CVI-08
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BIOSÍNTESIS DE 3,4-DIHIDROXI-L-FENILALANINA (L-DOPA) EN ESCHERICHIA COLI A PARTIR DE GLUCOSA. Ana Joyce Muñoz, Alfredo Martínez, Francisco Bolívar, Guillermo Gosset. Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis, Instituto de Biotecnología, UNAM. Av. Universidad 2001, Col. Chamilpa C.P. 62210 Cuernavaca, Morelos Apdo. Postal 510-3 C.P. 62250; Fax:(+52) 7773291648; e-mail: [email protected]. Palabras clave: L-Tirosina, L-DOPA, 4-HPA 3-hidroxilasa. Introducción. La tirosina (L-Tir) es un aminoácido aromático (AA) cuyo principal uso es como materia prima en la síntesis de 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA), una droga usada para tratar la enfermedad del Parkinson. Se han aplicado diversas estrategias de DNA recombinante e ingeniería de vías metabólicas (IVM) para la producción de compuestos aromáticos, a partir de glucosa, en microorganismos como Escherichia coli (E. coli). Para producir L-Tir, ha sido necesario eliminar los controles que éste AA ejerce sobre la vía general de síntesis de AA (vía del SHIK) así como sobre su vía terminal. Adicionalmente se han valorado puntos importantes para incrementar la disponibilidad de los precursores fosfoenolpiruvato (PEP) y eritrosa-4-fosfato (E4P) de la vía del SHIK. Por otro lado, la oxidación de L- Tir a L-DOPA involucra la introducción de un grupo hidroxilo al anillo aromático. La enzima 4- hidroxifenilacetato (4-HPA) 3-hidroxilasa, presente en E. coli W, es una monooxigenasa aromática de dos componentes, que cataliza la oxidación efectiva del sustrato en la presencia de NADH y FAD. Debido a que la 4-HPA 3-hidroxilasa es una enzima con un amplio rango de sustratos y puede convetir 3 o 4- hidroxifenilacetato, fenol, p-cresol e hidroquinona a su dihidroxil derivado con el co-consumo de NADH y O 2 , ya que le basta reconocer un grupo hidroxilo unido al anillo aromático, puede convertir L-Tir a L-DOPA. El objetivo de este trabajo es generar una cepa modificada por IVM, cuyo flujo de carbono se dirija a la síntesis de L-Tir, y expresar la 4-HPA 3-hidroxilasa, como una metodología para la producción de L-DOPA a partir de glucosa. Metodología. Para generar la cepa productora de L-Tir, primero se escindió el gen tyrR en las cepas W3110 (PTS) y VH33 (PTS - glc + ). El gen tktA y el gen aroG fbr clonados en el plásmido pJLB, y el operón tyrCpheA CM , clonado en el plásmido pTrc99A, fueron expresados en el fondo PTS, PTSΔtyrR, PTS - y PTS - ΔtyrR. Las cepas se caracterizaron en 50 ml de medio M9 suplementado con 10 g/l de glucosa, 100 μg de ampicilina, 30 μg de cloramfenicol y 0.0238 g/l de IPTG (1). El operón hpaBC, que codifica para la enzima 4-HPA 3-hidroxilasa, se clonó en el plásmido pTc99A y se expreso en la cepa XL1- Blue, para probar su capacidad de producir L-DOPA a partir de L-Tir exógena (2). Finalmente se subclonó el operón hpaBC bajo el promotor Trc en el plásmido pTrctyrCpheA CM , para generar el plásmido pTrchpaBCTrctyrCpheA CM . Resultados y discusión. En comparación con las PTS, las cepas PTS - mostraron una disminución importante en el crecimiento (μ), sin embargo presentaron las mejores productividades específicas (q L-Tir ) y rendimientos (Y g L-Tir/g glc ). Esto también se observa al comparar cada cepa con su derivada ΔtyrR (Cuadro 1). Cuadro 1.Parametros cinéticos y de producción de las cepas. Cepas μ(h -1 ) q glc q L-Tir Y L-Tir/glc Tit (g/l) PTS 0.35 0.35 0.01 0.030 0.15 PTSΔtyrR 0.32 0.52 0.02 0.042 0.22 PTS - 0.18 0.32 0.05 0.14 0.24 PTS - ΔtyrR 0.15 0.21 0.08 0.40 0.24 La 4-HPA 3-hidroxilasa produjo 1 mM de L-DOPA a partir de 3mM de L-Tir en una hora. Después de ese tiempo se observó una coloración café característico de la oxidación del catecol y sus derivados como la L-DOPA. Se transformó el plásmido pTrchpaBCTrctyrCpheA CM en las cepas W3110ΔtyrR y VH33ΔtyrR, que ya contaban con el plásmido pJLBaroG fbr tktA, para evaluar su capacidad de producir L-DOPA a partir de glucosa. Conclusiones. La mejor producción de L-Tir se observa en el fondo PTS - ΔtyrR. La 4-HPA 3-hidroxilasa produjo 0.2 g de L-DOPA a partir de 0.54 g de L-Tir en una hora, tiempo en el cual la L-DOPA permaneció estable. Agradecimiento. El presente trabajo se realizó con el financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT). Bibliografía. 1. Chávez, MI, Lara, A, López, H, Hernández, G, Martínez, A, Ramírez, O, Bolivar, F y Gosset, G. (2008). Metabolic Engineering of Escherichia coli for L-Tyrosine Production by Expression of Genes Coding for the Chorismate Mutase Domain of the Native Chorismate Mutase-Prephenate Dehydratase and a Cyclohexadienyl Dehydrogenase from Zymomonas mobilis. Appl. Environ. Microbiol. 74 (10): 3284- 3290. 2. Lee, JY y Xun, L. (1998). Novel biological process for L- DOPA production from L-tirosyne by p-hydroxyphenylacetate 3- hydroxylase. Biotechnol. Lett. 20 (5): 479-482.
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BIOSÍNTESIS DE 3,4-DIHIDROXI-L-FENILALANINA (L-DOPA) EN ESCHERICHIA COLI A PARTIR DE GLUCOSA.
Ana Joyce Muñoz, Alfredo Martínez, Francisco Bolívar, Guillermo Gosset. Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis, Instituto de Biotecnología, UNAM. Av. Universidad 2001, Col. Chamilpa C.P. 62210
Cuernavaca, Morelos Apdo. Postal 510-3 C.P. 62250; Fax:(+52) 7773291648; e-mail: [email protected].
Palabras clave: L-Tirosina, L-DOPA, 4-HPA 3-hidroxilasa.
Introducción. La tirosina (L-Tir) es un aminoácido aromático (AA) cuyo principal uso es como materia prima en la síntesis de 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA), una droga usada para tratar la enfermedad del Parkinson. Se han aplicado diversas estrategias de DNA recombinante e ingeniería de vías metabólicas (IVM) para la producción de compuestos aromáticos, a partir de glucosa, en microorganismos como Escherichia coli (E. coli). Para producir L-Tir, ha sido necesario eliminar los controles que éste AA ejerce sobre la vía general de síntesis de AA (vía del SHIK) así como sobre su vía terminal. Adicionalmente se han valorado puntos importantes para incrementar la disponibilidad de los precursores fosfoenolpiruvato (PEP) y eritrosa-4-fosfato (E4P) de la vía del SHIK. Por otro lado, la oxidación de L-Tir a L-DOPA involucra la introducción de un grupo hidroxilo al anillo aromático. La enzima 4-hidroxifenilacetato (4-HPA) 3-hidroxilasa, presente en E. coli W, es una monooxigenasa aromática de dos componentes, que cataliza la oxidación efectiva del sustrato en la presencia de NADH y FAD. Debido a que la 4-HPA 3-hidroxilasa es una enzima con un amplio rango de sustratos y puede convetir 3 o 4-hidroxifenilacetato, fenol, p-cresol e hidroquinona a su dihidroxil derivado con el co-consumo de NADH y O2, ya que le basta reconocer un grupo hidroxilo unido al anillo aromático, puede convertir L-Tir a L-DOPA. El objetivo de este trabajo es generar una cepa modificada por IVM, cuyo flujo de carbono se dirija a la síntesis de L-Tir, y expresar la 4-HPA 3-hidroxilasa, como una metodología para la producción de L-DOPA a partir de glucosa. Metodología. Para generar la cepa productora de L-Tir, primero se escindió el gen tyrR en las cepas W3110 (PTS) y VH33 (PTS
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+). El gen tktA y el gen aroG
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clonados en el plásmido pJLB, y el operón tyrCpheACM, clonado en el plásmido pTrc99A, fueron expresados en el fondo PTS, PTSΔtyrR, PTS
- y PTS
-ΔtyrR. Las cepas se
caracterizaron en 50 ml de medio M9 suplementado con 10 g/l de glucosa, 100 μg de ampicilina, 30 μg de
cloramfenicol y 0.0238 g/l de IPTG (1). El operón hpaBC, que codifica para la enzima 4-HPA 3-hidroxilasa, se clonó en el plásmido pTc99A y se expreso en la cepa XL1-Blue, para probar su capacidad de producir L-DOPA a partir de L-Tir exógena (2). Finalmente se subclonó el operón hpaBC bajo el promotor Trc en el plásmido
pTrctyrCpheACM, para generar el plásmido pTrchpaBCTrctyrCpheACM. Resultados y discusión. En comparación con las PTS, las cepas PTS
- mostraron una disminución importante en
el crecimiento (μ), sin embargo presentaron las mejores
productividades específicas (qL-Tir) y rendimientos (Yg L-Tir/g
glc). Esto también se observa al comparar cada cepa con su derivada ΔtyrR (Cuadro 1).
Cuadro 1.Parametros cinéticos y de producción de las cepas.
Cepas μ(h-1
) qglc qL-Tir YL-Tir/glc Tit (g/l)
PTS 0.35 0.35 0.01 0.030 0.15
PTSΔtyrR 0.32 0.52 0.02 0.042 0.22
PTS- 0.18 0.32 0.05 0.14 0.24
PTS-ΔtyrR 0.15 0.21 0.08 0.40 0.24
La 4-HPA 3-hidroxilasa produjo 1 mM de L-DOPA a partir de 3mM de L-Tir en una hora. Después de ese tiempo se observó una coloración café característico de la oxidación del catecol y sus derivados como la L-DOPA. Se transformó el plásmido pTrchpaBCTrctyrCpheACM en las cepas W3110ΔtyrR y VH33ΔtyrR, que ya contaban con el plásmido pJLBaroG
fbrtktA, para evaluar su capacidad
de producir L-DOPA a partir de glucosa.
Conclusiones. La mejor producción de L-Tir se observa en el fondo PTS
-ΔtyrR. La 4-HPA 3-hidroxilasa produjo
0.2 g de L-DOPA a partir de 0.54 g de L-Tir en una hora, tiempo en el cual la L-DOPA permaneció estable. Agradecimiento. El presente trabajo se realizó con el financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT). Bibliografía. 1. Chávez, MI, Lara, A, López, H, Hernández, G, Martínez, A, Ramírez, O, Bolivar, F y Gosset, G. (2008). Metabolic Engineering of Escherichia coli for L-Tyrosine Production by Expression of Genes Coding for the Chorismate Mutase Domain of the Native Chorismate Mutase-Prephenate Dehydratase and a Cyclohexadienyl Dehydrogenase from Zymomonas mobilis. Appl. Environ. Microbiol. 74 (10): 3284-3290. 2. Lee, JY y Xun, L. (1998). Novel biological process for L-DOPA production from L-tirosyne by p-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase. Biotechnol. Lett. 20 (5): 479-482.
