sino que fue
congelamiento convencional utilizando un equipo de refrigeracioacuten con una
capacidad de enfriamiento de hasta -80 ordmC y voluacutemenes de inoacuteculo pequentildeos
de entre 1 y 2 mL cuyo congelamiento fuera particularmente raacutepido
Igualmente se observoacute que los cultivos que mejor comportamiento y
reproducibilidad dieron como inoacuteculo fueron aquellos cuyas ceacutelulas eran
recolectadas previo al inicio de la produccioacuten de γ-PGA Cultivos cuya edad
superaba las 10 horas y que ya presentaban presencia de γ-PGA aunque
podiacutean emplearse para la obtencioacuten de inoacuteculos madres los mismos no
resultaban tan eficientes como los anteriormente descritos
El empleo de esta metodologiacutea de conservacioacuten de la cepa permitioacute una
reproducibilidad del 100 en los ensayos obtenieacutendose poliacutemero en la
totalidad de los cultivos de control que se establecieron durante cada una de
las fermentaciones llevadas a cabo en el biorreactor Estos resultados indican
que dicha metodologiacutea es eficaz para la preservacioacuten a largo plazo de Bacillus
licheniformis ATCC9945a y como estrategia para un adecuado escalamiento
durante el proceso de produccioacuten a mayor escala De igual manera la
descripcioacuten detallada del proceso de conservacioacuten volumen de inoacuteculo
concentracioacuten de la muestra (por absorbancia) temperatura y demaacutes permite
una alta reproducibilidad del meacutetodo en contraposicioacuten con los reportes
existentes por otros autores que no brindaban mayor detalles sobre coacutemo llevar
a cabo este proceso de conservacioacuten
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten
Las fermentaciones a presiones superiores a la presioacuten atmosfeacuterica no
son habituales tanto a nivel de investigacioacuten como a nivel de proceso Dicha
afirmacioacuten queda particularmente ratificada cuando se analizan las opciones
comerciales existentes a escala laboratorio de biorreactores disentildeados para
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 80
operar a presioacuten la cual resulta praacutecticamente nula Por este motivo y para
poder llevar a cabo este estudio se requirioacute adaptar un reactor quiacutemico de
modo tal que permitiese trabajar a presioacuten y a la vez tuviese un control de
agitacioacuten y temperatura miacutenimo de modo tal que permitiese el cultivo de
microorganismos El biorreactor disentildeado fue exitoso pues permitiacutea un
crecimiento microbiano oacuteptimo y la produccioacuten de γ-PGA en un tiempo
relativamente corto de 18 horas
Las modificaciones realizadas en realidad fueron miacutenimas con respecto
a la estructura baacutesica del reactor quiacutemico convencional y con ellas se buscoacute
crear las condiciones que permitiesen incrementar la turbulencia en el sistema
de modo que existiese una mayor oxigenacioacuten y un mayor coeficiente
volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno (kLa) partiendo de antemano de la
hipoacutetesis inicial que sentildealaba al oxiacutegeno como uno de los componentes
limitantes de hecho el de mayor importancia para que este fermentacioacuten
ocurriese de la manera adecuada y con un alto rendimiento de γ-PGA
Se decidioacute emplear un reactor hecho de vidrio en lugar de uno metaacutelico
debido a que las condiciones de oxidacioacuten de la fermentacioacuten y la sensibilidad
de las enzimas involucradas a los iones metaacutelicos haciacutean deseable un material
inerte como sucede con el vidrio De igual manera al emplearse vidrio se tiene
una visioacuten del interior del fermentador las condiciones de agitacioacuten y formacioacuten
de burbujas son visibles asiacute como el crecimiento microbiano lo que permite un
mejor ajuste y correccioacuten de las condiciones de fermentacioacuten al menos durante
las etapas iniciales de investigacioacuten Para poder trabajar a mayores presiones
se hubiese requerido un reactor quiacutemico metaacutelico de un costo sumamente
elevado Los resultados experimentales demostraron que el rango de presioacuten
definido resultoacute ser el correcto para la investigacioacuten
La seleccioacuten de una turbina tipo Rushton radica en que este tipo de
agitador de pala plana se considera como el ideal para la realizacioacuten de
fermentaciones Dado que las paletas de heacutelices Rushton son planas y
colocadas verticalmente a lo largo del eje de agitacioacuten producen un flujo radial
unidireccional que permite una alta difusioacuten de un gas en un liacutequido por lo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 81
comuacuten son utilizadas en la fermentacioacuten de liacuteneas celulares que requieren altas
tasas de oxiacutegeno tales como las levaduras bacterias y algunos hongos
Las laacuteminas deflectoras fueron incorporadas pues aunque a velocidades
muy bajas un agitador de paletas produce una agitacioacuten suave inclusive en un
tanque sin laacuteminas deflectoras cuando son necesarias velocidades elevadas
se requiere la incorporacioacuten de dichas laacuteminas para aumentar la turbulencia de
lo contrario el liacutequido se mueve como un remolino que gira alrededor del
tanque con velocidad elevada pero con poco efecto de mezcla
74 Tiempo de fermentacioacuten
El tiempo de fermentacioacuten empleado en esta investigacioacuten es
significativamente inferior al empleado por otros autores que hablan de un
promedio de 72 horas Es importante sentildealar que 18 horas es el tiempo
suficiente para que el pH del medio de cultivo descienda a cerca de 60
Valores de pH inferiores a este han demostrado ser perjudiciales pues decae
el consumo de aacutecido ciacutetrico se detiene en gran medida la polimerizacioacuten del γ-
PGA y la concentracioacuten tiende a disminuir con el paso del tiempo
Para poder aumentar el periacuteodo de fermentacioacuten se requeririacutea un
sistema de ajuste de pH que opere bajo condiciones del presioacuten mismo que no
se tuvo disponible Es probable que si se prolongara el tiempo de fermentacioacuten
dentro del biorreactor los rendimientos al cabo de 48 o 72 horas seriacutean un
poco mayores siempre y cuando se ajuste el pH en el valor de 65 como
recomiendan Cromwick y colaboradores (1995)
En nuestro caso el incremento del tiempo de fermentacioacuten sin
regulacioacuten del pH de 18 horas a 36 horas mostroacute un incremento miacutenimo en la
productividad (de 025 gL) pero si un cambio en la composicioacuten del γ-PGA
pues el pico de elucioacuten del poliacutemero se desplazoacute levemente hacia un valor de
tiempo mayor lo que podriacutea indicar una degradacioacuten parcial del poliacutemero
inicialmente producido Dichos datos se presentan en la figura 12
Nuestros resultados contradicen lo sentildealado por otros autores quienes
obtienen los mayores rendimientos entre las 48 y 96 horas Birrer y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 82
colaboradores (1995) observaron que Bacillus licheniformis ATCC9945a
alcanza la fase estacionaria a las 24 horas tiempo en el cual muy poco γ-PGA
ha sido formado y por consiguiente la mayor formacioacuten de γ-PGA acontece
entre las 24 y las 96 horas Estos resultados coinciden con los reportados por
Troy (1973) pero difieren a los observados por Goto y Kunioka (1992) con
Bacillus subtilis IFO3335 donde el mayor rendimiento se obtuvo desde las 24 y
hasta las 40 horas Estas diferencias podriacutean deberse a aspectos maacutes
relacionados con los voluacutemenes de fermentacioacuten empleados Por ejemplo para
el caso de Yoon y colaboradores (2000) estos alcanzaron rendimientos de 35
gL con un periacuteodo de fermentacioacuten maacuteximo de 35 horas indicando un
agotamiento del aacutecido ciacutetrico a las 20 horas en su caso el volumen empleado
fue de 1 litro de medio de cultivo
Figura 12 Cromatograma a las 18 (a) y 36 (b) horas de fermentacioacuten con Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 83
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento
Un punto vital para una adecuada fermentacioacuten es la concentracioacuten de
inoacuteculo aspecto que es sentildealado por Troy Cromwick y colaboradores a lo
largo de sus investigaciones pero que no detallan ni cuantifican
adecuadamente o al menos no lo reportan En nuestro caso se empleoacute un
inoacuteculo madre con una absorbancia de 25 o mayor y un inoacuteculo del reactor con
un valor de absorbancia de 120 aproximadamente con el propoacutesito de asiacute
logran estandarizar las condiciones de inoacuteculo Aunque este aspecto no fue
cuantificado a manera cualitativa si se observoacute un importante efecto de este
aspecto (concentracioacuten inicial) sobre la cantidad de γ-PGA obtenido y el tiempo
requerido Esto puede resultarnos obvio teniendo en cuenta una descripcioacuten no
estructurada del crecimiento microbiano pero podriacutea resultar maacutes compleja de
analizar si consideramos que la produccioacuten del γ-PGA estaacute afectada por
paraacutemetros de otra naturaleza maacutes allaacute de la disposicioacuten de nutrientes como
por ejemplo de una estructura celular particular o una relacioacuten de percepcioacuten
de quoacuterum dada Debemos recordar que la percepcioacuten de quoacuterum es un
mecanismo de regulacioacuten de la expresioacuten geneacutetica en respuesta a la densidad
de poblacioacuten celular Las ceacutelulas involucradas producen y excretan sustancias
llamadas autoinductores que sirven de sentildeal quiacutemica para inducir la expresioacuten
geneacutetica colectiva De Vizio (2011) sentildeala que en Bacillus licheniformis NCIMB
8874 la produccioacuten de lichenysin γ-PGA y algunas proteasas extracelulares
estaacute vinculado con los genes comQXPA mismo operoacuten que regula la
percepcioacuten de quoacuterum en Bacillus subtilis
De igual manera la relacioacuten de escalamiento aplicada fue de 16
ligeramente inferior a la que teoacutericamente se utiliza con mayor frecuencia de
110 Aunque este iacutendice no fue objeto de estudio su ajuste tambieacuten afecta de
manera directa los rendimientos obtenidos
La optimizacioacuten de la concentracioacuten del inoacuteculo la relacioacuten de
escalamiento y su frecuencia constituyen aspectos que deben estudiarse con
mayor profundidad para su propia optimizacioacuten pues su efecto sobre esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 84
fermentacioacuten y su rendimiento es bastante significativo Esta afirmacioacuten
adquiere validez cuando vemos que la produccioacuten del γ-PGA no es un
metabolito primario que se forme durante la fase de crecimiento exponencial
sino maacutes bien al inicio de la etapa estacionaria como indica Goto y Kunioka
(antildeo) o durante toda la etapa estacionaria tal y como lo sentildealan tanto Troy
(antildeo) como Birrer y colaboradores (1994) A esto debemos agregarle tambieacuten
lo anteriormente sentildealado referente a la concentracioacuten idoacutenea que produce la
percepcioacuten de quoacuterum responsable de direccionar el metabolismo de la
comunidad microbiana hacia la siacutentesis del γ-PGA
Conociendo la dependencia de esta biosiacutentesis de la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio y partiendo del hecho de que al inicio de la fase
estacionaria la concentracioacuten celular seraacute lo suficientemente alta para poner el
riesgo el mantenimiento de las condiciones aeroacutebicas en el biorreactor pero lo
justa para una adecuada siacutentesis del γ-PGA un inoacuteculo con una alta
concentracioacuten inicial de ceacutelulas podriacutea ayudar a obtener un mayor rendimiento
en un tiempo de fermentacioacuten menor o producir la respuesta de percepcioacuten de
quoacuterum (generalmente se trata de la liberacioacuten de un polipeacuteptido sentildeal) en un
tiempo menor con la consiguiente produccioacuten del γ-PGA
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa es un valor de
suma importancia para el escalamiento de bioprocesos en particular cuando
nos referimos a fermentaciones aeroacutebicas o cultivos de organismos o ceacutelulas
en condiciones de metabolismo aeroacutebico En nuestro caso un adecuado
coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno es garantiacutea que las
condiciones aeroacutebicas se sostendraacuten a lo largo del proceso de fermentacioacuten de
modo que no se produzcan desviacuteos metaboacutelicos indeseados o en el peor de
los casos el inicio del metabolismo anaerobio y la consecuente produccioacuten de
aacutecido aceacutetico
Los valores de kla obtenidos fueron de 0026 s-1 y 0025 s-1 para el
matraz y el bioreactor respectivamente Dichos valores por si mismos nos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 85
indican poco si no determinamos la tasa de consumo de oxiacutegeno requerida
para el cultivo aeroacutebico de Bacillus licheniformis Doran (1995) reporta una
velocidad de consumo de oxiacutegeno m02 para el cultivo aeroacutebico de Bacillus
licheniformis de 231 x 10-5 gO2 g-1cel s
-1 si la concentracioacuten de ceacutelulas X en el
reactor es de 20 gL (determinado experimentalmente como el valor final
alcanzado en matraces con alta concentracioacuten de γ-PGA) la tasa de consumo
de oxiacutegeno (OUR) MO2 seraacute igual a Xm02 es decir 46 x 10-4 mgO2mL-1s-1 A
partir de estos datos y conociendo que kla = MO2ΔcA ΔcA = cA ndash cA sabiendo
que presioacuten atmosfeacuterica cA = 801 mgL a 30 ordmC y el valor cA en el biorreactor
a 30 ordmC es 74 mgL obtenemos un valor de kla del orden de 0062 s-1 Dicho
valor corresponde al valor teoacuterico que seriacutea necesario para mantener el cultivo
con el suministro adecuado y suficiente de oxiacutegeno y que como puede verse
es 25 veces mayor al kla real lo que indica que cuando el cultivo alcance la
maacutexima concentracioacuten celular de 20 gL las condiciones del cultivo no seraacuten
suficientes para un metabolismo cien por ciento aeroacutebico
Tiene sentido entonces que los rendimientos alcanzados en matraz sean
significativamente mayores que los mejores rendimientos obtenidos en
bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica Dado que el cultivo en matraz incorporaba
uacutenicamente 100 mL de medio de cultivo el microorganismo es capaz de
alcanzar una mayor concentracioacuten en una menor unidad de tiempo lo que le
permite alcanzar una mayor concentracioacuten de poliacutemero durante las 26 horas de
cultivo (8 iniciales + 18)
Por su parte para el caso del biorreactor el crecimiento oacuteptimo
probablemente demore maacutes en alcanzarse por lo cual el tiempo que transcurre
entre el alcance de la concentracioacuten limitante de 8 gL (concentracioacuten a la cual
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y la tasa de consumo de oxiacutegeno
(OUR) se igualan) y la concentracioacuten oacuteptima es lo suficiente como para afectar
los rendimientos de γ-PGA Esto resulta evidente al comparar los resultados de
matraz con los de bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica (0 bar relativos) donde la
diferencia en productividad entre ambos es de 43 gL de γ-PGA Dicha
diferencia se explica porque mientras que la concentracioacuten del inoacuteculo madre
mostraba una absorbancia promedio de 25 la del inoacuteculo empleado para el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 86
biorreactor era de 120 (100 ml de medio + inoacuteculo madre creciendo durante 8
horas) es decir praacutecticamente la mitad por lo cual la concentracioacuten inicial de
ceacutelulas era significativamente menor para el biorreactor en comparacioacuten con el
matraz
77 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En condiciones estaacuteticas el contenido de γ-PGAdemostroacute reducir
considerablemente la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
pasando de 74 mgL a 440 mgL a una concentracioacuten del 20 en γ-PGA
Este fenoacutemeno puede deberse al incremento de la viscosidad por la
presencia del poliacutemero en el caldo de cultivo Dicha apreciacioacuten seguramente
afecta de manera negativa la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) pues
reduce tanto cA como cA sin embargo la determinacioacuten del valor de c
A de una
solucioacuten compuesta por sales γ-PGA y productos del metabolismo microbiano
es imposible de determinar teoacutericamente con certeza como para poder
cuantificar la magnitud de reduccioacuten de la OTR numeacutericamente De igual
manera el valor de kLa tambieacuten se ve afectado pues es sabido que a mayor
viscosidad mayor resistencia a la transferencia lo que reduce el valor de este
coeficiente
Asiacute mismo esta reduccioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
podriacutea deberse en parte a la naturaleza anioacutenica del poliacutemero y no solamente
al incremento de la viscosidad La solubilidad se ve afectada por la fuerza
ioacutenica por lo cual una solucioacuten con una concentracioacuten elevada de un poliacutemero
polianioacutenico como el γ-PGA probablemente muestre una importante reduccioacuten
en la solubilidad maacutexima (concentracioacuten de saturacioacuten) del oxiacutegeno en la
misma(Schumpe et al 1978)
Queda claro que dada esta reduccioacuten en la solubilidad de oxiacutegeno al
incrementar el contenido de γ-PGA durante la fermentacioacuten ya sea por la
naturaleza viscosa del biopoliacutemero o por su caraacutecter polianioacutenico la tasa de
transferencia de oxiacutegeno inicial y el valor de kLa se van reduciendo a lo largo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 87
del tiempo lo que dificulta auacuten maacutes garantizar las condiciones de oxigenacioacuten
oacuteptimas para este bioproceso Esto lo podemos explicar pues si tenemos que
OTR = kLa(cA-cA)
dado que al aumentar el contenido de γ-PGA ocurre una reduccioacuten en el valor
de kLa por accioacuten del incremento de la viscosidad (hecho que es
completamente cierto) y al aumentar la concentracioacuten de γ-PGA tambieacuten se
reduce tanto el valor de cA como el de cA (ya sea por efecto de la viscosidad o
de la naturaleza anioacutenico del poliacutemero) la OTR ve su magnitud evidente e
inevitablemente reducida dado que la misma es una relacioacuten de producto entre
ambos factores kLa y (cA ndashcA) Esto podriacutea explicar porque a voluacutemenes de
cultivo de 600 mL (en biorreactor) los rendimientos son mucho menores que en
voluacutemenes de cultivo de 100 ml (matraz) pues probablemente esta caiacuteda en la
OTR sea maacutes acentuada y criacutetica para los microorganismos cuando sucede a
voluacutemenes mayores donde mantener las condiciones de mezcla perfecta y una
alta concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto resultan maacutes dificultosas por lo que el
microorganismo es incapaz de crecer y alcanzar la concentracioacuten idoacutenea para
una maacutexima produccioacuten
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γshyPGA
La concentracioacuten de γ-PGA alcanzada al final de las 18 horas de
fermentacioacuten se vio afectada por la presioacuten Asiacute hasta los 103 bar a mayor
presioacuten mayor concentracioacuten de γ-PGA por encima de este valor de presioacuten la
concentracioacuten de γ-PGA disminuye
Esto puede explicarse por dos factores 1) el efecto de la presioacuten sobre
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y 2) impacto sobre la integridad y
viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γ-PGA
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR
La OTR se ve afectada tanto por el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de oxiacutegeno kLa asiacute como por la diferencia entre la concentracioacuten
de saturacioacuten y la concentracioacuten real en la fase liacutequida (cA-cA) El coeficiente kL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 88
es empiacuterico y su valor depende principalmente de factores tales como la
hidrodinaacutemica del sistema la turbulencia y su geometriacutea
Teoacutericamente kL se puede definir como kL = DABδ donde DAB es la
difusividad de A en B y δ es el espesor de la peliacutecula estancada seguacuten la
teoriacutea de peliacutecula para la transferencia de materia La difusividad en liacutequidos
depende en gran medida de la temperatura (afecta el coeficiente de difusioacuten) y
la concentracioacuten de solutos pero muy poco de la presioacuten (Diacuteaz 2011) En
nuestro caso podriacuteamos suponer que la presioacuten tiene poco efecto sobre kLa
pues tampoco es de esperar un cambio producto de la presioacuten en el aacuterea de
burbujas (a) producida por la agitacioacuten mecaacutenica auacuten maacutes cuando vemos el
hecho de que los ensayos llevados a cabo no contaron con un sistema de
aireacioacuten o burbujeo especiacutefico salvo aquel llevado a presioacuten atmosfeacuterica (0
bar relativa) y debidamente identificado como Aireacioacuten
Asiacute entonces tenemos en el segundo componente de la foacutermula la
diferencia (cA-cA) un punto de particular intereacutes pues efectivamente la
concentracioacuten de saturacioacuten y la concentracioacuten real variacutean con la presioacuten A
pesar de carecer de una sonda de oxiacutegeno disuelto directamente incorporada
al biorreactor y capaz de operar a presioacuten se determinoacute mediante transferencia
(con el sistema cerrado) la concentracioacuten real de oxiacutegeno en el medio de
cultivo a distintas presiones Tales concentraciones y las concentraciones de
saturacioacuten a cada presioacuten se presentan en el graacutefico 14
Para determinar el valor de las distintas concentraciones de saturacioacuten
al trabajar a presiones distintas a la atmosfeacuterica se realizoacute la siguiente
correccioacuten (Montoya amp Bermuacutedez 2003) para el valor de la solubilidad del
oxiacutegeno en agua
Ley de Henry
a 1 atm
Para una presioacuten P distinta a 1 atm tenemos que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 89
en mgL
Donde
C(S) = valor de solubilidad a 1 atm (mgL)
P = presioacuten de operacioacuten (atm)
T = temperatura de operacioacuten (K)
Graacutefico 14 Concentraciones de oxiacutegeno de saturacioacuten y en fas liacutequida a diferentes presiones
en medio de cultivo E sin crecimiento bacteriano
80
153
227
324
422
6681
141154
178
141
724857
1703
2438
y = 48525x + 68875
y = 14191x + 80039
y = 93382x + 11163
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
00
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 05 1 15 2 25 3
Concentracioacuten
Presioacuten (bar)
CONCENTRACIOacuteN DE SATURACIOacuteN CONCENTRACIOacuteN EN FASE LIacuteQUIDA DIFERENCIA
Aunque estos valores deben repetirse con una sonda de oxiacutegeno
disuelto interna (dentro del biorreactor) y bajo una metodologiacutea maacutes pertinente
preliminarmente puede observarse que la diferencia (cA-cA) aumenta al
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 90
aumentar la presioacuten y dado que OTR = kLa(cA-cA) al aumentar dicha
diferencia la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deberiacutea ser mayor Este
incremento de la OTR podriacutea explicar el porqueacute del raacutepido crecimiento
microbiano y la produccioacuten precoz de γ-PGA despueacutes de 18 horas de cultivo
en comparacioacuten con las entre 48 y 96 horas reportadas por otros autores asiacute
como el aumento del rendimiento al aumentar la presioacuten de los 0 bar relativos
(a presioacuten atmosfeacuterica) hasta los 103 bar relativos
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γshyPGA
Al superar los 103 bar relativos el rendimiento en γ-PGA decae
nuevamente Si consideramos un efecto positivo de la presioacuten sobre la OTR
como sentildealamos anteriormente esto no deberiacutea ocurrir Sin embargo al
someter las ceacutelulas a condiciones de presioacuten desconocemos el efecto que
dicha presioacuten puede ejercer sobre los microorganismos y sus rutas
metaboacutelicas asiacute como sobre la estructura de algunas biomoleacuteculas como por
ejemplo proteiacutenas
Meersman y Heremans (2008) sentildealan que el efecto de la presioacuten sobre
el crecimiento de los microorganismos puede explicarse por tres efectos
principales 1) Variaciones en el plegamiento y agregacioacuten de las proteiacutenas 2)
Variaciones en el estado de la membrana celular y 3) Variaciones en el
contenido de proteiacutenas asociadas a la membrana celular Estos aspectos son
de peculiar consideracioacuten pues la γ-PGA sintetasa es un complejo enzimaacutetico
formado por al menos tres unidades enzimaacuteticas distintas y que se encuentra
asociado a la membrana celular de Bacillus licheniformis
En lo referente a las proteiacutenas se sabe que su desnaturalizacioacuten se
produce por efecto de una reduccioacuten en su volumen producto de un cambio
configuracional probablemente de la estructura terciaria Asiacute tenemos que si el
volumen inicial de una proteiacutena viene dado por Vi = Vatomos + Vcavidades +
Vhidratacioacuten si en condiciones de presioacuten ocurre un cambio en el volumen de la
proteiacutena tal que ΔV = ΔVcavidades + ΔΔVhidratacioacuten(el volumen de los aacutetomos no
tiene por queacute variar con la presioacuten) la exposicioacuten de los grupos cargados o
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 91
hidrofoacutebicos de la proteiacutena al agua pueden conllevar a un cambio en la
estructura secundaria y terciaria de modo que la actividad de la proteiacutena se
vea perjudicada parcial o totalmente Esto se debe a que un aumento en la
presioacuten rompe las interacciones hidrofoacutebicas donde las interacciones proteiacutena-
proteiacutena son sustituidas por interacciones proteiacutena-agua particularmente
mediante puente de hidroacutegeno El incremento de la presioacuten podriacutea afectar la
conformacioacuten de alguno o algunos de los componentes del complejo
enzimaacutetico γ-PGA sintetasa lo que sin duda alguna se traduciriacutea en un menor
rendimiento en γ-PGA durante la fermentacioacuten Este posible efecto negativo de
la presioacuten sobre una de las enzimas involucradas en el proceso de biosiacutentesis
del γ-PGA se reafirma cuando vemos como variacutea la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA al aumentar la presioacuten aspecto que se discutiraacute con mayor detalle
maacutes adelante De hecho Ashiuchi y colaboradores (2004) sentildealan que el
complejo enzimaacutetico PgsBCA (γ-PGA sintetasa) es imposible de aislar en su
estado activo debido precisamente a su alta inestabilidad y elevada
hidrofobicidad
Por su parte la membrana celular al tratarse de una bicapa fosfolipiacutedica
es susceptible a sufrir cambios de fase producto de la temperatura o la presioacuten
como por ejemplo la transicioacuten gel-liacutequido El incremento de la presioacuten al igual
que sucede con la temperatura concede mayor fluidez a las bicapas lipiacutedicas
Asiacute en nuestro caso un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea permitir
una mayor difusioacuten de oxiacutegeno al interior celular lo que podriacutea afectar el
crecimiento bacteriano si por ejemplo se formase maacutes especies reactivas
toacutexicas de oxiacutegeno en el interior celular o si cierta maquinaria celular como la
misma γ-PGA sintetasa no fuese capaz de acoplarse adecuadamente en una
membrana con mayor fluidez
En lo referente a la interaccioacuten membrana celular-proteiacutenas es
importante destacar que entre el 20 y el 40 de las proteiacutenas de una ceacutelula
bacteriana suelen estar asociadas a esta estructura Como indicamos
anteriormente un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea afectar el
contenido concentracioacuten y capacidad de anclaje de las proteiacutenas a la
membrana celular El complejo enzimaacutetico γ-PGA sintetasa al tratarse de una
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 92
proteiacutena de membrana podriacutea no acoplarse de manera efectiva a la membrana
celular modificada bajo condiciones de presioacuten o ser liberada al medio de
cultivo lo que afectariacutea negativamente la produccioacuten de γ-PGA Estas
suposiciones podriacutean explicar el porqueacute de la gran cantidad de espuma
generada durante algunas fermentaciones a presioacuten (concretamente en
aquellas a una presioacuten superior a los 103 bar) a pesar de su menor
concentracioacuten de γ-PGA y teniendo presente que en las fermentaciones
microbianas la espuma suele estar constituida mayoritariamente por proteiacutenas
la presioacuten podriacutea estar favoreciendo la liberacioacuten de estas proteiacutenas al caldo de
cultivo y la consecuente formacioacuten abundante de espuma Este fenoacutemeno ya
ha sido reportado en otros microorganismos como Salmonella enterica donde
el tratamiento con presioacuten conllevaba a la peacuterdida de gran parte de sus
proteiacutenas de membrana y su consecuente liberacioacuten al medio de cultivo
(Meersman amp Heremans 2008) Esto se ve respaldado con las observaciones
de Ashiuchi y colaboradores (2004) quienes adicionaron detergentes como el
Tween20 y Triton X-114 (que modifican la estabilidad de la membrana celular y
favorece la liberacioacuten de las proteiacutenas asociadas a ella) a cultivos de Bacillus
spp productores de γ-PGA Ellos observaron una peacuterdida total de la capacidad
de siacutentesis del γ-PGA capacidad que no se recuperaba ni siquiera removiendo
la totalidad de dichos detergentes mediante diaacutelisis con lo cual concluyeron
que es indispensable que el complejo γ-PGA sintetasa se encuentre asociado a
la membrana celular para ser bioloacutegicamente activo
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γshyPGA
Un incremento de la intensidad de agitacioacuten afectariacutea positivamente el
valor de kLa incrementaacutendolo al aumentar el aacuterea de intercambio mediante una
mayor ruptura de las burbujas lo que aumenta el aacuterea de intercambio por
unidad de volumen Sin embargo existen liacutemites para la velocidad de agitacioacuten
esto debido al dantildeo ocasionado a los organismos debido a un esfuerzo
cortante excesivo A pesar de que la turbina Rushton es el impulsor de flujo
axial maacutes recomendado y maacutes eficiente para generar una mezcla perfecta de
alto perfil hidrodinaacutemico un bajo esfuerzo cortante y una alta distribucioacuten un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 93
exceso de agitacioacuten bajo condiciones de presioacuten es evidentemente perjudicial
Es probable que al aplicar presioacuten positiva sobre el cultivo la membrana celular
se encuentre en un estado de fluidez mayor al que presentariacutea a presioacuten
atmosfeacuterica asiacute mismo la presencia de glicerol en el medio de cultivo modifica
la composicioacuten lipiacutedica de la membrana favoreciendo la salida del γ-PGA al
exterior celular al aumentar de igual manera su fluidez Esto queda demostrado
por nuestros resultados a velocidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm
donde ocurre una reduccioacuten de la productividad conforme se aumenta la
agitacioacuten De igual manera la excesiva formacioacuten de espuma que se genera a
intensidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm podriacutea indicar la ruptura celular
y la liberacioacuten de componentes celulares y macromoleacuteculas al caldo de
fermentacioacuten Estas observaciones contradicen lo reportado por otros autores
(Yoon et al 2000) quienes indican velocidades de agitacioacuten oacuteptimas de hasta
1000 rpm a presioacuten atmosfeacuterica para un biorreactor de 24 L y un volumen
efectivo de cultivo de 1 L aunque no se brindan mayor detalle en lo referente al
tipo de turbina empleada
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
El cambio de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producto de la
presioacuten fue un resultado inesperado pues tradicionalmente se habiacutea sentildealado
a la concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo como el principal
responsable de controlar este aspecto Es importante destacar el hecho que
dicho cambio en la composicioacuten no es parcial o escalonado sino que por el
contrario el hecho de aplicar presioacuten durante la fermentacioacuten invierte
praacutecticamente los contenidos de aacutecido D-glutaacutemico y aacutecido L-glutamico de 87
y 13 respectivamente a presioacuten atmosfeacuterica (cultivo en matraz) a 17 y 83
respectivamente a una presioacuten relativa de 103 bar En algunos casos el
contenido de aacutecido D-glutaacutemico fue praacutecticamente 0
Efectivamente se sabe que el complejo γ-PGA sintetasa es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico aunque todaviacutea se
desconoce la arquitectura bioloacutegica de esta sintetasa Igualmente se sabe que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 94
es el componente PgsB el mayormente responsable de la cataacutelisis enzimaacutetica
(reaccioacuten de elongacioacuten del γ-PGA) (Ashiuchi 2010) Una hipoacutetesis que podriacutea
explicar estos resultados es que bajo presioacuten la estructura de esta proteiacutena se
modifique parcialmente (tanto la estructura de la proteiacutena propiamente dicha
como la estructura en funcioacuten de su anclaje a la membrana celular) lo
suficiente como para reducir su afinidad por el aacutecido D-glutaacutemico pero sin
afectar su afinidad por el aacutecido L-glutaacutemico ni conllevar a una
desnaturalizacioacuten de la proteiacutena y la consiguiente peacuterdida total de la actividad
enzimaacutetica Dado que es poco lo que se conoce de la estructura y mecanismo
de accioacuten de esta proteiacutena PgsB es imposible poder determinar con mayor
detalle el coacutemo pueden darse este cambio en la proteiacutena aunque casos
similares se observan durante la desnaturalizacioacuten de proteiacutenas por
temperatura donde las enzimas que operan sobre muacuteltiples sustratos no
pierden su capacidad enzimaacutetica de manera total sobre todos ellos sino que
inicialmente acontece una peacuterdida de afinidad diferenciada seguacuten el sustrato
hasta llegar al punto de desnaturalizacioacuten total donde se pierde toda actividad
enzimaacutetica para todos los sustratos
De igual manera es conocido que existe en Bacillus licheniformis una
enzima racemasa de naturaleza citosoacutelica responsable de transformar el aacutecido
L-glutaacutemico en aacutecido D-glutaacutemico podriacutea entonces tambieacuten asumirse alguacuten
efecto de la presioacuten sobre la actividad de la misma Sin embargo el hecho de
que esta enzima no esteacute asociada a una membrana celular (las proteiacutenas
asociadas a membrana celular tienden a ser maacutes vulnerables a los cambios de
presioacuten por la complejidad e indispensabilidad de su estructura terciaria sobre
su funcioacuten y su anclaje) sea una enzima de un uacutenico dominio y a que
experimentalmente el contenido de aacutecido D-glutaacutemico inclusive a la maacutexima
presioacuten (241 bar) no es cero hacen suponer que la misma se encuentra
bioloacutegicamente activa bajo las condiciones de presioacuten evaluadas
Estos resultados son de suma importancia pues para aplicaciones
biomeacutedicas y farmaceacuteuticas es necesario que el γ-PGA presente un alto
contenido en aacutecido L-glutaacutemico isoacutemero que es reconocido por el organismo
humano El efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre esta composicioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 95
enantiomeacuterica constituye un descubrimiento que pueda facilitar el empleo del γ-
PGA en medicina y que puede ser clave en el disentildeo de un proceso productivo
optimizado para tal fin
711 Peso molecular del γshyPGA En lo correspondiente al peso molecular del γ-PGA se observa que el
tamantildeo del poliacutemero es grande aunque no se observa ninguna tendencia en
los datos que pueda suponer alguacuten efecto de la presioacuten sobre el peso
molecular del poliacutemero Es importante sentildealar que la columna cromatograacutefica
empleada es incapaz de resolver moleacuteculas del alto peso molecular por lo
cual aunque si bien los resultados obtenidos resulten uacutetiles a nivel
comparativo dichos resultados deben tomarse con precaucioacuten Para un mejor
anaacutelisis seriacutea necesario emplear una columna capaz de resolver altos pesos
moleculares
Es importa sentildealar ademaacutes que tal y como se comentoacute anteriormente y
como se muestra en la figura 12 se observa una reduccioacuten del peso molecular
al prolongar el tiempo de fermentacioacuten hasta las 36 horas Para el caso del
reactor AHCJ32 al prolongar el tiempo de fermentacioacuten por 18 horas maacutes se
nota una reduccioacuten en la fraccioacuten de mayor peso molecular y un incremento en
la de menor sin que haya un cambio importante en el rendimiento global Esto
podriacutea deberse a que Bacillus licheniformis ATCC9945a posee enzimas
capaces de hidrolizar el γ-PGA y emplearlo como fuente de carbono Asiacute
mismo dicha observacioacuten sentildeala que si es necesario prolongar el tiempo de
fermentacioacuten es requerido realizar ajustes pues parece ser que la prolongacioacuten
por siacute misma uacutenicamente no es garantiacutea de una mejora en el rendimiento del
proceso fermentativo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 96
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 97
10 CONCLUSIONES
De la elaboracioacuten de la presente investigacioacuten se pueden extraer las
siguientes conclusiones principales
1) El rendimiento promedio en γ-PGA para el cultivo en matraz fue
superior a los 45 gL Dicho rendimiento es el mayor que se haya
reportado hasta la fecha para Bacillus licheniformis ATCC9945a lo
que convierte a esta cepa en una de las que mejor rendimiento
maacuteximo reporta para la biosiacutentesis de dicho poliacutemero natural
2) Un mecanismo eficiente para la conservacioacuten de cultivos de Bacillus
licheniformis ATCC9945a en un estado competente de produccioacuten
de γ-PGA es el congelamiento de ceacutelulas vegetativas a una
temperatura de -80 ordmC Es importante que la absorbancia de las
muestras congeladas sea superior a 25 lo que garantiza una alta
concentracioacuten de ceacutelulas
3) Dada la naturaleza del γ-PGA y su viscosidad el aumento de su
concentracioacuten en el caldo de cultivo a lo largo del tiempo de
fermentacioacuten afecta de manera negativa la tasa de transferencia de
oxiacutegeno disminuyeacutendola paulatinamente El cambio a condiciones
anaeroacutebicas conlleva a la detencioacuten de la biosiacutentesis del γ-PGA y el
consecuente inicio de un metabolismo netamente anaeroacutebico
4) Bacillus licheniformis ATCC9945a es capaz de crecer eficientemente
a presiones de hasta 242 bar relativos no vieacutendose afectado desde
el punto de vista de viabilidad por el incremento de la variable
presioacuten de fermentacioacuten
5) La presioacuten de fermentacioacuten afecta de manera significativa la
productividad de Bacillus licheniformis ATCC9945a en γ-PGA
6) El incremento de la presioacuten de fermentacioacuten hasta los 103 bar
relativos aumenta la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo de cultivo
seis veces (de 218 gL a 1334 gL) en comparacioacuten a los
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 98
rendimientos obtenidos a presioacuten atmosfeacuterica para un periacuteodo de
proceso de 18 horas
7) A presiones de fermentacioacuten superiores a los 103 bar la
productividad decae en comparacioacuten a la obtenida a dicha presioacuten
sin embargo la misma sigue siendo superior a la obtenida a presioacuten
atmosfeacuterica para un periacuteodo de proceso de 18 horas
8) El aumento de la presioacuten probablemente incremente la tasa de
transferencia de oxiacutegeno al incrementar la concentracioacuten de
saturacioacuten del mismo en el medio de cultivo lo que genera un
gradiente de concentracioacuten que permite una mayor transferencia
9) Presiones superiores a 103 bar probablemente afecten estructuras
celulares o biomoleacuteculas tales como las membranas celulares y las
proteiacutenas (γ-PGA sintasa) lo que tiene un efecto perjudicial sobre la
biosiacutentesis de γ-PGA
10) A una temperatura de 30 ordmC y a una presioacuten de 103 bar la
intensidad de agitacioacuten oacuteptima es de 300 rpm Una magnitud de
agitacioacuten mayor produce el dantildeo celular posiblemente por un exceso
de tensioacuten cortante
11) La presioacuten de fermentacioacuten modifica la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA A presioacuten atmosfeacuterica el γ-PGA estaacute compuesto
mayoritariamente por aacutecido D-glutaacutemico A presiones entre 052 y
242 bar dicha composicioacuten se revierte siendo el aacutecido L-glutaacutemico
el isoacutemero maacutes comuacutenmente presente en el γ-PGA
12) La biosiacutentesis de γ-PGA a presioacuten constituye una forma eficiente de
producir un biopoliacutemero mayoritariamente conformado por residuos
de aacutecido L-glutaacutemico aspecto de vital importancia para su aplicacioacuten
biomeacutedica dado que es este isoacutemero del aacutecido glutaacutemico es que es
reconocido y asimilado por el organismo humano
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 99
13) Aunque la modificacioacuten de la presioacuten de fermentacioacuten nunca ha sido
una variable importante en el estudio de los rendimientos para
distintos bioprocesos la presente investigacioacuten demuestra que la
modificacioacuten de dicha variable no soacutelo permite mejorar el
rendimiento global del proceso sino que tambieacuten puede conllevar a
la modificacioacuten del producto final lo que significariacutea una nueva rama
para la investigacioacuten en el disentildeo de bioprocesos de intereacutes
industrial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 100
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 101
11 AGRADECIMIENTOS
Un agradecimiento especial al profesor Jordi Bou por brindarme la
oportunidad de trabajar a su lado en este proyecto por el seguimiento y
asesoriacutea brindada a lo largo del mismo que nos permitioacute alcanzar nuestros
planteamientos y objetivos Espero que los aportes brindados con la presente
investigacioacuten permitan un mejor desarrollo en el futuro de estas temaacuteticas tan
novedosas biopoliacutemeros y fermentaciones bajo condiciones de presioacuten
positiva
Igualmente a la Ing Alejandra Hernaacutendez por la colaboracioacuten y asistencia
brindada durante esta investigacioacuten fue un apoyo importante durante el
desarrollo de las metodologiacuteas y distintas pruebas que se requirieron a lo largo
de esta investigacioacuten
A la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el Desarrollo
(AECID) y a Casa Ameacuterica Cataluntildea que me brindaron la oportunidad de cursar
este programa de maacutester a traveacutes de su programa de extensioacuten de becas a
ciudadanos extranjeros ha sido una oportunidad de crecimiento personal y
profesional que alcanza su punto maacuteximo con la elaboracioacuten de la presente
investigacioacuten El conocimiento adquirido sin duda alguna seraacute un valioso
compantildeero en mi desempentildeo profesional futuro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 102
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 103
12 BIBLIOGRAFIacuteA Ashiuchi M (2010) Occurrence and biosynthetic mechanism of poly-γ-
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Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 9
3 GLOSARIO
Bacillus Es un geacutenero de bacterias en forma de bastoacuten y Gram positiva El
geacutenero Bacillus pertenece a la divisioacuten Firmicutes Son aerobios estrictos o
anaerobios facultativos En condiciones estresantes forman una endospora de
ubicacioacuten central Dicha forma esporulada es resistente a las altas
temperaturas y a los desinfectantes quiacutemicos corrientes
γ-PGA Aacutecido gamma-poliglutaacutemico
ATCC American Type Culture Collection coleccioacuten y depositario de microorganismos
de importancia industrial y cientiacutefica
Biorreactor Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente
bioloacutegicamente activo En algunos casos un biorreactor es un recipiente en el
que se lleva a cabo un proceso quiacutemico que involucra organismos o
sustancias bioquiacutemicamente activas derivadas de dichos organismos Este
proceso puede ser aeroacutebico o anaeroacutebico Estos biorreactores son
comuacutenmente ciliacutendricos variando en tamantildeo desde algunos mililitros hasta
metros cuacutebicos y son usualmente fabricados en acero inoxidable
OTR Tasa de transferencia de oxiacutegeno
OUR Tasa de consume de oxiacutegeno por parte de un microorganismo
kL Coeficiente de transferencia maacutesica
a Aacuterea de transferencia de materia por unidad de volumen
kLa Coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 10
cA
Concentracioacuten de saturacioacuten de oxiacutegeno Maacutexima concentracioacuten de oxiacutegeno que pueda estar disuelto en una fase liacutequida perfectamente mezclada
cA Concentracioacuten de oxiacutegeno en el liacutequido o concentracioacuten real Es determinada experimentalmente haciendo uso de una sonda de oxiacutegeno disuelto
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 11
4 PREFACIO
21 Origen del proyecto
Este proyecto forma parte de una serie de estudios llevados a cabo en
el ETSEIB referentes al empleo y produccioacuten de biopoliacutemeros en Cataluntildea
Anteriormente no solo se ha investigado en torno a la produccioacuten mediante
fermentacioacuten del biopoliacutemero aacutecido poliglutaacutemico sino tambieacuten sobre la
produccioacuten de aacutecido polilaacutectico y su biodegradabilidad entre otros
Una de las principales limitantes que han encontrado los estudios
previos sobre produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico en medio liacutequido mediante
fermentacioacuten sumergida es la dificultad del escalamiento muy probablemente
debido a la reduccioacuten en la tasa de transferencia de oxiacutegeno al aumentar los
voluacutemenes de cultivo lo que conlleva a rendimientos pobres o a la generacioacuten
de un poliacutemero de bajo peso molecular Asiacute mismo la reproducibilidad de los
resultados es pobre en parte por muacuteltiples factores que fueron estudiados con
mayor detalle en este trabajo
Con el propoacutesito de dar solucioacuten a este problema el presente proyecto
plantea una forma diferente y creativa al menos no es la comuacuten en el aacutembito
microbioloacutegico de abordar la limitacioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
durante la fermentacioacuten y que podriacutea ser la responsable de la reduccioacuten en los
rendimientos Asiacute mediante la aplicacioacuten de condiciones de presioacuten positiva se
plantea una posible viacutea de mejora de los rendimientos fermentativos en la
produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico esperando que sus efectos sobre la
viabilidad microbiana sean los menores posibles
22 Motivacioacuten
En la sociedad actual existe una creciente buacutesqueda de soluciones
bioloacutegicas para los problemas que anteriormente abordaacutebamos desde una
percepcioacuten uacutenicamente quiacutemica Asiacute hoy en diacutea con el propoacutesito de garantizar
la preservacioacuten del medio ambiente reducir el impacto de la actividad humana
sobre las especies animales y vegetales y garantizar un planeta a las futuras
generaciones la palabra biopoliacutemero y bioplaacutestico se han vuelto maacutes y maacutes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 12
comunes tanto en el argot popular como en el aacutembito del conocimiento
cientiacutefico donde diacutea con diacutea son maacutes las investigaciones orientadas a este tipo
de productos de naturaleza bioloacutegica y por consiguiente biodegradable
El aacutecido poliglutaacutemico por sus caracteriacutesticas constituye un poliacutemero
natural que ofrece una amplia gama de aplicaciones industriales donde puede
ser empleado tanto como agente espesante o floculador hasta aplicaciones
maacutes novedosas relacionadas con la medicina y la farmacia
En este contexto de buacutesqueda de soluciones amigables con el ambiente
es donde surge la principal motivacioacuten para investigar sobre el aacutecido
poliglutaacutemico en particular sobre coacutemo aumentar la productividad del proceso
fermentativo a partir del cual se realiza su siacutentesis de modo que las ventajas
teoacutericas que ofrece este producto pronto esteacuten disponibles tanto para el
consumidor como para la industria Tristemente los productos biotecnoloacutegicos
casi siempre tienen como principal inconveniente la valoracioacuten econoacutemica
pues tienden a ser difiacuteciles de producir por lo que tienen altos costos
asociados o sus rendimientos son menores a los deseados para hacerlos
econoacutemicamente rentables Por este motivo las investigaciones deben
procurar al menos orientarse a ofrecer soluciones que alguacuten diacutea puedan ser
llevadas a la praacutectica o como sucede con esta investigacioacuten procurar dar
respuesta a los problemas que se enfrentan cuando se trata de llevar un
producto biotecnoloacutegico a la realidad
La importancia de la investigacioacuten biotecnoloacutegica en el campo de los
materiales radica en que en un mundo con materias primas limitadas
particularmente las fuentes foacutesiles los materiales del futuro tendraacuten un origen
maacutes bioloacutegico que mineral o extractivo por lo que la mejora de los procesos
productivos relacionados con estos productos son prioritarios para cualquier
paiacutes que desee mantenerse competitivo en el aacutembito econoacutemico y tecnoloacutegico
mundial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 13
5 INTRODUCCIOacuteN
En la actualidad el desarrollo de biomateriales constituye uno de los
principales ejes de investigacioacuten en el mundo de la ciencia Dentro de estos
biomateriales los biopoliacutemeros han logrado un particularmente alto grado de
atencioacuten especialmente en los uacuteltimos 30 antildeos debidos a sus muacuteltiples
aplicaciones industriales biomeacutedicas y farmaceacuteuticas que estaacuten aportando una
amplia gama de opciones y soluciones a problemas ambientales y en la
formulacioacuten de nuevas preparaciones biomeacutedicas y farmaceacuteuticas
Los biopoliacutemeros son materiales polimeacutericos o macromoleculares que
son sintetizados por seres vivos Debido en gran parte al precio creciente la
viabilidad declinante de las fuentes foacutesiles como materias primas asiacute como el
ritmo crecimiento de la poblacioacuten mundial han propiciado el desarrollo de
fuentes alternativas renovables capaces de suministrar las necesidades
mundiales crecientes en material de energiacutea y produccioacuten quiacutemica Esta
necesidad de nuevas fuentes alternativas ha permitido que la mirada cientiacutefica
se halle puesta sobre la diversidad microbiana que habita el planeta pues los
microorganismos siempre han demostrado ser una fuente importante de
materiales novedosos con la ventaja que en la actualidad se dispone de la
tecnologiacutea necesaria para crecer los microorganismos de manera masiva y
segura Este nuevo modelo conocido como la estrategia de las biorefineriacuteas
ha cambiado la concepcioacuten de la industria quiacutemica moderna y ha sido
empleada exitosamente en la produccioacuten convencional a granel de diversos
productos quiacutemicos como por ejemplo etanol glutamato y aacutecido ciacutetrico
En el presente la produccioacuten de poliacutemeros o monoacutemeros tales como el
13-propanediol el aacutecido polilaacutectico y los polihidroxialcanoatos ha sido uno de
los principales objetivos de mayor investigacioacuten Dentro de estos nuevos
materiales encontramos los poliaminoaacutecidos poliamidas de naturaleza
polimeacuterica cuyos constituyentes estaacuten unidos por enlaces del tipo amida El
aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) es uno de estos poliaminoaacutecidos un poliacutemero
biodegradable constituido por unidades de D- y L-aacutecido glutaacutemico y que es
producido de manera natural en algunas bacterias
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 14
El presente trabajo procura investigar sobre algunas de las condiciones
involucradas en la produccioacuten bacteriana de γ-PGA y que constituyen las
principales barreras que impiden alcanzar los rendimientos necesarios para
que la produccioacuten bioloacutegica de este poliacutemero sea viable tanto desde el punto de
vista bioloacutegico como econoacutemico
31 Objetivos
El objetivo general a partir del cual se estructura el desarrollo de la
presente investigacioacuten es
Estudiar la produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a y el efecto que tiene sobre el rendimiento y estructura del
producto factores propios de la ingenieriacutea quiacutemica como lo son la
presioacuten y la intensidad de agitacioacuten
Los objetivos especiacuteficos que se plantearon alcanzar en el siguiente
proyecto son los siguientes
Disentildear un biorreactor que permita realizar fermentaciones a presioacuten
positiva de hasta 4 bar absolutos
Describir las condiciones baacutesicas requeridas para lograr reproducibilidad
en la produccioacuten deaacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre el rendimiento de
produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico en gL por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre la composicioacuten
enantiomeacuterica y el peso molecular del aacutecido γ-poliglutaacutemico
Establecer el posible efecto de la presioacuten positiva sobre la tasa de
transferencia de oxiacutegeno en el biorreactor
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 15
6 MARCO TEOacuteRICO
41 Los poliaminoaacutecidos
Los poliaminoaacutecidos son poliamidas formadas por un uacutenico aminoaacutecido
y difieren de las proteiacutenas en muacuteltiples aspectos Las proteiacutenas son
biomoleacuteculas compuestas por una amplia gama de aminoaacutecidos mientras que
los poliaminoaacutecidos estaacuten compuestos uacutenicamente por un solo tipo de
aminoaacutecido al menos en su eje central La siacutentesis de proteiacutenas estaacute dirigida
por el ADN que controla la secuencia especiacutefica de aminoaacutecidos que termina
formando una moleacutecula de una proteiacutena en particular Por su parte los
poliaminoaacutecidos son sintetizados por una ruta metaboacutelica de los organismos
completamente distinta En enlace amida en las proteiacutenas acontece
uacutenicamente entre los grupos α-amino y α-carboxilo mientras que en los
poliaminoaacutecidos pueden verse involucradas otras cadenas laterales
funcionales como por ejemplo los grupos β- y γ-carboxiloy ε-amino(Bajaj amp
Singhal 2011)
Existen mayoritariamente tres poliaminoaacutecidos presentes en la
naturaleza el aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina En
el aacutecido γ-poliglutaacutemico los enlaces amida se forman entre el grupo α-amino y
el γ-carboxilo en el eje central La poli ε-lisina presenta monoacutemeros de lisina
unidos por los grupos α-carboxilo y ε-amino La cianoficina consiste en residuos
de aacutecido α-aspaacutertico que contienen residuos de arginina que penden unidos al
grupo β-carboxilo Las foacutermulas de dichos compuestos se presentan en la
figura 1
42 El aacutecido γshypoliglutaacutemico (γshyPGA)
El aacutecido γ-poliglutaacutemico (de ahora en adelante referido como γ-PGA) es
un poliacutemero inusual que acontece de forma natural anioacutenico soluble en agua
biodegradable comestible y que no resulta toacutexico ni para el ser humano ni para
el ambiente que en la naturaleza es producido por algunas bacterias todas
Gram-positivas una archea e inclusive en eucariotas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 16
Fue primeramente descubierto por Ivaacutenovics y colaboradores como
componente de la caacutepsula de la bacteria Bacillus anthracis despueacutes que se
liberara al medio producto tanto del proceso de autoclavado como por el
envejecimiento y lisis natural de los cultivos La comida tradicional japonesa
ldquoNattordquo estaacute constituida por una mezcla de γ-PGA y fructanos que son
producidos por la bacteria Bacillus natto (Bajaj amp Singhal 2011)
Figura 1 Foacutermula y estructura del aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina
(Fuente Feng et al 2007)
421 Propiedades quiacutemicas y bioquiacutemicas del γshyPGA
El γ-PGA es un poliacutemero polianioacutenico que puede estar compuesto
uacutenicamente por D- L- o por ambos enantioacutemeros del aacutecido glutaacutemico Como se
ha comentado ya es altamente soluble en agua El γ-PGA probablemente
pueda adoptar diferentes estructuras La estructura del γ-PGA ha sido predicha
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 17
asumiendo poliaminoaacutecidos constituidos por 10 o 25 moleacuteculas de aacutecido
glutaacutemico Este modelo teoacuterico calculado para una moleacutecula en solucioacuten
acuosa muestra que el γ-PGA consiste de una heacutelice levoacutegira estabilizada por
enlaces de hidroacutegeno intramoleculares Sin embargo otro estudio realizado a
partir de γ-PGA obtenido de Bacillus licheniformis mostroacute que la conformacioacuten
es realmente flexible y depende de la concentracioacuten de γ-PGA y el pH de la
disolucioacuten A bajas concentraciones (01 wv) y a un pH inferior a 7 el γ-PGA
adopta una conformacioacuten basada mayoritariamente en heacutelices del tipo α
mientras que la conformacioacuten tipo hojas β predomina a pH superiores pues
esta conformacioacuten permite una mejor exposicioacuten de las cargas negativas del γ-
PGA (Candelaamp Fouet 2006) Recientemente mediamente experimentos de
dicroiacutesmo circular se ha reportado una estructura desordenada (Joyce et al
2006 Candela amp Fouet 2006) pero sin detallar las condiciones de trabajo de
los experimentos en particular de pH
El peso molecular del γ-PGA parece variar seguacuten sea el organismo que
produce la moleacutecula sin embargo estas diferencias podriacutean deberse a
diferencias en torno a la degradacioacuten natural que acontece con el poliacutemero o a
los meacutetodos de purificacioacuten y anaacutelisis utilizados mismos que puedan afectar el
tamantildeo del γ-PGA Por ejemplo para el caso de Bacillus subtilis el peso
molecular del γ-PGA variacutea entre 160kDa hasta 1500 kDa las cadenas de γ-
PGA consisten entonces de coacutemo miacutenimo 1000 residuos de aacutecido glutaacutemico
Diferentes estudios enfocados en la siacutentesis microbioloacutegica de γ-PGA han
demostrado que el peso molecular de este poliacutemero es dependiente tanto de
las diversas cepas bacterianas que se empleen asiacute como de los componentes
del medio y las condiciones del medio de cultivo e inclusive de razones auacuten no
dilucidadas De alliacute que exista una gran dificultad para obtener un γ-PGA
altamente homogeacuteneo a partir de cultivos bacterianos esto en gran parte
debido a esta inestabilidad descrita asiacute como a la complejidad molecular
involucrada en su biosiacutentesis
Asiacute mismo el γ-PGA puede contener soacutelo aacutecido D-glutaacutemico soacutelo aacutecido
L-glutaacutemico o una mezcla de ambos enantioacutemeros De alliacute que los filamentos
puedan ser de aacutecido γ-poli-L-glutaacutemico (γ-PLGA) de aacutecido γ-poli-D-glutaacutemico
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 18
(γ-PDGA) o de aacutecido γ-poli-L-D-glutaacutemico (γ-PLDGA) La disposicioacuten de los
residuos en el PLGDA requiere un especial anaacutelisis ya que si bien tanto el
PLGA y el PDGA son ambos solubles en etanol cuando ambos se mezclan en
proporcioacuten equimolar precipitan en etanol Esta observacioacuten es utilizada para
demostrar que el γ-PGA producido por Bacillus licheniformis estaacute compuesto
por cadenas tanto de PLGA como de PDGA Asiacute mismo la digestioacuten con L-
glutamilhidrolasa ha demostrado que el γ-PGA de Bacillus subtilis consiste en
una mezcla de isoacutemeros PLGA y PLDGA
422 Siacutentesis microbioloacutegica de γshyPGA
Distribucioacuten en los microorganismos
Inicialmente el γ-PGA fue detectado como un componente de la pared
capsular de la altamente patogeacutenica bacteria Gram-positiva Bacillus anthracis
Posteriormente este poliacutemero seriacutea nuevamente encontrado presente alrededor
de ceacutelulas de otras bacterias Gram-positivas no patogeacutenicas particularmente
del geacutenero Bacillus Gracias a estos descubrimientos fue posible aislar a inicios
del siglo pasado una cepa de Bacillus capaz de producir grandes cantidades de
γ-PGA
Posteriormente y de manera adicional a estas bacterias formadoras de
endosporas del geacutenero Bacillus el γ-PGA fue encontrado en las eubacterias
haloacutefilas Sporosarcina halophila y Planococcus halophilus y en la
archeobacteria haloacutefila Natrialba aegyptiaca Asiacute mismo γ-PGA fue tambieacuten
detectado en cantidades significativas en nematocistos de Cnidaria (eucariota)
En la tabla 1 se presentan los principales organismos productores de γ-
PGA y algunas de las caracteriacutesticas del γ-PGA producido
Ruta de biosiacutentesis
La conversioacuten de glucosa a γ-PGA sugiere que la siacutentesis del poliacutemero
acontece durante la glicoacutelisis y el ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos (ciclo de
Krebs o del aacutecido ciacutetrico) hasta el 2-oxoglurato (α-cetoglutarato) que es un
precursor directo del aacutecido L-glutaacutemico Durante su crecimiento en un medio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 19
Tabla 1 Organismos que han sido reportados como productores de γ-PGA
ORGANISMO CONFORMACIOacuteN CONFORMACIOacuteN DEL FILAMENTO
Bacillus anthracis D D
Bacillus mesentericus D D
Bacillus licheniformis D y L D y L
Bacillus megaterium D y L D + L
Bacillus pumilus D y L ND
Bacillus subtilis D y L L y D+L
Planococcus halophilus D D
Sporosarcina halophila D D
Staphylococcus
epidermidis
D y L ND
Natrialba aegyptiaca L L
Hydra ND ND
Fuente (Candela amp Fouet 2006)
nutritivo Bacillus licheniformis expresa dos enzimas capaces de sintetizar el
aacutecido L-glutaacutemico la glutamato sintasa y la glutamato deshidrogenasa Ambas
enzimas son praacutecticamente insensibles a la inhibicioacuten por producto lo que
permite alcanzar altas concentraciones intracelulares de aacutecido L-glutaacutemico el
cual es entonces direccionado a la siacutentesis de γ-PGA Los estudios maacutes
detallados relacionados con la polimerizacioacuten del γ-PGA se han realizado con
Bacillus anthracis Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis especialmente
Bacillus licheniformis ATCC9945a lo que ha permitido la identificacioacuten de un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 20
sistema enzimaacutetico anclado a la membrada y denominado como PGA-
sintetasa Este sistema enzimaacutetico estaacute constituido por al menos tres
componentes con actividad enzimaacutetica y se presume que cataliza la siguiente
secuencia de reacciones (Troy 1973) (figura 2)
Aacutecido L-glutaacutemico + ATP ɣ-L-glutamil-AMP + PPi (a)
ɣ-L-glutamil-AMP + SH-enzima ɣ-X-glutamil-S-enzima + AMP (b)
ɣ-X-glutamil-S-enzimaɣ-D-glutamil-S-enzima (c)
ɣ-D-glutamil-S-enzima + [ɣ-D-glutamil]n[ɣ-D-glutamil]n+1 + SH-enzima (d)
Figura 2 Posible mecanismo enzimaacutetico de siacutentesis del γ-PGA (Fuente Ashiuchi 2010)
De acuerdo con este modelo solamente el aacutecido L-glutaacutemico es activado
en el paso (a) mediante fosforilacioacuten lo que significa que la biosiacutentesis del γ-
PGA requiere el suministro de energiacutea para la formacioacuten del enlace amida Maacutes
recientemente un segundo mecanismo ha sido descrito por Ashiuchi (2001) e
involucra un complejo enzimaacutetico denominado PgsBCA el cual es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico y donde la
polimerizacioacuten ocurre por un mecanismo de ligacioacuten tipo amida (figura 3)
Inicialmente se habiacutea descrito que el complejo enzimaacutetico era el responsable
de racemizar y polimerizar el aacutecido glutaacutemico sin embargo estas nuevas
evidencias parecen demostrar que el complejo enzimaacutetico involucrado en la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 21
siacutentesis de γ-PGA carece de actividad racemasa y que la formacioacuten del aacutecido
D-glutaacutemico es responsabilidad de una enzima citosoacutelica denominada aacutecido
glutaacutemico racemasa Glr que presenta una alta selectividad por el aacutecido
glutaacutemico y una mayor preferencia por el aacutecido L-glutaacutemico Un modelo de la
viacutea metaboacutelica mayoritariamente aceptada para la siacutentesis de γ-PGA se
presente en la figura 4
Figura 3 Mecanismo propuesto de biosiacutentesis del γ-PGA mediante ligacioacuten tipo amida
(Fuente Ashiuchi 2001)
Figura 4 Viacutea metaboacutelica de biosiacutentesis del γ-PGA (Fuente Buescher amp Margaritis 2007)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 22
Organizacioacuten geneacutetica
Solamente unas pocas bacterias la mayoriacutea dentro del geacutenero Bacillus
han sido reportadas como capaces de producir γ-PGA Asiacute mismo la
produccioacuten de γ-PGA no es uniforme en estos individuos inesperadamente
variacutea inclusive bajo condiciones de cultivo altamente estrictas De alliacute que la
identificacioacuten del sistema regulatorio y los genes involucrados en dicho sistema
es vital para dar solucioacuten a estos problemas de uniformidad y rendimiento El
complejo PGA-sintetasa estaacute codificado por cuatro loci que son denominados
pgs Los cuatro genes pgs son pgsB pgsC pgsAA y pgsE y se les denomina
en conjunto pgsBCA Todos estos genes son necesarios y suficientes para la
produccioacuten de γ-PGA in vivo La figura 5 muestra los elementos geneacuteticos
requeridos para la produccioacuten de γ-PGA en diferentes especies del genero
Bacillus
Figura 5 Elementos geneacuteticos necesarios para la siacutentesis de γ-PGA (Fuente Candela amp
Fouet 2006)
423 Produccioacuten fermentativa de γshyPGA
Diferentes cepas de bacterias del geacutenero Bacillus son capaces de
producir elγ-PGA ya sea como material viscoso extracelular o como
componente capsular En termino industrial estas cepas han sido las maacutes
utilizadas y por ende las maacutes estudiadas hasta el momento La mayor parte de
los estudios han estado orientados a determinar los requerimientos
nutricionales para el adecuado crecimiento celular asiacute como mejorar la
productividad de γ-PGA y la variacioacuten en la composicioacuten de su estructura en lo
referente al contenido de aacutecido L- y D-glutaacutemico Estos estudios como los
realizados por Troy (1973) Cromwicket al (1995) y Kunioka (1997) han
permitido determinar que los requerimientos nutricionales para la produccioacuten de
γ-PGA variacutean seguacuten sea la cepa que se emplea
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 23
De acuerdo a estos requerimientos nutricionales las cepas productoras
de γ-PGA se han dividido en dos grupos uno que requiere la adicioacuten de aacutecido
L-glutaacutemico al medio de cultivo para estimular la produccioacuten de γ-PGA y el
crecimiento celular y otro que no requiere de aacutecido L-glutaacutemico para la
produccioacuten de γ-PGA
Dentro de las bacterias dependientes de aacutecido L-glutaacutemico las cepas
maacutes promisorias han sido B anthracis B licheniformis ATCC9945a B subtilis
IFO3335 y B subtilis F-2-01 Por su parte dentro de las bacterias
independientes de aacutecido L-glutaacutemico encontramos mayoritariamente los caso s
de B subtilis 5E B subtilis TAM-4 y B licheniformis A35 B subtilis 5E puede
producir γ-PGA a partir de L-prolina como uacutenica fuente de carbono
complementado con una fuente de nitroacutegeno en un medio mineral B
licheniformis A35 produce γ-PGA a partir de glucosa y cloruro de amonio en
condiciones desnitrificantes y B subtilis TAM-4 produce grandes cantidades de
γ-PGA cuando crece en un medio de cultivo con una sal de amonio y azuacutecar
como fuentes de nitroacutegeno y carbono respectivamente Asiacute mismo ademaacutes de
la fuente de carbono y nitroacutegeno existen otra serie de factores tales como
fuerza ioacutenica del medio de cultivo pH del medio de cultivo aireacioacuten entre
otros que afectan en gran medida la productividad y calidad del γ-PGA
De primera impresioacuten pareciera conveniente el empleo de las cepas
independientes de aacutecido L-glutaacutemico para la produccioacuten industrial de γ-PGA
sin embargo la informacioacuten disponible en lo referente a la ruta biosinteacutetica el
mecanismo de formacioacuten del γ-PGA y los factores que afectan la productividad
es praacutecticamente nula para estas cepas A partir de los trabajos de
investigacioacuten y los estudios de aplicaciones industriales la produccioacuten de γ-
PGA se ha llevado a cabo mayoritariamente a partir de cepas dependientes de
aacutecido L-glutaacutemico
En la tabla 2 se presentan algunas de las principales cepas bacterianas
empleadas para la produccioacuten de γ-PGA los nutrientes las condiciones de
cultivo el rendimiento obtenido asiacute como los voluacutemenes de cultivo en que se
basan dichos reportes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 24
Tabla 2 Principales bacterias productoras de γ-PGA (Shih amp Van 2001)
CEPA
NUTRIENTES
CONDICIONES DE CULTIVO
RENDIMIENTO
VOLUMEN DE
TRABAJO B licheniformis ATCC9945a
Aacutecido glutaacutemico (20 gL) aacutecido ciacutetrico (12 gL) NH4Cl (7 gL)
30ordmC 4 diacuteas 17-23 gL 100 mL
B subtilis IFO 3335
Aacutecido glutaacutemico (30 gL) aacutecido ciacutetrico (20 gL)
37ordmC 2 diacuteas 10-20 gL 125 mL
B subtilis TAM-4
Fructosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 4 diacuteas 20 gL 100 mL
B licheniformis A35
Glucosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 3-5 diacuteas 8-12 gL 100 mL
B subtilis F02-1
Aacutecido glutaacutemico(70 gL) glucosa (1 gL)
30ordmC 2-3 diacuteas 50 gL 200 mL
B subtilis (natto)
Maltosa (60 gL) salsa de soya (70 gL) glutamato soacutedico (30 gL)
40 ordmC 3-4 diacuteas 35 gL 125 mL
Fuente Shih amp Van 2001
424 Produccioacuten de γshyPGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a
Generalidades de la bacteria Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis es una bacteria comuacutenmente encontrada en el
suelo y en las plumas de las aves Es gram-positiva de forma oval y mesoacutefila
Su temperatura oacuteptima de crecimiento se encuentra alrededor de los 30 ordmC
aunque es capaz de sobrevivir a temperaturas mucho mayores La temperatura
oacuteptima para la secrecioacuten de enzimas es de 37 ordmC Esta bacteria puede existir
como espora cuando las condiciones son inadecuadas o en estado vegetativo
cuando las condiciones le son maacutes favorables (Wecke et al 2006)
Bacillus licheniformis forma parte del grupo Subtilis junto con Bacillus
subtilis y Bacillus pumilus Estas bacterias son conocidas por ser
contaminantes comunes de alimentos asiacute como favorecer su descomposicioacuten
aunque no se consideran patoacutegenos de importancia para el ser humano
(Wecke et al 2006)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 25
La cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis y la siacutentesis de γ-PGA
La produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a fue
primeramente estudiada por Bovarnick en 1942 sin embargo no fue sino a
partir de 1954 cuando Thorne y colaboradores iniciaron una serie de estudios
sistemaacuteticos orientados a investigar los factores que afectan la produccioacuten de
γ-PGA lo que permitioacute determinar algunos factores y condiciones necesarios
para lograr mayores rendimientos Factores tales como presencia de ciertas
sales inorgaacutenicas aacutecido glutaacutemico aacutecido ciacutetrico glicerol y el tamantildeo del inoacuteculo
demostraron tener efectos importantes sobre el rendimiento de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a tanto en condiciones estaacuteticas como cultivos
bajo agitacioacuten Se encontroacute que los mejores rendimientos se produciacutean cuando
el microorganismo era cultivado en agitacioacuten orbital en un medio de cultivo
denominado como medio C (tabla 3) alcanzando una productividad de hasta
15 gL en un periacuteodo de 3-4 diacuteas Asiacute mismo la mayor produccioacuten de poliacutemero
soacutelo se alcanzaba cuando se empleaba agua de grifo y un lote especiacutefico de
FeCl3 Posteriormente se determinariacutea que dicho lote de FeCl3 estaba
contaminado con trazas de Mn2+ y que el agua de grifo conteniacutea cantidades
significativas de Ca2+ Posteriormente Leonard y colaboradores (1958) se
encargariacutean de comprobar la funcioacuten y concentracioacuten oacuteptima de ambos
elementos quiacutemicos mediante la elaboracioacuten de un medio de cultivo
quiacutemicamente definido tomando como base el medio C de Thorne
Tabla 3 Composicioacuten del medio de cultivo C (Thorne et al 1954)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua de grifo
Fuente Shih amp Van 2001
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 26
Leonard y colaboradores encontraron que aunque solamente se requeriacutea
de 15 x 10-7 moles por litro de Mn2+ para alcanzar el maacuteximo crecimiento
concentraciones mayores de Mn2+ mostraban un marcado efecto prolongando
la viabilidad celular y por consiguiente incrementando la productividad de γ-
PGA Un incremento de hasta 615 x 10-4 molL en la concentracioacuten de Mn2+
permitiacutea alcanzar los mayores rendimientos de γ-PGA De igual manera la
adicioacuten de 102 x 10-3 moles por litro de Ca2+ en presencia de 15 x 10-7 moles
por litro de Mn2+ permitiacutea alcanzar auacuten mayores rendimientos deγ-PGA en
comparacioacuten a los valores oacuteptimos de produccioacuten de poliacutemero obtenidos en
ausencia de este elemento El γ-PGA producido consistiacutea en un homopoliacutemero
de unidades repetidas de aacutecido D- y L-glutaacutemico con una concentracioacuten de
aacutecido D-glutaacutemico que variaba entre el 38 y el 86 seguacuten incrementaba la
concentracioacuten de Mn2+ entre 154 x 10-7 y 246 x 10-3 molL siendo esta
observacioacuten independiente de la concentracioacuten presente en el medio de cultivo
de Ca2+
Tabla 4 Composicioacuten del medio E revisado (Leonard et al 1958)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 0000026 a
042 CaCl22H2O 015 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua destilada
Fuente Shih amp Van 2001
A partir de estos resultados Leonard y colaboradores elaboraron el
medio de cultivo denominado Medio E (tabla 4) que es baacutesicamente el medio
original C exceptuando el hecho de que cantidades definidas de Mn2+ y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 27
Ca2+fueron agregadas El Ca2+ fue adicionado con el propoacutesito de asegurar
altas productividades de poliacutemero a cualquier concentracioacuten de Mn2+ que se
empleara mientras que la variacioacuten de la concentracioacuten de este uacuteltimo
elemento permitiriacutea alcanzar el contenido enantiomeacuterico deseado en el
poliacutemero tal y como se comentoacute anteriormente
La estereoquiacutemica del poliacutemero es decir el contenido enantiomeacuterico del
γ-PGA ha sido desde el inicio de las investigaciones uno de los problemas maacutes
complejos y de difiacutecil solucioacuten y de una importancia tanto fundamental como
praacutectica en lo que se refiere al estudio de la produccioacuten de γ-PGA en bacterias
A lo largo de todos estos antildeos han existido numerosas contradicciones entre
los investigadores en cuanto a si el contenido enantiomeacuterico del γ-PGA
producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a estaacute o no afectado por la
concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo Cromwick y Gross (1995)
realizaron un estudio profundo sobre los factores que influenciaban la
produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a Dicho estudio
encontroacute que el porcentaje de aacutecido L-glutaacutemico presente en el γ-PGA variaba
entre 59 y 10 cuando las concentraciones de Mn2+ variaban entre 0 y 615
μmolL asiacute mismo el rendimiento incrementaba desde los 5 hasta los 17 gL en
dicho intervalo de concentracioacuten de Mn2+
Cromwick y Gross (1995) encontraron en este mismo estudio que la
incorporacioacuten de Mn2+ al medio de cultivo es un factor criacutetico para la
conservacioacuten de la viabilidad celular durante periodos de cultivo prolongados
El nuacutemero de ceacutelulas viables se incrementaba del orden de 105 a 109 unidades
formadoras de colonias (ufc) para todas las concentraciones de Mn2+ hasta el
inicio de la fase estacionaria aproximadamente a las 24 horas Sin embargo
despueacutes de 50 horas de cultivo la viabilidad celular se veiacutea reducida
draacutesticamente para aquellas concentraciones de Mn2+ relativamente menores
(0 a 0615 μmolL) mientras que para las concentraciones mayores (338 a 615
μmolL) el nuacutemero de ceacutelulas viables se manteniacutea en el orden de 107-109
inclusive despueacutes de 140 horas de cultivo Asiacute mismo la presencia de Mn2+ en
concentraciones entre 338 y 615 μ incrementaba la utilizacioacuten de las fuentes
de carbono en gran medida cultivos que conteniacutean 615 μmolL de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 28
Mn2+utilizaban el 37 54 y 93 del aacutecido glutaacutemico el glicerol y el aacutecido
ciacutetrico respectivamente en comparacioacuten a aquellos cultivos que no
incorporaban el Mn2+ los cuales solo utilizaban el 19 10 y 17 del aacutecido
glutaacutemico el glicerol y el aacutecido ciacutetrico respectivamente
Uno de los problemas maacutes prolongados en torno a los estudios referidos
a la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC994a es el hecho de
que el microorganismo termina degenerando en una cepa incapaz de producir
γ-PGA despueacutes de cultivo repetitivo Esta inestabilidad exhibida por este
microorganismo es responsable de una gran variacioacuten de cultivo en cultivo en
lo referente a la cantidad y la cineacutetica de formacioacuten del γ-PGA Birrer y
colaboradores (1994) encontraron que el empleo de ceacutelulas vegetativas
criogeacutenicamente congeladas permitiacutea alcanzar un crecimiento y produccioacuten de
poliacutemero consistente de cultivo en cultivo Asiacute mismo y en congruencia con
otros estudios previamente realizados se encontroacute que el crecimiento celular
ocurriacutea baacutesicamente durante las primeras 24 h la mayor productividad
volumeacutetrica de γ-PGA era de 012 gmiddotL-1middoth-1 y se alcanzaba entre los diacuteas 2 y 4
el pH caiacutea de 74 a aproximadamente 5 despueacutes de 42 horas de cultivo e
incrementaba levemente a cerca de 6 despueacutes de 96 horas de cultivo el
empleo de glicerol glutamato y citrato se reduciacutea de 80 a 45 gL 18 a 10 gL y
de 12 a 1 gL respectivamente la produccioacuten de aacutecido aceacutetico hasta un nivel
maacuteximo de 45 gL asiacute como la presencia de 23-butanediol como producto
secundario entre las 42 y las 96 h El estudio del consumo de las fuentes de
carbono resulta un poco sorprendente pues demuestra unas tasas de
consumo del aacutecido ciacutetrico y de glicerol relativamente altas sin embargo para el
caso del aacutecido glutaacutemico dicha tasa de consumo fue por mucho menor y muy
lejana del agotamiento completo de dicha fuente Asiacute mismo la remocioacuten del
aacutecido L-glutaacutemico del medio de cultivo E afectaba en poca medida el
rendimiento en γ-PGA mientras que la remocioacuten de las otras fuentes (glicerol y
aacutecido ciacutetrico) disminuye de manera draacutestica la produccioacuten de γ-PGA Estos
resultados son contradictorios a los encontrados inicialmente por Thorne y
colaboradores (1954) e indica que Bacillus licheniformis ATCC9945 no requiere
de aacutecido L-glutaacutemico para alcanzar altas productividades de γ-PGA Asiacute mismo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 29
la presencia de 23-butanediol es indicador que los niveles de oxiacutegeno en el
medio de cultivo despueacutes de 42 horas son incapaces de sostener un
metabolismo 100 aeroacutebico esto no es de sorprender pues el γ-PGA es un
poliacutemero extracelular extremadamente viscoso y tasas cada vez menores de
transporte de oxiacutegeno son esperables conforme va aumentado la viscosidad en
el medio a medida que la concentracioacuten de γ-PGA se incrementa
Un trabajo de Cromwick y Gross (1996) estudioacute el efecto del pH y la
aireacioacuten sobre la productividad en γ-PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a en condiciones de fermentacioacuten por lotes El pH fue controlado en
los valores de 55 65 74 y 825 y se determinoacute su efecto sobre el crecimiento
celular la utilizacioacuten de las fuentes de carbono la productividad en γ-PGA el
peso molecular y la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA El mayor
rendimiento en γ-PGA se obtuvo a un pH de 65 (15 gL 96 horas de cultivo) y
decrecioacute significativamente en 55 y 74 Esto coincide con el hecho que el
consumo de glicerol y de aacutecido L-glutaacutemico se mantuvo invariable en funcioacuten
del pH sin embargo la mayor tasa de consumo de aacutecido ciacutetrico se observoacute a un
pH de 65 en contraste con 55 y 74 lo cual parece indicar que el metabolismo
del aacutecido ciacutetrico juega un papel importante a dicho valor de pH Previamente
Cromwick y Gross (1995) encontraron que el aacutecido ciacutetrico es efectivamente un
precursor en la produccioacuten del poliacutemero presumiblemente a traveacutes del ciclo de
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De igual manera la alteracioacuten del pH no mostroacute
ninguacuten efecto importante en cuanto al peso molecular y la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA El efecto de la aireacioacuten fue evaluado incrementando
la velocidad de agitacioacuten entre 250 y 800 rpm y la tasa de aireacioacuten entre los
05 y los 20 Lmin a un pH de 65 observaacutendose un incremento en las tasas de
crecimiento y los rendimientos de γ-PGA conforme el suministro de oxiacutegeno
incrementaba
A pesar de la intensa investigacioacuten que se ha llevado a cabo en lo
referente a la produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a el
mecanismo y las viacuteas biosinteacuteticas especiacuteficas por las cuales el poliacutemero es
producido auacuten no han logrado ser dilucidadas con total claridad a pesar de que
no se cuestione le hecho de que efectivamente acontece a traveacutes del ciclo de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 30
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De las tres fuentes de carbono presentes en el medio
de cultivo E el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido L-glutaacutemico constituyen dos sustratos
precursores para la produccioacuten de dicho poliacutemero sin embargo en lo referente
al glicerol auacuten no queda claro como este incrementa la formacioacuten de poliacutemero
maacutes allaacute del hecho de que Troy (1973) encontroacute que el complejo enzimaacutetico
PGA-sintetasa responsable de la polimerizacioacuten del aacutecido L-glutaacutemico a γ-
PGA es estimulada por la presencia de glicerol Considerando que la viacutea de
biosiacutentesis del γ-PGA efectivamente involucra el ciclo de los aacutecidos
tricarboxiacutelicos cualquier fuente de carbono no relacionada directamente como
el glicerol o la glucosa podriacutean en principio ser una fuente primaria de carbono
para el crecimiento celular y la produccioacuten de γ-PGA Efectivamente el empleo
de glucosa como principal fuente de carbono y cantidades traza de aacutecido ciacutetrico
y aacutecido L-glutaacutemico (05 gL) permitieron alcanzar un rendimiento en γ-PGA de
12 gL en cultivos de Bacillus licheniformisATCC9945a (Ko amp Gross 1998) Sin
embargo y a pesar de este hecho Du y colaboradores (1995) encontraron otra
posible explicacioacuten al incremento del rendimiento en presencia de glicerol Ellos
encontraron que en Bacillus licheniformis ATCC9945a las altas
concentraciones de glicerol en el medio de cultivo conllevan a un cambio en la
composicioacuten de los fosfoliacutepidos de la membrana celular incrementando la
proporcioacuten de los fosfoliacutepidos C120 y C101 y reduciendo la de fosfoliacutepidos
C181 y C161 lo que parece favorecer la formacioacuten de una membrana celular
menos compacta lo que conlleva a una efectiva excrecioacuten del γ-PGA fuera de
la membrana celular
En lo referente a produccioacuten a gran escala y en buacutesqueda de la
aplicacioacuten comercial del γ-PGA en grandes cantidades resulta maacutes que
evidente la necesidad de incrementar la productividad Yoon y colaboradores
(2000) desarrollaron una estrategia para la produccioacuten de γ-PGA con un alto
rendimiento mediante cultivo en lote alimentado de Bacillus licheniformis
ATCC9945a Mediante el empleo de un bioreactor de 25 L conteniendo 1 L de
medio de cultivo y bajo condiciones de pH y temperatura de 65 y 37ordmC
respectivamente un 40 de saturacioacuten de oxiacutegeno y una velocidad de
agitacioacuten de 1000 rpm lograron alcanzar una concentracioacuten maacutexima de γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 31
de 35 gL suministrando aacutecido ciacutetrico y aacutecido L-glutaacutemico a una velocidad de
alimentacioacuten de 02 mLmin (144 gh de aacutecido ciacutetrico y 24 gh de aacutecido
glutaacutemico) por un periacuteodo de 3 h despueacutes del agotamiento del aacutecido ciacutetrico
inicial lo cual aconteciacutea alrededor de las 22 h La productividad alcanzada fue
de 1 gmiddotl-1middoth-1
425 Purificacioacuten del γshyPGA
Dado que la produccioacuten del γ-PGA es mayoritariamente extracelular en
concreto en la cepa de intereacutes para el presente estudio la de Bacillus
licheniformis ATCC9945a la purificacioacuten del poliacutemero es directa y consta de
manera general de tres pasos I) la remocioacuten de las ceacutelulas mediante
centrifugacioacuten o filtracioacuten 2) la precipitacioacuten del producto del medio libre de
ceacutelulas mediante metanol etanol o 1-propanol y 3) la diaacutelisis para la remocioacuten
de impurezas de pequentildeo peso molecular
Du y colaboradores (2001) desarrollaron una estrategia eficiente para la
separacioacuten y recuperacioacuten delγ-PGA de caldos altamente viscosos Esta
consiste en dos procesos I) Separar el γ-PGA del caldo de cultivo viscoso y II)
Concentrar la solucioacuten de PGA por ultrafiltracioacuten con el propoacutesito de reducir la
cantidad de alcohol requerida en el proceso de separacioacuten Las ceacutelulas
encapsuladas con γ-PGA poseen carga negativa cerca del valor neutro de pH
esto debido a la ionizacioacuten del grupo carboxilo en las moleacuteculas de γ-PGA Esta
carga negativa en sus superficies les confiere a las ceacutelulas una alta estabilidad
en el medio de cultivo lo que dificulta la sedimentacioacuten de las ceacutelulas durante el
proceso de separacioacuten Esta alta estabilidad asiacute como la elevada viscosidad del
caldo de cultivo son los dos principales problemas que se enfrentan cuando se
trata de separar las ceacutelulas y el γ-PGA del medio de cultivo por lo cual la
reduccioacuten de ambas es vital para una eficiente recuperacioacuten del γ-PGA
Mediante la disminucioacuten del pH es posible reducir el nuacutemero de cargas
negativas sobre la superficie de las ceacutelulas lo que favorece su faacutecil agregacioacuten
y precipitacioacuten Esto permite reducir en hasta un 17 la energiacutea requerida para
una adecuada centrifugacioacuten del caldo de cultivo a un pH de 5 En lo referente
a los requerimientos de alcohol es conocido que un 75-80 del mismo es
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 32
requerido para la precipitacioacuten del γ-PGA presente en un caldo libre de ceacutelulas
a una concentracioacuten de 1-2 Dado que la cantidad de alcohol requerida
disminuye a medida que la concentracioacuten de γ-PGA aumenta es necesaria y
ventajoso sino la concentracioacuten del γ-PGA presente en el medio de cultivo libre
de ceacutelulas a lo largo del proceso de recuperacioacuten Asiacute es posible reducir en un
25 el alcohol requerido para precipitar una solucioacuten de γ-PGA que fue
concentrada de 20 gL a 60 gL mediante ultrafiltracioacuten a un pH de 5
Asiacute mismo y dada la naturaleza anioacutenica del γ-PGA es posible que el
empleo de la cromatografiacutea de intercambio ioacutenica constituya una herramienta
importante para la purificacioacuten de este poliacutemero
426 Control del peso molecular y degradacioacuten del γshyPGA
El peso molecular es una caracteriacutestica importante del γ-PGA microbiano
debido al efecto que tiene el tamantildeo molecular en las propiedades del
poliacutemero El γ-PGA producido por bacterias del geacutenero Bacillus por lo general
presenta un relativamente alto peso molecular Un poliacutemero de alto peso
molecular es uacutetil como agente espesante pero no es uacutetil para otros usos
debido a la alta viscosidad que lo vuelve difiacutecil de modificar quiacutemicamente
mediante la adicioacuten de alguacuten reactivo quiacutemico De acuerdo con el uso que se
pretenda dar es necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso
molecular por ejemplo en lo referente al empleo del γ-PGA en sistemas de
liberacioacuten de faacutermacos o en el disentildeo de faacutermacos polimeacutericos resulta
necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso para controlar el nivel de
liberacioacuten en los distintos tejidos (Shih et al 2001) Es evidente entonces que el
control del peso molecular del γ-PGA no es solamente un asunto de
importancia fundamental o teoacuterica sino de importancia praacutectica para el
desarrollo de aplicaciones comerciales para este poliacutemero Entre los meacutetodos
que se han empleado para la obtencioacuten de γ-PGA con diferentes pesos
moleculares encontramos la hidroacutelisis alcalina la degradacioacuten ultrasoacutenica la
degradacioacuten microbiana o enzimaacutetica y la alteracioacuten de la composicioacuten del
medio de cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 33
En otro estudio Birrer y colaboradores (1994) encontraron que la
variacioacuten de la fuerza ioacutenica del medio de cultivo mediante la adicioacuten de un 4
(pv) de NaCl conllevaba a la formacioacuten de un γ-PGA de un peso molecular
relativamente mayor
A la fecha existen pocos estudios sobre la biodegradacioacuten microbiana o
enzimaacutetica del γ-PGA a moleacuteculas de menor peso molecular sin embargo es
importante sentildealar que en la mayoriacutea de estudios sobre siacutentesis de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a se sugiera la posible existencia de una
enzima ldquodespolimerasardquo responsable de la descomposicioacuten del γ-PGA Lo que
inicialmente se observaba como una reduccioacuten en la viscosidad del medio de
cultivo con el tiempo o bajo ciertas condiciones demostroacute ser una enzima
poliglutamil-γ -hidrolasa responsable de la ruptura hidroliacutetica del γ-PGA en esta
cepa de Bacillus (King et al 2000) Curiosamente la enzima mostroacute ser
activada por la presencia de iones Zn2+ y Ca2+ y tener una alta afinidad por el γ-
PGA
427 Aplicaciones del γshyPGA
Dada la naturaleza del γ-PGA al ser un poliacutemero no toacutexico
biodegradable y cuya produccioacuten puede ser no tan costosa se han sugerido
gran cantidad de aplicaciones durante la uacuteltima deacutecada El γ-PGA de alto peso
molecular es decir mayor a 106 Da es el preferible en gran parte de las
aplicaciones aunque si bien existen otra serie de aplicaciones que se
presentaran a continuacioacuten y que podriacutean demandar diferentes caracteriacutesticas
Es importante destacar eso siacute que salvo las aplicaciones meacutedicas el resto
considera como indiferente la proporcioacuten de aacutecido D-glutaacutemico y de aacutecido L-
glutaacutemico presente en el γ-PGA
Alimentos
Existe una amplia gama de aplicaciones para el γ-PGA en la industria de
alimentos y sus derivados En jugos y otras bebidas el γ-PGA colabora en el
mejoramiento del sabor y su potabilidad Otra aplicacioacuten importante existe en
alimentos soacutelidos a base de harina de trigo como por ejemplo pan pasteles o
pasta donde la adicioacuten de γ-PGA ha demostrado retrasar el envejecimiento y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 34
mejorar la textura asiacute como permitir una mayor conservacioacuten de la forma Para
estas aplicaciones el γ-PGA recomendable es el de alto peso molecular
Asiacute mismo el γ-PGA ha demostrado poseer propiedades
anticongelantes propiedad que se ve incrementada conforme el tamantildeo del
poliacutemero se reduce Esto permitiriacutea emplear el γ-PGA en la conservacioacuten de
alimentos microorganismos y enzimas Debido a que las sales de este
poliacutemero tienen poco sabor por siacute mismas pueden ser empleadas en mayores
concentraciones en comparacioacuten con otros agentes anticongelantes tales como
la glucosa Aunque esta aplicacioacuten es dependiente del tipo de sal del poliacutemero
empleada es independiente de la proporcioacuten de aacutecido L- y D-glutaacutemico
presente en el poliacutemero Asiacute mismo la adicioacuten de γ-PGA en productos
alimenticios que contengan sustancias activas bioloacutegicamente como por
ejemplo carotenoides vitaminas o polifenoles incrementa la absorcioacuten de
dichas sustancias en el intestino delgado
Fertilizante
Es posible producir grandes cantidades de biomasa y γ-PGA a partir de
medios liacutequidos con estieacutercol glicerol aacutecido ciacutetrico y otras sales inorgaacutenicas
resultando un producto que funciona como un fertilizante de liberacioacuten lenta
cuando es aplicado en los campos de cultivo Dado que el γ-PGA es
particularmente inerte a la gran mayoriacutea de las proteasas la liberacioacuten de
nitroacutegeno puede verse reducida auacuten maacutes Inclusive es posible producir dicho
fertilizante mediante fermentacioacuten en fase soacutelida lo que podriacutea resultar auacuten
maacutes ventajoso en ciertos casos pues permite utilizar como co-sustrato de
fermentacioacuten productos agriacutecolas tales salvado de trigo soya o maiacutez Es
importante sentildealar que para dicha aplicacioacuten la proporcioacuten de aacutecido L- y D-
glutaacutemico presente en el poliacutemero es indiferente
Tratamiento de aguas residuales
Debido a la actividad de floculacioacuten que este poliacutemero presenta el
empleo del γ-PGA en el tratamiento de aguas residuales ha sido investigado en
muacuteltiples estudios demostrando una gran capacidad de absorcioacuten y afinidad
por el Cu2+ Adicionalmente se ha demostrado el requerimiento de iones
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 35
multivalentes tales como el Ca2+ Fe3+ y Al3+ para mejorar su actividad
floculante bajo ciertas condiciones
Asiacute mismo tambieacuten se ha empleado el γ-PGA entrecruzado mediante
radiacioacuten γ el cual ha demostrado ser eficiente en la clarificacioacuten de agua
tuacuterbida a concentraciones tan bajas como 1 mgkg
Bioplaacutesticos
La posibilidad de emplear eacutesteres de γ-PGA como plaacutestico
biodegradable tambieacuten constituye otra aplicacioacuten interesante de este poliacutemero
a pesar de que por el momento su costo es todaviacutea muy elevado como para
asegurar el eacutexito comercial Mediante la modificacioacuten de los grupos eacutester es
posible disentildear un plaacutestico que cumpla los requisitos de muacuteltiples propoacutesitos
asiacute mismo los eacutesteres de γ-PGA han demostrado ser maacutes estables a altas
temperaturas que sus respectivas sales de sodio
Hidrogeles
La formacioacuten de hidrogeles por parte de γ-PGA con o sin la adicioacuten de
poliacutemeros adicionales da origen a una amplia gama de novedosas
aplicaciones ya que las propiedades fiacutesicas del gel pueden ser controladas
para cumplir una amplia variedad de necesidades
Mediante irradiacioacuten γ de 19 kGy es posible generar un hidrogel a base
de γ-PGA con un contenido especiacutefico de agua de 3500 Esto constituye un
meacutetodo conveniente y sencillo para gelificar el γ-PGA sin necesidad de
poliacutemeros o entrecruzadores
Los hidrogeles pueden ser empleados en muacuteltiples aplicaciones como en
la liberacioacuten controlada de faacutermacos el disentildeo de biosensores operaciones de
diagnoacutestico e inclusive hasta bioseparadores pueden ser obtenidos a partir de
γ-PGA y PEG-metacrilato Los hidrogeles obtenidos de esta forma poseen la
cineacutetica de liberacioacuten deseada para partiacuteculas de distinto tamantildeo tales como
pequentildeos peacuteptidos proteiacutenas o inclusive ceacutelulas completas (Bajaj amp Singhal
2011)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 36
Una manera sencilla de obtener hidrogeles de γ-PGA es a traveacutes de la
adicioacuten de peroacutexido como entrecruzador al caldo de fermentacioacuten crudo dicho
hidrogel puede emplearse como absorbente de agua en muacuteltiples aplicaciones
que incluyen agricultura horticultura y construccioacuten civil
De igual manera tambieacuten se ha demostrado que los hidrogeles pueden
ser empelados para la liberacioacuten lenta y controlada de faacutermacos en particular
aquellos formados por α-L-PGA y PEG-metacrilato Hidrogeles formados por un
72 deγ-PGA sulfonado y el resto en γ-PGA han demostrado resultados
promisorios en la liberacioacuten controlada de faacutermacos con una liberacioacuten
praacutecticamente nula a un pH de 74 sin embargo a un pH menor a 65 como el
observado en los tejidos inflamados la liberacioacuten del faacutermaco incrementaba
considerablemente
Transportador de faacutermacos
Dado a su biodegradabilidad y biocompatibilidad el γ-PGA constituye un
biopoliacutemero de particular intereacutes en el desarrollo de faacutermacos de liberacioacuten
controlada tal y como se ha sentildealado previamente Dada la presencia de
grupos carboxilo en las cadenas laterales del poliacutemero que pueden
interaccionar con los grupos funcionales presentes en otros agentes
quimioterapeacuteuticos el γ-PGA permite obtener faacutermacos maacutes solubles y faacuteciles
de administrar Inclusive el conjugado faacutermaco-γ-PGA puede ingresar a las
ceacutelulas diana e irse degradando lentamente mientras libera el agente
farmacoloacutegico y a la vez el aacutecido glutaacutemico producido durante su degradacioacuten
puede ingresar directamente al metabolismo celular o ser excretado a traveacutes
del rintildeoacuten (Bajaj amp Singhal 2011)
Uno de los conjugados maacutes prometedores y estudiados hasta el
momento ha sido con el agente anticanceriacutegeno Paclitaxel Dichos conjugados
Paclitaxel-γ-PGA han demostrado presentar un perfil farmacocineacutetico distinto
capaz de proveer una alternativa hidrosoluble a las formulaciones habituales de
este faacutermaco Tambieacuten estos conjugados han mostrado una respuesta
antitumoral marcadamente superior en comparacioacuten con el Paclitaxel soacutelo
tanto en tejidos murinos como humanos Asiacute mismo estos conjugados han
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 37
mostrado reducir la TCD50 (dosis letal media contra ceacutelulas canceriacutegenas) de
una sola irradiacioacuten de 539 Gy a 75 Gy sin afectar la respuesta radioloacutegica de
los tejidos normales sanos
Adhesivos bioloacutegicos
Los adhesivos bioloacutegicos son empleados para la adhesioacuten de tejidos
homeostasis y para el sellado de fugas de liacutequidos o aire en los tejidos durante
una cirugiacutea En la actualidad el adhesivo de mayor uso es la fibrina la cual
presenta un pobre adhesioacuten a los tejidos Un poliacutemero formado por el
entrecruzamiento del γ-PGA y gelatina ha demostrado un gran potencial para
ser empleado como adhesivo quiruacutergico y agente homeostaacutetico conservando la
capacidad de ser degradado lentamente por el cuerpo sin causar respuestas
inflamatorias severas y a la vez solidificando tan raacutepido como la fibrina pero con
una mayor adherencia a los tejidos Similares hallazgos se han obtenido con
poliacutemeros formados del entrecruzamiento de γ-PGA y colaacutegeno porcino (Bajaj
amp Singhal 2011)
Cosmeacuteticos
El γ-PGA puede ser empleado como componente de valor agregado en
la elaboracioacuten de cosmeacuteticos y productos para el cuidado personal tales como
humectantes exfoliantes y antiarrugas Dada sus propiedades quiacutemicas el γ-
PGA es homogeacuteneamente miscible asiacute como quiacutemicamente estable en la gran
mayoriacutea de los ingredientes tiacutepicamente empleados para la elaboracioacuten de
cremas faciales Asiacute mismo ciertas calidades de γ-PGA son capaces de
producir peliacuteculas suaves elaacutesticas humectantes y suaves sobre la piel Dado
que se trata de un humectante natural hidrofiacutelico formidable el γ-PGA ha
demostrado en combinacioacuten con extractos de Aloe vera promover la produccioacuten
natural de factores humectantes tales como aacutecido pirrolidona-carboxiacutelico aacutecido
laacutectico y aacutecido urocaacutenico A nivel microscoacutepico esto se explica por el hecho de
que los hidrogeles de γ-PGA son capaces de absorber hasta 5000 veces su
propio peso en humedad lo que permitiriacutea incrementar de gran manera las
propiedades humectantes de muchos productos cosmetoloacutegicos con la adicioacuten
de γ-PGA algunos electrolitos y el ajuste a un pH adecuado
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 38
Adyuvante en vacunas
El γ-PGA ha demostrado que es capaz de generar una mejor respuesta
inmune contra otros antiacutegenos presentes en una vacuna El γ-PGA de alto peso
molecular ha demostrado estimular la respuesta inmune contra antiacutegenos
virales en conejos y ratones
43 Disentildeo de procesos biotecnoloacutegicos y la transferencia de materia gasshyliquido
Cuando un microorganismo ha sido identificado como productor de un
compuesto de intereacutes existen una serie de consideraciones que deben ser
valoradas previamente antes de que un proceso productivo econoacutemicamente
viable pueda ser llevado a la praacutectica a escala industrial En aquellas
organizaciones e industrias con una soacutelida experiencia en el disentildeo y
escalamiento de procesos fermentativos los nuevos procesos son
incorporados de manera relativamente raacutepida
El desarrollo de un nuevo proceso fermentativo puede ser a groso modo
dividido en cuatro fases
La primera consiste en identificar el producto su potencial valor de
mercado su precio de venta asiacute como la vida uacutetil del mismo
La siguiente fase es seleccionar o disentildear la cepa que seraacute utilizada en
el proceso productivo y por consiguiente disentildear el proceso como tal Esto
involucra una adecuada seleccioacuten del medio de cultivo oacuteptimo y de las
condiciones idoacuteneas de proceso En este sentido la produccioacuten de γ-PGA a
partir de Bacillus licheniformis ATCC9945a ha sido fuertemente investigada en
torno a las condiciones ideales para su produccioacuten sin embargo algunos
reportes y resultados resultan ser incompletos contradictorios o discutibles Sin
embargo lo que si resulta comuacuten en todas las investigaciones en particular en
aquellas donde se han empleado voluacutemenes mayores de produccioacuten como por
ejemplo de 05 a 10 L es que la produccioacuten del γ-PGA se detiene al reducirse
la concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo problema que ha sido
abordado incrementando el caudal de oxiacutegeno yo incrementando la velocidad
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 39
de agitacioacuten sin que se reporten resultados consistentes o claros La
acumulacioacuten del γ-PGA a lo largo de la fermentacioacuten parece reducir
draacutesticamente la tasa de transferencia de oxiacutegeno lo que termina generando
condiciones anaeroacutebicas en tiempos tan cortos como 20 horas con
concentraciones de oxiacutegeno inferiores a 1 mgL
431 La transferencia de materia gasshyliacutequido
Un requisito primordial para la ocurrencia de una reaccioacuten quiacutemica
cualquiera es que los reactantes esteacuten presentes en el sitio de reaccioacuten En los
sistemas multifase los procesos de transporte son generalmente maacutes lentos
que las tasas maacuteximas de reaccioacuten intriacutenseca Este fenoacutemeno da como
resultado que las tasas de reaccioacuten reales sean menores que las que se
podriacutean esperar por efecto de la cineacutetica de reaccioacuten uacutenicamente
Los fundamentos fiacutesicos principales que determinan la transferencia de
materia son los mismos que aplican para la transferencia de calor y de
momento es decir conveccioacuten y difusioacuten
En los sistemas bioloacutegicos multifase como las fermentaciones en medio
sumergido la transferencia de masa ocurre entre dos fases una gaseosa y
otra liacutequida La mayor parte de los procesos fermentativos a gran escala con
excepcioacuten tal vez uacutenicamente de la produccioacuten de etanol y aacutecido laacutectico son
aeroacutebicos y tiacutepicamente son llevados a cabo en biorreactores aireados gas-
liacutequido En estos procesos aeroacutebicos como sucede con la produccioacuten de γ-
PGA por parte de Bacillus licheniformis ATCC9945a la transferencia de
oxiacutegeno desde la fase gaseosa a la fase liacutequida resulta vital para el eacutexito de
dicho bioproceso
En los bioprocesos aeroacutebicos el oxiacutegeno es un sustrato clave y debido
a su baja solubilidad en caldos y medios de cultivo resulta necesario su
continuo suministro La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deber ser
conocida e inclusive predicha con el propoacutesito de llevar a cabo un adecuado
disentildeo operacional del proceso y un correcto escalado de los biorreactores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 40
432 La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR)
El transporte de oxiacutegeno gas-liacutequido en los bioprocesos aeroacutebicos es el
principal proceso gas-liacutequido a considerar a la hora de disentildear un bioproceso
La solubilidad del oxiacutegeno en un medio liacutequido es baja la concentracioacuten de
saturacioacuten de oxiacutegeno es de cerca de 7-8 mgL en un proceso tiacutepico en
aireacioacuten por lo cual una transferencia de oxiacutegeno continua de la fase gaseosa
a la liacutequida es esencial para conservar un metabolismo celular completamente
oxidativo Por ejemplo unos pocos minutos sin aireacioacuten pueden impactar
severamente en la habilidad de Penicillium chrysogenum para producir
penicilina mientras que en organismos aeroacutebicos facultativos esto puede
generar cambios draacutesticos en el rendimiento y el tipo de producto generado en
condiciones de carencia de oxiacutegeno
La transferencia de oxiacutegeno desde una fase gaseosa hasta el interior de
una ceacutelula ocurre siguiendo una serie de pasos secuenciales que son
1) Difusioacuten del O2 desde la fase gaseoso a la interfase gas-liacutequido
2) Transporte a traveacutes de la interfase gas-liacutequido
3) Difusioacuten del O2 a traveacutes de una regioacuten relativamente inactiva del liacutequido
adyacente a la burbuja es decir de la interfase gas-liacutequido a la de
mezclado del liacutequido
4) Transporte del oxiacutegeno disuelto a la ceacutelula los conglomerados celulares
o al pellet de ceacutelulas inmovilizadas
5) Difusioacuten a traveacutes de la peliacutecula inactiva hasta la superficie de la ceacutelula
dentro de los conglomerados celulares o al interior del pellet de ceacutelulas
inmovilizadas
6) Transporte a traveacutes de la membrana celular
7) Transporte del O2 en el interior celular hacia el sitio de demanda
433 Descripcioacuten de la transferencia maacutesica con kLa
La tasa volumeacutetrica de transferencia de materia de un compuesto A (qtA)
en este caso oxiacutegeno (O2) puede ser descrita cuantitativamente como el
producto de un coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (kLa) y una
fuerza impulsora que consiste en la diferencia entre la concentracioacuten de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 41
saturacioacuten del compuesto (cA) y la concentracioacuten actual del compuesto en la
fase liacutequida (cA)
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (unidad s-1) el kLa
es normalmente referido como un coeficiente uacutenico pero en realidad consiste
de dos partes el coeficiente de transferencia de materia propiamente dicho (kL)
que estaacute vinculado con el flujo maacutesico (tasa de transferencia por unidad de
aacuterea) y el aacuterea de la superficie especiacutefica (a) que es el aacuterea de transferencia
por unidad de volumen
La tasa de transferencia de oxiacutegeno (referida como velocidad de
transferencia de oxiacutegeno en algunos casos) el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de materia (kLa) y la concentracioacuten de oxiacutegeno estaacuten
relacionados por la ecuacioacuten
NAa = OTR = kLa(cA- cA) (gm3s)
Noacutetese en la ecuacioacuten que para que la transferencia sea mayor interesa
tener una kLa alta pero ademaacutes (cA-cA) debe tener un valor elevado lo que
podriacutea llevar a plantear que cA sea lo menor posible Sin embargo se requiere
de una concentracioacuten miacutenima de oxiacutegeno para mantener una fermentacioacuten
aerobia Con respecto a dicha ecuacioacuten es importante sentildealar que
1) La concentracioacuten en fase liacutequida cA corresponde a la cantidad de
oxiacutegeno que hay en la fase acuosa y se determina mediante un
electrodo de oxiacutegeno disuelto Si al sistema se introduce aire a presioacuten
atmosfeacuterica dicho valor estaraacute entre los 0-10 mgL
2) La concentracioacuten de saturacioacuten cA corresponde a la solubilidad de
oxiacutegeno y es dependiente de la concentracioacuten de oxiacutegeno en la fase
gaseosa es decir de la presioacuten parcial de oxiacutegeno Una vez conocida la
presioacuten parcial de oxiacutegeno es posible calcular el valor de la solubilidad
mediante la ley de Henry En agua una forma de esta ecuacioacuten seriacutea
pAGcA = He
Donde He es la constante de Henry y cuyo valor (aproximadamente
entre 15-30 atm m3kg) es funcioacuten de la temperatura A partir de esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 42
ecuacioacuten es posible despejar el valor de cA = pAGHe El valor de He
cambia con la temperatura por ejemplo en agua pura a 25 ordmC para el
oxiacutegeno es de 2396 x 106 Pamiddotm3middotkg-1 El valor de cA es modificable si
se manipula
a) Presioacuten podemos aumentar la concentracioacuten de saturacioacuten si
aumentamos la presioacuten parcial de oxiacutegeno por ejemplo si
pasamos de 021 atm a 1 atm introduciendo al reactor oxiacutegeno
puro en vez de aire a presioacuten atmosfeacuterica lo que da por
resultado un aumento en alrededor de cinco veces su valor
Es posible tambieacuten alcanzar un mayor aumento de la
concentracioacuten de saturacioacuten si aumentamos la presioacuten
absoluta no obstante si hacemos fermentaciones con
oxiacutegeno a presioacuten resulta necesario disponer de un
fermentador capaz de resistir tales condiciones de presioacuten
resulta evidentemente maacutes costoso y tambieacuten pueden ocurrir
cambios importantes en el metabolismo de los
microorganismos que puedan afectar su crecimiento o su
rendimiento en producto
b) Temperatura la solubilidad del oxiacutegeno en agua disminuye al
aumentar la temperatura
c) Composicioacuten del liacutequido si en lugar de agua pura se tiene una
disolucioacuten como sucede con la mayoriacutea de los medios que
tiene una composicioacuten salina importante la solubilidad debe
corregirse pues dichos componentes afectan su valor y dicho
efecto estaacute influenciado tanto por los iones presentes como
por los componentes orgaacutenicos
44 Fermentaciones a presioacuten
La gran mayoriacutea de los estudios sobre fermentaciones son generalmente
llevados a cabo bajo condiciones de presioacuten ambiental maacutes allaacute del hecho de
que el fermentador por lo general suele encontrarse positivamente presurizado
Son pocos los ejemplos a excepcioacuten de la cerveza y algunos vinos donde las
fermentaciones son llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten positiva en el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 43
fermentador Esta leve presurizacioacuten suele deberse al proceso de aireacioacuten del
biorreactor debido a la formacioacuten de una presioacuten de vuelta debido a las
restricciones del respiradero de escape del fermentador
La presioacuten positiva en muchos casos puede resultar beneficiosa para los
procesos de fermentacioacuten no soacutelo por el hecho de incrementar la solubilidad del
oxiacutegeno en el caldo de cultivo sino tambieacuten porque reduce las oportunidades
de contaminacioacuten externa durante el proceso de fermentacioacuten Igualmente la
presioacuten puede tener efectos nocivos sobre los procesos fermentativos La
presioacuten tiene el efecto de influenciar las velocidades y la direccioacuten del
metabolismo de los microorganismos Esto es particularmente evidente en el
caso de productos o subproductos volaacutetiles que forman parte de distintas rutas
metaboacutelicas La presioacuten en el fermentador puede evitar la produccioacuten o
expulsioacuten de un producto gaseoso al medio circundante Este fenoacutemeno puede
tener el efecto de interferir con el equilibrio de varias reacciones bioquiacutemicas y
puede resultar en toxicidad al interior de la ceacutelula o en la divergencia de rutas
metaboacutelicas Lo significante de este impacto dependeraacute de la duracioacuten del
proceso asiacute como de la magnitud de la presioacuten a la cual se realice la
fermentacioacuten
De igual manera el efecto de la presioacuten sobre las macromoleacuteculas
guarda una gran semejanza con los efectos de la temperatura lo cual se
desprende del parecido de la forma de los diagramas de estabilidad de las
proteiacutenas y viabilidad de los microorganismos entre ambas variables
temperatura y presioacuten observacioacuten que tambieacuten permite concluir que las
proteiacutenas constituyen los primeros elementos estructurales en ser afectados
de manera negativa por el incremento de la presioacuten La presioacuten parece afectar
en mayor medida las interacciones proteiacutena-proteiacutena en comparacioacuten con la
estabilidad proteica por siacute misma por lo que es vaacutelido concluir que son estas
interacciones las primeras en verse afectadas por dicha variable La
conservacioacuten de la viabilidad en los microorganismos al ser sometidos a
presioacuten dependeraacute en gran medida de su capacidad para conservar una
membrana celular funcional aunque los mecanismos que emplean para tal fin
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 44
auacuten son desconocidos dada la vital importancia de las interacciones proteiacutena-
proteiacutena en las funciones de membrana
Lo maacutes importante es conocer con detalle como efectivamente la presioacuten
ejercida afecta el proceso de fermentacioacuten en particular la bioquiacutemica y la
fisiologiacutea del mismo de igual manera si es posible controlar la direccioacuten de la
fermentacioacuten manipulando la presioacuten o si la presioacuten estaacute generando el
desarrollo de reacciones secundarias indeseadas las respuestas a dichas
interrogantes soacutelo pueden ser dilucidadas mediante la experimentacioacuten praacutectica
del proceso fermentativo en estudio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 45
7 MATERIALES Y METODOLOGIacuteA
51 Informacioacuten de la cepa empleada
Se empleoacute la cepa Bacillus licheniformis ATCC9945a la cual se
encontraba conservada en estado vegetativo y bajo refrigeracioacuten en el
Laboratorio de Biopoliacutemeros del ETSEIB UPC Cataluntildea Con el propoacutesito de
seleccionar colonias altamente mucosas capaces de producir γ-PGA se
procedioacute a rallar la biomasa conservada en placas con Agar LB (pH 75) e
incubarlas por 24 horas a 37 ordmC Las colonias que mostraron una morfologiacutea
mucosa indicadora de la produccioacuten de γ-PGA fueron utilizadas para elaborar
los inoacuteculos empleados en las distintas fermentaciones
52 Medio de cultivo empleado
El medio de cultivo empleado para la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a fue el medio de cultivo E (Leonard et al 1958) con
algunas modificaciones seguacuten recomendado por Birrer y colaboradores (1994)
El detalle de la formulacioacuten se presenta en la tabla 5
Tabla 5 Formulacioacuten del medio de cultivo E empleado en el cultivo SmF de Bacillus
licheniformis ATCC9945a
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO43H2O 043 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 015 CaCl2 011 Glicerol 80 pH 75 Esterilizacioacuten por filtracioacuten (045 μm) Volumen 1 L
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 46
El medio de cultivo fue esterilizado por filtracioacuten (045 μm) y conservado
en refrigeracioacuten a 7 ordmC
53 Preparacioacuten de los inoacuteculos madre
Las colonias seleccionadas fueron inoculadas en matraces de 125 mL
con 25 mL de medio de cultivo E y cultivadas a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica
con varilla imantada a 650 rpm por 12 horas El caldo resultante fue
centrifugado a 8000 rpm por 25 minutos la biomasa recuperada fue
resuspendida en 10 mL de medio de cultivo E y 10 mL de una solucioacuten de
glicerol al 20 Dicha solucioacuten fue distribuida en voluacutemenes de 1 mL en tubos
eppendorf y congeladas a -80 ordmC
Posteriormente uno de estos tubos eppendorf fue empleado para
inocular matraces de 500 mL conteniendo 125 mL de medio de cultivo y fueron
cultivados a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica con varilla imantada a 650 rpm por
14 horas El caldo resultante fue centrifugado nuevamente a 8000 rpm por 25
minutos se recuperoacute la biomasa precipitada y se resuspendioacute en 25 mL de
medio de cultivo E y 25 mL de una solucioacuten de glicerol al 20 Dicha solucioacuten
fue distribuida en voluacutemenes de 2 mL en tubos eppendorf y posteriormente
fueron congelados a -80 ordmC Cada uno de estos eppendorf constituiacutea un inoacuteculo
de origen para una fermentacioacuten individual La absorbancia promedio de estos
inoacuteculos se encontraba cercana a 25
531 Conservacioacuten de la cepa en estado productivo
Los inoacuteculos deben conservarse en todo momento bajo congelacioacuten a
una temperatura inferior a -15 ordmC siendo preferible conservarlos a -80 ordmC La
condicioacuten de produccioacuten de γ-PGA es extremadamente fraacutegil y cambios de
temperatura o descongelamiento pueden conllevar la peacuterdida de dicha
capacidad La reutilizacioacuten de biomasa residual de fermentaciones previas
queda descartada
54 Montaje del biorreactor a presioacuten
En la actualidad los principales fabricantes de biorreactores para la
industria biotecnoloacutegica carecen de equipos de fermentacioacuten a escala
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 47
laboratorio que puedan operar bajo condiciones de presioacuten superiores a los 01
bares relativos Por este motivo se debioacute modificar un reactor quiacutemico a
presioacuten de modo tal que pudiese cumplir los requisitos necesarios para el
cultivo de microorganismos El modelo empleado fue el reactor quiacutemico a
presioacuten modelo 6425-214 de la casa AceGlass (Estados Unidos) de un
volumen total de 2 L Este reactor tiene la capacidad de operar hasta 35 psig
(241 bares relativos) a una temperatura de 100 ordmC y a una agitacioacuten de 300
rpm El mismo seguacuten su disentildeo original se presenta en la figura 6
Figura 6 Reactor quiacutemico a presioacuten modelo 6425-214 de AceGlass Co
Las dimensiones del frasco del reactor de forma ciliacutendrica y fondo
redondeado son las siguientes
Diaacutemetro de boca 95 mm
Diaacutemetro maacuteximo 120 mm
Profundidad 180 mm
Con el propoacutesito de adecuarlo al cultivo de microorganismos el reactor
fue ligeramente modificado en algunos de sus componentes y su distribucioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 48
Entre los principales cambios realizados al sistema se encuentran los
siguientes
1) Incorporacioacuten de una turbina de disco tipo Rushton al tratarse de una
fermentacioacuten aeroacutebica es necesario garantizar una adecuada aireacioacuten
del medio de cultivo mediante agitacioacuten efectiva La paleta de agitacioacuten
original del sistema no cumpliacutea con dicho requisito por lo cual se cambioacute
la misma por una turbina tipo Rushton cuyas dimensiones se muestran
en la figura 7
Dimensiones
A = 75 mm
B = 18 mm
C = 1mm
D = 20 mm
Figura 7 Dimensiones de la turbina tipo Rushton empleada
Esta turbina se encuentra en posicioacuten central a 3 cm del fondo del
reactor y a 6 mm de los deflectores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 49
2) Incorporacioacuten de deflectores se incorporaron dos laacuteminas deflectoras de
disentildeo propio de1 mm de ancho en una posicioacuten de 90 grados con
respecto a la superficie del reactor con el propoacutesito de reducir la
formacioacuten de voacutertice promover una agitacioacuten turbulenta y una mayor
formacioacuten de burbujas La geometriacutea de las laacuteminas deflectoras se
detalla en la Figura 8
Dimensiones
Ancho de laacutemina = 10 mm
Diaacutemetro = 95 mm
Longitud de laacutemina = 200 mm
Figura 8 Geometriacutea de las laacuteminas deflectoras
3) Cambio del motor de agitacioacuten se incorporoacute un motor IKA RW20 con
capacidad de hasta 2000 rpm en sustitucioacuten del motor original con que
A
B
C
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 50
disponiacutea el equipo (el sistema original trae un motor limitado a una
velocidad de agitacioacuten maacutexima de 330 rpm) con el propoacutesito de variar la
agitacioacuten del sistema y observar su efecto sobre el crecimiento y la
produccioacuten de poliacutemero
4) Reubicacioacuten de la vaacutelvula de seguridad de sobrepresioacuten con el
propoacutesito de garantizar una mayor seguridad del equipo maximizar la
vida uacutetil del cilindro de aire comprimido y evitar la sobrepresioacuten que
pueden generar el crecimiento del microorganismo (su metabolismo
puede liberar compuestos gaseosos o volaacutetiles) se trasladoacute la vaacutelvula de
seguridad del equipo de la tuberiacutea de llenado a la tapa del reactor
5) Eliminacioacuten de componentes dado que no resultaban uacutetiles para la
presente investigacioacuten se prescindioacute de instalar en la tapa del equipo el
condensado y el embudo de adicioacuten El disco de ruptura de la tuberiacutea de
llenado fue sustituido por una vaacutelvula de apertura manual con el
propoacutesito de permitir un mejor y maacutes raacutepido ajuste de la presioacuten durante
el establecimiento inicial de las condiciones de fermentacioacuten
55 Condiciones de fermentacioacuten
El detalle de las condiciones de temperatura presioacuten pH y agitacioacuten en
las cuales fueron establecidas las distintas fermentaciones asiacute como la
metodologiacutea de escalamiento empleada se presentan a continuacioacuten
551 Escalamiento
Inicialmente se procediacutea a inocular por duplicado 100 mL de medio de
cultivo con uno de los inoacuteculos madre (2 mL de ceacutelulas de Bacillus licheniformis
ATCC9945a conservados en tubos eppendorf a -20 ordmC) en matraces con
deflectores de 500 mL de capacidad A dichos matraces se les incorporaba una
pastilla de agitacioacuten magneacutetica de 25 cm de longitud y 07 cm de diaacutemetro y
eran colocados en agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm (agitador IKA C-MAG HS7)
por 8 horas a una temperatura aproximada de 30 ordmC
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 51
Posteriormente uno de los matraces (100 mL de cultivo) anteriormente
establecidos era utilizado para inocular 500 mL de medio de cultivo en el
biorreactor a presioacuten manteniendo una temperatura constante de 30 ordmC
aproximadamente Distintas presiones velocidades de agitacioacuten y densidades
oacutepticas del inoacuteculo fueron evaluadas El detalle del disentildeo experimental de
dichas pruebas se presenta a continuacioacuten en la tabla6
Tabla 6 Diferentes condiciones de presioacuten relativa agitacioacuten y absorbancia evaluadas en las
fermentaciones en biorreactor
CONDICIOacuteN
VALORES EVALUADOS
SOBREPRESIOacuteN
Agitacioacuten 300 rpm
Absorbancia del inoacuteculo 120
O bar (0 psig)
052 bar (75 psig)
103 bar (15 psig)
172 bar (25 psig)
241 bar (35 psig)
AGITACIOacuteN
Sobrepresioacuten 103 bar (15 psig)
Absorbancia del inoacuteculo 120
300 rpm
400 rpm
500 rpm
650 rpm
El tiempo de fermentacioacuten para cada uno de los ensayos evaluados fue
de 18 horas tiempo en el que el pH habiacutea descendido a un valor cercano pero
auacuten superior a 6 No se realizoacute ajuste alguno del pH a lo largo de la
fermentacioacuten Posteriormente se procediacutea a centrifugar el caldo de
fermentacioacuten a 8000 rpm por 25 minutos el sobrenadante recuperado era
almacenado para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA presente en
el mismo
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre
Con el propoacutesito de garantizar que el inoacuteculo madre era apto para la
produccioacuten de γ-PGA uno de los matraces inicialmente establecidos era
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 52
conservado bajo agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm y a 30 ordmC durante las 18 horas
que requeriacutea la fermentacioacuten en el biorreactor Posteriormente se determinaba
cualitativamente la produccioacuten de γ-PGA seguacuten la simbologiacutea que se presenta
en la tabla 7
Tabla 7 Simbologiacutea empleada para la medicioacuten cualitativa de la produccioacuten de γ-PGA en los
matraces de control
SIacuteMBOLO OBSERVACIOacuteN CUALITATIVA
- No produccioacuten de γ-PGA
+ Produccioacuten de γ-PGA
+++ Elevada produccioacuten de γ-PGA
56 Determinacioacuten del valor de kLa
Para la determinacioacuten del valor aproximado de kLa tanto en los
matraces coacutemo en el biorreactor se empleoacute el meacutetodo estaacutetico sin operacioacuten
del cultivo celular Dicho valor no fue determinado bajo condiciones de presioacuten
pues se careciacutea con la instrumentacioacuten adecuada sino soacutelo a presioacuten
atmosfeacuterica para ambos casos matraz y biorreactor
Este meacutetodo consiste en disminuir la concentracioacuten de oxiacutegeno hasta
una concentracioacuten de 1-25 mgL despueacutes el sistema es retornado a aireacioacuten
yo agitacioacuten y se mide como va aumentando la concentracioacuten de oxiacutegeno en la
fase liacutequida conforme transcurre el tiempo El objetivo es por tanto disminuir la
concentracioacuten de cA0 lo suficiente como para tener un cambio importante
obteniendo asiacute una curva de ascenso de las concentraciones de oxiacutegeno en el
tiempo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 53
561 Matraces de cultivo
A un matraz de cultivo en reposo conteniendo 100 mL de medio de
cultivo E se le agregoacute 001 g de sulfito de sodio (Na2SO3) y una punta de
espaacutetula de cloruro de cobalto (actuacutea como catalizador) y se agita
manualmente por 20 s Posteriormente se introdujo la sonda de oxiacutegeno
disuelto del medidor Hanna Oxi-check y se dejoacute descender el nivel de oxiacutegeno
disuelto hasta el valor miacutenimo posible entre 20-25 mgL Seguidamente se
activoacute la agitacioacuten magneacutetica y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto cada 10
segundos hasta alcanzar un punto maacuteximo que se repitiese al menos durante
2 minutos
562 Biorreactor
Se procedioacute a llenar el reactor con 600 mL de medio de cultivo y en
estado de reposo se le agregoacute 006 g de sulfito de sodio una punta de espaacutetula
de cloruro de cobalto y se agitoacute suavemente a 100 rpm por 20 segundos
Haciendo uso de la sonda de oxiacutegeno se determinoacute el menor nivel posible de
oxiacutegeno disuelto alrededor de 15-20 mgL Posteriormente se encendioacute la
agitacioacuten mecaacutenica a 300 rpm y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto en
intervalos de 10 segundos hasta alcanzar un valor maacuteximo de oxiacutegeno disuelto
sostenido en el tiempo es decir que se repitiese por al menos un minuto
563 Graficacioacuten
Con el propoacutesito de determinar el valor de kla a partir de la ecuacioacuten de
balance de oxiacutegeno
V(dCAdt) = VkLa(cA-cA)
Se tiene que integrando dicha ecuacioacuten con la concentracioacuten inicial cA0
se obtiene
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 54
Representado ln((cA - cA0)(c
A- cA)) contra el tiempo t se obtiene una
recta cuya pendiente es el valor de kLa
57 Determinacioacuten del contenido de γshyPGA en el caldo de fermentacioacuten
Con el propoacutesito de determinar la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo
post-fermentacioacuten se utilizoacute la teacutecnica analiacutetica llamada cromatografiacutea liacutequida
de alta eficiencia conocida normalmente por sus siglas en ingleacutes HPLC
especiacuteficamente la conocida como cromatografiacutea de permeacioacuten en gel (GPC)
uno de los tipos de cromatografiacutea de exclusioacuten molecular (SEC) maacutes
empleados en la separacioacuten de poliacutemeros
El equipo empleado fue el cromatoacutegrafo modelo 1260 Infinity de Agilent
Technologies La columna de separacioacuten empleada fue una columna PL
aquagel-OH de 8μm para cromatografiacutea GPC en fase acuosa El meacutetodo de
cromatografiacutea empleado consistioacute en eludir 25 μL de la muestra haciendo uso
de una solucioacuten tampoacuten fosfato 005 molL con un tiempo de elucioacuten de 15 min
por muestra El caudal de flujo del eluyente fue de 08 mLmin La deteccioacuten se
llevoacute a cabo a traveacutes de un detector de absorbancia UV-vis de longitud de onda
variable (VWD) a una longitud de onda de 220 nm y tambieacuten un detector de
iacutendice de refraccioacuten (RID) con polaridad positiva y una temperatura de la
unidad oacuteptica de 35 ordmC aunque los resultados reportados y empleados fueron
los obtenidos con el detector VWD El tiempo de retencioacuten de la fraccioacuten
polimeacuterica correspondiente al γ-PGA se encontroacute entre los 65 y los 90
minutos considerando el hecho de que el mismo se trata de una mezcla de
moleacuteculas polimeacutericas de distinta longitud y por ende distinto peso molecular
Para poder cuantificar la cantidad de poliacutemero presente en la muestra se
elaboroacute una curva de calibracioacuten inicial Se prepararon soluciones en agua
destilada de γ-PGA a concentraciones de 10 5 2 1 y 05 gL Las mismas
fueron analizadas mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva para el
pico correspondiente al γ-PGA para cada concentracioacuten Dichos valores fueron
empleados para la elaboracioacuten de la curva de calibracioacuten inicial del equipo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 55
Las muestras a analizar fueron preparadas de la siguiente manera 400
μL del caldo crudo se diluyeron en agua destilada hasta un volumen final de 2
mL (dilucioacuten 5x) y posteriormente fueron filtradas mediante jeringa haciendo
uso de filtros de 045 μm en viales de HPLC Las muestras fueron analizadas
mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva del pico correspondiente al
γ-PGA para cada una de las muestras
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
Con el propoacutesito de determinar el efecto del contenido de γ-PGA sobre la
solubilidad maacutexima de oxiacutegeno en el medio de cultivo en condiciones estaacuteticas
es decir sin crecimiento microbiano (consumo de oxiacutegeno de los
microorganismos nulo) se procedioacute a preparar soluciones de 100 mL de
volumen a concentraciones crecientes de poliacutemero (poliacutemero + biomasa) en
medio de cultivo y medir el nivel de oxiacutegeno disuelto en mgL haciendo uso de
un medidor de oxiacutegeno disuelto Hanna Oxi-check Dichas soluciones fueron
evaluadas en las mismas condiciones de fermentacioacuten empleadas en la
primera etapa de escalamiento matraces de 500 mL con deflectores y a una
agitacioacuten magneacutetica de 650 rpm Se evaluaron concentraciones de biopoliacutemero
de 0 7 14 21 36 54 y 71 gL
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano
Para determinar el crecimiento bacteriano se aprovechoacute el efecto que
dicho crecimiento genera sobre la turbidez del caldo a lo largo de la
fermentacioacuten Por ello se empleoacute la teacutecnica de espectrofotometriacutea
determinando la absorbancia del medio de cultivo inoculado y su incremento
con el tiempo Se empleoacute el coloriacutemetro modelo ZUSI 4200A a una longitud de
onda de 660 nm El equipo era inicialmente calibrado en 0 haciendo uso de
agua destilada acto seguido se determinaba el valor de absorbancia de la
muestra a analizar
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 56
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producido se determinoacute
mediante el meacutetodo desarrollado por Marfey (1984) para la determinacioacuten
cuantitativa de la composicioacuten enantiomeacuterica de aminoaacutecidos Dicho meacutetodo se
basa en la reaccioacuten del aacutecido glutaacutemico con el reactivo de Marfey (1-fluoro-24-
dinitrofenil-5-L-alanina) Dicho compuesto es oacutepticamente activo por lo que al
reaccionar con los enantioacutemeros D- y L- del aacutecido glutaacutemico forma dos
diasteroisoacutemeros que pueden separarse mediante cromatografiacutea HPLC con
tiempos de retencioacuten para el isoacutemero L- y el D- de 675 y 100 minutos
aproximadamente Para poder cuantificar la composicioacuten de manera efectiva
se realizoacute un calibrado previo con mezclas de concentracioacuten conocida de cada
isoacutemero
5101 Preparacioacuten de la muestras
Se introdujo 3 mg del γ-PGA a analizar en viales de 5 mL y se les
adicionoacute 2 mL de HCl 6 molL Se dejaron calentar a 100 ordmC en estufa por un
periacuteodo de 24 horas Posteriormente se trasfirioacute 100 μL de cada una de las
muestras a tubos eppendorf y se dejaron en desecador al vaciacuteo por un periacuteodo
de tres diacuteas empleando NaOH como desecante Seguidamente se disolvioacute los
productos en 100 μL de agua y se hicieron reaccionar con 200 μL de una
disolucioacuten con concentracioacuten de 5 mgmL de reactivo de Marfey en acetona con
20 μL de carbonato aacutecido de sodio (NaHCO3) durante una hora en estufa a 37
ordmC Al finalizar se neutralizoacute como 10 μL de HCl 2 molL y se dejoacute secar al vaciacuteo
por 3 diacuteas en el desecador a vaciacuteo con NaOH como desecante Finalmente se
diluyoacute la muestra en 350 μL de dimetilsulfoacutexido (DMSO) para cromatografiarla
por HPLC
La cromatografiacutea se llevoacute a cabo en el mismo equipo empleado para la
determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA pero con los siguientes cambios
1) Se empleoacute una columna de fase estacionaria reversa Spherisorb ODS2
de 5 μm de poro 25 cm de longitud y 046 cm de diaacutemetro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 57
2) El caudal de flujo del eluyente fue de 15 mLmin
3) El detector de longitud de onda variable (VWD) operaba a 340 nm y el
tiempo de elucioacuten era de 25 minutos
4) El eluyente empleado era una mezcla 8020 de fosfato de trietilamonio
50 mmolL a pH 3 y acetonitrilo El fosfato de trietilamonio se obteniacutea
haciendo reaccionar cantidades equimolares de trietilamina y aacutecido
fosfoacuterico
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual
La composicioacuten porcentual enantiomeacuterica del γ-PGA es decir el
contenido porcentual de aacutecido D- y L-glutaacutemico se determinoacute mediante
contraste de las aacutereas obtenidas en el cromatograma para cada uno de los
picos correspondientes a cada diasteroisoacutemero con el aacuterea total
correspondiente a los productos de reaccioacuten (sumatoria de ambos
diasteroisoacutemeros) La composicioacuten se reportoacute como un porcentaje de aacutecido D-
glutaacutemico y aacutecido L-glutaacutemico presente en la muestra analizada
511 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA Para la determinacioacuten del peso molecular del poliacutemero se procedioacute a
analizar los cromatogramas obtenidos para el caacutelculo de la concentracioacuten de γ-
PGA Se empleoacute el programa informaacutetico ChemStation for LC Systemsreg de
Agilent Technologies Dicho programa posee unas potentes herramientas de
anaacutelisis que permiten automaacuteticamente calcular el peso molecular de un
compuesto Para las muestras analizadas se determinoacute el peso molecular
promedio en nuacutemero (Mn) el peso molecular promedio en peso (Mw) la
polidispersidad y el peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) La recta de
calibrado fue obtenida previamente por Bou y colaboradores con estaacutendares de
polioacutexido de etileno (PEO)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 58
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 59
8 RESULTADOS
61 Montaje del biorreactor a presioacuten
El detalle final del biorreactor empleado puede observarse en la figura 8
Noacutetese que la temperatura es controlada por la accioacuten de una manta teacutermica
externa como sucede con el disentildeo original del reactor y no por el empleo de
un serpentiacuten interno caso de la gran mayoriacutea de biorreactores comerciales a
escala laboratorio El mismo permite operar en condiciones de agitacioacuten de 100
a 650 rpm y a presiones de hasta 24 bar de sobrepresioacuten (35 psig) El
biorreactor resultoacute apto para el crecimiento microbiano alcanzaacutendose valores
de absorbancia de hasta 37 similares a los observados en cultivos en
matraces
Figura 9 Biorreactor empleado para la produccioacuten de γ-PGA bajo presioacuten
62 Competencia del inoacuteculo madre
Mediante la metodologiacutea descrita previamente para la preparacioacuten del
inoacuteculo madre fue posible alcanzar en el 100 de los cultivos de control la
produccioacuten de γ-PGA en alta cantidad Aunque dichos resultados no se
muestran el empleo de inoacuteculos de otra naturaleza como reutilizacioacuten de
biomasa o inoacuteculos conservados a temperaturas superiores a -20 ordmC mostraron
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 60
ser ineficaces y poco reproducibles en cuanto a la produccioacuten de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a Los resultados de los cultivos control
pueden observarse en el graacutefico 10 bajo el nombre de Matraz
63 Determinacioacuten de los valores de kLa
631 Matraz
En lo referente al cultivo en matraz bajo las condiciones de agitacioacuten y
temperatura empleadas y en condiciones estaacuteticas (sin crecimiento
microbiano) se encontroacute un valor de kLa de 0026 s-1 En el graacutefico 1 y 2 se
muestran la curva de concentracioacuten de oxiacutegeno en funcioacuten del tiempo al
reiniciarse el proceso de agitacioacuten asiacute como el caacutelculo de dicho valor de
coeficiente mediante regresioacuten lineal respectivamente
Graacutefico 1 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concentracioacuten m
gL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 61
Graacutefico 2 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00257x ‐ 08809Rsup2 = 09966
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
Cuando se realizoacute la misma determinacioacuten pero a una velocidad de
agitacioacuten menor (430 rpm) el valor de kLa disminuyoacute significativamente En
dicho caso el valor de kLaobtenido fue de 0017 s-1 Estos resultados se
muestran en los graacuteficos 3 y 4
Como se puede observar en dichos graacuteficos el tiempo requerido para
alcanzar el valor maacuteximo estable se incrementoacute considerablemente en 60
segundos lo que indica una menor velocidad de transferencia producto de la
reduccioacuten de la intensidad de la agitacioacuten suministrada al cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 62
Graacutefico 3 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 430 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Graacutefico 4 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00168x ‐ 07551Rsup2 = 09835
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
ln Linear (ln)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 63
632 Biorreactor
Para el caso del biorreactor el valor de kLa determinado fue de 0025 s-1
esto bajo condiciones estaacuteticas (sin crecimiento microbiano) y en las
condiciones de temperatura y operacioacuten previamente descritas
Como se puede observar dicho valor es praacutecticamente igual al obtenido
para el caso del matraz lo que indica condiciones de transferencia de oxiacutegeno
gas-liacutequido muy similares en ambos casos El valor dekLa fue determinado en
un punto lateral del reactor 2 cm por debajo del nivel de medio de cultivo y
contiguo a uno de los deflectores punto donde la transferencia de materia
debiera en principio ser mayor Dichos resultados se presentan en los graacuteficos
5 y 6
Graacutefico 5 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten mecaacutenica del medio de cultivo en biorreactor a 300 rpm
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
560
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Concentracioacuten
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 64
Graacutefico 6 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00246x ‐ 03222Rsup2 = 09902
000
050
100
150
200
250
300
0 20 40 60 80 100 120 140
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
64 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En lo referente a los niveles de oxiacutegeno a distintas concentraciones de γ-
PGA en condiciones estaacuteticas sin crecimiento microbiano se observa una
draacutestica reduccioacuten de dicho nivel conforme se incrementa la concentracioacuten del
biopoliacutemero Dicho fenoacutemeno es esperable dada la alta viscosidad del γ-PGA
La concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo alcanza un valor inicial de
74 mgL el cual se reduce draacutesticamente a 52 mgL a un valor de
concentracioacuten de γ-PGA de 14 gL Esta reduccioacuten es uacutenicamente producto de
la presencia del γ-PGA en el medio de cultivo El graacutefico 7 muestra dicho
fenoacutemeno hasta un valor miacutenimo de oxiacutegeno disuelto de 25 mgL cuando la
concentracioacuten de poliacutemero alcanza un maacuteximo 71 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 65
Graacutefico 7 Efecto de la concentracioacuten de γ-PGA sobre el nivel maacuteximo de oxiacutegeno disuelto en el
medio de cultivo E
y = ‐00569x + 64671Rsup2 = 08709
000
100
200
300
400
500
600
700
800
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Oxiacutegeno disuelto m
gL
γ‐PGA gL
Solubilidad O2 (mgL) Linear (Solubilidad O2 (mgL))
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γshyPGA mediante GPC
La curva de calibracioacuten obtenida a partir de soluciones con
concentracioacuten conocida de γ-PGA se presenta en el graacutefico 8
Como se puede observar se obtuvo un valor del coeficiente de
determinacioacuten R2 de 09983 lo que indica un ajuste lineal suficiente y un valor
del coeficiente de correlacioacuten R de 09991 lo que indica una correlacioacuten
positiva entre los datos contrastados La concentracioacuten de γ-PGA estaacute
determinada entonces por la siguiente ecuacioacuten
Concentracioacuten γ-PGA (gL) = (00027 x Aacuterea) ndash 00916
Esta curva fue posteriormente empleada para determinar la
concentracioacuten de γ-PGA en los caldos de cultivo obtenidos despueacutes de cada
una de las fermentaciones realizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 66
Graacutefico 8 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA mediante
GPC
y = 00027x ‐ 00916Rsup2 = 09983
0
2
4
6
8
10
12
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Concentracioacuten gL
Aacuterea
Series1 Linear (Series1)
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γshyPGA
En lo referente al efecto de la presioacuten (relativa) sobre la productividad en
γ-PGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a se encontroacute un incremento de los
rendimientos fermentativos conforme se incrementaba la presioacuten hasta
alcanzar un valor maacuteximo de sobrepresioacuten de 103 bar (15 psig) una vez
superado dicho umbral la productividad se veiacutea reducida draacutesticamente A 103
bar la productividad en γ-PGA alcanzaba un valor de 1334 gL productividad
mayor a la obtenida en condiciones de aireacioacuten (2 Lmin) a presioacuten
atmosfeacuterica la cual fue de 508 gL Esta productividad maacutexima contrasta con
la obtenida a presioacuten atmosfeacuterica la cual fue miacutenima con un valor de 217 gL
Los graacuteficos 9 y 10 muestran los resultados anteriormente comentados Asiacute
mismo en la tabla 8 se presentan la totalidad de fermentaciones llevadas a
cabo las productividades obtenidas y el promedio de cada condicioacuten Es
importante destacar que cada condicioacuten de presioacuten fue evaluada por duplicado
no encontraacutendose diferencias importantes entre los resultados obtenidos para
ninguno de los casos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 67
Graacutefico 9 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748
617
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 05 1 15 2 25
PGGA (gL)
Presioacuten (bar)
RENDIMIENTO gL
Graacutefico 10 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten y la aireacioacuten a presioacuten atmosfeacuterica (0 relativa)
sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748617 508
4582
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
0 052 103 172 241 0 +Aireacioacuten
Matraz
Concentracioacuten γ‐PGA gL
Presioacuten
RENDIMIENTO gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 68
Tabla 8 Fermentaciones realizadas y concentraciones de γ-PGA obtenidas
Reactor Condiciones A D C (gL)AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10108 5 130
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10926 5 141
AHJC11 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 11753 5 152
AHJC11 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10186 5 131
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 95011 5 122
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 97936 5 126
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28706 3 20
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28194 3 20
AHJC14 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 33184 3 24
AHJC14 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 32866 3 23
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 68396 3 52
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 65871 3 50
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43692 5 54
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 46235 5 57
AHJC16 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 49809 5 62
AHJC16 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 58872 5 74
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 57321 5 72
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43021 5 53
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 57727 5 72
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 62398 5 78
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 60469 5 76
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 58335 5 73
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 6083 5 76
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 57897 5 72
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 51267 5 64
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 48407 5 60
= nuacutemero de muestra A = aacuterea D = dilucioacuten C = concentracioacuten y bar = bar relativo
Algunos de los cromatogramas realizados se muestran en las figuras 10
y 11 Como se puede observar la forma del pico de elucioacuten demuestra que el
biopoliacutemero estaacute compuesto por moleacuteculas de distinta longitud por lo cual
existen diferentes pesos moleculares Es importante destacar que para la gran
mayoriacutea de las fermentaciones realizadas el pico siempre presentoacute su maacutexima
altura al inicio lo que demuestra que la mayor parte de eacutel se trataba de un
poliacutemero de alto peso molecular Igualmente esto podriacutea indicar poca
degradacioacuten del biopoliacutemero durante las 18 horas de fermentacioacuten lo cual es
importante dada la capacidad de Bacillus licheniformis ATCC9945a de
hidrolizar enzimaacuteticamente el γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 69
Figura 10 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA analizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 70
Figura 11 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA (052-103-172 y 241 bar relativas)
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γshyPGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a
En lo referente al efecto de la intensidad de agitacioacuten en rpm sobre la
produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a a una presioacuten de
103 bar relativos (15 psig) se encontroacute un efecto negativo del aumento de la
agitacioacuten por encima de las 300 rpm lo que se demuestra con una importante
reduccioacuten en la concentracioacuten final de γ-PGA obtenida despueacutes de 18 horas de
fermentacioacuten Estos resultados se presentan en el graacutefico 11 Como se puede
observar una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm llega a ser tan perjudicial
para el microorganismo que la productividad en γ-PGA cae por debajo del valor
de 1 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 71
Graacutefico 11 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis
ATCC9945a a 103 bar (15 psig) a 30 ordmC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
300 350 400 450 500 550 600 650 700
Concentracioacuten gL
Agitacioacuten rpm
RENDIMIENTO (gL)
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica resultoacute afectada por las condiciones de
presioacuten Como demuestra el graacutefico 12 la proporcioacuten de aacutecido L-glutaacutemico en
las muestras correspondientes a fermentaciones bajo presioacuten resultoacute ser por
mucho mayor a las observadas en los cultivos control tanto en comparacioacuten
con el de matraz como con el sometido a aireacioacuten
La respectiva curva de calibracioacuten con las muestras conformadas por
mezclas con composicioacuten definida de ambos enantioacutemeros se presente en el
graacutefico 13 Como se puede observar los valores teoacutericos y los valores
experimentales obtenidos en el cromatograma coinciden en buena medida lo
que indica la validez de esta teacutecnica para la determinacioacuten de la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA
En dos casos para las fermentaciones llevada a cabo a 052 bar y 172
bar de sobrepresioacuten (75 y 25 psig respectivamente) la proporcioacuten de aacutecido D-
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 72
glutaacutemico fue de cero en contraste con el control en matraz donde dicha forma
del aacutecido glutaacutemico estaba presente mayoritariamente en un 87
De igual manera en lo que concierne a la fermentacioacuten llevada a cabo a
presioacuten atmosfeacuterica y bajo condiciones de aireacioacuten se observa tambieacuten que el
enantioacutemero mayoritariamente presente es el aacutecido D-glutaacutemico con un 83
en contraste con el aacutecido L-glutaacutemico con apenas un 17 Todas las
fermentaciones llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten presentan un
contenido de aacutecido L-glutaacutemico superior al 83
Aunque no fue posible encontrar una correlacioacuten directa entre la presioacuten
y la composicioacuten porcentual en aacutecido D-glutaacutemico si es posible observar como
las condiciones de presioacuten parecen limitar condicionar o disminuir la presencia
de esta forma del aacutecido glutaacutemico en el γ-PGA
Graacutefico 12 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica en aacutecido
L-glutaacutemico y aacutecido D-glutaacutemica del γ-PGA producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a
R11 (103bar)
R12 (103bar)
R15 (0 +aireacioacuten)
R16 (241bar)
R19 (172bar)
R22 (052bar)
MATRAZ
AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO 9518 8319 1736 10000 8347 10000 1285
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO 482 1681 8264 000 1653 000 8715
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 73
Graacutefico 13 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-
PGA mediante HPLC
000
2900
4700
7700
970010000
7100
5300
2300
300
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
100 L 75 L 25 D 50 L 50 D 25 L 75 D 100 D
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO
69 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA
Los resultados de los pesos moleculares de los poliacutemeros obtenidos en
los distintos ensayos se muestran en la tabla 9 El peso molecular promedio de
permeacioacuten (Mp) de todas las muestras se encontroacute entre los 269-307 x 107
gmol
Tabla 8 Valores de peso molecular promedio en nuacutemero (Mn) peso molecular promedio en
peso (Mw) peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) y polidispersidad (PD) delγ‐PGA
producido en los distintos ensayos evaluados
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
MATRAZ1 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 157 214 29 137
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
MATRAZ2 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 160 216 292 135
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar relativos
207 252 307 122 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 74
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
204 252 307 124 PRIMERO MAYOR
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
202 252 307 125 PRIMERO MAYOR
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
199 251 307 126 PRIMERO MAYOR
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 200 247 307 123
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 226 26 306 115
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 179 223 281 125
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 172 221 264 128
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
217 248 304 114 PRIMERO MAYOR
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
210 246 304 117 PRIMERO MAYOR
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
195 233 284 120 SEGUNDO MAYOR
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
178 225 269 126 SEGUNDO MAYOR
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
223 262 306 118 PRIMERO MAYOR
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
222 261 306 117 PRIMERO PAYOR
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
207 254 307 122 PRIMERO MAYOR
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
187 251 306 134 PRIMERO MAYOR
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
171 246 306 144 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
185 253 306 136 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
202 252 306 125 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 75
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
232 263 306 113 PRIMERO MAYOR
AHJC32-1-18HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
173 228 307 132 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-2-18HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
177 230 306 130 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-1-36HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
165 220 23 133 IGUALES
AHJC32-2-36HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
173 224 302 130 IGUALES
Los valores de polidispersidad estuvieron entre 113 y 144 Asiacute mismo
no se observan mayores diferencias entre los pesos moleculares obtenidos a
distintas presiones aunque la existencia de un segundo pico era maacutes evidente
en los cromatogramas correspondientes a γ-PGA producido en condiciones de
presioacuten relativa 0 Asiacute mismo dichas muestras presentan un peso molecular
levemente menor aunque dicha tendencia no es absoluta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 76
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 77
9 DISCUSIOacuteN
71 Cepa empleada
Bacillus licheniformis ATCC9945a es una cepa que ha sido empleada
con eacutexito en la produccioacuten de γ-PGA particularmente a escala laboratorio maacutes
no ha sido empleada a escala industrial donde otras cepas particularmente de
la especie Bacillus subtilis han sido las preferidas tanto por aspectos de
rendimiento como estabilidad productiva de la cepa El presente estudio
determinoacute una productividad promedio en condiciones de matraz de 4582 gL
despueacutes de 72 horas de cultivo Valores de productividad tan altos no habiacutean
sido reportado previamente para Bacillus licheniformis ATCC9945a donde
valores entre 17 y 23 gL de rendimiento han sido reportados por Troy (1973)
Cromwick y Gross (1996) 26 a 35 gL por Bajaj y colaboradores (2009) y 35
gL por Yoon y colaboradores (2000)
Los motivos de este mayor rendimiento aunque no son claros pueden
deberse a una mejor transferencia de oxiacutegeno en el sistema de agitacioacuten
magneacutetica en comparacioacuten con la agitacioacuten orbital estaacutendar Asiacute por ejemplo y
utilizando la ecuacioacuten simplificada para determinar en valor de kLa en agitacioacuten
orbital (Diacuteaz 2011) tenemos que a 20 ordmC
kLa = 139 x 10-3n (VTVL)084
Asiacute tenemos que para un sistema en agitacioacuten orbital a 250 rpm es decir
a una frecuencia de 417 s-1 con un volumen de medio de cultivo de 100 mL y
un volumen total del matraz 500 mL el valor de kLa es de aproximadamente
0020 s-1 inferior al valor de 0026 s-1 obtenido en el presente estudio para el
cultivo en agitacioacuten magneacutetica a 30 ordmC Dado que la difusividad disminuye al
aumentar la temperatura es de esperar que a 30 ordmC dicho valor de kLa teoacuterico
sea auacuten menor
Es importante sentildealar que en lo referente a la composicioacuten del medio de
cultivo el medio de cultivo E empleado en este estudio es el mismo empleado
previamente por otros autores para el estudio de la produccioacuten de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a por lo cual no se considera que la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 78
composicioacuten del medio de cultivo pueda ser la responsable de las diferencias
con los resultados reportados anteriormente por otros investigadores quienes
en particular tambieacuten emplearon dicho medio de cultivo en sus pruebas
Dicho valor de rendimiento promedio obtenido de 4582 gL (en matraz)
coloca a este cepa al mismo nivel de productividad de las cepas
industrialmente empleadas como sucede con Bacillus subtilis F02-1 con un
rendimiento reportado por Kubota y colaboradores (1993) de 50 gL pero con
una menor necesidad de aacutecido glutaacutemico (20 gL en contra de 80 gL) La
conveniencia del empleo de la cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis debe
entonces evaluarse entorno a su capacidad de escalamiento y conservacioacuten de
la competencia en la produccioacuten de γ-PGA y no entorno a su maacuteximo
rendimiento pues en este aspecto ha demostrado en condiciones oacuteptimas la
capacidad de producir γ-PGA en concentraciones extremadamente elevadas
Los resultados acaacute obtenidos refuerzan lo ya descrito por otros autores quienes
sentildealan precisamente estos aspectos (escalamiento y estabilidad) como los
principales retos para llevar a cabo la produccioacuten de γ-PGA mediante Bacillus
licheniformis ATCC9945a
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente
Uno de los principales problemas que se enfrentoacute a lo largo de la
presente investigacioacuten es la facilidad con la cual la cepa ATCC9945a de
Bacillus licheniformis revierte a formas incapaces de producir γ-PGA Este
fenoacutemeno puede ocurrir incluso con tan soacutelo una generacioacuten de cultivo por lo
cual el empleo de la biomasa generada en una fermentacioacuten previa es
indeseable pues seguramente no daraacute resultados positivos para la produccioacuten
de γ-PGA
Este fenoacutemeno es uno de los principales inconvenientes que se
enfrentan a la hora de evaluar el efecto de diversos paraacutemetros sobre la
productividad de γ-PGA en esta cepa pues la incapacidad de garantizar
resultados reproducibles imposibilita poder evaluar condiciones nutricionales
de agitacioacuten temperatura y demaacutes teniendo la certeza que las diferencias
encontradas solo se deberaacuten a los paraacutemetros bajo control
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 79
Cromwick y colaboradores (1994) reportaron el congelamiento con
nitroacutegeno liacutequido como una forma vaacutelida para la preservacioacuten de las ceacutelulas en
un estado consistente de alta productividad de γ-PGA En nuestro caso la
metodologiacutea empleada fue distinta Se incorporoacute el glicerol como crioprotector y
el congelamiento no se realizoacute mediante nitroacutegeno liacutequido sino que fue
congelamiento convencional utilizando un equipo de refrigeracioacuten con una
capacidad de enfriamiento de hasta -80 ordmC y voluacutemenes de inoacuteculo pequentildeos
de entre 1 y 2 mL cuyo congelamiento fuera particularmente raacutepido
Igualmente se observoacute que los cultivos que mejor comportamiento y
reproducibilidad dieron como inoacuteculo fueron aquellos cuyas ceacutelulas eran
recolectadas previo al inicio de la produccioacuten de γ-PGA Cultivos cuya edad
superaba las 10 horas y que ya presentaban presencia de γ-PGA aunque
podiacutean emplearse para la obtencioacuten de inoacuteculos madres los mismos no
resultaban tan eficientes como los anteriormente descritos
El empleo de esta metodologiacutea de conservacioacuten de la cepa permitioacute una
reproducibilidad del 100 en los ensayos obtenieacutendose poliacutemero en la
totalidad de los cultivos de control que se establecieron durante cada una de
las fermentaciones llevadas a cabo en el biorreactor Estos resultados indican
que dicha metodologiacutea es eficaz para la preservacioacuten a largo plazo de Bacillus
licheniformis ATCC9945a y como estrategia para un adecuado escalamiento
durante el proceso de produccioacuten a mayor escala De igual manera la
descripcioacuten detallada del proceso de conservacioacuten volumen de inoacuteculo
concentracioacuten de la muestra (por absorbancia) temperatura y demaacutes permite
una alta reproducibilidad del meacutetodo en contraposicioacuten con los reportes
existentes por otros autores que no brindaban mayor detalles sobre coacutemo llevar
a cabo este proceso de conservacioacuten
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten
Las fermentaciones a presiones superiores a la presioacuten atmosfeacuterica no
son habituales tanto a nivel de investigacioacuten como a nivel de proceso Dicha
afirmacioacuten queda particularmente ratificada cuando se analizan las opciones
comerciales existentes a escala laboratorio de biorreactores disentildeados para
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 80
operar a presioacuten la cual resulta praacutecticamente nula Por este motivo y para
poder llevar a cabo este estudio se requirioacute adaptar un reactor quiacutemico de
modo tal que permitiese trabajar a presioacuten y a la vez tuviese un control de
agitacioacuten y temperatura miacutenimo de modo tal que permitiese el cultivo de
microorganismos El biorreactor disentildeado fue exitoso pues permitiacutea un
crecimiento microbiano oacuteptimo y la produccioacuten de γ-PGA en un tiempo
relativamente corto de 18 horas
Las modificaciones realizadas en realidad fueron miacutenimas con respecto
a la estructura baacutesica del reactor quiacutemico convencional y con ellas se buscoacute
crear las condiciones que permitiesen incrementar la turbulencia en el sistema
de modo que existiese una mayor oxigenacioacuten y un mayor coeficiente
volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno (kLa) partiendo de antemano de la
hipoacutetesis inicial que sentildealaba al oxiacutegeno como uno de los componentes
limitantes de hecho el de mayor importancia para que este fermentacioacuten
ocurriese de la manera adecuada y con un alto rendimiento de γ-PGA
Se decidioacute emplear un reactor hecho de vidrio en lugar de uno metaacutelico
debido a que las condiciones de oxidacioacuten de la fermentacioacuten y la sensibilidad
de las enzimas involucradas a los iones metaacutelicos haciacutean deseable un material
inerte como sucede con el vidrio De igual manera al emplearse vidrio se tiene
una visioacuten del interior del fermentador las condiciones de agitacioacuten y formacioacuten
de burbujas son visibles asiacute como el crecimiento microbiano lo que permite un
mejor ajuste y correccioacuten de las condiciones de fermentacioacuten al menos durante
las etapas iniciales de investigacioacuten Para poder trabajar a mayores presiones
se hubiese requerido un reactor quiacutemico metaacutelico de un costo sumamente
elevado Los resultados experimentales demostraron que el rango de presioacuten
definido resultoacute ser el correcto para la investigacioacuten
La seleccioacuten de una turbina tipo Rushton radica en que este tipo de
agitador de pala plana se considera como el ideal para la realizacioacuten de
fermentaciones Dado que las paletas de heacutelices Rushton son planas y
colocadas verticalmente a lo largo del eje de agitacioacuten producen un flujo radial
unidireccional que permite una alta difusioacuten de un gas en un liacutequido por lo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 81
comuacuten son utilizadas en la fermentacioacuten de liacuteneas celulares que requieren altas
tasas de oxiacutegeno tales como las levaduras bacterias y algunos hongos
Las laacuteminas deflectoras fueron incorporadas pues aunque a velocidades
muy bajas un agitador de paletas produce una agitacioacuten suave inclusive en un
tanque sin laacuteminas deflectoras cuando son necesarias velocidades elevadas
se requiere la incorporacioacuten de dichas laacuteminas para aumentar la turbulencia de
lo contrario el liacutequido se mueve como un remolino que gira alrededor del
tanque con velocidad elevada pero con poco efecto de mezcla
74 Tiempo de fermentacioacuten
El tiempo de fermentacioacuten empleado en esta investigacioacuten es
significativamente inferior al empleado por otros autores que hablan de un
promedio de 72 horas Es importante sentildealar que 18 horas es el tiempo
suficiente para que el pH del medio de cultivo descienda a cerca de 60
Valores de pH inferiores a este han demostrado ser perjudiciales pues decae
el consumo de aacutecido ciacutetrico se detiene en gran medida la polimerizacioacuten del γ-
PGA y la concentracioacuten tiende a disminuir con el paso del tiempo
Para poder aumentar el periacuteodo de fermentacioacuten se requeririacutea un
sistema de ajuste de pH que opere bajo condiciones del presioacuten mismo que no
se tuvo disponible Es probable que si se prolongara el tiempo de fermentacioacuten
dentro del biorreactor los rendimientos al cabo de 48 o 72 horas seriacutean un
poco mayores siempre y cuando se ajuste el pH en el valor de 65 como
recomiendan Cromwick y colaboradores (1995)
En nuestro caso el incremento del tiempo de fermentacioacuten sin
regulacioacuten del pH de 18 horas a 36 horas mostroacute un incremento miacutenimo en la
productividad (de 025 gL) pero si un cambio en la composicioacuten del γ-PGA
pues el pico de elucioacuten del poliacutemero se desplazoacute levemente hacia un valor de
tiempo mayor lo que podriacutea indicar una degradacioacuten parcial del poliacutemero
inicialmente producido Dichos datos se presentan en la figura 12
Nuestros resultados contradicen lo sentildealado por otros autores quienes
obtienen los mayores rendimientos entre las 48 y 96 horas Birrer y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 82
colaboradores (1995) observaron que Bacillus licheniformis ATCC9945a
alcanza la fase estacionaria a las 24 horas tiempo en el cual muy poco γ-PGA
ha sido formado y por consiguiente la mayor formacioacuten de γ-PGA acontece
entre las 24 y las 96 horas Estos resultados coinciden con los reportados por
Troy (1973) pero difieren a los observados por Goto y Kunioka (1992) con
Bacillus subtilis IFO3335 donde el mayor rendimiento se obtuvo desde las 24 y
hasta las 40 horas Estas diferencias podriacutean deberse a aspectos maacutes
relacionados con los voluacutemenes de fermentacioacuten empleados Por ejemplo para
el caso de Yoon y colaboradores (2000) estos alcanzaron rendimientos de 35
gL con un periacuteodo de fermentacioacuten maacuteximo de 35 horas indicando un
agotamiento del aacutecido ciacutetrico a las 20 horas en su caso el volumen empleado
fue de 1 litro de medio de cultivo
Figura 12 Cromatograma a las 18 (a) y 36 (b) horas de fermentacioacuten con Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 83
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento
Un punto vital para una adecuada fermentacioacuten es la concentracioacuten de
inoacuteculo aspecto que es sentildealado por Troy Cromwick y colaboradores a lo
largo de sus investigaciones pero que no detallan ni cuantifican
adecuadamente o al menos no lo reportan En nuestro caso se empleoacute un
inoacuteculo madre con una absorbancia de 25 o mayor y un inoacuteculo del reactor con
un valor de absorbancia de 120 aproximadamente con el propoacutesito de asiacute
logran estandarizar las condiciones de inoacuteculo Aunque este aspecto no fue
cuantificado a manera cualitativa si se observoacute un importante efecto de este
aspecto (concentracioacuten inicial) sobre la cantidad de γ-PGA obtenido y el tiempo
requerido Esto puede resultarnos obvio teniendo en cuenta una descripcioacuten no
estructurada del crecimiento microbiano pero podriacutea resultar maacutes compleja de
analizar si consideramos que la produccioacuten del γ-PGA estaacute afectada por
paraacutemetros de otra naturaleza maacutes allaacute de la disposicioacuten de nutrientes como
por ejemplo de una estructura celular particular o una relacioacuten de percepcioacuten
de quoacuterum dada Debemos recordar que la percepcioacuten de quoacuterum es un
mecanismo de regulacioacuten de la expresioacuten geneacutetica en respuesta a la densidad
de poblacioacuten celular Las ceacutelulas involucradas producen y excretan sustancias
llamadas autoinductores que sirven de sentildeal quiacutemica para inducir la expresioacuten
geneacutetica colectiva De Vizio (2011) sentildeala que en Bacillus licheniformis NCIMB
8874 la produccioacuten de lichenysin γ-PGA y algunas proteasas extracelulares
estaacute vinculado con los genes comQXPA mismo operoacuten que regula la
percepcioacuten de quoacuterum en Bacillus subtilis
De igual manera la relacioacuten de escalamiento aplicada fue de 16
ligeramente inferior a la que teoacutericamente se utiliza con mayor frecuencia de
110 Aunque este iacutendice no fue objeto de estudio su ajuste tambieacuten afecta de
manera directa los rendimientos obtenidos
La optimizacioacuten de la concentracioacuten del inoacuteculo la relacioacuten de
escalamiento y su frecuencia constituyen aspectos que deben estudiarse con
mayor profundidad para su propia optimizacioacuten pues su efecto sobre esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 84
fermentacioacuten y su rendimiento es bastante significativo Esta afirmacioacuten
adquiere validez cuando vemos que la produccioacuten del γ-PGA no es un
metabolito primario que se forme durante la fase de crecimiento exponencial
sino maacutes bien al inicio de la etapa estacionaria como indica Goto y Kunioka
(antildeo) o durante toda la etapa estacionaria tal y como lo sentildealan tanto Troy
(antildeo) como Birrer y colaboradores (1994) A esto debemos agregarle tambieacuten
lo anteriormente sentildealado referente a la concentracioacuten idoacutenea que produce la
percepcioacuten de quoacuterum responsable de direccionar el metabolismo de la
comunidad microbiana hacia la siacutentesis del γ-PGA
Conociendo la dependencia de esta biosiacutentesis de la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio y partiendo del hecho de que al inicio de la fase
estacionaria la concentracioacuten celular seraacute lo suficientemente alta para poner el
riesgo el mantenimiento de las condiciones aeroacutebicas en el biorreactor pero lo
justa para una adecuada siacutentesis del γ-PGA un inoacuteculo con una alta
concentracioacuten inicial de ceacutelulas podriacutea ayudar a obtener un mayor rendimiento
en un tiempo de fermentacioacuten menor o producir la respuesta de percepcioacuten de
quoacuterum (generalmente se trata de la liberacioacuten de un polipeacuteptido sentildeal) en un
tiempo menor con la consiguiente produccioacuten del γ-PGA
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa es un valor de
suma importancia para el escalamiento de bioprocesos en particular cuando
nos referimos a fermentaciones aeroacutebicas o cultivos de organismos o ceacutelulas
en condiciones de metabolismo aeroacutebico En nuestro caso un adecuado
coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno es garantiacutea que las
condiciones aeroacutebicas se sostendraacuten a lo largo del proceso de fermentacioacuten de
modo que no se produzcan desviacuteos metaboacutelicos indeseados o en el peor de
los casos el inicio del metabolismo anaerobio y la consecuente produccioacuten de
aacutecido aceacutetico
Los valores de kla obtenidos fueron de 0026 s-1 y 0025 s-1 para el
matraz y el bioreactor respectivamente Dichos valores por si mismos nos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 85
indican poco si no determinamos la tasa de consumo de oxiacutegeno requerida
para el cultivo aeroacutebico de Bacillus licheniformis Doran (1995) reporta una
velocidad de consumo de oxiacutegeno m02 para el cultivo aeroacutebico de Bacillus
licheniformis de 231 x 10-5 gO2 g-1cel s
-1 si la concentracioacuten de ceacutelulas X en el
reactor es de 20 gL (determinado experimentalmente como el valor final
alcanzado en matraces con alta concentracioacuten de γ-PGA) la tasa de consumo
de oxiacutegeno (OUR) MO2 seraacute igual a Xm02 es decir 46 x 10-4 mgO2mL-1s-1 A
partir de estos datos y conociendo que kla = MO2ΔcA ΔcA = cA ndash cA sabiendo
que presioacuten atmosfeacuterica cA = 801 mgL a 30 ordmC y el valor cA en el biorreactor
a 30 ordmC es 74 mgL obtenemos un valor de kla del orden de 0062 s-1 Dicho
valor corresponde al valor teoacuterico que seriacutea necesario para mantener el cultivo
con el suministro adecuado y suficiente de oxiacutegeno y que como puede verse
es 25 veces mayor al kla real lo que indica que cuando el cultivo alcance la
maacutexima concentracioacuten celular de 20 gL las condiciones del cultivo no seraacuten
suficientes para un metabolismo cien por ciento aeroacutebico
Tiene sentido entonces que los rendimientos alcanzados en matraz sean
significativamente mayores que los mejores rendimientos obtenidos en
bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica Dado que el cultivo en matraz incorporaba
uacutenicamente 100 mL de medio de cultivo el microorganismo es capaz de
alcanzar una mayor concentracioacuten en una menor unidad de tiempo lo que le
permite alcanzar una mayor concentracioacuten de poliacutemero durante las 26 horas de
cultivo (8 iniciales + 18)
Por su parte para el caso del biorreactor el crecimiento oacuteptimo
probablemente demore maacutes en alcanzarse por lo cual el tiempo que transcurre
entre el alcance de la concentracioacuten limitante de 8 gL (concentracioacuten a la cual
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y la tasa de consumo de oxiacutegeno
(OUR) se igualan) y la concentracioacuten oacuteptima es lo suficiente como para afectar
los rendimientos de γ-PGA Esto resulta evidente al comparar los resultados de
matraz con los de bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica (0 bar relativos) donde la
diferencia en productividad entre ambos es de 43 gL de γ-PGA Dicha
diferencia se explica porque mientras que la concentracioacuten del inoacuteculo madre
mostraba una absorbancia promedio de 25 la del inoacuteculo empleado para el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 86
biorreactor era de 120 (100 ml de medio + inoacuteculo madre creciendo durante 8
horas) es decir praacutecticamente la mitad por lo cual la concentracioacuten inicial de
ceacutelulas era significativamente menor para el biorreactor en comparacioacuten con el
matraz
77 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En condiciones estaacuteticas el contenido de γ-PGAdemostroacute reducir
considerablemente la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
pasando de 74 mgL a 440 mgL a una concentracioacuten del 20 en γ-PGA
Este fenoacutemeno puede deberse al incremento de la viscosidad por la
presencia del poliacutemero en el caldo de cultivo Dicha apreciacioacuten seguramente
afecta de manera negativa la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) pues
reduce tanto cA como cA sin embargo la determinacioacuten del valor de c
A de una
solucioacuten compuesta por sales γ-PGA y productos del metabolismo microbiano
es imposible de determinar teoacutericamente con certeza como para poder
cuantificar la magnitud de reduccioacuten de la OTR numeacutericamente De igual
manera el valor de kLa tambieacuten se ve afectado pues es sabido que a mayor
viscosidad mayor resistencia a la transferencia lo que reduce el valor de este
coeficiente
Asiacute mismo esta reduccioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
podriacutea deberse en parte a la naturaleza anioacutenica del poliacutemero y no solamente
al incremento de la viscosidad La solubilidad se ve afectada por la fuerza
ioacutenica por lo cual una solucioacuten con una concentracioacuten elevada de un poliacutemero
polianioacutenico como el γ-PGA probablemente muestre una importante reduccioacuten
en la solubilidad maacutexima (concentracioacuten de saturacioacuten) del oxiacutegeno en la
misma(Schumpe et al 1978)
Queda claro que dada esta reduccioacuten en la solubilidad de oxiacutegeno al
incrementar el contenido de γ-PGA durante la fermentacioacuten ya sea por la
naturaleza viscosa del biopoliacutemero o por su caraacutecter polianioacutenico la tasa de
transferencia de oxiacutegeno inicial y el valor de kLa se van reduciendo a lo largo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 87
del tiempo lo que dificulta auacuten maacutes garantizar las condiciones de oxigenacioacuten
oacuteptimas para este bioproceso Esto lo podemos explicar pues si tenemos que
OTR = kLa(cA-cA)
dado que al aumentar el contenido de γ-PGA ocurre una reduccioacuten en el valor
de kLa por accioacuten del incremento de la viscosidad (hecho que es
completamente cierto) y al aumentar la concentracioacuten de γ-PGA tambieacuten se
reduce tanto el valor de cA como el de cA (ya sea por efecto de la viscosidad o
de la naturaleza anioacutenico del poliacutemero) la OTR ve su magnitud evidente e
inevitablemente reducida dado que la misma es una relacioacuten de producto entre
ambos factores kLa y (cA ndashcA) Esto podriacutea explicar porque a voluacutemenes de
cultivo de 600 mL (en biorreactor) los rendimientos son mucho menores que en
voluacutemenes de cultivo de 100 ml (matraz) pues probablemente esta caiacuteda en la
OTR sea maacutes acentuada y criacutetica para los microorganismos cuando sucede a
voluacutemenes mayores donde mantener las condiciones de mezcla perfecta y una
alta concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto resultan maacutes dificultosas por lo que el
microorganismo es incapaz de crecer y alcanzar la concentracioacuten idoacutenea para
una maacutexima produccioacuten
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γshyPGA
La concentracioacuten de γ-PGA alcanzada al final de las 18 horas de
fermentacioacuten se vio afectada por la presioacuten Asiacute hasta los 103 bar a mayor
presioacuten mayor concentracioacuten de γ-PGA por encima de este valor de presioacuten la
concentracioacuten de γ-PGA disminuye
Esto puede explicarse por dos factores 1) el efecto de la presioacuten sobre
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y 2) impacto sobre la integridad y
viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γ-PGA
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR
La OTR se ve afectada tanto por el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de oxiacutegeno kLa asiacute como por la diferencia entre la concentracioacuten
de saturacioacuten y la concentracioacuten real en la fase liacutequida (cA-cA) El coeficiente kL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 88
es empiacuterico y su valor depende principalmente de factores tales como la
hidrodinaacutemica del sistema la turbulencia y su geometriacutea
Teoacutericamente kL se puede definir como kL = DABδ donde DAB es la
difusividad de A en B y δ es el espesor de la peliacutecula estancada seguacuten la
teoriacutea de peliacutecula para la transferencia de materia La difusividad en liacutequidos
depende en gran medida de la temperatura (afecta el coeficiente de difusioacuten) y
la concentracioacuten de solutos pero muy poco de la presioacuten (Diacuteaz 2011) En
nuestro caso podriacuteamos suponer que la presioacuten tiene poco efecto sobre kLa
pues tampoco es de esperar un cambio producto de la presioacuten en el aacuterea de
burbujas (a) producida por la agitacioacuten mecaacutenica auacuten maacutes cuando vemos el
hecho de que los ensayos llevados a cabo no contaron con un sistema de
aireacioacuten o burbujeo especiacutefico salvo aquel llevado a presioacuten atmosfeacuterica (0
bar relativa) y debidamente identificado como Aireacioacuten
Asiacute entonces tenemos en el segundo componente de la foacutermula la
diferencia (cA-cA) un punto de particular intereacutes pues efectivamente la
concentracioacuten de saturacioacuten y la concentracioacuten real variacutean con la presioacuten A
pesar de carecer de una sonda de oxiacutegeno disuelto directamente incorporada
al biorreactor y capaz de operar a presioacuten se determinoacute mediante transferencia
(con el sistema cerrado) la concentracioacuten real de oxiacutegeno en el medio de
cultivo a distintas presiones Tales concentraciones y las concentraciones de
saturacioacuten a cada presioacuten se presentan en el graacutefico 14
Para determinar el valor de las distintas concentraciones de saturacioacuten
al trabajar a presiones distintas a la atmosfeacuterica se realizoacute la siguiente
correccioacuten (Montoya amp Bermuacutedez 2003) para el valor de la solubilidad del
oxiacutegeno en agua
Ley de Henry
a 1 atm
Para una presioacuten P distinta a 1 atm tenemos que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 89
en mgL
Donde
C(S) = valor de solubilidad a 1 atm (mgL)
P = presioacuten de operacioacuten (atm)
T = temperatura de operacioacuten (K)
Graacutefico 14 Concentraciones de oxiacutegeno de saturacioacuten y en fas liacutequida a diferentes presiones
en medio de cultivo E sin crecimiento bacteriano
80
153
227
324
422
6681
141154
178
141
724857
1703
2438
y = 48525x + 68875
y = 14191x + 80039
y = 93382x + 11163
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
00
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 05 1 15 2 25 3
Concentracioacuten
Presioacuten (bar)
CONCENTRACIOacuteN DE SATURACIOacuteN CONCENTRACIOacuteN EN FASE LIacuteQUIDA DIFERENCIA
Aunque estos valores deben repetirse con una sonda de oxiacutegeno
disuelto interna (dentro del biorreactor) y bajo una metodologiacutea maacutes pertinente
preliminarmente puede observarse que la diferencia (cA-cA) aumenta al
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 90
aumentar la presioacuten y dado que OTR = kLa(cA-cA) al aumentar dicha
diferencia la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deberiacutea ser mayor Este
incremento de la OTR podriacutea explicar el porqueacute del raacutepido crecimiento
microbiano y la produccioacuten precoz de γ-PGA despueacutes de 18 horas de cultivo
en comparacioacuten con las entre 48 y 96 horas reportadas por otros autores asiacute
como el aumento del rendimiento al aumentar la presioacuten de los 0 bar relativos
(a presioacuten atmosfeacuterica) hasta los 103 bar relativos
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γshyPGA
Al superar los 103 bar relativos el rendimiento en γ-PGA decae
nuevamente Si consideramos un efecto positivo de la presioacuten sobre la OTR
como sentildealamos anteriormente esto no deberiacutea ocurrir Sin embargo al
someter las ceacutelulas a condiciones de presioacuten desconocemos el efecto que
dicha presioacuten puede ejercer sobre los microorganismos y sus rutas
metaboacutelicas asiacute como sobre la estructura de algunas biomoleacuteculas como por
ejemplo proteiacutenas
Meersman y Heremans (2008) sentildealan que el efecto de la presioacuten sobre
el crecimiento de los microorganismos puede explicarse por tres efectos
principales 1) Variaciones en el plegamiento y agregacioacuten de las proteiacutenas 2)
Variaciones en el estado de la membrana celular y 3) Variaciones en el
contenido de proteiacutenas asociadas a la membrana celular Estos aspectos son
de peculiar consideracioacuten pues la γ-PGA sintetasa es un complejo enzimaacutetico
formado por al menos tres unidades enzimaacuteticas distintas y que se encuentra
asociado a la membrana celular de Bacillus licheniformis
En lo referente a las proteiacutenas se sabe que su desnaturalizacioacuten se
produce por efecto de una reduccioacuten en su volumen producto de un cambio
configuracional probablemente de la estructura terciaria Asiacute tenemos que si el
volumen inicial de una proteiacutena viene dado por Vi = Vatomos + Vcavidades +
Vhidratacioacuten si en condiciones de presioacuten ocurre un cambio en el volumen de la
proteiacutena tal que ΔV = ΔVcavidades + ΔΔVhidratacioacuten(el volumen de los aacutetomos no
tiene por queacute variar con la presioacuten) la exposicioacuten de los grupos cargados o
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 91
hidrofoacutebicos de la proteiacutena al agua pueden conllevar a un cambio en la
estructura secundaria y terciaria de modo que la actividad de la proteiacutena se
vea perjudicada parcial o totalmente Esto se debe a que un aumento en la
presioacuten rompe las interacciones hidrofoacutebicas donde las interacciones proteiacutena-
proteiacutena son sustituidas por interacciones proteiacutena-agua particularmente
mediante puente de hidroacutegeno El incremento de la presioacuten podriacutea afectar la
conformacioacuten de alguno o algunos de los componentes del complejo
enzimaacutetico γ-PGA sintetasa lo que sin duda alguna se traduciriacutea en un menor
rendimiento en γ-PGA durante la fermentacioacuten Este posible efecto negativo de
la presioacuten sobre una de las enzimas involucradas en el proceso de biosiacutentesis
del γ-PGA se reafirma cuando vemos como variacutea la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA al aumentar la presioacuten aspecto que se discutiraacute con mayor detalle
maacutes adelante De hecho Ashiuchi y colaboradores (2004) sentildealan que el
complejo enzimaacutetico PgsBCA (γ-PGA sintetasa) es imposible de aislar en su
estado activo debido precisamente a su alta inestabilidad y elevada
hidrofobicidad
Por su parte la membrana celular al tratarse de una bicapa fosfolipiacutedica
es susceptible a sufrir cambios de fase producto de la temperatura o la presioacuten
como por ejemplo la transicioacuten gel-liacutequido El incremento de la presioacuten al igual
que sucede con la temperatura concede mayor fluidez a las bicapas lipiacutedicas
Asiacute en nuestro caso un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea permitir
una mayor difusioacuten de oxiacutegeno al interior celular lo que podriacutea afectar el
crecimiento bacteriano si por ejemplo se formase maacutes especies reactivas
toacutexicas de oxiacutegeno en el interior celular o si cierta maquinaria celular como la
misma γ-PGA sintetasa no fuese capaz de acoplarse adecuadamente en una
membrana con mayor fluidez
En lo referente a la interaccioacuten membrana celular-proteiacutenas es
importante destacar que entre el 20 y el 40 de las proteiacutenas de una ceacutelula
bacteriana suelen estar asociadas a esta estructura Como indicamos
anteriormente un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea afectar el
contenido concentracioacuten y capacidad de anclaje de las proteiacutenas a la
membrana celular El complejo enzimaacutetico γ-PGA sintetasa al tratarse de una
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 92
proteiacutena de membrana podriacutea no acoplarse de manera efectiva a la membrana
celular modificada bajo condiciones de presioacuten o ser liberada al medio de
cultivo lo que afectariacutea negativamente la produccioacuten de γ-PGA Estas
suposiciones podriacutean explicar el porqueacute de la gran cantidad de espuma
generada durante algunas fermentaciones a presioacuten (concretamente en
aquellas a una presioacuten superior a los 103 bar) a pesar de su menor
concentracioacuten de γ-PGA y teniendo presente que en las fermentaciones
microbianas la espuma suele estar constituida mayoritariamente por proteiacutenas
la presioacuten podriacutea estar favoreciendo la liberacioacuten de estas proteiacutenas al caldo de
cultivo y la consecuente formacioacuten abundante de espuma Este fenoacutemeno ya
ha sido reportado en otros microorganismos como Salmonella enterica donde
el tratamiento con presioacuten conllevaba a la peacuterdida de gran parte de sus
proteiacutenas de membrana y su consecuente liberacioacuten al medio de cultivo
(Meersman amp Heremans 2008) Esto se ve respaldado con las observaciones
de Ashiuchi y colaboradores (2004) quienes adicionaron detergentes como el
Tween20 y Triton X-114 (que modifican la estabilidad de la membrana celular y
favorece la liberacioacuten de las proteiacutenas asociadas a ella) a cultivos de Bacillus
spp productores de γ-PGA Ellos observaron una peacuterdida total de la capacidad
de siacutentesis del γ-PGA capacidad que no se recuperaba ni siquiera removiendo
la totalidad de dichos detergentes mediante diaacutelisis con lo cual concluyeron
que es indispensable que el complejo γ-PGA sintetasa se encuentre asociado a
la membrana celular para ser bioloacutegicamente activo
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γshyPGA
Un incremento de la intensidad de agitacioacuten afectariacutea positivamente el
valor de kLa incrementaacutendolo al aumentar el aacuterea de intercambio mediante una
mayor ruptura de las burbujas lo que aumenta el aacuterea de intercambio por
unidad de volumen Sin embargo existen liacutemites para la velocidad de agitacioacuten
esto debido al dantildeo ocasionado a los organismos debido a un esfuerzo
cortante excesivo A pesar de que la turbina Rushton es el impulsor de flujo
axial maacutes recomendado y maacutes eficiente para generar una mezcla perfecta de
alto perfil hidrodinaacutemico un bajo esfuerzo cortante y una alta distribucioacuten un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 93
exceso de agitacioacuten bajo condiciones de presioacuten es evidentemente perjudicial
Es probable que al aplicar presioacuten positiva sobre el cultivo la membrana celular
se encuentre en un estado de fluidez mayor al que presentariacutea a presioacuten
atmosfeacuterica asiacute mismo la presencia de glicerol en el medio de cultivo modifica
la composicioacuten lipiacutedica de la membrana favoreciendo la salida del γ-PGA al
exterior celular al aumentar de igual manera su fluidez Esto queda demostrado
por nuestros resultados a velocidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm
donde ocurre una reduccioacuten de la productividad conforme se aumenta la
agitacioacuten De igual manera la excesiva formacioacuten de espuma que se genera a
intensidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm podriacutea indicar la ruptura celular
y la liberacioacuten de componentes celulares y macromoleacuteculas al caldo de
fermentacioacuten Estas observaciones contradicen lo reportado por otros autores
(Yoon et al 2000) quienes indican velocidades de agitacioacuten oacuteptimas de hasta
1000 rpm a presioacuten atmosfeacuterica para un biorreactor de 24 L y un volumen
efectivo de cultivo de 1 L aunque no se brindan mayor detalle en lo referente al
tipo de turbina empleada
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
El cambio de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producto de la
presioacuten fue un resultado inesperado pues tradicionalmente se habiacutea sentildealado
a la concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo como el principal
responsable de controlar este aspecto Es importante destacar el hecho que
dicho cambio en la composicioacuten no es parcial o escalonado sino que por el
contrario el hecho de aplicar presioacuten durante la fermentacioacuten invierte
praacutecticamente los contenidos de aacutecido D-glutaacutemico y aacutecido L-glutamico de 87
y 13 respectivamente a presioacuten atmosfeacuterica (cultivo en matraz) a 17 y 83
respectivamente a una presioacuten relativa de 103 bar En algunos casos el
contenido de aacutecido D-glutaacutemico fue praacutecticamente 0
Efectivamente se sabe que el complejo γ-PGA sintetasa es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico aunque todaviacutea se
desconoce la arquitectura bioloacutegica de esta sintetasa Igualmente se sabe que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 94
es el componente PgsB el mayormente responsable de la cataacutelisis enzimaacutetica
(reaccioacuten de elongacioacuten del γ-PGA) (Ashiuchi 2010) Una hipoacutetesis que podriacutea
explicar estos resultados es que bajo presioacuten la estructura de esta proteiacutena se
modifique parcialmente (tanto la estructura de la proteiacutena propiamente dicha
como la estructura en funcioacuten de su anclaje a la membrana celular) lo
suficiente como para reducir su afinidad por el aacutecido D-glutaacutemico pero sin
afectar su afinidad por el aacutecido L-glutaacutemico ni conllevar a una
desnaturalizacioacuten de la proteiacutena y la consiguiente peacuterdida total de la actividad
enzimaacutetica Dado que es poco lo que se conoce de la estructura y mecanismo
de accioacuten de esta proteiacutena PgsB es imposible poder determinar con mayor
detalle el coacutemo pueden darse este cambio en la proteiacutena aunque casos
similares se observan durante la desnaturalizacioacuten de proteiacutenas por
temperatura donde las enzimas que operan sobre muacuteltiples sustratos no
pierden su capacidad enzimaacutetica de manera total sobre todos ellos sino que
inicialmente acontece una peacuterdida de afinidad diferenciada seguacuten el sustrato
hasta llegar al punto de desnaturalizacioacuten total donde se pierde toda actividad
enzimaacutetica para todos los sustratos
De igual manera es conocido que existe en Bacillus licheniformis una
enzima racemasa de naturaleza citosoacutelica responsable de transformar el aacutecido
L-glutaacutemico en aacutecido D-glutaacutemico podriacutea entonces tambieacuten asumirse alguacuten
efecto de la presioacuten sobre la actividad de la misma Sin embargo el hecho de
que esta enzima no esteacute asociada a una membrana celular (las proteiacutenas
asociadas a membrana celular tienden a ser maacutes vulnerables a los cambios de
presioacuten por la complejidad e indispensabilidad de su estructura terciaria sobre
su funcioacuten y su anclaje) sea una enzima de un uacutenico dominio y a que
experimentalmente el contenido de aacutecido D-glutaacutemico inclusive a la maacutexima
presioacuten (241 bar) no es cero hacen suponer que la misma se encuentra
bioloacutegicamente activa bajo las condiciones de presioacuten evaluadas
Estos resultados son de suma importancia pues para aplicaciones
biomeacutedicas y farmaceacuteuticas es necesario que el γ-PGA presente un alto
contenido en aacutecido L-glutaacutemico isoacutemero que es reconocido por el organismo
humano El efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre esta composicioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 95
enantiomeacuterica constituye un descubrimiento que pueda facilitar el empleo del γ-
PGA en medicina y que puede ser clave en el disentildeo de un proceso productivo
optimizado para tal fin
711 Peso molecular del γshyPGA En lo correspondiente al peso molecular del γ-PGA se observa que el
tamantildeo del poliacutemero es grande aunque no se observa ninguna tendencia en
los datos que pueda suponer alguacuten efecto de la presioacuten sobre el peso
molecular del poliacutemero Es importante sentildealar que la columna cromatograacutefica
empleada es incapaz de resolver moleacuteculas del alto peso molecular por lo
cual aunque si bien los resultados obtenidos resulten uacutetiles a nivel
comparativo dichos resultados deben tomarse con precaucioacuten Para un mejor
anaacutelisis seriacutea necesario emplear una columna capaz de resolver altos pesos
moleculares
Es importa sentildealar ademaacutes que tal y como se comentoacute anteriormente y
como se muestra en la figura 12 se observa una reduccioacuten del peso molecular
al prolongar el tiempo de fermentacioacuten hasta las 36 horas Para el caso del
reactor AHCJ32 al prolongar el tiempo de fermentacioacuten por 18 horas maacutes se
nota una reduccioacuten en la fraccioacuten de mayor peso molecular y un incremento en
la de menor sin que haya un cambio importante en el rendimiento global Esto
podriacutea deberse a que Bacillus licheniformis ATCC9945a posee enzimas
capaces de hidrolizar el γ-PGA y emplearlo como fuente de carbono Asiacute
mismo dicha observacioacuten sentildeala que si es necesario prolongar el tiempo de
fermentacioacuten es requerido realizar ajustes pues parece ser que la prolongacioacuten
por siacute misma uacutenicamente no es garantiacutea de una mejora en el rendimiento del
proceso fermentativo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 96
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 97
10 CONCLUSIONES
De la elaboracioacuten de la presente investigacioacuten se pueden extraer las
siguientes conclusiones principales
1) El rendimiento promedio en γ-PGA para el cultivo en matraz fue
superior a los 45 gL Dicho rendimiento es el mayor que se haya
reportado hasta la fecha para Bacillus licheniformis ATCC9945a lo
que convierte a esta cepa en una de las que mejor rendimiento
maacuteximo reporta para la biosiacutentesis de dicho poliacutemero natural
2) Un mecanismo eficiente para la conservacioacuten de cultivos de Bacillus
licheniformis ATCC9945a en un estado competente de produccioacuten
de γ-PGA es el congelamiento de ceacutelulas vegetativas a una
temperatura de -80 ordmC Es importante que la absorbancia de las
muestras congeladas sea superior a 25 lo que garantiza una alta
concentracioacuten de ceacutelulas
3) Dada la naturaleza del γ-PGA y su viscosidad el aumento de su
concentracioacuten en el caldo de cultivo a lo largo del tiempo de
fermentacioacuten afecta de manera negativa la tasa de transferencia de
oxiacutegeno disminuyeacutendola paulatinamente El cambio a condiciones
anaeroacutebicas conlleva a la detencioacuten de la biosiacutentesis del γ-PGA y el
consecuente inicio de un metabolismo netamente anaeroacutebico
4) Bacillus licheniformis ATCC9945a es capaz de crecer eficientemente
a presiones de hasta 242 bar relativos no vieacutendose afectado desde
el punto de vista de viabilidad por el incremento de la variable
presioacuten de fermentacioacuten
5) La presioacuten de fermentacioacuten afecta de manera significativa la
productividad de Bacillus licheniformis ATCC9945a en γ-PGA
6) El incremento de la presioacuten de fermentacioacuten hasta los 103 bar
relativos aumenta la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo de cultivo
seis veces (de 218 gL a 1334 gL) en comparacioacuten a los
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 98
rendimientos obtenidos a presioacuten atmosfeacuterica para un periacuteodo de
proceso de 18 horas
7) A presiones de fermentacioacuten superiores a los 103 bar la
productividad decae en comparacioacuten a la obtenida a dicha presioacuten
sin embargo la misma sigue siendo superior a la obtenida a presioacuten
atmosfeacuterica para un periacuteodo de proceso de 18 horas
8) El aumento de la presioacuten probablemente incremente la tasa de
transferencia de oxiacutegeno al incrementar la concentracioacuten de
saturacioacuten del mismo en el medio de cultivo lo que genera un
gradiente de concentracioacuten que permite una mayor transferencia
9) Presiones superiores a 103 bar probablemente afecten estructuras
celulares o biomoleacuteculas tales como las membranas celulares y las
proteiacutenas (γ-PGA sintasa) lo que tiene un efecto perjudicial sobre la
biosiacutentesis de γ-PGA
10) A una temperatura de 30 ordmC y a una presioacuten de 103 bar la
intensidad de agitacioacuten oacuteptima es de 300 rpm Una magnitud de
agitacioacuten mayor produce el dantildeo celular posiblemente por un exceso
de tensioacuten cortante
11) La presioacuten de fermentacioacuten modifica la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA A presioacuten atmosfeacuterica el γ-PGA estaacute compuesto
mayoritariamente por aacutecido D-glutaacutemico A presiones entre 052 y
242 bar dicha composicioacuten se revierte siendo el aacutecido L-glutaacutemico
el isoacutemero maacutes comuacutenmente presente en el γ-PGA
12) La biosiacutentesis de γ-PGA a presioacuten constituye una forma eficiente de
producir un biopoliacutemero mayoritariamente conformado por residuos
de aacutecido L-glutaacutemico aspecto de vital importancia para su aplicacioacuten
biomeacutedica dado que es este isoacutemero del aacutecido glutaacutemico es que es
reconocido y asimilado por el organismo humano
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 99
13) Aunque la modificacioacuten de la presioacuten de fermentacioacuten nunca ha sido
una variable importante en el estudio de los rendimientos para
distintos bioprocesos la presente investigacioacuten demuestra que la
modificacioacuten de dicha variable no soacutelo permite mejorar el
rendimiento global del proceso sino que tambieacuten puede conllevar a
la modificacioacuten del producto final lo que significariacutea una nueva rama
para la investigacioacuten en el disentildeo de bioprocesos de intereacutes
industrial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 100
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 101
11 AGRADECIMIENTOS
Un agradecimiento especial al profesor Jordi Bou por brindarme la
oportunidad de trabajar a su lado en este proyecto por el seguimiento y
asesoriacutea brindada a lo largo del mismo que nos permitioacute alcanzar nuestros
planteamientos y objetivos Espero que los aportes brindados con la presente
investigacioacuten permitan un mejor desarrollo en el futuro de estas temaacuteticas tan
novedosas biopoliacutemeros y fermentaciones bajo condiciones de presioacuten
positiva
Igualmente a la Ing Alejandra Hernaacutendez por la colaboracioacuten y asistencia
brindada durante esta investigacioacuten fue un apoyo importante durante el
desarrollo de las metodologiacuteas y distintas pruebas que se requirieron a lo largo
de esta investigacioacuten
A la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el Desarrollo
(AECID) y a Casa Ameacuterica Cataluntildea que me brindaron la oportunidad de cursar
este programa de maacutester a traveacutes de su programa de extensioacuten de becas a
ciudadanos extranjeros ha sido una oportunidad de crecimiento personal y
profesional que alcanza su punto maacuteximo con la elaboracioacuten de la presente
investigacioacuten El conocimiento adquirido sin duda alguna seraacute un valioso
compantildeero en mi desempentildeo profesional futuro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 102
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 103
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Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 10
cA
Concentracioacuten de saturacioacuten de oxiacutegeno Maacutexima concentracioacuten de oxiacutegeno que pueda estar disuelto en una fase liacutequida perfectamente mezclada
cA Concentracioacuten de oxiacutegeno en el liacutequido o concentracioacuten real Es determinada experimentalmente haciendo uso de una sonda de oxiacutegeno disuelto
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 11
4 PREFACIO
21 Origen del proyecto
Este proyecto forma parte de una serie de estudios llevados a cabo en
el ETSEIB referentes al empleo y produccioacuten de biopoliacutemeros en Cataluntildea
Anteriormente no solo se ha investigado en torno a la produccioacuten mediante
fermentacioacuten del biopoliacutemero aacutecido poliglutaacutemico sino tambieacuten sobre la
produccioacuten de aacutecido polilaacutectico y su biodegradabilidad entre otros
Una de las principales limitantes que han encontrado los estudios
previos sobre produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico en medio liacutequido mediante
fermentacioacuten sumergida es la dificultad del escalamiento muy probablemente
debido a la reduccioacuten en la tasa de transferencia de oxiacutegeno al aumentar los
voluacutemenes de cultivo lo que conlleva a rendimientos pobres o a la generacioacuten
de un poliacutemero de bajo peso molecular Asiacute mismo la reproducibilidad de los
resultados es pobre en parte por muacuteltiples factores que fueron estudiados con
mayor detalle en este trabajo
Con el propoacutesito de dar solucioacuten a este problema el presente proyecto
plantea una forma diferente y creativa al menos no es la comuacuten en el aacutembito
microbioloacutegico de abordar la limitacioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
durante la fermentacioacuten y que podriacutea ser la responsable de la reduccioacuten en los
rendimientos Asiacute mediante la aplicacioacuten de condiciones de presioacuten positiva se
plantea una posible viacutea de mejora de los rendimientos fermentativos en la
produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico esperando que sus efectos sobre la
viabilidad microbiana sean los menores posibles
22 Motivacioacuten
En la sociedad actual existe una creciente buacutesqueda de soluciones
bioloacutegicas para los problemas que anteriormente abordaacutebamos desde una
percepcioacuten uacutenicamente quiacutemica Asiacute hoy en diacutea con el propoacutesito de garantizar
la preservacioacuten del medio ambiente reducir el impacto de la actividad humana
sobre las especies animales y vegetales y garantizar un planeta a las futuras
generaciones la palabra biopoliacutemero y bioplaacutestico se han vuelto maacutes y maacutes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 12
comunes tanto en el argot popular como en el aacutembito del conocimiento
cientiacutefico donde diacutea con diacutea son maacutes las investigaciones orientadas a este tipo
de productos de naturaleza bioloacutegica y por consiguiente biodegradable
El aacutecido poliglutaacutemico por sus caracteriacutesticas constituye un poliacutemero
natural que ofrece una amplia gama de aplicaciones industriales donde puede
ser empleado tanto como agente espesante o floculador hasta aplicaciones
maacutes novedosas relacionadas con la medicina y la farmacia
En este contexto de buacutesqueda de soluciones amigables con el ambiente
es donde surge la principal motivacioacuten para investigar sobre el aacutecido
poliglutaacutemico en particular sobre coacutemo aumentar la productividad del proceso
fermentativo a partir del cual se realiza su siacutentesis de modo que las ventajas
teoacutericas que ofrece este producto pronto esteacuten disponibles tanto para el
consumidor como para la industria Tristemente los productos biotecnoloacutegicos
casi siempre tienen como principal inconveniente la valoracioacuten econoacutemica
pues tienden a ser difiacuteciles de producir por lo que tienen altos costos
asociados o sus rendimientos son menores a los deseados para hacerlos
econoacutemicamente rentables Por este motivo las investigaciones deben
procurar al menos orientarse a ofrecer soluciones que alguacuten diacutea puedan ser
llevadas a la praacutectica o como sucede con esta investigacioacuten procurar dar
respuesta a los problemas que se enfrentan cuando se trata de llevar un
producto biotecnoloacutegico a la realidad
La importancia de la investigacioacuten biotecnoloacutegica en el campo de los
materiales radica en que en un mundo con materias primas limitadas
particularmente las fuentes foacutesiles los materiales del futuro tendraacuten un origen
maacutes bioloacutegico que mineral o extractivo por lo que la mejora de los procesos
productivos relacionados con estos productos son prioritarios para cualquier
paiacutes que desee mantenerse competitivo en el aacutembito econoacutemico y tecnoloacutegico
mundial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 13
5 INTRODUCCIOacuteN
En la actualidad el desarrollo de biomateriales constituye uno de los
principales ejes de investigacioacuten en el mundo de la ciencia Dentro de estos
biomateriales los biopoliacutemeros han logrado un particularmente alto grado de
atencioacuten especialmente en los uacuteltimos 30 antildeos debidos a sus muacuteltiples
aplicaciones industriales biomeacutedicas y farmaceacuteuticas que estaacuten aportando una
amplia gama de opciones y soluciones a problemas ambientales y en la
formulacioacuten de nuevas preparaciones biomeacutedicas y farmaceacuteuticas
Los biopoliacutemeros son materiales polimeacutericos o macromoleculares que
son sintetizados por seres vivos Debido en gran parte al precio creciente la
viabilidad declinante de las fuentes foacutesiles como materias primas asiacute como el
ritmo crecimiento de la poblacioacuten mundial han propiciado el desarrollo de
fuentes alternativas renovables capaces de suministrar las necesidades
mundiales crecientes en material de energiacutea y produccioacuten quiacutemica Esta
necesidad de nuevas fuentes alternativas ha permitido que la mirada cientiacutefica
se halle puesta sobre la diversidad microbiana que habita el planeta pues los
microorganismos siempre han demostrado ser una fuente importante de
materiales novedosos con la ventaja que en la actualidad se dispone de la
tecnologiacutea necesaria para crecer los microorganismos de manera masiva y
segura Este nuevo modelo conocido como la estrategia de las biorefineriacuteas
ha cambiado la concepcioacuten de la industria quiacutemica moderna y ha sido
empleada exitosamente en la produccioacuten convencional a granel de diversos
productos quiacutemicos como por ejemplo etanol glutamato y aacutecido ciacutetrico
En el presente la produccioacuten de poliacutemeros o monoacutemeros tales como el
13-propanediol el aacutecido polilaacutectico y los polihidroxialcanoatos ha sido uno de
los principales objetivos de mayor investigacioacuten Dentro de estos nuevos
materiales encontramos los poliaminoaacutecidos poliamidas de naturaleza
polimeacuterica cuyos constituyentes estaacuten unidos por enlaces del tipo amida El
aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) es uno de estos poliaminoaacutecidos un poliacutemero
biodegradable constituido por unidades de D- y L-aacutecido glutaacutemico y que es
producido de manera natural en algunas bacterias
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 14
El presente trabajo procura investigar sobre algunas de las condiciones
involucradas en la produccioacuten bacteriana de γ-PGA y que constituyen las
principales barreras que impiden alcanzar los rendimientos necesarios para
que la produccioacuten bioloacutegica de este poliacutemero sea viable tanto desde el punto de
vista bioloacutegico como econoacutemico
31 Objetivos
El objetivo general a partir del cual se estructura el desarrollo de la
presente investigacioacuten es
Estudiar la produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a y el efecto que tiene sobre el rendimiento y estructura del
producto factores propios de la ingenieriacutea quiacutemica como lo son la
presioacuten y la intensidad de agitacioacuten
Los objetivos especiacuteficos que se plantearon alcanzar en el siguiente
proyecto son los siguientes
Disentildear un biorreactor que permita realizar fermentaciones a presioacuten
positiva de hasta 4 bar absolutos
Describir las condiciones baacutesicas requeridas para lograr reproducibilidad
en la produccioacuten deaacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre el rendimiento de
produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico en gL por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre la composicioacuten
enantiomeacuterica y el peso molecular del aacutecido γ-poliglutaacutemico
Establecer el posible efecto de la presioacuten positiva sobre la tasa de
transferencia de oxiacutegeno en el biorreactor
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 15
6 MARCO TEOacuteRICO
41 Los poliaminoaacutecidos
Los poliaminoaacutecidos son poliamidas formadas por un uacutenico aminoaacutecido
y difieren de las proteiacutenas en muacuteltiples aspectos Las proteiacutenas son
biomoleacuteculas compuestas por una amplia gama de aminoaacutecidos mientras que
los poliaminoaacutecidos estaacuten compuestos uacutenicamente por un solo tipo de
aminoaacutecido al menos en su eje central La siacutentesis de proteiacutenas estaacute dirigida
por el ADN que controla la secuencia especiacutefica de aminoaacutecidos que termina
formando una moleacutecula de una proteiacutena en particular Por su parte los
poliaminoaacutecidos son sintetizados por una ruta metaboacutelica de los organismos
completamente distinta En enlace amida en las proteiacutenas acontece
uacutenicamente entre los grupos α-amino y α-carboxilo mientras que en los
poliaminoaacutecidos pueden verse involucradas otras cadenas laterales
funcionales como por ejemplo los grupos β- y γ-carboxiloy ε-amino(Bajaj amp
Singhal 2011)
Existen mayoritariamente tres poliaminoaacutecidos presentes en la
naturaleza el aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina En
el aacutecido γ-poliglutaacutemico los enlaces amida se forman entre el grupo α-amino y
el γ-carboxilo en el eje central La poli ε-lisina presenta monoacutemeros de lisina
unidos por los grupos α-carboxilo y ε-amino La cianoficina consiste en residuos
de aacutecido α-aspaacutertico que contienen residuos de arginina que penden unidos al
grupo β-carboxilo Las foacutermulas de dichos compuestos se presentan en la
figura 1
42 El aacutecido γshypoliglutaacutemico (γshyPGA)
El aacutecido γ-poliglutaacutemico (de ahora en adelante referido como γ-PGA) es
un poliacutemero inusual que acontece de forma natural anioacutenico soluble en agua
biodegradable comestible y que no resulta toacutexico ni para el ser humano ni para
el ambiente que en la naturaleza es producido por algunas bacterias todas
Gram-positivas una archea e inclusive en eucariotas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 16
Fue primeramente descubierto por Ivaacutenovics y colaboradores como
componente de la caacutepsula de la bacteria Bacillus anthracis despueacutes que se
liberara al medio producto tanto del proceso de autoclavado como por el
envejecimiento y lisis natural de los cultivos La comida tradicional japonesa
ldquoNattordquo estaacute constituida por una mezcla de γ-PGA y fructanos que son
producidos por la bacteria Bacillus natto (Bajaj amp Singhal 2011)
Figura 1 Foacutermula y estructura del aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina
(Fuente Feng et al 2007)
421 Propiedades quiacutemicas y bioquiacutemicas del γshyPGA
El γ-PGA es un poliacutemero polianioacutenico que puede estar compuesto
uacutenicamente por D- L- o por ambos enantioacutemeros del aacutecido glutaacutemico Como se
ha comentado ya es altamente soluble en agua El γ-PGA probablemente
pueda adoptar diferentes estructuras La estructura del γ-PGA ha sido predicha
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 17
asumiendo poliaminoaacutecidos constituidos por 10 o 25 moleacuteculas de aacutecido
glutaacutemico Este modelo teoacuterico calculado para una moleacutecula en solucioacuten
acuosa muestra que el γ-PGA consiste de una heacutelice levoacutegira estabilizada por
enlaces de hidroacutegeno intramoleculares Sin embargo otro estudio realizado a
partir de γ-PGA obtenido de Bacillus licheniformis mostroacute que la conformacioacuten
es realmente flexible y depende de la concentracioacuten de γ-PGA y el pH de la
disolucioacuten A bajas concentraciones (01 wv) y a un pH inferior a 7 el γ-PGA
adopta una conformacioacuten basada mayoritariamente en heacutelices del tipo α
mientras que la conformacioacuten tipo hojas β predomina a pH superiores pues
esta conformacioacuten permite una mejor exposicioacuten de las cargas negativas del γ-
PGA (Candelaamp Fouet 2006) Recientemente mediamente experimentos de
dicroiacutesmo circular se ha reportado una estructura desordenada (Joyce et al
2006 Candela amp Fouet 2006) pero sin detallar las condiciones de trabajo de
los experimentos en particular de pH
El peso molecular del γ-PGA parece variar seguacuten sea el organismo que
produce la moleacutecula sin embargo estas diferencias podriacutean deberse a
diferencias en torno a la degradacioacuten natural que acontece con el poliacutemero o a
los meacutetodos de purificacioacuten y anaacutelisis utilizados mismos que puedan afectar el
tamantildeo del γ-PGA Por ejemplo para el caso de Bacillus subtilis el peso
molecular del γ-PGA variacutea entre 160kDa hasta 1500 kDa las cadenas de γ-
PGA consisten entonces de coacutemo miacutenimo 1000 residuos de aacutecido glutaacutemico
Diferentes estudios enfocados en la siacutentesis microbioloacutegica de γ-PGA han
demostrado que el peso molecular de este poliacutemero es dependiente tanto de
las diversas cepas bacterianas que se empleen asiacute como de los componentes
del medio y las condiciones del medio de cultivo e inclusive de razones auacuten no
dilucidadas De alliacute que exista una gran dificultad para obtener un γ-PGA
altamente homogeacuteneo a partir de cultivos bacterianos esto en gran parte
debido a esta inestabilidad descrita asiacute como a la complejidad molecular
involucrada en su biosiacutentesis
Asiacute mismo el γ-PGA puede contener soacutelo aacutecido D-glutaacutemico soacutelo aacutecido
L-glutaacutemico o una mezcla de ambos enantioacutemeros De alliacute que los filamentos
puedan ser de aacutecido γ-poli-L-glutaacutemico (γ-PLGA) de aacutecido γ-poli-D-glutaacutemico
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 18
(γ-PDGA) o de aacutecido γ-poli-L-D-glutaacutemico (γ-PLDGA) La disposicioacuten de los
residuos en el PLGDA requiere un especial anaacutelisis ya que si bien tanto el
PLGA y el PDGA son ambos solubles en etanol cuando ambos se mezclan en
proporcioacuten equimolar precipitan en etanol Esta observacioacuten es utilizada para
demostrar que el γ-PGA producido por Bacillus licheniformis estaacute compuesto
por cadenas tanto de PLGA como de PDGA Asiacute mismo la digestioacuten con L-
glutamilhidrolasa ha demostrado que el γ-PGA de Bacillus subtilis consiste en
una mezcla de isoacutemeros PLGA y PLDGA
422 Siacutentesis microbioloacutegica de γshyPGA
Distribucioacuten en los microorganismos
Inicialmente el γ-PGA fue detectado como un componente de la pared
capsular de la altamente patogeacutenica bacteria Gram-positiva Bacillus anthracis
Posteriormente este poliacutemero seriacutea nuevamente encontrado presente alrededor
de ceacutelulas de otras bacterias Gram-positivas no patogeacutenicas particularmente
del geacutenero Bacillus Gracias a estos descubrimientos fue posible aislar a inicios
del siglo pasado una cepa de Bacillus capaz de producir grandes cantidades de
γ-PGA
Posteriormente y de manera adicional a estas bacterias formadoras de
endosporas del geacutenero Bacillus el γ-PGA fue encontrado en las eubacterias
haloacutefilas Sporosarcina halophila y Planococcus halophilus y en la
archeobacteria haloacutefila Natrialba aegyptiaca Asiacute mismo γ-PGA fue tambieacuten
detectado en cantidades significativas en nematocistos de Cnidaria (eucariota)
En la tabla 1 se presentan los principales organismos productores de γ-
PGA y algunas de las caracteriacutesticas del γ-PGA producido
Ruta de biosiacutentesis
La conversioacuten de glucosa a γ-PGA sugiere que la siacutentesis del poliacutemero
acontece durante la glicoacutelisis y el ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos (ciclo de
Krebs o del aacutecido ciacutetrico) hasta el 2-oxoglurato (α-cetoglutarato) que es un
precursor directo del aacutecido L-glutaacutemico Durante su crecimiento en un medio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 19
Tabla 1 Organismos que han sido reportados como productores de γ-PGA
ORGANISMO CONFORMACIOacuteN CONFORMACIOacuteN DEL FILAMENTO
Bacillus anthracis D D
Bacillus mesentericus D D
Bacillus licheniformis D y L D y L
Bacillus megaterium D y L D + L
Bacillus pumilus D y L ND
Bacillus subtilis D y L L y D+L
Planococcus halophilus D D
Sporosarcina halophila D D
Staphylococcus
epidermidis
D y L ND
Natrialba aegyptiaca L L
Hydra ND ND
Fuente (Candela amp Fouet 2006)
nutritivo Bacillus licheniformis expresa dos enzimas capaces de sintetizar el
aacutecido L-glutaacutemico la glutamato sintasa y la glutamato deshidrogenasa Ambas
enzimas son praacutecticamente insensibles a la inhibicioacuten por producto lo que
permite alcanzar altas concentraciones intracelulares de aacutecido L-glutaacutemico el
cual es entonces direccionado a la siacutentesis de γ-PGA Los estudios maacutes
detallados relacionados con la polimerizacioacuten del γ-PGA se han realizado con
Bacillus anthracis Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis especialmente
Bacillus licheniformis ATCC9945a lo que ha permitido la identificacioacuten de un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 20
sistema enzimaacutetico anclado a la membrada y denominado como PGA-
sintetasa Este sistema enzimaacutetico estaacute constituido por al menos tres
componentes con actividad enzimaacutetica y se presume que cataliza la siguiente
secuencia de reacciones (Troy 1973) (figura 2)
Aacutecido L-glutaacutemico + ATP ɣ-L-glutamil-AMP + PPi (a)
ɣ-L-glutamil-AMP + SH-enzima ɣ-X-glutamil-S-enzima + AMP (b)
ɣ-X-glutamil-S-enzimaɣ-D-glutamil-S-enzima (c)
ɣ-D-glutamil-S-enzima + [ɣ-D-glutamil]n[ɣ-D-glutamil]n+1 + SH-enzima (d)
Figura 2 Posible mecanismo enzimaacutetico de siacutentesis del γ-PGA (Fuente Ashiuchi 2010)
De acuerdo con este modelo solamente el aacutecido L-glutaacutemico es activado
en el paso (a) mediante fosforilacioacuten lo que significa que la biosiacutentesis del γ-
PGA requiere el suministro de energiacutea para la formacioacuten del enlace amida Maacutes
recientemente un segundo mecanismo ha sido descrito por Ashiuchi (2001) e
involucra un complejo enzimaacutetico denominado PgsBCA el cual es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico y donde la
polimerizacioacuten ocurre por un mecanismo de ligacioacuten tipo amida (figura 3)
Inicialmente se habiacutea descrito que el complejo enzimaacutetico era el responsable
de racemizar y polimerizar el aacutecido glutaacutemico sin embargo estas nuevas
evidencias parecen demostrar que el complejo enzimaacutetico involucrado en la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 21
siacutentesis de γ-PGA carece de actividad racemasa y que la formacioacuten del aacutecido
D-glutaacutemico es responsabilidad de una enzima citosoacutelica denominada aacutecido
glutaacutemico racemasa Glr que presenta una alta selectividad por el aacutecido
glutaacutemico y una mayor preferencia por el aacutecido L-glutaacutemico Un modelo de la
viacutea metaboacutelica mayoritariamente aceptada para la siacutentesis de γ-PGA se
presente en la figura 4
Figura 3 Mecanismo propuesto de biosiacutentesis del γ-PGA mediante ligacioacuten tipo amida
(Fuente Ashiuchi 2001)
Figura 4 Viacutea metaboacutelica de biosiacutentesis del γ-PGA (Fuente Buescher amp Margaritis 2007)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 22
Organizacioacuten geneacutetica
Solamente unas pocas bacterias la mayoriacutea dentro del geacutenero Bacillus
han sido reportadas como capaces de producir γ-PGA Asiacute mismo la
produccioacuten de γ-PGA no es uniforme en estos individuos inesperadamente
variacutea inclusive bajo condiciones de cultivo altamente estrictas De alliacute que la
identificacioacuten del sistema regulatorio y los genes involucrados en dicho sistema
es vital para dar solucioacuten a estos problemas de uniformidad y rendimiento El
complejo PGA-sintetasa estaacute codificado por cuatro loci que son denominados
pgs Los cuatro genes pgs son pgsB pgsC pgsAA y pgsE y se les denomina
en conjunto pgsBCA Todos estos genes son necesarios y suficientes para la
produccioacuten de γ-PGA in vivo La figura 5 muestra los elementos geneacuteticos
requeridos para la produccioacuten de γ-PGA en diferentes especies del genero
Bacillus
Figura 5 Elementos geneacuteticos necesarios para la siacutentesis de γ-PGA (Fuente Candela amp
Fouet 2006)
423 Produccioacuten fermentativa de γshyPGA
Diferentes cepas de bacterias del geacutenero Bacillus son capaces de
producir elγ-PGA ya sea como material viscoso extracelular o como
componente capsular En termino industrial estas cepas han sido las maacutes
utilizadas y por ende las maacutes estudiadas hasta el momento La mayor parte de
los estudios han estado orientados a determinar los requerimientos
nutricionales para el adecuado crecimiento celular asiacute como mejorar la
productividad de γ-PGA y la variacioacuten en la composicioacuten de su estructura en lo
referente al contenido de aacutecido L- y D-glutaacutemico Estos estudios como los
realizados por Troy (1973) Cromwicket al (1995) y Kunioka (1997) han
permitido determinar que los requerimientos nutricionales para la produccioacuten de
γ-PGA variacutean seguacuten sea la cepa que se emplea
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 23
De acuerdo a estos requerimientos nutricionales las cepas productoras
de γ-PGA se han dividido en dos grupos uno que requiere la adicioacuten de aacutecido
L-glutaacutemico al medio de cultivo para estimular la produccioacuten de γ-PGA y el
crecimiento celular y otro que no requiere de aacutecido L-glutaacutemico para la
produccioacuten de γ-PGA
Dentro de las bacterias dependientes de aacutecido L-glutaacutemico las cepas
maacutes promisorias han sido B anthracis B licheniformis ATCC9945a B subtilis
IFO3335 y B subtilis F-2-01 Por su parte dentro de las bacterias
independientes de aacutecido L-glutaacutemico encontramos mayoritariamente los caso s
de B subtilis 5E B subtilis TAM-4 y B licheniformis A35 B subtilis 5E puede
producir γ-PGA a partir de L-prolina como uacutenica fuente de carbono
complementado con una fuente de nitroacutegeno en un medio mineral B
licheniformis A35 produce γ-PGA a partir de glucosa y cloruro de amonio en
condiciones desnitrificantes y B subtilis TAM-4 produce grandes cantidades de
γ-PGA cuando crece en un medio de cultivo con una sal de amonio y azuacutecar
como fuentes de nitroacutegeno y carbono respectivamente Asiacute mismo ademaacutes de
la fuente de carbono y nitroacutegeno existen otra serie de factores tales como
fuerza ioacutenica del medio de cultivo pH del medio de cultivo aireacioacuten entre
otros que afectan en gran medida la productividad y calidad del γ-PGA
De primera impresioacuten pareciera conveniente el empleo de las cepas
independientes de aacutecido L-glutaacutemico para la produccioacuten industrial de γ-PGA
sin embargo la informacioacuten disponible en lo referente a la ruta biosinteacutetica el
mecanismo de formacioacuten del γ-PGA y los factores que afectan la productividad
es praacutecticamente nula para estas cepas A partir de los trabajos de
investigacioacuten y los estudios de aplicaciones industriales la produccioacuten de γ-
PGA se ha llevado a cabo mayoritariamente a partir de cepas dependientes de
aacutecido L-glutaacutemico
En la tabla 2 se presentan algunas de las principales cepas bacterianas
empleadas para la produccioacuten de γ-PGA los nutrientes las condiciones de
cultivo el rendimiento obtenido asiacute como los voluacutemenes de cultivo en que se
basan dichos reportes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 24
Tabla 2 Principales bacterias productoras de γ-PGA (Shih amp Van 2001)
CEPA
NUTRIENTES
CONDICIONES DE CULTIVO
RENDIMIENTO
VOLUMEN DE
TRABAJO B licheniformis ATCC9945a
Aacutecido glutaacutemico (20 gL) aacutecido ciacutetrico (12 gL) NH4Cl (7 gL)
30ordmC 4 diacuteas 17-23 gL 100 mL
B subtilis IFO 3335
Aacutecido glutaacutemico (30 gL) aacutecido ciacutetrico (20 gL)
37ordmC 2 diacuteas 10-20 gL 125 mL
B subtilis TAM-4
Fructosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 4 diacuteas 20 gL 100 mL
B licheniformis A35
Glucosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 3-5 diacuteas 8-12 gL 100 mL
B subtilis F02-1
Aacutecido glutaacutemico(70 gL) glucosa (1 gL)
30ordmC 2-3 diacuteas 50 gL 200 mL
B subtilis (natto)
Maltosa (60 gL) salsa de soya (70 gL) glutamato soacutedico (30 gL)
40 ordmC 3-4 diacuteas 35 gL 125 mL
Fuente Shih amp Van 2001
424 Produccioacuten de γshyPGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a
Generalidades de la bacteria Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis es una bacteria comuacutenmente encontrada en el
suelo y en las plumas de las aves Es gram-positiva de forma oval y mesoacutefila
Su temperatura oacuteptima de crecimiento se encuentra alrededor de los 30 ordmC
aunque es capaz de sobrevivir a temperaturas mucho mayores La temperatura
oacuteptima para la secrecioacuten de enzimas es de 37 ordmC Esta bacteria puede existir
como espora cuando las condiciones son inadecuadas o en estado vegetativo
cuando las condiciones le son maacutes favorables (Wecke et al 2006)
Bacillus licheniformis forma parte del grupo Subtilis junto con Bacillus
subtilis y Bacillus pumilus Estas bacterias son conocidas por ser
contaminantes comunes de alimentos asiacute como favorecer su descomposicioacuten
aunque no se consideran patoacutegenos de importancia para el ser humano
(Wecke et al 2006)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 25
La cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis y la siacutentesis de γ-PGA
La produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a fue
primeramente estudiada por Bovarnick en 1942 sin embargo no fue sino a
partir de 1954 cuando Thorne y colaboradores iniciaron una serie de estudios
sistemaacuteticos orientados a investigar los factores que afectan la produccioacuten de
γ-PGA lo que permitioacute determinar algunos factores y condiciones necesarios
para lograr mayores rendimientos Factores tales como presencia de ciertas
sales inorgaacutenicas aacutecido glutaacutemico aacutecido ciacutetrico glicerol y el tamantildeo del inoacuteculo
demostraron tener efectos importantes sobre el rendimiento de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a tanto en condiciones estaacuteticas como cultivos
bajo agitacioacuten Se encontroacute que los mejores rendimientos se produciacutean cuando
el microorganismo era cultivado en agitacioacuten orbital en un medio de cultivo
denominado como medio C (tabla 3) alcanzando una productividad de hasta
15 gL en un periacuteodo de 3-4 diacuteas Asiacute mismo la mayor produccioacuten de poliacutemero
soacutelo se alcanzaba cuando se empleaba agua de grifo y un lote especiacutefico de
FeCl3 Posteriormente se determinariacutea que dicho lote de FeCl3 estaba
contaminado con trazas de Mn2+ y que el agua de grifo conteniacutea cantidades
significativas de Ca2+ Posteriormente Leonard y colaboradores (1958) se
encargariacutean de comprobar la funcioacuten y concentracioacuten oacuteptima de ambos
elementos quiacutemicos mediante la elaboracioacuten de un medio de cultivo
quiacutemicamente definido tomando como base el medio C de Thorne
Tabla 3 Composicioacuten del medio de cultivo C (Thorne et al 1954)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua de grifo
Fuente Shih amp Van 2001
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 26
Leonard y colaboradores encontraron que aunque solamente se requeriacutea
de 15 x 10-7 moles por litro de Mn2+ para alcanzar el maacuteximo crecimiento
concentraciones mayores de Mn2+ mostraban un marcado efecto prolongando
la viabilidad celular y por consiguiente incrementando la productividad de γ-
PGA Un incremento de hasta 615 x 10-4 molL en la concentracioacuten de Mn2+
permitiacutea alcanzar los mayores rendimientos de γ-PGA De igual manera la
adicioacuten de 102 x 10-3 moles por litro de Ca2+ en presencia de 15 x 10-7 moles
por litro de Mn2+ permitiacutea alcanzar auacuten mayores rendimientos deγ-PGA en
comparacioacuten a los valores oacuteptimos de produccioacuten de poliacutemero obtenidos en
ausencia de este elemento El γ-PGA producido consistiacutea en un homopoliacutemero
de unidades repetidas de aacutecido D- y L-glutaacutemico con una concentracioacuten de
aacutecido D-glutaacutemico que variaba entre el 38 y el 86 seguacuten incrementaba la
concentracioacuten de Mn2+ entre 154 x 10-7 y 246 x 10-3 molL siendo esta
observacioacuten independiente de la concentracioacuten presente en el medio de cultivo
de Ca2+
Tabla 4 Composicioacuten del medio E revisado (Leonard et al 1958)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 0000026 a
042 CaCl22H2O 015 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua destilada
Fuente Shih amp Van 2001
A partir de estos resultados Leonard y colaboradores elaboraron el
medio de cultivo denominado Medio E (tabla 4) que es baacutesicamente el medio
original C exceptuando el hecho de que cantidades definidas de Mn2+ y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 27
Ca2+fueron agregadas El Ca2+ fue adicionado con el propoacutesito de asegurar
altas productividades de poliacutemero a cualquier concentracioacuten de Mn2+ que se
empleara mientras que la variacioacuten de la concentracioacuten de este uacuteltimo
elemento permitiriacutea alcanzar el contenido enantiomeacuterico deseado en el
poliacutemero tal y como se comentoacute anteriormente
La estereoquiacutemica del poliacutemero es decir el contenido enantiomeacuterico del
γ-PGA ha sido desde el inicio de las investigaciones uno de los problemas maacutes
complejos y de difiacutecil solucioacuten y de una importancia tanto fundamental como
praacutectica en lo que se refiere al estudio de la produccioacuten de γ-PGA en bacterias
A lo largo de todos estos antildeos han existido numerosas contradicciones entre
los investigadores en cuanto a si el contenido enantiomeacuterico del γ-PGA
producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a estaacute o no afectado por la
concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo Cromwick y Gross (1995)
realizaron un estudio profundo sobre los factores que influenciaban la
produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a Dicho estudio
encontroacute que el porcentaje de aacutecido L-glutaacutemico presente en el γ-PGA variaba
entre 59 y 10 cuando las concentraciones de Mn2+ variaban entre 0 y 615
μmolL asiacute mismo el rendimiento incrementaba desde los 5 hasta los 17 gL en
dicho intervalo de concentracioacuten de Mn2+
Cromwick y Gross (1995) encontraron en este mismo estudio que la
incorporacioacuten de Mn2+ al medio de cultivo es un factor criacutetico para la
conservacioacuten de la viabilidad celular durante periodos de cultivo prolongados
El nuacutemero de ceacutelulas viables se incrementaba del orden de 105 a 109 unidades
formadoras de colonias (ufc) para todas las concentraciones de Mn2+ hasta el
inicio de la fase estacionaria aproximadamente a las 24 horas Sin embargo
despueacutes de 50 horas de cultivo la viabilidad celular se veiacutea reducida
draacutesticamente para aquellas concentraciones de Mn2+ relativamente menores
(0 a 0615 μmolL) mientras que para las concentraciones mayores (338 a 615
μmolL) el nuacutemero de ceacutelulas viables se manteniacutea en el orden de 107-109
inclusive despueacutes de 140 horas de cultivo Asiacute mismo la presencia de Mn2+ en
concentraciones entre 338 y 615 μ incrementaba la utilizacioacuten de las fuentes
de carbono en gran medida cultivos que conteniacutean 615 μmolL de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 28
Mn2+utilizaban el 37 54 y 93 del aacutecido glutaacutemico el glicerol y el aacutecido
ciacutetrico respectivamente en comparacioacuten a aquellos cultivos que no
incorporaban el Mn2+ los cuales solo utilizaban el 19 10 y 17 del aacutecido
glutaacutemico el glicerol y el aacutecido ciacutetrico respectivamente
Uno de los problemas maacutes prolongados en torno a los estudios referidos
a la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC994a es el hecho de
que el microorganismo termina degenerando en una cepa incapaz de producir
γ-PGA despueacutes de cultivo repetitivo Esta inestabilidad exhibida por este
microorganismo es responsable de una gran variacioacuten de cultivo en cultivo en
lo referente a la cantidad y la cineacutetica de formacioacuten del γ-PGA Birrer y
colaboradores (1994) encontraron que el empleo de ceacutelulas vegetativas
criogeacutenicamente congeladas permitiacutea alcanzar un crecimiento y produccioacuten de
poliacutemero consistente de cultivo en cultivo Asiacute mismo y en congruencia con
otros estudios previamente realizados se encontroacute que el crecimiento celular
ocurriacutea baacutesicamente durante las primeras 24 h la mayor productividad
volumeacutetrica de γ-PGA era de 012 gmiddotL-1middoth-1 y se alcanzaba entre los diacuteas 2 y 4
el pH caiacutea de 74 a aproximadamente 5 despueacutes de 42 horas de cultivo e
incrementaba levemente a cerca de 6 despueacutes de 96 horas de cultivo el
empleo de glicerol glutamato y citrato se reduciacutea de 80 a 45 gL 18 a 10 gL y
de 12 a 1 gL respectivamente la produccioacuten de aacutecido aceacutetico hasta un nivel
maacuteximo de 45 gL asiacute como la presencia de 23-butanediol como producto
secundario entre las 42 y las 96 h El estudio del consumo de las fuentes de
carbono resulta un poco sorprendente pues demuestra unas tasas de
consumo del aacutecido ciacutetrico y de glicerol relativamente altas sin embargo para el
caso del aacutecido glutaacutemico dicha tasa de consumo fue por mucho menor y muy
lejana del agotamiento completo de dicha fuente Asiacute mismo la remocioacuten del
aacutecido L-glutaacutemico del medio de cultivo E afectaba en poca medida el
rendimiento en γ-PGA mientras que la remocioacuten de las otras fuentes (glicerol y
aacutecido ciacutetrico) disminuye de manera draacutestica la produccioacuten de γ-PGA Estos
resultados son contradictorios a los encontrados inicialmente por Thorne y
colaboradores (1954) e indica que Bacillus licheniformis ATCC9945 no requiere
de aacutecido L-glutaacutemico para alcanzar altas productividades de γ-PGA Asiacute mismo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 29
la presencia de 23-butanediol es indicador que los niveles de oxiacutegeno en el
medio de cultivo despueacutes de 42 horas son incapaces de sostener un
metabolismo 100 aeroacutebico esto no es de sorprender pues el γ-PGA es un
poliacutemero extracelular extremadamente viscoso y tasas cada vez menores de
transporte de oxiacutegeno son esperables conforme va aumentado la viscosidad en
el medio a medida que la concentracioacuten de γ-PGA se incrementa
Un trabajo de Cromwick y Gross (1996) estudioacute el efecto del pH y la
aireacioacuten sobre la productividad en γ-PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a en condiciones de fermentacioacuten por lotes El pH fue controlado en
los valores de 55 65 74 y 825 y se determinoacute su efecto sobre el crecimiento
celular la utilizacioacuten de las fuentes de carbono la productividad en γ-PGA el
peso molecular y la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA El mayor
rendimiento en γ-PGA se obtuvo a un pH de 65 (15 gL 96 horas de cultivo) y
decrecioacute significativamente en 55 y 74 Esto coincide con el hecho que el
consumo de glicerol y de aacutecido L-glutaacutemico se mantuvo invariable en funcioacuten
del pH sin embargo la mayor tasa de consumo de aacutecido ciacutetrico se observoacute a un
pH de 65 en contraste con 55 y 74 lo cual parece indicar que el metabolismo
del aacutecido ciacutetrico juega un papel importante a dicho valor de pH Previamente
Cromwick y Gross (1995) encontraron que el aacutecido ciacutetrico es efectivamente un
precursor en la produccioacuten del poliacutemero presumiblemente a traveacutes del ciclo de
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De igual manera la alteracioacuten del pH no mostroacute
ninguacuten efecto importante en cuanto al peso molecular y la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA El efecto de la aireacioacuten fue evaluado incrementando
la velocidad de agitacioacuten entre 250 y 800 rpm y la tasa de aireacioacuten entre los
05 y los 20 Lmin a un pH de 65 observaacutendose un incremento en las tasas de
crecimiento y los rendimientos de γ-PGA conforme el suministro de oxiacutegeno
incrementaba
A pesar de la intensa investigacioacuten que se ha llevado a cabo en lo
referente a la produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a el
mecanismo y las viacuteas biosinteacuteticas especiacuteficas por las cuales el poliacutemero es
producido auacuten no han logrado ser dilucidadas con total claridad a pesar de que
no se cuestione le hecho de que efectivamente acontece a traveacutes del ciclo de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 30
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De las tres fuentes de carbono presentes en el medio
de cultivo E el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido L-glutaacutemico constituyen dos sustratos
precursores para la produccioacuten de dicho poliacutemero sin embargo en lo referente
al glicerol auacuten no queda claro como este incrementa la formacioacuten de poliacutemero
maacutes allaacute del hecho de que Troy (1973) encontroacute que el complejo enzimaacutetico
PGA-sintetasa responsable de la polimerizacioacuten del aacutecido L-glutaacutemico a γ-
PGA es estimulada por la presencia de glicerol Considerando que la viacutea de
biosiacutentesis del γ-PGA efectivamente involucra el ciclo de los aacutecidos
tricarboxiacutelicos cualquier fuente de carbono no relacionada directamente como
el glicerol o la glucosa podriacutean en principio ser una fuente primaria de carbono
para el crecimiento celular y la produccioacuten de γ-PGA Efectivamente el empleo
de glucosa como principal fuente de carbono y cantidades traza de aacutecido ciacutetrico
y aacutecido L-glutaacutemico (05 gL) permitieron alcanzar un rendimiento en γ-PGA de
12 gL en cultivos de Bacillus licheniformisATCC9945a (Ko amp Gross 1998) Sin
embargo y a pesar de este hecho Du y colaboradores (1995) encontraron otra
posible explicacioacuten al incremento del rendimiento en presencia de glicerol Ellos
encontraron que en Bacillus licheniformis ATCC9945a las altas
concentraciones de glicerol en el medio de cultivo conllevan a un cambio en la
composicioacuten de los fosfoliacutepidos de la membrana celular incrementando la
proporcioacuten de los fosfoliacutepidos C120 y C101 y reduciendo la de fosfoliacutepidos
C181 y C161 lo que parece favorecer la formacioacuten de una membrana celular
menos compacta lo que conlleva a una efectiva excrecioacuten del γ-PGA fuera de
la membrana celular
En lo referente a produccioacuten a gran escala y en buacutesqueda de la
aplicacioacuten comercial del γ-PGA en grandes cantidades resulta maacutes que
evidente la necesidad de incrementar la productividad Yoon y colaboradores
(2000) desarrollaron una estrategia para la produccioacuten de γ-PGA con un alto
rendimiento mediante cultivo en lote alimentado de Bacillus licheniformis
ATCC9945a Mediante el empleo de un bioreactor de 25 L conteniendo 1 L de
medio de cultivo y bajo condiciones de pH y temperatura de 65 y 37ordmC
respectivamente un 40 de saturacioacuten de oxiacutegeno y una velocidad de
agitacioacuten de 1000 rpm lograron alcanzar una concentracioacuten maacutexima de γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 31
de 35 gL suministrando aacutecido ciacutetrico y aacutecido L-glutaacutemico a una velocidad de
alimentacioacuten de 02 mLmin (144 gh de aacutecido ciacutetrico y 24 gh de aacutecido
glutaacutemico) por un periacuteodo de 3 h despueacutes del agotamiento del aacutecido ciacutetrico
inicial lo cual aconteciacutea alrededor de las 22 h La productividad alcanzada fue
de 1 gmiddotl-1middoth-1
425 Purificacioacuten del γshyPGA
Dado que la produccioacuten del γ-PGA es mayoritariamente extracelular en
concreto en la cepa de intereacutes para el presente estudio la de Bacillus
licheniformis ATCC9945a la purificacioacuten del poliacutemero es directa y consta de
manera general de tres pasos I) la remocioacuten de las ceacutelulas mediante
centrifugacioacuten o filtracioacuten 2) la precipitacioacuten del producto del medio libre de
ceacutelulas mediante metanol etanol o 1-propanol y 3) la diaacutelisis para la remocioacuten
de impurezas de pequentildeo peso molecular
Du y colaboradores (2001) desarrollaron una estrategia eficiente para la
separacioacuten y recuperacioacuten delγ-PGA de caldos altamente viscosos Esta
consiste en dos procesos I) Separar el γ-PGA del caldo de cultivo viscoso y II)
Concentrar la solucioacuten de PGA por ultrafiltracioacuten con el propoacutesito de reducir la
cantidad de alcohol requerida en el proceso de separacioacuten Las ceacutelulas
encapsuladas con γ-PGA poseen carga negativa cerca del valor neutro de pH
esto debido a la ionizacioacuten del grupo carboxilo en las moleacuteculas de γ-PGA Esta
carga negativa en sus superficies les confiere a las ceacutelulas una alta estabilidad
en el medio de cultivo lo que dificulta la sedimentacioacuten de las ceacutelulas durante el
proceso de separacioacuten Esta alta estabilidad asiacute como la elevada viscosidad del
caldo de cultivo son los dos principales problemas que se enfrentan cuando se
trata de separar las ceacutelulas y el γ-PGA del medio de cultivo por lo cual la
reduccioacuten de ambas es vital para una eficiente recuperacioacuten del γ-PGA
Mediante la disminucioacuten del pH es posible reducir el nuacutemero de cargas
negativas sobre la superficie de las ceacutelulas lo que favorece su faacutecil agregacioacuten
y precipitacioacuten Esto permite reducir en hasta un 17 la energiacutea requerida para
una adecuada centrifugacioacuten del caldo de cultivo a un pH de 5 En lo referente
a los requerimientos de alcohol es conocido que un 75-80 del mismo es
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 32
requerido para la precipitacioacuten del γ-PGA presente en un caldo libre de ceacutelulas
a una concentracioacuten de 1-2 Dado que la cantidad de alcohol requerida
disminuye a medida que la concentracioacuten de γ-PGA aumenta es necesaria y
ventajoso sino la concentracioacuten del γ-PGA presente en el medio de cultivo libre
de ceacutelulas a lo largo del proceso de recuperacioacuten Asiacute es posible reducir en un
25 el alcohol requerido para precipitar una solucioacuten de γ-PGA que fue
concentrada de 20 gL a 60 gL mediante ultrafiltracioacuten a un pH de 5
Asiacute mismo y dada la naturaleza anioacutenica del γ-PGA es posible que el
empleo de la cromatografiacutea de intercambio ioacutenica constituya una herramienta
importante para la purificacioacuten de este poliacutemero
426 Control del peso molecular y degradacioacuten del γshyPGA
El peso molecular es una caracteriacutestica importante del γ-PGA microbiano
debido al efecto que tiene el tamantildeo molecular en las propiedades del
poliacutemero El γ-PGA producido por bacterias del geacutenero Bacillus por lo general
presenta un relativamente alto peso molecular Un poliacutemero de alto peso
molecular es uacutetil como agente espesante pero no es uacutetil para otros usos
debido a la alta viscosidad que lo vuelve difiacutecil de modificar quiacutemicamente
mediante la adicioacuten de alguacuten reactivo quiacutemico De acuerdo con el uso que se
pretenda dar es necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso
molecular por ejemplo en lo referente al empleo del γ-PGA en sistemas de
liberacioacuten de faacutermacos o en el disentildeo de faacutermacos polimeacutericos resulta
necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso para controlar el nivel de
liberacioacuten en los distintos tejidos (Shih et al 2001) Es evidente entonces que el
control del peso molecular del γ-PGA no es solamente un asunto de
importancia fundamental o teoacuterica sino de importancia praacutectica para el
desarrollo de aplicaciones comerciales para este poliacutemero Entre los meacutetodos
que se han empleado para la obtencioacuten de γ-PGA con diferentes pesos
moleculares encontramos la hidroacutelisis alcalina la degradacioacuten ultrasoacutenica la
degradacioacuten microbiana o enzimaacutetica y la alteracioacuten de la composicioacuten del
medio de cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 33
En otro estudio Birrer y colaboradores (1994) encontraron que la
variacioacuten de la fuerza ioacutenica del medio de cultivo mediante la adicioacuten de un 4
(pv) de NaCl conllevaba a la formacioacuten de un γ-PGA de un peso molecular
relativamente mayor
A la fecha existen pocos estudios sobre la biodegradacioacuten microbiana o
enzimaacutetica del γ-PGA a moleacuteculas de menor peso molecular sin embargo es
importante sentildealar que en la mayoriacutea de estudios sobre siacutentesis de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a se sugiera la posible existencia de una
enzima ldquodespolimerasardquo responsable de la descomposicioacuten del γ-PGA Lo que
inicialmente se observaba como una reduccioacuten en la viscosidad del medio de
cultivo con el tiempo o bajo ciertas condiciones demostroacute ser una enzima
poliglutamil-γ -hidrolasa responsable de la ruptura hidroliacutetica del γ-PGA en esta
cepa de Bacillus (King et al 2000) Curiosamente la enzima mostroacute ser
activada por la presencia de iones Zn2+ y Ca2+ y tener una alta afinidad por el γ-
PGA
427 Aplicaciones del γshyPGA
Dada la naturaleza del γ-PGA al ser un poliacutemero no toacutexico
biodegradable y cuya produccioacuten puede ser no tan costosa se han sugerido
gran cantidad de aplicaciones durante la uacuteltima deacutecada El γ-PGA de alto peso
molecular es decir mayor a 106 Da es el preferible en gran parte de las
aplicaciones aunque si bien existen otra serie de aplicaciones que se
presentaran a continuacioacuten y que podriacutean demandar diferentes caracteriacutesticas
Es importante destacar eso siacute que salvo las aplicaciones meacutedicas el resto
considera como indiferente la proporcioacuten de aacutecido D-glutaacutemico y de aacutecido L-
glutaacutemico presente en el γ-PGA
Alimentos
Existe una amplia gama de aplicaciones para el γ-PGA en la industria de
alimentos y sus derivados En jugos y otras bebidas el γ-PGA colabora en el
mejoramiento del sabor y su potabilidad Otra aplicacioacuten importante existe en
alimentos soacutelidos a base de harina de trigo como por ejemplo pan pasteles o
pasta donde la adicioacuten de γ-PGA ha demostrado retrasar el envejecimiento y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 34
mejorar la textura asiacute como permitir una mayor conservacioacuten de la forma Para
estas aplicaciones el γ-PGA recomendable es el de alto peso molecular
Asiacute mismo el γ-PGA ha demostrado poseer propiedades
anticongelantes propiedad que se ve incrementada conforme el tamantildeo del
poliacutemero se reduce Esto permitiriacutea emplear el γ-PGA en la conservacioacuten de
alimentos microorganismos y enzimas Debido a que las sales de este
poliacutemero tienen poco sabor por siacute mismas pueden ser empleadas en mayores
concentraciones en comparacioacuten con otros agentes anticongelantes tales como
la glucosa Aunque esta aplicacioacuten es dependiente del tipo de sal del poliacutemero
empleada es independiente de la proporcioacuten de aacutecido L- y D-glutaacutemico
presente en el poliacutemero Asiacute mismo la adicioacuten de γ-PGA en productos
alimenticios que contengan sustancias activas bioloacutegicamente como por
ejemplo carotenoides vitaminas o polifenoles incrementa la absorcioacuten de
dichas sustancias en el intestino delgado
Fertilizante
Es posible producir grandes cantidades de biomasa y γ-PGA a partir de
medios liacutequidos con estieacutercol glicerol aacutecido ciacutetrico y otras sales inorgaacutenicas
resultando un producto que funciona como un fertilizante de liberacioacuten lenta
cuando es aplicado en los campos de cultivo Dado que el γ-PGA es
particularmente inerte a la gran mayoriacutea de las proteasas la liberacioacuten de
nitroacutegeno puede verse reducida auacuten maacutes Inclusive es posible producir dicho
fertilizante mediante fermentacioacuten en fase soacutelida lo que podriacutea resultar auacuten
maacutes ventajoso en ciertos casos pues permite utilizar como co-sustrato de
fermentacioacuten productos agriacutecolas tales salvado de trigo soya o maiacutez Es
importante sentildealar que para dicha aplicacioacuten la proporcioacuten de aacutecido L- y D-
glutaacutemico presente en el poliacutemero es indiferente
Tratamiento de aguas residuales
Debido a la actividad de floculacioacuten que este poliacutemero presenta el
empleo del γ-PGA en el tratamiento de aguas residuales ha sido investigado en
muacuteltiples estudios demostrando una gran capacidad de absorcioacuten y afinidad
por el Cu2+ Adicionalmente se ha demostrado el requerimiento de iones
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 35
multivalentes tales como el Ca2+ Fe3+ y Al3+ para mejorar su actividad
floculante bajo ciertas condiciones
Asiacute mismo tambieacuten se ha empleado el γ-PGA entrecruzado mediante
radiacioacuten γ el cual ha demostrado ser eficiente en la clarificacioacuten de agua
tuacuterbida a concentraciones tan bajas como 1 mgkg
Bioplaacutesticos
La posibilidad de emplear eacutesteres de γ-PGA como plaacutestico
biodegradable tambieacuten constituye otra aplicacioacuten interesante de este poliacutemero
a pesar de que por el momento su costo es todaviacutea muy elevado como para
asegurar el eacutexito comercial Mediante la modificacioacuten de los grupos eacutester es
posible disentildear un plaacutestico que cumpla los requisitos de muacuteltiples propoacutesitos
asiacute mismo los eacutesteres de γ-PGA han demostrado ser maacutes estables a altas
temperaturas que sus respectivas sales de sodio
Hidrogeles
La formacioacuten de hidrogeles por parte de γ-PGA con o sin la adicioacuten de
poliacutemeros adicionales da origen a una amplia gama de novedosas
aplicaciones ya que las propiedades fiacutesicas del gel pueden ser controladas
para cumplir una amplia variedad de necesidades
Mediante irradiacioacuten γ de 19 kGy es posible generar un hidrogel a base
de γ-PGA con un contenido especiacutefico de agua de 3500 Esto constituye un
meacutetodo conveniente y sencillo para gelificar el γ-PGA sin necesidad de
poliacutemeros o entrecruzadores
Los hidrogeles pueden ser empleados en muacuteltiples aplicaciones como en
la liberacioacuten controlada de faacutermacos el disentildeo de biosensores operaciones de
diagnoacutestico e inclusive hasta bioseparadores pueden ser obtenidos a partir de
γ-PGA y PEG-metacrilato Los hidrogeles obtenidos de esta forma poseen la
cineacutetica de liberacioacuten deseada para partiacuteculas de distinto tamantildeo tales como
pequentildeos peacuteptidos proteiacutenas o inclusive ceacutelulas completas (Bajaj amp Singhal
2011)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 36
Una manera sencilla de obtener hidrogeles de γ-PGA es a traveacutes de la
adicioacuten de peroacutexido como entrecruzador al caldo de fermentacioacuten crudo dicho
hidrogel puede emplearse como absorbente de agua en muacuteltiples aplicaciones
que incluyen agricultura horticultura y construccioacuten civil
De igual manera tambieacuten se ha demostrado que los hidrogeles pueden
ser empelados para la liberacioacuten lenta y controlada de faacutermacos en particular
aquellos formados por α-L-PGA y PEG-metacrilato Hidrogeles formados por un
72 deγ-PGA sulfonado y el resto en γ-PGA han demostrado resultados
promisorios en la liberacioacuten controlada de faacutermacos con una liberacioacuten
praacutecticamente nula a un pH de 74 sin embargo a un pH menor a 65 como el
observado en los tejidos inflamados la liberacioacuten del faacutermaco incrementaba
considerablemente
Transportador de faacutermacos
Dado a su biodegradabilidad y biocompatibilidad el γ-PGA constituye un
biopoliacutemero de particular intereacutes en el desarrollo de faacutermacos de liberacioacuten
controlada tal y como se ha sentildealado previamente Dada la presencia de
grupos carboxilo en las cadenas laterales del poliacutemero que pueden
interaccionar con los grupos funcionales presentes en otros agentes
quimioterapeacuteuticos el γ-PGA permite obtener faacutermacos maacutes solubles y faacuteciles
de administrar Inclusive el conjugado faacutermaco-γ-PGA puede ingresar a las
ceacutelulas diana e irse degradando lentamente mientras libera el agente
farmacoloacutegico y a la vez el aacutecido glutaacutemico producido durante su degradacioacuten
puede ingresar directamente al metabolismo celular o ser excretado a traveacutes
del rintildeoacuten (Bajaj amp Singhal 2011)
Uno de los conjugados maacutes prometedores y estudiados hasta el
momento ha sido con el agente anticanceriacutegeno Paclitaxel Dichos conjugados
Paclitaxel-γ-PGA han demostrado presentar un perfil farmacocineacutetico distinto
capaz de proveer una alternativa hidrosoluble a las formulaciones habituales de
este faacutermaco Tambieacuten estos conjugados han mostrado una respuesta
antitumoral marcadamente superior en comparacioacuten con el Paclitaxel soacutelo
tanto en tejidos murinos como humanos Asiacute mismo estos conjugados han
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 37
mostrado reducir la TCD50 (dosis letal media contra ceacutelulas canceriacutegenas) de
una sola irradiacioacuten de 539 Gy a 75 Gy sin afectar la respuesta radioloacutegica de
los tejidos normales sanos
Adhesivos bioloacutegicos
Los adhesivos bioloacutegicos son empleados para la adhesioacuten de tejidos
homeostasis y para el sellado de fugas de liacutequidos o aire en los tejidos durante
una cirugiacutea En la actualidad el adhesivo de mayor uso es la fibrina la cual
presenta un pobre adhesioacuten a los tejidos Un poliacutemero formado por el
entrecruzamiento del γ-PGA y gelatina ha demostrado un gran potencial para
ser empleado como adhesivo quiruacutergico y agente homeostaacutetico conservando la
capacidad de ser degradado lentamente por el cuerpo sin causar respuestas
inflamatorias severas y a la vez solidificando tan raacutepido como la fibrina pero con
una mayor adherencia a los tejidos Similares hallazgos se han obtenido con
poliacutemeros formados del entrecruzamiento de γ-PGA y colaacutegeno porcino (Bajaj
amp Singhal 2011)
Cosmeacuteticos
El γ-PGA puede ser empleado como componente de valor agregado en
la elaboracioacuten de cosmeacuteticos y productos para el cuidado personal tales como
humectantes exfoliantes y antiarrugas Dada sus propiedades quiacutemicas el γ-
PGA es homogeacuteneamente miscible asiacute como quiacutemicamente estable en la gran
mayoriacutea de los ingredientes tiacutepicamente empleados para la elaboracioacuten de
cremas faciales Asiacute mismo ciertas calidades de γ-PGA son capaces de
producir peliacuteculas suaves elaacutesticas humectantes y suaves sobre la piel Dado
que se trata de un humectante natural hidrofiacutelico formidable el γ-PGA ha
demostrado en combinacioacuten con extractos de Aloe vera promover la produccioacuten
natural de factores humectantes tales como aacutecido pirrolidona-carboxiacutelico aacutecido
laacutectico y aacutecido urocaacutenico A nivel microscoacutepico esto se explica por el hecho de
que los hidrogeles de γ-PGA son capaces de absorber hasta 5000 veces su
propio peso en humedad lo que permitiriacutea incrementar de gran manera las
propiedades humectantes de muchos productos cosmetoloacutegicos con la adicioacuten
de γ-PGA algunos electrolitos y el ajuste a un pH adecuado
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 38
Adyuvante en vacunas
El γ-PGA ha demostrado que es capaz de generar una mejor respuesta
inmune contra otros antiacutegenos presentes en una vacuna El γ-PGA de alto peso
molecular ha demostrado estimular la respuesta inmune contra antiacutegenos
virales en conejos y ratones
43 Disentildeo de procesos biotecnoloacutegicos y la transferencia de materia gasshyliquido
Cuando un microorganismo ha sido identificado como productor de un
compuesto de intereacutes existen una serie de consideraciones que deben ser
valoradas previamente antes de que un proceso productivo econoacutemicamente
viable pueda ser llevado a la praacutectica a escala industrial En aquellas
organizaciones e industrias con una soacutelida experiencia en el disentildeo y
escalamiento de procesos fermentativos los nuevos procesos son
incorporados de manera relativamente raacutepida
El desarrollo de un nuevo proceso fermentativo puede ser a groso modo
dividido en cuatro fases
La primera consiste en identificar el producto su potencial valor de
mercado su precio de venta asiacute como la vida uacutetil del mismo
La siguiente fase es seleccionar o disentildear la cepa que seraacute utilizada en
el proceso productivo y por consiguiente disentildear el proceso como tal Esto
involucra una adecuada seleccioacuten del medio de cultivo oacuteptimo y de las
condiciones idoacuteneas de proceso En este sentido la produccioacuten de γ-PGA a
partir de Bacillus licheniformis ATCC9945a ha sido fuertemente investigada en
torno a las condiciones ideales para su produccioacuten sin embargo algunos
reportes y resultados resultan ser incompletos contradictorios o discutibles Sin
embargo lo que si resulta comuacuten en todas las investigaciones en particular en
aquellas donde se han empleado voluacutemenes mayores de produccioacuten como por
ejemplo de 05 a 10 L es que la produccioacuten del γ-PGA se detiene al reducirse
la concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo problema que ha sido
abordado incrementando el caudal de oxiacutegeno yo incrementando la velocidad
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 39
de agitacioacuten sin que se reporten resultados consistentes o claros La
acumulacioacuten del γ-PGA a lo largo de la fermentacioacuten parece reducir
draacutesticamente la tasa de transferencia de oxiacutegeno lo que termina generando
condiciones anaeroacutebicas en tiempos tan cortos como 20 horas con
concentraciones de oxiacutegeno inferiores a 1 mgL
431 La transferencia de materia gasshyliacutequido
Un requisito primordial para la ocurrencia de una reaccioacuten quiacutemica
cualquiera es que los reactantes esteacuten presentes en el sitio de reaccioacuten En los
sistemas multifase los procesos de transporte son generalmente maacutes lentos
que las tasas maacuteximas de reaccioacuten intriacutenseca Este fenoacutemeno da como
resultado que las tasas de reaccioacuten reales sean menores que las que se
podriacutean esperar por efecto de la cineacutetica de reaccioacuten uacutenicamente
Los fundamentos fiacutesicos principales que determinan la transferencia de
materia son los mismos que aplican para la transferencia de calor y de
momento es decir conveccioacuten y difusioacuten
En los sistemas bioloacutegicos multifase como las fermentaciones en medio
sumergido la transferencia de masa ocurre entre dos fases una gaseosa y
otra liacutequida La mayor parte de los procesos fermentativos a gran escala con
excepcioacuten tal vez uacutenicamente de la produccioacuten de etanol y aacutecido laacutectico son
aeroacutebicos y tiacutepicamente son llevados a cabo en biorreactores aireados gas-
liacutequido En estos procesos aeroacutebicos como sucede con la produccioacuten de γ-
PGA por parte de Bacillus licheniformis ATCC9945a la transferencia de
oxiacutegeno desde la fase gaseosa a la fase liacutequida resulta vital para el eacutexito de
dicho bioproceso
En los bioprocesos aeroacutebicos el oxiacutegeno es un sustrato clave y debido
a su baja solubilidad en caldos y medios de cultivo resulta necesario su
continuo suministro La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deber ser
conocida e inclusive predicha con el propoacutesito de llevar a cabo un adecuado
disentildeo operacional del proceso y un correcto escalado de los biorreactores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 40
432 La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR)
El transporte de oxiacutegeno gas-liacutequido en los bioprocesos aeroacutebicos es el
principal proceso gas-liacutequido a considerar a la hora de disentildear un bioproceso
La solubilidad del oxiacutegeno en un medio liacutequido es baja la concentracioacuten de
saturacioacuten de oxiacutegeno es de cerca de 7-8 mgL en un proceso tiacutepico en
aireacioacuten por lo cual una transferencia de oxiacutegeno continua de la fase gaseosa
a la liacutequida es esencial para conservar un metabolismo celular completamente
oxidativo Por ejemplo unos pocos minutos sin aireacioacuten pueden impactar
severamente en la habilidad de Penicillium chrysogenum para producir
penicilina mientras que en organismos aeroacutebicos facultativos esto puede
generar cambios draacutesticos en el rendimiento y el tipo de producto generado en
condiciones de carencia de oxiacutegeno
La transferencia de oxiacutegeno desde una fase gaseosa hasta el interior de
una ceacutelula ocurre siguiendo una serie de pasos secuenciales que son
1) Difusioacuten del O2 desde la fase gaseoso a la interfase gas-liacutequido
2) Transporte a traveacutes de la interfase gas-liacutequido
3) Difusioacuten del O2 a traveacutes de una regioacuten relativamente inactiva del liacutequido
adyacente a la burbuja es decir de la interfase gas-liacutequido a la de
mezclado del liacutequido
4) Transporte del oxiacutegeno disuelto a la ceacutelula los conglomerados celulares
o al pellet de ceacutelulas inmovilizadas
5) Difusioacuten a traveacutes de la peliacutecula inactiva hasta la superficie de la ceacutelula
dentro de los conglomerados celulares o al interior del pellet de ceacutelulas
inmovilizadas
6) Transporte a traveacutes de la membrana celular
7) Transporte del O2 en el interior celular hacia el sitio de demanda
433 Descripcioacuten de la transferencia maacutesica con kLa
La tasa volumeacutetrica de transferencia de materia de un compuesto A (qtA)
en este caso oxiacutegeno (O2) puede ser descrita cuantitativamente como el
producto de un coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (kLa) y una
fuerza impulsora que consiste en la diferencia entre la concentracioacuten de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 41
saturacioacuten del compuesto (cA) y la concentracioacuten actual del compuesto en la
fase liacutequida (cA)
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (unidad s-1) el kLa
es normalmente referido como un coeficiente uacutenico pero en realidad consiste
de dos partes el coeficiente de transferencia de materia propiamente dicho (kL)
que estaacute vinculado con el flujo maacutesico (tasa de transferencia por unidad de
aacuterea) y el aacuterea de la superficie especiacutefica (a) que es el aacuterea de transferencia
por unidad de volumen
La tasa de transferencia de oxiacutegeno (referida como velocidad de
transferencia de oxiacutegeno en algunos casos) el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de materia (kLa) y la concentracioacuten de oxiacutegeno estaacuten
relacionados por la ecuacioacuten
NAa = OTR = kLa(cA- cA) (gm3s)
Noacutetese en la ecuacioacuten que para que la transferencia sea mayor interesa
tener una kLa alta pero ademaacutes (cA-cA) debe tener un valor elevado lo que
podriacutea llevar a plantear que cA sea lo menor posible Sin embargo se requiere
de una concentracioacuten miacutenima de oxiacutegeno para mantener una fermentacioacuten
aerobia Con respecto a dicha ecuacioacuten es importante sentildealar que
1) La concentracioacuten en fase liacutequida cA corresponde a la cantidad de
oxiacutegeno que hay en la fase acuosa y se determina mediante un
electrodo de oxiacutegeno disuelto Si al sistema se introduce aire a presioacuten
atmosfeacuterica dicho valor estaraacute entre los 0-10 mgL
2) La concentracioacuten de saturacioacuten cA corresponde a la solubilidad de
oxiacutegeno y es dependiente de la concentracioacuten de oxiacutegeno en la fase
gaseosa es decir de la presioacuten parcial de oxiacutegeno Una vez conocida la
presioacuten parcial de oxiacutegeno es posible calcular el valor de la solubilidad
mediante la ley de Henry En agua una forma de esta ecuacioacuten seriacutea
pAGcA = He
Donde He es la constante de Henry y cuyo valor (aproximadamente
entre 15-30 atm m3kg) es funcioacuten de la temperatura A partir de esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 42
ecuacioacuten es posible despejar el valor de cA = pAGHe El valor de He
cambia con la temperatura por ejemplo en agua pura a 25 ordmC para el
oxiacutegeno es de 2396 x 106 Pamiddotm3middotkg-1 El valor de cA es modificable si
se manipula
a) Presioacuten podemos aumentar la concentracioacuten de saturacioacuten si
aumentamos la presioacuten parcial de oxiacutegeno por ejemplo si
pasamos de 021 atm a 1 atm introduciendo al reactor oxiacutegeno
puro en vez de aire a presioacuten atmosfeacuterica lo que da por
resultado un aumento en alrededor de cinco veces su valor
Es posible tambieacuten alcanzar un mayor aumento de la
concentracioacuten de saturacioacuten si aumentamos la presioacuten
absoluta no obstante si hacemos fermentaciones con
oxiacutegeno a presioacuten resulta necesario disponer de un
fermentador capaz de resistir tales condiciones de presioacuten
resulta evidentemente maacutes costoso y tambieacuten pueden ocurrir
cambios importantes en el metabolismo de los
microorganismos que puedan afectar su crecimiento o su
rendimiento en producto
b) Temperatura la solubilidad del oxiacutegeno en agua disminuye al
aumentar la temperatura
c) Composicioacuten del liacutequido si en lugar de agua pura se tiene una
disolucioacuten como sucede con la mayoriacutea de los medios que
tiene una composicioacuten salina importante la solubilidad debe
corregirse pues dichos componentes afectan su valor y dicho
efecto estaacute influenciado tanto por los iones presentes como
por los componentes orgaacutenicos
44 Fermentaciones a presioacuten
La gran mayoriacutea de los estudios sobre fermentaciones son generalmente
llevados a cabo bajo condiciones de presioacuten ambiental maacutes allaacute del hecho de
que el fermentador por lo general suele encontrarse positivamente presurizado
Son pocos los ejemplos a excepcioacuten de la cerveza y algunos vinos donde las
fermentaciones son llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten positiva en el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 43
fermentador Esta leve presurizacioacuten suele deberse al proceso de aireacioacuten del
biorreactor debido a la formacioacuten de una presioacuten de vuelta debido a las
restricciones del respiradero de escape del fermentador
La presioacuten positiva en muchos casos puede resultar beneficiosa para los
procesos de fermentacioacuten no soacutelo por el hecho de incrementar la solubilidad del
oxiacutegeno en el caldo de cultivo sino tambieacuten porque reduce las oportunidades
de contaminacioacuten externa durante el proceso de fermentacioacuten Igualmente la
presioacuten puede tener efectos nocivos sobre los procesos fermentativos La
presioacuten tiene el efecto de influenciar las velocidades y la direccioacuten del
metabolismo de los microorganismos Esto es particularmente evidente en el
caso de productos o subproductos volaacutetiles que forman parte de distintas rutas
metaboacutelicas La presioacuten en el fermentador puede evitar la produccioacuten o
expulsioacuten de un producto gaseoso al medio circundante Este fenoacutemeno puede
tener el efecto de interferir con el equilibrio de varias reacciones bioquiacutemicas y
puede resultar en toxicidad al interior de la ceacutelula o en la divergencia de rutas
metaboacutelicas Lo significante de este impacto dependeraacute de la duracioacuten del
proceso asiacute como de la magnitud de la presioacuten a la cual se realice la
fermentacioacuten
De igual manera el efecto de la presioacuten sobre las macromoleacuteculas
guarda una gran semejanza con los efectos de la temperatura lo cual se
desprende del parecido de la forma de los diagramas de estabilidad de las
proteiacutenas y viabilidad de los microorganismos entre ambas variables
temperatura y presioacuten observacioacuten que tambieacuten permite concluir que las
proteiacutenas constituyen los primeros elementos estructurales en ser afectados
de manera negativa por el incremento de la presioacuten La presioacuten parece afectar
en mayor medida las interacciones proteiacutena-proteiacutena en comparacioacuten con la
estabilidad proteica por siacute misma por lo que es vaacutelido concluir que son estas
interacciones las primeras en verse afectadas por dicha variable La
conservacioacuten de la viabilidad en los microorganismos al ser sometidos a
presioacuten dependeraacute en gran medida de su capacidad para conservar una
membrana celular funcional aunque los mecanismos que emplean para tal fin
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 44
auacuten son desconocidos dada la vital importancia de las interacciones proteiacutena-
proteiacutena en las funciones de membrana
Lo maacutes importante es conocer con detalle como efectivamente la presioacuten
ejercida afecta el proceso de fermentacioacuten en particular la bioquiacutemica y la
fisiologiacutea del mismo de igual manera si es posible controlar la direccioacuten de la
fermentacioacuten manipulando la presioacuten o si la presioacuten estaacute generando el
desarrollo de reacciones secundarias indeseadas las respuestas a dichas
interrogantes soacutelo pueden ser dilucidadas mediante la experimentacioacuten praacutectica
del proceso fermentativo en estudio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 45
7 MATERIALES Y METODOLOGIacuteA
51 Informacioacuten de la cepa empleada
Se empleoacute la cepa Bacillus licheniformis ATCC9945a la cual se
encontraba conservada en estado vegetativo y bajo refrigeracioacuten en el
Laboratorio de Biopoliacutemeros del ETSEIB UPC Cataluntildea Con el propoacutesito de
seleccionar colonias altamente mucosas capaces de producir γ-PGA se
procedioacute a rallar la biomasa conservada en placas con Agar LB (pH 75) e
incubarlas por 24 horas a 37 ordmC Las colonias que mostraron una morfologiacutea
mucosa indicadora de la produccioacuten de γ-PGA fueron utilizadas para elaborar
los inoacuteculos empleados en las distintas fermentaciones
52 Medio de cultivo empleado
El medio de cultivo empleado para la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a fue el medio de cultivo E (Leonard et al 1958) con
algunas modificaciones seguacuten recomendado por Birrer y colaboradores (1994)
El detalle de la formulacioacuten se presenta en la tabla 5
Tabla 5 Formulacioacuten del medio de cultivo E empleado en el cultivo SmF de Bacillus
licheniformis ATCC9945a
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO43H2O 043 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 015 CaCl2 011 Glicerol 80 pH 75 Esterilizacioacuten por filtracioacuten (045 μm) Volumen 1 L
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 46
El medio de cultivo fue esterilizado por filtracioacuten (045 μm) y conservado
en refrigeracioacuten a 7 ordmC
53 Preparacioacuten de los inoacuteculos madre
Las colonias seleccionadas fueron inoculadas en matraces de 125 mL
con 25 mL de medio de cultivo E y cultivadas a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica
con varilla imantada a 650 rpm por 12 horas El caldo resultante fue
centrifugado a 8000 rpm por 25 minutos la biomasa recuperada fue
resuspendida en 10 mL de medio de cultivo E y 10 mL de una solucioacuten de
glicerol al 20 Dicha solucioacuten fue distribuida en voluacutemenes de 1 mL en tubos
eppendorf y congeladas a -80 ordmC
Posteriormente uno de estos tubos eppendorf fue empleado para
inocular matraces de 500 mL conteniendo 125 mL de medio de cultivo y fueron
cultivados a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica con varilla imantada a 650 rpm por
14 horas El caldo resultante fue centrifugado nuevamente a 8000 rpm por 25
minutos se recuperoacute la biomasa precipitada y se resuspendioacute en 25 mL de
medio de cultivo E y 25 mL de una solucioacuten de glicerol al 20 Dicha solucioacuten
fue distribuida en voluacutemenes de 2 mL en tubos eppendorf y posteriormente
fueron congelados a -80 ordmC Cada uno de estos eppendorf constituiacutea un inoacuteculo
de origen para una fermentacioacuten individual La absorbancia promedio de estos
inoacuteculos se encontraba cercana a 25
531 Conservacioacuten de la cepa en estado productivo
Los inoacuteculos deben conservarse en todo momento bajo congelacioacuten a
una temperatura inferior a -15 ordmC siendo preferible conservarlos a -80 ordmC La
condicioacuten de produccioacuten de γ-PGA es extremadamente fraacutegil y cambios de
temperatura o descongelamiento pueden conllevar la peacuterdida de dicha
capacidad La reutilizacioacuten de biomasa residual de fermentaciones previas
queda descartada
54 Montaje del biorreactor a presioacuten
En la actualidad los principales fabricantes de biorreactores para la
industria biotecnoloacutegica carecen de equipos de fermentacioacuten a escala
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 47
laboratorio que puedan operar bajo condiciones de presioacuten superiores a los 01
bares relativos Por este motivo se debioacute modificar un reactor quiacutemico a
presioacuten de modo tal que pudiese cumplir los requisitos necesarios para el
cultivo de microorganismos El modelo empleado fue el reactor quiacutemico a
presioacuten modelo 6425-214 de la casa AceGlass (Estados Unidos) de un
volumen total de 2 L Este reactor tiene la capacidad de operar hasta 35 psig
(241 bares relativos) a una temperatura de 100 ordmC y a una agitacioacuten de 300
rpm El mismo seguacuten su disentildeo original se presenta en la figura 6
Figura 6 Reactor quiacutemico a presioacuten modelo 6425-214 de AceGlass Co
Las dimensiones del frasco del reactor de forma ciliacutendrica y fondo
redondeado son las siguientes
Diaacutemetro de boca 95 mm
Diaacutemetro maacuteximo 120 mm
Profundidad 180 mm
Con el propoacutesito de adecuarlo al cultivo de microorganismos el reactor
fue ligeramente modificado en algunos de sus componentes y su distribucioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 48
Entre los principales cambios realizados al sistema se encuentran los
siguientes
1) Incorporacioacuten de una turbina de disco tipo Rushton al tratarse de una
fermentacioacuten aeroacutebica es necesario garantizar una adecuada aireacioacuten
del medio de cultivo mediante agitacioacuten efectiva La paleta de agitacioacuten
original del sistema no cumpliacutea con dicho requisito por lo cual se cambioacute
la misma por una turbina tipo Rushton cuyas dimensiones se muestran
en la figura 7
Dimensiones
A = 75 mm
B = 18 mm
C = 1mm
D = 20 mm
Figura 7 Dimensiones de la turbina tipo Rushton empleada
Esta turbina se encuentra en posicioacuten central a 3 cm del fondo del
reactor y a 6 mm de los deflectores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 49
2) Incorporacioacuten de deflectores se incorporaron dos laacuteminas deflectoras de
disentildeo propio de1 mm de ancho en una posicioacuten de 90 grados con
respecto a la superficie del reactor con el propoacutesito de reducir la
formacioacuten de voacutertice promover una agitacioacuten turbulenta y una mayor
formacioacuten de burbujas La geometriacutea de las laacuteminas deflectoras se
detalla en la Figura 8
Dimensiones
Ancho de laacutemina = 10 mm
Diaacutemetro = 95 mm
Longitud de laacutemina = 200 mm
Figura 8 Geometriacutea de las laacuteminas deflectoras
3) Cambio del motor de agitacioacuten se incorporoacute un motor IKA RW20 con
capacidad de hasta 2000 rpm en sustitucioacuten del motor original con que
A
B
C
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 50
disponiacutea el equipo (el sistema original trae un motor limitado a una
velocidad de agitacioacuten maacutexima de 330 rpm) con el propoacutesito de variar la
agitacioacuten del sistema y observar su efecto sobre el crecimiento y la
produccioacuten de poliacutemero
4) Reubicacioacuten de la vaacutelvula de seguridad de sobrepresioacuten con el
propoacutesito de garantizar una mayor seguridad del equipo maximizar la
vida uacutetil del cilindro de aire comprimido y evitar la sobrepresioacuten que
pueden generar el crecimiento del microorganismo (su metabolismo
puede liberar compuestos gaseosos o volaacutetiles) se trasladoacute la vaacutelvula de
seguridad del equipo de la tuberiacutea de llenado a la tapa del reactor
5) Eliminacioacuten de componentes dado que no resultaban uacutetiles para la
presente investigacioacuten se prescindioacute de instalar en la tapa del equipo el
condensado y el embudo de adicioacuten El disco de ruptura de la tuberiacutea de
llenado fue sustituido por una vaacutelvula de apertura manual con el
propoacutesito de permitir un mejor y maacutes raacutepido ajuste de la presioacuten durante
el establecimiento inicial de las condiciones de fermentacioacuten
55 Condiciones de fermentacioacuten
El detalle de las condiciones de temperatura presioacuten pH y agitacioacuten en
las cuales fueron establecidas las distintas fermentaciones asiacute como la
metodologiacutea de escalamiento empleada se presentan a continuacioacuten
551 Escalamiento
Inicialmente se procediacutea a inocular por duplicado 100 mL de medio de
cultivo con uno de los inoacuteculos madre (2 mL de ceacutelulas de Bacillus licheniformis
ATCC9945a conservados en tubos eppendorf a -20 ordmC) en matraces con
deflectores de 500 mL de capacidad A dichos matraces se les incorporaba una
pastilla de agitacioacuten magneacutetica de 25 cm de longitud y 07 cm de diaacutemetro y
eran colocados en agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm (agitador IKA C-MAG HS7)
por 8 horas a una temperatura aproximada de 30 ordmC
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 51
Posteriormente uno de los matraces (100 mL de cultivo) anteriormente
establecidos era utilizado para inocular 500 mL de medio de cultivo en el
biorreactor a presioacuten manteniendo una temperatura constante de 30 ordmC
aproximadamente Distintas presiones velocidades de agitacioacuten y densidades
oacutepticas del inoacuteculo fueron evaluadas El detalle del disentildeo experimental de
dichas pruebas se presenta a continuacioacuten en la tabla6
Tabla 6 Diferentes condiciones de presioacuten relativa agitacioacuten y absorbancia evaluadas en las
fermentaciones en biorreactor
CONDICIOacuteN
VALORES EVALUADOS
SOBREPRESIOacuteN
Agitacioacuten 300 rpm
Absorbancia del inoacuteculo 120
O bar (0 psig)
052 bar (75 psig)
103 bar (15 psig)
172 bar (25 psig)
241 bar (35 psig)
AGITACIOacuteN
Sobrepresioacuten 103 bar (15 psig)
Absorbancia del inoacuteculo 120
300 rpm
400 rpm
500 rpm
650 rpm
El tiempo de fermentacioacuten para cada uno de los ensayos evaluados fue
de 18 horas tiempo en el que el pH habiacutea descendido a un valor cercano pero
auacuten superior a 6 No se realizoacute ajuste alguno del pH a lo largo de la
fermentacioacuten Posteriormente se procediacutea a centrifugar el caldo de
fermentacioacuten a 8000 rpm por 25 minutos el sobrenadante recuperado era
almacenado para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA presente en
el mismo
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre
Con el propoacutesito de garantizar que el inoacuteculo madre era apto para la
produccioacuten de γ-PGA uno de los matraces inicialmente establecidos era
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 52
conservado bajo agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm y a 30 ordmC durante las 18 horas
que requeriacutea la fermentacioacuten en el biorreactor Posteriormente se determinaba
cualitativamente la produccioacuten de γ-PGA seguacuten la simbologiacutea que se presenta
en la tabla 7
Tabla 7 Simbologiacutea empleada para la medicioacuten cualitativa de la produccioacuten de γ-PGA en los
matraces de control
SIacuteMBOLO OBSERVACIOacuteN CUALITATIVA
- No produccioacuten de γ-PGA
+ Produccioacuten de γ-PGA
+++ Elevada produccioacuten de γ-PGA
56 Determinacioacuten del valor de kLa
Para la determinacioacuten del valor aproximado de kLa tanto en los
matraces coacutemo en el biorreactor se empleoacute el meacutetodo estaacutetico sin operacioacuten
del cultivo celular Dicho valor no fue determinado bajo condiciones de presioacuten
pues se careciacutea con la instrumentacioacuten adecuada sino soacutelo a presioacuten
atmosfeacuterica para ambos casos matraz y biorreactor
Este meacutetodo consiste en disminuir la concentracioacuten de oxiacutegeno hasta
una concentracioacuten de 1-25 mgL despueacutes el sistema es retornado a aireacioacuten
yo agitacioacuten y se mide como va aumentando la concentracioacuten de oxiacutegeno en la
fase liacutequida conforme transcurre el tiempo El objetivo es por tanto disminuir la
concentracioacuten de cA0 lo suficiente como para tener un cambio importante
obteniendo asiacute una curva de ascenso de las concentraciones de oxiacutegeno en el
tiempo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 53
561 Matraces de cultivo
A un matraz de cultivo en reposo conteniendo 100 mL de medio de
cultivo E se le agregoacute 001 g de sulfito de sodio (Na2SO3) y una punta de
espaacutetula de cloruro de cobalto (actuacutea como catalizador) y se agita
manualmente por 20 s Posteriormente se introdujo la sonda de oxiacutegeno
disuelto del medidor Hanna Oxi-check y se dejoacute descender el nivel de oxiacutegeno
disuelto hasta el valor miacutenimo posible entre 20-25 mgL Seguidamente se
activoacute la agitacioacuten magneacutetica y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto cada 10
segundos hasta alcanzar un punto maacuteximo que se repitiese al menos durante
2 minutos
562 Biorreactor
Se procedioacute a llenar el reactor con 600 mL de medio de cultivo y en
estado de reposo se le agregoacute 006 g de sulfito de sodio una punta de espaacutetula
de cloruro de cobalto y se agitoacute suavemente a 100 rpm por 20 segundos
Haciendo uso de la sonda de oxiacutegeno se determinoacute el menor nivel posible de
oxiacutegeno disuelto alrededor de 15-20 mgL Posteriormente se encendioacute la
agitacioacuten mecaacutenica a 300 rpm y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto en
intervalos de 10 segundos hasta alcanzar un valor maacuteximo de oxiacutegeno disuelto
sostenido en el tiempo es decir que se repitiese por al menos un minuto
563 Graficacioacuten
Con el propoacutesito de determinar el valor de kla a partir de la ecuacioacuten de
balance de oxiacutegeno
V(dCAdt) = VkLa(cA-cA)
Se tiene que integrando dicha ecuacioacuten con la concentracioacuten inicial cA0
se obtiene
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 54
Representado ln((cA - cA0)(c
A- cA)) contra el tiempo t se obtiene una
recta cuya pendiente es el valor de kLa
57 Determinacioacuten del contenido de γshyPGA en el caldo de fermentacioacuten
Con el propoacutesito de determinar la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo
post-fermentacioacuten se utilizoacute la teacutecnica analiacutetica llamada cromatografiacutea liacutequida
de alta eficiencia conocida normalmente por sus siglas en ingleacutes HPLC
especiacuteficamente la conocida como cromatografiacutea de permeacioacuten en gel (GPC)
uno de los tipos de cromatografiacutea de exclusioacuten molecular (SEC) maacutes
empleados en la separacioacuten de poliacutemeros
El equipo empleado fue el cromatoacutegrafo modelo 1260 Infinity de Agilent
Technologies La columna de separacioacuten empleada fue una columna PL
aquagel-OH de 8μm para cromatografiacutea GPC en fase acuosa El meacutetodo de
cromatografiacutea empleado consistioacute en eludir 25 μL de la muestra haciendo uso
de una solucioacuten tampoacuten fosfato 005 molL con un tiempo de elucioacuten de 15 min
por muestra El caudal de flujo del eluyente fue de 08 mLmin La deteccioacuten se
llevoacute a cabo a traveacutes de un detector de absorbancia UV-vis de longitud de onda
variable (VWD) a una longitud de onda de 220 nm y tambieacuten un detector de
iacutendice de refraccioacuten (RID) con polaridad positiva y una temperatura de la
unidad oacuteptica de 35 ordmC aunque los resultados reportados y empleados fueron
los obtenidos con el detector VWD El tiempo de retencioacuten de la fraccioacuten
polimeacuterica correspondiente al γ-PGA se encontroacute entre los 65 y los 90
minutos considerando el hecho de que el mismo se trata de una mezcla de
moleacuteculas polimeacutericas de distinta longitud y por ende distinto peso molecular
Para poder cuantificar la cantidad de poliacutemero presente en la muestra se
elaboroacute una curva de calibracioacuten inicial Se prepararon soluciones en agua
destilada de γ-PGA a concentraciones de 10 5 2 1 y 05 gL Las mismas
fueron analizadas mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva para el
pico correspondiente al γ-PGA para cada concentracioacuten Dichos valores fueron
empleados para la elaboracioacuten de la curva de calibracioacuten inicial del equipo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 55
Las muestras a analizar fueron preparadas de la siguiente manera 400
μL del caldo crudo se diluyeron en agua destilada hasta un volumen final de 2
mL (dilucioacuten 5x) y posteriormente fueron filtradas mediante jeringa haciendo
uso de filtros de 045 μm en viales de HPLC Las muestras fueron analizadas
mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva del pico correspondiente al
γ-PGA para cada una de las muestras
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
Con el propoacutesito de determinar el efecto del contenido de γ-PGA sobre la
solubilidad maacutexima de oxiacutegeno en el medio de cultivo en condiciones estaacuteticas
es decir sin crecimiento microbiano (consumo de oxiacutegeno de los
microorganismos nulo) se procedioacute a preparar soluciones de 100 mL de
volumen a concentraciones crecientes de poliacutemero (poliacutemero + biomasa) en
medio de cultivo y medir el nivel de oxiacutegeno disuelto en mgL haciendo uso de
un medidor de oxiacutegeno disuelto Hanna Oxi-check Dichas soluciones fueron
evaluadas en las mismas condiciones de fermentacioacuten empleadas en la
primera etapa de escalamiento matraces de 500 mL con deflectores y a una
agitacioacuten magneacutetica de 650 rpm Se evaluaron concentraciones de biopoliacutemero
de 0 7 14 21 36 54 y 71 gL
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano
Para determinar el crecimiento bacteriano se aprovechoacute el efecto que
dicho crecimiento genera sobre la turbidez del caldo a lo largo de la
fermentacioacuten Por ello se empleoacute la teacutecnica de espectrofotometriacutea
determinando la absorbancia del medio de cultivo inoculado y su incremento
con el tiempo Se empleoacute el coloriacutemetro modelo ZUSI 4200A a una longitud de
onda de 660 nm El equipo era inicialmente calibrado en 0 haciendo uso de
agua destilada acto seguido se determinaba el valor de absorbancia de la
muestra a analizar
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 56
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producido se determinoacute
mediante el meacutetodo desarrollado por Marfey (1984) para la determinacioacuten
cuantitativa de la composicioacuten enantiomeacuterica de aminoaacutecidos Dicho meacutetodo se
basa en la reaccioacuten del aacutecido glutaacutemico con el reactivo de Marfey (1-fluoro-24-
dinitrofenil-5-L-alanina) Dicho compuesto es oacutepticamente activo por lo que al
reaccionar con los enantioacutemeros D- y L- del aacutecido glutaacutemico forma dos
diasteroisoacutemeros que pueden separarse mediante cromatografiacutea HPLC con
tiempos de retencioacuten para el isoacutemero L- y el D- de 675 y 100 minutos
aproximadamente Para poder cuantificar la composicioacuten de manera efectiva
se realizoacute un calibrado previo con mezclas de concentracioacuten conocida de cada
isoacutemero
5101 Preparacioacuten de la muestras
Se introdujo 3 mg del γ-PGA a analizar en viales de 5 mL y se les
adicionoacute 2 mL de HCl 6 molL Se dejaron calentar a 100 ordmC en estufa por un
periacuteodo de 24 horas Posteriormente se trasfirioacute 100 μL de cada una de las
muestras a tubos eppendorf y se dejaron en desecador al vaciacuteo por un periacuteodo
de tres diacuteas empleando NaOH como desecante Seguidamente se disolvioacute los
productos en 100 μL de agua y se hicieron reaccionar con 200 μL de una
disolucioacuten con concentracioacuten de 5 mgmL de reactivo de Marfey en acetona con
20 μL de carbonato aacutecido de sodio (NaHCO3) durante una hora en estufa a 37
ordmC Al finalizar se neutralizoacute como 10 μL de HCl 2 molL y se dejoacute secar al vaciacuteo
por 3 diacuteas en el desecador a vaciacuteo con NaOH como desecante Finalmente se
diluyoacute la muestra en 350 μL de dimetilsulfoacutexido (DMSO) para cromatografiarla
por HPLC
La cromatografiacutea se llevoacute a cabo en el mismo equipo empleado para la
determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA pero con los siguientes cambios
1) Se empleoacute una columna de fase estacionaria reversa Spherisorb ODS2
de 5 μm de poro 25 cm de longitud y 046 cm de diaacutemetro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 57
2) El caudal de flujo del eluyente fue de 15 mLmin
3) El detector de longitud de onda variable (VWD) operaba a 340 nm y el
tiempo de elucioacuten era de 25 minutos
4) El eluyente empleado era una mezcla 8020 de fosfato de trietilamonio
50 mmolL a pH 3 y acetonitrilo El fosfato de trietilamonio se obteniacutea
haciendo reaccionar cantidades equimolares de trietilamina y aacutecido
fosfoacuterico
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual
La composicioacuten porcentual enantiomeacuterica del γ-PGA es decir el
contenido porcentual de aacutecido D- y L-glutaacutemico se determinoacute mediante
contraste de las aacutereas obtenidas en el cromatograma para cada uno de los
picos correspondientes a cada diasteroisoacutemero con el aacuterea total
correspondiente a los productos de reaccioacuten (sumatoria de ambos
diasteroisoacutemeros) La composicioacuten se reportoacute como un porcentaje de aacutecido D-
glutaacutemico y aacutecido L-glutaacutemico presente en la muestra analizada
511 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA Para la determinacioacuten del peso molecular del poliacutemero se procedioacute a
analizar los cromatogramas obtenidos para el caacutelculo de la concentracioacuten de γ-
PGA Se empleoacute el programa informaacutetico ChemStation for LC Systemsreg de
Agilent Technologies Dicho programa posee unas potentes herramientas de
anaacutelisis que permiten automaacuteticamente calcular el peso molecular de un
compuesto Para las muestras analizadas se determinoacute el peso molecular
promedio en nuacutemero (Mn) el peso molecular promedio en peso (Mw) la
polidispersidad y el peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) La recta de
calibrado fue obtenida previamente por Bou y colaboradores con estaacutendares de
polioacutexido de etileno (PEO)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 58
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 59
8 RESULTADOS
61 Montaje del biorreactor a presioacuten
El detalle final del biorreactor empleado puede observarse en la figura 8
Noacutetese que la temperatura es controlada por la accioacuten de una manta teacutermica
externa como sucede con el disentildeo original del reactor y no por el empleo de
un serpentiacuten interno caso de la gran mayoriacutea de biorreactores comerciales a
escala laboratorio El mismo permite operar en condiciones de agitacioacuten de 100
a 650 rpm y a presiones de hasta 24 bar de sobrepresioacuten (35 psig) El
biorreactor resultoacute apto para el crecimiento microbiano alcanzaacutendose valores
de absorbancia de hasta 37 similares a los observados en cultivos en
matraces
Figura 9 Biorreactor empleado para la produccioacuten de γ-PGA bajo presioacuten
62 Competencia del inoacuteculo madre
Mediante la metodologiacutea descrita previamente para la preparacioacuten del
inoacuteculo madre fue posible alcanzar en el 100 de los cultivos de control la
produccioacuten de γ-PGA en alta cantidad Aunque dichos resultados no se
muestran el empleo de inoacuteculos de otra naturaleza como reutilizacioacuten de
biomasa o inoacuteculos conservados a temperaturas superiores a -20 ordmC mostraron
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 60
ser ineficaces y poco reproducibles en cuanto a la produccioacuten de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a Los resultados de los cultivos control
pueden observarse en el graacutefico 10 bajo el nombre de Matraz
63 Determinacioacuten de los valores de kLa
631 Matraz
En lo referente al cultivo en matraz bajo las condiciones de agitacioacuten y
temperatura empleadas y en condiciones estaacuteticas (sin crecimiento
microbiano) se encontroacute un valor de kLa de 0026 s-1 En el graacutefico 1 y 2 se
muestran la curva de concentracioacuten de oxiacutegeno en funcioacuten del tiempo al
reiniciarse el proceso de agitacioacuten asiacute como el caacutelculo de dicho valor de
coeficiente mediante regresioacuten lineal respectivamente
Graacutefico 1 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concentracioacuten m
gL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 61
Graacutefico 2 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00257x ‐ 08809Rsup2 = 09966
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
Cuando se realizoacute la misma determinacioacuten pero a una velocidad de
agitacioacuten menor (430 rpm) el valor de kLa disminuyoacute significativamente En
dicho caso el valor de kLaobtenido fue de 0017 s-1 Estos resultados se
muestran en los graacuteficos 3 y 4
Como se puede observar en dichos graacuteficos el tiempo requerido para
alcanzar el valor maacuteximo estable se incrementoacute considerablemente en 60
segundos lo que indica una menor velocidad de transferencia producto de la
reduccioacuten de la intensidad de la agitacioacuten suministrada al cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 62
Graacutefico 3 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 430 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Graacutefico 4 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00168x ‐ 07551Rsup2 = 09835
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
ln Linear (ln)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 63
632 Biorreactor
Para el caso del biorreactor el valor de kLa determinado fue de 0025 s-1
esto bajo condiciones estaacuteticas (sin crecimiento microbiano) y en las
condiciones de temperatura y operacioacuten previamente descritas
Como se puede observar dicho valor es praacutecticamente igual al obtenido
para el caso del matraz lo que indica condiciones de transferencia de oxiacutegeno
gas-liacutequido muy similares en ambos casos El valor dekLa fue determinado en
un punto lateral del reactor 2 cm por debajo del nivel de medio de cultivo y
contiguo a uno de los deflectores punto donde la transferencia de materia
debiera en principio ser mayor Dichos resultados se presentan en los graacuteficos
5 y 6
Graacutefico 5 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten mecaacutenica del medio de cultivo en biorreactor a 300 rpm
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
560
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Concentracioacuten
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 64
Graacutefico 6 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00246x ‐ 03222Rsup2 = 09902
000
050
100
150
200
250
300
0 20 40 60 80 100 120 140
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
64 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En lo referente a los niveles de oxiacutegeno a distintas concentraciones de γ-
PGA en condiciones estaacuteticas sin crecimiento microbiano se observa una
draacutestica reduccioacuten de dicho nivel conforme se incrementa la concentracioacuten del
biopoliacutemero Dicho fenoacutemeno es esperable dada la alta viscosidad del γ-PGA
La concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo alcanza un valor inicial de
74 mgL el cual se reduce draacutesticamente a 52 mgL a un valor de
concentracioacuten de γ-PGA de 14 gL Esta reduccioacuten es uacutenicamente producto de
la presencia del γ-PGA en el medio de cultivo El graacutefico 7 muestra dicho
fenoacutemeno hasta un valor miacutenimo de oxiacutegeno disuelto de 25 mgL cuando la
concentracioacuten de poliacutemero alcanza un maacuteximo 71 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 65
Graacutefico 7 Efecto de la concentracioacuten de γ-PGA sobre el nivel maacuteximo de oxiacutegeno disuelto en el
medio de cultivo E
y = ‐00569x + 64671Rsup2 = 08709
000
100
200
300
400
500
600
700
800
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Oxiacutegeno disuelto m
gL
γ‐PGA gL
Solubilidad O2 (mgL) Linear (Solubilidad O2 (mgL))
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γshyPGA mediante GPC
La curva de calibracioacuten obtenida a partir de soluciones con
concentracioacuten conocida de γ-PGA se presenta en el graacutefico 8
Como se puede observar se obtuvo un valor del coeficiente de
determinacioacuten R2 de 09983 lo que indica un ajuste lineal suficiente y un valor
del coeficiente de correlacioacuten R de 09991 lo que indica una correlacioacuten
positiva entre los datos contrastados La concentracioacuten de γ-PGA estaacute
determinada entonces por la siguiente ecuacioacuten
Concentracioacuten γ-PGA (gL) = (00027 x Aacuterea) ndash 00916
Esta curva fue posteriormente empleada para determinar la
concentracioacuten de γ-PGA en los caldos de cultivo obtenidos despueacutes de cada
una de las fermentaciones realizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 66
Graacutefico 8 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA mediante
GPC
y = 00027x ‐ 00916Rsup2 = 09983
0
2
4
6
8
10
12
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Concentracioacuten gL
Aacuterea
Series1 Linear (Series1)
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γshyPGA
En lo referente al efecto de la presioacuten (relativa) sobre la productividad en
γ-PGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a se encontroacute un incremento de los
rendimientos fermentativos conforme se incrementaba la presioacuten hasta
alcanzar un valor maacuteximo de sobrepresioacuten de 103 bar (15 psig) una vez
superado dicho umbral la productividad se veiacutea reducida draacutesticamente A 103
bar la productividad en γ-PGA alcanzaba un valor de 1334 gL productividad
mayor a la obtenida en condiciones de aireacioacuten (2 Lmin) a presioacuten
atmosfeacuterica la cual fue de 508 gL Esta productividad maacutexima contrasta con
la obtenida a presioacuten atmosfeacuterica la cual fue miacutenima con un valor de 217 gL
Los graacuteficos 9 y 10 muestran los resultados anteriormente comentados Asiacute
mismo en la tabla 8 se presentan la totalidad de fermentaciones llevadas a
cabo las productividades obtenidas y el promedio de cada condicioacuten Es
importante destacar que cada condicioacuten de presioacuten fue evaluada por duplicado
no encontraacutendose diferencias importantes entre los resultados obtenidos para
ninguno de los casos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 67
Graacutefico 9 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748
617
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 05 1 15 2 25
PGGA (gL)
Presioacuten (bar)
RENDIMIENTO gL
Graacutefico 10 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten y la aireacioacuten a presioacuten atmosfeacuterica (0 relativa)
sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748617 508
4582
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
0 052 103 172 241 0 +Aireacioacuten
Matraz
Concentracioacuten γ‐PGA gL
Presioacuten
RENDIMIENTO gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 68
Tabla 8 Fermentaciones realizadas y concentraciones de γ-PGA obtenidas
Reactor Condiciones A D C (gL)AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10108 5 130
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10926 5 141
AHJC11 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 11753 5 152
AHJC11 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10186 5 131
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 95011 5 122
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 97936 5 126
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28706 3 20
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28194 3 20
AHJC14 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 33184 3 24
AHJC14 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 32866 3 23
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 68396 3 52
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 65871 3 50
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43692 5 54
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 46235 5 57
AHJC16 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 49809 5 62
AHJC16 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 58872 5 74
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 57321 5 72
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43021 5 53
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 57727 5 72
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 62398 5 78
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 60469 5 76
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 58335 5 73
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 6083 5 76
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 57897 5 72
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 51267 5 64
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 48407 5 60
= nuacutemero de muestra A = aacuterea D = dilucioacuten C = concentracioacuten y bar = bar relativo
Algunos de los cromatogramas realizados se muestran en las figuras 10
y 11 Como se puede observar la forma del pico de elucioacuten demuestra que el
biopoliacutemero estaacute compuesto por moleacuteculas de distinta longitud por lo cual
existen diferentes pesos moleculares Es importante destacar que para la gran
mayoriacutea de las fermentaciones realizadas el pico siempre presentoacute su maacutexima
altura al inicio lo que demuestra que la mayor parte de eacutel se trataba de un
poliacutemero de alto peso molecular Igualmente esto podriacutea indicar poca
degradacioacuten del biopoliacutemero durante las 18 horas de fermentacioacuten lo cual es
importante dada la capacidad de Bacillus licheniformis ATCC9945a de
hidrolizar enzimaacuteticamente el γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 69
Figura 10 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA analizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 70
Figura 11 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA (052-103-172 y 241 bar relativas)
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γshyPGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a
En lo referente al efecto de la intensidad de agitacioacuten en rpm sobre la
produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a a una presioacuten de
103 bar relativos (15 psig) se encontroacute un efecto negativo del aumento de la
agitacioacuten por encima de las 300 rpm lo que se demuestra con una importante
reduccioacuten en la concentracioacuten final de γ-PGA obtenida despueacutes de 18 horas de
fermentacioacuten Estos resultados se presentan en el graacutefico 11 Como se puede
observar una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm llega a ser tan perjudicial
para el microorganismo que la productividad en γ-PGA cae por debajo del valor
de 1 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 71
Graacutefico 11 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis
ATCC9945a a 103 bar (15 psig) a 30 ordmC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
300 350 400 450 500 550 600 650 700
Concentracioacuten gL
Agitacioacuten rpm
RENDIMIENTO (gL)
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica resultoacute afectada por las condiciones de
presioacuten Como demuestra el graacutefico 12 la proporcioacuten de aacutecido L-glutaacutemico en
las muestras correspondientes a fermentaciones bajo presioacuten resultoacute ser por
mucho mayor a las observadas en los cultivos control tanto en comparacioacuten
con el de matraz como con el sometido a aireacioacuten
La respectiva curva de calibracioacuten con las muestras conformadas por
mezclas con composicioacuten definida de ambos enantioacutemeros se presente en el
graacutefico 13 Como se puede observar los valores teoacutericos y los valores
experimentales obtenidos en el cromatograma coinciden en buena medida lo
que indica la validez de esta teacutecnica para la determinacioacuten de la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA
En dos casos para las fermentaciones llevada a cabo a 052 bar y 172
bar de sobrepresioacuten (75 y 25 psig respectivamente) la proporcioacuten de aacutecido D-
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 72
glutaacutemico fue de cero en contraste con el control en matraz donde dicha forma
del aacutecido glutaacutemico estaba presente mayoritariamente en un 87
De igual manera en lo que concierne a la fermentacioacuten llevada a cabo a
presioacuten atmosfeacuterica y bajo condiciones de aireacioacuten se observa tambieacuten que el
enantioacutemero mayoritariamente presente es el aacutecido D-glutaacutemico con un 83
en contraste con el aacutecido L-glutaacutemico con apenas un 17 Todas las
fermentaciones llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten presentan un
contenido de aacutecido L-glutaacutemico superior al 83
Aunque no fue posible encontrar una correlacioacuten directa entre la presioacuten
y la composicioacuten porcentual en aacutecido D-glutaacutemico si es posible observar como
las condiciones de presioacuten parecen limitar condicionar o disminuir la presencia
de esta forma del aacutecido glutaacutemico en el γ-PGA
Graacutefico 12 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica en aacutecido
L-glutaacutemico y aacutecido D-glutaacutemica del γ-PGA producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a
R11 (103bar)
R12 (103bar)
R15 (0 +aireacioacuten)
R16 (241bar)
R19 (172bar)
R22 (052bar)
MATRAZ
AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO 9518 8319 1736 10000 8347 10000 1285
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO 482 1681 8264 000 1653 000 8715
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 73
Graacutefico 13 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-
PGA mediante HPLC
000
2900
4700
7700
970010000
7100
5300
2300
300
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
100 L 75 L 25 D 50 L 50 D 25 L 75 D 100 D
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO
69 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA
Los resultados de los pesos moleculares de los poliacutemeros obtenidos en
los distintos ensayos se muestran en la tabla 9 El peso molecular promedio de
permeacioacuten (Mp) de todas las muestras se encontroacute entre los 269-307 x 107
gmol
Tabla 8 Valores de peso molecular promedio en nuacutemero (Mn) peso molecular promedio en
peso (Mw) peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) y polidispersidad (PD) delγ‐PGA
producido en los distintos ensayos evaluados
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
MATRAZ1 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 157 214 29 137
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
MATRAZ2 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 160 216 292 135
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar relativos
207 252 307 122 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 74
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
204 252 307 124 PRIMERO MAYOR
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
202 252 307 125 PRIMERO MAYOR
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
199 251 307 126 PRIMERO MAYOR
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 200 247 307 123
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 226 26 306 115
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 179 223 281 125
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 172 221 264 128
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
217 248 304 114 PRIMERO MAYOR
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
210 246 304 117 PRIMERO MAYOR
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
195 233 284 120 SEGUNDO MAYOR
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
178 225 269 126 SEGUNDO MAYOR
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
223 262 306 118 PRIMERO MAYOR
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
222 261 306 117 PRIMERO PAYOR
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
207 254 307 122 PRIMERO MAYOR
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
187 251 306 134 PRIMERO MAYOR
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
171 246 306 144 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
185 253 306 136 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
202 252 306 125 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 75
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
232 263 306 113 PRIMERO MAYOR
AHJC32-1-18HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
173 228 307 132 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-2-18HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
177 230 306 130 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-1-36HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
165 220 23 133 IGUALES
AHJC32-2-36HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
173 224 302 130 IGUALES
Los valores de polidispersidad estuvieron entre 113 y 144 Asiacute mismo
no se observan mayores diferencias entre los pesos moleculares obtenidos a
distintas presiones aunque la existencia de un segundo pico era maacutes evidente
en los cromatogramas correspondientes a γ-PGA producido en condiciones de
presioacuten relativa 0 Asiacute mismo dichas muestras presentan un peso molecular
levemente menor aunque dicha tendencia no es absoluta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 76
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 77
9 DISCUSIOacuteN
71 Cepa empleada
Bacillus licheniformis ATCC9945a es una cepa que ha sido empleada
con eacutexito en la produccioacuten de γ-PGA particularmente a escala laboratorio maacutes
no ha sido empleada a escala industrial donde otras cepas particularmente de
la especie Bacillus subtilis han sido las preferidas tanto por aspectos de
rendimiento como estabilidad productiva de la cepa El presente estudio
determinoacute una productividad promedio en condiciones de matraz de 4582 gL
despueacutes de 72 horas de cultivo Valores de productividad tan altos no habiacutean
sido reportado previamente para Bacillus licheniformis ATCC9945a donde
valores entre 17 y 23 gL de rendimiento han sido reportados por Troy (1973)
Cromwick y Gross (1996) 26 a 35 gL por Bajaj y colaboradores (2009) y 35
gL por Yoon y colaboradores (2000)
Los motivos de este mayor rendimiento aunque no son claros pueden
deberse a una mejor transferencia de oxiacutegeno en el sistema de agitacioacuten
magneacutetica en comparacioacuten con la agitacioacuten orbital estaacutendar Asiacute por ejemplo y
utilizando la ecuacioacuten simplificada para determinar en valor de kLa en agitacioacuten
orbital (Diacuteaz 2011) tenemos que a 20 ordmC
kLa = 139 x 10-3n (VTVL)084
Asiacute tenemos que para un sistema en agitacioacuten orbital a 250 rpm es decir
a una frecuencia de 417 s-1 con un volumen de medio de cultivo de 100 mL y
un volumen total del matraz 500 mL el valor de kLa es de aproximadamente
0020 s-1 inferior al valor de 0026 s-1 obtenido en el presente estudio para el
cultivo en agitacioacuten magneacutetica a 30 ordmC Dado que la difusividad disminuye al
aumentar la temperatura es de esperar que a 30 ordmC dicho valor de kLa teoacuterico
sea auacuten menor
Es importante sentildealar que en lo referente a la composicioacuten del medio de
cultivo el medio de cultivo E empleado en este estudio es el mismo empleado
previamente por otros autores para el estudio de la produccioacuten de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a por lo cual no se considera que la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 78
composicioacuten del medio de cultivo pueda ser la responsable de las diferencias
con los resultados reportados anteriormente por otros investigadores quienes
en particular tambieacuten emplearon dicho medio de cultivo en sus pruebas
Dicho valor de rendimiento promedio obtenido de 4582 gL (en matraz)
coloca a este cepa al mismo nivel de productividad de las cepas
industrialmente empleadas como sucede con Bacillus subtilis F02-1 con un
rendimiento reportado por Kubota y colaboradores (1993) de 50 gL pero con
una menor necesidad de aacutecido glutaacutemico (20 gL en contra de 80 gL) La
conveniencia del empleo de la cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis debe
entonces evaluarse entorno a su capacidad de escalamiento y conservacioacuten de
la competencia en la produccioacuten de γ-PGA y no entorno a su maacuteximo
rendimiento pues en este aspecto ha demostrado en condiciones oacuteptimas la
capacidad de producir γ-PGA en concentraciones extremadamente elevadas
Los resultados acaacute obtenidos refuerzan lo ya descrito por otros autores quienes
sentildealan precisamente estos aspectos (escalamiento y estabilidad) como los
principales retos para llevar a cabo la produccioacuten de γ-PGA mediante Bacillus
licheniformis ATCC9945a
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente
Uno de los principales problemas que se enfrentoacute a lo largo de la
presente investigacioacuten es la facilidad con la cual la cepa ATCC9945a de
Bacillus licheniformis revierte a formas incapaces de producir γ-PGA Este
fenoacutemeno puede ocurrir incluso con tan soacutelo una generacioacuten de cultivo por lo
cual el empleo de la biomasa generada en una fermentacioacuten previa es
indeseable pues seguramente no daraacute resultados positivos para la produccioacuten
de γ-PGA
Este fenoacutemeno es uno de los principales inconvenientes que se
enfrentan a la hora de evaluar el efecto de diversos paraacutemetros sobre la
productividad de γ-PGA en esta cepa pues la incapacidad de garantizar
resultados reproducibles imposibilita poder evaluar condiciones nutricionales
de agitacioacuten temperatura y demaacutes teniendo la certeza que las diferencias
encontradas solo se deberaacuten a los paraacutemetros bajo control
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 79
Cromwick y colaboradores (1994) reportaron el congelamiento con
nitroacutegeno liacutequido como una forma vaacutelida para la preservacioacuten de las ceacutelulas en
un estado consistente de alta productividad de γ-PGA En nuestro caso la
metodologiacutea empleada fue distinta Se incorporoacute el glicerol como crioprotector y
el congelamiento no se realizoacute mediante nitroacutegeno liacutequido sino que fue
congelamiento convencional utilizando un equipo de refrigeracioacuten con una
capacidad de enfriamiento de hasta -80 ordmC y voluacutemenes de inoacuteculo pequentildeos
de entre 1 y 2 mL cuyo congelamiento fuera particularmente raacutepido
Igualmente se observoacute que los cultivos que mejor comportamiento y
reproducibilidad dieron como inoacuteculo fueron aquellos cuyas ceacutelulas eran
recolectadas previo al inicio de la produccioacuten de γ-PGA Cultivos cuya edad
superaba las 10 horas y que ya presentaban presencia de γ-PGA aunque
podiacutean emplearse para la obtencioacuten de inoacuteculos madres los mismos no
resultaban tan eficientes como los anteriormente descritos
El empleo de esta metodologiacutea de conservacioacuten de la cepa permitioacute una
reproducibilidad del 100 en los ensayos obtenieacutendose poliacutemero en la
totalidad de los cultivos de control que se establecieron durante cada una de
las fermentaciones llevadas a cabo en el biorreactor Estos resultados indican
que dicha metodologiacutea es eficaz para la preservacioacuten a largo plazo de Bacillus
licheniformis ATCC9945a y como estrategia para un adecuado escalamiento
durante el proceso de produccioacuten a mayor escala De igual manera la
descripcioacuten detallada del proceso de conservacioacuten volumen de inoacuteculo
concentracioacuten de la muestra (por absorbancia) temperatura y demaacutes permite
una alta reproducibilidad del meacutetodo en contraposicioacuten con los reportes
existentes por otros autores que no brindaban mayor detalles sobre coacutemo llevar
a cabo este proceso de conservacioacuten
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten
Las fermentaciones a presiones superiores a la presioacuten atmosfeacuterica no
son habituales tanto a nivel de investigacioacuten como a nivel de proceso Dicha
afirmacioacuten queda particularmente ratificada cuando se analizan las opciones
comerciales existentes a escala laboratorio de biorreactores disentildeados para
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 80
operar a presioacuten la cual resulta praacutecticamente nula Por este motivo y para
poder llevar a cabo este estudio se requirioacute adaptar un reactor quiacutemico de
modo tal que permitiese trabajar a presioacuten y a la vez tuviese un control de
agitacioacuten y temperatura miacutenimo de modo tal que permitiese el cultivo de
microorganismos El biorreactor disentildeado fue exitoso pues permitiacutea un
crecimiento microbiano oacuteptimo y la produccioacuten de γ-PGA en un tiempo
relativamente corto de 18 horas
Las modificaciones realizadas en realidad fueron miacutenimas con respecto
a la estructura baacutesica del reactor quiacutemico convencional y con ellas se buscoacute
crear las condiciones que permitiesen incrementar la turbulencia en el sistema
de modo que existiese una mayor oxigenacioacuten y un mayor coeficiente
volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno (kLa) partiendo de antemano de la
hipoacutetesis inicial que sentildealaba al oxiacutegeno como uno de los componentes
limitantes de hecho el de mayor importancia para que este fermentacioacuten
ocurriese de la manera adecuada y con un alto rendimiento de γ-PGA
Se decidioacute emplear un reactor hecho de vidrio en lugar de uno metaacutelico
debido a que las condiciones de oxidacioacuten de la fermentacioacuten y la sensibilidad
de las enzimas involucradas a los iones metaacutelicos haciacutean deseable un material
inerte como sucede con el vidrio De igual manera al emplearse vidrio se tiene
una visioacuten del interior del fermentador las condiciones de agitacioacuten y formacioacuten
de burbujas son visibles asiacute como el crecimiento microbiano lo que permite un
mejor ajuste y correccioacuten de las condiciones de fermentacioacuten al menos durante
las etapas iniciales de investigacioacuten Para poder trabajar a mayores presiones
se hubiese requerido un reactor quiacutemico metaacutelico de un costo sumamente
elevado Los resultados experimentales demostraron que el rango de presioacuten
definido resultoacute ser el correcto para la investigacioacuten
La seleccioacuten de una turbina tipo Rushton radica en que este tipo de
agitador de pala plana se considera como el ideal para la realizacioacuten de
fermentaciones Dado que las paletas de heacutelices Rushton son planas y
colocadas verticalmente a lo largo del eje de agitacioacuten producen un flujo radial
unidireccional que permite una alta difusioacuten de un gas en un liacutequido por lo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 81
comuacuten son utilizadas en la fermentacioacuten de liacuteneas celulares que requieren altas
tasas de oxiacutegeno tales como las levaduras bacterias y algunos hongos
Las laacuteminas deflectoras fueron incorporadas pues aunque a velocidades
muy bajas un agitador de paletas produce una agitacioacuten suave inclusive en un
tanque sin laacuteminas deflectoras cuando son necesarias velocidades elevadas
se requiere la incorporacioacuten de dichas laacuteminas para aumentar la turbulencia de
lo contrario el liacutequido se mueve como un remolino que gira alrededor del
tanque con velocidad elevada pero con poco efecto de mezcla
74 Tiempo de fermentacioacuten
El tiempo de fermentacioacuten empleado en esta investigacioacuten es
significativamente inferior al empleado por otros autores que hablan de un
promedio de 72 horas Es importante sentildealar que 18 horas es el tiempo
suficiente para que el pH del medio de cultivo descienda a cerca de 60
Valores de pH inferiores a este han demostrado ser perjudiciales pues decae
el consumo de aacutecido ciacutetrico se detiene en gran medida la polimerizacioacuten del γ-
PGA y la concentracioacuten tiende a disminuir con el paso del tiempo
Para poder aumentar el periacuteodo de fermentacioacuten se requeririacutea un
sistema de ajuste de pH que opere bajo condiciones del presioacuten mismo que no
se tuvo disponible Es probable que si se prolongara el tiempo de fermentacioacuten
dentro del biorreactor los rendimientos al cabo de 48 o 72 horas seriacutean un
poco mayores siempre y cuando se ajuste el pH en el valor de 65 como
recomiendan Cromwick y colaboradores (1995)
En nuestro caso el incremento del tiempo de fermentacioacuten sin
regulacioacuten del pH de 18 horas a 36 horas mostroacute un incremento miacutenimo en la
productividad (de 025 gL) pero si un cambio en la composicioacuten del γ-PGA
pues el pico de elucioacuten del poliacutemero se desplazoacute levemente hacia un valor de
tiempo mayor lo que podriacutea indicar una degradacioacuten parcial del poliacutemero
inicialmente producido Dichos datos se presentan en la figura 12
Nuestros resultados contradicen lo sentildealado por otros autores quienes
obtienen los mayores rendimientos entre las 48 y 96 horas Birrer y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 82
colaboradores (1995) observaron que Bacillus licheniformis ATCC9945a
alcanza la fase estacionaria a las 24 horas tiempo en el cual muy poco γ-PGA
ha sido formado y por consiguiente la mayor formacioacuten de γ-PGA acontece
entre las 24 y las 96 horas Estos resultados coinciden con los reportados por
Troy (1973) pero difieren a los observados por Goto y Kunioka (1992) con
Bacillus subtilis IFO3335 donde el mayor rendimiento se obtuvo desde las 24 y
hasta las 40 horas Estas diferencias podriacutean deberse a aspectos maacutes
relacionados con los voluacutemenes de fermentacioacuten empleados Por ejemplo para
el caso de Yoon y colaboradores (2000) estos alcanzaron rendimientos de 35
gL con un periacuteodo de fermentacioacuten maacuteximo de 35 horas indicando un
agotamiento del aacutecido ciacutetrico a las 20 horas en su caso el volumen empleado
fue de 1 litro de medio de cultivo
Figura 12 Cromatograma a las 18 (a) y 36 (b) horas de fermentacioacuten con Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 83
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento
Un punto vital para una adecuada fermentacioacuten es la concentracioacuten de
inoacuteculo aspecto que es sentildealado por Troy Cromwick y colaboradores a lo
largo de sus investigaciones pero que no detallan ni cuantifican
adecuadamente o al menos no lo reportan En nuestro caso se empleoacute un
inoacuteculo madre con una absorbancia de 25 o mayor y un inoacuteculo del reactor con
un valor de absorbancia de 120 aproximadamente con el propoacutesito de asiacute
logran estandarizar las condiciones de inoacuteculo Aunque este aspecto no fue
cuantificado a manera cualitativa si se observoacute un importante efecto de este
aspecto (concentracioacuten inicial) sobre la cantidad de γ-PGA obtenido y el tiempo
requerido Esto puede resultarnos obvio teniendo en cuenta una descripcioacuten no
estructurada del crecimiento microbiano pero podriacutea resultar maacutes compleja de
analizar si consideramos que la produccioacuten del γ-PGA estaacute afectada por
paraacutemetros de otra naturaleza maacutes allaacute de la disposicioacuten de nutrientes como
por ejemplo de una estructura celular particular o una relacioacuten de percepcioacuten
de quoacuterum dada Debemos recordar que la percepcioacuten de quoacuterum es un
mecanismo de regulacioacuten de la expresioacuten geneacutetica en respuesta a la densidad
de poblacioacuten celular Las ceacutelulas involucradas producen y excretan sustancias
llamadas autoinductores que sirven de sentildeal quiacutemica para inducir la expresioacuten
geneacutetica colectiva De Vizio (2011) sentildeala que en Bacillus licheniformis NCIMB
8874 la produccioacuten de lichenysin γ-PGA y algunas proteasas extracelulares
estaacute vinculado con los genes comQXPA mismo operoacuten que regula la
percepcioacuten de quoacuterum en Bacillus subtilis
De igual manera la relacioacuten de escalamiento aplicada fue de 16
ligeramente inferior a la que teoacutericamente se utiliza con mayor frecuencia de
110 Aunque este iacutendice no fue objeto de estudio su ajuste tambieacuten afecta de
manera directa los rendimientos obtenidos
La optimizacioacuten de la concentracioacuten del inoacuteculo la relacioacuten de
escalamiento y su frecuencia constituyen aspectos que deben estudiarse con
mayor profundidad para su propia optimizacioacuten pues su efecto sobre esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 84
fermentacioacuten y su rendimiento es bastante significativo Esta afirmacioacuten
adquiere validez cuando vemos que la produccioacuten del γ-PGA no es un
metabolito primario que se forme durante la fase de crecimiento exponencial
sino maacutes bien al inicio de la etapa estacionaria como indica Goto y Kunioka
(antildeo) o durante toda la etapa estacionaria tal y como lo sentildealan tanto Troy
(antildeo) como Birrer y colaboradores (1994) A esto debemos agregarle tambieacuten
lo anteriormente sentildealado referente a la concentracioacuten idoacutenea que produce la
percepcioacuten de quoacuterum responsable de direccionar el metabolismo de la
comunidad microbiana hacia la siacutentesis del γ-PGA
Conociendo la dependencia de esta biosiacutentesis de la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio y partiendo del hecho de que al inicio de la fase
estacionaria la concentracioacuten celular seraacute lo suficientemente alta para poner el
riesgo el mantenimiento de las condiciones aeroacutebicas en el biorreactor pero lo
justa para una adecuada siacutentesis del γ-PGA un inoacuteculo con una alta
concentracioacuten inicial de ceacutelulas podriacutea ayudar a obtener un mayor rendimiento
en un tiempo de fermentacioacuten menor o producir la respuesta de percepcioacuten de
quoacuterum (generalmente se trata de la liberacioacuten de un polipeacuteptido sentildeal) en un
tiempo menor con la consiguiente produccioacuten del γ-PGA
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa es un valor de
suma importancia para el escalamiento de bioprocesos en particular cuando
nos referimos a fermentaciones aeroacutebicas o cultivos de organismos o ceacutelulas
en condiciones de metabolismo aeroacutebico En nuestro caso un adecuado
coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno es garantiacutea que las
condiciones aeroacutebicas se sostendraacuten a lo largo del proceso de fermentacioacuten de
modo que no se produzcan desviacuteos metaboacutelicos indeseados o en el peor de
los casos el inicio del metabolismo anaerobio y la consecuente produccioacuten de
aacutecido aceacutetico
Los valores de kla obtenidos fueron de 0026 s-1 y 0025 s-1 para el
matraz y el bioreactor respectivamente Dichos valores por si mismos nos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 85
indican poco si no determinamos la tasa de consumo de oxiacutegeno requerida
para el cultivo aeroacutebico de Bacillus licheniformis Doran (1995) reporta una
velocidad de consumo de oxiacutegeno m02 para el cultivo aeroacutebico de Bacillus
licheniformis de 231 x 10-5 gO2 g-1cel s
-1 si la concentracioacuten de ceacutelulas X en el
reactor es de 20 gL (determinado experimentalmente como el valor final
alcanzado en matraces con alta concentracioacuten de γ-PGA) la tasa de consumo
de oxiacutegeno (OUR) MO2 seraacute igual a Xm02 es decir 46 x 10-4 mgO2mL-1s-1 A
partir de estos datos y conociendo que kla = MO2ΔcA ΔcA = cA ndash cA sabiendo
que presioacuten atmosfeacuterica cA = 801 mgL a 30 ordmC y el valor cA en el biorreactor
a 30 ordmC es 74 mgL obtenemos un valor de kla del orden de 0062 s-1 Dicho
valor corresponde al valor teoacuterico que seriacutea necesario para mantener el cultivo
con el suministro adecuado y suficiente de oxiacutegeno y que como puede verse
es 25 veces mayor al kla real lo que indica que cuando el cultivo alcance la
maacutexima concentracioacuten celular de 20 gL las condiciones del cultivo no seraacuten
suficientes para un metabolismo cien por ciento aeroacutebico
Tiene sentido entonces que los rendimientos alcanzados en matraz sean
significativamente mayores que los mejores rendimientos obtenidos en
bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica Dado que el cultivo en matraz incorporaba
uacutenicamente 100 mL de medio de cultivo el microorganismo es capaz de
alcanzar una mayor concentracioacuten en una menor unidad de tiempo lo que le
permite alcanzar una mayor concentracioacuten de poliacutemero durante las 26 horas de
cultivo (8 iniciales + 18)
Por su parte para el caso del biorreactor el crecimiento oacuteptimo
probablemente demore maacutes en alcanzarse por lo cual el tiempo que transcurre
entre el alcance de la concentracioacuten limitante de 8 gL (concentracioacuten a la cual
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y la tasa de consumo de oxiacutegeno
(OUR) se igualan) y la concentracioacuten oacuteptima es lo suficiente como para afectar
los rendimientos de γ-PGA Esto resulta evidente al comparar los resultados de
matraz con los de bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica (0 bar relativos) donde la
diferencia en productividad entre ambos es de 43 gL de γ-PGA Dicha
diferencia se explica porque mientras que la concentracioacuten del inoacuteculo madre
mostraba una absorbancia promedio de 25 la del inoacuteculo empleado para el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 86
biorreactor era de 120 (100 ml de medio + inoacuteculo madre creciendo durante 8
horas) es decir praacutecticamente la mitad por lo cual la concentracioacuten inicial de
ceacutelulas era significativamente menor para el biorreactor en comparacioacuten con el
matraz
77 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En condiciones estaacuteticas el contenido de γ-PGAdemostroacute reducir
considerablemente la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
pasando de 74 mgL a 440 mgL a una concentracioacuten del 20 en γ-PGA
Este fenoacutemeno puede deberse al incremento de la viscosidad por la
presencia del poliacutemero en el caldo de cultivo Dicha apreciacioacuten seguramente
afecta de manera negativa la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) pues
reduce tanto cA como cA sin embargo la determinacioacuten del valor de c
A de una
solucioacuten compuesta por sales γ-PGA y productos del metabolismo microbiano
es imposible de determinar teoacutericamente con certeza como para poder
cuantificar la magnitud de reduccioacuten de la OTR numeacutericamente De igual
manera el valor de kLa tambieacuten se ve afectado pues es sabido que a mayor
viscosidad mayor resistencia a la transferencia lo que reduce el valor de este
coeficiente
Asiacute mismo esta reduccioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
podriacutea deberse en parte a la naturaleza anioacutenica del poliacutemero y no solamente
al incremento de la viscosidad La solubilidad se ve afectada por la fuerza
ioacutenica por lo cual una solucioacuten con una concentracioacuten elevada de un poliacutemero
polianioacutenico como el γ-PGA probablemente muestre una importante reduccioacuten
en la solubilidad maacutexima (concentracioacuten de saturacioacuten) del oxiacutegeno en la
misma(Schumpe et al 1978)
Queda claro que dada esta reduccioacuten en la solubilidad de oxiacutegeno al
incrementar el contenido de γ-PGA durante la fermentacioacuten ya sea por la
naturaleza viscosa del biopoliacutemero o por su caraacutecter polianioacutenico la tasa de
transferencia de oxiacutegeno inicial y el valor de kLa se van reduciendo a lo largo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 87
del tiempo lo que dificulta auacuten maacutes garantizar las condiciones de oxigenacioacuten
oacuteptimas para este bioproceso Esto lo podemos explicar pues si tenemos que
OTR = kLa(cA-cA)
dado que al aumentar el contenido de γ-PGA ocurre una reduccioacuten en el valor
de kLa por accioacuten del incremento de la viscosidad (hecho que es
completamente cierto) y al aumentar la concentracioacuten de γ-PGA tambieacuten se
reduce tanto el valor de cA como el de cA (ya sea por efecto de la viscosidad o
de la naturaleza anioacutenico del poliacutemero) la OTR ve su magnitud evidente e
inevitablemente reducida dado que la misma es una relacioacuten de producto entre
ambos factores kLa y (cA ndashcA) Esto podriacutea explicar porque a voluacutemenes de
cultivo de 600 mL (en biorreactor) los rendimientos son mucho menores que en
voluacutemenes de cultivo de 100 ml (matraz) pues probablemente esta caiacuteda en la
OTR sea maacutes acentuada y criacutetica para los microorganismos cuando sucede a
voluacutemenes mayores donde mantener las condiciones de mezcla perfecta y una
alta concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto resultan maacutes dificultosas por lo que el
microorganismo es incapaz de crecer y alcanzar la concentracioacuten idoacutenea para
una maacutexima produccioacuten
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γshyPGA
La concentracioacuten de γ-PGA alcanzada al final de las 18 horas de
fermentacioacuten se vio afectada por la presioacuten Asiacute hasta los 103 bar a mayor
presioacuten mayor concentracioacuten de γ-PGA por encima de este valor de presioacuten la
concentracioacuten de γ-PGA disminuye
Esto puede explicarse por dos factores 1) el efecto de la presioacuten sobre
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y 2) impacto sobre la integridad y
viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γ-PGA
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR
La OTR se ve afectada tanto por el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de oxiacutegeno kLa asiacute como por la diferencia entre la concentracioacuten
de saturacioacuten y la concentracioacuten real en la fase liacutequida (cA-cA) El coeficiente kL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 88
es empiacuterico y su valor depende principalmente de factores tales como la
hidrodinaacutemica del sistema la turbulencia y su geometriacutea
Teoacutericamente kL se puede definir como kL = DABδ donde DAB es la
difusividad de A en B y δ es el espesor de la peliacutecula estancada seguacuten la
teoriacutea de peliacutecula para la transferencia de materia La difusividad en liacutequidos
depende en gran medida de la temperatura (afecta el coeficiente de difusioacuten) y
la concentracioacuten de solutos pero muy poco de la presioacuten (Diacuteaz 2011) En
nuestro caso podriacuteamos suponer que la presioacuten tiene poco efecto sobre kLa
pues tampoco es de esperar un cambio producto de la presioacuten en el aacuterea de
burbujas (a) producida por la agitacioacuten mecaacutenica auacuten maacutes cuando vemos el
hecho de que los ensayos llevados a cabo no contaron con un sistema de
aireacioacuten o burbujeo especiacutefico salvo aquel llevado a presioacuten atmosfeacuterica (0
bar relativa) y debidamente identificado como Aireacioacuten
Asiacute entonces tenemos en el segundo componente de la foacutermula la
diferencia (cA-cA) un punto de particular intereacutes pues efectivamente la
concentracioacuten de saturacioacuten y la concentracioacuten real variacutean con la presioacuten A
pesar de carecer de una sonda de oxiacutegeno disuelto directamente incorporada
al biorreactor y capaz de operar a presioacuten se determinoacute mediante transferencia
(con el sistema cerrado) la concentracioacuten real de oxiacutegeno en el medio de
cultivo a distintas presiones Tales concentraciones y las concentraciones de
saturacioacuten a cada presioacuten se presentan en el graacutefico 14
Para determinar el valor de las distintas concentraciones de saturacioacuten
al trabajar a presiones distintas a la atmosfeacuterica se realizoacute la siguiente
correccioacuten (Montoya amp Bermuacutedez 2003) para el valor de la solubilidad del
oxiacutegeno en agua
Ley de Henry
a 1 atm
Para una presioacuten P distinta a 1 atm tenemos que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 89
en mgL
Donde
C(S) = valor de solubilidad a 1 atm (mgL)
P = presioacuten de operacioacuten (atm)
T = temperatura de operacioacuten (K)
Graacutefico 14 Concentraciones de oxiacutegeno de saturacioacuten y en fas liacutequida a diferentes presiones
en medio de cultivo E sin crecimiento bacteriano
80
153
227
324
422
6681
141154
178
141
724857
1703
2438
y = 48525x + 68875
y = 14191x + 80039
y = 93382x + 11163
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
00
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 05 1 15 2 25 3
Concentracioacuten
Presioacuten (bar)
CONCENTRACIOacuteN DE SATURACIOacuteN CONCENTRACIOacuteN EN FASE LIacuteQUIDA DIFERENCIA
Aunque estos valores deben repetirse con una sonda de oxiacutegeno
disuelto interna (dentro del biorreactor) y bajo una metodologiacutea maacutes pertinente
preliminarmente puede observarse que la diferencia (cA-cA) aumenta al
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 90
aumentar la presioacuten y dado que OTR = kLa(cA-cA) al aumentar dicha
diferencia la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deberiacutea ser mayor Este
incremento de la OTR podriacutea explicar el porqueacute del raacutepido crecimiento
microbiano y la produccioacuten precoz de γ-PGA despueacutes de 18 horas de cultivo
en comparacioacuten con las entre 48 y 96 horas reportadas por otros autores asiacute
como el aumento del rendimiento al aumentar la presioacuten de los 0 bar relativos
(a presioacuten atmosfeacuterica) hasta los 103 bar relativos
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γshyPGA
Al superar los 103 bar relativos el rendimiento en γ-PGA decae
nuevamente Si consideramos un efecto positivo de la presioacuten sobre la OTR
como sentildealamos anteriormente esto no deberiacutea ocurrir Sin embargo al
someter las ceacutelulas a condiciones de presioacuten desconocemos el efecto que
dicha presioacuten puede ejercer sobre los microorganismos y sus rutas
metaboacutelicas asiacute como sobre la estructura de algunas biomoleacuteculas como por
ejemplo proteiacutenas
Meersman y Heremans (2008) sentildealan que el efecto de la presioacuten sobre
el crecimiento de los microorganismos puede explicarse por tres efectos
principales 1) Variaciones en el plegamiento y agregacioacuten de las proteiacutenas 2)
Variaciones en el estado de la membrana celular y 3) Variaciones en el
contenido de proteiacutenas asociadas a la membrana celular Estos aspectos son
de peculiar consideracioacuten pues la γ-PGA sintetasa es un complejo enzimaacutetico
formado por al menos tres unidades enzimaacuteticas distintas y que se encuentra
asociado a la membrana celular de Bacillus licheniformis
En lo referente a las proteiacutenas se sabe que su desnaturalizacioacuten se
produce por efecto de una reduccioacuten en su volumen producto de un cambio
configuracional probablemente de la estructura terciaria Asiacute tenemos que si el
volumen inicial de una proteiacutena viene dado por Vi = Vatomos + Vcavidades +
Vhidratacioacuten si en condiciones de presioacuten ocurre un cambio en el volumen de la
proteiacutena tal que ΔV = ΔVcavidades + ΔΔVhidratacioacuten(el volumen de los aacutetomos no
tiene por queacute variar con la presioacuten) la exposicioacuten de los grupos cargados o
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 91
hidrofoacutebicos de la proteiacutena al agua pueden conllevar a un cambio en la
estructura secundaria y terciaria de modo que la actividad de la proteiacutena se
vea perjudicada parcial o totalmente Esto se debe a que un aumento en la
presioacuten rompe las interacciones hidrofoacutebicas donde las interacciones proteiacutena-
proteiacutena son sustituidas por interacciones proteiacutena-agua particularmente
mediante puente de hidroacutegeno El incremento de la presioacuten podriacutea afectar la
conformacioacuten de alguno o algunos de los componentes del complejo
enzimaacutetico γ-PGA sintetasa lo que sin duda alguna se traduciriacutea en un menor
rendimiento en γ-PGA durante la fermentacioacuten Este posible efecto negativo de
la presioacuten sobre una de las enzimas involucradas en el proceso de biosiacutentesis
del γ-PGA se reafirma cuando vemos como variacutea la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA al aumentar la presioacuten aspecto que se discutiraacute con mayor detalle
maacutes adelante De hecho Ashiuchi y colaboradores (2004) sentildealan que el
complejo enzimaacutetico PgsBCA (γ-PGA sintetasa) es imposible de aislar en su
estado activo debido precisamente a su alta inestabilidad y elevada
hidrofobicidad
Por su parte la membrana celular al tratarse de una bicapa fosfolipiacutedica
es susceptible a sufrir cambios de fase producto de la temperatura o la presioacuten
como por ejemplo la transicioacuten gel-liacutequido El incremento de la presioacuten al igual
que sucede con la temperatura concede mayor fluidez a las bicapas lipiacutedicas
Asiacute en nuestro caso un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea permitir
una mayor difusioacuten de oxiacutegeno al interior celular lo que podriacutea afectar el
crecimiento bacteriano si por ejemplo se formase maacutes especies reactivas
toacutexicas de oxiacutegeno en el interior celular o si cierta maquinaria celular como la
misma γ-PGA sintetasa no fuese capaz de acoplarse adecuadamente en una
membrana con mayor fluidez
En lo referente a la interaccioacuten membrana celular-proteiacutenas es
importante destacar que entre el 20 y el 40 de las proteiacutenas de una ceacutelula
bacteriana suelen estar asociadas a esta estructura Como indicamos
anteriormente un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea afectar el
contenido concentracioacuten y capacidad de anclaje de las proteiacutenas a la
membrana celular El complejo enzimaacutetico γ-PGA sintetasa al tratarse de una
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 92
proteiacutena de membrana podriacutea no acoplarse de manera efectiva a la membrana
celular modificada bajo condiciones de presioacuten o ser liberada al medio de
cultivo lo que afectariacutea negativamente la produccioacuten de γ-PGA Estas
suposiciones podriacutean explicar el porqueacute de la gran cantidad de espuma
generada durante algunas fermentaciones a presioacuten (concretamente en
aquellas a una presioacuten superior a los 103 bar) a pesar de su menor
concentracioacuten de γ-PGA y teniendo presente que en las fermentaciones
microbianas la espuma suele estar constituida mayoritariamente por proteiacutenas
la presioacuten podriacutea estar favoreciendo la liberacioacuten de estas proteiacutenas al caldo de
cultivo y la consecuente formacioacuten abundante de espuma Este fenoacutemeno ya
ha sido reportado en otros microorganismos como Salmonella enterica donde
el tratamiento con presioacuten conllevaba a la peacuterdida de gran parte de sus
proteiacutenas de membrana y su consecuente liberacioacuten al medio de cultivo
(Meersman amp Heremans 2008) Esto se ve respaldado con las observaciones
de Ashiuchi y colaboradores (2004) quienes adicionaron detergentes como el
Tween20 y Triton X-114 (que modifican la estabilidad de la membrana celular y
favorece la liberacioacuten de las proteiacutenas asociadas a ella) a cultivos de Bacillus
spp productores de γ-PGA Ellos observaron una peacuterdida total de la capacidad
de siacutentesis del γ-PGA capacidad que no se recuperaba ni siquiera removiendo
la totalidad de dichos detergentes mediante diaacutelisis con lo cual concluyeron
que es indispensable que el complejo γ-PGA sintetasa se encuentre asociado a
la membrana celular para ser bioloacutegicamente activo
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γshyPGA
Un incremento de la intensidad de agitacioacuten afectariacutea positivamente el
valor de kLa incrementaacutendolo al aumentar el aacuterea de intercambio mediante una
mayor ruptura de las burbujas lo que aumenta el aacuterea de intercambio por
unidad de volumen Sin embargo existen liacutemites para la velocidad de agitacioacuten
esto debido al dantildeo ocasionado a los organismos debido a un esfuerzo
cortante excesivo A pesar de que la turbina Rushton es el impulsor de flujo
axial maacutes recomendado y maacutes eficiente para generar una mezcla perfecta de
alto perfil hidrodinaacutemico un bajo esfuerzo cortante y una alta distribucioacuten un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 93
exceso de agitacioacuten bajo condiciones de presioacuten es evidentemente perjudicial
Es probable que al aplicar presioacuten positiva sobre el cultivo la membrana celular
se encuentre en un estado de fluidez mayor al que presentariacutea a presioacuten
atmosfeacuterica asiacute mismo la presencia de glicerol en el medio de cultivo modifica
la composicioacuten lipiacutedica de la membrana favoreciendo la salida del γ-PGA al
exterior celular al aumentar de igual manera su fluidez Esto queda demostrado
por nuestros resultados a velocidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm
donde ocurre una reduccioacuten de la productividad conforme se aumenta la
agitacioacuten De igual manera la excesiva formacioacuten de espuma que se genera a
intensidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm podriacutea indicar la ruptura celular
y la liberacioacuten de componentes celulares y macromoleacuteculas al caldo de
fermentacioacuten Estas observaciones contradicen lo reportado por otros autores
(Yoon et al 2000) quienes indican velocidades de agitacioacuten oacuteptimas de hasta
1000 rpm a presioacuten atmosfeacuterica para un biorreactor de 24 L y un volumen
efectivo de cultivo de 1 L aunque no se brindan mayor detalle en lo referente al
tipo de turbina empleada
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
El cambio de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producto de la
presioacuten fue un resultado inesperado pues tradicionalmente se habiacutea sentildealado
a la concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo como el principal
responsable de controlar este aspecto Es importante destacar el hecho que
dicho cambio en la composicioacuten no es parcial o escalonado sino que por el
contrario el hecho de aplicar presioacuten durante la fermentacioacuten invierte
praacutecticamente los contenidos de aacutecido D-glutaacutemico y aacutecido L-glutamico de 87
y 13 respectivamente a presioacuten atmosfeacuterica (cultivo en matraz) a 17 y 83
respectivamente a una presioacuten relativa de 103 bar En algunos casos el
contenido de aacutecido D-glutaacutemico fue praacutecticamente 0
Efectivamente se sabe que el complejo γ-PGA sintetasa es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico aunque todaviacutea se
desconoce la arquitectura bioloacutegica de esta sintetasa Igualmente se sabe que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 94
es el componente PgsB el mayormente responsable de la cataacutelisis enzimaacutetica
(reaccioacuten de elongacioacuten del γ-PGA) (Ashiuchi 2010) Una hipoacutetesis que podriacutea
explicar estos resultados es que bajo presioacuten la estructura de esta proteiacutena se
modifique parcialmente (tanto la estructura de la proteiacutena propiamente dicha
como la estructura en funcioacuten de su anclaje a la membrana celular) lo
suficiente como para reducir su afinidad por el aacutecido D-glutaacutemico pero sin
afectar su afinidad por el aacutecido L-glutaacutemico ni conllevar a una
desnaturalizacioacuten de la proteiacutena y la consiguiente peacuterdida total de la actividad
enzimaacutetica Dado que es poco lo que se conoce de la estructura y mecanismo
de accioacuten de esta proteiacutena PgsB es imposible poder determinar con mayor
detalle el coacutemo pueden darse este cambio en la proteiacutena aunque casos
similares se observan durante la desnaturalizacioacuten de proteiacutenas por
temperatura donde las enzimas que operan sobre muacuteltiples sustratos no
pierden su capacidad enzimaacutetica de manera total sobre todos ellos sino que
inicialmente acontece una peacuterdida de afinidad diferenciada seguacuten el sustrato
hasta llegar al punto de desnaturalizacioacuten total donde se pierde toda actividad
enzimaacutetica para todos los sustratos
De igual manera es conocido que existe en Bacillus licheniformis una
enzima racemasa de naturaleza citosoacutelica responsable de transformar el aacutecido
L-glutaacutemico en aacutecido D-glutaacutemico podriacutea entonces tambieacuten asumirse alguacuten
efecto de la presioacuten sobre la actividad de la misma Sin embargo el hecho de
que esta enzima no esteacute asociada a una membrana celular (las proteiacutenas
asociadas a membrana celular tienden a ser maacutes vulnerables a los cambios de
presioacuten por la complejidad e indispensabilidad de su estructura terciaria sobre
su funcioacuten y su anclaje) sea una enzima de un uacutenico dominio y a que
experimentalmente el contenido de aacutecido D-glutaacutemico inclusive a la maacutexima
presioacuten (241 bar) no es cero hacen suponer que la misma se encuentra
bioloacutegicamente activa bajo las condiciones de presioacuten evaluadas
Estos resultados son de suma importancia pues para aplicaciones
biomeacutedicas y farmaceacuteuticas es necesario que el γ-PGA presente un alto
contenido en aacutecido L-glutaacutemico isoacutemero que es reconocido por el organismo
humano El efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre esta composicioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 95
enantiomeacuterica constituye un descubrimiento que pueda facilitar el empleo del γ-
PGA en medicina y que puede ser clave en el disentildeo de un proceso productivo
optimizado para tal fin
711 Peso molecular del γshyPGA En lo correspondiente al peso molecular del γ-PGA se observa que el
tamantildeo del poliacutemero es grande aunque no se observa ninguna tendencia en
los datos que pueda suponer alguacuten efecto de la presioacuten sobre el peso
molecular del poliacutemero Es importante sentildealar que la columna cromatograacutefica
empleada es incapaz de resolver moleacuteculas del alto peso molecular por lo
cual aunque si bien los resultados obtenidos resulten uacutetiles a nivel
comparativo dichos resultados deben tomarse con precaucioacuten Para un mejor
anaacutelisis seriacutea necesario emplear una columna capaz de resolver altos pesos
moleculares
Es importa sentildealar ademaacutes que tal y como se comentoacute anteriormente y
como se muestra en la figura 12 se observa una reduccioacuten del peso molecular
al prolongar el tiempo de fermentacioacuten hasta las 36 horas Para el caso del
reactor AHCJ32 al prolongar el tiempo de fermentacioacuten por 18 horas maacutes se
nota una reduccioacuten en la fraccioacuten de mayor peso molecular y un incremento en
la de menor sin que haya un cambio importante en el rendimiento global Esto
podriacutea deberse a que Bacillus licheniformis ATCC9945a posee enzimas
capaces de hidrolizar el γ-PGA y emplearlo como fuente de carbono Asiacute
mismo dicha observacioacuten sentildeala que si es necesario prolongar el tiempo de
fermentacioacuten es requerido realizar ajustes pues parece ser que la prolongacioacuten
por siacute misma uacutenicamente no es garantiacutea de una mejora en el rendimiento del
proceso fermentativo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 96
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 97
10 CONCLUSIONES
De la elaboracioacuten de la presente investigacioacuten se pueden extraer las
siguientes conclusiones principales
1) El rendimiento promedio en γ-PGA para el cultivo en matraz fue
superior a los 45 gL Dicho rendimiento es el mayor que se haya
reportado hasta la fecha para Bacillus licheniformis ATCC9945a lo
que convierte a esta cepa en una de las que mejor rendimiento
maacuteximo reporta para la biosiacutentesis de dicho poliacutemero natural
2) Un mecanismo eficiente para la conservacioacuten de cultivos de Bacillus
licheniformis ATCC9945a en un estado competente de produccioacuten
de γ-PGA es el congelamiento de ceacutelulas vegetativas a una
temperatura de -80 ordmC Es importante que la absorbancia de las
muestras congeladas sea superior a 25 lo que garantiza una alta
concentracioacuten de ceacutelulas
3) Dada la naturaleza del γ-PGA y su viscosidad el aumento de su
concentracioacuten en el caldo de cultivo a lo largo del tiempo de
fermentacioacuten afecta de manera negativa la tasa de transferencia de
oxiacutegeno disminuyeacutendola paulatinamente El cambio a condiciones
anaeroacutebicas conlleva a la detencioacuten de la biosiacutentesis del γ-PGA y el
consecuente inicio de un metabolismo netamente anaeroacutebico
4) Bacillus licheniformis ATCC9945a es capaz de crecer eficientemente
a presiones de hasta 242 bar relativos no vieacutendose afectado desde
el punto de vista de viabilidad por el incremento de la variable
presioacuten de fermentacioacuten
5) La presioacuten de fermentacioacuten afecta de manera significativa la
productividad de Bacillus licheniformis ATCC9945a en γ-PGA
6) El incremento de la presioacuten de fermentacioacuten hasta los 103 bar
relativos aumenta la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo de cultivo
seis veces (de 218 gL a 1334 gL) en comparacioacuten a los
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 98
rendimientos obtenidos a presioacuten atmosfeacuterica para un periacuteodo de
proceso de 18 horas
7) A presiones de fermentacioacuten superiores a los 103 bar la
productividad decae en comparacioacuten a la obtenida a dicha presioacuten
sin embargo la misma sigue siendo superior a la obtenida a presioacuten
atmosfeacuterica para un periacuteodo de proceso de 18 horas
8) El aumento de la presioacuten probablemente incremente la tasa de
transferencia de oxiacutegeno al incrementar la concentracioacuten de
saturacioacuten del mismo en el medio de cultivo lo que genera un
gradiente de concentracioacuten que permite una mayor transferencia
9) Presiones superiores a 103 bar probablemente afecten estructuras
celulares o biomoleacuteculas tales como las membranas celulares y las
proteiacutenas (γ-PGA sintasa) lo que tiene un efecto perjudicial sobre la
biosiacutentesis de γ-PGA
10) A una temperatura de 30 ordmC y a una presioacuten de 103 bar la
intensidad de agitacioacuten oacuteptima es de 300 rpm Una magnitud de
agitacioacuten mayor produce el dantildeo celular posiblemente por un exceso
de tensioacuten cortante
11) La presioacuten de fermentacioacuten modifica la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA A presioacuten atmosfeacuterica el γ-PGA estaacute compuesto
mayoritariamente por aacutecido D-glutaacutemico A presiones entre 052 y
242 bar dicha composicioacuten se revierte siendo el aacutecido L-glutaacutemico
el isoacutemero maacutes comuacutenmente presente en el γ-PGA
12) La biosiacutentesis de γ-PGA a presioacuten constituye una forma eficiente de
producir un biopoliacutemero mayoritariamente conformado por residuos
de aacutecido L-glutaacutemico aspecto de vital importancia para su aplicacioacuten
biomeacutedica dado que es este isoacutemero del aacutecido glutaacutemico es que es
reconocido y asimilado por el organismo humano
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 99
13) Aunque la modificacioacuten de la presioacuten de fermentacioacuten nunca ha sido
una variable importante en el estudio de los rendimientos para
distintos bioprocesos la presente investigacioacuten demuestra que la
modificacioacuten de dicha variable no soacutelo permite mejorar el
rendimiento global del proceso sino que tambieacuten puede conllevar a
la modificacioacuten del producto final lo que significariacutea una nueva rama
para la investigacioacuten en el disentildeo de bioprocesos de intereacutes
industrial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 100
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 101
11 AGRADECIMIENTOS
Un agradecimiento especial al profesor Jordi Bou por brindarme la
oportunidad de trabajar a su lado en este proyecto por el seguimiento y
asesoriacutea brindada a lo largo del mismo que nos permitioacute alcanzar nuestros
planteamientos y objetivos Espero que los aportes brindados con la presente
investigacioacuten permitan un mejor desarrollo en el futuro de estas temaacuteticas tan
novedosas biopoliacutemeros y fermentaciones bajo condiciones de presioacuten
positiva
Igualmente a la Ing Alejandra Hernaacutendez por la colaboracioacuten y asistencia
brindada durante esta investigacioacuten fue un apoyo importante durante el
desarrollo de las metodologiacuteas y distintas pruebas que se requirieron a lo largo
de esta investigacioacuten
A la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el Desarrollo
(AECID) y a Casa Ameacuterica Cataluntildea que me brindaron la oportunidad de cursar
este programa de maacutester a traveacutes de su programa de extensioacuten de becas a
ciudadanos extranjeros ha sido una oportunidad de crecimiento personal y
profesional que alcanza su punto maacuteximo con la elaboracioacuten de la presente
investigacioacuten El conocimiento adquirido sin duda alguna seraacute un valioso
compantildeero en mi desempentildeo profesional futuro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 102
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 103
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Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 11
4 PREFACIO
21 Origen del proyecto
Este proyecto forma parte de una serie de estudios llevados a cabo en
el ETSEIB referentes al empleo y produccioacuten de biopoliacutemeros en Cataluntildea
Anteriormente no solo se ha investigado en torno a la produccioacuten mediante
fermentacioacuten del biopoliacutemero aacutecido poliglutaacutemico sino tambieacuten sobre la
produccioacuten de aacutecido polilaacutectico y su biodegradabilidad entre otros
Una de las principales limitantes que han encontrado los estudios
previos sobre produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico en medio liacutequido mediante
fermentacioacuten sumergida es la dificultad del escalamiento muy probablemente
debido a la reduccioacuten en la tasa de transferencia de oxiacutegeno al aumentar los
voluacutemenes de cultivo lo que conlleva a rendimientos pobres o a la generacioacuten
de un poliacutemero de bajo peso molecular Asiacute mismo la reproducibilidad de los
resultados es pobre en parte por muacuteltiples factores que fueron estudiados con
mayor detalle en este trabajo
Con el propoacutesito de dar solucioacuten a este problema el presente proyecto
plantea una forma diferente y creativa al menos no es la comuacuten en el aacutembito
microbioloacutegico de abordar la limitacioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
durante la fermentacioacuten y que podriacutea ser la responsable de la reduccioacuten en los
rendimientos Asiacute mediante la aplicacioacuten de condiciones de presioacuten positiva se
plantea una posible viacutea de mejora de los rendimientos fermentativos en la
produccioacuten de aacutecido poliglutaacutemico esperando que sus efectos sobre la
viabilidad microbiana sean los menores posibles
22 Motivacioacuten
En la sociedad actual existe una creciente buacutesqueda de soluciones
bioloacutegicas para los problemas que anteriormente abordaacutebamos desde una
percepcioacuten uacutenicamente quiacutemica Asiacute hoy en diacutea con el propoacutesito de garantizar
la preservacioacuten del medio ambiente reducir el impacto de la actividad humana
sobre las especies animales y vegetales y garantizar un planeta a las futuras
generaciones la palabra biopoliacutemero y bioplaacutestico se han vuelto maacutes y maacutes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 12
comunes tanto en el argot popular como en el aacutembito del conocimiento
cientiacutefico donde diacutea con diacutea son maacutes las investigaciones orientadas a este tipo
de productos de naturaleza bioloacutegica y por consiguiente biodegradable
El aacutecido poliglutaacutemico por sus caracteriacutesticas constituye un poliacutemero
natural que ofrece una amplia gama de aplicaciones industriales donde puede
ser empleado tanto como agente espesante o floculador hasta aplicaciones
maacutes novedosas relacionadas con la medicina y la farmacia
En este contexto de buacutesqueda de soluciones amigables con el ambiente
es donde surge la principal motivacioacuten para investigar sobre el aacutecido
poliglutaacutemico en particular sobre coacutemo aumentar la productividad del proceso
fermentativo a partir del cual se realiza su siacutentesis de modo que las ventajas
teoacutericas que ofrece este producto pronto esteacuten disponibles tanto para el
consumidor como para la industria Tristemente los productos biotecnoloacutegicos
casi siempre tienen como principal inconveniente la valoracioacuten econoacutemica
pues tienden a ser difiacuteciles de producir por lo que tienen altos costos
asociados o sus rendimientos son menores a los deseados para hacerlos
econoacutemicamente rentables Por este motivo las investigaciones deben
procurar al menos orientarse a ofrecer soluciones que alguacuten diacutea puedan ser
llevadas a la praacutectica o como sucede con esta investigacioacuten procurar dar
respuesta a los problemas que se enfrentan cuando se trata de llevar un
producto biotecnoloacutegico a la realidad
La importancia de la investigacioacuten biotecnoloacutegica en el campo de los
materiales radica en que en un mundo con materias primas limitadas
particularmente las fuentes foacutesiles los materiales del futuro tendraacuten un origen
maacutes bioloacutegico que mineral o extractivo por lo que la mejora de los procesos
productivos relacionados con estos productos son prioritarios para cualquier
paiacutes que desee mantenerse competitivo en el aacutembito econoacutemico y tecnoloacutegico
mundial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 13
5 INTRODUCCIOacuteN
En la actualidad el desarrollo de biomateriales constituye uno de los
principales ejes de investigacioacuten en el mundo de la ciencia Dentro de estos
biomateriales los biopoliacutemeros han logrado un particularmente alto grado de
atencioacuten especialmente en los uacuteltimos 30 antildeos debidos a sus muacuteltiples
aplicaciones industriales biomeacutedicas y farmaceacuteuticas que estaacuten aportando una
amplia gama de opciones y soluciones a problemas ambientales y en la
formulacioacuten de nuevas preparaciones biomeacutedicas y farmaceacuteuticas
Los biopoliacutemeros son materiales polimeacutericos o macromoleculares que
son sintetizados por seres vivos Debido en gran parte al precio creciente la
viabilidad declinante de las fuentes foacutesiles como materias primas asiacute como el
ritmo crecimiento de la poblacioacuten mundial han propiciado el desarrollo de
fuentes alternativas renovables capaces de suministrar las necesidades
mundiales crecientes en material de energiacutea y produccioacuten quiacutemica Esta
necesidad de nuevas fuentes alternativas ha permitido que la mirada cientiacutefica
se halle puesta sobre la diversidad microbiana que habita el planeta pues los
microorganismos siempre han demostrado ser una fuente importante de
materiales novedosos con la ventaja que en la actualidad se dispone de la
tecnologiacutea necesaria para crecer los microorganismos de manera masiva y
segura Este nuevo modelo conocido como la estrategia de las biorefineriacuteas
ha cambiado la concepcioacuten de la industria quiacutemica moderna y ha sido
empleada exitosamente en la produccioacuten convencional a granel de diversos
productos quiacutemicos como por ejemplo etanol glutamato y aacutecido ciacutetrico
En el presente la produccioacuten de poliacutemeros o monoacutemeros tales como el
13-propanediol el aacutecido polilaacutectico y los polihidroxialcanoatos ha sido uno de
los principales objetivos de mayor investigacioacuten Dentro de estos nuevos
materiales encontramos los poliaminoaacutecidos poliamidas de naturaleza
polimeacuterica cuyos constituyentes estaacuten unidos por enlaces del tipo amida El
aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) es uno de estos poliaminoaacutecidos un poliacutemero
biodegradable constituido por unidades de D- y L-aacutecido glutaacutemico y que es
producido de manera natural en algunas bacterias
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 14
El presente trabajo procura investigar sobre algunas de las condiciones
involucradas en la produccioacuten bacteriana de γ-PGA y que constituyen las
principales barreras que impiden alcanzar los rendimientos necesarios para
que la produccioacuten bioloacutegica de este poliacutemero sea viable tanto desde el punto de
vista bioloacutegico como econoacutemico
31 Objetivos
El objetivo general a partir del cual se estructura el desarrollo de la
presente investigacioacuten es
Estudiar la produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a y el efecto que tiene sobre el rendimiento y estructura del
producto factores propios de la ingenieriacutea quiacutemica como lo son la
presioacuten y la intensidad de agitacioacuten
Los objetivos especiacuteficos que se plantearon alcanzar en el siguiente
proyecto son los siguientes
Disentildear un biorreactor que permita realizar fermentaciones a presioacuten
positiva de hasta 4 bar absolutos
Describir las condiciones baacutesicas requeridas para lograr reproducibilidad
en la produccioacuten deaacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre el rendimiento de
produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico en gL por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre la composicioacuten
enantiomeacuterica y el peso molecular del aacutecido γ-poliglutaacutemico
Establecer el posible efecto de la presioacuten positiva sobre la tasa de
transferencia de oxiacutegeno en el biorreactor
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 15
6 MARCO TEOacuteRICO
41 Los poliaminoaacutecidos
Los poliaminoaacutecidos son poliamidas formadas por un uacutenico aminoaacutecido
y difieren de las proteiacutenas en muacuteltiples aspectos Las proteiacutenas son
biomoleacuteculas compuestas por una amplia gama de aminoaacutecidos mientras que
los poliaminoaacutecidos estaacuten compuestos uacutenicamente por un solo tipo de
aminoaacutecido al menos en su eje central La siacutentesis de proteiacutenas estaacute dirigida
por el ADN que controla la secuencia especiacutefica de aminoaacutecidos que termina
formando una moleacutecula de una proteiacutena en particular Por su parte los
poliaminoaacutecidos son sintetizados por una ruta metaboacutelica de los organismos
completamente distinta En enlace amida en las proteiacutenas acontece
uacutenicamente entre los grupos α-amino y α-carboxilo mientras que en los
poliaminoaacutecidos pueden verse involucradas otras cadenas laterales
funcionales como por ejemplo los grupos β- y γ-carboxiloy ε-amino(Bajaj amp
Singhal 2011)
Existen mayoritariamente tres poliaminoaacutecidos presentes en la
naturaleza el aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina En
el aacutecido γ-poliglutaacutemico los enlaces amida se forman entre el grupo α-amino y
el γ-carboxilo en el eje central La poli ε-lisina presenta monoacutemeros de lisina
unidos por los grupos α-carboxilo y ε-amino La cianoficina consiste en residuos
de aacutecido α-aspaacutertico que contienen residuos de arginina que penden unidos al
grupo β-carboxilo Las foacutermulas de dichos compuestos se presentan en la
figura 1
42 El aacutecido γshypoliglutaacutemico (γshyPGA)
El aacutecido γ-poliglutaacutemico (de ahora en adelante referido como γ-PGA) es
un poliacutemero inusual que acontece de forma natural anioacutenico soluble en agua
biodegradable comestible y que no resulta toacutexico ni para el ser humano ni para
el ambiente que en la naturaleza es producido por algunas bacterias todas
Gram-positivas una archea e inclusive en eucariotas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 16
Fue primeramente descubierto por Ivaacutenovics y colaboradores como
componente de la caacutepsula de la bacteria Bacillus anthracis despueacutes que se
liberara al medio producto tanto del proceso de autoclavado como por el
envejecimiento y lisis natural de los cultivos La comida tradicional japonesa
ldquoNattordquo estaacute constituida por una mezcla de γ-PGA y fructanos que son
producidos por la bacteria Bacillus natto (Bajaj amp Singhal 2011)
Figura 1 Foacutermula y estructura del aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina
(Fuente Feng et al 2007)
421 Propiedades quiacutemicas y bioquiacutemicas del γshyPGA
El γ-PGA es un poliacutemero polianioacutenico que puede estar compuesto
uacutenicamente por D- L- o por ambos enantioacutemeros del aacutecido glutaacutemico Como se
ha comentado ya es altamente soluble en agua El γ-PGA probablemente
pueda adoptar diferentes estructuras La estructura del γ-PGA ha sido predicha
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 17
asumiendo poliaminoaacutecidos constituidos por 10 o 25 moleacuteculas de aacutecido
glutaacutemico Este modelo teoacuterico calculado para una moleacutecula en solucioacuten
acuosa muestra que el γ-PGA consiste de una heacutelice levoacutegira estabilizada por
enlaces de hidroacutegeno intramoleculares Sin embargo otro estudio realizado a
partir de γ-PGA obtenido de Bacillus licheniformis mostroacute que la conformacioacuten
es realmente flexible y depende de la concentracioacuten de γ-PGA y el pH de la
disolucioacuten A bajas concentraciones (01 wv) y a un pH inferior a 7 el γ-PGA
adopta una conformacioacuten basada mayoritariamente en heacutelices del tipo α
mientras que la conformacioacuten tipo hojas β predomina a pH superiores pues
esta conformacioacuten permite una mejor exposicioacuten de las cargas negativas del γ-
PGA (Candelaamp Fouet 2006) Recientemente mediamente experimentos de
dicroiacutesmo circular se ha reportado una estructura desordenada (Joyce et al
2006 Candela amp Fouet 2006) pero sin detallar las condiciones de trabajo de
los experimentos en particular de pH
El peso molecular del γ-PGA parece variar seguacuten sea el organismo que
produce la moleacutecula sin embargo estas diferencias podriacutean deberse a
diferencias en torno a la degradacioacuten natural que acontece con el poliacutemero o a
los meacutetodos de purificacioacuten y anaacutelisis utilizados mismos que puedan afectar el
tamantildeo del γ-PGA Por ejemplo para el caso de Bacillus subtilis el peso
molecular del γ-PGA variacutea entre 160kDa hasta 1500 kDa las cadenas de γ-
PGA consisten entonces de coacutemo miacutenimo 1000 residuos de aacutecido glutaacutemico
Diferentes estudios enfocados en la siacutentesis microbioloacutegica de γ-PGA han
demostrado que el peso molecular de este poliacutemero es dependiente tanto de
las diversas cepas bacterianas que se empleen asiacute como de los componentes
del medio y las condiciones del medio de cultivo e inclusive de razones auacuten no
dilucidadas De alliacute que exista una gran dificultad para obtener un γ-PGA
altamente homogeacuteneo a partir de cultivos bacterianos esto en gran parte
debido a esta inestabilidad descrita asiacute como a la complejidad molecular
involucrada en su biosiacutentesis
Asiacute mismo el γ-PGA puede contener soacutelo aacutecido D-glutaacutemico soacutelo aacutecido
L-glutaacutemico o una mezcla de ambos enantioacutemeros De alliacute que los filamentos
puedan ser de aacutecido γ-poli-L-glutaacutemico (γ-PLGA) de aacutecido γ-poli-D-glutaacutemico
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 18
(γ-PDGA) o de aacutecido γ-poli-L-D-glutaacutemico (γ-PLDGA) La disposicioacuten de los
residuos en el PLGDA requiere un especial anaacutelisis ya que si bien tanto el
PLGA y el PDGA son ambos solubles en etanol cuando ambos se mezclan en
proporcioacuten equimolar precipitan en etanol Esta observacioacuten es utilizada para
demostrar que el γ-PGA producido por Bacillus licheniformis estaacute compuesto
por cadenas tanto de PLGA como de PDGA Asiacute mismo la digestioacuten con L-
glutamilhidrolasa ha demostrado que el γ-PGA de Bacillus subtilis consiste en
una mezcla de isoacutemeros PLGA y PLDGA
422 Siacutentesis microbioloacutegica de γshyPGA
Distribucioacuten en los microorganismos
Inicialmente el γ-PGA fue detectado como un componente de la pared
capsular de la altamente patogeacutenica bacteria Gram-positiva Bacillus anthracis
Posteriormente este poliacutemero seriacutea nuevamente encontrado presente alrededor
de ceacutelulas de otras bacterias Gram-positivas no patogeacutenicas particularmente
del geacutenero Bacillus Gracias a estos descubrimientos fue posible aislar a inicios
del siglo pasado una cepa de Bacillus capaz de producir grandes cantidades de
γ-PGA
Posteriormente y de manera adicional a estas bacterias formadoras de
endosporas del geacutenero Bacillus el γ-PGA fue encontrado en las eubacterias
haloacutefilas Sporosarcina halophila y Planococcus halophilus y en la
archeobacteria haloacutefila Natrialba aegyptiaca Asiacute mismo γ-PGA fue tambieacuten
detectado en cantidades significativas en nematocistos de Cnidaria (eucariota)
En la tabla 1 se presentan los principales organismos productores de γ-
PGA y algunas de las caracteriacutesticas del γ-PGA producido
Ruta de biosiacutentesis
La conversioacuten de glucosa a γ-PGA sugiere que la siacutentesis del poliacutemero
acontece durante la glicoacutelisis y el ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos (ciclo de
Krebs o del aacutecido ciacutetrico) hasta el 2-oxoglurato (α-cetoglutarato) que es un
precursor directo del aacutecido L-glutaacutemico Durante su crecimiento en un medio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 19
Tabla 1 Organismos que han sido reportados como productores de γ-PGA
ORGANISMO CONFORMACIOacuteN CONFORMACIOacuteN DEL FILAMENTO
Bacillus anthracis D D
Bacillus mesentericus D D
Bacillus licheniformis D y L D y L
Bacillus megaterium D y L D + L
Bacillus pumilus D y L ND
Bacillus subtilis D y L L y D+L
Planococcus halophilus D D
Sporosarcina halophila D D
Staphylococcus
epidermidis
D y L ND
Natrialba aegyptiaca L L
Hydra ND ND
Fuente (Candela amp Fouet 2006)
nutritivo Bacillus licheniformis expresa dos enzimas capaces de sintetizar el
aacutecido L-glutaacutemico la glutamato sintasa y la glutamato deshidrogenasa Ambas
enzimas son praacutecticamente insensibles a la inhibicioacuten por producto lo que
permite alcanzar altas concentraciones intracelulares de aacutecido L-glutaacutemico el
cual es entonces direccionado a la siacutentesis de γ-PGA Los estudios maacutes
detallados relacionados con la polimerizacioacuten del γ-PGA se han realizado con
Bacillus anthracis Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis especialmente
Bacillus licheniformis ATCC9945a lo que ha permitido la identificacioacuten de un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 20
sistema enzimaacutetico anclado a la membrada y denominado como PGA-
sintetasa Este sistema enzimaacutetico estaacute constituido por al menos tres
componentes con actividad enzimaacutetica y se presume que cataliza la siguiente
secuencia de reacciones (Troy 1973) (figura 2)
Aacutecido L-glutaacutemico + ATP ɣ-L-glutamil-AMP + PPi (a)
ɣ-L-glutamil-AMP + SH-enzima ɣ-X-glutamil-S-enzima + AMP (b)
ɣ-X-glutamil-S-enzimaɣ-D-glutamil-S-enzima (c)
ɣ-D-glutamil-S-enzima + [ɣ-D-glutamil]n[ɣ-D-glutamil]n+1 + SH-enzima (d)
Figura 2 Posible mecanismo enzimaacutetico de siacutentesis del γ-PGA (Fuente Ashiuchi 2010)
De acuerdo con este modelo solamente el aacutecido L-glutaacutemico es activado
en el paso (a) mediante fosforilacioacuten lo que significa que la biosiacutentesis del γ-
PGA requiere el suministro de energiacutea para la formacioacuten del enlace amida Maacutes
recientemente un segundo mecanismo ha sido descrito por Ashiuchi (2001) e
involucra un complejo enzimaacutetico denominado PgsBCA el cual es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico y donde la
polimerizacioacuten ocurre por un mecanismo de ligacioacuten tipo amida (figura 3)
Inicialmente se habiacutea descrito que el complejo enzimaacutetico era el responsable
de racemizar y polimerizar el aacutecido glutaacutemico sin embargo estas nuevas
evidencias parecen demostrar que el complejo enzimaacutetico involucrado en la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 21
siacutentesis de γ-PGA carece de actividad racemasa y que la formacioacuten del aacutecido
D-glutaacutemico es responsabilidad de una enzima citosoacutelica denominada aacutecido
glutaacutemico racemasa Glr que presenta una alta selectividad por el aacutecido
glutaacutemico y una mayor preferencia por el aacutecido L-glutaacutemico Un modelo de la
viacutea metaboacutelica mayoritariamente aceptada para la siacutentesis de γ-PGA se
presente en la figura 4
Figura 3 Mecanismo propuesto de biosiacutentesis del γ-PGA mediante ligacioacuten tipo amida
(Fuente Ashiuchi 2001)
Figura 4 Viacutea metaboacutelica de biosiacutentesis del γ-PGA (Fuente Buescher amp Margaritis 2007)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 22
Organizacioacuten geneacutetica
Solamente unas pocas bacterias la mayoriacutea dentro del geacutenero Bacillus
han sido reportadas como capaces de producir γ-PGA Asiacute mismo la
produccioacuten de γ-PGA no es uniforme en estos individuos inesperadamente
variacutea inclusive bajo condiciones de cultivo altamente estrictas De alliacute que la
identificacioacuten del sistema regulatorio y los genes involucrados en dicho sistema
es vital para dar solucioacuten a estos problemas de uniformidad y rendimiento El
complejo PGA-sintetasa estaacute codificado por cuatro loci que son denominados
pgs Los cuatro genes pgs son pgsB pgsC pgsAA y pgsE y se les denomina
en conjunto pgsBCA Todos estos genes son necesarios y suficientes para la
produccioacuten de γ-PGA in vivo La figura 5 muestra los elementos geneacuteticos
requeridos para la produccioacuten de γ-PGA en diferentes especies del genero
Bacillus
Figura 5 Elementos geneacuteticos necesarios para la siacutentesis de γ-PGA (Fuente Candela amp
Fouet 2006)
423 Produccioacuten fermentativa de γshyPGA
Diferentes cepas de bacterias del geacutenero Bacillus son capaces de
producir elγ-PGA ya sea como material viscoso extracelular o como
componente capsular En termino industrial estas cepas han sido las maacutes
utilizadas y por ende las maacutes estudiadas hasta el momento La mayor parte de
los estudios han estado orientados a determinar los requerimientos
nutricionales para el adecuado crecimiento celular asiacute como mejorar la
productividad de γ-PGA y la variacioacuten en la composicioacuten de su estructura en lo
referente al contenido de aacutecido L- y D-glutaacutemico Estos estudios como los
realizados por Troy (1973) Cromwicket al (1995) y Kunioka (1997) han
permitido determinar que los requerimientos nutricionales para la produccioacuten de
γ-PGA variacutean seguacuten sea la cepa que se emplea
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 23
De acuerdo a estos requerimientos nutricionales las cepas productoras
de γ-PGA se han dividido en dos grupos uno que requiere la adicioacuten de aacutecido
L-glutaacutemico al medio de cultivo para estimular la produccioacuten de γ-PGA y el
crecimiento celular y otro que no requiere de aacutecido L-glutaacutemico para la
produccioacuten de γ-PGA
Dentro de las bacterias dependientes de aacutecido L-glutaacutemico las cepas
maacutes promisorias han sido B anthracis B licheniformis ATCC9945a B subtilis
IFO3335 y B subtilis F-2-01 Por su parte dentro de las bacterias
independientes de aacutecido L-glutaacutemico encontramos mayoritariamente los caso s
de B subtilis 5E B subtilis TAM-4 y B licheniformis A35 B subtilis 5E puede
producir γ-PGA a partir de L-prolina como uacutenica fuente de carbono
complementado con una fuente de nitroacutegeno en un medio mineral B
licheniformis A35 produce γ-PGA a partir de glucosa y cloruro de amonio en
condiciones desnitrificantes y B subtilis TAM-4 produce grandes cantidades de
γ-PGA cuando crece en un medio de cultivo con una sal de amonio y azuacutecar
como fuentes de nitroacutegeno y carbono respectivamente Asiacute mismo ademaacutes de
la fuente de carbono y nitroacutegeno existen otra serie de factores tales como
fuerza ioacutenica del medio de cultivo pH del medio de cultivo aireacioacuten entre
otros que afectan en gran medida la productividad y calidad del γ-PGA
De primera impresioacuten pareciera conveniente el empleo de las cepas
independientes de aacutecido L-glutaacutemico para la produccioacuten industrial de γ-PGA
sin embargo la informacioacuten disponible en lo referente a la ruta biosinteacutetica el
mecanismo de formacioacuten del γ-PGA y los factores que afectan la productividad
es praacutecticamente nula para estas cepas A partir de los trabajos de
investigacioacuten y los estudios de aplicaciones industriales la produccioacuten de γ-
PGA se ha llevado a cabo mayoritariamente a partir de cepas dependientes de
aacutecido L-glutaacutemico
En la tabla 2 se presentan algunas de las principales cepas bacterianas
empleadas para la produccioacuten de γ-PGA los nutrientes las condiciones de
cultivo el rendimiento obtenido asiacute como los voluacutemenes de cultivo en que se
basan dichos reportes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 24
Tabla 2 Principales bacterias productoras de γ-PGA (Shih amp Van 2001)
CEPA
NUTRIENTES
CONDICIONES DE CULTIVO
RENDIMIENTO
VOLUMEN DE
TRABAJO B licheniformis ATCC9945a
Aacutecido glutaacutemico (20 gL) aacutecido ciacutetrico (12 gL) NH4Cl (7 gL)
30ordmC 4 diacuteas 17-23 gL 100 mL
B subtilis IFO 3335
Aacutecido glutaacutemico (30 gL) aacutecido ciacutetrico (20 gL)
37ordmC 2 diacuteas 10-20 gL 125 mL
B subtilis TAM-4
Fructosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 4 diacuteas 20 gL 100 mL
B licheniformis A35
Glucosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 3-5 diacuteas 8-12 gL 100 mL
B subtilis F02-1
Aacutecido glutaacutemico(70 gL) glucosa (1 gL)
30ordmC 2-3 diacuteas 50 gL 200 mL
B subtilis (natto)
Maltosa (60 gL) salsa de soya (70 gL) glutamato soacutedico (30 gL)
40 ordmC 3-4 diacuteas 35 gL 125 mL
Fuente Shih amp Van 2001
424 Produccioacuten de γshyPGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a
Generalidades de la bacteria Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis es una bacteria comuacutenmente encontrada en el
suelo y en las plumas de las aves Es gram-positiva de forma oval y mesoacutefila
Su temperatura oacuteptima de crecimiento se encuentra alrededor de los 30 ordmC
aunque es capaz de sobrevivir a temperaturas mucho mayores La temperatura
oacuteptima para la secrecioacuten de enzimas es de 37 ordmC Esta bacteria puede existir
como espora cuando las condiciones son inadecuadas o en estado vegetativo
cuando las condiciones le son maacutes favorables (Wecke et al 2006)
Bacillus licheniformis forma parte del grupo Subtilis junto con Bacillus
subtilis y Bacillus pumilus Estas bacterias son conocidas por ser
contaminantes comunes de alimentos asiacute como favorecer su descomposicioacuten
aunque no se consideran patoacutegenos de importancia para el ser humano
(Wecke et al 2006)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 25
La cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis y la siacutentesis de γ-PGA
La produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a fue
primeramente estudiada por Bovarnick en 1942 sin embargo no fue sino a
partir de 1954 cuando Thorne y colaboradores iniciaron una serie de estudios
sistemaacuteticos orientados a investigar los factores que afectan la produccioacuten de
γ-PGA lo que permitioacute determinar algunos factores y condiciones necesarios
para lograr mayores rendimientos Factores tales como presencia de ciertas
sales inorgaacutenicas aacutecido glutaacutemico aacutecido ciacutetrico glicerol y el tamantildeo del inoacuteculo
demostraron tener efectos importantes sobre el rendimiento de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a tanto en condiciones estaacuteticas como cultivos
bajo agitacioacuten Se encontroacute que los mejores rendimientos se produciacutean cuando
el microorganismo era cultivado en agitacioacuten orbital en un medio de cultivo
denominado como medio C (tabla 3) alcanzando una productividad de hasta
15 gL en un periacuteodo de 3-4 diacuteas Asiacute mismo la mayor produccioacuten de poliacutemero
soacutelo se alcanzaba cuando se empleaba agua de grifo y un lote especiacutefico de
FeCl3 Posteriormente se determinariacutea que dicho lote de FeCl3 estaba
contaminado con trazas de Mn2+ y que el agua de grifo conteniacutea cantidades
significativas de Ca2+ Posteriormente Leonard y colaboradores (1958) se
encargariacutean de comprobar la funcioacuten y concentracioacuten oacuteptima de ambos
elementos quiacutemicos mediante la elaboracioacuten de un medio de cultivo
quiacutemicamente definido tomando como base el medio C de Thorne
Tabla 3 Composicioacuten del medio de cultivo C (Thorne et al 1954)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua de grifo
Fuente Shih amp Van 2001
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 26
Leonard y colaboradores encontraron que aunque solamente se requeriacutea
de 15 x 10-7 moles por litro de Mn2+ para alcanzar el maacuteximo crecimiento
concentraciones mayores de Mn2+ mostraban un marcado efecto prolongando
la viabilidad celular y por consiguiente incrementando la productividad de γ-
PGA Un incremento de hasta 615 x 10-4 molL en la concentracioacuten de Mn2+
permitiacutea alcanzar los mayores rendimientos de γ-PGA De igual manera la
adicioacuten de 102 x 10-3 moles por litro de Ca2+ en presencia de 15 x 10-7 moles
por litro de Mn2+ permitiacutea alcanzar auacuten mayores rendimientos deγ-PGA en
comparacioacuten a los valores oacuteptimos de produccioacuten de poliacutemero obtenidos en
ausencia de este elemento El γ-PGA producido consistiacutea en un homopoliacutemero
de unidades repetidas de aacutecido D- y L-glutaacutemico con una concentracioacuten de
aacutecido D-glutaacutemico que variaba entre el 38 y el 86 seguacuten incrementaba la
concentracioacuten de Mn2+ entre 154 x 10-7 y 246 x 10-3 molL siendo esta
observacioacuten independiente de la concentracioacuten presente en el medio de cultivo
de Ca2+
Tabla 4 Composicioacuten del medio E revisado (Leonard et al 1958)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 0000026 a
042 CaCl22H2O 015 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua destilada
Fuente Shih amp Van 2001
A partir de estos resultados Leonard y colaboradores elaboraron el
medio de cultivo denominado Medio E (tabla 4) que es baacutesicamente el medio
original C exceptuando el hecho de que cantidades definidas de Mn2+ y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 27
Ca2+fueron agregadas El Ca2+ fue adicionado con el propoacutesito de asegurar
altas productividades de poliacutemero a cualquier concentracioacuten de Mn2+ que se
empleara mientras que la variacioacuten de la concentracioacuten de este uacuteltimo
elemento permitiriacutea alcanzar el contenido enantiomeacuterico deseado en el
poliacutemero tal y como se comentoacute anteriormente
La estereoquiacutemica del poliacutemero es decir el contenido enantiomeacuterico del
γ-PGA ha sido desde el inicio de las investigaciones uno de los problemas maacutes
complejos y de difiacutecil solucioacuten y de una importancia tanto fundamental como
praacutectica en lo que se refiere al estudio de la produccioacuten de γ-PGA en bacterias
A lo largo de todos estos antildeos han existido numerosas contradicciones entre
los investigadores en cuanto a si el contenido enantiomeacuterico del γ-PGA
producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a estaacute o no afectado por la
concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo Cromwick y Gross (1995)
realizaron un estudio profundo sobre los factores que influenciaban la
produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a Dicho estudio
encontroacute que el porcentaje de aacutecido L-glutaacutemico presente en el γ-PGA variaba
entre 59 y 10 cuando las concentraciones de Mn2+ variaban entre 0 y 615
μmolL asiacute mismo el rendimiento incrementaba desde los 5 hasta los 17 gL en
dicho intervalo de concentracioacuten de Mn2+
Cromwick y Gross (1995) encontraron en este mismo estudio que la
incorporacioacuten de Mn2+ al medio de cultivo es un factor criacutetico para la
conservacioacuten de la viabilidad celular durante periodos de cultivo prolongados
El nuacutemero de ceacutelulas viables se incrementaba del orden de 105 a 109 unidades
formadoras de colonias (ufc) para todas las concentraciones de Mn2+ hasta el
inicio de la fase estacionaria aproximadamente a las 24 horas Sin embargo
despueacutes de 50 horas de cultivo la viabilidad celular se veiacutea reducida
draacutesticamente para aquellas concentraciones de Mn2+ relativamente menores
(0 a 0615 μmolL) mientras que para las concentraciones mayores (338 a 615
μmolL) el nuacutemero de ceacutelulas viables se manteniacutea en el orden de 107-109
inclusive despueacutes de 140 horas de cultivo Asiacute mismo la presencia de Mn2+ en
concentraciones entre 338 y 615 μ incrementaba la utilizacioacuten de las fuentes
de carbono en gran medida cultivos que conteniacutean 615 μmolL de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 28
Mn2+utilizaban el 37 54 y 93 del aacutecido glutaacutemico el glicerol y el aacutecido
ciacutetrico respectivamente en comparacioacuten a aquellos cultivos que no
incorporaban el Mn2+ los cuales solo utilizaban el 19 10 y 17 del aacutecido
glutaacutemico el glicerol y el aacutecido ciacutetrico respectivamente
Uno de los problemas maacutes prolongados en torno a los estudios referidos
a la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC994a es el hecho de
que el microorganismo termina degenerando en una cepa incapaz de producir
γ-PGA despueacutes de cultivo repetitivo Esta inestabilidad exhibida por este
microorganismo es responsable de una gran variacioacuten de cultivo en cultivo en
lo referente a la cantidad y la cineacutetica de formacioacuten del γ-PGA Birrer y
colaboradores (1994) encontraron que el empleo de ceacutelulas vegetativas
criogeacutenicamente congeladas permitiacutea alcanzar un crecimiento y produccioacuten de
poliacutemero consistente de cultivo en cultivo Asiacute mismo y en congruencia con
otros estudios previamente realizados se encontroacute que el crecimiento celular
ocurriacutea baacutesicamente durante las primeras 24 h la mayor productividad
volumeacutetrica de γ-PGA era de 012 gmiddotL-1middoth-1 y se alcanzaba entre los diacuteas 2 y 4
el pH caiacutea de 74 a aproximadamente 5 despueacutes de 42 horas de cultivo e
incrementaba levemente a cerca de 6 despueacutes de 96 horas de cultivo el
empleo de glicerol glutamato y citrato se reduciacutea de 80 a 45 gL 18 a 10 gL y
de 12 a 1 gL respectivamente la produccioacuten de aacutecido aceacutetico hasta un nivel
maacuteximo de 45 gL asiacute como la presencia de 23-butanediol como producto
secundario entre las 42 y las 96 h El estudio del consumo de las fuentes de
carbono resulta un poco sorprendente pues demuestra unas tasas de
consumo del aacutecido ciacutetrico y de glicerol relativamente altas sin embargo para el
caso del aacutecido glutaacutemico dicha tasa de consumo fue por mucho menor y muy
lejana del agotamiento completo de dicha fuente Asiacute mismo la remocioacuten del
aacutecido L-glutaacutemico del medio de cultivo E afectaba en poca medida el
rendimiento en γ-PGA mientras que la remocioacuten de las otras fuentes (glicerol y
aacutecido ciacutetrico) disminuye de manera draacutestica la produccioacuten de γ-PGA Estos
resultados son contradictorios a los encontrados inicialmente por Thorne y
colaboradores (1954) e indica que Bacillus licheniformis ATCC9945 no requiere
de aacutecido L-glutaacutemico para alcanzar altas productividades de γ-PGA Asiacute mismo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 29
la presencia de 23-butanediol es indicador que los niveles de oxiacutegeno en el
medio de cultivo despueacutes de 42 horas son incapaces de sostener un
metabolismo 100 aeroacutebico esto no es de sorprender pues el γ-PGA es un
poliacutemero extracelular extremadamente viscoso y tasas cada vez menores de
transporte de oxiacutegeno son esperables conforme va aumentado la viscosidad en
el medio a medida que la concentracioacuten de γ-PGA se incrementa
Un trabajo de Cromwick y Gross (1996) estudioacute el efecto del pH y la
aireacioacuten sobre la productividad en γ-PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a en condiciones de fermentacioacuten por lotes El pH fue controlado en
los valores de 55 65 74 y 825 y se determinoacute su efecto sobre el crecimiento
celular la utilizacioacuten de las fuentes de carbono la productividad en γ-PGA el
peso molecular y la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA El mayor
rendimiento en γ-PGA se obtuvo a un pH de 65 (15 gL 96 horas de cultivo) y
decrecioacute significativamente en 55 y 74 Esto coincide con el hecho que el
consumo de glicerol y de aacutecido L-glutaacutemico se mantuvo invariable en funcioacuten
del pH sin embargo la mayor tasa de consumo de aacutecido ciacutetrico se observoacute a un
pH de 65 en contraste con 55 y 74 lo cual parece indicar que el metabolismo
del aacutecido ciacutetrico juega un papel importante a dicho valor de pH Previamente
Cromwick y Gross (1995) encontraron que el aacutecido ciacutetrico es efectivamente un
precursor en la produccioacuten del poliacutemero presumiblemente a traveacutes del ciclo de
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De igual manera la alteracioacuten del pH no mostroacute
ninguacuten efecto importante en cuanto al peso molecular y la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA El efecto de la aireacioacuten fue evaluado incrementando
la velocidad de agitacioacuten entre 250 y 800 rpm y la tasa de aireacioacuten entre los
05 y los 20 Lmin a un pH de 65 observaacutendose un incremento en las tasas de
crecimiento y los rendimientos de γ-PGA conforme el suministro de oxiacutegeno
incrementaba
A pesar de la intensa investigacioacuten que se ha llevado a cabo en lo
referente a la produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a el
mecanismo y las viacuteas biosinteacuteticas especiacuteficas por las cuales el poliacutemero es
producido auacuten no han logrado ser dilucidadas con total claridad a pesar de que
no se cuestione le hecho de que efectivamente acontece a traveacutes del ciclo de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 30
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De las tres fuentes de carbono presentes en el medio
de cultivo E el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido L-glutaacutemico constituyen dos sustratos
precursores para la produccioacuten de dicho poliacutemero sin embargo en lo referente
al glicerol auacuten no queda claro como este incrementa la formacioacuten de poliacutemero
maacutes allaacute del hecho de que Troy (1973) encontroacute que el complejo enzimaacutetico
PGA-sintetasa responsable de la polimerizacioacuten del aacutecido L-glutaacutemico a γ-
PGA es estimulada por la presencia de glicerol Considerando que la viacutea de
biosiacutentesis del γ-PGA efectivamente involucra el ciclo de los aacutecidos
tricarboxiacutelicos cualquier fuente de carbono no relacionada directamente como
el glicerol o la glucosa podriacutean en principio ser una fuente primaria de carbono
para el crecimiento celular y la produccioacuten de γ-PGA Efectivamente el empleo
de glucosa como principal fuente de carbono y cantidades traza de aacutecido ciacutetrico
y aacutecido L-glutaacutemico (05 gL) permitieron alcanzar un rendimiento en γ-PGA de
12 gL en cultivos de Bacillus licheniformisATCC9945a (Ko amp Gross 1998) Sin
embargo y a pesar de este hecho Du y colaboradores (1995) encontraron otra
posible explicacioacuten al incremento del rendimiento en presencia de glicerol Ellos
encontraron que en Bacillus licheniformis ATCC9945a las altas
concentraciones de glicerol en el medio de cultivo conllevan a un cambio en la
composicioacuten de los fosfoliacutepidos de la membrana celular incrementando la
proporcioacuten de los fosfoliacutepidos C120 y C101 y reduciendo la de fosfoliacutepidos
C181 y C161 lo que parece favorecer la formacioacuten de una membrana celular
menos compacta lo que conlleva a una efectiva excrecioacuten del γ-PGA fuera de
la membrana celular
En lo referente a produccioacuten a gran escala y en buacutesqueda de la
aplicacioacuten comercial del γ-PGA en grandes cantidades resulta maacutes que
evidente la necesidad de incrementar la productividad Yoon y colaboradores
(2000) desarrollaron una estrategia para la produccioacuten de γ-PGA con un alto
rendimiento mediante cultivo en lote alimentado de Bacillus licheniformis
ATCC9945a Mediante el empleo de un bioreactor de 25 L conteniendo 1 L de
medio de cultivo y bajo condiciones de pH y temperatura de 65 y 37ordmC
respectivamente un 40 de saturacioacuten de oxiacutegeno y una velocidad de
agitacioacuten de 1000 rpm lograron alcanzar una concentracioacuten maacutexima de γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 31
de 35 gL suministrando aacutecido ciacutetrico y aacutecido L-glutaacutemico a una velocidad de
alimentacioacuten de 02 mLmin (144 gh de aacutecido ciacutetrico y 24 gh de aacutecido
glutaacutemico) por un periacuteodo de 3 h despueacutes del agotamiento del aacutecido ciacutetrico
inicial lo cual aconteciacutea alrededor de las 22 h La productividad alcanzada fue
de 1 gmiddotl-1middoth-1
425 Purificacioacuten del γshyPGA
Dado que la produccioacuten del γ-PGA es mayoritariamente extracelular en
concreto en la cepa de intereacutes para el presente estudio la de Bacillus
licheniformis ATCC9945a la purificacioacuten del poliacutemero es directa y consta de
manera general de tres pasos I) la remocioacuten de las ceacutelulas mediante
centrifugacioacuten o filtracioacuten 2) la precipitacioacuten del producto del medio libre de
ceacutelulas mediante metanol etanol o 1-propanol y 3) la diaacutelisis para la remocioacuten
de impurezas de pequentildeo peso molecular
Du y colaboradores (2001) desarrollaron una estrategia eficiente para la
separacioacuten y recuperacioacuten delγ-PGA de caldos altamente viscosos Esta
consiste en dos procesos I) Separar el γ-PGA del caldo de cultivo viscoso y II)
Concentrar la solucioacuten de PGA por ultrafiltracioacuten con el propoacutesito de reducir la
cantidad de alcohol requerida en el proceso de separacioacuten Las ceacutelulas
encapsuladas con γ-PGA poseen carga negativa cerca del valor neutro de pH
esto debido a la ionizacioacuten del grupo carboxilo en las moleacuteculas de γ-PGA Esta
carga negativa en sus superficies les confiere a las ceacutelulas una alta estabilidad
en el medio de cultivo lo que dificulta la sedimentacioacuten de las ceacutelulas durante el
proceso de separacioacuten Esta alta estabilidad asiacute como la elevada viscosidad del
caldo de cultivo son los dos principales problemas que se enfrentan cuando se
trata de separar las ceacutelulas y el γ-PGA del medio de cultivo por lo cual la
reduccioacuten de ambas es vital para una eficiente recuperacioacuten del γ-PGA
Mediante la disminucioacuten del pH es posible reducir el nuacutemero de cargas
negativas sobre la superficie de las ceacutelulas lo que favorece su faacutecil agregacioacuten
y precipitacioacuten Esto permite reducir en hasta un 17 la energiacutea requerida para
una adecuada centrifugacioacuten del caldo de cultivo a un pH de 5 En lo referente
a los requerimientos de alcohol es conocido que un 75-80 del mismo es
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 32
requerido para la precipitacioacuten del γ-PGA presente en un caldo libre de ceacutelulas
a una concentracioacuten de 1-2 Dado que la cantidad de alcohol requerida
disminuye a medida que la concentracioacuten de γ-PGA aumenta es necesaria y
ventajoso sino la concentracioacuten del γ-PGA presente en el medio de cultivo libre
de ceacutelulas a lo largo del proceso de recuperacioacuten Asiacute es posible reducir en un
25 el alcohol requerido para precipitar una solucioacuten de γ-PGA que fue
concentrada de 20 gL a 60 gL mediante ultrafiltracioacuten a un pH de 5
Asiacute mismo y dada la naturaleza anioacutenica del γ-PGA es posible que el
empleo de la cromatografiacutea de intercambio ioacutenica constituya una herramienta
importante para la purificacioacuten de este poliacutemero
426 Control del peso molecular y degradacioacuten del γshyPGA
El peso molecular es una caracteriacutestica importante del γ-PGA microbiano
debido al efecto que tiene el tamantildeo molecular en las propiedades del
poliacutemero El γ-PGA producido por bacterias del geacutenero Bacillus por lo general
presenta un relativamente alto peso molecular Un poliacutemero de alto peso
molecular es uacutetil como agente espesante pero no es uacutetil para otros usos
debido a la alta viscosidad que lo vuelve difiacutecil de modificar quiacutemicamente
mediante la adicioacuten de alguacuten reactivo quiacutemico De acuerdo con el uso que se
pretenda dar es necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso
molecular por ejemplo en lo referente al empleo del γ-PGA en sistemas de
liberacioacuten de faacutermacos o en el disentildeo de faacutermacos polimeacutericos resulta
necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso para controlar el nivel de
liberacioacuten en los distintos tejidos (Shih et al 2001) Es evidente entonces que el
control del peso molecular del γ-PGA no es solamente un asunto de
importancia fundamental o teoacuterica sino de importancia praacutectica para el
desarrollo de aplicaciones comerciales para este poliacutemero Entre los meacutetodos
que se han empleado para la obtencioacuten de γ-PGA con diferentes pesos
moleculares encontramos la hidroacutelisis alcalina la degradacioacuten ultrasoacutenica la
degradacioacuten microbiana o enzimaacutetica y la alteracioacuten de la composicioacuten del
medio de cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 33
En otro estudio Birrer y colaboradores (1994) encontraron que la
variacioacuten de la fuerza ioacutenica del medio de cultivo mediante la adicioacuten de un 4
(pv) de NaCl conllevaba a la formacioacuten de un γ-PGA de un peso molecular
relativamente mayor
A la fecha existen pocos estudios sobre la biodegradacioacuten microbiana o
enzimaacutetica del γ-PGA a moleacuteculas de menor peso molecular sin embargo es
importante sentildealar que en la mayoriacutea de estudios sobre siacutentesis de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a se sugiera la posible existencia de una
enzima ldquodespolimerasardquo responsable de la descomposicioacuten del γ-PGA Lo que
inicialmente se observaba como una reduccioacuten en la viscosidad del medio de
cultivo con el tiempo o bajo ciertas condiciones demostroacute ser una enzima
poliglutamil-γ -hidrolasa responsable de la ruptura hidroliacutetica del γ-PGA en esta
cepa de Bacillus (King et al 2000) Curiosamente la enzima mostroacute ser
activada por la presencia de iones Zn2+ y Ca2+ y tener una alta afinidad por el γ-
PGA
427 Aplicaciones del γshyPGA
Dada la naturaleza del γ-PGA al ser un poliacutemero no toacutexico
biodegradable y cuya produccioacuten puede ser no tan costosa se han sugerido
gran cantidad de aplicaciones durante la uacuteltima deacutecada El γ-PGA de alto peso
molecular es decir mayor a 106 Da es el preferible en gran parte de las
aplicaciones aunque si bien existen otra serie de aplicaciones que se
presentaran a continuacioacuten y que podriacutean demandar diferentes caracteriacutesticas
Es importante destacar eso siacute que salvo las aplicaciones meacutedicas el resto
considera como indiferente la proporcioacuten de aacutecido D-glutaacutemico y de aacutecido L-
glutaacutemico presente en el γ-PGA
Alimentos
Existe una amplia gama de aplicaciones para el γ-PGA en la industria de
alimentos y sus derivados En jugos y otras bebidas el γ-PGA colabora en el
mejoramiento del sabor y su potabilidad Otra aplicacioacuten importante existe en
alimentos soacutelidos a base de harina de trigo como por ejemplo pan pasteles o
pasta donde la adicioacuten de γ-PGA ha demostrado retrasar el envejecimiento y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 34
mejorar la textura asiacute como permitir una mayor conservacioacuten de la forma Para
estas aplicaciones el γ-PGA recomendable es el de alto peso molecular
Asiacute mismo el γ-PGA ha demostrado poseer propiedades
anticongelantes propiedad que se ve incrementada conforme el tamantildeo del
poliacutemero se reduce Esto permitiriacutea emplear el γ-PGA en la conservacioacuten de
alimentos microorganismos y enzimas Debido a que las sales de este
poliacutemero tienen poco sabor por siacute mismas pueden ser empleadas en mayores
concentraciones en comparacioacuten con otros agentes anticongelantes tales como
la glucosa Aunque esta aplicacioacuten es dependiente del tipo de sal del poliacutemero
empleada es independiente de la proporcioacuten de aacutecido L- y D-glutaacutemico
presente en el poliacutemero Asiacute mismo la adicioacuten de γ-PGA en productos
alimenticios que contengan sustancias activas bioloacutegicamente como por
ejemplo carotenoides vitaminas o polifenoles incrementa la absorcioacuten de
dichas sustancias en el intestino delgado
Fertilizante
Es posible producir grandes cantidades de biomasa y γ-PGA a partir de
medios liacutequidos con estieacutercol glicerol aacutecido ciacutetrico y otras sales inorgaacutenicas
resultando un producto que funciona como un fertilizante de liberacioacuten lenta
cuando es aplicado en los campos de cultivo Dado que el γ-PGA es
particularmente inerte a la gran mayoriacutea de las proteasas la liberacioacuten de
nitroacutegeno puede verse reducida auacuten maacutes Inclusive es posible producir dicho
fertilizante mediante fermentacioacuten en fase soacutelida lo que podriacutea resultar auacuten
maacutes ventajoso en ciertos casos pues permite utilizar como co-sustrato de
fermentacioacuten productos agriacutecolas tales salvado de trigo soya o maiacutez Es
importante sentildealar que para dicha aplicacioacuten la proporcioacuten de aacutecido L- y D-
glutaacutemico presente en el poliacutemero es indiferente
Tratamiento de aguas residuales
Debido a la actividad de floculacioacuten que este poliacutemero presenta el
empleo del γ-PGA en el tratamiento de aguas residuales ha sido investigado en
muacuteltiples estudios demostrando una gran capacidad de absorcioacuten y afinidad
por el Cu2+ Adicionalmente se ha demostrado el requerimiento de iones
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 35
multivalentes tales como el Ca2+ Fe3+ y Al3+ para mejorar su actividad
floculante bajo ciertas condiciones
Asiacute mismo tambieacuten se ha empleado el γ-PGA entrecruzado mediante
radiacioacuten γ el cual ha demostrado ser eficiente en la clarificacioacuten de agua
tuacuterbida a concentraciones tan bajas como 1 mgkg
Bioplaacutesticos
La posibilidad de emplear eacutesteres de γ-PGA como plaacutestico
biodegradable tambieacuten constituye otra aplicacioacuten interesante de este poliacutemero
a pesar de que por el momento su costo es todaviacutea muy elevado como para
asegurar el eacutexito comercial Mediante la modificacioacuten de los grupos eacutester es
posible disentildear un plaacutestico que cumpla los requisitos de muacuteltiples propoacutesitos
asiacute mismo los eacutesteres de γ-PGA han demostrado ser maacutes estables a altas
temperaturas que sus respectivas sales de sodio
Hidrogeles
La formacioacuten de hidrogeles por parte de γ-PGA con o sin la adicioacuten de
poliacutemeros adicionales da origen a una amplia gama de novedosas
aplicaciones ya que las propiedades fiacutesicas del gel pueden ser controladas
para cumplir una amplia variedad de necesidades
Mediante irradiacioacuten γ de 19 kGy es posible generar un hidrogel a base
de γ-PGA con un contenido especiacutefico de agua de 3500 Esto constituye un
meacutetodo conveniente y sencillo para gelificar el γ-PGA sin necesidad de
poliacutemeros o entrecruzadores
Los hidrogeles pueden ser empleados en muacuteltiples aplicaciones como en
la liberacioacuten controlada de faacutermacos el disentildeo de biosensores operaciones de
diagnoacutestico e inclusive hasta bioseparadores pueden ser obtenidos a partir de
γ-PGA y PEG-metacrilato Los hidrogeles obtenidos de esta forma poseen la
cineacutetica de liberacioacuten deseada para partiacuteculas de distinto tamantildeo tales como
pequentildeos peacuteptidos proteiacutenas o inclusive ceacutelulas completas (Bajaj amp Singhal
2011)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 36
Una manera sencilla de obtener hidrogeles de γ-PGA es a traveacutes de la
adicioacuten de peroacutexido como entrecruzador al caldo de fermentacioacuten crudo dicho
hidrogel puede emplearse como absorbente de agua en muacuteltiples aplicaciones
que incluyen agricultura horticultura y construccioacuten civil
De igual manera tambieacuten se ha demostrado que los hidrogeles pueden
ser empelados para la liberacioacuten lenta y controlada de faacutermacos en particular
aquellos formados por α-L-PGA y PEG-metacrilato Hidrogeles formados por un
72 deγ-PGA sulfonado y el resto en γ-PGA han demostrado resultados
promisorios en la liberacioacuten controlada de faacutermacos con una liberacioacuten
praacutecticamente nula a un pH de 74 sin embargo a un pH menor a 65 como el
observado en los tejidos inflamados la liberacioacuten del faacutermaco incrementaba
considerablemente
Transportador de faacutermacos
Dado a su biodegradabilidad y biocompatibilidad el γ-PGA constituye un
biopoliacutemero de particular intereacutes en el desarrollo de faacutermacos de liberacioacuten
controlada tal y como se ha sentildealado previamente Dada la presencia de
grupos carboxilo en las cadenas laterales del poliacutemero que pueden
interaccionar con los grupos funcionales presentes en otros agentes
quimioterapeacuteuticos el γ-PGA permite obtener faacutermacos maacutes solubles y faacuteciles
de administrar Inclusive el conjugado faacutermaco-γ-PGA puede ingresar a las
ceacutelulas diana e irse degradando lentamente mientras libera el agente
farmacoloacutegico y a la vez el aacutecido glutaacutemico producido durante su degradacioacuten
puede ingresar directamente al metabolismo celular o ser excretado a traveacutes
del rintildeoacuten (Bajaj amp Singhal 2011)
Uno de los conjugados maacutes prometedores y estudiados hasta el
momento ha sido con el agente anticanceriacutegeno Paclitaxel Dichos conjugados
Paclitaxel-γ-PGA han demostrado presentar un perfil farmacocineacutetico distinto
capaz de proveer una alternativa hidrosoluble a las formulaciones habituales de
este faacutermaco Tambieacuten estos conjugados han mostrado una respuesta
antitumoral marcadamente superior en comparacioacuten con el Paclitaxel soacutelo
tanto en tejidos murinos como humanos Asiacute mismo estos conjugados han
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 37
mostrado reducir la TCD50 (dosis letal media contra ceacutelulas canceriacutegenas) de
una sola irradiacioacuten de 539 Gy a 75 Gy sin afectar la respuesta radioloacutegica de
los tejidos normales sanos
Adhesivos bioloacutegicos
Los adhesivos bioloacutegicos son empleados para la adhesioacuten de tejidos
homeostasis y para el sellado de fugas de liacutequidos o aire en los tejidos durante
una cirugiacutea En la actualidad el adhesivo de mayor uso es la fibrina la cual
presenta un pobre adhesioacuten a los tejidos Un poliacutemero formado por el
entrecruzamiento del γ-PGA y gelatina ha demostrado un gran potencial para
ser empleado como adhesivo quiruacutergico y agente homeostaacutetico conservando la
capacidad de ser degradado lentamente por el cuerpo sin causar respuestas
inflamatorias severas y a la vez solidificando tan raacutepido como la fibrina pero con
una mayor adherencia a los tejidos Similares hallazgos se han obtenido con
poliacutemeros formados del entrecruzamiento de γ-PGA y colaacutegeno porcino (Bajaj
amp Singhal 2011)
Cosmeacuteticos
El γ-PGA puede ser empleado como componente de valor agregado en
la elaboracioacuten de cosmeacuteticos y productos para el cuidado personal tales como
humectantes exfoliantes y antiarrugas Dada sus propiedades quiacutemicas el γ-
PGA es homogeacuteneamente miscible asiacute como quiacutemicamente estable en la gran
mayoriacutea de los ingredientes tiacutepicamente empleados para la elaboracioacuten de
cremas faciales Asiacute mismo ciertas calidades de γ-PGA son capaces de
producir peliacuteculas suaves elaacutesticas humectantes y suaves sobre la piel Dado
que se trata de un humectante natural hidrofiacutelico formidable el γ-PGA ha
demostrado en combinacioacuten con extractos de Aloe vera promover la produccioacuten
natural de factores humectantes tales como aacutecido pirrolidona-carboxiacutelico aacutecido
laacutectico y aacutecido urocaacutenico A nivel microscoacutepico esto se explica por el hecho de
que los hidrogeles de γ-PGA son capaces de absorber hasta 5000 veces su
propio peso en humedad lo que permitiriacutea incrementar de gran manera las
propiedades humectantes de muchos productos cosmetoloacutegicos con la adicioacuten
de γ-PGA algunos electrolitos y el ajuste a un pH adecuado
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 38
Adyuvante en vacunas
El γ-PGA ha demostrado que es capaz de generar una mejor respuesta
inmune contra otros antiacutegenos presentes en una vacuna El γ-PGA de alto peso
molecular ha demostrado estimular la respuesta inmune contra antiacutegenos
virales en conejos y ratones
43 Disentildeo de procesos biotecnoloacutegicos y la transferencia de materia gasshyliquido
Cuando un microorganismo ha sido identificado como productor de un
compuesto de intereacutes existen una serie de consideraciones que deben ser
valoradas previamente antes de que un proceso productivo econoacutemicamente
viable pueda ser llevado a la praacutectica a escala industrial En aquellas
organizaciones e industrias con una soacutelida experiencia en el disentildeo y
escalamiento de procesos fermentativos los nuevos procesos son
incorporados de manera relativamente raacutepida
El desarrollo de un nuevo proceso fermentativo puede ser a groso modo
dividido en cuatro fases
La primera consiste en identificar el producto su potencial valor de
mercado su precio de venta asiacute como la vida uacutetil del mismo
La siguiente fase es seleccionar o disentildear la cepa que seraacute utilizada en
el proceso productivo y por consiguiente disentildear el proceso como tal Esto
involucra una adecuada seleccioacuten del medio de cultivo oacuteptimo y de las
condiciones idoacuteneas de proceso En este sentido la produccioacuten de γ-PGA a
partir de Bacillus licheniformis ATCC9945a ha sido fuertemente investigada en
torno a las condiciones ideales para su produccioacuten sin embargo algunos
reportes y resultados resultan ser incompletos contradictorios o discutibles Sin
embargo lo que si resulta comuacuten en todas las investigaciones en particular en
aquellas donde se han empleado voluacutemenes mayores de produccioacuten como por
ejemplo de 05 a 10 L es que la produccioacuten del γ-PGA se detiene al reducirse
la concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo problema que ha sido
abordado incrementando el caudal de oxiacutegeno yo incrementando la velocidad
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 39
de agitacioacuten sin que se reporten resultados consistentes o claros La
acumulacioacuten del γ-PGA a lo largo de la fermentacioacuten parece reducir
draacutesticamente la tasa de transferencia de oxiacutegeno lo que termina generando
condiciones anaeroacutebicas en tiempos tan cortos como 20 horas con
concentraciones de oxiacutegeno inferiores a 1 mgL
431 La transferencia de materia gasshyliacutequido
Un requisito primordial para la ocurrencia de una reaccioacuten quiacutemica
cualquiera es que los reactantes esteacuten presentes en el sitio de reaccioacuten En los
sistemas multifase los procesos de transporte son generalmente maacutes lentos
que las tasas maacuteximas de reaccioacuten intriacutenseca Este fenoacutemeno da como
resultado que las tasas de reaccioacuten reales sean menores que las que se
podriacutean esperar por efecto de la cineacutetica de reaccioacuten uacutenicamente
Los fundamentos fiacutesicos principales que determinan la transferencia de
materia son los mismos que aplican para la transferencia de calor y de
momento es decir conveccioacuten y difusioacuten
En los sistemas bioloacutegicos multifase como las fermentaciones en medio
sumergido la transferencia de masa ocurre entre dos fases una gaseosa y
otra liacutequida La mayor parte de los procesos fermentativos a gran escala con
excepcioacuten tal vez uacutenicamente de la produccioacuten de etanol y aacutecido laacutectico son
aeroacutebicos y tiacutepicamente son llevados a cabo en biorreactores aireados gas-
liacutequido En estos procesos aeroacutebicos como sucede con la produccioacuten de γ-
PGA por parte de Bacillus licheniformis ATCC9945a la transferencia de
oxiacutegeno desde la fase gaseosa a la fase liacutequida resulta vital para el eacutexito de
dicho bioproceso
En los bioprocesos aeroacutebicos el oxiacutegeno es un sustrato clave y debido
a su baja solubilidad en caldos y medios de cultivo resulta necesario su
continuo suministro La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deber ser
conocida e inclusive predicha con el propoacutesito de llevar a cabo un adecuado
disentildeo operacional del proceso y un correcto escalado de los biorreactores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 40
432 La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR)
El transporte de oxiacutegeno gas-liacutequido en los bioprocesos aeroacutebicos es el
principal proceso gas-liacutequido a considerar a la hora de disentildear un bioproceso
La solubilidad del oxiacutegeno en un medio liacutequido es baja la concentracioacuten de
saturacioacuten de oxiacutegeno es de cerca de 7-8 mgL en un proceso tiacutepico en
aireacioacuten por lo cual una transferencia de oxiacutegeno continua de la fase gaseosa
a la liacutequida es esencial para conservar un metabolismo celular completamente
oxidativo Por ejemplo unos pocos minutos sin aireacioacuten pueden impactar
severamente en la habilidad de Penicillium chrysogenum para producir
penicilina mientras que en organismos aeroacutebicos facultativos esto puede
generar cambios draacutesticos en el rendimiento y el tipo de producto generado en
condiciones de carencia de oxiacutegeno
La transferencia de oxiacutegeno desde una fase gaseosa hasta el interior de
una ceacutelula ocurre siguiendo una serie de pasos secuenciales que son
1) Difusioacuten del O2 desde la fase gaseoso a la interfase gas-liacutequido
2) Transporte a traveacutes de la interfase gas-liacutequido
3) Difusioacuten del O2 a traveacutes de una regioacuten relativamente inactiva del liacutequido
adyacente a la burbuja es decir de la interfase gas-liacutequido a la de
mezclado del liacutequido
4) Transporte del oxiacutegeno disuelto a la ceacutelula los conglomerados celulares
o al pellet de ceacutelulas inmovilizadas
5) Difusioacuten a traveacutes de la peliacutecula inactiva hasta la superficie de la ceacutelula
dentro de los conglomerados celulares o al interior del pellet de ceacutelulas
inmovilizadas
6) Transporte a traveacutes de la membrana celular
7) Transporte del O2 en el interior celular hacia el sitio de demanda
433 Descripcioacuten de la transferencia maacutesica con kLa
La tasa volumeacutetrica de transferencia de materia de un compuesto A (qtA)
en este caso oxiacutegeno (O2) puede ser descrita cuantitativamente como el
producto de un coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (kLa) y una
fuerza impulsora que consiste en la diferencia entre la concentracioacuten de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 41
saturacioacuten del compuesto (cA) y la concentracioacuten actual del compuesto en la
fase liacutequida (cA)
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (unidad s-1) el kLa
es normalmente referido como un coeficiente uacutenico pero en realidad consiste
de dos partes el coeficiente de transferencia de materia propiamente dicho (kL)
que estaacute vinculado con el flujo maacutesico (tasa de transferencia por unidad de
aacuterea) y el aacuterea de la superficie especiacutefica (a) que es el aacuterea de transferencia
por unidad de volumen
La tasa de transferencia de oxiacutegeno (referida como velocidad de
transferencia de oxiacutegeno en algunos casos) el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de materia (kLa) y la concentracioacuten de oxiacutegeno estaacuten
relacionados por la ecuacioacuten
NAa = OTR = kLa(cA- cA) (gm3s)
Noacutetese en la ecuacioacuten que para que la transferencia sea mayor interesa
tener una kLa alta pero ademaacutes (cA-cA) debe tener un valor elevado lo que
podriacutea llevar a plantear que cA sea lo menor posible Sin embargo se requiere
de una concentracioacuten miacutenima de oxiacutegeno para mantener una fermentacioacuten
aerobia Con respecto a dicha ecuacioacuten es importante sentildealar que
1) La concentracioacuten en fase liacutequida cA corresponde a la cantidad de
oxiacutegeno que hay en la fase acuosa y se determina mediante un
electrodo de oxiacutegeno disuelto Si al sistema se introduce aire a presioacuten
atmosfeacuterica dicho valor estaraacute entre los 0-10 mgL
2) La concentracioacuten de saturacioacuten cA corresponde a la solubilidad de
oxiacutegeno y es dependiente de la concentracioacuten de oxiacutegeno en la fase
gaseosa es decir de la presioacuten parcial de oxiacutegeno Una vez conocida la
presioacuten parcial de oxiacutegeno es posible calcular el valor de la solubilidad
mediante la ley de Henry En agua una forma de esta ecuacioacuten seriacutea
pAGcA = He
Donde He es la constante de Henry y cuyo valor (aproximadamente
entre 15-30 atm m3kg) es funcioacuten de la temperatura A partir de esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 42
ecuacioacuten es posible despejar el valor de cA = pAGHe El valor de He
cambia con la temperatura por ejemplo en agua pura a 25 ordmC para el
oxiacutegeno es de 2396 x 106 Pamiddotm3middotkg-1 El valor de cA es modificable si
se manipula
a) Presioacuten podemos aumentar la concentracioacuten de saturacioacuten si
aumentamos la presioacuten parcial de oxiacutegeno por ejemplo si
pasamos de 021 atm a 1 atm introduciendo al reactor oxiacutegeno
puro en vez de aire a presioacuten atmosfeacuterica lo que da por
resultado un aumento en alrededor de cinco veces su valor
Es posible tambieacuten alcanzar un mayor aumento de la
concentracioacuten de saturacioacuten si aumentamos la presioacuten
absoluta no obstante si hacemos fermentaciones con
oxiacutegeno a presioacuten resulta necesario disponer de un
fermentador capaz de resistir tales condiciones de presioacuten
resulta evidentemente maacutes costoso y tambieacuten pueden ocurrir
cambios importantes en el metabolismo de los
microorganismos que puedan afectar su crecimiento o su
rendimiento en producto
b) Temperatura la solubilidad del oxiacutegeno en agua disminuye al
aumentar la temperatura
c) Composicioacuten del liacutequido si en lugar de agua pura se tiene una
disolucioacuten como sucede con la mayoriacutea de los medios que
tiene una composicioacuten salina importante la solubilidad debe
corregirse pues dichos componentes afectan su valor y dicho
efecto estaacute influenciado tanto por los iones presentes como
por los componentes orgaacutenicos
44 Fermentaciones a presioacuten
La gran mayoriacutea de los estudios sobre fermentaciones son generalmente
llevados a cabo bajo condiciones de presioacuten ambiental maacutes allaacute del hecho de
que el fermentador por lo general suele encontrarse positivamente presurizado
Son pocos los ejemplos a excepcioacuten de la cerveza y algunos vinos donde las
fermentaciones son llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten positiva en el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 43
fermentador Esta leve presurizacioacuten suele deberse al proceso de aireacioacuten del
biorreactor debido a la formacioacuten de una presioacuten de vuelta debido a las
restricciones del respiradero de escape del fermentador
La presioacuten positiva en muchos casos puede resultar beneficiosa para los
procesos de fermentacioacuten no soacutelo por el hecho de incrementar la solubilidad del
oxiacutegeno en el caldo de cultivo sino tambieacuten porque reduce las oportunidades
de contaminacioacuten externa durante el proceso de fermentacioacuten Igualmente la
presioacuten puede tener efectos nocivos sobre los procesos fermentativos La
presioacuten tiene el efecto de influenciar las velocidades y la direccioacuten del
metabolismo de los microorganismos Esto es particularmente evidente en el
caso de productos o subproductos volaacutetiles que forman parte de distintas rutas
metaboacutelicas La presioacuten en el fermentador puede evitar la produccioacuten o
expulsioacuten de un producto gaseoso al medio circundante Este fenoacutemeno puede
tener el efecto de interferir con el equilibrio de varias reacciones bioquiacutemicas y
puede resultar en toxicidad al interior de la ceacutelula o en la divergencia de rutas
metaboacutelicas Lo significante de este impacto dependeraacute de la duracioacuten del
proceso asiacute como de la magnitud de la presioacuten a la cual se realice la
fermentacioacuten
De igual manera el efecto de la presioacuten sobre las macromoleacuteculas
guarda una gran semejanza con los efectos de la temperatura lo cual se
desprende del parecido de la forma de los diagramas de estabilidad de las
proteiacutenas y viabilidad de los microorganismos entre ambas variables
temperatura y presioacuten observacioacuten que tambieacuten permite concluir que las
proteiacutenas constituyen los primeros elementos estructurales en ser afectados
de manera negativa por el incremento de la presioacuten La presioacuten parece afectar
en mayor medida las interacciones proteiacutena-proteiacutena en comparacioacuten con la
estabilidad proteica por siacute misma por lo que es vaacutelido concluir que son estas
interacciones las primeras en verse afectadas por dicha variable La
conservacioacuten de la viabilidad en los microorganismos al ser sometidos a
presioacuten dependeraacute en gran medida de su capacidad para conservar una
membrana celular funcional aunque los mecanismos que emplean para tal fin
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 44
auacuten son desconocidos dada la vital importancia de las interacciones proteiacutena-
proteiacutena en las funciones de membrana
Lo maacutes importante es conocer con detalle como efectivamente la presioacuten
ejercida afecta el proceso de fermentacioacuten en particular la bioquiacutemica y la
fisiologiacutea del mismo de igual manera si es posible controlar la direccioacuten de la
fermentacioacuten manipulando la presioacuten o si la presioacuten estaacute generando el
desarrollo de reacciones secundarias indeseadas las respuestas a dichas
interrogantes soacutelo pueden ser dilucidadas mediante la experimentacioacuten praacutectica
del proceso fermentativo en estudio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 45
7 MATERIALES Y METODOLOGIacuteA
51 Informacioacuten de la cepa empleada
Se empleoacute la cepa Bacillus licheniformis ATCC9945a la cual se
encontraba conservada en estado vegetativo y bajo refrigeracioacuten en el
Laboratorio de Biopoliacutemeros del ETSEIB UPC Cataluntildea Con el propoacutesito de
seleccionar colonias altamente mucosas capaces de producir γ-PGA se
procedioacute a rallar la biomasa conservada en placas con Agar LB (pH 75) e
incubarlas por 24 horas a 37 ordmC Las colonias que mostraron una morfologiacutea
mucosa indicadora de la produccioacuten de γ-PGA fueron utilizadas para elaborar
los inoacuteculos empleados en las distintas fermentaciones
52 Medio de cultivo empleado
El medio de cultivo empleado para la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a fue el medio de cultivo E (Leonard et al 1958) con
algunas modificaciones seguacuten recomendado por Birrer y colaboradores (1994)
El detalle de la formulacioacuten se presenta en la tabla 5
Tabla 5 Formulacioacuten del medio de cultivo E empleado en el cultivo SmF de Bacillus
licheniformis ATCC9945a
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO43H2O 043 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 015 CaCl2 011 Glicerol 80 pH 75 Esterilizacioacuten por filtracioacuten (045 μm) Volumen 1 L
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 46
El medio de cultivo fue esterilizado por filtracioacuten (045 μm) y conservado
en refrigeracioacuten a 7 ordmC
53 Preparacioacuten de los inoacuteculos madre
Las colonias seleccionadas fueron inoculadas en matraces de 125 mL
con 25 mL de medio de cultivo E y cultivadas a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica
con varilla imantada a 650 rpm por 12 horas El caldo resultante fue
centrifugado a 8000 rpm por 25 minutos la biomasa recuperada fue
resuspendida en 10 mL de medio de cultivo E y 10 mL de una solucioacuten de
glicerol al 20 Dicha solucioacuten fue distribuida en voluacutemenes de 1 mL en tubos
eppendorf y congeladas a -80 ordmC
Posteriormente uno de estos tubos eppendorf fue empleado para
inocular matraces de 500 mL conteniendo 125 mL de medio de cultivo y fueron
cultivados a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica con varilla imantada a 650 rpm por
14 horas El caldo resultante fue centrifugado nuevamente a 8000 rpm por 25
minutos se recuperoacute la biomasa precipitada y se resuspendioacute en 25 mL de
medio de cultivo E y 25 mL de una solucioacuten de glicerol al 20 Dicha solucioacuten
fue distribuida en voluacutemenes de 2 mL en tubos eppendorf y posteriormente
fueron congelados a -80 ordmC Cada uno de estos eppendorf constituiacutea un inoacuteculo
de origen para una fermentacioacuten individual La absorbancia promedio de estos
inoacuteculos se encontraba cercana a 25
531 Conservacioacuten de la cepa en estado productivo
Los inoacuteculos deben conservarse en todo momento bajo congelacioacuten a
una temperatura inferior a -15 ordmC siendo preferible conservarlos a -80 ordmC La
condicioacuten de produccioacuten de γ-PGA es extremadamente fraacutegil y cambios de
temperatura o descongelamiento pueden conllevar la peacuterdida de dicha
capacidad La reutilizacioacuten de biomasa residual de fermentaciones previas
queda descartada
54 Montaje del biorreactor a presioacuten
En la actualidad los principales fabricantes de biorreactores para la
industria biotecnoloacutegica carecen de equipos de fermentacioacuten a escala
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 47
laboratorio que puedan operar bajo condiciones de presioacuten superiores a los 01
bares relativos Por este motivo se debioacute modificar un reactor quiacutemico a
presioacuten de modo tal que pudiese cumplir los requisitos necesarios para el
cultivo de microorganismos El modelo empleado fue el reactor quiacutemico a
presioacuten modelo 6425-214 de la casa AceGlass (Estados Unidos) de un
volumen total de 2 L Este reactor tiene la capacidad de operar hasta 35 psig
(241 bares relativos) a una temperatura de 100 ordmC y a una agitacioacuten de 300
rpm El mismo seguacuten su disentildeo original se presenta en la figura 6
Figura 6 Reactor quiacutemico a presioacuten modelo 6425-214 de AceGlass Co
Las dimensiones del frasco del reactor de forma ciliacutendrica y fondo
redondeado son las siguientes
Diaacutemetro de boca 95 mm
Diaacutemetro maacuteximo 120 mm
Profundidad 180 mm
Con el propoacutesito de adecuarlo al cultivo de microorganismos el reactor
fue ligeramente modificado en algunos de sus componentes y su distribucioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 48
Entre los principales cambios realizados al sistema se encuentran los
siguientes
1) Incorporacioacuten de una turbina de disco tipo Rushton al tratarse de una
fermentacioacuten aeroacutebica es necesario garantizar una adecuada aireacioacuten
del medio de cultivo mediante agitacioacuten efectiva La paleta de agitacioacuten
original del sistema no cumpliacutea con dicho requisito por lo cual se cambioacute
la misma por una turbina tipo Rushton cuyas dimensiones se muestran
en la figura 7
Dimensiones
A = 75 mm
B = 18 mm
C = 1mm
D = 20 mm
Figura 7 Dimensiones de la turbina tipo Rushton empleada
Esta turbina se encuentra en posicioacuten central a 3 cm del fondo del
reactor y a 6 mm de los deflectores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 49
2) Incorporacioacuten de deflectores se incorporaron dos laacuteminas deflectoras de
disentildeo propio de1 mm de ancho en una posicioacuten de 90 grados con
respecto a la superficie del reactor con el propoacutesito de reducir la
formacioacuten de voacutertice promover una agitacioacuten turbulenta y una mayor
formacioacuten de burbujas La geometriacutea de las laacuteminas deflectoras se
detalla en la Figura 8
Dimensiones
Ancho de laacutemina = 10 mm
Diaacutemetro = 95 mm
Longitud de laacutemina = 200 mm
Figura 8 Geometriacutea de las laacuteminas deflectoras
3) Cambio del motor de agitacioacuten se incorporoacute un motor IKA RW20 con
capacidad de hasta 2000 rpm en sustitucioacuten del motor original con que
A
B
C
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 50
disponiacutea el equipo (el sistema original trae un motor limitado a una
velocidad de agitacioacuten maacutexima de 330 rpm) con el propoacutesito de variar la
agitacioacuten del sistema y observar su efecto sobre el crecimiento y la
produccioacuten de poliacutemero
4) Reubicacioacuten de la vaacutelvula de seguridad de sobrepresioacuten con el
propoacutesito de garantizar una mayor seguridad del equipo maximizar la
vida uacutetil del cilindro de aire comprimido y evitar la sobrepresioacuten que
pueden generar el crecimiento del microorganismo (su metabolismo
puede liberar compuestos gaseosos o volaacutetiles) se trasladoacute la vaacutelvula de
seguridad del equipo de la tuberiacutea de llenado a la tapa del reactor
5) Eliminacioacuten de componentes dado que no resultaban uacutetiles para la
presente investigacioacuten se prescindioacute de instalar en la tapa del equipo el
condensado y el embudo de adicioacuten El disco de ruptura de la tuberiacutea de
llenado fue sustituido por una vaacutelvula de apertura manual con el
propoacutesito de permitir un mejor y maacutes raacutepido ajuste de la presioacuten durante
el establecimiento inicial de las condiciones de fermentacioacuten
55 Condiciones de fermentacioacuten
El detalle de las condiciones de temperatura presioacuten pH y agitacioacuten en
las cuales fueron establecidas las distintas fermentaciones asiacute como la
metodologiacutea de escalamiento empleada se presentan a continuacioacuten
551 Escalamiento
Inicialmente se procediacutea a inocular por duplicado 100 mL de medio de
cultivo con uno de los inoacuteculos madre (2 mL de ceacutelulas de Bacillus licheniformis
ATCC9945a conservados en tubos eppendorf a -20 ordmC) en matraces con
deflectores de 500 mL de capacidad A dichos matraces se les incorporaba una
pastilla de agitacioacuten magneacutetica de 25 cm de longitud y 07 cm de diaacutemetro y
eran colocados en agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm (agitador IKA C-MAG HS7)
por 8 horas a una temperatura aproximada de 30 ordmC
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 51
Posteriormente uno de los matraces (100 mL de cultivo) anteriormente
establecidos era utilizado para inocular 500 mL de medio de cultivo en el
biorreactor a presioacuten manteniendo una temperatura constante de 30 ordmC
aproximadamente Distintas presiones velocidades de agitacioacuten y densidades
oacutepticas del inoacuteculo fueron evaluadas El detalle del disentildeo experimental de
dichas pruebas se presenta a continuacioacuten en la tabla6
Tabla 6 Diferentes condiciones de presioacuten relativa agitacioacuten y absorbancia evaluadas en las
fermentaciones en biorreactor
CONDICIOacuteN
VALORES EVALUADOS
SOBREPRESIOacuteN
Agitacioacuten 300 rpm
Absorbancia del inoacuteculo 120
O bar (0 psig)
052 bar (75 psig)
103 bar (15 psig)
172 bar (25 psig)
241 bar (35 psig)
AGITACIOacuteN
Sobrepresioacuten 103 bar (15 psig)
Absorbancia del inoacuteculo 120
300 rpm
400 rpm
500 rpm
650 rpm
El tiempo de fermentacioacuten para cada uno de los ensayos evaluados fue
de 18 horas tiempo en el que el pH habiacutea descendido a un valor cercano pero
auacuten superior a 6 No se realizoacute ajuste alguno del pH a lo largo de la
fermentacioacuten Posteriormente se procediacutea a centrifugar el caldo de
fermentacioacuten a 8000 rpm por 25 minutos el sobrenadante recuperado era
almacenado para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA presente en
el mismo
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre
Con el propoacutesito de garantizar que el inoacuteculo madre era apto para la
produccioacuten de γ-PGA uno de los matraces inicialmente establecidos era
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 52
conservado bajo agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm y a 30 ordmC durante las 18 horas
que requeriacutea la fermentacioacuten en el biorreactor Posteriormente se determinaba
cualitativamente la produccioacuten de γ-PGA seguacuten la simbologiacutea que se presenta
en la tabla 7
Tabla 7 Simbologiacutea empleada para la medicioacuten cualitativa de la produccioacuten de γ-PGA en los
matraces de control
SIacuteMBOLO OBSERVACIOacuteN CUALITATIVA
- No produccioacuten de γ-PGA
+ Produccioacuten de γ-PGA
+++ Elevada produccioacuten de γ-PGA
56 Determinacioacuten del valor de kLa
Para la determinacioacuten del valor aproximado de kLa tanto en los
matraces coacutemo en el biorreactor se empleoacute el meacutetodo estaacutetico sin operacioacuten
del cultivo celular Dicho valor no fue determinado bajo condiciones de presioacuten
pues se careciacutea con la instrumentacioacuten adecuada sino soacutelo a presioacuten
atmosfeacuterica para ambos casos matraz y biorreactor
Este meacutetodo consiste en disminuir la concentracioacuten de oxiacutegeno hasta
una concentracioacuten de 1-25 mgL despueacutes el sistema es retornado a aireacioacuten
yo agitacioacuten y se mide como va aumentando la concentracioacuten de oxiacutegeno en la
fase liacutequida conforme transcurre el tiempo El objetivo es por tanto disminuir la
concentracioacuten de cA0 lo suficiente como para tener un cambio importante
obteniendo asiacute una curva de ascenso de las concentraciones de oxiacutegeno en el
tiempo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 53
561 Matraces de cultivo
A un matraz de cultivo en reposo conteniendo 100 mL de medio de
cultivo E se le agregoacute 001 g de sulfito de sodio (Na2SO3) y una punta de
espaacutetula de cloruro de cobalto (actuacutea como catalizador) y se agita
manualmente por 20 s Posteriormente se introdujo la sonda de oxiacutegeno
disuelto del medidor Hanna Oxi-check y se dejoacute descender el nivel de oxiacutegeno
disuelto hasta el valor miacutenimo posible entre 20-25 mgL Seguidamente se
activoacute la agitacioacuten magneacutetica y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto cada 10
segundos hasta alcanzar un punto maacuteximo que se repitiese al menos durante
2 minutos
562 Biorreactor
Se procedioacute a llenar el reactor con 600 mL de medio de cultivo y en
estado de reposo se le agregoacute 006 g de sulfito de sodio una punta de espaacutetula
de cloruro de cobalto y se agitoacute suavemente a 100 rpm por 20 segundos
Haciendo uso de la sonda de oxiacutegeno se determinoacute el menor nivel posible de
oxiacutegeno disuelto alrededor de 15-20 mgL Posteriormente se encendioacute la
agitacioacuten mecaacutenica a 300 rpm y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto en
intervalos de 10 segundos hasta alcanzar un valor maacuteximo de oxiacutegeno disuelto
sostenido en el tiempo es decir que se repitiese por al menos un minuto
563 Graficacioacuten
Con el propoacutesito de determinar el valor de kla a partir de la ecuacioacuten de
balance de oxiacutegeno
V(dCAdt) = VkLa(cA-cA)
Se tiene que integrando dicha ecuacioacuten con la concentracioacuten inicial cA0
se obtiene
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 54
Representado ln((cA - cA0)(c
A- cA)) contra el tiempo t se obtiene una
recta cuya pendiente es el valor de kLa
57 Determinacioacuten del contenido de γshyPGA en el caldo de fermentacioacuten
Con el propoacutesito de determinar la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo
post-fermentacioacuten se utilizoacute la teacutecnica analiacutetica llamada cromatografiacutea liacutequida
de alta eficiencia conocida normalmente por sus siglas en ingleacutes HPLC
especiacuteficamente la conocida como cromatografiacutea de permeacioacuten en gel (GPC)
uno de los tipos de cromatografiacutea de exclusioacuten molecular (SEC) maacutes
empleados en la separacioacuten de poliacutemeros
El equipo empleado fue el cromatoacutegrafo modelo 1260 Infinity de Agilent
Technologies La columna de separacioacuten empleada fue una columna PL
aquagel-OH de 8μm para cromatografiacutea GPC en fase acuosa El meacutetodo de
cromatografiacutea empleado consistioacute en eludir 25 μL de la muestra haciendo uso
de una solucioacuten tampoacuten fosfato 005 molL con un tiempo de elucioacuten de 15 min
por muestra El caudal de flujo del eluyente fue de 08 mLmin La deteccioacuten se
llevoacute a cabo a traveacutes de un detector de absorbancia UV-vis de longitud de onda
variable (VWD) a una longitud de onda de 220 nm y tambieacuten un detector de
iacutendice de refraccioacuten (RID) con polaridad positiva y una temperatura de la
unidad oacuteptica de 35 ordmC aunque los resultados reportados y empleados fueron
los obtenidos con el detector VWD El tiempo de retencioacuten de la fraccioacuten
polimeacuterica correspondiente al γ-PGA se encontroacute entre los 65 y los 90
minutos considerando el hecho de que el mismo se trata de una mezcla de
moleacuteculas polimeacutericas de distinta longitud y por ende distinto peso molecular
Para poder cuantificar la cantidad de poliacutemero presente en la muestra se
elaboroacute una curva de calibracioacuten inicial Se prepararon soluciones en agua
destilada de γ-PGA a concentraciones de 10 5 2 1 y 05 gL Las mismas
fueron analizadas mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva para el
pico correspondiente al γ-PGA para cada concentracioacuten Dichos valores fueron
empleados para la elaboracioacuten de la curva de calibracioacuten inicial del equipo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 55
Las muestras a analizar fueron preparadas de la siguiente manera 400
μL del caldo crudo se diluyeron en agua destilada hasta un volumen final de 2
mL (dilucioacuten 5x) y posteriormente fueron filtradas mediante jeringa haciendo
uso de filtros de 045 μm en viales de HPLC Las muestras fueron analizadas
mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva del pico correspondiente al
γ-PGA para cada una de las muestras
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
Con el propoacutesito de determinar el efecto del contenido de γ-PGA sobre la
solubilidad maacutexima de oxiacutegeno en el medio de cultivo en condiciones estaacuteticas
es decir sin crecimiento microbiano (consumo de oxiacutegeno de los
microorganismos nulo) se procedioacute a preparar soluciones de 100 mL de
volumen a concentraciones crecientes de poliacutemero (poliacutemero + biomasa) en
medio de cultivo y medir el nivel de oxiacutegeno disuelto en mgL haciendo uso de
un medidor de oxiacutegeno disuelto Hanna Oxi-check Dichas soluciones fueron
evaluadas en las mismas condiciones de fermentacioacuten empleadas en la
primera etapa de escalamiento matraces de 500 mL con deflectores y a una
agitacioacuten magneacutetica de 650 rpm Se evaluaron concentraciones de biopoliacutemero
de 0 7 14 21 36 54 y 71 gL
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano
Para determinar el crecimiento bacteriano se aprovechoacute el efecto que
dicho crecimiento genera sobre la turbidez del caldo a lo largo de la
fermentacioacuten Por ello se empleoacute la teacutecnica de espectrofotometriacutea
determinando la absorbancia del medio de cultivo inoculado y su incremento
con el tiempo Se empleoacute el coloriacutemetro modelo ZUSI 4200A a una longitud de
onda de 660 nm El equipo era inicialmente calibrado en 0 haciendo uso de
agua destilada acto seguido se determinaba el valor de absorbancia de la
muestra a analizar
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 56
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producido se determinoacute
mediante el meacutetodo desarrollado por Marfey (1984) para la determinacioacuten
cuantitativa de la composicioacuten enantiomeacuterica de aminoaacutecidos Dicho meacutetodo se
basa en la reaccioacuten del aacutecido glutaacutemico con el reactivo de Marfey (1-fluoro-24-
dinitrofenil-5-L-alanina) Dicho compuesto es oacutepticamente activo por lo que al
reaccionar con los enantioacutemeros D- y L- del aacutecido glutaacutemico forma dos
diasteroisoacutemeros que pueden separarse mediante cromatografiacutea HPLC con
tiempos de retencioacuten para el isoacutemero L- y el D- de 675 y 100 minutos
aproximadamente Para poder cuantificar la composicioacuten de manera efectiva
se realizoacute un calibrado previo con mezclas de concentracioacuten conocida de cada
isoacutemero
5101 Preparacioacuten de la muestras
Se introdujo 3 mg del γ-PGA a analizar en viales de 5 mL y se les
adicionoacute 2 mL de HCl 6 molL Se dejaron calentar a 100 ordmC en estufa por un
periacuteodo de 24 horas Posteriormente se trasfirioacute 100 μL de cada una de las
muestras a tubos eppendorf y se dejaron en desecador al vaciacuteo por un periacuteodo
de tres diacuteas empleando NaOH como desecante Seguidamente se disolvioacute los
productos en 100 μL de agua y se hicieron reaccionar con 200 μL de una
disolucioacuten con concentracioacuten de 5 mgmL de reactivo de Marfey en acetona con
20 μL de carbonato aacutecido de sodio (NaHCO3) durante una hora en estufa a 37
ordmC Al finalizar se neutralizoacute como 10 μL de HCl 2 molL y se dejoacute secar al vaciacuteo
por 3 diacuteas en el desecador a vaciacuteo con NaOH como desecante Finalmente se
diluyoacute la muestra en 350 μL de dimetilsulfoacutexido (DMSO) para cromatografiarla
por HPLC
La cromatografiacutea se llevoacute a cabo en el mismo equipo empleado para la
determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA pero con los siguientes cambios
1) Se empleoacute una columna de fase estacionaria reversa Spherisorb ODS2
de 5 μm de poro 25 cm de longitud y 046 cm de diaacutemetro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 57
2) El caudal de flujo del eluyente fue de 15 mLmin
3) El detector de longitud de onda variable (VWD) operaba a 340 nm y el
tiempo de elucioacuten era de 25 minutos
4) El eluyente empleado era una mezcla 8020 de fosfato de trietilamonio
50 mmolL a pH 3 y acetonitrilo El fosfato de trietilamonio se obteniacutea
haciendo reaccionar cantidades equimolares de trietilamina y aacutecido
fosfoacuterico
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual
La composicioacuten porcentual enantiomeacuterica del γ-PGA es decir el
contenido porcentual de aacutecido D- y L-glutaacutemico se determinoacute mediante
contraste de las aacutereas obtenidas en el cromatograma para cada uno de los
picos correspondientes a cada diasteroisoacutemero con el aacuterea total
correspondiente a los productos de reaccioacuten (sumatoria de ambos
diasteroisoacutemeros) La composicioacuten se reportoacute como un porcentaje de aacutecido D-
glutaacutemico y aacutecido L-glutaacutemico presente en la muestra analizada
511 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA Para la determinacioacuten del peso molecular del poliacutemero se procedioacute a
analizar los cromatogramas obtenidos para el caacutelculo de la concentracioacuten de γ-
PGA Se empleoacute el programa informaacutetico ChemStation for LC Systemsreg de
Agilent Technologies Dicho programa posee unas potentes herramientas de
anaacutelisis que permiten automaacuteticamente calcular el peso molecular de un
compuesto Para las muestras analizadas se determinoacute el peso molecular
promedio en nuacutemero (Mn) el peso molecular promedio en peso (Mw) la
polidispersidad y el peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) La recta de
calibrado fue obtenida previamente por Bou y colaboradores con estaacutendares de
polioacutexido de etileno (PEO)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 58
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 59
8 RESULTADOS
61 Montaje del biorreactor a presioacuten
El detalle final del biorreactor empleado puede observarse en la figura 8
Noacutetese que la temperatura es controlada por la accioacuten de una manta teacutermica
externa como sucede con el disentildeo original del reactor y no por el empleo de
un serpentiacuten interno caso de la gran mayoriacutea de biorreactores comerciales a
escala laboratorio El mismo permite operar en condiciones de agitacioacuten de 100
a 650 rpm y a presiones de hasta 24 bar de sobrepresioacuten (35 psig) El
biorreactor resultoacute apto para el crecimiento microbiano alcanzaacutendose valores
de absorbancia de hasta 37 similares a los observados en cultivos en
matraces
Figura 9 Biorreactor empleado para la produccioacuten de γ-PGA bajo presioacuten
62 Competencia del inoacuteculo madre
Mediante la metodologiacutea descrita previamente para la preparacioacuten del
inoacuteculo madre fue posible alcanzar en el 100 de los cultivos de control la
produccioacuten de γ-PGA en alta cantidad Aunque dichos resultados no se
muestran el empleo de inoacuteculos de otra naturaleza como reutilizacioacuten de
biomasa o inoacuteculos conservados a temperaturas superiores a -20 ordmC mostraron
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 60
ser ineficaces y poco reproducibles en cuanto a la produccioacuten de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a Los resultados de los cultivos control
pueden observarse en el graacutefico 10 bajo el nombre de Matraz
63 Determinacioacuten de los valores de kLa
631 Matraz
En lo referente al cultivo en matraz bajo las condiciones de agitacioacuten y
temperatura empleadas y en condiciones estaacuteticas (sin crecimiento
microbiano) se encontroacute un valor de kLa de 0026 s-1 En el graacutefico 1 y 2 se
muestran la curva de concentracioacuten de oxiacutegeno en funcioacuten del tiempo al
reiniciarse el proceso de agitacioacuten asiacute como el caacutelculo de dicho valor de
coeficiente mediante regresioacuten lineal respectivamente
Graacutefico 1 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concentracioacuten m
gL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 61
Graacutefico 2 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00257x ‐ 08809Rsup2 = 09966
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
Cuando se realizoacute la misma determinacioacuten pero a una velocidad de
agitacioacuten menor (430 rpm) el valor de kLa disminuyoacute significativamente En
dicho caso el valor de kLaobtenido fue de 0017 s-1 Estos resultados se
muestran en los graacuteficos 3 y 4
Como se puede observar en dichos graacuteficos el tiempo requerido para
alcanzar el valor maacuteximo estable se incrementoacute considerablemente en 60
segundos lo que indica una menor velocidad de transferencia producto de la
reduccioacuten de la intensidad de la agitacioacuten suministrada al cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 62
Graacutefico 3 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 430 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Graacutefico 4 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00168x ‐ 07551Rsup2 = 09835
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
ln Linear (ln)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 63
632 Biorreactor
Para el caso del biorreactor el valor de kLa determinado fue de 0025 s-1
esto bajo condiciones estaacuteticas (sin crecimiento microbiano) y en las
condiciones de temperatura y operacioacuten previamente descritas
Como se puede observar dicho valor es praacutecticamente igual al obtenido
para el caso del matraz lo que indica condiciones de transferencia de oxiacutegeno
gas-liacutequido muy similares en ambos casos El valor dekLa fue determinado en
un punto lateral del reactor 2 cm por debajo del nivel de medio de cultivo y
contiguo a uno de los deflectores punto donde la transferencia de materia
debiera en principio ser mayor Dichos resultados se presentan en los graacuteficos
5 y 6
Graacutefico 5 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten mecaacutenica del medio de cultivo en biorreactor a 300 rpm
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
560
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Concentracioacuten
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 64
Graacutefico 6 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00246x ‐ 03222Rsup2 = 09902
000
050
100
150
200
250
300
0 20 40 60 80 100 120 140
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
64 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En lo referente a los niveles de oxiacutegeno a distintas concentraciones de γ-
PGA en condiciones estaacuteticas sin crecimiento microbiano se observa una
draacutestica reduccioacuten de dicho nivel conforme se incrementa la concentracioacuten del
biopoliacutemero Dicho fenoacutemeno es esperable dada la alta viscosidad del γ-PGA
La concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo alcanza un valor inicial de
74 mgL el cual se reduce draacutesticamente a 52 mgL a un valor de
concentracioacuten de γ-PGA de 14 gL Esta reduccioacuten es uacutenicamente producto de
la presencia del γ-PGA en el medio de cultivo El graacutefico 7 muestra dicho
fenoacutemeno hasta un valor miacutenimo de oxiacutegeno disuelto de 25 mgL cuando la
concentracioacuten de poliacutemero alcanza un maacuteximo 71 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 65
Graacutefico 7 Efecto de la concentracioacuten de γ-PGA sobre el nivel maacuteximo de oxiacutegeno disuelto en el
medio de cultivo E
y = ‐00569x + 64671Rsup2 = 08709
000
100
200
300
400
500
600
700
800
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Oxiacutegeno disuelto m
gL
γ‐PGA gL
Solubilidad O2 (mgL) Linear (Solubilidad O2 (mgL))
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γshyPGA mediante GPC
La curva de calibracioacuten obtenida a partir de soluciones con
concentracioacuten conocida de γ-PGA se presenta en el graacutefico 8
Como se puede observar se obtuvo un valor del coeficiente de
determinacioacuten R2 de 09983 lo que indica un ajuste lineal suficiente y un valor
del coeficiente de correlacioacuten R de 09991 lo que indica una correlacioacuten
positiva entre los datos contrastados La concentracioacuten de γ-PGA estaacute
determinada entonces por la siguiente ecuacioacuten
Concentracioacuten γ-PGA (gL) = (00027 x Aacuterea) ndash 00916
Esta curva fue posteriormente empleada para determinar la
concentracioacuten de γ-PGA en los caldos de cultivo obtenidos despueacutes de cada
una de las fermentaciones realizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 66
Graacutefico 8 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA mediante
GPC
y = 00027x ‐ 00916Rsup2 = 09983
0
2
4
6
8
10
12
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Concentracioacuten gL
Aacuterea
Series1 Linear (Series1)
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γshyPGA
En lo referente al efecto de la presioacuten (relativa) sobre la productividad en
γ-PGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a se encontroacute un incremento de los
rendimientos fermentativos conforme se incrementaba la presioacuten hasta
alcanzar un valor maacuteximo de sobrepresioacuten de 103 bar (15 psig) una vez
superado dicho umbral la productividad se veiacutea reducida draacutesticamente A 103
bar la productividad en γ-PGA alcanzaba un valor de 1334 gL productividad
mayor a la obtenida en condiciones de aireacioacuten (2 Lmin) a presioacuten
atmosfeacuterica la cual fue de 508 gL Esta productividad maacutexima contrasta con
la obtenida a presioacuten atmosfeacuterica la cual fue miacutenima con un valor de 217 gL
Los graacuteficos 9 y 10 muestran los resultados anteriormente comentados Asiacute
mismo en la tabla 8 se presentan la totalidad de fermentaciones llevadas a
cabo las productividades obtenidas y el promedio de cada condicioacuten Es
importante destacar que cada condicioacuten de presioacuten fue evaluada por duplicado
no encontraacutendose diferencias importantes entre los resultados obtenidos para
ninguno de los casos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 67
Graacutefico 9 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748
617
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 05 1 15 2 25
PGGA (gL)
Presioacuten (bar)
RENDIMIENTO gL
Graacutefico 10 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten y la aireacioacuten a presioacuten atmosfeacuterica (0 relativa)
sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748617 508
4582
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
0 052 103 172 241 0 +Aireacioacuten
Matraz
Concentracioacuten γ‐PGA gL
Presioacuten
RENDIMIENTO gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 68
Tabla 8 Fermentaciones realizadas y concentraciones de γ-PGA obtenidas
Reactor Condiciones A D C (gL)AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10108 5 130
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10926 5 141
AHJC11 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 11753 5 152
AHJC11 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10186 5 131
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 95011 5 122
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 97936 5 126
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28706 3 20
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28194 3 20
AHJC14 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 33184 3 24
AHJC14 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 32866 3 23
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 68396 3 52
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 65871 3 50
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43692 5 54
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 46235 5 57
AHJC16 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 49809 5 62
AHJC16 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 58872 5 74
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 57321 5 72
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43021 5 53
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 57727 5 72
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 62398 5 78
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 60469 5 76
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 58335 5 73
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 6083 5 76
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 57897 5 72
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 51267 5 64
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 48407 5 60
= nuacutemero de muestra A = aacuterea D = dilucioacuten C = concentracioacuten y bar = bar relativo
Algunos de los cromatogramas realizados se muestran en las figuras 10
y 11 Como se puede observar la forma del pico de elucioacuten demuestra que el
biopoliacutemero estaacute compuesto por moleacuteculas de distinta longitud por lo cual
existen diferentes pesos moleculares Es importante destacar que para la gran
mayoriacutea de las fermentaciones realizadas el pico siempre presentoacute su maacutexima
altura al inicio lo que demuestra que la mayor parte de eacutel se trataba de un
poliacutemero de alto peso molecular Igualmente esto podriacutea indicar poca
degradacioacuten del biopoliacutemero durante las 18 horas de fermentacioacuten lo cual es
importante dada la capacidad de Bacillus licheniformis ATCC9945a de
hidrolizar enzimaacuteticamente el γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 69
Figura 10 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA analizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 70
Figura 11 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA (052-103-172 y 241 bar relativas)
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γshyPGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a
En lo referente al efecto de la intensidad de agitacioacuten en rpm sobre la
produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a a una presioacuten de
103 bar relativos (15 psig) se encontroacute un efecto negativo del aumento de la
agitacioacuten por encima de las 300 rpm lo que se demuestra con una importante
reduccioacuten en la concentracioacuten final de γ-PGA obtenida despueacutes de 18 horas de
fermentacioacuten Estos resultados se presentan en el graacutefico 11 Como se puede
observar una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm llega a ser tan perjudicial
para el microorganismo que la productividad en γ-PGA cae por debajo del valor
de 1 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 71
Graacutefico 11 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis
ATCC9945a a 103 bar (15 psig) a 30 ordmC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
300 350 400 450 500 550 600 650 700
Concentracioacuten gL
Agitacioacuten rpm
RENDIMIENTO (gL)
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica resultoacute afectada por las condiciones de
presioacuten Como demuestra el graacutefico 12 la proporcioacuten de aacutecido L-glutaacutemico en
las muestras correspondientes a fermentaciones bajo presioacuten resultoacute ser por
mucho mayor a las observadas en los cultivos control tanto en comparacioacuten
con el de matraz como con el sometido a aireacioacuten
La respectiva curva de calibracioacuten con las muestras conformadas por
mezclas con composicioacuten definida de ambos enantioacutemeros se presente en el
graacutefico 13 Como se puede observar los valores teoacutericos y los valores
experimentales obtenidos en el cromatograma coinciden en buena medida lo
que indica la validez de esta teacutecnica para la determinacioacuten de la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA
En dos casos para las fermentaciones llevada a cabo a 052 bar y 172
bar de sobrepresioacuten (75 y 25 psig respectivamente) la proporcioacuten de aacutecido D-
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 72
glutaacutemico fue de cero en contraste con el control en matraz donde dicha forma
del aacutecido glutaacutemico estaba presente mayoritariamente en un 87
De igual manera en lo que concierne a la fermentacioacuten llevada a cabo a
presioacuten atmosfeacuterica y bajo condiciones de aireacioacuten se observa tambieacuten que el
enantioacutemero mayoritariamente presente es el aacutecido D-glutaacutemico con un 83
en contraste con el aacutecido L-glutaacutemico con apenas un 17 Todas las
fermentaciones llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten presentan un
contenido de aacutecido L-glutaacutemico superior al 83
Aunque no fue posible encontrar una correlacioacuten directa entre la presioacuten
y la composicioacuten porcentual en aacutecido D-glutaacutemico si es posible observar como
las condiciones de presioacuten parecen limitar condicionar o disminuir la presencia
de esta forma del aacutecido glutaacutemico en el γ-PGA
Graacutefico 12 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica en aacutecido
L-glutaacutemico y aacutecido D-glutaacutemica del γ-PGA producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a
R11 (103bar)
R12 (103bar)
R15 (0 +aireacioacuten)
R16 (241bar)
R19 (172bar)
R22 (052bar)
MATRAZ
AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO 9518 8319 1736 10000 8347 10000 1285
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO 482 1681 8264 000 1653 000 8715
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 73
Graacutefico 13 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-
PGA mediante HPLC
000
2900
4700
7700
970010000
7100
5300
2300
300
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
100 L 75 L 25 D 50 L 50 D 25 L 75 D 100 D
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO
69 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA
Los resultados de los pesos moleculares de los poliacutemeros obtenidos en
los distintos ensayos se muestran en la tabla 9 El peso molecular promedio de
permeacioacuten (Mp) de todas las muestras se encontroacute entre los 269-307 x 107
gmol
Tabla 8 Valores de peso molecular promedio en nuacutemero (Mn) peso molecular promedio en
peso (Mw) peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) y polidispersidad (PD) delγ‐PGA
producido en los distintos ensayos evaluados
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
MATRAZ1 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 157 214 29 137
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
MATRAZ2 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 160 216 292 135
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar relativos
207 252 307 122 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 74
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
204 252 307 124 PRIMERO MAYOR
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
202 252 307 125 PRIMERO MAYOR
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
199 251 307 126 PRIMERO MAYOR
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 200 247 307 123
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 226 26 306 115
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 179 223 281 125
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 172 221 264 128
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
217 248 304 114 PRIMERO MAYOR
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
210 246 304 117 PRIMERO MAYOR
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
195 233 284 120 SEGUNDO MAYOR
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
178 225 269 126 SEGUNDO MAYOR
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
223 262 306 118 PRIMERO MAYOR
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
222 261 306 117 PRIMERO PAYOR
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
207 254 307 122 PRIMERO MAYOR
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
187 251 306 134 PRIMERO MAYOR
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
171 246 306 144 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
185 253 306 136 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
202 252 306 125 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 75
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
232 263 306 113 PRIMERO MAYOR
AHJC32-1-18HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
173 228 307 132 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-2-18HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
177 230 306 130 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-1-36HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
165 220 23 133 IGUALES
AHJC32-2-36HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
173 224 302 130 IGUALES
Los valores de polidispersidad estuvieron entre 113 y 144 Asiacute mismo
no se observan mayores diferencias entre los pesos moleculares obtenidos a
distintas presiones aunque la existencia de un segundo pico era maacutes evidente
en los cromatogramas correspondientes a γ-PGA producido en condiciones de
presioacuten relativa 0 Asiacute mismo dichas muestras presentan un peso molecular
levemente menor aunque dicha tendencia no es absoluta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 76
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 77
9 DISCUSIOacuteN
71 Cepa empleada
Bacillus licheniformis ATCC9945a es una cepa que ha sido empleada
con eacutexito en la produccioacuten de γ-PGA particularmente a escala laboratorio maacutes
no ha sido empleada a escala industrial donde otras cepas particularmente de
la especie Bacillus subtilis han sido las preferidas tanto por aspectos de
rendimiento como estabilidad productiva de la cepa El presente estudio
determinoacute una productividad promedio en condiciones de matraz de 4582 gL
despueacutes de 72 horas de cultivo Valores de productividad tan altos no habiacutean
sido reportado previamente para Bacillus licheniformis ATCC9945a donde
valores entre 17 y 23 gL de rendimiento han sido reportados por Troy (1973)
Cromwick y Gross (1996) 26 a 35 gL por Bajaj y colaboradores (2009) y 35
gL por Yoon y colaboradores (2000)
Los motivos de este mayor rendimiento aunque no son claros pueden
deberse a una mejor transferencia de oxiacutegeno en el sistema de agitacioacuten
magneacutetica en comparacioacuten con la agitacioacuten orbital estaacutendar Asiacute por ejemplo y
utilizando la ecuacioacuten simplificada para determinar en valor de kLa en agitacioacuten
orbital (Diacuteaz 2011) tenemos que a 20 ordmC
kLa = 139 x 10-3n (VTVL)084
Asiacute tenemos que para un sistema en agitacioacuten orbital a 250 rpm es decir
a una frecuencia de 417 s-1 con un volumen de medio de cultivo de 100 mL y
un volumen total del matraz 500 mL el valor de kLa es de aproximadamente
0020 s-1 inferior al valor de 0026 s-1 obtenido en el presente estudio para el
cultivo en agitacioacuten magneacutetica a 30 ordmC Dado que la difusividad disminuye al
aumentar la temperatura es de esperar que a 30 ordmC dicho valor de kLa teoacuterico
sea auacuten menor
Es importante sentildealar que en lo referente a la composicioacuten del medio de
cultivo el medio de cultivo E empleado en este estudio es el mismo empleado
previamente por otros autores para el estudio de la produccioacuten de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a por lo cual no se considera que la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 78
composicioacuten del medio de cultivo pueda ser la responsable de las diferencias
con los resultados reportados anteriormente por otros investigadores quienes
en particular tambieacuten emplearon dicho medio de cultivo en sus pruebas
Dicho valor de rendimiento promedio obtenido de 4582 gL (en matraz)
coloca a este cepa al mismo nivel de productividad de las cepas
industrialmente empleadas como sucede con Bacillus subtilis F02-1 con un
rendimiento reportado por Kubota y colaboradores (1993) de 50 gL pero con
una menor necesidad de aacutecido glutaacutemico (20 gL en contra de 80 gL) La
conveniencia del empleo de la cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis debe
entonces evaluarse entorno a su capacidad de escalamiento y conservacioacuten de
la competencia en la produccioacuten de γ-PGA y no entorno a su maacuteximo
rendimiento pues en este aspecto ha demostrado en condiciones oacuteptimas la
capacidad de producir γ-PGA en concentraciones extremadamente elevadas
Los resultados acaacute obtenidos refuerzan lo ya descrito por otros autores quienes
sentildealan precisamente estos aspectos (escalamiento y estabilidad) como los
principales retos para llevar a cabo la produccioacuten de γ-PGA mediante Bacillus
licheniformis ATCC9945a
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente
Uno de los principales problemas que se enfrentoacute a lo largo de la
presente investigacioacuten es la facilidad con la cual la cepa ATCC9945a de
Bacillus licheniformis revierte a formas incapaces de producir γ-PGA Este
fenoacutemeno puede ocurrir incluso con tan soacutelo una generacioacuten de cultivo por lo
cual el empleo de la biomasa generada en una fermentacioacuten previa es
indeseable pues seguramente no daraacute resultados positivos para la produccioacuten
de γ-PGA
Este fenoacutemeno es uno de los principales inconvenientes que se
enfrentan a la hora de evaluar el efecto de diversos paraacutemetros sobre la
productividad de γ-PGA en esta cepa pues la incapacidad de garantizar
resultados reproducibles imposibilita poder evaluar condiciones nutricionales
de agitacioacuten temperatura y demaacutes teniendo la certeza que las diferencias
encontradas solo se deberaacuten a los paraacutemetros bajo control
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 79
Cromwick y colaboradores (1994) reportaron el congelamiento con
nitroacutegeno liacutequido como una forma vaacutelida para la preservacioacuten de las ceacutelulas en
un estado consistente de alta productividad de γ-PGA En nuestro caso la
metodologiacutea empleada fue distinta Se incorporoacute el glicerol como crioprotector y
el congelamiento no se realizoacute mediante nitroacutegeno liacutequido sino que fue
congelamiento convencional utilizando un equipo de refrigeracioacuten con una
capacidad de enfriamiento de hasta -80 ordmC y voluacutemenes de inoacuteculo pequentildeos
de entre 1 y 2 mL cuyo congelamiento fuera particularmente raacutepido
Igualmente se observoacute que los cultivos que mejor comportamiento y
reproducibilidad dieron como inoacuteculo fueron aquellos cuyas ceacutelulas eran
recolectadas previo al inicio de la produccioacuten de γ-PGA Cultivos cuya edad
superaba las 10 horas y que ya presentaban presencia de γ-PGA aunque
podiacutean emplearse para la obtencioacuten de inoacuteculos madres los mismos no
resultaban tan eficientes como los anteriormente descritos
El empleo de esta metodologiacutea de conservacioacuten de la cepa permitioacute una
reproducibilidad del 100 en los ensayos obtenieacutendose poliacutemero en la
totalidad de los cultivos de control que se establecieron durante cada una de
las fermentaciones llevadas a cabo en el biorreactor Estos resultados indican
que dicha metodologiacutea es eficaz para la preservacioacuten a largo plazo de Bacillus
licheniformis ATCC9945a y como estrategia para un adecuado escalamiento
durante el proceso de produccioacuten a mayor escala De igual manera la
descripcioacuten detallada del proceso de conservacioacuten volumen de inoacuteculo
concentracioacuten de la muestra (por absorbancia) temperatura y demaacutes permite
una alta reproducibilidad del meacutetodo en contraposicioacuten con los reportes
existentes por otros autores que no brindaban mayor detalles sobre coacutemo llevar
a cabo este proceso de conservacioacuten
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten
Las fermentaciones a presiones superiores a la presioacuten atmosfeacuterica no
son habituales tanto a nivel de investigacioacuten como a nivel de proceso Dicha
afirmacioacuten queda particularmente ratificada cuando se analizan las opciones
comerciales existentes a escala laboratorio de biorreactores disentildeados para
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 80
operar a presioacuten la cual resulta praacutecticamente nula Por este motivo y para
poder llevar a cabo este estudio se requirioacute adaptar un reactor quiacutemico de
modo tal que permitiese trabajar a presioacuten y a la vez tuviese un control de
agitacioacuten y temperatura miacutenimo de modo tal que permitiese el cultivo de
microorganismos El biorreactor disentildeado fue exitoso pues permitiacutea un
crecimiento microbiano oacuteptimo y la produccioacuten de γ-PGA en un tiempo
relativamente corto de 18 horas
Las modificaciones realizadas en realidad fueron miacutenimas con respecto
a la estructura baacutesica del reactor quiacutemico convencional y con ellas se buscoacute
crear las condiciones que permitiesen incrementar la turbulencia en el sistema
de modo que existiese una mayor oxigenacioacuten y un mayor coeficiente
volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno (kLa) partiendo de antemano de la
hipoacutetesis inicial que sentildealaba al oxiacutegeno como uno de los componentes
limitantes de hecho el de mayor importancia para que este fermentacioacuten
ocurriese de la manera adecuada y con un alto rendimiento de γ-PGA
Se decidioacute emplear un reactor hecho de vidrio en lugar de uno metaacutelico
debido a que las condiciones de oxidacioacuten de la fermentacioacuten y la sensibilidad
de las enzimas involucradas a los iones metaacutelicos haciacutean deseable un material
inerte como sucede con el vidrio De igual manera al emplearse vidrio se tiene
una visioacuten del interior del fermentador las condiciones de agitacioacuten y formacioacuten
de burbujas son visibles asiacute como el crecimiento microbiano lo que permite un
mejor ajuste y correccioacuten de las condiciones de fermentacioacuten al menos durante
las etapas iniciales de investigacioacuten Para poder trabajar a mayores presiones
se hubiese requerido un reactor quiacutemico metaacutelico de un costo sumamente
elevado Los resultados experimentales demostraron que el rango de presioacuten
definido resultoacute ser el correcto para la investigacioacuten
La seleccioacuten de una turbina tipo Rushton radica en que este tipo de
agitador de pala plana se considera como el ideal para la realizacioacuten de
fermentaciones Dado que las paletas de heacutelices Rushton son planas y
colocadas verticalmente a lo largo del eje de agitacioacuten producen un flujo radial
unidireccional que permite una alta difusioacuten de un gas en un liacutequido por lo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 81
comuacuten son utilizadas en la fermentacioacuten de liacuteneas celulares que requieren altas
tasas de oxiacutegeno tales como las levaduras bacterias y algunos hongos
Las laacuteminas deflectoras fueron incorporadas pues aunque a velocidades
muy bajas un agitador de paletas produce una agitacioacuten suave inclusive en un
tanque sin laacuteminas deflectoras cuando son necesarias velocidades elevadas
se requiere la incorporacioacuten de dichas laacuteminas para aumentar la turbulencia de
lo contrario el liacutequido se mueve como un remolino que gira alrededor del
tanque con velocidad elevada pero con poco efecto de mezcla
74 Tiempo de fermentacioacuten
El tiempo de fermentacioacuten empleado en esta investigacioacuten es
significativamente inferior al empleado por otros autores que hablan de un
promedio de 72 horas Es importante sentildealar que 18 horas es el tiempo
suficiente para que el pH del medio de cultivo descienda a cerca de 60
Valores de pH inferiores a este han demostrado ser perjudiciales pues decae
el consumo de aacutecido ciacutetrico se detiene en gran medida la polimerizacioacuten del γ-
PGA y la concentracioacuten tiende a disminuir con el paso del tiempo
Para poder aumentar el periacuteodo de fermentacioacuten se requeririacutea un
sistema de ajuste de pH que opere bajo condiciones del presioacuten mismo que no
se tuvo disponible Es probable que si se prolongara el tiempo de fermentacioacuten
dentro del biorreactor los rendimientos al cabo de 48 o 72 horas seriacutean un
poco mayores siempre y cuando se ajuste el pH en el valor de 65 como
recomiendan Cromwick y colaboradores (1995)
En nuestro caso el incremento del tiempo de fermentacioacuten sin
regulacioacuten del pH de 18 horas a 36 horas mostroacute un incremento miacutenimo en la
productividad (de 025 gL) pero si un cambio en la composicioacuten del γ-PGA
pues el pico de elucioacuten del poliacutemero se desplazoacute levemente hacia un valor de
tiempo mayor lo que podriacutea indicar una degradacioacuten parcial del poliacutemero
inicialmente producido Dichos datos se presentan en la figura 12
Nuestros resultados contradicen lo sentildealado por otros autores quienes
obtienen los mayores rendimientos entre las 48 y 96 horas Birrer y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 82
colaboradores (1995) observaron que Bacillus licheniformis ATCC9945a
alcanza la fase estacionaria a las 24 horas tiempo en el cual muy poco γ-PGA
ha sido formado y por consiguiente la mayor formacioacuten de γ-PGA acontece
entre las 24 y las 96 horas Estos resultados coinciden con los reportados por
Troy (1973) pero difieren a los observados por Goto y Kunioka (1992) con
Bacillus subtilis IFO3335 donde el mayor rendimiento se obtuvo desde las 24 y
hasta las 40 horas Estas diferencias podriacutean deberse a aspectos maacutes
relacionados con los voluacutemenes de fermentacioacuten empleados Por ejemplo para
el caso de Yoon y colaboradores (2000) estos alcanzaron rendimientos de 35
gL con un periacuteodo de fermentacioacuten maacuteximo de 35 horas indicando un
agotamiento del aacutecido ciacutetrico a las 20 horas en su caso el volumen empleado
fue de 1 litro de medio de cultivo
Figura 12 Cromatograma a las 18 (a) y 36 (b) horas de fermentacioacuten con Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 83
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento
Un punto vital para una adecuada fermentacioacuten es la concentracioacuten de
inoacuteculo aspecto que es sentildealado por Troy Cromwick y colaboradores a lo
largo de sus investigaciones pero que no detallan ni cuantifican
adecuadamente o al menos no lo reportan En nuestro caso se empleoacute un
inoacuteculo madre con una absorbancia de 25 o mayor y un inoacuteculo del reactor con
un valor de absorbancia de 120 aproximadamente con el propoacutesito de asiacute
logran estandarizar las condiciones de inoacuteculo Aunque este aspecto no fue
cuantificado a manera cualitativa si se observoacute un importante efecto de este
aspecto (concentracioacuten inicial) sobre la cantidad de γ-PGA obtenido y el tiempo
requerido Esto puede resultarnos obvio teniendo en cuenta una descripcioacuten no
estructurada del crecimiento microbiano pero podriacutea resultar maacutes compleja de
analizar si consideramos que la produccioacuten del γ-PGA estaacute afectada por
paraacutemetros de otra naturaleza maacutes allaacute de la disposicioacuten de nutrientes como
por ejemplo de una estructura celular particular o una relacioacuten de percepcioacuten
de quoacuterum dada Debemos recordar que la percepcioacuten de quoacuterum es un
mecanismo de regulacioacuten de la expresioacuten geneacutetica en respuesta a la densidad
de poblacioacuten celular Las ceacutelulas involucradas producen y excretan sustancias
llamadas autoinductores que sirven de sentildeal quiacutemica para inducir la expresioacuten
geneacutetica colectiva De Vizio (2011) sentildeala que en Bacillus licheniformis NCIMB
8874 la produccioacuten de lichenysin γ-PGA y algunas proteasas extracelulares
estaacute vinculado con los genes comQXPA mismo operoacuten que regula la
percepcioacuten de quoacuterum en Bacillus subtilis
De igual manera la relacioacuten de escalamiento aplicada fue de 16
ligeramente inferior a la que teoacutericamente se utiliza con mayor frecuencia de
110 Aunque este iacutendice no fue objeto de estudio su ajuste tambieacuten afecta de
manera directa los rendimientos obtenidos
La optimizacioacuten de la concentracioacuten del inoacuteculo la relacioacuten de
escalamiento y su frecuencia constituyen aspectos que deben estudiarse con
mayor profundidad para su propia optimizacioacuten pues su efecto sobre esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 84
fermentacioacuten y su rendimiento es bastante significativo Esta afirmacioacuten
adquiere validez cuando vemos que la produccioacuten del γ-PGA no es un
metabolito primario que se forme durante la fase de crecimiento exponencial
sino maacutes bien al inicio de la etapa estacionaria como indica Goto y Kunioka
(antildeo) o durante toda la etapa estacionaria tal y como lo sentildealan tanto Troy
(antildeo) como Birrer y colaboradores (1994) A esto debemos agregarle tambieacuten
lo anteriormente sentildealado referente a la concentracioacuten idoacutenea que produce la
percepcioacuten de quoacuterum responsable de direccionar el metabolismo de la
comunidad microbiana hacia la siacutentesis del γ-PGA
Conociendo la dependencia de esta biosiacutentesis de la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio y partiendo del hecho de que al inicio de la fase
estacionaria la concentracioacuten celular seraacute lo suficientemente alta para poner el
riesgo el mantenimiento de las condiciones aeroacutebicas en el biorreactor pero lo
justa para una adecuada siacutentesis del γ-PGA un inoacuteculo con una alta
concentracioacuten inicial de ceacutelulas podriacutea ayudar a obtener un mayor rendimiento
en un tiempo de fermentacioacuten menor o producir la respuesta de percepcioacuten de
quoacuterum (generalmente se trata de la liberacioacuten de un polipeacuteptido sentildeal) en un
tiempo menor con la consiguiente produccioacuten del γ-PGA
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa es un valor de
suma importancia para el escalamiento de bioprocesos en particular cuando
nos referimos a fermentaciones aeroacutebicas o cultivos de organismos o ceacutelulas
en condiciones de metabolismo aeroacutebico En nuestro caso un adecuado
coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno es garantiacutea que las
condiciones aeroacutebicas se sostendraacuten a lo largo del proceso de fermentacioacuten de
modo que no se produzcan desviacuteos metaboacutelicos indeseados o en el peor de
los casos el inicio del metabolismo anaerobio y la consecuente produccioacuten de
aacutecido aceacutetico
Los valores de kla obtenidos fueron de 0026 s-1 y 0025 s-1 para el
matraz y el bioreactor respectivamente Dichos valores por si mismos nos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 85
indican poco si no determinamos la tasa de consumo de oxiacutegeno requerida
para el cultivo aeroacutebico de Bacillus licheniformis Doran (1995) reporta una
velocidad de consumo de oxiacutegeno m02 para el cultivo aeroacutebico de Bacillus
licheniformis de 231 x 10-5 gO2 g-1cel s
-1 si la concentracioacuten de ceacutelulas X en el
reactor es de 20 gL (determinado experimentalmente como el valor final
alcanzado en matraces con alta concentracioacuten de γ-PGA) la tasa de consumo
de oxiacutegeno (OUR) MO2 seraacute igual a Xm02 es decir 46 x 10-4 mgO2mL-1s-1 A
partir de estos datos y conociendo que kla = MO2ΔcA ΔcA = cA ndash cA sabiendo
que presioacuten atmosfeacuterica cA = 801 mgL a 30 ordmC y el valor cA en el biorreactor
a 30 ordmC es 74 mgL obtenemos un valor de kla del orden de 0062 s-1 Dicho
valor corresponde al valor teoacuterico que seriacutea necesario para mantener el cultivo
con el suministro adecuado y suficiente de oxiacutegeno y que como puede verse
es 25 veces mayor al kla real lo que indica que cuando el cultivo alcance la
maacutexima concentracioacuten celular de 20 gL las condiciones del cultivo no seraacuten
suficientes para un metabolismo cien por ciento aeroacutebico
Tiene sentido entonces que los rendimientos alcanzados en matraz sean
significativamente mayores que los mejores rendimientos obtenidos en
bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica Dado que el cultivo en matraz incorporaba
uacutenicamente 100 mL de medio de cultivo el microorganismo es capaz de
alcanzar una mayor concentracioacuten en una menor unidad de tiempo lo que le
permite alcanzar una mayor concentracioacuten de poliacutemero durante las 26 horas de
cultivo (8 iniciales + 18)
Por su parte para el caso del biorreactor el crecimiento oacuteptimo
probablemente demore maacutes en alcanzarse por lo cual el tiempo que transcurre
entre el alcance de la concentracioacuten limitante de 8 gL (concentracioacuten a la cual
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y la tasa de consumo de oxiacutegeno
(OUR) se igualan) y la concentracioacuten oacuteptima es lo suficiente como para afectar
los rendimientos de γ-PGA Esto resulta evidente al comparar los resultados de
matraz con los de bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica (0 bar relativos) donde la
diferencia en productividad entre ambos es de 43 gL de γ-PGA Dicha
diferencia se explica porque mientras que la concentracioacuten del inoacuteculo madre
mostraba una absorbancia promedio de 25 la del inoacuteculo empleado para el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 86
biorreactor era de 120 (100 ml de medio + inoacuteculo madre creciendo durante 8
horas) es decir praacutecticamente la mitad por lo cual la concentracioacuten inicial de
ceacutelulas era significativamente menor para el biorreactor en comparacioacuten con el
matraz
77 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En condiciones estaacuteticas el contenido de γ-PGAdemostroacute reducir
considerablemente la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
pasando de 74 mgL a 440 mgL a una concentracioacuten del 20 en γ-PGA
Este fenoacutemeno puede deberse al incremento de la viscosidad por la
presencia del poliacutemero en el caldo de cultivo Dicha apreciacioacuten seguramente
afecta de manera negativa la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) pues
reduce tanto cA como cA sin embargo la determinacioacuten del valor de c
A de una
solucioacuten compuesta por sales γ-PGA y productos del metabolismo microbiano
es imposible de determinar teoacutericamente con certeza como para poder
cuantificar la magnitud de reduccioacuten de la OTR numeacutericamente De igual
manera el valor de kLa tambieacuten se ve afectado pues es sabido que a mayor
viscosidad mayor resistencia a la transferencia lo que reduce el valor de este
coeficiente
Asiacute mismo esta reduccioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
podriacutea deberse en parte a la naturaleza anioacutenica del poliacutemero y no solamente
al incremento de la viscosidad La solubilidad se ve afectada por la fuerza
ioacutenica por lo cual una solucioacuten con una concentracioacuten elevada de un poliacutemero
polianioacutenico como el γ-PGA probablemente muestre una importante reduccioacuten
en la solubilidad maacutexima (concentracioacuten de saturacioacuten) del oxiacutegeno en la
misma(Schumpe et al 1978)
Queda claro que dada esta reduccioacuten en la solubilidad de oxiacutegeno al
incrementar el contenido de γ-PGA durante la fermentacioacuten ya sea por la
naturaleza viscosa del biopoliacutemero o por su caraacutecter polianioacutenico la tasa de
transferencia de oxiacutegeno inicial y el valor de kLa se van reduciendo a lo largo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 87
del tiempo lo que dificulta auacuten maacutes garantizar las condiciones de oxigenacioacuten
oacuteptimas para este bioproceso Esto lo podemos explicar pues si tenemos que
OTR = kLa(cA-cA)
dado que al aumentar el contenido de γ-PGA ocurre una reduccioacuten en el valor
de kLa por accioacuten del incremento de la viscosidad (hecho que es
completamente cierto) y al aumentar la concentracioacuten de γ-PGA tambieacuten se
reduce tanto el valor de cA como el de cA (ya sea por efecto de la viscosidad o
de la naturaleza anioacutenico del poliacutemero) la OTR ve su magnitud evidente e
inevitablemente reducida dado que la misma es una relacioacuten de producto entre
ambos factores kLa y (cA ndashcA) Esto podriacutea explicar porque a voluacutemenes de
cultivo de 600 mL (en biorreactor) los rendimientos son mucho menores que en
voluacutemenes de cultivo de 100 ml (matraz) pues probablemente esta caiacuteda en la
OTR sea maacutes acentuada y criacutetica para los microorganismos cuando sucede a
voluacutemenes mayores donde mantener las condiciones de mezcla perfecta y una
alta concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto resultan maacutes dificultosas por lo que el
microorganismo es incapaz de crecer y alcanzar la concentracioacuten idoacutenea para
una maacutexima produccioacuten
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γshyPGA
La concentracioacuten de γ-PGA alcanzada al final de las 18 horas de
fermentacioacuten se vio afectada por la presioacuten Asiacute hasta los 103 bar a mayor
presioacuten mayor concentracioacuten de γ-PGA por encima de este valor de presioacuten la
concentracioacuten de γ-PGA disminuye
Esto puede explicarse por dos factores 1) el efecto de la presioacuten sobre
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y 2) impacto sobre la integridad y
viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γ-PGA
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR
La OTR se ve afectada tanto por el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de oxiacutegeno kLa asiacute como por la diferencia entre la concentracioacuten
de saturacioacuten y la concentracioacuten real en la fase liacutequida (cA-cA) El coeficiente kL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 88
es empiacuterico y su valor depende principalmente de factores tales como la
hidrodinaacutemica del sistema la turbulencia y su geometriacutea
Teoacutericamente kL se puede definir como kL = DABδ donde DAB es la
difusividad de A en B y δ es el espesor de la peliacutecula estancada seguacuten la
teoriacutea de peliacutecula para la transferencia de materia La difusividad en liacutequidos
depende en gran medida de la temperatura (afecta el coeficiente de difusioacuten) y
la concentracioacuten de solutos pero muy poco de la presioacuten (Diacuteaz 2011) En
nuestro caso podriacuteamos suponer que la presioacuten tiene poco efecto sobre kLa
pues tampoco es de esperar un cambio producto de la presioacuten en el aacuterea de
burbujas (a) producida por la agitacioacuten mecaacutenica auacuten maacutes cuando vemos el
hecho de que los ensayos llevados a cabo no contaron con un sistema de
aireacioacuten o burbujeo especiacutefico salvo aquel llevado a presioacuten atmosfeacuterica (0
bar relativa) y debidamente identificado como Aireacioacuten
Asiacute entonces tenemos en el segundo componente de la foacutermula la
diferencia (cA-cA) un punto de particular intereacutes pues efectivamente la
concentracioacuten de saturacioacuten y la concentracioacuten real variacutean con la presioacuten A
pesar de carecer de una sonda de oxiacutegeno disuelto directamente incorporada
al biorreactor y capaz de operar a presioacuten se determinoacute mediante transferencia
(con el sistema cerrado) la concentracioacuten real de oxiacutegeno en el medio de
cultivo a distintas presiones Tales concentraciones y las concentraciones de
saturacioacuten a cada presioacuten se presentan en el graacutefico 14
Para determinar el valor de las distintas concentraciones de saturacioacuten
al trabajar a presiones distintas a la atmosfeacuterica se realizoacute la siguiente
correccioacuten (Montoya amp Bermuacutedez 2003) para el valor de la solubilidad del
oxiacutegeno en agua
Ley de Henry
a 1 atm
Para una presioacuten P distinta a 1 atm tenemos que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 89
en mgL
Donde
C(S) = valor de solubilidad a 1 atm (mgL)
P = presioacuten de operacioacuten (atm)
T = temperatura de operacioacuten (K)
Graacutefico 14 Concentraciones de oxiacutegeno de saturacioacuten y en fas liacutequida a diferentes presiones
en medio de cultivo E sin crecimiento bacteriano
80
153
227
324
422
6681
141154
178
141
724857
1703
2438
y = 48525x + 68875
y = 14191x + 80039
y = 93382x + 11163
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
00
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 05 1 15 2 25 3
Concentracioacuten
Presioacuten (bar)
CONCENTRACIOacuteN DE SATURACIOacuteN CONCENTRACIOacuteN EN FASE LIacuteQUIDA DIFERENCIA
Aunque estos valores deben repetirse con una sonda de oxiacutegeno
disuelto interna (dentro del biorreactor) y bajo una metodologiacutea maacutes pertinente
preliminarmente puede observarse que la diferencia (cA-cA) aumenta al
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 90
aumentar la presioacuten y dado que OTR = kLa(cA-cA) al aumentar dicha
diferencia la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deberiacutea ser mayor Este
incremento de la OTR podriacutea explicar el porqueacute del raacutepido crecimiento
microbiano y la produccioacuten precoz de γ-PGA despueacutes de 18 horas de cultivo
en comparacioacuten con las entre 48 y 96 horas reportadas por otros autores asiacute
como el aumento del rendimiento al aumentar la presioacuten de los 0 bar relativos
(a presioacuten atmosfeacuterica) hasta los 103 bar relativos
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γshyPGA
Al superar los 103 bar relativos el rendimiento en γ-PGA decae
nuevamente Si consideramos un efecto positivo de la presioacuten sobre la OTR
como sentildealamos anteriormente esto no deberiacutea ocurrir Sin embargo al
someter las ceacutelulas a condiciones de presioacuten desconocemos el efecto que
dicha presioacuten puede ejercer sobre los microorganismos y sus rutas
metaboacutelicas asiacute como sobre la estructura de algunas biomoleacuteculas como por
ejemplo proteiacutenas
Meersman y Heremans (2008) sentildealan que el efecto de la presioacuten sobre
el crecimiento de los microorganismos puede explicarse por tres efectos
principales 1) Variaciones en el plegamiento y agregacioacuten de las proteiacutenas 2)
Variaciones en el estado de la membrana celular y 3) Variaciones en el
contenido de proteiacutenas asociadas a la membrana celular Estos aspectos son
de peculiar consideracioacuten pues la γ-PGA sintetasa es un complejo enzimaacutetico
formado por al menos tres unidades enzimaacuteticas distintas y que se encuentra
asociado a la membrana celular de Bacillus licheniformis
En lo referente a las proteiacutenas se sabe que su desnaturalizacioacuten se
produce por efecto de una reduccioacuten en su volumen producto de un cambio
configuracional probablemente de la estructura terciaria Asiacute tenemos que si el
volumen inicial de una proteiacutena viene dado por Vi = Vatomos + Vcavidades +
Vhidratacioacuten si en condiciones de presioacuten ocurre un cambio en el volumen de la
proteiacutena tal que ΔV = ΔVcavidades + ΔΔVhidratacioacuten(el volumen de los aacutetomos no
tiene por queacute variar con la presioacuten) la exposicioacuten de los grupos cargados o
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 91
hidrofoacutebicos de la proteiacutena al agua pueden conllevar a un cambio en la
estructura secundaria y terciaria de modo que la actividad de la proteiacutena se
vea perjudicada parcial o totalmente Esto se debe a que un aumento en la
presioacuten rompe las interacciones hidrofoacutebicas donde las interacciones proteiacutena-
proteiacutena son sustituidas por interacciones proteiacutena-agua particularmente
mediante puente de hidroacutegeno El incremento de la presioacuten podriacutea afectar la
conformacioacuten de alguno o algunos de los componentes del complejo
enzimaacutetico γ-PGA sintetasa lo que sin duda alguna se traduciriacutea en un menor
rendimiento en γ-PGA durante la fermentacioacuten Este posible efecto negativo de
la presioacuten sobre una de las enzimas involucradas en el proceso de biosiacutentesis
del γ-PGA se reafirma cuando vemos como variacutea la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA al aumentar la presioacuten aspecto que se discutiraacute con mayor detalle
maacutes adelante De hecho Ashiuchi y colaboradores (2004) sentildealan que el
complejo enzimaacutetico PgsBCA (γ-PGA sintetasa) es imposible de aislar en su
estado activo debido precisamente a su alta inestabilidad y elevada
hidrofobicidad
Por su parte la membrana celular al tratarse de una bicapa fosfolipiacutedica
es susceptible a sufrir cambios de fase producto de la temperatura o la presioacuten
como por ejemplo la transicioacuten gel-liacutequido El incremento de la presioacuten al igual
que sucede con la temperatura concede mayor fluidez a las bicapas lipiacutedicas
Asiacute en nuestro caso un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea permitir
una mayor difusioacuten de oxiacutegeno al interior celular lo que podriacutea afectar el
crecimiento bacteriano si por ejemplo se formase maacutes especies reactivas
toacutexicas de oxiacutegeno en el interior celular o si cierta maquinaria celular como la
misma γ-PGA sintetasa no fuese capaz de acoplarse adecuadamente en una
membrana con mayor fluidez
En lo referente a la interaccioacuten membrana celular-proteiacutenas es
importante destacar que entre el 20 y el 40 de las proteiacutenas de una ceacutelula
bacteriana suelen estar asociadas a esta estructura Como indicamos
anteriormente un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea afectar el
contenido concentracioacuten y capacidad de anclaje de las proteiacutenas a la
membrana celular El complejo enzimaacutetico γ-PGA sintetasa al tratarse de una
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 92
proteiacutena de membrana podriacutea no acoplarse de manera efectiva a la membrana
celular modificada bajo condiciones de presioacuten o ser liberada al medio de
cultivo lo que afectariacutea negativamente la produccioacuten de γ-PGA Estas
suposiciones podriacutean explicar el porqueacute de la gran cantidad de espuma
generada durante algunas fermentaciones a presioacuten (concretamente en
aquellas a una presioacuten superior a los 103 bar) a pesar de su menor
concentracioacuten de γ-PGA y teniendo presente que en las fermentaciones
microbianas la espuma suele estar constituida mayoritariamente por proteiacutenas
la presioacuten podriacutea estar favoreciendo la liberacioacuten de estas proteiacutenas al caldo de
cultivo y la consecuente formacioacuten abundante de espuma Este fenoacutemeno ya
ha sido reportado en otros microorganismos como Salmonella enterica donde
el tratamiento con presioacuten conllevaba a la peacuterdida de gran parte de sus
proteiacutenas de membrana y su consecuente liberacioacuten al medio de cultivo
(Meersman amp Heremans 2008) Esto se ve respaldado con las observaciones
de Ashiuchi y colaboradores (2004) quienes adicionaron detergentes como el
Tween20 y Triton X-114 (que modifican la estabilidad de la membrana celular y
favorece la liberacioacuten de las proteiacutenas asociadas a ella) a cultivos de Bacillus
spp productores de γ-PGA Ellos observaron una peacuterdida total de la capacidad
de siacutentesis del γ-PGA capacidad que no se recuperaba ni siquiera removiendo
la totalidad de dichos detergentes mediante diaacutelisis con lo cual concluyeron
que es indispensable que el complejo γ-PGA sintetasa se encuentre asociado a
la membrana celular para ser bioloacutegicamente activo
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γshyPGA
Un incremento de la intensidad de agitacioacuten afectariacutea positivamente el
valor de kLa incrementaacutendolo al aumentar el aacuterea de intercambio mediante una
mayor ruptura de las burbujas lo que aumenta el aacuterea de intercambio por
unidad de volumen Sin embargo existen liacutemites para la velocidad de agitacioacuten
esto debido al dantildeo ocasionado a los organismos debido a un esfuerzo
cortante excesivo A pesar de que la turbina Rushton es el impulsor de flujo
axial maacutes recomendado y maacutes eficiente para generar una mezcla perfecta de
alto perfil hidrodinaacutemico un bajo esfuerzo cortante y una alta distribucioacuten un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 93
exceso de agitacioacuten bajo condiciones de presioacuten es evidentemente perjudicial
Es probable que al aplicar presioacuten positiva sobre el cultivo la membrana celular
se encuentre en un estado de fluidez mayor al que presentariacutea a presioacuten
atmosfeacuterica asiacute mismo la presencia de glicerol en el medio de cultivo modifica
la composicioacuten lipiacutedica de la membrana favoreciendo la salida del γ-PGA al
exterior celular al aumentar de igual manera su fluidez Esto queda demostrado
por nuestros resultados a velocidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm
donde ocurre una reduccioacuten de la productividad conforme se aumenta la
agitacioacuten De igual manera la excesiva formacioacuten de espuma que se genera a
intensidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm podriacutea indicar la ruptura celular
y la liberacioacuten de componentes celulares y macromoleacuteculas al caldo de
fermentacioacuten Estas observaciones contradicen lo reportado por otros autores
(Yoon et al 2000) quienes indican velocidades de agitacioacuten oacuteptimas de hasta
1000 rpm a presioacuten atmosfeacuterica para un biorreactor de 24 L y un volumen
efectivo de cultivo de 1 L aunque no se brindan mayor detalle en lo referente al
tipo de turbina empleada
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
El cambio de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producto de la
presioacuten fue un resultado inesperado pues tradicionalmente se habiacutea sentildealado
a la concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo como el principal
responsable de controlar este aspecto Es importante destacar el hecho que
dicho cambio en la composicioacuten no es parcial o escalonado sino que por el
contrario el hecho de aplicar presioacuten durante la fermentacioacuten invierte
praacutecticamente los contenidos de aacutecido D-glutaacutemico y aacutecido L-glutamico de 87
y 13 respectivamente a presioacuten atmosfeacuterica (cultivo en matraz) a 17 y 83
respectivamente a una presioacuten relativa de 103 bar En algunos casos el
contenido de aacutecido D-glutaacutemico fue praacutecticamente 0
Efectivamente se sabe que el complejo γ-PGA sintetasa es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico aunque todaviacutea se
desconoce la arquitectura bioloacutegica de esta sintetasa Igualmente se sabe que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 94
es el componente PgsB el mayormente responsable de la cataacutelisis enzimaacutetica
(reaccioacuten de elongacioacuten del γ-PGA) (Ashiuchi 2010) Una hipoacutetesis que podriacutea
explicar estos resultados es que bajo presioacuten la estructura de esta proteiacutena se
modifique parcialmente (tanto la estructura de la proteiacutena propiamente dicha
como la estructura en funcioacuten de su anclaje a la membrana celular) lo
suficiente como para reducir su afinidad por el aacutecido D-glutaacutemico pero sin
afectar su afinidad por el aacutecido L-glutaacutemico ni conllevar a una
desnaturalizacioacuten de la proteiacutena y la consiguiente peacuterdida total de la actividad
enzimaacutetica Dado que es poco lo que se conoce de la estructura y mecanismo
de accioacuten de esta proteiacutena PgsB es imposible poder determinar con mayor
detalle el coacutemo pueden darse este cambio en la proteiacutena aunque casos
similares se observan durante la desnaturalizacioacuten de proteiacutenas por
temperatura donde las enzimas que operan sobre muacuteltiples sustratos no
pierden su capacidad enzimaacutetica de manera total sobre todos ellos sino que
inicialmente acontece una peacuterdida de afinidad diferenciada seguacuten el sustrato
hasta llegar al punto de desnaturalizacioacuten total donde se pierde toda actividad
enzimaacutetica para todos los sustratos
De igual manera es conocido que existe en Bacillus licheniformis una
enzima racemasa de naturaleza citosoacutelica responsable de transformar el aacutecido
L-glutaacutemico en aacutecido D-glutaacutemico podriacutea entonces tambieacuten asumirse alguacuten
efecto de la presioacuten sobre la actividad de la misma Sin embargo el hecho de
que esta enzima no esteacute asociada a una membrana celular (las proteiacutenas
asociadas a membrana celular tienden a ser maacutes vulnerables a los cambios de
presioacuten por la complejidad e indispensabilidad de su estructura terciaria sobre
su funcioacuten y su anclaje) sea una enzima de un uacutenico dominio y a que
experimentalmente el contenido de aacutecido D-glutaacutemico inclusive a la maacutexima
presioacuten (241 bar) no es cero hacen suponer que la misma se encuentra
bioloacutegicamente activa bajo las condiciones de presioacuten evaluadas
Estos resultados son de suma importancia pues para aplicaciones
biomeacutedicas y farmaceacuteuticas es necesario que el γ-PGA presente un alto
contenido en aacutecido L-glutaacutemico isoacutemero que es reconocido por el organismo
humano El efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre esta composicioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 95
enantiomeacuterica constituye un descubrimiento que pueda facilitar el empleo del γ-
PGA en medicina y que puede ser clave en el disentildeo de un proceso productivo
optimizado para tal fin
711 Peso molecular del γshyPGA En lo correspondiente al peso molecular del γ-PGA se observa que el
tamantildeo del poliacutemero es grande aunque no se observa ninguna tendencia en
los datos que pueda suponer alguacuten efecto de la presioacuten sobre el peso
molecular del poliacutemero Es importante sentildealar que la columna cromatograacutefica
empleada es incapaz de resolver moleacuteculas del alto peso molecular por lo
cual aunque si bien los resultados obtenidos resulten uacutetiles a nivel
comparativo dichos resultados deben tomarse con precaucioacuten Para un mejor
anaacutelisis seriacutea necesario emplear una columna capaz de resolver altos pesos
moleculares
Es importa sentildealar ademaacutes que tal y como se comentoacute anteriormente y
como se muestra en la figura 12 se observa una reduccioacuten del peso molecular
al prolongar el tiempo de fermentacioacuten hasta las 36 horas Para el caso del
reactor AHCJ32 al prolongar el tiempo de fermentacioacuten por 18 horas maacutes se
nota una reduccioacuten en la fraccioacuten de mayor peso molecular y un incremento en
la de menor sin que haya un cambio importante en el rendimiento global Esto
podriacutea deberse a que Bacillus licheniformis ATCC9945a posee enzimas
capaces de hidrolizar el γ-PGA y emplearlo como fuente de carbono Asiacute
mismo dicha observacioacuten sentildeala que si es necesario prolongar el tiempo de
fermentacioacuten es requerido realizar ajustes pues parece ser que la prolongacioacuten
por siacute misma uacutenicamente no es garantiacutea de una mejora en el rendimiento del
proceso fermentativo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 96
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 97
10 CONCLUSIONES
De la elaboracioacuten de la presente investigacioacuten se pueden extraer las
siguientes conclusiones principales
1) El rendimiento promedio en γ-PGA para el cultivo en matraz fue
superior a los 45 gL Dicho rendimiento es el mayor que se haya
reportado hasta la fecha para Bacillus licheniformis ATCC9945a lo
que convierte a esta cepa en una de las que mejor rendimiento
maacuteximo reporta para la biosiacutentesis de dicho poliacutemero natural
2) Un mecanismo eficiente para la conservacioacuten de cultivos de Bacillus
licheniformis ATCC9945a en un estado competente de produccioacuten
de γ-PGA es el congelamiento de ceacutelulas vegetativas a una
temperatura de -80 ordmC Es importante que la absorbancia de las
muestras congeladas sea superior a 25 lo que garantiza una alta
concentracioacuten de ceacutelulas
3) Dada la naturaleza del γ-PGA y su viscosidad el aumento de su
concentracioacuten en el caldo de cultivo a lo largo del tiempo de
fermentacioacuten afecta de manera negativa la tasa de transferencia de
oxiacutegeno disminuyeacutendola paulatinamente El cambio a condiciones
anaeroacutebicas conlleva a la detencioacuten de la biosiacutentesis del γ-PGA y el
consecuente inicio de un metabolismo netamente anaeroacutebico
4) Bacillus licheniformis ATCC9945a es capaz de crecer eficientemente
a presiones de hasta 242 bar relativos no vieacutendose afectado desde
el punto de vista de viabilidad por el incremento de la variable
presioacuten de fermentacioacuten
5) La presioacuten de fermentacioacuten afecta de manera significativa la
productividad de Bacillus licheniformis ATCC9945a en γ-PGA
6) El incremento de la presioacuten de fermentacioacuten hasta los 103 bar
relativos aumenta la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo de cultivo
seis veces (de 218 gL a 1334 gL) en comparacioacuten a los
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 98
rendimientos obtenidos a presioacuten atmosfeacuterica para un periacuteodo de
proceso de 18 horas
7) A presiones de fermentacioacuten superiores a los 103 bar la
productividad decae en comparacioacuten a la obtenida a dicha presioacuten
sin embargo la misma sigue siendo superior a la obtenida a presioacuten
atmosfeacuterica para un periacuteodo de proceso de 18 horas
8) El aumento de la presioacuten probablemente incremente la tasa de
transferencia de oxiacutegeno al incrementar la concentracioacuten de
saturacioacuten del mismo en el medio de cultivo lo que genera un
gradiente de concentracioacuten que permite una mayor transferencia
9) Presiones superiores a 103 bar probablemente afecten estructuras
celulares o biomoleacuteculas tales como las membranas celulares y las
proteiacutenas (γ-PGA sintasa) lo que tiene un efecto perjudicial sobre la
biosiacutentesis de γ-PGA
10) A una temperatura de 30 ordmC y a una presioacuten de 103 bar la
intensidad de agitacioacuten oacuteptima es de 300 rpm Una magnitud de
agitacioacuten mayor produce el dantildeo celular posiblemente por un exceso
de tensioacuten cortante
11) La presioacuten de fermentacioacuten modifica la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA A presioacuten atmosfeacuterica el γ-PGA estaacute compuesto
mayoritariamente por aacutecido D-glutaacutemico A presiones entre 052 y
242 bar dicha composicioacuten se revierte siendo el aacutecido L-glutaacutemico
el isoacutemero maacutes comuacutenmente presente en el γ-PGA
12) La biosiacutentesis de γ-PGA a presioacuten constituye una forma eficiente de
producir un biopoliacutemero mayoritariamente conformado por residuos
de aacutecido L-glutaacutemico aspecto de vital importancia para su aplicacioacuten
biomeacutedica dado que es este isoacutemero del aacutecido glutaacutemico es que es
reconocido y asimilado por el organismo humano
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 99
13) Aunque la modificacioacuten de la presioacuten de fermentacioacuten nunca ha sido
una variable importante en el estudio de los rendimientos para
distintos bioprocesos la presente investigacioacuten demuestra que la
modificacioacuten de dicha variable no soacutelo permite mejorar el
rendimiento global del proceso sino que tambieacuten puede conllevar a
la modificacioacuten del producto final lo que significariacutea una nueva rama
para la investigacioacuten en el disentildeo de bioprocesos de intereacutes
industrial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 100
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 101
11 AGRADECIMIENTOS
Un agradecimiento especial al profesor Jordi Bou por brindarme la
oportunidad de trabajar a su lado en este proyecto por el seguimiento y
asesoriacutea brindada a lo largo del mismo que nos permitioacute alcanzar nuestros
planteamientos y objetivos Espero que los aportes brindados con la presente
investigacioacuten permitan un mejor desarrollo en el futuro de estas temaacuteticas tan
novedosas biopoliacutemeros y fermentaciones bajo condiciones de presioacuten
positiva
Igualmente a la Ing Alejandra Hernaacutendez por la colaboracioacuten y asistencia
brindada durante esta investigacioacuten fue un apoyo importante durante el
desarrollo de las metodologiacuteas y distintas pruebas que se requirieron a lo largo
de esta investigacioacuten
A la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el Desarrollo
(AECID) y a Casa Ameacuterica Cataluntildea que me brindaron la oportunidad de cursar
este programa de maacutester a traveacutes de su programa de extensioacuten de becas a
ciudadanos extranjeros ha sido una oportunidad de crecimiento personal y
profesional que alcanza su punto maacuteximo con la elaboracioacuten de la presente
investigacioacuten El conocimiento adquirido sin duda alguna seraacute un valioso
compantildeero en mi desempentildeo profesional futuro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 102
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 103
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Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 12
comunes tanto en el argot popular como en el aacutembito del conocimiento
cientiacutefico donde diacutea con diacutea son maacutes las investigaciones orientadas a este tipo
de productos de naturaleza bioloacutegica y por consiguiente biodegradable
El aacutecido poliglutaacutemico por sus caracteriacutesticas constituye un poliacutemero
natural que ofrece una amplia gama de aplicaciones industriales donde puede
ser empleado tanto como agente espesante o floculador hasta aplicaciones
maacutes novedosas relacionadas con la medicina y la farmacia
En este contexto de buacutesqueda de soluciones amigables con el ambiente
es donde surge la principal motivacioacuten para investigar sobre el aacutecido
poliglutaacutemico en particular sobre coacutemo aumentar la productividad del proceso
fermentativo a partir del cual se realiza su siacutentesis de modo que las ventajas
teoacutericas que ofrece este producto pronto esteacuten disponibles tanto para el
consumidor como para la industria Tristemente los productos biotecnoloacutegicos
casi siempre tienen como principal inconveniente la valoracioacuten econoacutemica
pues tienden a ser difiacuteciles de producir por lo que tienen altos costos
asociados o sus rendimientos son menores a los deseados para hacerlos
econoacutemicamente rentables Por este motivo las investigaciones deben
procurar al menos orientarse a ofrecer soluciones que alguacuten diacutea puedan ser
llevadas a la praacutectica o como sucede con esta investigacioacuten procurar dar
respuesta a los problemas que se enfrentan cuando se trata de llevar un
producto biotecnoloacutegico a la realidad
La importancia de la investigacioacuten biotecnoloacutegica en el campo de los
materiales radica en que en un mundo con materias primas limitadas
particularmente las fuentes foacutesiles los materiales del futuro tendraacuten un origen
maacutes bioloacutegico que mineral o extractivo por lo que la mejora de los procesos
productivos relacionados con estos productos son prioritarios para cualquier
paiacutes que desee mantenerse competitivo en el aacutembito econoacutemico y tecnoloacutegico
mundial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 13
5 INTRODUCCIOacuteN
En la actualidad el desarrollo de biomateriales constituye uno de los
principales ejes de investigacioacuten en el mundo de la ciencia Dentro de estos
biomateriales los biopoliacutemeros han logrado un particularmente alto grado de
atencioacuten especialmente en los uacuteltimos 30 antildeos debidos a sus muacuteltiples
aplicaciones industriales biomeacutedicas y farmaceacuteuticas que estaacuten aportando una
amplia gama de opciones y soluciones a problemas ambientales y en la
formulacioacuten de nuevas preparaciones biomeacutedicas y farmaceacuteuticas
Los biopoliacutemeros son materiales polimeacutericos o macromoleculares que
son sintetizados por seres vivos Debido en gran parte al precio creciente la
viabilidad declinante de las fuentes foacutesiles como materias primas asiacute como el
ritmo crecimiento de la poblacioacuten mundial han propiciado el desarrollo de
fuentes alternativas renovables capaces de suministrar las necesidades
mundiales crecientes en material de energiacutea y produccioacuten quiacutemica Esta
necesidad de nuevas fuentes alternativas ha permitido que la mirada cientiacutefica
se halle puesta sobre la diversidad microbiana que habita el planeta pues los
microorganismos siempre han demostrado ser una fuente importante de
materiales novedosos con la ventaja que en la actualidad se dispone de la
tecnologiacutea necesaria para crecer los microorganismos de manera masiva y
segura Este nuevo modelo conocido como la estrategia de las biorefineriacuteas
ha cambiado la concepcioacuten de la industria quiacutemica moderna y ha sido
empleada exitosamente en la produccioacuten convencional a granel de diversos
productos quiacutemicos como por ejemplo etanol glutamato y aacutecido ciacutetrico
En el presente la produccioacuten de poliacutemeros o monoacutemeros tales como el
13-propanediol el aacutecido polilaacutectico y los polihidroxialcanoatos ha sido uno de
los principales objetivos de mayor investigacioacuten Dentro de estos nuevos
materiales encontramos los poliaminoaacutecidos poliamidas de naturaleza
polimeacuterica cuyos constituyentes estaacuten unidos por enlaces del tipo amida El
aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) es uno de estos poliaminoaacutecidos un poliacutemero
biodegradable constituido por unidades de D- y L-aacutecido glutaacutemico y que es
producido de manera natural en algunas bacterias
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 14
El presente trabajo procura investigar sobre algunas de las condiciones
involucradas en la produccioacuten bacteriana de γ-PGA y que constituyen las
principales barreras que impiden alcanzar los rendimientos necesarios para
que la produccioacuten bioloacutegica de este poliacutemero sea viable tanto desde el punto de
vista bioloacutegico como econoacutemico
31 Objetivos
El objetivo general a partir del cual se estructura el desarrollo de la
presente investigacioacuten es
Estudiar la produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a y el efecto que tiene sobre el rendimiento y estructura del
producto factores propios de la ingenieriacutea quiacutemica como lo son la
presioacuten y la intensidad de agitacioacuten
Los objetivos especiacuteficos que se plantearon alcanzar en el siguiente
proyecto son los siguientes
Disentildear un biorreactor que permita realizar fermentaciones a presioacuten
positiva de hasta 4 bar absolutos
Describir las condiciones baacutesicas requeridas para lograr reproducibilidad
en la produccioacuten deaacutecido γ-poliglutaacutemico por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre el rendimiento de
produccioacuten de aacutecido γ-poliglutaacutemico en gL por Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Determinar el efecto de la presioacuten positiva sobre la composicioacuten
enantiomeacuterica y el peso molecular del aacutecido γ-poliglutaacutemico
Establecer el posible efecto de la presioacuten positiva sobre la tasa de
transferencia de oxiacutegeno en el biorreactor
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 15
6 MARCO TEOacuteRICO
41 Los poliaminoaacutecidos
Los poliaminoaacutecidos son poliamidas formadas por un uacutenico aminoaacutecido
y difieren de las proteiacutenas en muacuteltiples aspectos Las proteiacutenas son
biomoleacuteculas compuestas por una amplia gama de aminoaacutecidos mientras que
los poliaminoaacutecidos estaacuten compuestos uacutenicamente por un solo tipo de
aminoaacutecido al menos en su eje central La siacutentesis de proteiacutenas estaacute dirigida
por el ADN que controla la secuencia especiacutefica de aminoaacutecidos que termina
formando una moleacutecula de una proteiacutena en particular Por su parte los
poliaminoaacutecidos son sintetizados por una ruta metaboacutelica de los organismos
completamente distinta En enlace amida en las proteiacutenas acontece
uacutenicamente entre los grupos α-amino y α-carboxilo mientras que en los
poliaminoaacutecidos pueden verse involucradas otras cadenas laterales
funcionales como por ejemplo los grupos β- y γ-carboxiloy ε-amino(Bajaj amp
Singhal 2011)
Existen mayoritariamente tres poliaminoaacutecidos presentes en la
naturaleza el aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina En
el aacutecido γ-poliglutaacutemico los enlaces amida se forman entre el grupo α-amino y
el γ-carboxilo en el eje central La poli ε-lisina presenta monoacutemeros de lisina
unidos por los grupos α-carboxilo y ε-amino La cianoficina consiste en residuos
de aacutecido α-aspaacutertico que contienen residuos de arginina que penden unidos al
grupo β-carboxilo Las foacutermulas de dichos compuestos se presentan en la
figura 1
42 El aacutecido γshypoliglutaacutemico (γshyPGA)
El aacutecido γ-poliglutaacutemico (de ahora en adelante referido como γ-PGA) es
un poliacutemero inusual que acontece de forma natural anioacutenico soluble en agua
biodegradable comestible y que no resulta toacutexico ni para el ser humano ni para
el ambiente que en la naturaleza es producido por algunas bacterias todas
Gram-positivas una archea e inclusive en eucariotas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 16
Fue primeramente descubierto por Ivaacutenovics y colaboradores como
componente de la caacutepsula de la bacteria Bacillus anthracis despueacutes que se
liberara al medio producto tanto del proceso de autoclavado como por el
envejecimiento y lisis natural de los cultivos La comida tradicional japonesa
ldquoNattordquo estaacute constituida por una mezcla de γ-PGA y fructanos que son
producidos por la bacteria Bacillus natto (Bajaj amp Singhal 2011)
Figura 1 Foacutermula y estructura del aacutecido γ-poliglutaacutemico (γ-PGA) la poli ε-lisina y la cianoficina
(Fuente Feng et al 2007)
421 Propiedades quiacutemicas y bioquiacutemicas del γshyPGA
El γ-PGA es un poliacutemero polianioacutenico que puede estar compuesto
uacutenicamente por D- L- o por ambos enantioacutemeros del aacutecido glutaacutemico Como se
ha comentado ya es altamente soluble en agua El γ-PGA probablemente
pueda adoptar diferentes estructuras La estructura del γ-PGA ha sido predicha
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 17
asumiendo poliaminoaacutecidos constituidos por 10 o 25 moleacuteculas de aacutecido
glutaacutemico Este modelo teoacuterico calculado para una moleacutecula en solucioacuten
acuosa muestra que el γ-PGA consiste de una heacutelice levoacutegira estabilizada por
enlaces de hidroacutegeno intramoleculares Sin embargo otro estudio realizado a
partir de γ-PGA obtenido de Bacillus licheniformis mostroacute que la conformacioacuten
es realmente flexible y depende de la concentracioacuten de γ-PGA y el pH de la
disolucioacuten A bajas concentraciones (01 wv) y a un pH inferior a 7 el γ-PGA
adopta una conformacioacuten basada mayoritariamente en heacutelices del tipo α
mientras que la conformacioacuten tipo hojas β predomina a pH superiores pues
esta conformacioacuten permite una mejor exposicioacuten de las cargas negativas del γ-
PGA (Candelaamp Fouet 2006) Recientemente mediamente experimentos de
dicroiacutesmo circular se ha reportado una estructura desordenada (Joyce et al
2006 Candela amp Fouet 2006) pero sin detallar las condiciones de trabajo de
los experimentos en particular de pH
El peso molecular del γ-PGA parece variar seguacuten sea el organismo que
produce la moleacutecula sin embargo estas diferencias podriacutean deberse a
diferencias en torno a la degradacioacuten natural que acontece con el poliacutemero o a
los meacutetodos de purificacioacuten y anaacutelisis utilizados mismos que puedan afectar el
tamantildeo del γ-PGA Por ejemplo para el caso de Bacillus subtilis el peso
molecular del γ-PGA variacutea entre 160kDa hasta 1500 kDa las cadenas de γ-
PGA consisten entonces de coacutemo miacutenimo 1000 residuos de aacutecido glutaacutemico
Diferentes estudios enfocados en la siacutentesis microbioloacutegica de γ-PGA han
demostrado que el peso molecular de este poliacutemero es dependiente tanto de
las diversas cepas bacterianas que se empleen asiacute como de los componentes
del medio y las condiciones del medio de cultivo e inclusive de razones auacuten no
dilucidadas De alliacute que exista una gran dificultad para obtener un γ-PGA
altamente homogeacuteneo a partir de cultivos bacterianos esto en gran parte
debido a esta inestabilidad descrita asiacute como a la complejidad molecular
involucrada en su biosiacutentesis
Asiacute mismo el γ-PGA puede contener soacutelo aacutecido D-glutaacutemico soacutelo aacutecido
L-glutaacutemico o una mezcla de ambos enantioacutemeros De alliacute que los filamentos
puedan ser de aacutecido γ-poli-L-glutaacutemico (γ-PLGA) de aacutecido γ-poli-D-glutaacutemico
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 18
(γ-PDGA) o de aacutecido γ-poli-L-D-glutaacutemico (γ-PLDGA) La disposicioacuten de los
residuos en el PLGDA requiere un especial anaacutelisis ya que si bien tanto el
PLGA y el PDGA son ambos solubles en etanol cuando ambos se mezclan en
proporcioacuten equimolar precipitan en etanol Esta observacioacuten es utilizada para
demostrar que el γ-PGA producido por Bacillus licheniformis estaacute compuesto
por cadenas tanto de PLGA como de PDGA Asiacute mismo la digestioacuten con L-
glutamilhidrolasa ha demostrado que el γ-PGA de Bacillus subtilis consiste en
una mezcla de isoacutemeros PLGA y PLDGA
422 Siacutentesis microbioloacutegica de γshyPGA
Distribucioacuten en los microorganismos
Inicialmente el γ-PGA fue detectado como un componente de la pared
capsular de la altamente patogeacutenica bacteria Gram-positiva Bacillus anthracis
Posteriormente este poliacutemero seriacutea nuevamente encontrado presente alrededor
de ceacutelulas de otras bacterias Gram-positivas no patogeacutenicas particularmente
del geacutenero Bacillus Gracias a estos descubrimientos fue posible aislar a inicios
del siglo pasado una cepa de Bacillus capaz de producir grandes cantidades de
γ-PGA
Posteriormente y de manera adicional a estas bacterias formadoras de
endosporas del geacutenero Bacillus el γ-PGA fue encontrado en las eubacterias
haloacutefilas Sporosarcina halophila y Planococcus halophilus y en la
archeobacteria haloacutefila Natrialba aegyptiaca Asiacute mismo γ-PGA fue tambieacuten
detectado en cantidades significativas en nematocistos de Cnidaria (eucariota)
En la tabla 1 se presentan los principales organismos productores de γ-
PGA y algunas de las caracteriacutesticas del γ-PGA producido
Ruta de biosiacutentesis
La conversioacuten de glucosa a γ-PGA sugiere que la siacutentesis del poliacutemero
acontece durante la glicoacutelisis y el ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos (ciclo de
Krebs o del aacutecido ciacutetrico) hasta el 2-oxoglurato (α-cetoglutarato) que es un
precursor directo del aacutecido L-glutaacutemico Durante su crecimiento en un medio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 19
Tabla 1 Organismos que han sido reportados como productores de γ-PGA
ORGANISMO CONFORMACIOacuteN CONFORMACIOacuteN DEL FILAMENTO
Bacillus anthracis D D
Bacillus mesentericus D D
Bacillus licheniformis D y L D y L
Bacillus megaterium D y L D + L
Bacillus pumilus D y L ND
Bacillus subtilis D y L L y D+L
Planococcus halophilus D D
Sporosarcina halophila D D
Staphylococcus
epidermidis
D y L ND
Natrialba aegyptiaca L L
Hydra ND ND
Fuente (Candela amp Fouet 2006)
nutritivo Bacillus licheniformis expresa dos enzimas capaces de sintetizar el
aacutecido L-glutaacutemico la glutamato sintasa y la glutamato deshidrogenasa Ambas
enzimas son praacutecticamente insensibles a la inhibicioacuten por producto lo que
permite alcanzar altas concentraciones intracelulares de aacutecido L-glutaacutemico el
cual es entonces direccionado a la siacutentesis de γ-PGA Los estudios maacutes
detallados relacionados con la polimerizacioacuten del γ-PGA se han realizado con
Bacillus anthracis Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis especialmente
Bacillus licheniformis ATCC9945a lo que ha permitido la identificacioacuten de un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 20
sistema enzimaacutetico anclado a la membrada y denominado como PGA-
sintetasa Este sistema enzimaacutetico estaacute constituido por al menos tres
componentes con actividad enzimaacutetica y se presume que cataliza la siguiente
secuencia de reacciones (Troy 1973) (figura 2)
Aacutecido L-glutaacutemico + ATP ɣ-L-glutamil-AMP + PPi (a)
ɣ-L-glutamil-AMP + SH-enzima ɣ-X-glutamil-S-enzima + AMP (b)
ɣ-X-glutamil-S-enzimaɣ-D-glutamil-S-enzima (c)
ɣ-D-glutamil-S-enzima + [ɣ-D-glutamil]n[ɣ-D-glutamil]n+1 + SH-enzima (d)
Figura 2 Posible mecanismo enzimaacutetico de siacutentesis del γ-PGA (Fuente Ashiuchi 2010)
De acuerdo con este modelo solamente el aacutecido L-glutaacutemico es activado
en el paso (a) mediante fosforilacioacuten lo que significa que la biosiacutentesis del γ-
PGA requiere el suministro de energiacutea para la formacioacuten del enlace amida Maacutes
recientemente un segundo mecanismo ha sido descrito por Ashiuchi (2001) e
involucra un complejo enzimaacutetico denominado PgsBCA el cual es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico y donde la
polimerizacioacuten ocurre por un mecanismo de ligacioacuten tipo amida (figura 3)
Inicialmente se habiacutea descrito que el complejo enzimaacutetico era el responsable
de racemizar y polimerizar el aacutecido glutaacutemico sin embargo estas nuevas
evidencias parecen demostrar que el complejo enzimaacutetico involucrado en la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 21
siacutentesis de γ-PGA carece de actividad racemasa y que la formacioacuten del aacutecido
D-glutaacutemico es responsabilidad de una enzima citosoacutelica denominada aacutecido
glutaacutemico racemasa Glr que presenta una alta selectividad por el aacutecido
glutaacutemico y una mayor preferencia por el aacutecido L-glutaacutemico Un modelo de la
viacutea metaboacutelica mayoritariamente aceptada para la siacutentesis de γ-PGA se
presente en la figura 4
Figura 3 Mecanismo propuesto de biosiacutentesis del γ-PGA mediante ligacioacuten tipo amida
(Fuente Ashiuchi 2001)
Figura 4 Viacutea metaboacutelica de biosiacutentesis del γ-PGA (Fuente Buescher amp Margaritis 2007)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 22
Organizacioacuten geneacutetica
Solamente unas pocas bacterias la mayoriacutea dentro del geacutenero Bacillus
han sido reportadas como capaces de producir γ-PGA Asiacute mismo la
produccioacuten de γ-PGA no es uniforme en estos individuos inesperadamente
variacutea inclusive bajo condiciones de cultivo altamente estrictas De alliacute que la
identificacioacuten del sistema regulatorio y los genes involucrados en dicho sistema
es vital para dar solucioacuten a estos problemas de uniformidad y rendimiento El
complejo PGA-sintetasa estaacute codificado por cuatro loci que son denominados
pgs Los cuatro genes pgs son pgsB pgsC pgsAA y pgsE y se les denomina
en conjunto pgsBCA Todos estos genes son necesarios y suficientes para la
produccioacuten de γ-PGA in vivo La figura 5 muestra los elementos geneacuteticos
requeridos para la produccioacuten de γ-PGA en diferentes especies del genero
Bacillus
Figura 5 Elementos geneacuteticos necesarios para la siacutentesis de γ-PGA (Fuente Candela amp
Fouet 2006)
423 Produccioacuten fermentativa de γshyPGA
Diferentes cepas de bacterias del geacutenero Bacillus son capaces de
producir elγ-PGA ya sea como material viscoso extracelular o como
componente capsular En termino industrial estas cepas han sido las maacutes
utilizadas y por ende las maacutes estudiadas hasta el momento La mayor parte de
los estudios han estado orientados a determinar los requerimientos
nutricionales para el adecuado crecimiento celular asiacute como mejorar la
productividad de γ-PGA y la variacioacuten en la composicioacuten de su estructura en lo
referente al contenido de aacutecido L- y D-glutaacutemico Estos estudios como los
realizados por Troy (1973) Cromwicket al (1995) y Kunioka (1997) han
permitido determinar que los requerimientos nutricionales para la produccioacuten de
γ-PGA variacutean seguacuten sea la cepa que se emplea
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 23
De acuerdo a estos requerimientos nutricionales las cepas productoras
de γ-PGA se han dividido en dos grupos uno que requiere la adicioacuten de aacutecido
L-glutaacutemico al medio de cultivo para estimular la produccioacuten de γ-PGA y el
crecimiento celular y otro que no requiere de aacutecido L-glutaacutemico para la
produccioacuten de γ-PGA
Dentro de las bacterias dependientes de aacutecido L-glutaacutemico las cepas
maacutes promisorias han sido B anthracis B licheniformis ATCC9945a B subtilis
IFO3335 y B subtilis F-2-01 Por su parte dentro de las bacterias
independientes de aacutecido L-glutaacutemico encontramos mayoritariamente los caso s
de B subtilis 5E B subtilis TAM-4 y B licheniformis A35 B subtilis 5E puede
producir γ-PGA a partir de L-prolina como uacutenica fuente de carbono
complementado con una fuente de nitroacutegeno en un medio mineral B
licheniformis A35 produce γ-PGA a partir de glucosa y cloruro de amonio en
condiciones desnitrificantes y B subtilis TAM-4 produce grandes cantidades de
γ-PGA cuando crece en un medio de cultivo con una sal de amonio y azuacutecar
como fuentes de nitroacutegeno y carbono respectivamente Asiacute mismo ademaacutes de
la fuente de carbono y nitroacutegeno existen otra serie de factores tales como
fuerza ioacutenica del medio de cultivo pH del medio de cultivo aireacioacuten entre
otros que afectan en gran medida la productividad y calidad del γ-PGA
De primera impresioacuten pareciera conveniente el empleo de las cepas
independientes de aacutecido L-glutaacutemico para la produccioacuten industrial de γ-PGA
sin embargo la informacioacuten disponible en lo referente a la ruta biosinteacutetica el
mecanismo de formacioacuten del γ-PGA y los factores que afectan la productividad
es praacutecticamente nula para estas cepas A partir de los trabajos de
investigacioacuten y los estudios de aplicaciones industriales la produccioacuten de γ-
PGA se ha llevado a cabo mayoritariamente a partir de cepas dependientes de
aacutecido L-glutaacutemico
En la tabla 2 se presentan algunas de las principales cepas bacterianas
empleadas para la produccioacuten de γ-PGA los nutrientes las condiciones de
cultivo el rendimiento obtenido asiacute como los voluacutemenes de cultivo en que se
basan dichos reportes
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 24
Tabla 2 Principales bacterias productoras de γ-PGA (Shih amp Van 2001)
CEPA
NUTRIENTES
CONDICIONES DE CULTIVO
RENDIMIENTO
VOLUMEN DE
TRABAJO B licheniformis ATCC9945a
Aacutecido glutaacutemico (20 gL) aacutecido ciacutetrico (12 gL) NH4Cl (7 gL)
30ordmC 4 diacuteas 17-23 gL 100 mL
B subtilis IFO 3335
Aacutecido glutaacutemico (30 gL) aacutecido ciacutetrico (20 gL)
37ordmC 2 diacuteas 10-20 gL 125 mL
B subtilis TAM-4
Fructosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 4 diacuteas 20 gL 100 mL
B licheniformis A35
Glucosa (75 gL) NH4Cl (18 gL)
30ordmC 3-5 diacuteas 8-12 gL 100 mL
B subtilis F02-1
Aacutecido glutaacutemico(70 gL) glucosa (1 gL)
30ordmC 2-3 diacuteas 50 gL 200 mL
B subtilis (natto)
Maltosa (60 gL) salsa de soya (70 gL) glutamato soacutedico (30 gL)
40 ordmC 3-4 diacuteas 35 gL 125 mL
Fuente Shih amp Van 2001
424 Produccioacuten de γshyPGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a
Generalidades de la bacteria Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis es una bacteria comuacutenmente encontrada en el
suelo y en las plumas de las aves Es gram-positiva de forma oval y mesoacutefila
Su temperatura oacuteptima de crecimiento se encuentra alrededor de los 30 ordmC
aunque es capaz de sobrevivir a temperaturas mucho mayores La temperatura
oacuteptima para la secrecioacuten de enzimas es de 37 ordmC Esta bacteria puede existir
como espora cuando las condiciones son inadecuadas o en estado vegetativo
cuando las condiciones le son maacutes favorables (Wecke et al 2006)
Bacillus licheniformis forma parte del grupo Subtilis junto con Bacillus
subtilis y Bacillus pumilus Estas bacterias son conocidas por ser
contaminantes comunes de alimentos asiacute como favorecer su descomposicioacuten
aunque no se consideran patoacutegenos de importancia para el ser humano
(Wecke et al 2006)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 25
La cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis y la siacutentesis de γ-PGA
La produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a fue
primeramente estudiada por Bovarnick en 1942 sin embargo no fue sino a
partir de 1954 cuando Thorne y colaboradores iniciaron una serie de estudios
sistemaacuteticos orientados a investigar los factores que afectan la produccioacuten de
γ-PGA lo que permitioacute determinar algunos factores y condiciones necesarios
para lograr mayores rendimientos Factores tales como presencia de ciertas
sales inorgaacutenicas aacutecido glutaacutemico aacutecido ciacutetrico glicerol y el tamantildeo del inoacuteculo
demostraron tener efectos importantes sobre el rendimiento de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a tanto en condiciones estaacuteticas como cultivos
bajo agitacioacuten Se encontroacute que los mejores rendimientos se produciacutean cuando
el microorganismo era cultivado en agitacioacuten orbital en un medio de cultivo
denominado como medio C (tabla 3) alcanzando una productividad de hasta
15 gL en un periacuteodo de 3-4 diacuteas Asiacute mismo la mayor produccioacuten de poliacutemero
soacutelo se alcanzaba cuando se empleaba agua de grifo y un lote especiacutefico de
FeCl3 Posteriormente se determinariacutea que dicho lote de FeCl3 estaba
contaminado con trazas de Mn2+ y que el agua de grifo conteniacutea cantidades
significativas de Ca2+ Posteriormente Leonard y colaboradores (1958) se
encargariacutean de comprobar la funcioacuten y concentracioacuten oacuteptima de ambos
elementos quiacutemicos mediante la elaboracioacuten de un medio de cultivo
quiacutemicamente definido tomando como base el medio C de Thorne
Tabla 3 Composicioacuten del medio de cultivo C (Thorne et al 1954)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua de grifo
Fuente Shih amp Van 2001
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 26
Leonard y colaboradores encontraron que aunque solamente se requeriacutea
de 15 x 10-7 moles por litro de Mn2+ para alcanzar el maacuteximo crecimiento
concentraciones mayores de Mn2+ mostraban un marcado efecto prolongando
la viabilidad celular y por consiguiente incrementando la productividad de γ-
PGA Un incremento de hasta 615 x 10-4 molL en la concentracioacuten de Mn2+
permitiacutea alcanzar los mayores rendimientos de γ-PGA De igual manera la
adicioacuten de 102 x 10-3 moles por litro de Ca2+ en presencia de 15 x 10-7 moles
por litro de Mn2+ permitiacutea alcanzar auacuten mayores rendimientos deγ-PGA en
comparacioacuten a los valores oacuteptimos de produccioacuten de poliacutemero obtenidos en
ausencia de este elemento El γ-PGA producido consistiacutea en un homopoliacutemero
de unidades repetidas de aacutecido D- y L-glutaacutemico con una concentracioacuten de
aacutecido D-glutaacutemico que variaba entre el 38 y el 86 seguacuten incrementaba la
concentracioacuten de Mn2+ entre 154 x 10-7 y 246 x 10-3 molL siendo esta
observacioacuten independiente de la concentracioacuten presente en el medio de cultivo
de Ca2+
Tabla 4 Composicioacuten del medio E revisado (Leonard et al 1958)
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO4 05 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 0000026 a
042 CaCl22H2O 015 Glicerol 80 pH 74 Volumen 1 L empleando agua destilada
Fuente Shih amp Van 2001
A partir de estos resultados Leonard y colaboradores elaboraron el
medio de cultivo denominado Medio E (tabla 4) que es baacutesicamente el medio
original C exceptuando el hecho de que cantidades definidas de Mn2+ y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 27
Ca2+fueron agregadas El Ca2+ fue adicionado con el propoacutesito de asegurar
altas productividades de poliacutemero a cualquier concentracioacuten de Mn2+ que se
empleara mientras que la variacioacuten de la concentracioacuten de este uacuteltimo
elemento permitiriacutea alcanzar el contenido enantiomeacuterico deseado en el
poliacutemero tal y como se comentoacute anteriormente
La estereoquiacutemica del poliacutemero es decir el contenido enantiomeacuterico del
γ-PGA ha sido desde el inicio de las investigaciones uno de los problemas maacutes
complejos y de difiacutecil solucioacuten y de una importancia tanto fundamental como
praacutectica en lo que se refiere al estudio de la produccioacuten de γ-PGA en bacterias
A lo largo de todos estos antildeos han existido numerosas contradicciones entre
los investigadores en cuanto a si el contenido enantiomeacuterico del γ-PGA
producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a estaacute o no afectado por la
concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo Cromwick y Gross (1995)
realizaron un estudio profundo sobre los factores que influenciaban la
produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a Dicho estudio
encontroacute que el porcentaje de aacutecido L-glutaacutemico presente en el γ-PGA variaba
entre 59 y 10 cuando las concentraciones de Mn2+ variaban entre 0 y 615
μmolL asiacute mismo el rendimiento incrementaba desde los 5 hasta los 17 gL en
dicho intervalo de concentracioacuten de Mn2+
Cromwick y Gross (1995) encontraron en este mismo estudio que la
incorporacioacuten de Mn2+ al medio de cultivo es un factor criacutetico para la
conservacioacuten de la viabilidad celular durante periodos de cultivo prolongados
El nuacutemero de ceacutelulas viables se incrementaba del orden de 105 a 109 unidades
formadoras de colonias (ufc) para todas las concentraciones de Mn2+ hasta el
inicio de la fase estacionaria aproximadamente a las 24 horas Sin embargo
despueacutes de 50 horas de cultivo la viabilidad celular se veiacutea reducida
draacutesticamente para aquellas concentraciones de Mn2+ relativamente menores
(0 a 0615 μmolL) mientras que para las concentraciones mayores (338 a 615
μmolL) el nuacutemero de ceacutelulas viables se manteniacutea en el orden de 107-109
inclusive despueacutes de 140 horas de cultivo Asiacute mismo la presencia de Mn2+ en
concentraciones entre 338 y 615 μ incrementaba la utilizacioacuten de las fuentes
de carbono en gran medida cultivos que conteniacutean 615 μmolL de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 28
Mn2+utilizaban el 37 54 y 93 del aacutecido glutaacutemico el glicerol y el aacutecido
ciacutetrico respectivamente en comparacioacuten a aquellos cultivos que no
incorporaban el Mn2+ los cuales solo utilizaban el 19 10 y 17 del aacutecido
glutaacutemico el glicerol y el aacutecido ciacutetrico respectivamente
Uno de los problemas maacutes prolongados en torno a los estudios referidos
a la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC994a es el hecho de
que el microorganismo termina degenerando en una cepa incapaz de producir
γ-PGA despueacutes de cultivo repetitivo Esta inestabilidad exhibida por este
microorganismo es responsable de una gran variacioacuten de cultivo en cultivo en
lo referente a la cantidad y la cineacutetica de formacioacuten del γ-PGA Birrer y
colaboradores (1994) encontraron que el empleo de ceacutelulas vegetativas
criogeacutenicamente congeladas permitiacutea alcanzar un crecimiento y produccioacuten de
poliacutemero consistente de cultivo en cultivo Asiacute mismo y en congruencia con
otros estudios previamente realizados se encontroacute que el crecimiento celular
ocurriacutea baacutesicamente durante las primeras 24 h la mayor productividad
volumeacutetrica de γ-PGA era de 012 gmiddotL-1middoth-1 y se alcanzaba entre los diacuteas 2 y 4
el pH caiacutea de 74 a aproximadamente 5 despueacutes de 42 horas de cultivo e
incrementaba levemente a cerca de 6 despueacutes de 96 horas de cultivo el
empleo de glicerol glutamato y citrato se reduciacutea de 80 a 45 gL 18 a 10 gL y
de 12 a 1 gL respectivamente la produccioacuten de aacutecido aceacutetico hasta un nivel
maacuteximo de 45 gL asiacute como la presencia de 23-butanediol como producto
secundario entre las 42 y las 96 h El estudio del consumo de las fuentes de
carbono resulta un poco sorprendente pues demuestra unas tasas de
consumo del aacutecido ciacutetrico y de glicerol relativamente altas sin embargo para el
caso del aacutecido glutaacutemico dicha tasa de consumo fue por mucho menor y muy
lejana del agotamiento completo de dicha fuente Asiacute mismo la remocioacuten del
aacutecido L-glutaacutemico del medio de cultivo E afectaba en poca medida el
rendimiento en γ-PGA mientras que la remocioacuten de las otras fuentes (glicerol y
aacutecido ciacutetrico) disminuye de manera draacutestica la produccioacuten de γ-PGA Estos
resultados son contradictorios a los encontrados inicialmente por Thorne y
colaboradores (1954) e indica que Bacillus licheniformis ATCC9945 no requiere
de aacutecido L-glutaacutemico para alcanzar altas productividades de γ-PGA Asiacute mismo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 29
la presencia de 23-butanediol es indicador que los niveles de oxiacutegeno en el
medio de cultivo despueacutes de 42 horas son incapaces de sostener un
metabolismo 100 aeroacutebico esto no es de sorprender pues el γ-PGA es un
poliacutemero extracelular extremadamente viscoso y tasas cada vez menores de
transporte de oxiacutegeno son esperables conforme va aumentado la viscosidad en
el medio a medida que la concentracioacuten de γ-PGA se incrementa
Un trabajo de Cromwick y Gross (1996) estudioacute el efecto del pH y la
aireacioacuten sobre la productividad en γ-PGA de Bacillus licheniformis
ATCC9945a en condiciones de fermentacioacuten por lotes El pH fue controlado en
los valores de 55 65 74 y 825 y se determinoacute su efecto sobre el crecimiento
celular la utilizacioacuten de las fuentes de carbono la productividad en γ-PGA el
peso molecular y la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA El mayor
rendimiento en γ-PGA se obtuvo a un pH de 65 (15 gL 96 horas de cultivo) y
decrecioacute significativamente en 55 y 74 Esto coincide con el hecho que el
consumo de glicerol y de aacutecido L-glutaacutemico se mantuvo invariable en funcioacuten
del pH sin embargo la mayor tasa de consumo de aacutecido ciacutetrico se observoacute a un
pH de 65 en contraste con 55 y 74 lo cual parece indicar que el metabolismo
del aacutecido ciacutetrico juega un papel importante a dicho valor de pH Previamente
Cromwick y Gross (1995) encontraron que el aacutecido ciacutetrico es efectivamente un
precursor en la produccioacuten del poliacutemero presumiblemente a traveacutes del ciclo de
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De igual manera la alteracioacuten del pH no mostroacute
ninguacuten efecto importante en cuanto al peso molecular y la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA El efecto de la aireacioacuten fue evaluado incrementando
la velocidad de agitacioacuten entre 250 y 800 rpm y la tasa de aireacioacuten entre los
05 y los 20 Lmin a un pH de 65 observaacutendose un incremento en las tasas de
crecimiento y los rendimientos de γ-PGA conforme el suministro de oxiacutegeno
incrementaba
A pesar de la intensa investigacioacuten que se ha llevado a cabo en lo
referente a la produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a el
mecanismo y las viacuteas biosinteacuteticas especiacuteficas por las cuales el poliacutemero es
producido auacuten no han logrado ser dilucidadas con total claridad a pesar de que
no se cuestione le hecho de que efectivamente acontece a traveacutes del ciclo de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 30
los aacutecidos tricarboxiacutelicos De las tres fuentes de carbono presentes en el medio
de cultivo E el aacutecido ciacutetrico y el aacutecido L-glutaacutemico constituyen dos sustratos
precursores para la produccioacuten de dicho poliacutemero sin embargo en lo referente
al glicerol auacuten no queda claro como este incrementa la formacioacuten de poliacutemero
maacutes allaacute del hecho de que Troy (1973) encontroacute que el complejo enzimaacutetico
PGA-sintetasa responsable de la polimerizacioacuten del aacutecido L-glutaacutemico a γ-
PGA es estimulada por la presencia de glicerol Considerando que la viacutea de
biosiacutentesis del γ-PGA efectivamente involucra el ciclo de los aacutecidos
tricarboxiacutelicos cualquier fuente de carbono no relacionada directamente como
el glicerol o la glucosa podriacutean en principio ser una fuente primaria de carbono
para el crecimiento celular y la produccioacuten de γ-PGA Efectivamente el empleo
de glucosa como principal fuente de carbono y cantidades traza de aacutecido ciacutetrico
y aacutecido L-glutaacutemico (05 gL) permitieron alcanzar un rendimiento en γ-PGA de
12 gL en cultivos de Bacillus licheniformisATCC9945a (Ko amp Gross 1998) Sin
embargo y a pesar de este hecho Du y colaboradores (1995) encontraron otra
posible explicacioacuten al incremento del rendimiento en presencia de glicerol Ellos
encontraron que en Bacillus licheniformis ATCC9945a las altas
concentraciones de glicerol en el medio de cultivo conllevan a un cambio en la
composicioacuten de los fosfoliacutepidos de la membrana celular incrementando la
proporcioacuten de los fosfoliacutepidos C120 y C101 y reduciendo la de fosfoliacutepidos
C181 y C161 lo que parece favorecer la formacioacuten de una membrana celular
menos compacta lo que conlleva a una efectiva excrecioacuten del γ-PGA fuera de
la membrana celular
En lo referente a produccioacuten a gran escala y en buacutesqueda de la
aplicacioacuten comercial del γ-PGA en grandes cantidades resulta maacutes que
evidente la necesidad de incrementar la productividad Yoon y colaboradores
(2000) desarrollaron una estrategia para la produccioacuten de γ-PGA con un alto
rendimiento mediante cultivo en lote alimentado de Bacillus licheniformis
ATCC9945a Mediante el empleo de un bioreactor de 25 L conteniendo 1 L de
medio de cultivo y bajo condiciones de pH y temperatura de 65 y 37ordmC
respectivamente un 40 de saturacioacuten de oxiacutegeno y una velocidad de
agitacioacuten de 1000 rpm lograron alcanzar una concentracioacuten maacutexima de γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 31
de 35 gL suministrando aacutecido ciacutetrico y aacutecido L-glutaacutemico a una velocidad de
alimentacioacuten de 02 mLmin (144 gh de aacutecido ciacutetrico y 24 gh de aacutecido
glutaacutemico) por un periacuteodo de 3 h despueacutes del agotamiento del aacutecido ciacutetrico
inicial lo cual aconteciacutea alrededor de las 22 h La productividad alcanzada fue
de 1 gmiddotl-1middoth-1
425 Purificacioacuten del γshyPGA
Dado que la produccioacuten del γ-PGA es mayoritariamente extracelular en
concreto en la cepa de intereacutes para el presente estudio la de Bacillus
licheniformis ATCC9945a la purificacioacuten del poliacutemero es directa y consta de
manera general de tres pasos I) la remocioacuten de las ceacutelulas mediante
centrifugacioacuten o filtracioacuten 2) la precipitacioacuten del producto del medio libre de
ceacutelulas mediante metanol etanol o 1-propanol y 3) la diaacutelisis para la remocioacuten
de impurezas de pequentildeo peso molecular
Du y colaboradores (2001) desarrollaron una estrategia eficiente para la
separacioacuten y recuperacioacuten delγ-PGA de caldos altamente viscosos Esta
consiste en dos procesos I) Separar el γ-PGA del caldo de cultivo viscoso y II)
Concentrar la solucioacuten de PGA por ultrafiltracioacuten con el propoacutesito de reducir la
cantidad de alcohol requerida en el proceso de separacioacuten Las ceacutelulas
encapsuladas con γ-PGA poseen carga negativa cerca del valor neutro de pH
esto debido a la ionizacioacuten del grupo carboxilo en las moleacuteculas de γ-PGA Esta
carga negativa en sus superficies les confiere a las ceacutelulas una alta estabilidad
en el medio de cultivo lo que dificulta la sedimentacioacuten de las ceacutelulas durante el
proceso de separacioacuten Esta alta estabilidad asiacute como la elevada viscosidad del
caldo de cultivo son los dos principales problemas que se enfrentan cuando se
trata de separar las ceacutelulas y el γ-PGA del medio de cultivo por lo cual la
reduccioacuten de ambas es vital para una eficiente recuperacioacuten del γ-PGA
Mediante la disminucioacuten del pH es posible reducir el nuacutemero de cargas
negativas sobre la superficie de las ceacutelulas lo que favorece su faacutecil agregacioacuten
y precipitacioacuten Esto permite reducir en hasta un 17 la energiacutea requerida para
una adecuada centrifugacioacuten del caldo de cultivo a un pH de 5 En lo referente
a los requerimientos de alcohol es conocido que un 75-80 del mismo es
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 32
requerido para la precipitacioacuten del γ-PGA presente en un caldo libre de ceacutelulas
a una concentracioacuten de 1-2 Dado que la cantidad de alcohol requerida
disminuye a medida que la concentracioacuten de γ-PGA aumenta es necesaria y
ventajoso sino la concentracioacuten del γ-PGA presente en el medio de cultivo libre
de ceacutelulas a lo largo del proceso de recuperacioacuten Asiacute es posible reducir en un
25 el alcohol requerido para precipitar una solucioacuten de γ-PGA que fue
concentrada de 20 gL a 60 gL mediante ultrafiltracioacuten a un pH de 5
Asiacute mismo y dada la naturaleza anioacutenica del γ-PGA es posible que el
empleo de la cromatografiacutea de intercambio ioacutenica constituya una herramienta
importante para la purificacioacuten de este poliacutemero
426 Control del peso molecular y degradacioacuten del γshyPGA
El peso molecular es una caracteriacutestica importante del γ-PGA microbiano
debido al efecto que tiene el tamantildeo molecular en las propiedades del
poliacutemero El γ-PGA producido por bacterias del geacutenero Bacillus por lo general
presenta un relativamente alto peso molecular Un poliacutemero de alto peso
molecular es uacutetil como agente espesante pero no es uacutetil para otros usos
debido a la alta viscosidad que lo vuelve difiacutecil de modificar quiacutemicamente
mediante la adicioacuten de alguacuten reactivo quiacutemico De acuerdo con el uso que se
pretenda dar es necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso
molecular por ejemplo en lo referente al empleo del γ-PGA en sistemas de
liberacioacuten de faacutermacos o en el disentildeo de faacutermacos polimeacutericos resulta
necesaria la existencia de poliacutemeros de distinto peso para controlar el nivel de
liberacioacuten en los distintos tejidos (Shih et al 2001) Es evidente entonces que el
control del peso molecular del γ-PGA no es solamente un asunto de
importancia fundamental o teoacuterica sino de importancia praacutectica para el
desarrollo de aplicaciones comerciales para este poliacutemero Entre los meacutetodos
que se han empleado para la obtencioacuten de γ-PGA con diferentes pesos
moleculares encontramos la hidroacutelisis alcalina la degradacioacuten ultrasoacutenica la
degradacioacuten microbiana o enzimaacutetica y la alteracioacuten de la composicioacuten del
medio de cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 33
En otro estudio Birrer y colaboradores (1994) encontraron que la
variacioacuten de la fuerza ioacutenica del medio de cultivo mediante la adicioacuten de un 4
(pv) de NaCl conllevaba a la formacioacuten de un γ-PGA de un peso molecular
relativamente mayor
A la fecha existen pocos estudios sobre la biodegradacioacuten microbiana o
enzimaacutetica del γ-PGA a moleacuteculas de menor peso molecular sin embargo es
importante sentildealar que en la mayoriacutea de estudios sobre siacutentesis de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a se sugiera la posible existencia de una
enzima ldquodespolimerasardquo responsable de la descomposicioacuten del γ-PGA Lo que
inicialmente se observaba como una reduccioacuten en la viscosidad del medio de
cultivo con el tiempo o bajo ciertas condiciones demostroacute ser una enzima
poliglutamil-γ -hidrolasa responsable de la ruptura hidroliacutetica del γ-PGA en esta
cepa de Bacillus (King et al 2000) Curiosamente la enzima mostroacute ser
activada por la presencia de iones Zn2+ y Ca2+ y tener una alta afinidad por el γ-
PGA
427 Aplicaciones del γshyPGA
Dada la naturaleza del γ-PGA al ser un poliacutemero no toacutexico
biodegradable y cuya produccioacuten puede ser no tan costosa se han sugerido
gran cantidad de aplicaciones durante la uacuteltima deacutecada El γ-PGA de alto peso
molecular es decir mayor a 106 Da es el preferible en gran parte de las
aplicaciones aunque si bien existen otra serie de aplicaciones que se
presentaran a continuacioacuten y que podriacutean demandar diferentes caracteriacutesticas
Es importante destacar eso siacute que salvo las aplicaciones meacutedicas el resto
considera como indiferente la proporcioacuten de aacutecido D-glutaacutemico y de aacutecido L-
glutaacutemico presente en el γ-PGA
Alimentos
Existe una amplia gama de aplicaciones para el γ-PGA en la industria de
alimentos y sus derivados En jugos y otras bebidas el γ-PGA colabora en el
mejoramiento del sabor y su potabilidad Otra aplicacioacuten importante existe en
alimentos soacutelidos a base de harina de trigo como por ejemplo pan pasteles o
pasta donde la adicioacuten de γ-PGA ha demostrado retrasar el envejecimiento y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 34
mejorar la textura asiacute como permitir una mayor conservacioacuten de la forma Para
estas aplicaciones el γ-PGA recomendable es el de alto peso molecular
Asiacute mismo el γ-PGA ha demostrado poseer propiedades
anticongelantes propiedad que se ve incrementada conforme el tamantildeo del
poliacutemero se reduce Esto permitiriacutea emplear el γ-PGA en la conservacioacuten de
alimentos microorganismos y enzimas Debido a que las sales de este
poliacutemero tienen poco sabor por siacute mismas pueden ser empleadas en mayores
concentraciones en comparacioacuten con otros agentes anticongelantes tales como
la glucosa Aunque esta aplicacioacuten es dependiente del tipo de sal del poliacutemero
empleada es independiente de la proporcioacuten de aacutecido L- y D-glutaacutemico
presente en el poliacutemero Asiacute mismo la adicioacuten de γ-PGA en productos
alimenticios que contengan sustancias activas bioloacutegicamente como por
ejemplo carotenoides vitaminas o polifenoles incrementa la absorcioacuten de
dichas sustancias en el intestino delgado
Fertilizante
Es posible producir grandes cantidades de biomasa y γ-PGA a partir de
medios liacutequidos con estieacutercol glicerol aacutecido ciacutetrico y otras sales inorgaacutenicas
resultando un producto que funciona como un fertilizante de liberacioacuten lenta
cuando es aplicado en los campos de cultivo Dado que el γ-PGA es
particularmente inerte a la gran mayoriacutea de las proteasas la liberacioacuten de
nitroacutegeno puede verse reducida auacuten maacutes Inclusive es posible producir dicho
fertilizante mediante fermentacioacuten en fase soacutelida lo que podriacutea resultar auacuten
maacutes ventajoso en ciertos casos pues permite utilizar como co-sustrato de
fermentacioacuten productos agriacutecolas tales salvado de trigo soya o maiacutez Es
importante sentildealar que para dicha aplicacioacuten la proporcioacuten de aacutecido L- y D-
glutaacutemico presente en el poliacutemero es indiferente
Tratamiento de aguas residuales
Debido a la actividad de floculacioacuten que este poliacutemero presenta el
empleo del γ-PGA en el tratamiento de aguas residuales ha sido investigado en
muacuteltiples estudios demostrando una gran capacidad de absorcioacuten y afinidad
por el Cu2+ Adicionalmente se ha demostrado el requerimiento de iones
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 35
multivalentes tales como el Ca2+ Fe3+ y Al3+ para mejorar su actividad
floculante bajo ciertas condiciones
Asiacute mismo tambieacuten se ha empleado el γ-PGA entrecruzado mediante
radiacioacuten γ el cual ha demostrado ser eficiente en la clarificacioacuten de agua
tuacuterbida a concentraciones tan bajas como 1 mgkg
Bioplaacutesticos
La posibilidad de emplear eacutesteres de γ-PGA como plaacutestico
biodegradable tambieacuten constituye otra aplicacioacuten interesante de este poliacutemero
a pesar de que por el momento su costo es todaviacutea muy elevado como para
asegurar el eacutexito comercial Mediante la modificacioacuten de los grupos eacutester es
posible disentildear un plaacutestico que cumpla los requisitos de muacuteltiples propoacutesitos
asiacute mismo los eacutesteres de γ-PGA han demostrado ser maacutes estables a altas
temperaturas que sus respectivas sales de sodio
Hidrogeles
La formacioacuten de hidrogeles por parte de γ-PGA con o sin la adicioacuten de
poliacutemeros adicionales da origen a una amplia gama de novedosas
aplicaciones ya que las propiedades fiacutesicas del gel pueden ser controladas
para cumplir una amplia variedad de necesidades
Mediante irradiacioacuten γ de 19 kGy es posible generar un hidrogel a base
de γ-PGA con un contenido especiacutefico de agua de 3500 Esto constituye un
meacutetodo conveniente y sencillo para gelificar el γ-PGA sin necesidad de
poliacutemeros o entrecruzadores
Los hidrogeles pueden ser empleados en muacuteltiples aplicaciones como en
la liberacioacuten controlada de faacutermacos el disentildeo de biosensores operaciones de
diagnoacutestico e inclusive hasta bioseparadores pueden ser obtenidos a partir de
γ-PGA y PEG-metacrilato Los hidrogeles obtenidos de esta forma poseen la
cineacutetica de liberacioacuten deseada para partiacuteculas de distinto tamantildeo tales como
pequentildeos peacuteptidos proteiacutenas o inclusive ceacutelulas completas (Bajaj amp Singhal
2011)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 36
Una manera sencilla de obtener hidrogeles de γ-PGA es a traveacutes de la
adicioacuten de peroacutexido como entrecruzador al caldo de fermentacioacuten crudo dicho
hidrogel puede emplearse como absorbente de agua en muacuteltiples aplicaciones
que incluyen agricultura horticultura y construccioacuten civil
De igual manera tambieacuten se ha demostrado que los hidrogeles pueden
ser empelados para la liberacioacuten lenta y controlada de faacutermacos en particular
aquellos formados por α-L-PGA y PEG-metacrilato Hidrogeles formados por un
72 deγ-PGA sulfonado y el resto en γ-PGA han demostrado resultados
promisorios en la liberacioacuten controlada de faacutermacos con una liberacioacuten
praacutecticamente nula a un pH de 74 sin embargo a un pH menor a 65 como el
observado en los tejidos inflamados la liberacioacuten del faacutermaco incrementaba
considerablemente
Transportador de faacutermacos
Dado a su biodegradabilidad y biocompatibilidad el γ-PGA constituye un
biopoliacutemero de particular intereacutes en el desarrollo de faacutermacos de liberacioacuten
controlada tal y como se ha sentildealado previamente Dada la presencia de
grupos carboxilo en las cadenas laterales del poliacutemero que pueden
interaccionar con los grupos funcionales presentes en otros agentes
quimioterapeacuteuticos el γ-PGA permite obtener faacutermacos maacutes solubles y faacuteciles
de administrar Inclusive el conjugado faacutermaco-γ-PGA puede ingresar a las
ceacutelulas diana e irse degradando lentamente mientras libera el agente
farmacoloacutegico y a la vez el aacutecido glutaacutemico producido durante su degradacioacuten
puede ingresar directamente al metabolismo celular o ser excretado a traveacutes
del rintildeoacuten (Bajaj amp Singhal 2011)
Uno de los conjugados maacutes prometedores y estudiados hasta el
momento ha sido con el agente anticanceriacutegeno Paclitaxel Dichos conjugados
Paclitaxel-γ-PGA han demostrado presentar un perfil farmacocineacutetico distinto
capaz de proveer una alternativa hidrosoluble a las formulaciones habituales de
este faacutermaco Tambieacuten estos conjugados han mostrado una respuesta
antitumoral marcadamente superior en comparacioacuten con el Paclitaxel soacutelo
tanto en tejidos murinos como humanos Asiacute mismo estos conjugados han
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 37
mostrado reducir la TCD50 (dosis letal media contra ceacutelulas canceriacutegenas) de
una sola irradiacioacuten de 539 Gy a 75 Gy sin afectar la respuesta radioloacutegica de
los tejidos normales sanos
Adhesivos bioloacutegicos
Los adhesivos bioloacutegicos son empleados para la adhesioacuten de tejidos
homeostasis y para el sellado de fugas de liacutequidos o aire en los tejidos durante
una cirugiacutea En la actualidad el adhesivo de mayor uso es la fibrina la cual
presenta un pobre adhesioacuten a los tejidos Un poliacutemero formado por el
entrecruzamiento del γ-PGA y gelatina ha demostrado un gran potencial para
ser empleado como adhesivo quiruacutergico y agente homeostaacutetico conservando la
capacidad de ser degradado lentamente por el cuerpo sin causar respuestas
inflamatorias severas y a la vez solidificando tan raacutepido como la fibrina pero con
una mayor adherencia a los tejidos Similares hallazgos se han obtenido con
poliacutemeros formados del entrecruzamiento de γ-PGA y colaacutegeno porcino (Bajaj
amp Singhal 2011)
Cosmeacuteticos
El γ-PGA puede ser empleado como componente de valor agregado en
la elaboracioacuten de cosmeacuteticos y productos para el cuidado personal tales como
humectantes exfoliantes y antiarrugas Dada sus propiedades quiacutemicas el γ-
PGA es homogeacuteneamente miscible asiacute como quiacutemicamente estable en la gran
mayoriacutea de los ingredientes tiacutepicamente empleados para la elaboracioacuten de
cremas faciales Asiacute mismo ciertas calidades de γ-PGA son capaces de
producir peliacuteculas suaves elaacutesticas humectantes y suaves sobre la piel Dado
que se trata de un humectante natural hidrofiacutelico formidable el γ-PGA ha
demostrado en combinacioacuten con extractos de Aloe vera promover la produccioacuten
natural de factores humectantes tales como aacutecido pirrolidona-carboxiacutelico aacutecido
laacutectico y aacutecido urocaacutenico A nivel microscoacutepico esto se explica por el hecho de
que los hidrogeles de γ-PGA son capaces de absorber hasta 5000 veces su
propio peso en humedad lo que permitiriacutea incrementar de gran manera las
propiedades humectantes de muchos productos cosmetoloacutegicos con la adicioacuten
de γ-PGA algunos electrolitos y el ajuste a un pH adecuado
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 38
Adyuvante en vacunas
El γ-PGA ha demostrado que es capaz de generar una mejor respuesta
inmune contra otros antiacutegenos presentes en una vacuna El γ-PGA de alto peso
molecular ha demostrado estimular la respuesta inmune contra antiacutegenos
virales en conejos y ratones
43 Disentildeo de procesos biotecnoloacutegicos y la transferencia de materia gasshyliquido
Cuando un microorganismo ha sido identificado como productor de un
compuesto de intereacutes existen una serie de consideraciones que deben ser
valoradas previamente antes de que un proceso productivo econoacutemicamente
viable pueda ser llevado a la praacutectica a escala industrial En aquellas
organizaciones e industrias con una soacutelida experiencia en el disentildeo y
escalamiento de procesos fermentativos los nuevos procesos son
incorporados de manera relativamente raacutepida
El desarrollo de un nuevo proceso fermentativo puede ser a groso modo
dividido en cuatro fases
La primera consiste en identificar el producto su potencial valor de
mercado su precio de venta asiacute como la vida uacutetil del mismo
La siguiente fase es seleccionar o disentildear la cepa que seraacute utilizada en
el proceso productivo y por consiguiente disentildear el proceso como tal Esto
involucra una adecuada seleccioacuten del medio de cultivo oacuteptimo y de las
condiciones idoacuteneas de proceso En este sentido la produccioacuten de γ-PGA a
partir de Bacillus licheniformis ATCC9945a ha sido fuertemente investigada en
torno a las condiciones ideales para su produccioacuten sin embargo algunos
reportes y resultados resultan ser incompletos contradictorios o discutibles Sin
embargo lo que si resulta comuacuten en todas las investigaciones en particular en
aquellas donde se han empleado voluacutemenes mayores de produccioacuten como por
ejemplo de 05 a 10 L es que la produccioacuten del γ-PGA se detiene al reducirse
la concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo problema que ha sido
abordado incrementando el caudal de oxiacutegeno yo incrementando la velocidad
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 39
de agitacioacuten sin que se reporten resultados consistentes o claros La
acumulacioacuten del γ-PGA a lo largo de la fermentacioacuten parece reducir
draacutesticamente la tasa de transferencia de oxiacutegeno lo que termina generando
condiciones anaeroacutebicas en tiempos tan cortos como 20 horas con
concentraciones de oxiacutegeno inferiores a 1 mgL
431 La transferencia de materia gasshyliacutequido
Un requisito primordial para la ocurrencia de una reaccioacuten quiacutemica
cualquiera es que los reactantes esteacuten presentes en el sitio de reaccioacuten En los
sistemas multifase los procesos de transporte son generalmente maacutes lentos
que las tasas maacuteximas de reaccioacuten intriacutenseca Este fenoacutemeno da como
resultado que las tasas de reaccioacuten reales sean menores que las que se
podriacutean esperar por efecto de la cineacutetica de reaccioacuten uacutenicamente
Los fundamentos fiacutesicos principales que determinan la transferencia de
materia son los mismos que aplican para la transferencia de calor y de
momento es decir conveccioacuten y difusioacuten
En los sistemas bioloacutegicos multifase como las fermentaciones en medio
sumergido la transferencia de masa ocurre entre dos fases una gaseosa y
otra liacutequida La mayor parte de los procesos fermentativos a gran escala con
excepcioacuten tal vez uacutenicamente de la produccioacuten de etanol y aacutecido laacutectico son
aeroacutebicos y tiacutepicamente son llevados a cabo en biorreactores aireados gas-
liacutequido En estos procesos aeroacutebicos como sucede con la produccioacuten de γ-
PGA por parte de Bacillus licheniformis ATCC9945a la transferencia de
oxiacutegeno desde la fase gaseosa a la fase liacutequida resulta vital para el eacutexito de
dicho bioproceso
En los bioprocesos aeroacutebicos el oxiacutegeno es un sustrato clave y debido
a su baja solubilidad en caldos y medios de cultivo resulta necesario su
continuo suministro La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deber ser
conocida e inclusive predicha con el propoacutesito de llevar a cabo un adecuado
disentildeo operacional del proceso y un correcto escalado de los biorreactores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 40
432 La tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR)
El transporte de oxiacutegeno gas-liacutequido en los bioprocesos aeroacutebicos es el
principal proceso gas-liacutequido a considerar a la hora de disentildear un bioproceso
La solubilidad del oxiacutegeno en un medio liacutequido es baja la concentracioacuten de
saturacioacuten de oxiacutegeno es de cerca de 7-8 mgL en un proceso tiacutepico en
aireacioacuten por lo cual una transferencia de oxiacutegeno continua de la fase gaseosa
a la liacutequida es esencial para conservar un metabolismo celular completamente
oxidativo Por ejemplo unos pocos minutos sin aireacioacuten pueden impactar
severamente en la habilidad de Penicillium chrysogenum para producir
penicilina mientras que en organismos aeroacutebicos facultativos esto puede
generar cambios draacutesticos en el rendimiento y el tipo de producto generado en
condiciones de carencia de oxiacutegeno
La transferencia de oxiacutegeno desde una fase gaseosa hasta el interior de
una ceacutelula ocurre siguiendo una serie de pasos secuenciales que son
1) Difusioacuten del O2 desde la fase gaseoso a la interfase gas-liacutequido
2) Transporte a traveacutes de la interfase gas-liacutequido
3) Difusioacuten del O2 a traveacutes de una regioacuten relativamente inactiva del liacutequido
adyacente a la burbuja es decir de la interfase gas-liacutequido a la de
mezclado del liacutequido
4) Transporte del oxiacutegeno disuelto a la ceacutelula los conglomerados celulares
o al pellet de ceacutelulas inmovilizadas
5) Difusioacuten a traveacutes de la peliacutecula inactiva hasta la superficie de la ceacutelula
dentro de los conglomerados celulares o al interior del pellet de ceacutelulas
inmovilizadas
6) Transporte a traveacutes de la membrana celular
7) Transporte del O2 en el interior celular hacia el sitio de demanda
433 Descripcioacuten de la transferencia maacutesica con kLa
La tasa volumeacutetrica de transferencia de materia de un compuesto A (qtA)
en este caso oxiacutegeno (O2) puede ser descrita cuantitativamente como el
producto de un coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (kLa) y una
fuerza impulsora que consiste en la diferencia entre la concentracioacuten de
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 41
saturacioacuten del compuesto (cA) y la concentracioacuten actual del compuesto en la
fase liacutequida (cA)
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de materia (unidad s-1) el kLa
es normalmente referido como un coeficiente uacutenico pero en realidad consiste
de dos partes el coeficiente de transferencia de materia propiamente dicho (kL)
que estaacute vinculado con el flujo maacutesico (tasa de transferencia por unidad de
aacuterea) y el aacuterea de la superficie especiacutefica (a) que es el aacuterea de transferencia
por unidad de volumen
La tasa de transferencia de oxiacutegeno (referida como velocidad de
transferencia de oxiacutegeno en algunos casos) el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de materia (kLa) y la concentracioacuten de oxiacutegeno estaacuten
relacionados por la ecuacioacuten
NAa = OTR = kLa(cA- cA) (gm3s)
Noacutetese en la ecuacioacuten que para que la transferencia sea mayor interesa
tener una kLa alta pero ademaacutes (cA-cA) debe tener un valor elevado lo que
podriacutea llevar a plantear que cA sea lo menor posible Sin embargo se requiere
de una concentracioacuten miacutenima de oxiacutegeno para mantener una fermentacioacuten
aerobia Con respecto a dicha ecuacioacuten es importante sentildealar que
1) La concentracioacuten en fase liacutequida cA corresponde a la cantidad de
oxiacutegeno que hay en la fase acuosa y se determina mediante un
electrodo de oxiacutegeno disuelto Si al sistema se introduce aire a presioacuten
atmosfeacuterica dicho valor estaraacute entre los 0-10 mgL
2) La concentracioacuten de saturacioacuten cA corresponde a la solubilidad de
oxiacutegeno y es dependiente de la concentracioacuten de oxiacutegeno en la fase
gaseosa es decir de la presioacuten parcial de oxiacutegeno Una vez conocida la
presioacuten parcial de oxiacutegeno es posible calcular el valor de la solubilidad
mediante la ley de Henry En agua una forma de esta ecuacioacuten seriacutea
pAGcA = He
Donde He es la constante de Henry y cuyo valor (aproximadamente
entre 15-30 atm m3kg) es funcioacuten de la temperatura A partir de esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 42
ecuacioacuten es posible despejar el valor de cA = pAGHe El valor de He
cambia con la temperatura por ejemplo en agua pura a 25 ordmC para el
oxiacutegeno es de 2396 x 106 Pamiddotm3middotkg-1 El valor de cA es modificable si
se manipula
a) Presioacuten podemos aumentar la concentracioacuten de saturacioacuten si
aumentamos la presioacuten parcial de oxiacutegeno por ejemplo si
pasamos de 021 atm a 1 atm introduciendo al reactor oxiacutegeno
puro en vez de aire a presioacuten atmosfeacuterica lo que da por
resultado un aumento en alrededor de cinco veces su valor
Es posible tambieacuten alcanzar un mayor aumento de la
concentracioacuten de saturacioacuten si aumentamos la presioacuten
absoluta no obstante si hacemos fermentaciones con
oxiacutegeno a presioacuten resulta necesario disponer de un
fermentador capaz de resistir tales condiciones de presioacuten
resulta evidentemente maacutes costoso y tambieacuten pueden ocurrir
cambios importantes en el metabolismo de los
microorganismos que puedan afectar su crecimiento o su
rendimiento en producto
b) Temperatura la solubilidad del oxiacutegeno en agua disminuye al
aumentar la temperatura
c) Composicioacuten del liacutequido si en lugar de agua pura se tiene una
disolucioacuten como sucede con la mayoriacutea de los medios que
tiene una composicioacuten salina importante la solubilidad debe
corregirse pues dichos componentes afectan su valor y dicho
efecto estaacute influenciado tanto por los iones presentes como
por los componentes orgaacutenicos
44 Fermentaciones a presioacuten
La gran mayoriacutea de los estudios sobre fermentaciones son generalmente
llevados a cabo bajo condiciones de presioacuten ambiental maacutes allaacute del hecho de
que el fermentador por lo general suele encontrarse positivamente presurizado
Son pocos los ejemplos a excepcioacuten de la cerveza y algunos vinos donde las
fermentaciones son llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten positiva en el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 43
fermentador Esta leve presurizacioacuten suele deberse al proceso de aireacioacuten del
biorreactor debido a la formacioacuten de una presioacuten de vuelta debido a las
restricciones del respiradero de escape del fermentador
La presioacuten positiva en muchos casos puede resultar beneficiosa para los
procesos de fermentacioacuten no soacutelo por el hecho de incrementar la solubilidad del
oxiacutegeno en el caldo de cultivo sino tambieacuten porque reduce las oportunidades
de contaminacioacuten externa durante el proceso de fermentacioacuten Igualmente la
presioacuten puede tener efectos nocivos sobre los procesos fermentativos La
presioacuten tiene el efecto de influenciar las velocidades y la direccioacuten del
metabolismo de los microorganismos Esto es particularmente evidente en el
caso de productos o subproductos volaacutetiles que forman parte de distintas rutas
metaboacutelicas La presioacuten en el fermentador puede evitar la produccioacuten o
expulsioacuten de un producto gaseoso al medio circundante Este fenoacutemeno puede
tener el efecto de interferir con el equilibrio de varias reacciones bioquiacutemicas y
puede resultar en toxicidad al interior de la ceacutelula o en la divergencia de rutas
metaboacutelicas Lo significante de este impacto dependeraacute de la duracioacuten del
proceso asiacute como de la magnitud de la presioacuten a la cual se realice la
fermentacioacuten
De igual manera el efecto de la presioacuten sobre las macromoleacuteculas
guarda una gran semejanza con los efectos de la temperatura lo cual se
desprende del parecido de la forma de los diagramas de estabilidad de las
proteiacutenas y viabilidad de los microorganismos entre ambas variables
temperatura y presioacuten observacioacuten que tambieacuten permite concluir que las
proteiacutenas constituyen los primeros elementos estructurales en ser afectados
de manera negativa por el incremento de la presioacuten La presioacuten parece afectar
en mayor medida las interacciones proteiacutena-proteiacutena en comparacioacuten con la
estabilidad proteica por siacute misma por lo que es vaacutelido concluir que son estas
interacciones las primeras en verse afectadas por dicha variable La
conservacioacuten de la viabilidad en los microorganismos al ser sometidos a
presioacuten dependeraacute en gran medida de su capacidad para conservar una
membrana celular funcional aunque los mecanismos que emplean para tal fin
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 44
auacuten son desconocidos dada la vital importancia de las interacciones proteiacutena-
proteiacutena en las funciones de membrana
Lo maacutes importante es conocer con detalle como efectivamente la presioacuten
ejercida afecta el proceso de fermentacioacuten en particular la bioquiacutemica y la
fisiologiacutea del mismo de igual manera si es posible controlar la direccioacuten de la
fermentacioacuten manipulando la presioacuten o si la presioacuten estaacute generando el
desarrollo de reacciones secundarias indeseadas las respuestas a dichas
interrogantes soacutelo pueden ser dilucidadas mediante la experimentacioacuten praacutectica
del proceso fermentativo en estudio
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 45
7 MATERIALES Y METODOLOGIacuteA
51 Informacioacuten de la cepa empleada
Se empleoacute la cepa Bacillus licheniformis ATCC9945a la cual se
encontraba conservada en estado vegetativo y bajo refrigeracioacuten en el
Laboratorio de Biopoliacutemeros del ETSEIB UPC Cataluntildea Con el propoacutesito de
seleccionar colonias altamente mucosas capaces de producir γ-PGA se
procedioacute a rallar la biomasa conservada en placas con Agar LB (pH 75) e
incubarlas por 24 horas a 37 ordmC Las colonias que mostraron una morfologiacutea
mucosa indicadora de la produccioacuten de γ-PGA fueron utilizadas para elaborar
los inoacuteculos empleados en las distintas fermentaciones
52 Medio de cultivo empleado
El medio de cultivo empleado para la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a fue el medio de cultivo E (Leonard et al 1958) con
algunas modificaciones seguacuten recomendado por Birrer y colaboradores (1994)
El detalle de la formulacioacuten se presenta en la tabla 5
Tabla 5 Formulacioacuten del medio de cultivo E empleado en el cultivo SmF de Bacillus
licheniformis ATCC9945a
Componente
Concentracioacuten
(gL)
Aacutecido L-glutaacutemico 20 Aacutecido ciacutetrico anhidro 12 Cloruro de amonio 7 K2HPO43H2O 043 MgSO47H2O 05 FeCl36H2O 004 MnSO4H2O 015 CaCl2 011 Glicerol 80 pH 75 Esterilizacioacuten por filtracioacuten (045 μm) Volumen 1 L
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 46
El medio de cultivo fue esterilizado por filtracioacuten (045 μm) y conservado
en refrigeracioacuten a 7 ordmC
53 Preparacioacuten de los inoacuteculos madre
Las colonias seleccionadas fueron inoculadas en matraces de 125 mL
con 25 mL de medio de cultivo E y cultivadas a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica
con varilla imantada a 650 rpm por 12 horas El caldo resultante fue
centrifugado a 8000 rpm por 25 minutos la biomasa recuperada fue
resuspendida en 10 mL de medio de cultivo E y 10 mL de una solucioacuten de
glicerol al 20 Dicha solucioacuten fue distribuida en voluacutemenes de 1 mL en tubos
eppendorf y congeladas a -80 ordmC
Posteriormente uno de estos tubos eppendorf fue empleado para
inocular matraces de 500 mL conteniendo 125 mL de medio de cultivo y fueron
cultivados a 30 ordmC bajo agitacioacuten magneacutetica con varilla imantada a 650 rpm por
14 horas El caldo resultante fue centrifugado nuevamente a 8000 rpm por 25
minutos se recuperoacute la biomasa precipitada y se resuspendioacute en 25 mL de
medio de cultivo E y 25 mL de una solucioacuten de glicerol al 20 Dicha solucioacuten
fue distribuida en voluacutemenes de 2 mL en tubos eppendorf y posteriormente
fueron congelados a -80 ordmC Cada uno de estos eppendorf constituiacutea un inoacuteculo
de origen para una fermentacioacuten individual La absorbancia promedio de estos
inoacuteculos se encontraba cercana a 25
531 Conservacioacuten de la cepa en estado productivo
Los inoacuteculos deben conservarse en todo momento bajo congelacioacuten a
una temperatura inferior a -15 ordmC siendo preferible conservarlos a -80 ordmC La
condicioacuten de produccioacuten de γ-PGA es extremadamente fraacutegil y cambios de
temperatura o descongelamiento pueden conllevar la peacuterdida de dicha
capacidad La reutilizacioacuten de biomasa residual de fermentaciones previas
queda descartada
54 Montaje del biorreactor a presioacuten
En la actualidad los principales fabricantes de biorreactores para la
industria biotecnoloacutegica carecen de equipos de fermentacioacuten a escala
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 47
laboratorio que puedan operar bajo condiciones de presioacuten superiores a los 01
bares relativos Por este motivo se debioacute modificar un reactor quiacutemico a
presioacuten de modo tal que pudiese cumplir los requisitos necesarios para el
cultivo de microorganismos El modelo empleado fue el reactor quiacutemico a
presioacuten modelo 6425-214 de la casa AceGlass (Estados Unidos) de un
volumen total de 2 L Este reactor tiene la capacidad de operar hasta 35 psig
(241 bares relativos) a una temperatura de 100 ordmC y a una agitacioacuten de 300
rpm El mismo seguacuten su disentildeo original se presenta en la figura 6
Figura 6 Reactor quiacutemico a presioacuten modelo 6425-214 de AceGlass Co
Las dimensiones del frasco del reactor de forma ciliacutendrica y fondo
redondeado son las siguientes
Diaacutemetro de boca 95 mm
Diaacutemetro maacuteximo 120 mm
Profundidad 180 mm
Con el propoacutesito de adecuarlo al cultivo de microorganismos el reactor
fue ligeramente modificado en algunos de sus componentes y su distribucioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 48
Entre los principales cambios realizados al sistema se encuentran los
siguientes
1) Incorporacioacuten de una turbina de disco tipo Rushton al tratarse de una
fermentacioacuten aeroacutebica es necesario garantizar una adecuada aireacioacuten
del medio de cultivo mediante agitacioacuten efectiva La paleta de agitacioacuten
original del sistema no cumpliacutea con dicho requisito por lo cual se cambioacute
la misma por una turbina tipo Rushton cuyas dimensiones se muestran
en la figura 7
Dimensiones
A = 75 mm
B = 18 mm
C = 1mm
D = 20 mm
Figura 7 Dimensiones de la turbina tipo Rushton empleada
Esta turbina se encuentra en posicioacuten central a 3 cm del fondo del
reactor y a 6 mm de los deflectores
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 49
2) Incorporacioacuten de deflectores se incorporaron dos laacuteminas deflectoras de
disentildeo propio de1 mm de ancho en una posicioacuten de 90 grados con
respecto a la superficie del reactor con el propoacutesito de reducir la
formacioacuten de voacutertice promover una agitacioacuten turbulenta y una mayor
formacioacuten de burbujas La geometriacutea de las laacuteminas deflectoras se
detalla en la Figura 8
Dimensiones
Ancho de laacutemina = 10 mm
Diaacutemetro = 95 mm
Longitud de laacutemina = 200 mm
Figura 8 Geometriacutea de las laacuteminas deflectoras
3) Cambio del motor de agitacioacuten se incorporoacute un motor IKA RW20 con
capacidad de hasta 2000 rpm en sustitucioacuten del motor original con que
A
B
C
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 50
disponiacutea el equipo (el sistema original trae un motor limitado a una
velocidad de agitacioacuten maacutexima de 330 rpm) con el propoacutesito de variar la
agitacioacuten del sistema y observar su efecto sobre el crecimiento y la
produccioacuten de poliacutemero
4) Reubicacioacuten de la vaacutelvula de seguridad de sobrepresioacuten con el
propoacutesito de garantizar una mayor seguridad del equipo maximizar la
vida uacutetil del cilindro de aire comprimido y evitar la sobrepresioacuten que
pueden generar el crecimiento del microorganismo (su metabolismo
puede liberar compuestos gaseosos o volaacutetiles) se trasladoacute la vaacutelvula de
seguridad del equipo de la tuberiacutea de llenado a la tapa del reactor
5) Eliminacioacuten de componentes dado que no resultaban uacutetiles para la
presente investigacioacuten se prescindioacute de instalar en la tapa del equipo el
condensado y el embudo de adicioacuten El disco de ruptura de la tuberiacutea de
llenado fue sustituido por una vaacutelvula de apertura manual con el
propoacutesito de permitir un mejor y maacutes raacutepido ajuste de la presioacuten durante
el establecimiento inicial de las condiciones de fermentacioacuten
55 Condiciones de fermentacioacuten
El detalle de las condiciones de temperatura presioacuten pH y agitacioacuten en
las cuales fueron establecidas las distintas fermentaciones asiacute como la
metodologiacutea de escalamiento empleada se presentan a continuacioacuten
551 Escalamiento
Inicialmente se procediacutea a inocular por duplicado 100 mL de medio de
cultivo con uno de los inoacuteculos madre (2 mL de ceacutelulas de Bacillus licheniformis
ATCC9945a conservados en tubos eppendorf a -20 ordmC) en matraces con
deflectores de 500 mL de capacidad A dichos matraces se les incorporaba una
pastilla de agitacioacuten magneacutetica de 25 cm de longitud y 07 cm de diaacutemetro y
eran colocados en agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm (agitador IKA C-MAG HS7)
por 8 horas a una temperatura aproximada de 30 ordmC
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 51
Posteriormente uno de los matraces (100 mL de cultivo) anteriormente
establecidos era utilizado para inocular 500 mL de medio de cultivo en el
biorreactor a presioacuten manteniendo una temperatura constante de 30 ordmC
aproximadamente Distintas presiones velocidades de agitacioacuten y densidades
oacutepticas del inoacuteculo fueron evaluadas El detalle del disentildeo experimental de
dichas pruebas se presenta a continuacioacuten en la tabla6
Tabla 6 Diferentes condiciones de presioacuten relativa agitacioacuten y absorbancia evaluadas en las
fermentaciones en biorreactor
CONDICIOacuteN
VALORES EVALUADOS
SOBREPRESIOacuteN
Agitacioacuten 300 rpm
Absorbancia del inoacuteculo 120
O bar (0 psig)
052 bar (75 psig)
103 bar (15 psig)
172 bar (25 psig)
241 bar (35 psig)
AGITACIOacuteN
Sobrepresioacuten 103 bar (15 psig)
Absorbancia del inoacuteculo 120
300 rpm
400 rpm
500 rpm
650 rpm
El tiempo de fermentacioacuten para cada uno de los ensayos evaluados fue
de 18 horas tiempo en el que el pH habiacutea descendido a un valor cercano pero
auacuten superior a 6 No se realizoacute ajuste alguno del pH a lo largo de la
fermentacioacuten Posteriormente se procediacutea a centrifugar el caldo de
fermentacioacuten a 8000 rpm por 25 minutos el sobrenadante recuperado era
almacenado para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA presente en
el mismo
552 Control de la competencia del inoacuteculo madre
Con el propoacutesito de garantizar que el inoacuteculo madre era apto para la
produccioacuten de γ-PGA uno de los matraces inicialmente establecidos era
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 52
conservado bajo agitacioacuten magneacutetica a 650 rpm y a 30 ordmC durante las 18 horas
que requeriacutea la fermentacioacuten en el biorreactor Posteriormente se determinaba
cualitativamente la produccioacuten de γ-PGA seguacuten la simbologiacutea que se presenta
en la tabla 7
Tabla 7 Simbologiacutea empleada para la medicioacuten cualitativa de la produccioacuten de γ-PGA en los
matraces de control
SIacuteMBOLO OBSERVACIOacuteN CUALITATIVA
- No produccioacuten de γ-PGA
+ Produccioacuten de γ-PGA
+++ Elevada produccioacuten de γ-PGA
56 Determinacioacuten del valor de kLa
Para la determinacioacuten del valor aproximado de kLa tanto en los
matraces coacutemo en el biorreactor se empleoacute el meacutetodo estaacutetico sin operacioacuten
del cultivo celular Dicho valor no fue determinado bajo condiciones de presioacuten
pues se careciacutea con la instrumentacioacuten adecuada sino soacutelo a presioacuten
atmosfeacuterica para ambos casos matraz y biorreactor
Este meacutetodo consiste en disminuir la concentracioacuten de oxiacutegeno hasta
una concentracioacuten de 1-25 mgL despueacutes el sistema es retornado a aireacioacuten
yo agitacioacuten y se mide como va aumentando la concentracioacuten de oxiacutegeno en la
fase liacutequida conforme transcurre el tiempo El objetivo es por tanto disminuir la
concentracioacuten de cA0 lo suficiente como para tener un cambio importante
obteniendo asiacute una curva de ascenso de las concentraciones de oxiacutegeno en el
tiempo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 53
561 Matraces de cultivo
A un matraz de cultivo en reposo conteniendo 100 mL de medio de
cultivo E se le agregoacute 001 g de sulfito de sodio (Na2SO3) y una punta de
espaacutetula de cloruro de cobalto (actuacutea como catalizador) y se agita
manualmente por 20 s Posteriormente se introdujo la sonda de oxiacutegeno
disuelto del medidor Hanna Oxi-check y se dejoacute descender el nivel de oxiacutegeno
disuelto hasta el valor miacutenimo posible entre 20-25 mgL Seguidamente se
activoacute la agitacioacuten magneacutetica y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto cada 10
segundos hasta alcanzar un punto maacuteximo que se repitiese al menos durante
2 minutos
562 Biorreactor
Se procedioacute a llenar el reactor con 600 mL de medio de cultivo y en
estado de reposo se le agregoacute 006 g de sulfito de sodio una punta de espaacutetula
de cloruro de cobalto y se agitoacute suavemente a 100 rpm por 20 segundos
Haciendo uso de la sonda de oxiacutegeno se determinoacute el menor nivel posible de
oxiacutegeno disuelto alrededor de 15-20 mgL Posteriormente se encendioacute la
agitacioacuten mecaacutenica a 300 rpm y se midioacute el nivel de oxiacutegeno disuelto en
intervalos de 10 segundos hasta alcanzar un valor maacuteximo de oxiacutegeno disuelto
sostenido en el tiempo es decir que se repitiese por al menos un minuto
563 Graficacioacuten
Con el propoacutesito de determinar el valor de kla a partir de la ecuacioacuten de
balance de oxiacutegeno
V(dCAdt) = VkLa(cA-cA)
Se tiene que integrando dicha ecuacioacuten con la concentracioacuten inicial cA0
se obtiene
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 54
Representado ln((cA - cA0)(c
A- cA)) contra el tiempo t se obtiene una
recta cuya pendiente es el valor de kLa
57 Determinacioacuten del contenido de γshyPGA en el caldo de fermentacioacuten
Con el propoacutesito de determinar la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo
post-fermentacioacuten se utilizoacute la teacutecnica analiacutetica llamada cromatografiacutea liacutequida
de alta eficiencia conocida normalmente por sus siglas en ingleacutes HPLC
especiacuteficamente la conocida como cromatografiacutea de permeacioacuten en gel (GPC)
uno de los tipos de cromatografiacutea de exclusioacuten molecular (SEC) maacutes
empleados en la separacioacuten de poliacutemeros
El equipo empleado fue el cromatoacutegrafo modelo 1260 Infinity de Agilent
Technologies La columna de separacioacuten empleada fue una columna PL
aquagel-OH de 8μm para cromatografiacutea GPC en fase acuosa El meacutetodo de
cromatografiacutea empleado consistioacute en eludir 25 μL de la muestra haciendo uso
de una solucioacuten tampoacuten fosfato 005 molL con un tiempo de elucioacuten de 15 min
por muestra El caudal de flujo del eluyente fue de 08 mLmin La deteccioacuten se
llevoacute a cabo a traveacutes de un detector de absorbancia UV-vis de longitud de onda
variable (VWD) a una longitud de onda de 220 nm y tambieacuten un detector de
iacutendice de refraccioacuten (RID) con polaridad positiva y una temperatura de la
unidad oacuteptica de 35 ordmC aunque los resultados reportados y empleados fueron
los obtenidos con el detector VWD El tiempo de retencioacuten de la fraccioacuten
polimeacuterica correspondiente al γ-PGA se encontroacute entre los 65 y los 90
minutos considerando el hecho de que el mismo se trata de una mezcla de
moleacuteculas polimeacutericas de distinta longitud y por ende distinto peso molecular
Para poder cuantificar la cantidad de poliacutemero presente en la muestra se
elaboroacute una curva de calibracioacuten inicial Se prepararon soluciones en agua
destilada de γ-PGA a concentraciones de 10 5 2 1 y 05 gL Las mismas
fueron analizadas mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva para el
pico correspondiente al γ-PGA para cada concentracioacuten Dichos valores fueron
empleados para la elaboracioacuten de la curva de calibracioacuten inicial del equipo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 55
Las muestras a analizar fueron preparadas de la siguiente manera 400
μL del caldo crudo se diluyeron en agua destilada hasta un volumen final de 2
mL (dilucioacuten 5x) y posteriormente fueron filtradas mediante jeringa haciendo
uso de filtros de 045 μm en viales de HPLC Las muestras fueron analizadas
mediante HPLC y se determinoacute el aacuterea bajo la curva del pico correspondiente al
γ-PGA para cada una de las muestras
58 Determinacioacuten del efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
Con el propoacutesito de determinar el efecto del contenido de γ-PGA sobre la
solubilidad maacutexima de oxiacutegeno en el medio de cultivo en condiciones estaacuteticas
es decir sin crecimiento microbiano (consumo de oxiacutegeno de los
microorganismos nulo) se procedioacute a preparar soluciones de 100 mL de
volumen a concentraciones crecientes de poliacutemero (poliacutemero + biomasa) en
medio de cultivo y medir el nivel de oxiacutegeno disuelto en mgL haciendo uso de
un medidor de oxiacutegeno disuelto Hanna Oxi-check Dichas soluciones fueron
evaluadas en las mismas condiciones de fermentacioacuten empleadas en la
primera etapa de escalamiento matraces de 500 mL con deflectores y a una
agitacioacuten magneacutetica de 650 rpm Se evaluaron concentraciones de biopoliacutemero
de 0 7 14 21 36 54 y 71 gL
59 Medicioacuten del crecimiento bacteriano
Para determinar el crecimiento bacteriano se aprovechoacute el efecto que
dicho crecimiento genera sobre la turbidez del caldo a lo largo de la
fermentacioacuten Por ello se empleoacute la teacutecnica de espectrofotometriacutea
determinando la absorbancia del medio de cultivo inoculado y su incremento
con el tiempo Se empleoacute el coloriacutemetro modelo ZUSI 4200A a una longitud de
onda de 660 nm El equipo era inicialmente calibrado en 0 haciendo uso de
agua destilada acto seguido se determinaba el valor de absorbancia de la
muestra a analizar
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 56
510 Determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producido se determinoacute
mediante el meacutetodo desarrollado por Marfey (1984) para la determinacioacuten
cuantitativa de la composicioacuten enantiomeacuterica de aminoaacutecidos Dicho meacutetodo se
basa en la reaccioacuten del aacutecido glutaacutemico con el reactivo de Marfey (1-fluoro-24-
dinitrofenil-5-L-alanina) Dicho compuesto es oacutepticamente activo por lo que al
reaccionar con los enantioacutemeros D- y L- del aacutecido glutaacutemico forma dos
diasteroisoacutemeros que pueden separarse mediante cromatografiacutea HPLC con
tiempos de retencioacuten para el isoacutemero L- y el D- de 675 y 100 minutos
aproximadamente Para poder cuantificar la composicioacuten de manera efectiva
se realizoacute un calibrado previo con mezclas de concentracioacuten conocida de cada
isoacutemero
5101 Preparacioacuten de la muestras
Se introdujo 3 mg del γ-PGA a analizar en viales de 5 mL y se les
adicionoacute 2 mL de HCl 6 molL Se dejaron calentar a 100 ordmC en estufa por un
periacuteodo de 24 horas Posteriormente se trasfirioacute 100 μL de cada una de las
muestras a tubos eppendorf y se dejaron en desecador al vaciacuteo por un periacuteodo
de tres diacuteas empleando NaOH como desecante Seguidamente se disolvioacute los
productos en 100 μL de agua y se hicieron reaccionar con 200 μL de una
disolucioacuten con concentracioacuten de 5 mgmL de reactivo de Marfey en acetona con
20 μL de carbonato aacutecido de sodio (NaHCO3) durante una hora en estufa a 37
ordmC Al finalizar se neutralizoacute como 10 μL de HCl 2 molL y se dejoacute secar al vaciacuteo
por 3 diacuteas en el desecador a vaciacuteo con NaOH como desecante Finalmente se
diluyoacute la muestra en 350 μL de dimetilsulfoacutexido (DMSO) para cromatografiarla
por HPLC
La cromatografiacutea se llevoacute a cabo en el mismo equipo empleado para la
determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA pero con los siguientes cambios
1) Se empleoacute una columna de fase estacionaria reversa Spherisorb ODS2
de 5 μm de poro 25 cm de longitud y 046 cm de diaacutemetro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 57
2) El caudal de flujo del eluyente fue de 15 mLmin
3) El detector de longitud de onda variable (VWD) operaba a 340 nm y el
tiempo de elucioacuten era de 25 minutos
4) El eluyente empleado era una mezcla 8020 de fosfato de trietilamonio
50 mmolL a pH 3 y acetonitrilo El fosfato de trietilamonio se obteniacutea
haciendo reaccionar cantidades equimolares de trietilamina y aacutecido
fosfoacuterico
5102 Determinacioacuten de la composicioacuten porcentual
La composicioacuten porcentual enantiomeacuterica del γ-PGA es decir el
contenido porcentual de aacutecido D- y L-glutaacutemico se determinoacute mediante
contraste de las aacutereas obtenidas en el cromatograma para cada uno de los
picos correspondientes a cada diasteroisoacutemero con el aacuterea total
correspondiente a los productos de reaccioacuten (sumatoria de ambos
diasteroisoacutemeros) La composicioacuten se reportoacute como un porcentaje de aacutecido D-
glutaacutemico y aacutecido L-glutaacutemico presente en la muestra analizada
511 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA Para la determinacioacuten del peso molecular del poliacutemero se procedioacute a
analizar los cromatogramas obtenidos para el caacutelculo de la concentracioacuten de γ-
PGA Se empleoacute el programa informaacutetico ChemStation for LC Systemsreg de
Agilent Technologies Dicho programa posee unas potentes herramientas de
anaacutelisis que permiten automaacuteticamente calcular el peso molecular de un
compuesto Para las muestras analizadas se determinoacute el peso molecular
promedio en nuacutemero (Mn) el peso molecular promedio en peso (Mw) la
polidispersidad y el peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) La recta de
calibrado fue obtenida previamente por Bou y colaboradores con estaacutendares de
polioacutexido de etileno (PEO)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 58
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 59
8 RESULTADOS
61 Montaje del biorreactor a presioacuten
El detalle final del biorreactor empleado puede observarse en la figura 8
Noacutetese que la temperatura es controlada por la accioacuten de una manta teacutermica
externa como sucede con el disentildeo original del reactor y no por el empleo de
un serpentiacuten interno caso de la gran mayoriacutea de biorreactores comerciales a
escala laboratorio El mismo permite operar en condiciones de agitacioacuten de 100
a 650 rpm y a presiones de hasta 24 bar de sobrepresioacuten (35 psig) El
biorreactor resultoacute apto para el crecimiento microbiano alcanzaacutendose valores
de absorbancia de hasta 37 similares a los observados en cultivos en
matraces
Figura 9 Biorreactor empleado para la produccioacuten de γ-PGA bajo presioacuten
62 Competencia del inoacuteculo madre
Mediante la metodologiacutea descrita previamente para la preparacioacuten del
inoacuteculo madre fue posible alcanzar en el 100 de los cultivos de control la
produccioacuten de γ-PGA en alta cantidad Aunque dichos resultados no se
muestran el empleo de inoacuteculos de otra naturaleza como reutilizacioacuten de
biomasa o inoacuteculos conservados a temperaturas superiores a -20 ordmC mostraron
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 60
ser ineficaces y poco reproducibles en cuanto a la produccioacuten de γ-PGA por
Bacillus licheniformis ATCC9945a Los resultados de los cultivos control
pueden observarse en el graacutefico 10 bajo el nombre de Matraz
63 Determinacioacuten de los valores de kLa
631 Matraz
En lo referente al cultivo en matraz bajo las condiciones de agitacioacuten y
temperatura empleadas y en condiciones estaacuteticas (sin crecimiento
microbiano) se encontroacute un valor de kLa de 0026 s-1 En el graacutefico 1 y 2 se
muestran la curva de concentracioacuten de oxiacutegeno en funcioacuten del tiempo al
reiniciarse el proceso de agitacioacuten asiacute como el caacutelculo de dicho valor de
coeficiente mediante regresioacuten lineal respectivamente
Graacutefico 1 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concentracioacuten m
gL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 61
Graacutefico 2 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00257x ‐ 08809Rsup2 = 09966
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
Cuando se realizoacute la misma determinacioacuten pero a una velocidad de
agitacioacuten menor (430 rpm) el valor de kLa disminuyoacute significativamente En
dicho caso el valor de kLaobtenido fue de 0017 s-1 Estos resultados se
muestran en los graacuteficos 3 y 4
Como se puede observar en dichos graacuteficos el tiempo requerido para
alcanzar el valor maacuteximo estable se incrementoacute considerablemente en 60
segundos lo que indica una menor velocidad de transferencia producto de la
reduccioacuten de la intensidad de la agitacioacuten suministrada al cultivo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 62
Graacutefico 3 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten magneacutetica del medio de cultivo en matraz a una intensidad de agitacioacuten de 430 rpm
100
150
200
250
300
350
400
450
0 50 100 150 200 250
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Graacutefico 4 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00168x ‐ 07551Rsup2 = 09835
000
050
100
150
200
250
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Concen
tracioacuten mgL
Tiempo s
ln Linear (ln)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 63
632 Biorreactor
Para el caso del biorreactor el valor de kLa determinado fue de 0025 s-1
esto bajo condiciones estaacuteticas (sin crecimiento microbiano) y en las
condiciones de temperatura y operacioacuten previamente descritas
Como se puede observar dicho valor es praacutecticamente igual al obtenido
para el caso del matraz lo que indica condiciones de transferencia de oxiacutegeno
gas-liacutequido muy similares en ambos casos El valor dekLa fue determinado en
un punto lateral del reactor 2 cm por debajo del nivel de medio de cultivo y
contiguo a uno de los deflectores punto donde la transferencia de materia
debiera en principio ser mayor Dichos resultados se presentan en los graacuteficos
5 y 6
Graacutefico 5 Variacioacuten de la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en funcioacuten del tiempo al reiniciar la
agitacioacuten mecaacutenica del medio de cultivo en biorreactor a 300 rpm
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
560
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Concentracioacuten
Tiempo s
OXIacuteGENO DISUELTO (mgl)
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 64
Graacutefico 6 Regresioacuten lineal para la determinacioacuten del valor de kLa
y = 00246x ‐ 03222Rsup2 = 09902
000
050
100
150
200
250
300
0 20 40 60 80 100 120 140
ln
Tiempo s
LN Linear (LN)
64 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En lo referente a los niveles de oxiacutegeno a distintas concentraciones de γ-
PGA en condiciones estaacuteticas sin crecimiento microbiano se observa una
draacutestica reduccioacuten de dicho nivel conforme se incrementa la concentracioacuten del
biopoliacutemero Dicho fenoacutemeno es esperable dada la alta viscosidad del γ-PGA
La concentracioacuten de oxiacutegeno en el medio de cultivo alcanza un valor inicial de
74 mgL el cual se reduce draacutesticamente a 52 mgL a un valor de
concentracioacuten de γ-PGA de 14 gL Esta reduccioacuten es uacutenicamente producto de
la presencia del γ-PGA en el medio de cultivo El graacutefico 7 muestra dicho
fenoacutemeno hasta un valor miacutenimo de oxiacutegeno disuelto de 25 mgL cuando la
concentracioacuten de poliacutemero alcanza un maacuteximo 71 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 65
Graacutefico 7 Efecto de la concentracioacuten de γ-PGA sobre el nivel maacuteximo de oxiacutegeno disuelto en el
medio de cultivo E
y = ‐00569x + 64671Rsup2 = 08709
000
100
200
300
400
500
600
700
800
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Oxiacutegeno disuelto m
gL
γ‐PGA gL
Solubilidad O2 (mgL) Linear (Solubilidad O2 (mgL))
65 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γshyPGA mediante GPC
La curva de calibracioacuten obtenida a partir de soluciones con
concentracioacuten conocida de γ-PGA se presenta en el graacutefico 8
Como se puede observar se obtuvo un valor del coeficiente de
determinacioacuten R2 de 09983 lo que indica un ajuste lineal suficiente y un valor
del coeficiente de correlacioacuten R de 09991 lo que indica una correlacioacuten
positiva entre los datos contrastados La concentracioacuten de γ-PGA estaacute
determinada entonces por la siguiente ecuacioacuten
Concentracioacuten γ-PGA (gL) = (00027 x Aacuterea) ndash 00916
Esta curva fue posteriormente empleada para determinar la
concentracioacuten de γ-PGA en los caldos de cultivo obtenidos despueacutes de cada
una de las fermentaciones realizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 66
Graacutefico 8 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la concentracioacuten de γ-PGA mediante
GPC
y = 00027x ‐ 00916Rsup2 = 09983
0
2
4
6
8
10
12
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
Concentracioacuten gL
Aacuterea
Series1 Linear (Series1)
66 Efecto de la presioacuten sobre el rendimiento de γshyPGA
En lo referente al efecto de la presioacuten (relativa) sobre la productividad en
γ-PGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a se encontroacute un incremento de los
rendimientos fermentativos conforme se incrementaba la presioacuten hasta
alcanzar un valor maacuteximo de sobrepresioacuten de 103 bar (15 psig) una vez
superado dicho umbral la productividad se veiacutea reducida draacutesticamente A 103
bar la productividad en γ-PGA alcanzaba un valor de 1334 gL productividad
mayor a la obtenida en condiciones de aireacioacuten (2 Lmin) a presioacuten
atmosfeacuterica la cual fue de 508 gL Esta productividad maacutexima contrasta con
la obtenida a presioacuten atmosfeacuterica la cual fue miacutenima con un valor de 217 gL
Los graacuteficos 9 y 10 muestran los resultados anteriormente comentados Asiacute
mismo en la tabla 8 se presentan la totalidad de fermentaciones llevadas a
cabo las productividades obtenidas y el promedio de cada condicioacuten Es
importante destacar que cada condicioacuten de presioacuten fue evaluada por duplicado
no encontraacutendose diferencias importantes entre los resultados obtenidos para
ninguno de los casos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 67
Graacutefico 9 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus
licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748
617
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 05 1 15 2 25
PGGA (gL)
Presioacuten (bar)
RENDIMIENTO gL
Graacutefico 10 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten y la aireacioacuten a presioacuten atmosfeacuterica (0 relativa)
sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis ATCC9945a
218
680
1334
748617 508
4582
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000
0 052 103 172 241 0 +Aireacioacuten
Matraz
Concentracioacuten γ‐PGA gL
Presioacuten
RENDIMIENTO gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 68
Tabla 8 Fermentaciones realizadas y concentraciones de γ-PGA obtenidas
Reactor Condiciones A D C (gL)AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10108 5 130
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10926 5 141
AHJC11 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 11753 5 152
AHJC11 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 10186 5 131
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 95011 5 122
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103 bar 97936 5 126
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28706 3 20
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 28194 3 20
AHJC14 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 33184 3 24
AHJC14 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar 32866 3 23
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 68396 3 52
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0 bar +
aireacioacuten 2 Lmin 65871 3 50
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43692 5 54
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 46235 5 57
AHJC16 3 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 49809 5 62
AHJC16 4 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 58872 5 74
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 57321 5 72
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 241 bar 43021 5 53
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 57727 5 72
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 62398 5 78
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 60469 5 76
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 172 bar 58335 5 73
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 6083 5 76
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 57897 5 72
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 51267 5 64
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 052 bar 48407 5 60
= nuacutemero de muestra A = aacuterea D = dilucioacuten C = concentracioacuten y bar = bar relativo
Algunos de los cromatogramas realizados se muestran en las figuras 10
y 11 Como se puede observar la forma del pico de elucioacuten demuestra que el
biopoliacutemero estaacute compuesto por moleacuteculas de distinta longitud por lo cual
existen diferentes pesos moleculares Es importante destacar que para la gran
mayoriacutea de las fermentaciones realizadas el pico siempre presentoacute su maacutexima
altura al inicio lo que demuestra que la mayor parte de eacutel se trataba de un
poliacutemero de alto peso molecular Igualmente esto podriacutea indicar poca
degradacioacuten del biopoliacutemero durante las 18 horas de fermentacioacuten lo cual es
importante dada la capacidad de Bacillus licheniformis ATCC9945a de
hidrolizar enzimaacuteticamente el γ-PGA
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 69
Figura 10 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA analizadas
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 70
Figura 11 Cromatogramas de las muestras de γ-PGA (052-103-172 y 241 bar relativas)
67 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γshyPGA de Bacillus licheniformis ATCC9945a
En lo referente al efecto de la intensidad de agitacioacuten en rpm sobre la
produccioacuten de γ-PGA por Bacillus licheniformis ATCC9945a a una presioacuten de
103 bar relativos (15 psig) se encontroacute un efecto negativo del aumento de la
agitacioacuten por encima de las 300 rpm lo que se demuestra con una importante
reduccioacuten en la concentracioacuten final de γ-PGA obtenida despueacutes de 18 horas de
fermentacioacuten Estos resultados se presentan en el graacutefico 11 Como se puede
observar una intensidad de agitacioacuten de 650 rpm llega a ser tan perjudicial
para el microorganismo que la productividad en γ-PGA cae por debajo del valor
de 1 gL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 71
Graacutefico 11 Efecto de la agitacioacuten sobre la produccioacuten de γ-PGA en Bacillus licheniformis
ATCC9945a a 103 bar (15 psig) a 30 ordmC
0
2
4
6
8
10
12
14
16
300 350 400 450 500 550 600 650 700
Concentracioacuten gL
Agitacioacuten rpm
RENDIMIENTO (gL)
68 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
La composicioacuten enantiomeacuterica resultoacute afectada por las condiciones de
presioacuten Como demuestra el graacutefico 12 la proporcioacuten de aacutecido L-glutaacutemico en
las muestras correspondientes a fermentaciones bajo presioacuten resultoacute ser por
mucho mayor a las observadas en los cultivos control tanto en comparacioacuten
con el de matraz como con el sometido a aireacioacuten
La respectiva curva de calibracioacuten con las muestras conformadas por
mezclas con composicioacuten definida de ambos enantioacutemeros se presente en el
graacutefico 13 Como se puede observar los valores teoacutericos y los valores
experimentales obtenidos en el cromatograma coinciden en buena medida lo
que indica la validez de esta teacutecnica para la determinacioacuten de la composicioacuten
enantiomeacuterica del γ-PGA
En dos casos para las fermentaciones llevada a cabo a 052 bar y 172
bar de sobrepresioacuten (75 y 25 psig respectivamente) la proporcioacuten de aacutecido D-
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 72
glutaacutemico fue de cero en contraste con el control en matraz donde dicha forma
del aacutecido glutaacutemico estaba presente mayoritariamente en un 87
De igual manera en lo que concierne a la fermentacioacuten llevada a cabo a
presioacuten atmosfeacuterica y bajo condiciones de aireacioacuten se observa tambieacuten que el
enantioacutemero mayoritariamente presente es el aacutecido D-glutaacutemico con un 83
en contraste con el aacutecido L-glutaacutemico con apenas un 17 Todas las
fermentaciones llevadas a cabo bajo condiciones de presioacuten presentan un
contenido de aacutecido L-glutaacutemico superior al 83
Aunque no fue posible encontrar una correlacioacuten directa entre la presioacuten
y la composicioacuten porcentual en aacutecido D-glutaacutemico si es posible observar como
las condiciones de presioacuten parecen limitar condicionar o disminuir la presencia
de esta forma del aacutecido glutaacutemico en el γ-PGA
Graacutefico 12 Efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica en aacutecido
L-glutaacutemico y aacutecido D-glutaacutemica del γ-PGA producido por Bacillus licheniformis ATCC9945a
R11 (103bar)
R12 (103bar)
R15 (0 +aireacioacuten)
R16 (241bar)
R19 (172bar)
R22 (052bar)
MATRAZ
AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO 9518 8319 1736 10000 8347 10000 1285
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO 482 1681 8264 000 1653 000 8715
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 73
Graacutefico 13 Curva de calibracioacuten para la determinacioacuten de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-
PGA mediante HPLC
000
2900
4700
7700
970010000
7100
5300
2300
300
000
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
100 L 75 L 25 D 50 L 50 D 25 L 75 D 100 D
Composicioacuten enantiomeacuterica porcentual
AacuteCIDO D‐GLUTAacuteMICO AacuteCIDO L‐GLUTAacuteMICO
69 Determinacioacuten del peso molecular del γshyPGA
Los resultados de los pesos moleculares de los poliacutemeros obtenidos en
los distintos ensayos se muestran en la tabla 9 El peso molecular promedio de
permeacioacuten (Mp) de todas las muestras se encontroacute entre los 269-307 x 107
gmol
Tabla 8 Valores de peso molecular promedio en nuacutemero (Mn) peso molecular promedio en
peso (Mw) peso molecular promedio de permeacioacuten (Mp) y polidispersidad (PD) delγ‐PGA
producido en los distintos ensayos evaluados
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
MATRAZ1 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 157 214 29 137
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
MATRAZ2 1 650 rpm agitacioacuten magneacutetica 30ordmC 160 216 292 135
PRIMERO MAYOR AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC11 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar relativos
207 252 307 122 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 74
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC11 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
204 252 307 124 PRIMERO MAYOR
AHJC12 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
202 252 307 125 PRIMERO MAYOR
AHJC12 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 103 bar
199 251 307 126 PRIMERO MAYOR
AHJC13 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 200 247 307 123
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC13 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar 226 26 306 115
PRIMERO MAYOR SEGUNDO PEQUENtildeO
AHJC15 1 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 179 223 281 125
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC15 2 300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 0
bar + aireacioacuten 172 221 264 128
IGUALES MAS DEL SEGUNDO PICO
AHJC16 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
217 248 304 114 PRIMERO MAYOR
AHJC16 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
210 246 304 117 PRIMERO MAYOR
AHJC17 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
195 233 284 120 SEGUNDO MAYOR
AHJC17 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 241 bar
178 225 269 126 SEGUNDO MAYOR
AHJC19 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
223 262 306 118 PRIMERO MAYOR
AHJC19 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
222 261 306 117 PRIMERO PAYOR
AHJC20 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
207 254 307 122 PRIMERO MAYOR
AHJC20 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 172 bar
187 251 306 134 PRIMERO MAYOR
AHJC21 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
171 246 306 144 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC21 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
185 253 306 136 PRIMERO MAYOR SEGUNDO PICO
PEQUENtildeO APRECIABLE
AHJC22 1 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
202 252 306 125 PRIMERO MAYOR
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 75
Reactor Condiciones Mn
106 Mw
106 Mp
106 PD Tamantildeo del pico
AHJC22 2 300 rpm agitacioacuten
mecaacutenica 30ordmC 052 bar
232 263 306 113 PRIMERO MAYOR
AHJC32-1-18HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
173 228 307 132 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-2-18HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 18 horas de cultivo
177 230 306 130 PRIMERO MAYOR
AMBOS PICOS EXISTEN
AHJC32-1-36HRS
1
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
165 220 23 133 IGUALES
AHJC32-2-36HRS
2
300 rpm agitacioacuten mecaacutenica 30ordmC 103
bar 36 horas de cultivo
173 224 302 130 IGUALES
Los valores de polidispersidad estuvieron entre 113 y 144 Asiacute mismo
no se observan mayores diferencias entre los pesos moleculares obtenidos a
distintas presiones aunque la existencia de un segundo pico era maacutes evidente
en los cromatogramas correspondientes a γ-PGA producido en condiciones de
presioacuten relativa 0 Asiacute mismo dichas muestras presentan un peso molecular
levemente menor aunque dicha tendencia no es absoluta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 76
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 77
9 DISCUSIOacuteN
71 Cepa empleada
Bacillus licheniformis ATCC9945a es una cepa que ha sido empleada
con eacutexito en la produccioacuten de γ-PGA particularmente a escala laboratorio maacutes
no ha sido empleada a escala industrial donde otras cepas particularmente de
la especie Bacillus subtilis han sido las preferidas tanto por aspectos de
rendimiento como estabilidad productiva de la cepa El presente estudio
determinoacute una productividad promedio en condiciones de matraz de 4582 gL
despueacutes de 72 horas de cultivo Valores de productividad tan altos no habiacutean
sido reportado previamente para Bacillus licheniformis ATCC9945a donde
valores entre 17 y 23 gL de rendimiento han sido reportados por Troy (1973)
Cromwick y Gross (1996) 26 a 35 gL por Bajaj y colaboradores (2009) y 35
gL por Yoon y colaboradores (2000)
Los motivos de este mayor rendimiento aunque no son claros pueden
deberse a una mejor transferencia de oxiacutegeno en el sistema de agitacioacuten
magneacutetica en comparacioacuten con la agitacioacuten orbital estaacutendar Asiacute por ejemplo y
utilizando la ecuacioacuten simplificada para determinar en valor de kLa en agitacioacuten
orbital (Diacuteaz 2011) tenemos que a 20 ordmC
kLa = 139 x 10-3n (VTVL)084
Asiacute tenemos que para un sistema en agitacioacuten orbital a 250 rpm es decir
a una frecuencia de 417 s-1 con un volumen de medio de cultivo de 100 mL y
un volumen total del matraz 500 mL el valor de kLa es de aproximadamente
0020 s-1 inferior al valor de 0026 s-1 obtenido en el presente estudio para el
cultivo en agitacioacuten magneacutetica a 30 ordmC Dado que la difusividad disminuye al
aumentar la temperatura es de esperar que a 30 ordmC dicho valor de kLa teoacuterico
sea auacuten menor
Es importante sentildealar que en lo referente a la composicioacuten del medio de
cultivo el medio de cultivo E empleado en este estudio es el mismo empleado
previamente por otros autores para el estudio de la produccioacuten de γ-PGA en
Bacillus licheniformis ATCC9945a por lo cual no se considera que la
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 78
composicioacuten del medio de cultivo pueda ser la responsable de las diferencias
con los resultados reportados anteriormente por otros investigadores quienes
en particular tambieacuten emplearon dicho medio de cultivo en sus pruebas
Dicho valor de rendimiento promedio obtenido de 4582 gL (en matraz)
coloca a este cepa al mismo nivel de productividad de las cepas
industrialmente empleadas como sucede con Bacillus subtilis F02-1 con un
rendimiento reportado por Kubota y colaboradores (1993) de 50 gL pero con
una menor necesidad de aacutecido glutaacutemico (20 gL en contra de 80 gL) La
conveniencia del empleo de la cepa ATCC9945a de Bacillus licheniformis debe
entonces evaluarse entorno a su capacidad de escalamiento y conservacioacuten de
la competencia en la produccioacuten de γ-PGA y no entorno a su maacuteximo
rendimiento pues en este aspecto ha demostrado en condiciones oacuteptimas la
capacidad de producir γ-PGA en concentraciones extremadamente elevadas
Los resultados acaacute obtenidos refuerzan lo ya descrito por otros autores quienes
sentildealan precisamente estos aspectos (escalamiento y estabilidad) como los
principales retos para llevar a cabo la produccioacuten de γ-PGA mediante Bacillus
licheniformis ATCC9945a
72 Conservacioacuten de la cepa en estado competente
Uno de los principales problemas que se enfrentoacute a lo largo de la
presente investigacioacuten es la facilidad con la cual la cepa ATCC9945a de
Bacillus licheniformis revierte a formas incapaces de producir γ-PGA Este
fenoacutemeno puede ocurrir incluso con tan soacutelo una generacioacuten de cultivo por lo
cual el empleo de la biomasa generada en una fermentacioacuten previa es
indeseable pues seguramente no daraacute resultados positivos para la produccioacuten
de γ-PGA
Este fenoacutemeno es uno de los principales inconvenientes que se
enfrentan a la hora de evaluar el efecto de diversos paraacutemetros sobre la
productividad de γ-PGA en esta cepa pues la incapacidad de garantizar
resultados reproducibles imposibilita poder evaluar condiciones nutricionales
de agitacioacuten temperatura y demaacutes teniendo la certeza que las diferencias
encontradas solo se deberaacuten a los paraacutemetros bajo control
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 79
Cromwick y colaboradores (1994) reportaron el congelamiento con
nitroacutegeno liacutequido como una forma vaacutelida para la preservacioacuten de las ceacutelulas en
un estado consistente de alta productividad de γ-PGA En nuestro caso la
metodologiacutea empleada fue distinta Se incorporoacute el glicerol como crioprotector y
el congelamiento no se realizoacute mediante nitroacutegeno liacutequido sino que fue
congelamiento convencional utilizando un equipo de refrigeracioacuten con una
capacidad de enfriamiento de hasta -80 ordmC y voluacutemenes de inoacuteculo pequentildeos
de entre 1 y 2 mL cuyo congelamiento fuera particularmente raacutepido
Igualmente se observoacute que los cultivos que mejor comportamiento y
reproducibilidad dieron como inoacuteculo fueron aquellos cuyas ceacutelulas eran
recolectadas previo al inicio de la produccioacuten de γ-PGA Cultivos cuya edad
superaba las 10 horas y que ya presentaban presencia de γ-PGA aunque
podiacutean emplearse para la obtencioacuten de inoacuteculos madres los mismos no
resultaban tan eficientes como los anteriormente descritos
El empleo de esta metodologiacutea de conservacioacuten de la cepa permitioacute una
reproducibilidad del 100 en los ensayos obtenieacutendose poliacutemero en la
totalidad de los cultivos de control que se establecieron durante cada una de
las fermentaciones llevadas a cabo en el biorreactor Estos resultados indican
que dicha metodologiacutea es eficaz para la preservacioacuten a largo plazo de Bacillus
licheniformis ATCC9945a y como estrategia para un adecuado escalamiento
durante el proceso de produccioacuten a mayor escala De igual manera la
descripcioacuten detallada del proceso de conservacioacuten volumen de inoacuteculo
concentracioacuten de la muestra (por absorbancia) temperatura y demaacutes permite
una alta reproducibilidad del meacutetodo en contraposicioacuten con los reportes
existentes por otros autores que no brindaban mayor detalles sobre coacutemo llevar
a cabo este proceso de conservacioacuten
73 Disentildeo del biorreactor a presioacuten
Las fermentaciones a presiones superiores a la presioacuten atmosfeacuterica no
son habituales tanto a nivel de investigacioacuten como a nivel de proceso Dicha
afirmacioacuten queda particularmente ratificada cuando se analizan las opciones
comerciales existentes a escala laboratorio de biorreactores disentildeados para
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 80
operar a presioacuten la cual resulta praacutecticamente nula Por este motivo y para
poder llevar a cabo este estudio se requirioacute adaptar un reactor quiacutemico de
modo tal que permitiese trabajar a presioacuten y a la vez tuviese un control de
agitacioacuten y temperatura miacutenimo de modo tal que permitiese el cultivo de
microorganismos El biorreactor disentildeado fue exitoso pues permitiacutea un
crecimiento microbiano oacuteptimo y la produccioacuten de γ-PGA en un tiempo
relativamente corto de 18 horas
Las modificaciones realizadas en realidad fueron miacutenimas con respecto
a la estructura baacutesica del reactor quiacutemico convencional y con ellas se buscoacute
crear las condiciones que permitiesen incrementar la turbulencia en el sistema
de modo que existiese una mayor oxigenacioacuten y un mayor coeficiente
volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno (kLa) partiendo de antemano de la
hipoacutetesis inicial que sentildealaba al oxiacutegeno como uno de los componentes
limitantes de hecho el de mayor importancia para que este fermentacioacuten
ocurriese de la manera adecuada y con un alto rendimiento de γ-PGA
Se decidioacute emplear un reactor hecho de vidrio en lugar de uno metaacutelico
debido a que las condiciones de oxidacioacuten de la fermentacioacuten y la sensibilidad
de las enzimas involucradas a los iones metaacutelicos haciacutean deseable un material
inerte como sucede con el vidrio De igual manera al emplearse vidrio se tiene
una visioacuten del interior del fermentador las condiciones de agitacioacuten y formacioacuten
de burbujas son visibles asiacute como el crecimiento microbiano lo que permite un
mejor ajuste y correccioacuten de las condiciones de fermentacioacuten al menos durante
las etapas iniciales de investigacioacuten Para poder trabajar a mayores presiones
se hubiese requerido un reactor quiacutemico metaacutelico de un costo sumamente
elevado Los resultados experimentales demostraron que el rango de presioacuten
definido resultoacute ser el correcto para la investigacioacuten
La seleccioacuten de una turbina tipo Rushton radica en que este tipo de
agitador de pala plana se considera como el ideal para la realizacioacuten de
fermentaciones Dado que las paletas de heacutelices Rushton son planas y
colocadas verticalmente a lo largo del eje de agitacioacuten producen un flujo radial
unidireccional que permite una alta difusioacuten de un gas en un liacutequido por lo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 81
comuacuten son utilizadas en la fermentacioacuten de liacuteneas celulares que requieren altas
tasas de oxiacutegeno tales como las levaduras bacterias y algunos hongos
Las laacuteminas deflectoras fueron incorporadas pues aunque a velocidades
muy bajas un agitador de paletas produce una agitacioacuten suave inclusive en un
tanque sin laacuteminas deflectoras cuando son necesarias velocidades elevadas
se requiere la incorporacioacuten de dichas laacuteminas para aumentar la turbulencia de
lo contrario el liacutequido se mueve como un remolino que gira alrededor del
tanque con velocidad elevada pero con poco efecto de mezcla
74 Tiempo de fermentacioacuten
El tiempo de fermentacioacuten empleado en esta investigacioacuten es
significativamente inferior al empleado por otros autores que hablan de un
promedio de 72 horas Es importante sentildealar que 18 horas es el tiempo
suficiente para que el pH del medio de cultivo descienda a cerca de 60
Valores de pH inferiores a este han demostrado ser perjudiciales pues decae
el consumo de aacutecido ciacutetrico se detiene en gran medida la polimerizacioacuten del γ-
PGA y la concentracioacuten tiende a disminuir con el paso del tiempo
Para poder aumentar el periacuteodo de fermentacioacuten se requeririacutea un
sistema de ajuste de pH que opere bajo condiciones del presioacuten mismo que no
se tuvo disponible Es probable que si se prolongara el tiempo de fermentacioacuten
dentro del biorreactor los rendimientos al cabo de 48 o 72 horas seriacutean un
poco mayores siempre y cuando se ajuste el pH en el valor de 65 como
recomiendan Cromwick y colaboradores (1995)
En nuestro caso el incremento del tiempo de fermentacioacuten sin
regulacioacuten del pH de 18 horas a 36 horas mostroacute un incremento miacutenimo en la
productividad (de 025 gL) pero si un cambio en la composicioacuten del γ-PGA
pues el pico de elucioacuten del poliacutemero se desplazoacute levemente hacia un valor de
tiempo mayor lo que podriacutea indicar una degradacioacuten parcial del poliacutemero
inicialmente producido Dichos datos se presentan en la figura 12
Nuestros resultados contradicen lo sentildealado por otros autores quienes
obtienen los mayores rendimientos entre las 48 y 96 horas Birrer y
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 82
colaboradores (1995) observaron que Bacillus licheniformis ATCC9945a
alcanza la fase estacionaria a las 24 horas tiempo en el cual muy poco γ-PGA
ha sido formado y por consiguiente la mayor formacioacuten de γ-PGA acontece
entre las 24 y las 96 horas Estos resultados coinciden con los reportados por
Troy (1973) pero difieren a los observados por Goto y Kunioka (1992) con
Bacillus subtilis IFO3335 donde el mayor rendimiento se obtuvo desde las 24 y
hasta las 40 horas Estas diferencias podriacutean deberse a aspectos maacutes
relacionados con los voluacutemenes de fermentacioacuten empleados Por ejemplo para
el caso de Yoon y colaboradores (2000) estos alcanzaron rendimientos de 35
gL con un periacuteodo de fermentacioacuten maacuteximo de 35 horas indicando un
agotamiento del aacutecido ciacutetrico a las 20 horas en su caso el volumen empleado
fue de 1 litro de medio de cultivo
Figura 12 Cromatograma a las 18 (a) y 36 (b) horas de fermentacioacuten con Bacillus licheniformis
ATCC9945a
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 83
75 Concentracioacuten del inoacuteculo del reactor y relacioacuten de escalamiento
Un punto vital para una adecuada fermentacioacuten es la concentracioacuten de
inoacuteculo aspecto que es sentildealado por Troy Cromwick y colaboradores a lo
largo de sus investigaciones pero que no detallan ni cuantifican
adecuadamente o al menos no lo reportan En nuestro caso se empleoacute un
inoacuteculo madre con una absorbancia de 25 o mayor y un inoacuteculo del reactor con
un valor de absorbancia de 120 aproximadamente con el propoacutesito de asiacute
logran estandarizar las condiciones de inoacuteculo Aunque este aspecto no fue
cuantificado a manera cualitativa si se observoacute un importante efecto de este
aspecto (concentracioacuten inicial) sobre la cantidad de γ-PGA obtenido y el tiempo
requerido Esto puede resultarnos obvio teniendo en cuenta una descripcioacuten no
estructurada del crecimiento microbiano pero podriacutea resultar maacutes compleja de
analizar si consideramos que la produccioacuten del γ-PGA estaacute afectada por
paraacutemetros de otra naturaleza maacutes allaacute de la disposicioacuten de nutrientes como
por ejemplo de una estructura celular particular o una relacioacuten de percepcioacuten
de quoacuterum dada Debemos recordar que la percepcioacuten de quoacuterum es un
mecanismo de regulacioacuten de la expresioacuten geneacutetica en respuesta a la densidad
de poblacioacuten celular Las ceacutelulas involucradas producen y excretan sustancias
llamadas autoinductores que sirven de sentildeal quiacutemica para inducir la expresioacuten
geneacutetica colectiva De Vizio (2011) sentildeala que en Bacillus licheniformis NCIMB
8874 la produccioacuten de lichenysin γ-PGA y algunas proteasas extracelulares
estaacute vinculado con los genes comQXPA mismo operoacuten que regula la
percepcioacuten de quoacuterum en Bacillus subtilis
De igual manera la relacioacuten de escalamiento aplicada fue de 16
ligeramente inferior a la que teoacutericamente se utiliza con mayor frecuencia de
110 Aunque este iacutendice no fue objeto de estudio su ajuste tambieacuten afecta de
manera directa los rendimientos obtenidos
La optimizacioacuten de la concentracioacuten del inoacuteculo la relacioacuten de
escalamiento y su frecuencia constituyen aspectos que deben estudiarse con
mayor profundidad para su propia optimizacioacuten pues su efecto sobre esta
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 84
fermentacioacuten y su rendimiento es bastante significativo Esta afirmacioacuten
adquiere validez cuando vemos que la produccioacuten del γ-PGA no es un
metabolito primario que se forme durante la fase de crecimiento exponencial
sino maacutes bien al inicio de la etapa estacionaria como indica Goto y Kunioka
(antildeo) o durante toda la etapa estacionaria tal y como lo sentildealan tanto Troy
(antildeo) como Birrer y colaboradores (1994) A esto debemos agregarle tambieacuten
lo anteriormente sentildealado referente a la concentracioacuten idoacutenea que produce la
percepcioacuten de quoacuterum responsable de direccionar el metabolismo de la
comunidad microbiana hacia la siacutentesis del γ-PGA
Conociendo la dependencia de esta biosiacutentesis de la concentracioacuten de
oxiacutegeno disuelto en el medio y partiendo del hecho de que al inicio de la fase
estacionaria la concentracioacuten celular seraacute lo suficientemente alta para poner el
riesgo el mantenimiento de las condiciones aeroacutebicas en el biorreactor pero lo
justa para una adecuada siacutentesis del γ-PGA un inoacuteculo con una alta
concentracioacuten inicial de ceacutelulas podriacutea ayudar a obtener un mayor rendimiento
en un tiempo de fermentacioacuten menor o producir la respuesta de percepcioacuten de
quoacuterum (generalmente se trata de la liberacioacuten de un polipeacuteptido sentildeal) en un
tiempo menor con la consiguiente produccioacuten del γ-PGA
76 Determinacioacuten del coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa
El coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno kLa es un valor de
suma importancia para el escalamiento de bioprocesos en particular cuando
nos referimos a fermentaciones aeroacutebicas o cultivos de organismos o ceacutelulas
en condiciones de metabolismo aeroacutebico En nuestro caso un adecuado
coeficiente volumeacutetrico de transferencia de oxiacutegeno es garantiacutea que las
condiciones aeroacutebicas se sostendraacuten a lo largo del proceso de fermentacioacuten de
modo que no se produzcan desviacuteos metaboacutelicos indeseados o en el peor de
los casos el inicio del metabolismo anaerobio y la consecuente produccioacuten de
aacutecido aceacutetico
Los valores de kla obtenidos fueron de 0026 s-1 y 0025 s-1 para el
matraz y el bioreactor respectivamente Dichos valores por si mismos nos
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 85
indican poco si no determinamos la tasa de consumo de oxiacutegeno requerida
para el cultivo aeroacutebico de Bacillus licheniformis Doran (1995) reporta una
velocidad de consumo de oxiacutegeno m02 para el cultivo aeroacutebico de Bacillus
licheniformis de 231 x 10-5 gO2 g-1cel s
-1 si la concentracioacuten de ceacutelulas X en el
reactor es de 20 gL (determinado experimentalmente como el valor final
alcanzado en matraces con alta concentracioacuten de γ-PGA) la tasa de consumo
de oxiacutegeno (OUR) MO2 seraacute igual a Xm02 es decir 46 x 10-4 mgO2mL-1s-1 A
partir de estos datos y conociendo que kla = MO2ΔcA ΔcA = cA ndash cA sabiendo
que presioacuten atmosfeacuterica cA = 801 mgL a 30 ordmC y el valor cA en el biorreactor
a 30 ordmC es 74 mgL obtenemos un valor de kla del orden de 0062 s-1 Dicho
valor corresponde al valor teoacuterico que seriacutea necesario para mantener el cultivo
con el suministro adecuado y suficiente de oxiacutegeno y que como puede verse
es 25 veces mayor al kla real lo que indica que cuando el cultivo alcance la
maacutexima concentracioacuten celular de 20 gL las condiciones del cultivo no seraacuten
suficientes para un metabolismo cien por ciento aeroacutebico
Tiene sentido entonces que los rendimientos alcanzados en matraz sean
significativamente mayores que los mejores rendimientos obtenidos en
bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica Dado que el cultivo en matraz incorporaba
uacutenicamente 100 mL de medio de cultivo el microorganismo es capaz de
alcanzar una mayor concentracioacuten en una menor unidad de tiempo lo que le
permite alcanzar una mayor concentracioacuten de poliacutemero durante las 26 horas de
cultivo (8 iniciales + 18)
Por su parte para el caso del biorreactor el crecimiento oacuteptimo
probablemente demore maacutes en alcanzarse por lo cual el tiempo que transcurre
entre el alcance de la concentracioacuten limitante de 8 gL (concentracioacuten a la cual
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y la tasa de consumo de oxiacutegeno
(OUR) se igualan) y la concentracioacuten oacuteptima es lo suficiente como para afectar
los rendimientos de γ-PGA Esto resulta evidente al comparar los resultados de
matraz con los de bioreactor a presioacuten atmosfeacuterica (0 bar relativos) donde la
diferencia en productividad entre ambos es de 43 gL de γ-PGA Dicha
diferencia se explica porque mientras que la concentracioacuten del inoacuteculo madre
mostraba una absorbancia promedio de 25 la del inoacuteculo empleado para el
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 86
biorreactor era de 120 (100 ml de medio + inoacuteculo madre creciendo durante 8
horas) es decir praacutecticamente la mitad por lo cual la concentracioacuten inicial de
ceacutelulas era significativamente menor para el biorreactor en comparacioacuten con el
matraz
77 Efecto de la concentracioacuten de γshyPGA sobre la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
En condiciones estaacuteticas el contenido de γ-PGAdemostroacute reducir
considerablemente la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto en el medio de cultivo
pasando de 74 mgL a 440 mgL a una concentracioacuten del 20 en γ-PGA
Este fenoacutemeno puede deberse al incremento de la viscosidad por la
presencia del poliacutemero en el caldo de cultivo Dicha apreciacioacuten seguramente
afecta de manera negativa la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) pues
reduce tanto cA como cA sin embargo la determinacioacuten del valor de c
A de una
solucioacuten compuesta por sales γ-PGA y productos del metabolismo microbiano
es imposible de determinar teoacutericamente con certeza como para poder
cuantificar la magnitud de reduccioacuten de la OTR numeacutericamente De igual
manera el valor de kLa tambieacuten se ve afectado pues es sabido que a mayor
viscosidad mayor resistencia a la transferencia lo que reduce el valor de este
coeficiente
Asiacute mismo esta reduccioacuten en la concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto
podriacutea deberse en parte a la naturaleza anioacutenica del poliacutemero y no solamente
al incremento de la viscosidad La solubilidad se ve afectada por la fuerza
ioacutenica por lo cual una solucioacuten con una concentracioacuten elevada de un poliacutemero
polianioacutenico como el γ-PGA probablemente muestre una importante reduccioacuten
en la solubilidad maacutexima (concentracioacuten de saturacioacuten) del oxiacutegeno en la
misma(Schumpe et al 1978)
Queda claro que dada esta reduccioacuten en la solubilidad de oxiacutegeno al
incrementar el contenido de γ-PGA durante la fermentacioacuten ya sea por la
naturaleza viscosa del biopoliacutemero o por su caraacutecter polianioacutenico la tasa de
transferencia de oxiacutegeno inicial y el valor de kLa se van reduciendo a lo largo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 87
del tiempo lo que dificulta auacuten maacutes garantizar las condiciones de oxigenacioacuten
oacuteptimas para este bioproceso Esto lo podemos explicar pues si tenemos que
OTR = kLa(cA-cA)
dado que al aumentar el contenido de γ-PGA ocurre una reduccioacuten en el valor
de kLa por accioacuten del incremento de la viscosidad (hecho que es
completamente cierto) y al aumentar la concentracioacuten de γ-PGA tambieacuten se
reduce tanto el valor de cA como el de cA (ya sea por efecto de la viscosidad o
de la naturaleza anioacutenico del poliacutemero) la OTR ve su magnitud evidente e
inevitablemente reducida dado que la misma es una relacioacuten de producto entre
ambos factores kLa y (cA ndashcA) Esto podriacutea explicar porque a voluacutemenes de
cultivo de 600 mL (en biorreactor) los rendimientos son mucho menores que en
voluacutemenes de cultivo de 100 ml (matraz) pues probablemente esta caiacuteda en la
OTR sea maacutes acentuada y criacutetica para los microorganismos cuando sucede a
voluacutemenes mayores donde mantener las condiciones de mezcla perfecta y una
alta concentracioacuten de oxiacutegeno disuelto resultan maacutes dificultosas por lo que el
microorganismo es incapaz de crecer y alcanzar la concentracioacuten idoacutenea para
una maacutexima produccioacuten
78 Efecto de la presioacuten sobre la productividad de γshyPGA
La concentracioacuten de γ-PGA alcanzada al final de las 18 horas de
fermentacioacuten se vio afectada por la presioacuten Asiacute hasta los 103 bar a mayor
presioacuten mayor concentracioacuten de γ-PGA por encima de este valor de presioacuten la
concentracioacuten de γ-PGA disminuye
Esto puede explicarse por dos factores 1) el efecto de la presioacuten sobre
la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) y 2) impacto sobre la integridad y
viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γ-PGA
781 Efecto de la presioacuten sobre la OTR
La OTR se ve afectada tanto por el coeficiente volumeacutetrico de
transferencia de oxiacutegeno kLa asiacute como por la diferencia entre la concentracioacuten
de saturacioacuten y la concentracioacuten real en la fase liacutequida (cA-cA) El coeficiente kL
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 88
es empiacuterico y su valor depende principalmente de factores tales como la
hidrodinaacutemica del sistema la turbulencia y su geometriacutea
Teoacutericamente kL se puede definir como kL = DABδ donde DAB es la
difusividad de A en B y δ es el espesor de la peliacutecula estancada seguacuten la
teoriacutea de peliacutecula para la transferencia de materia La difusividad en liacutequidos
depende en gran medida de la temperatura (afecta el coeficiente de difusioacuten) y
la concentracioacuten de solutos pero muy poco de la presioacuten (Diacuteaz 2011) En
nuestro caso podriacuteamos suponer que la presioacuten tiene poco efecto sobre kLa
pues tampoco es de esperar un cambio producto de la presioacuten en el aacuterea de
burbujas (a) producida por la agitacioacuten mecaacutenica auacuten maacutes cuando vemos el
hecho de que los ensayos llevados a cabo no contaron con un sistema de
aireacioacuten o burbujeo especiacutefico salvo aquel llevado a presioacuten atmosfeacuterica (0
bar relativa) y debidamente identificado como Aireacioacuten
Asiacute entonces tenemos en el segundo componente de la foacutermula la
diferencia (cA-cA) un punto de particular intereacutes pues efectivamente la
concentracioacuten de saturacioacuten y la concentracioacuten real variacutean con la presioacuten A
pesar de carecer de una sonda de oxiacutegeno disuelto directamente incorporada
al biorreactor y capaz de operar a presioacuten se determinoacute mediante transferencia
(con el sistema cerrado) la concentracioacuten real de oxiacutegeno en el medio de
cultivo a distintas presiones Tales concentraciones y las concentraciones de
saturacioacuten a cada presioacuten se presentan en el graacutefico 14
Para determinar el valor de las distintas concentraciones de saturacioacuten
al trabajar a presiones distintas a la atmosfeacuterica se realizoacute la siguiente
correccioacuten (Montoya amp Bermuacutedez 2003) para el valor de la solubilidad del
oxiacutegeno en agua
Ley de Henry
a 1 atm
Para una presioacuten P distinta a 1 atm tenemos que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 89
en mgL
Donde
C(S) = valor de solubilidad a 1 atm (mgL)
P = presioacuten de operacioacuten (atm)
T = temperatura de operacioacuten (K)
Graacutefico 14 Concentraciones de oxiacutegeno de saturacioacuten y en fas liacutequida a diferentes presiones
en medio de cultivo E sin crecimiento bacteriano
80
153
227
324
422
6681
141154
178
141
724857
1703
2438
y = 48525x + 68875
y = 14191x + 80039
y = 93382x + 11163
000
500
1000
1500
2000
2500
3000
00
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 05 1 15 2 25 3
Concentracioacuten
Presioacuten (bar)
CONCENTRACIOacuteN DE SATURACIOacuteN CONCENTRACIOacuteN EN FASE LIacuteQUIDA DIFERENCIA
Aunque estos valores deben repetirse con una sonda de oxiacutegeno
disuelto interna (dentro del biorreactor) y bajo una metodologiacutea maacutes pertinente
preliminarmente puede observarse que la diferencia (cA-cA) aumenta al
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 90
aumentar la presioacuten y dado que OTR = kLa(cA-cA) al aumentar dicha
diferencia la tasa de transferencia de oxiacutegeno (OTR) deberiacutea ser mayor Este
incremento de la OTR podriacutea explicar el porqueacute del raacutepido crecimiento
microbiano y la produccioacuten precoz de γ-PGA despueacutes de 18 horas de cultivo
en comparacioacuten con las entre 48 y 96 horas reportadas por otros autores asiacute
como el aumento del rendimiento al aumentar la presioacuten de los 0 bar relativos
(a presioacuten atmosfeacuterica) hasta los 103 bar relativos
782 Impacto sobre la integridad y viabilidad de las proteiacutenas involucradas en la biosiacutentesis del γshyPGA
Al superar los 103 bar relativos el rendimiento en γ-PGA decae
nuevamente Si consideramos un efecto positivo de la presioacuten sobre la OTR
como sentildealamos anteriormente esto no deberiacutea ocurrir Sin embargo al
someter las ceacutelulas a condiciones de presioacuten desconocemos el efecto que
dicha presioacuten puede ejercer sobre los microorganismos y sus rutas
metaboacutelicas asiacute como sobre la estructura de algunas biomoleacuteculas como por
ejemplo proteiacutenas
Meersman y Heremans (2008) sentildealan que el efecto de la presioacuten sobre
el crecimiento de los microorganismos puede explicarse por tres efectos
principales 1) Variaciones en el plegamiento y agregacioacuten de las proteiacutenas 2)
Variaciones en el estado de la membrana celular y 3) Variaciones en el
contenido de proteiacutenas asociadas a la membrana celular Estos aspectos son
de peculiar consideracioacuten pues la γ-PGA sintetasa es un complejo enzimaacutetico
formado por al menos tres unidades enzimaacuteticas distintas y que se encuentra
asociado a la membrana celular de Bacillus licheniformis
En lo referente a las proteiacutenas se sabe que su desnaturalizacioacuten se
produce por efecto de una reduccioacuten en su volumen producto de un cambio
configuracional probablemente de la estructura terciaria Asiacute tenemos que si el
volumen inicial de una proteiacutena viene dado por Vi = Vatomos + Vcavidades +
Vhidratacioacuten si en condiciones de presioacuten ocurre un cambio en el volumen de la
proteiacutena tal que ΔV = ΔVcavidades + ΔΔVhidratacioacuten(el volumen de los aacutetomos no
tiene por queacute variar con la presioacuten) la exposicioacuten de los grupos cargados o
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 91
hidrofoacutebicos de la proteiacutena al agua pueden conllevar a un cambio en la
estructura secundaria y terciaria de modo que la actividad de la proteiacutena se
vea perjudicada parcial o totalmente Esto se debe a que un aumento en la
presioacuten rompe las interacciones hidrofoacutebicas donde las interacciones proteiacutena-
proteiacutena son sustituidas por interacciones proteiacutena-agua particularmente
mediante puente de hidroacutegeno El incremento de la presioacuten podriacutea afectar la
conformacioacuten de alguno o algunos de los componentes del complejo
enzimaacutetico γ-PGA sintetasa lo que sin duda alguna se traduciriacutea en un menor
rendimiento en γ-PGA durante la fermentacioacuten Este posible efecto negativo de
la presioacuten sobre una de las enzimas involucradas en el proceso de biosiacutentesis
del γ-PGA se reafirma cuando vemos como variacutea la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA al aumentar la presioacuten aspecto que se discutiraacute con mayor detalle
maacutes adelante De hecho Ashiuchi y colaboradores (2004) sentildealan que el
complejo enzimaacutetico PgsBCA (γ-PGA sintetasa) es imposible de aislar en su
estado activo debido precisamente a su alta inestabilidad y elevada
hidrofobicidad
Por su parte la membrana celular al tratarse de una bicapa fosfolipiacutedica
es susceptible a sufrir cambios de fase producto de la temperatura o la presioacuten
como por ejemplo la transicioacuten gel-liacutequido El incremento de la presioacuten al igual
que sucede con la temperatura concede mayor fluidez a las bicapas lipiacutedicas
Asiacute en nuestro caso un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea permitir
una mayor difusioacuten de oxiacutegeno al interior celular lo que podriacutea afectar el
crecimiento bacteriano si por ejemplo se formase maacutes especies reactivas
toacutexicas de oxiacutegeno en el interior celular o si cierta maquinaria celular como la
misma γ-PGA sintetasa no fuese capaz de acoplarse adecuadamente en una
membrana con mayor fluidez
En lo referente a la interaccioacuten membrana celular-proteiacutenas es
importante destacar que entre el 20 y el 40 de las proteiacutenas de una ceacutelula
bacteriana suelen estar asociadas a esta estructura Como indicamos
anteriormente un cambio en la fluidez de la membrana podriacutea afectar el
contenido concentracioacuten y capacidad de anclaje de las proteiacutenas a la
membrana celular El complejo enzimaacutetico γ-PGA sintetasa al tratarse de una
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 92
proteiacutena de membrana podriacutea no acoplarse de manera efectiva a la membrana
celular modificada bajo condiciones de presioacuten o ser liberada al medio de
cultivo lo que afectariacutea negativamente la produccioacuten de γ-PGA Estas
suposiciones podriacutean explicar el porqueacute de la gran cantidad de espuma
generada durante algunas fermentaciones a presioacuten (concretamente en
aquellas a una presioacuten superior a los 103 bar) a pesar de su menor
concentracioacuten de γ-PGA y teniendo presente que en las fermentaciones
microbianas la espuma suele estar constituida mayoritariamente por proteiacutenas
la presioacuten podriacutea estar favoreciendo la liberacioacuten de estas proteiacutenas al caldo de
cultivo y la consecuente formacioacuten abundante de espuma Este fenoacutemeno ya
ha sido reportado en otros microorganismos como Salmonella enterica donde
el tratamiento con presioacuten conllevaba a la peacuterdida de gran parte de sus
proteiacutenas de membrana y su consecuente liberacioacuten al medio de cultivo
(Meersman amp Heremans 2008) Esto se ve respaldado con las observaciones
de Ashiuchi y colaboradores (2004) quienes adicionaron detergentes como el
Tween20 y Triton X-114 (que modifican la estabilidad de la membrana celular y
favorece la liberacioacuten de las proteiacutenas asociadas a ella) a cultivos de Bacillus
spp productores de γ-PGA Ellos observaron una peacuterdida total de la capacidad
de siacutentesis del γ-PGA capacidad que no se recuperaba ni siquiera removiendo
la totalidad de dichos detergentes mediante diaacutelisis con lo cual concluyeron
que es indispensable que el complejo γ-PGA sintetasa se encuentre asociado a
la membrana celular para ser bioloacutegicamente activo
79 Efecto de la intensidad de agitacioacuten sobre la productividad γshyPGA
Un incremento de la intensidad de agitacioacuten afectariacutea positivamente el
valor de kLa incrementaacutendolo al aumentar el aacuterea de intercambio mediante una
mayor ruptura de las burbujas lo que aumenta el aacuterea de intercambio por
unidad de volumen Sin embargo existen liacutemites para la velocidad de agitacioacuten
esto debido al dantildeo ocasionado a los organismos debido a un esfuerzo
cortante excesivo A pesar de que la turbina Rushton es el impulsor de flujo
axial maacutes recomendado y maacutes eficiente para generar una mezcla perfecta de
alto perfil hidrodinaacutemico un bajo esfuerzo cortante y una alta distribucioacuten un
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 93
exceso de agitacioacuten bajo condiciones de presioacuten es evidentemente perjudicial
Es probable que al aplicar presioacuten positiva sobre el cultivo la membrana celular
se encuentre en un estado de fluidez mayor al que presentariacutea a presioacuten
atmosfeacuterica asiacute mismo la presencia de glicerol en el medio de cultivo modifica
la composicioacuten lipiacutedica de la membrana favoreciendo la salida del γ-PGA al
exterior celular al aumentar de igual manera su fluidez Esto queda demostrado
por nuestros resultados a velocidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm
donde ocurre una reduccioacuten de la productividad conforme se aumenta la
agitacioacuten De igual manera la excesiva formacioacuten de espuma que se genera a
intensidades de agitacioacuten superiores a 300 rpm podriacutea indicar la ruptura celular
y la liberacioacuten de componentes celulares y macromoleacuteculas al caldo de
fermentacioacuten Estas observaciones contradicen lo reportado por otros autores
(Yoon et al 2000) quienes indican velocidades de agitacioacuten oacuteptimas de hasta
1000 rpm a presioacuten atmosfeacuterica para un biorreactor de 24 L y un volumen
efectivo de cultivo de 1 L aunque no se brindan mayor detalle en lo referente al
tipo de turbina empleada
710 Efecto de la presioacuten sobre la composicioacuten enantiomeacuterica del γshyPGA
El cambio de la composicioacuten enantiomeacuterica del γ-PGA producto de la
presioacuten fue un resultado inesperado pues tradicionalmente se habiacutea sentildealado
a la concentracioacuten del ioacuten Mn2+ en el medio de cultivo como el principal
responsable de controlar este aspecto Es importante destacar el hecho que
dicho cambio en la composicioacuten no es parcial o escalonado sino que por el
contrario el hecho de aplicar presioacuten durante la fermentacioacuten invierte
praacutecticamente los contenidos de aacutecido D-glutaacutemico y aacutecido L-glutamico de 87
y 13 respectivamente a presioacuten atmosfeacuterica (cultivo en matraz) a 17 y 83
respectivamente a una presioacuten relativa de 103 bar En algunos casos el
contenido de aacutecido D-glutaacutemico fue praacutecticamente 0
Efectivamente se sabe que el complejo γ-PGA sintetasa es capaz de
aceptar tanto aacutecido D-glutaacutemico como aacutecido L-glutaacutemico aunque todaviacutea se
desconoce la arquitectura bioloacutegica de esta sintetasa Igualmente se sabe que
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 94
es el componente PgsB el mayormente responsable de la cataacutelisis enzimaacutetica
(reaccioacuten de elongacioacuten del γ-PGA) (Ashiuchi 2010) Una hipoacutetesis que podriacutea
explicar estos resultados es que bajo presioacuten la estructura de esta proteiacutena se
modifique parcialmente (tanto la estructura de la proteiacutena propiamente dicha
como la estructura en funcioacuten de su anclaje a la membrana celular) lo
suficiente como para reducir su afinidad por el aacutecido D-glutaacutemico pero sin
afectar su afinidad por el aacutecido L-glutaacutemico ni conllevar a una
desnaturalizacioacuten de la proteiacutena y la consiguiente peacuterdida total de la actividad
enzimaacutetica Dado que es poco lo que se conoce de la estructura y mecanismo
de accioacuten de esta proteiacutena PgsB es imposible poder determinar con mayor
detalle el coacutemo pueden darse este cambio en la proteiacutena aunque casos
similares se observan durante la desnaturalizacioacuten de proteiacutenas por
temperatura donde las enzimas que operan sobre muacuteltiples sustratos no
pierden su capacidad enzimaacutetica de manera total sobre todos ellos sino que
inicialmente acontece una peacuterdida de afinidad diferenciada seguacuten el sustrato
hasta llegar al punto de desnaturalizacioacuten total donde se pierde toda actividad
enzimaacutetica para todos los sustratos
De igual manera es conocido que existe en Bacillus licheniformis una
enzima racemasa de naturaleza citosoacutelica responsable de transformar el aacutecido
L-glutaacutemico en aacutecido D-glutaacutemico podriacutea entonces tambieacuten asumirse alguacuten
efecto de la presioacuten sobre la actividad de la misma Sin embargo el hecho de
que esta enzima no esteacute asociada a una membrana celular (las proteiacutenas
asociadas a membrana celular tienden a ser maacutes vulnerables a los cambios de
presioacuten por la complejidad e indispensabilidad de su estructura terciaria sobre
su funcioacuten y su anclaje) sea una enzima de un uacutenico dominio y a que
experimentalmente el contenido de aacutecido D-glutaacutemico inclusive a la maacutexima
presioacuten (241 bar) no es cero hacen suponer que la misma se encuentra
bioloacutegicamente activa bajo las condiciones de presioacuten evaluadas
Estos resultados son de suma importancia pues para aplicaciones
biomeacutedicas y farmaceacuteuticas es necesario que el γ-PGA presente un alto
contenido en aacutecido L-glutaacutemico isoacutemero que es reconocido por el organismo
humano El efecto de la presioacuten de fermentacioacuten sobre esta composicioacuten
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 95
enantiomeacuterica constituye un descubrimiento que pueda facilitar el empleo del γ-
PGA en medicina y que puede ser clave en el disentildeo de un proceso productivo
optimizado para tal fin
711 Peso molecular del γshyPGA En lo correspondiente al peso molecular del γ-PGA se observa que el
tamantildeo del poliacutemero es grande aunque no se observa ninguna tendencia en
los datos que pueda suponer alguacuten efecto de la presioacuten sobre el peso
molecular del poliacutemero Es importante sentildealar que la columna cromatograacutefica
empleada es incapaz de resolver moleacuteculas del alto peso molecular por lo
cual aunque si bien los resultados obtenidos resulten uacutetiles a nivel
comparativo dichos resultados deben tomarse con precaucioacuten Para un mejor
anaacutelisis seriacutea necesario emplear una columna capaz de resolver altos pesos
moleculares
Es importa sentildealar ademaacutes que tal y como se comentoacute anteriormente y
como se muestra en la figura 12 se observa una reduccioacuten del peso molecular
al prolongar el tiempo de fermentacioacuten hasta las 36 horas Para el caso del
reactor AHCJ32 al prolongar el tiempo de fermentacioacuten por 18 horas maacutes se
nota una reduccioacuten en la fraccioacuten de mayor peso molecular y un incremento en
la de menor sin que haya un cambio importante en el rendimiento global Esto
podriacutea deberse a que Bacillus licheniformis ATCC9945a posee enzimas
capaces de hidrolizar el γ-PGA y emplearlo como fuente de carbono Asiacute
mismo dicha observacioacuten sentildeala que si es necesario prolongar el tiempo de
fermentacioacuten es requerido realizar ajustes pues parece ser que la prolongacioacuten
por siacute misma uacutenicamente no es garantiacutea de una mejora en el rendimiento del
proceso fermentativo
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 96
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 97
10 CONCLUSIONES
De la elaboracioacuten de la presente investigacioacuten se pueden extraer las
siguientes conclusiones principales
1) El rendimiento promedio en γ-PGA para el cultivo en matraz fue
superior a los 45 gL Dicho rendimiento es el mayor que se haya
reportado hasta la fecha para Bacillus licheniformis ATCC9945a lo
que convierte a esta cepa en una de las que mejor rendimiento
maacuteximo reporta para la biosiacutentesis de dicho poliacutemero natural
2) Un mecanismo eficiente para la conservacioacuten de cultivos de Bacillus
licheniformis ATCC9945a en un estado competente de produccioacuten
de γ-PGA es el congelamiento de ceacutelulas vegetativas a una
temperatura de -80 ordmC Es importante que la absorbancia de las
muestras congeladas sea superior a 25 lo que garantiza una alta
concentracioacuten de ceacutelulas
3) Dada la naturaleza del γ-PGA y su viscosidad el aumento de su
concentracioacuten en el caldo de cultivo a lo largo del tiempo de
fermentacioacuten afecta de manera negativa la tasa de transferencia de
oxiacutegeno disminuyeacutendola paulatinamente El cambio a condiciones
anaeroacutebicas conlleva a la detencioacuten de la biosiacutentesis del γ-PGA y el
consecuente inicio de un metabolismo netamente anaeroacutebico
4) Bacillus licheniformis ATCC9945a es capaz de crecer eficientemente
a presiones de hasta 242 bar relativos no vieacutendose afectado desde
el punto de vista de viabilidad por el incremento de la variable
presioacuten de fermentacioacuten
5) La presioacuten de fermentacioacuten afecta de manera significativa la
productividad de Bacillus licheniformis ATCC9945a en γ-PGA
6) El incremento de la presioacuten de fermentacioacuten hasta los 103 bar
relativos aumenta la concentracioacuten de γ-PGA en el caldo de cultivo
seis veces (de 218 gL a 1334 gL) en comparacioacuten a los
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 98
rendimientos obtenidos a presioacuten atmosfeacuterica para un periacuteodo de
proceso de 18 horas
7) A presiones de fermentacioacuten superiores a los 103 bar la
productividad decae en comparacioacuten a la obtenida a dicha presioacuten
sin embargo la misma sigue siendo superior a la obtenida a presioacuten
atmosfeacuterica para un periacuteodo de proceso de 18 horas
8) El aumento de la presioacuten probablemente incremente la tasa de
transferencia de oxiacutegeno al incrementar la concentracioacuten de
saturacioacuten del mismo en el medio de cultivo lo que genera un
gradiente de concentracioacuten que permite una mayor transferencia
9) Presiones superiores a 103 bar probablemente afecten estructuras
celulares o biomoleacuteculas tales como las membranas celulares y las
proteiacutenas (γ-PGA sintasa) lo que tiene un efecto perjudicial sobre la
biosiacutentesis de γ-PGA
10) A una temperatura de 30 ordmC y a una presioacuten de 103 bar la
intensidad de agitacioacuten oacuteptima es de 300 rpm Una magnitud de
agitacioacuten mayor produce el dantildeo celular posiblemente por un exceso
de tensioacuten cortante
11) La presioacuten de fermentacioacuten modifica la composicioacuten enantiomeacuterica
del γ-PGA A presioacuten atmosfeacuterica el γ-PGA estaacute compuesto
mayoritariamente por aacutecido D-glutaacutemico A presiones entre 052 y
242 bar dicha composicioacuten se revierte siendo el aacutecido L-glutaacutemico
el isoacutemero maacutes comuacutenmente presente en el γ-PGA
12) La biosiacutentesis de γ-PGA a presioacuten constituye una forma eficiente de
producir un biopoliacutemero mayoritariamente conformado por residuos
de aacutecido L-glutaacutemico aspecto de vital importancia para su aplicacioacuten
biomeacutedica dado que es este isoacutemero del aacutecido glutaacutemico es que es
reconocido y asimilado por el organismo humano
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 99
13) Aunque la modificacioacuten de la presioacuten de fermentacioacuten nunca ha sido
una variable importante en el estudio de los rendimientos para
distintos bioprocesos la presente investigacioacuten demuestra que la
modificacioacuten de dicha variable no soacutelo permite mejorar el
rendimiento global del proceso sino que tambieacuten puede conllevar a
la modificacioacuten del producto final lo que significariacutea una nueva rama
para la investigacioacuten en el disentildeo de bioprocesos de intereacutes
industrial
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 100
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 101
11 AGRADECIMIENTOS
Un agradecimiento especial al profesor Jordi Bou por brindarme la
oportunidad de trabajar a su lado en este proyecto por el seguimiento y
asesoriacutea brindada a lo largo del mismo que nos permitioacute alcanzar nuestros
planteamientos y objetivos Espero que los aportes brindados con la presente
investigacioacuten permitan un mejor desarrollo en el futuro de estas temaacuteticas tan
novedosas biopoliacutemeros y fermentaciones bajo condiciones de presioacuten
positiva
Igualmente a la Ing Alejandra Hernaacutendez por la colaboracioacuten y asistencia
brindada durante esta investigacioacuten fue un apoyo importante durante el
desarrollo de las metodologiacuteas y distintas pruebas que se requirieron a lo largo
de esta investigacioacuten
A la Agencia Espantildeola de Cooperacioacuten Internacional para el Desarrollo
(AECID) y a Casa Ameacuterica Cataluntildea que me brindaron la oportunidad de cursar
este programa de maacutester a traveacutes de su programa de extensioacuten de becas a
ciudadanos extranjeros ha sido una oportunidad de crecimiento personal y
profesional que alcanza su punto maacuteximo con la elaboracioacuten de la presente
investigacioacuten El conocimiento adquirido sin duda alguna seraacute un valioso
compantildeero en mi desempentildeo profesional futuro
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 102
Fermentacioacuten de bacterias del geacutenero Bacillus en altas concentraciones de oxiacutegeno 103
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