LA POLIFENOLOXIDASA

La Polifenoloxidasa (PPO) conocida también como Tirosinasa, Fenolasa, Catecol oxidasa, o-difenoloxidasa, monofenol oxidasa cresolasa 2, clasificada por la Comision de Enzimas (EC) con el numero 1.10.3.1 2., dentro de la clase de las oxidoreductasas, es una meteloenzima que actúa sobre compuestos fenólicos, causando su oxidación y polimerización con el consecuente desarrollo de un color café como se demuestra en la figura 1 3, durante el procesamiento y senescencia de frutas y vegetales, lo cual produce un deterioro en las características organolépticas de los alimentos, disminuyendo su valor proteico y reduciendo la aceptabilidad del consumidor por el producto.2,4

2 AL- ZUBAIDY, M.M.I. & KHALIL, R.A. 2006. Kinetic and prediction studies of ascorbic acid degradation in normal and concentrate local lemon juice during storage. Food Chemistry, 101: 254-259.2 Aydemir T. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from artichoke (Cynara scolymus L.) heads. Food Chem. 2004 Aug; 87 (1): 59-67.3 Prota G. Progress in the chemistry of melanins and related metabolites. Med Res Rev. 1988 Oct-Dec; 8 (4): 525-556.4 RAMIRZ, E.C. & WHITAKER,J.R. 2003. Polyphenol Oxidase: p. 509-523. En: J. R. Whitaker, A.G. J. Voragen & D.W.S. Wong (eds.). Handbook of Food Enzymology. Marcel Dekker Inc., New York.

1

FIGURA 1: Acción de la PPO sobre los compuestos Fenólicos. Fuente: AL- ZUBAIDY, M.M.I. & KHALIL, R.A. (2006).

La Polifenoloxidasa está compuesta por aminoácidos catalíticos y aminoácidos de unión, donde su principal característica es su ciclo activo, donde existe presencia de atomos de cobre (metaloenzima), unidos a histidinas; alrededor de los átomos de cobre se sitúan aminoácidos hidrofobicos, con anillos aromáticos que integran el grupo de aminoácidos de unión, importantes para la unión de los sustratos al ciclo activo de la enzima para su próxima catálisis1,3 su actividad máxima se logra pH comprendidos entre 6 y 7 a una temperatura de 30ºC 2,3.

SITIO ACTIVO

Los sitios activos muestran una estructura piramidal trigonal coordinadas por esferas formadas por los tres ligandos de histidina y la molécula del solvente como puente. El átomo de azufre de la cisteína 92 no se liga al centro del cobre pero esta unido covalentemente al átomo de histidina 109; alrededor de ellos aminoácidos hidrofobicos, unidos mediante puentes iónicos, los cuales permiten la unión de los sustratos. Ver figura 2.3

31 Aydemir T. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from artichoke (Cynara scolymus L.) heads. Food Chem. 2004 Aug; 87 (1): 59-67.2 KLABUNDE, T., EICKEN, C., SACCHETTINI, J.C. & KREBS, B. 1998. Cristal structure of a plant catechol oxidase containing a dicopper center. Nature Structural Biology, 5(12): 1084-1090.3 NEVIN-RIDLEY 2009. Enzyme Structures Database. Londres. Disponible en: http://www.ebi.ac.uk/thorntonsrv/databases/enzymes/ (consultada en abril 11 de 2009).

2

FIGURA 2: HISTIDINA

Fuente: http://es.123rf.com/photo_12771524_aminoacido-esencial-la-estructura-molecular-de-histidina.html

MECANISMO DE REACCIÓN

El mecanismo de reacción de la PPO, como su clasificación lo indica “Oxidoreductasa”, es una enzima que actúa sobre los compuestos fenólicos y polifenolicos oxidándolos en presencia de oxigeno molecular; donde su catálisis se desarrolla en dos etapas: oxidación de un monofenol a o-difenol y la subsiguiente oxidación del o-difenol a o-quinona, actividad de cresolasa y catecolasa respectivamente 1,4,5.

Los sustratos más comunes para estas enzimas son compuestos insaturados como monofenoles, o-difenoles, flavonoides, taninos, dihidroxifenilalanina, acido gálico, y otras hidroquinonas, acido cloragenico y tirosina. Las dos últimas siendo de mayor importancia en alimentos; las fenolasas pueden presentar dos tipos de actividad enzimática, fenolhidrolasas o polifenoloxidasas también conocidas como catecolosas, las cuales actúan por medio de reaccione de adición en las que una molécula de oxigeno es introducida a la molécula insaturada de sustrato que al polimerizarse produce compuestos pigmentados oscuros. Siguiendo un mecanismo ordenado, la enzima liga primero al oxigeno y después al monofenol.

Se produce un cambio de valencia de los iones de los 2 átomos de cobre que posee en su ciclo catalítico de Cu1+ a Cu2+ formándose un complejo que tiene un enlace O – O bien polarizado donde se produce la hidroxilacion a o-difenilo. La oxidación del o-difenol a o-quinona finaliza el ciclo 1,2. Figura 3.5

41 Aydemir T. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from artichoke (Cynara scolymus L.) heads. Food Chem. 2004 Aug; 87 (1): 59-67.2 Miller, D. D. (2002). Química de Alimentos Manual de Laboratorio. Departamento de Ciencia de los Alimentos. Cornell University. Ithaca, Nueva York.3 NEVIN-RIDLEY 2009. Enzyme Structures Database. Londres. Disponible en: http://www.ebi.ac.uk/thorntonsrv/databases/enzymes/ (consultada en abril 11 de 2009).4 AL- ZUBAIDY, M.M.I. & KHALIL, R.A. 2006. Kinetic and prediction studies of ascorbic acid degradation innormal and concentrate local lemon juice during storage. Food Chemistry, 101: 254-259.5 KLABUNDE, T., EICKEN, C., SACCHETTINI, J.C. & KREBS, B. 1998. Cristal structure of a plant catechol oxidase containing a dicopper center. Nature Structural Biology, 5(12): 1084-1090.

51 Aydemir T. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from artichoke (Cynara scolymus L.) heads. Food Chem. 2004 Aug; 87 (1): 59-67.2 KLABUNDE, T., EICKEN, C., SACCHETTINI, J.C. & KREBS, B. 1998. Cristal structure of a plant catechol

3

FIGURA 3: Geometría de los centros activos de la PPO. Fuente: Klabunde et al. (1998)

La primera reacción requiere de fenoles, de oxigeno y cobre mientras que la segunda no interviene la enzima y es función de la temperatura y el pH, donde la o-quinonas formadas interaccionan con hidroxiquinonas u otras para formar polímeros 2,3.

EXTRACCIÓN DE LA PPO

oxidase containing a dicopper center. Nature Structural Biology, 5(12): 1084-1090.3Quinde Z, Ullrich SE, Baik BK. Genotypic variation in color and discoloration potential of barley-based food products. Cereal Chemistry. 2004; 81(6):752-758.

5RAMIRZ, E.C. & WHITAKER,J.R. 2003. Polyphenol Oxidase: p. 509-523. En: J. R. Whitaker, A.G. J. Voragen & D.W.S. Wong (eds.). Handbook of Food Enzymology. Marcel Dekker Inc., New York.

4

FIGURA 4: Mecanismo cinético propuesto para la oxidación de o-difenol (catecol [A]) y un monofenol ( fenol [B]).

Fuente: Ramírez et al. (2003)

FIGURA 5: Reacción generalizada de la PPO en plantas. Fuente: Gacche et al. (2003).

Se puede observar diversas metodologías para la extracción y purificación de PPO de frutas y vegetales. En el proceso de extracción se indican metodologías con variaciones importantes en el pH, la concentración y la composición del buffer de extracción, y en los procesos de precipitación proteica empleándose principalmente sulfato de amonio , y en algunas ocasiones acetona 1,6.

Los métodos convencionales para la purificación de esta enzima emplean separaciones cromatografías usando dietilaminoetil (DEAE) y celulosa o sefarosa,fenil u octil sefarosa, sephadex G25 - G100 ,como matrices. Sin embargo, son costosos y esto dificulta su escalado, por eso uno de los métodos más empleados es el “Sistema Bifásicos Acuosos” como método de extracción y purificación de enzimas como la Polifenoloxidasa 1,2.

SISTEMAS BIFASICOS ACUOSOS (SEBAS)

Los sistemas bifásicos acuosos o SEBAS, es una técnica empleada tanto para extraer enzimas, de una matriz vegetal o animal o como método de purificación parcial. Un sistema bifásicos acuoso se forma cuando un polímero como el polietilenglicol (PEG) se mezcla con otro como el dextran, o sales en concentraciones particulares. Por lo tanto, el coeficiente de partición de la proteína en un SEBAS depende no solo de sus propiedades de superficie tales como la carga o la hidrofobicidad sino también de las propiedades fisicoquímicas de las dos fases formadas, las cuales pueden ser manipuladas ajustando factores como el peso molecular del polímero y las concentraciones de las sales a utilizar, fuerza iónica o pH, como se aprecia en la figura 5 7.

61 Aydemir T. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from artichoke (Cynara scolymus L.) heads. Food Chem. 2004 Aug; 87 (1): 59-67.2 Prota G. Progress in the chemistry of melanins and related metabolites. Med Res Rev. 1988 Oct-Dec; 8 (4): 525-556.

5

FIGURA 6: Proceso de extracción y purificación de la PPO utilizando el SEBAS Fuente: Sojo et al.(1998)

CONCLUSIÓN

La Polifenoloxidasa es una metaloenzima perteneciente a la familia de las oxidoreductasas, y por lo tanto es una de las causantes del pardeamiento de los alimentos mediante reacciones de oxidación, para lo cual su inhibición se puede realizar mediante elevaciones de temperatura, ya que la PPO solo es estable en temperaturas entre 30-45º C, mayor a 55 ya la PPO se inactiva; también con variaciones del pH ya que esta enzima tiene como pH máximo un valor de 6; y con

6

ello, poder prolongar la vida del alimento y conservar sus características organolépticas del alimento, como son color aroma y sabor.

REFERENCIA DE DATOS

AL- ZUBAIDY, M.M.I. & KHALIL, R.A. 2006. Kinetic and prediction studies of ascorbic acid degradation in normal and concentrate local lemon juice during storage. Food Chemistry, 101: 254-259.

Aydemir T. Partial purification and characterization of polyphenol oxidase from artichoke (Cynara scolymus L.) heads. Food Chem. 2004 Aug; 87 (1): 59-67.

7

KLABUNDE, T., EICKEN, C., SACCHETTINI, J.C. & KREBS, B. 1998. Cristal structure of a plant catechol oxidase containing a dicopper center. Nature Structural Biology, 5(12): 1084-1090.

Miller, D. D. (2002). Química de Alimentos Manual de Laboratorio.o Departamento de Ciencia de los Alimentos. Cornell University. Ithaca,

Nueva York.

Nelson D, Cox M. Lehninger: Principles of Biochemistry. Worth Publishers, New York. 2000.

NEVIN-RIDLEY 2009. Enzyme Structures Database. Londres. Disponible en: http://www.ebi.ac.uk/thorntonsrv/databases/enzymes/ (consultada en abril 11 de 2009).

Prota G. Progress in the chemistry of melanins and related metabolites. Med Res Rev. 1988 Oct-Dec; 8 (4): 525-556.

Quinde Z, Ullrich SE, Baik BK. Genotypic variation in color and discoloration potential of barley-based food products. Cereal Chemistry. 2004; 81(6):752-758.

RAMIRZ, E.C. & WHITAKER,J.R. 2003. Polyphenol Oxidase: p. 509-523. En: J. R. Whitaker, A.G. J. Voragen & D.W.S. Wong (eds.). Handbook of Food Enzymology. Marcel Dekker Inc., New York.

SOJO, M. M., NUNEZ-DELICADO, E., GARCIA-CARMONA, F. & ANCHEZ- FERRER, A. 1998. Partial purification of a polyphenol oxidase using Triton X- 114 and PEG 8000 for removal of polyphenols. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46: 4924-4930.

ANEXOS

ANEXO Nº 1

8

ANEXO Nº2

TIROSINASA

Introducción

El pardeamiento enzimático es una reacción de oxidación en la que interviene como substrato el oxígeno molecular, catalizada por un tipo de enzimas que se puede encontrar en prácticamente todos los seres vivos, desde las bacterias al hombre. En el hombre es la responsable de la formación de pigmentos del pelo y de la piel. En los cefalópodos produce el pigmento de la tinta, y en los artrópodos participa en el endurecimiento de las cutículas del

9

caparazón, al formar quinonas que reaccionan con las proteínas, insolubilizándolas. En los vegetales no se conoce con precisión cuál es su papel fisiológico.

El enzima responsable del pardeamiento enzimático recibe el nombre de Polifenoloxidasa, fenolasa o tirosinasa, en este último caso especialmente cuando se hace referencia a animales, ya que en ellos la tirosina es el principal substrato. También se ha utilizado el término cresolasa, aplicado a la enzima de vegetales. Se descubrió primero en los champiñones, en los que el efecto de pardeamiento tras un daño mecánico, como el corte, es muy evidente.

Champiñones cortados, mantenidos a temperatura ambiente y fotografiada a distintos tiempos.

En el campo de los alimentos, el pardeamiento enzimático puede ser un problema muy serio en frutas, champiñones, patatas y otros vegetales, y también en algunos crustáceos, e incluso en la industria del vino, al producir alteraciones en el color que reducen el valor comercial de los productos, o incluso los hacen inaceptables para el consumidor. Estas pérdidas son muy importantes en el caso de las frutas tropicales y de los camarones, productos trascendentales para la economía de muchos países poco desarrollados.

A pesar del nombre genérico de “pardeamiento” (“browning” en inglés), los colores formados son muy variables, marrones, rojizos o negros, dependiendo del alimento y de las condiciones del proceso. En algún caso, como en las pasas, otras frutas secas, la sidra, el té o el cacao, el pardeamiento enzimático contribuye al desarrollo de los colores característicos de estos productos, aunque como se ha indicado, en otros muchos constituye un problema grave.

10

Además de la alteración del color, los productos formados pueden reaccionar con las proteínas, insolubilizándolas. Por otra parte, puede producirse también una pérdida

nutricional, ya que aunque la

Polifenoloxidasa no oxida directamente al ácido ascórbico, esta vitamina puede destruirse al reaccionar con intermedios de la reacción.

Estructura de las polifenoloxidasas

La Polifenoloxidasa, EC 1.14.18.1 tiene dos actividades enzimáticas, una hidroxilando monofenoles (“cresolasa”) y otra oxidando difenoles a quinonas (“catecolasa”). Dependiendo de la fuente, la actividad “cresolasa” es mayor o menor, incluso inexistente en algunos casos. En cambio, todas las enzimas tienen actividad “catecolasa”.

La característica estructural más importante de estas enzimas es la presencia en su centro activo de dos átomos de cobre, unidos cada uno de ellos a tres histidinas, que se han conservado a lo largo de la evolución en todas las enzimas de este tipo, desde las bacterias al hombre. En su entorno se sitúan una serie de aminoácidos hidrofóbicos, con anillos aromáticos, que también son importantes en su actividad, para la unión de los sustratos.

Estructura de la difenoloxidasa de la batata

ANEXO Nº 3

11

ESTRES POR FRIO Y ACTIVIDAD DE LA POLIFENOLOXIDASA EN MANGO(Mangifera indica cv. MANILA).

Vela Gutiérrez Gilber, León G. Dinora M. , García Galindo Hugo S.1 y De la Cruz MedinaJavier . Unidad de Investigación y Desarrollo en Alimentos (ITV). Fax 01(29) 341478 y 69 Ext.201. Email: gvelag@mailbanamex.com

Palabras claves: Polifenoloxidasa, daño por frío, pardeamiento.

12

Introducción: El almacenamiento a bajastemperaturas de ciertos frutos ha probado sermuy efectivo para disminuir los procesos demaduración. Uno de los inconvenientes delalmacenamiento refrigerado es el daño por frío(DF) que causa la liberación de metabolitoscomoaminoacidos,azúcares,minerales,terpinoles y compuestos fenólicos del interior delas células, así como la degradación de laestructura celular. Se ha encontrado que elobscurecimiento interno que puede ser causadopor el rompimiento de la membrana permite a lasenzimas y sustratos mezclarse dentro de la célula(Brown, 1986). Los disturbios provocados por elDF traen como consecuencia una reducción en lacalidad general y la inaceptabilidad del productoen el mercado. Uno de los síntomas másimportantes es el pardeamiento enzimáticodebido a la actividad de la Polifenoloxidasa(PPO). Compuestos terpinólicos y otros volátilespresentes en la savia y cáscara de mango alentrar en contacto con la enzima producencompuestos de Melanoidinas. Tomando encuenta lo anterior se propuso como objetivo delpresente trabajo determinar los cambios en laactividad de la Polifenoloxidasa que ocurrendurante la maduración del mango (Mangiferaindica cv Manila) y su estrés por refrigeración.Metodología: Se utilizaron mangos de lavariedad Manila en estado preclimatérico, loscualesfueronlavados,desinfectados,seleccionados y clasificados para su ánalisis. Sealmacenaron tres lotes de mangos a 6°, 12° y untestigo a 25°C, durante 30, 28 y 14 díasrespectivamente. Con humedad relativa (HR) del80±5%. Se evaluó propiedades fisicoquímicas(pH, % de ac. cítrico, % de sólidos solubles,pérdida de peso, firmeza del tejido ypardeamiento) de cada lote a cada 4 días; almismo tiempo, se retiraron 6 mangos de los lotesrefrigerados y fueron llevados a maduración parasu análisis posterior. Se determinó la actividadde la PPO del extracto obtenido tanto de lacáscara como de la pulpa de mango. El extractopreviamente centrifugado a 15000 rpm durante15 minutos, a 4°C, se hizo reaccionar con 4-

metilcatecol (sustrato) durante 10 minutos,inhibiendo la reacción inmediatamente con unasolución de ácido tricloroacético (TCA) al 10%.Se determinó el cambio en densidad óptica porespectrofotometría a 400 nm. Se cuantificóproteína por el método de Bradford para cadaextracto analizado.Resultados y discusión: Los parámetrosfisicoquímicos como pH, °Brix, % de sólidossolubles, % de ácido cítrico y firmeza mostraronmayor incremento en el testigo, siendo de menorproporción para 12°C y 6°C. Por el contrario, lapérdida de peso fué menor en los mangosalmacenados a temperaturas de refrigeración queen el testigo. La actividad de la PPO que sepresentó en el mesocarpio fué mínima y seconsideró como nula para las tres temperaturas.La actividad de la PPO en la cáscara de losmangos refrigerados fué mayor y se observó unadiferencia significativa respecto al testigo. Seobservó un incremento en la actividad de la PPOen la cáscara de los mangos almacenados a 6° Cal día 16, siendo similar este comportamiento ala temperatura de 12°C y en el mis mo día, perocon una actividad menor. Después de 16 días dealmacenamiento los mangos fueron llevados amaduración (25°C) dónde se observó unadisminución de la actividad de la enzima,resultados símilares fueron reportados porSanchez de Medina et al., 1987.Conclusiones: La actividad enzimática de laPPO fué significativamente menor en los mangosalmacenados a 25°C (testigo). La mayoractividad enzimática se presentó en a 6°C dondeel DF es más sévero; a 12°C la actividad esmenor dónde se observo un menor DF.

Bibliografía: Brown, B.I.(1986). Temperaturemanagement and chilling injury of tropical andsubtropical fruit. Acta Hort 175: 339-342.Sanchez de Medina L. et al., (1987). Changes inpolyfenoloxidasa, peroxidasa, catalasa and acidphosphatasa activities for cherimoya fruit(Annona cherimolia) during ripening incontrolled temperature and relative humiduty.Revista-de-Agroquímica-y-TecnologíadeAlimentos; 26(4): 529-538.