ESPECIALIDAD LABORATORISTA CLINICOV SEMESTRE

ALUMNO:____________________________________________

C B T i s 4PRUEBAS TRANSFUSIONALES

CUADERNILLO DE PRACTICAS DE LABORATORIO

CONTENIDOObjetivo

Fundamentación

Practica 1 ASEPSIA Y VENOPUNCIÓN A DONADORES

Práctica 2 DETERMINACION DE LA FORMULA ROJA

Práctica 3 DETERMINACION DE GRUPOS SANGUINEOS

SISTEMAS ABO Y RH (MÉTODO DIRECTO EN

TUBO)

Práctica 4 DETERMINACION DE SUBGRUPOS A1 Y A2

Práctica 5 DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO

SISTEMA ABO (MÉTODO: INVERSO)

Práctica 6 DETERMINACION DE LA VARIEAD DU

Práctica 7 REACCIONES FEBRILES

Práctica 8 DETERMINACIÓN DE V.D.R.L. Y R.P.R.

Práctica 9 DETERMINACION DE VIH Y HEPATITIS C

Práctica 10 PRUEBA DE COOMBS DIRECTA

Práctica 11 PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA

Práctica 12 PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD (PRUEBAS

CRUZADAS)

Bibliografía

OBJETIVO

El alumno conoce y aplica las técnicas adecuadas para: la selección de donadores de sangre segura y las técnicas de recolección de sangre, además realiza las diferentes pruebas pretransfunsionales para una compatibilidad sin riesgo; de igual forma se busca que el alumno tenga los conocimientos, habilidades y destrezas necesarios para que pueda obtener y clasificar los diferentes hemoderivados de la sangre para su conservación, transporte y utilización.

FUNDAMENTACION

La sangre hasta hoy es irreemplazable, no existe en

forma artificial. Varios componentes sanguíneos, en

particular los celulares, así como sus funciones, son

demasiado complejos para ser "fabricados". Por lo tanto,

la transfusión sanguínea es la única alternativa para

ciertos pacientes.

Con este submódulo el estudiante conoce y aplica los

procedimientos y técnicas para seleccionar a los

voluntarios sanos para donar, recolectar la sangre,

estudiarla, separarla en sus componentes, conservarlos

adecuadamente para tenerlos disponibles para los

pacientes que tienen deficiencia de alguno de ellos o

perdidas por accidentes, cirugías o por enfermedades

sistémicas.

PRACTICA: 1 ASEPSIA Y VENOPUNCIÓN A DONADORES

OBJETIVO: Que el alumno conozca el procedimiento, materiales y cuidados que se deben tener durante una flebotomía a donadores a fin de robustecer su desempeño en el banco de sangre.

FUNDAMENTO: La contaminación bacteriana de la sangre y sus componentes es un problema significativo en la práctica transfusional. La sangre y sus componentes pueden contaminarse de manera exógena y endógena. La desinfección inadecuada del sitio de venopunción puede aumentar la probabilidad de contaminación. Se debe tomar como rutina una técnica en especial para la desinfección del brazo de los donadores para que de esta manera se reduzca la posibilidad de contaminación bacteriana, de la sangre y sus componentes, que puede ocasionar infección y en casos graves la muerte del paciente a transfundir.

MATERIAL Y EQUIPO:- Dos pinzas de Nelly- Bolsa recolectora de sangre (sencilla, doble o triple)- Tijeras- Tubos de ensaye con y sin anticoagulante (EDTA)- Gasas estériles y cinta adhesiva- Torundas con alcohol- Jabón líquido e isodine espumoso (cutáneo)- Fumarato Ferroso

CARACTERISITICAS DE LOS MARBETES (ETIQUETAS) EN LAS BOLSAS RECOLECTORAS DE SANGRE Y SUS FRACCIONES

- Nombre, domicilio y teléfono del establecimiento- Nombre del donador y anotar el tipo de donación: familiar o altruista- Identificación del grupo sanguíneo ABO con letras de 3X3 cm siguiendo

las indicaciones del “CODIGO INTERNACIONAL DE COLORES”

Amarillo para el gurpo A Azul para el gurpo B Rojo para el grupo AB Negro para el grupo O- Indicación del factor Rh (con palabras POSITIVO O NEGATIVO)- Fecha de extracción y caducidad de acuerdo al anticoagulante Empleado.- Señalar el volumen y producto conservado- Se inscribirá el resultado de las pruebas de laboratorio efectuadas- Llevar la leyenda consérvese entre 4 – 6 ºC- En caso de que el producto se encuentre preparado para un receptor

determinado, anotar el nombre completo del paciente, número de cama, servicio y resultado de las pruebas de compatibilidad pretransfusionales.

-Si el producto está pendiente de ser dado de baja, señalarlo claramente en la etiqueta con la leyenda “BAJA, NO USAR”.

ACTIVIDAD:

1.- Consultar porqué son los citratos los anticoagulantes utilizados para almacenamiento de las unidades de donación.

2.- Dibujar una bolsa de donación y especificar sus componentes.

3.- Investigar la utilidad de las bolsas satélites de las unidades de donación.

POSICION DEL DONADOR Y FLEBOTOMIA

- El donador debe de estar recostado en una posición elevada para que el técnico que realice la venopunción, no se incline.

- Es importante que el donador se encuentre en ayuno, y en casos urgentes con mínimo de cuatro horas.- Para realizar la flebotomía (técnica de venopunción), se escoge una vena

grande de la región antecubital generalmente la vena media. Una vez seleccionada se procede a realizar la asepsia.

- Asepsia: Limpiar una zona en circulo de aproximadamente 8 a 10 cm de diámetro con jabón líquido (vigorosamente), eliminar el jabón con una torunda con alcohol y posteriormente aplicar una solución desinfectante por dos minutos, se utiliza el isodine espumoso (solución yodada), quitar el isodine con una torunda con alcohol.

Una vez realizada la asepsia , ESTA REGION NO SE DEBE TOCAR.

- Colocar el torniquete en el brazo indicando al paciente que cierre el puño.

- Se efectúa un nudo flojo en el tubo de hule de la bolsa, se pinza y se retira el protector de la aguja. Posteriormente se punciona con el bisel hacia arriba y siguiendo el curso de la vena.

- Retirar las pinzas y al aparecer el flujo de sangre con velocidad constante, fijar la aguja con cinta adhesiva.

- Colocar la bolsa recolectora a un nivel inferior al brazo del donador, aflojar el torniquete ( no lo quite ) para que la sangre fluya por gravedad.

- Mezclar la bolsa con movimientos continuos de arriba hacia abajo hasta terminar el sangrado, para asegurar la mezcla con el anticoagulante.

- Inspeccionar continuamente la posición de la aguja y observar que no se presenten coágulos, la sangre debe fluir libremente.

- Una vez terminada la recolección, colocar dos pinzas Nelly en el tubo de Hule inmediatamente después de la región de punción y cortar con unas tijeras en medio de ellas.

- Llenar dos tubos, uno con anticoagulante y otro sin el, como tubos pilotos, esto se realiza despinzando el trozo de tubo de hule que aun permanece insertado en el brazo.

- Volver a pinzar y retirar el torniquete y las cintas adhesivas. Extraer la aguja lentamente y colocar una torunda con alcohol, doblar el brazo indicando al donador que permanezca en reposo durante 10 min.- A la unidad de sangre recolectada, extraer las burbujas de aire y cerrar el tubo de hule con nudos o utilizando un sellador eléctrico, almacenarla en el refrigerador de 4 – 6 ºC.

- Después de permanecer 10 minutos en reposo, el donador, se le proporciona una dieta principalmente rica en líquidos y se le administran pastillas de Fumarato ferroso (se le indican 20 comprimidos para que tome una pastilla después de cada alimento).

- En caso de desmayo, coloque los pies del donador a un nivel superior y que aspire una torunda con alcohol.

ACTIVIDAD:

1.- ¿Cuanto es el tiempo estimado para la sangría de un donador?

2.- ¿Que complicaciones se pueden presentar cuando se rebasa el tiempo de sangría del dondaor?.

3.- ¿Cuales son las concentraciones indicadas para los antisépticos utilizados en la flebotomía a donadores?

4.- ¿Cual es la finalidad de seccionar la manguera de la unidad de sangre con nudos o con sellos durante su almacenamiento?

PRACTICA: 2 DETERMINACION DE LA FORMULA ROJA

MÉTODOS DETERMINACION DE HEMOGLOBINA POR CIANOMETAHEMOGLOBINA Y DETERMINACION DEL MICROHEMATOCRITO

OBJETIVO: El alumno realiza la determinación de Hemoglobina y hematocrito para valorar en un primer plano el estado de la sangre de un posible donador dentro del banco de sangre.

FUNDAMENTO: La fórmula roja consiste generalmente en la determinación de la concentración de hemoglobina, el hematocrito y los índices hemáticos (o eritrocitarios). Con el surgimiento de los contadores electrónicos de células se ha incluido el recuento total de eritrocitos

MATERIAL Y EQUIPO:- Tubos de ensayo - Pipetas serológicas de 10 ml- Pipeta de Salí- Boquilla- Capilares- Mechero Bunsen- Gradilla para tubos- Centrífuga - Solución de Drabkin- Tubos con anticoagulante EDTA- Tabla de lectura para hematocrito- Espectrofotómetro

PROCEDIMIENTO:

MICROHEMATOCRITO1.- Homogeneizar la muestra y llenar un tubo capilar a 2/3 partes de su capacidad.2.- Sellar con plastilina o al calor uno de los extremos del capilar3.- Centrifugar durante 5 minutos a 11,000 r.p.m.4.- Obtener el % de Hematocrito con una tabla o por cálculo.5.- Registrar el resultado.

HEMOGLOBINA (CIANOMETAHb)

1.- Homogeneizar la muestra y con pipeta de Salhi recoger 20μl (λ) de sangre.2.- Colocar la muestra en un tubo de ensaye preparado con 5 ml de Rvo. de Drabkin3.- Mezclar y dejar reposar durante 10 minutos4.- Leer Absorbancia en espectrofotómetro a 540 nm 5.- Interpretar con la curva correspondiente o un factor.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS:Dependiendo de los valores obtenidos para Hb, Hto e IE, se valorará al donante para su aceptación o rechazo de acuerdo a los requisitos de donación establecidos por el Sector Salud.

VALORES DE REFERENCIA

HEMATOCRITO: Hombres 40 – 54 %Mujeres 37 – 47 %

HEMOGLOBINA: Hombres: 13.5 – 17.5 gr/dlMujeres: 12.0 – 15.5 gr/dl

ACTIVIDAD:

1.- En la actualidad ¿que procedimientos realizan los bancos de sangre para determinar la formula roja de los donadores?

2.- ¿Que ventajas ofrecen éstos procedimientos?

PRACTICA: 3 DETERMINACION DE GRUPOS SANGUINEOS SISTEMAS ABO Y RH

MÉTODO DIRECTO EN TUBO

OBJETIVO: Que el alumno aprenda y aplique el método para la identificación de antígenos eritrocitarios como preámbulo a la compatibilidad de una unidad de sangre, utilizando antisueros comerciales.

FUNDAMENTO: El sistema ABO es el único sistema sanguíneo en que el plasma y el suero contienen aglutininas que reaccionan con los antígenos presentes en los hematíes de otras personas. Por estas reacciones de antígeno– anticuerpo (Ag-Ac) Landersteiner demostró la presencia de grupos sanguíneos ABO. La isoaglutinación se lleva a cabo a temperatura ambiente (20 – 25 ºC), y las isoaglutininas (Ac responsables de la aglutinación) son del llamado tipo Completo ( Inmunoglobulinas M, IgM).

El factor Rh se descubrió en 1940 por Landsteiner y Wiener realizando estudios en monos Rhesus. En conclusión se investigó que en la membrana de los eritrocitos se puede encontrar en la mayoría de las personas un Ag el “D” que es el que designa el Rh.

MATERIAL Y EQUIPO:

- Tubos de ensayo - Pipetas Pasteur- Gradilla para tubos- Centrífuga - Solución salina fisiológica (0.85%)- Anticoagulante EDTA- Antisueros A, B, AB y D

PROCEDIMIENTO:

1.- Rotular cuatro tubos como “A”, “B”, “AB” y “D”.2.- Colocar una gota del antisuero, a cada tubo respectivamente.3.- Colocar a cada uno de los cuatro tubos una gota de eritrocitos, previamente lavados y diluidos al 2 -5% en SSF.4.- Mezclar y centrifugar a 1000 r.p.m. durante 15 a 30 segundos.5.- Resuspender las células (el botón) cuidadosamente y observar la presencia de aglutinación macroscópica. Registrar los resultados.

INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS:

SISTEMA ABO.-

AGLUTINACION EN: GRUPO SANGUÍNEO:Tubo A y tubo AB ATubo B y tubo AB B

Tubo AB ABNo hay aglutinación en tubos A, B y AB. O

SISTEMA Rh.- Si aglutina en tubo “D” Rh PositivoSi no aglutina en tubo “D” Rh Negativo

OBSERVACIONES:

La presencia de Ag y Ac en el sistema sanguíneo ABO se confirman en la práctica de “GRUPO INVERSO”.

A todos los Rh negativos se les practicará la variedad débil del Ag “D” (Du).

PRACTICA 5 DETERMINACION DE GRUPO SANGUINEO

MÉTODO: INVERSO

OBJETIVO: Que el alumno conozca y aplique el procedimiento para determinar los anticuerpos del sistema ABO presentes en una muestra de suero o plasma utilizando eritrocitos de grupo sanguíneo conocido.

FUNDAMENTO: El grupo inverso también llamado sérico o de confirmación (afirmagén) se determina probando el suero o plasma de una muestra de sangre con eritrocitos conocidos de grupo A y B (al 2–5% en solución salina). El grupo inverso se determina con los Ac del suero tanto del donador como del receptor; los Ac investigados son: anti-A, anti-B, anti-AB o ninguno.

MATERIAL: REACTIVOS:- Pipetas Pasteur - Células conocidas “A”- Tubos de ensaye - Células conocidas “B”- Centrífuga - Solución salina- Gradilla

PROCEDIMIENTO:

1.- Rotular dos tubos de ensayo como A y B respectivamente.2.- Al tubo “A”, agregar dos gotas de suero o plasma del paciente y una gota de glóbulos rojos conocidos “A”.3.- Al tubo “B”, agregar dos gotas de suero o plasma del paciente y una gota de glóbulos rojos conocidos “B”.4.- Mezclar, centrifugar a 3,000 r.p.m. por 15 segundos y observar la aglutinación.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:

AGLUTINACION GRUPO SANGUINEO

Eritrocitos A BB A

AB O

CONTROL DE CALIDAD: Es importante comprobar la eficacia de los reactivos principalmente que tanto las células conocidas como el suero o plasma no se encuentren hemolizados ni contaminados.

ANTIGENOS ANTICUERPOS GRUPOA anti-B AB anti-A B

AB NINGUNO ABAUSENTE A,B anti-A y anti-B O

D NINGUNO Rh POSITIVOAUSENTE D NINGUNO Rh NEGATIVO

ACTIVIDAD:

1.- Esquematiza los sistemas antigénicos ABO y Rh, así como las inmunoglobulinas correspondientes a éstos sistemas.

2.- ¿Cual es el origen de las inmunoglobulinas de grupo sanguíneo del sistema ABO en los seres humanos?

PRACTICA 4 DETERMINACION DE SUBGRUPOS A1 Y A2

OBJETIVO: Que el alumno conozca el procedimiento para identificar los subgrupos de A, aplicando el método de aglutinación directa utilizando un antisuero comercial.

FUNDAMENTO: G.W. Bird en 1952 descubrió un estrato preparado a partir de semillas de Dolichus biflorus que aglutinaba solamente con los hematíes humanos del grupo A1. El anti-A1 lectina usado con técnicas serológicas apropiadas puede ayudar a distinguir entre los subgrupos anguíneos A1, A1B, A2, A2B y otros subgrupos débiles de A.La lectina anti-A1 contiene una fitoaglutinina que aglutina con los hematíes humanos del subgrupo A1, pero no aglutina con los subgrupos débiles de A.

MATERIAL: REACTIVOS:- Solución salina fisiológica - Lectina anti-A1- Tubos de ensaye - Gradilla- Pipetas Pasteur- Centrífuga

PROCEDIMIENTO:1.- Preparar una suspensión de células lavadas al 2 – 5% en solución salina.2.- Etiquetar un tubo de ensaye para la identificación apropiada.3.- Dispensar dos gotas de Lectin-A1, en el tubo etiquetado.4.- Añadir una gota de la suspensión de las células al 2 - 5%. Mezclar.5.- Centrifugar 1000 r.p.m. durante 30 segundos.6.- Resuspender las células (el botón) cuidadosamente –deslizando la muestra de forma horizontal- y observar la presencia de aglutinación macroscópica. Registrar los resultados.

CONTROLES:La reactividad del producto debe confirmarse cada día antes de usarse mediante el empleo de células conocidas del grupo A1 (control positivo) y células conocidas del grupo A2, B y O (control negativo).

ITERPRETACION DE RESULTADOS:

1.- Subgrupos A1 y A1B aglutinan2.- Subgrupos A2, A2B, y otros subgrupos débiles de A no aglutinan.

LIMITACIONES DE LA TÉCNICA:

No incluir tubos de ensaye a 37 ºC. El test en portaobjetos debe ser leído en un tiempo no superior a un minuto.

ACTIVIDAD:

1.- ¿Qué es el Dolichus biflorus?

2.- Consultar que es una fitoaglutinina

3.- Esquematiza la reacción Ag-Ac entre la fitoaglutinina y el Ag eritrocitario

PRACTICA 6 DETERMINACION DE LA VARIEAD DU

OBJETIVO: Que el alumno conozca y aprenda el procedimiento para detectar alguna irregularidad o ausencia del Ag D, expresión que se encuentra regulada genotípicamente y cuyo fenotipo implica una gran importancia en la prevención de reacciones hemolíticas de Recién Nacidos o postrasnfusionales.

FUNDAMENTO: Se basa en la reacción del Ag Du con el Ac “incompleto” gamma globulina, que posteriormente reacciona con el Ac “intermedio” anti-gamma globulina (suero de Coombs) para formar un puente entre la gamma globulina facilitando el acercamiento de los eritrocitos y así provocar la aglutinación en caso de que los eritrocitos contengan el “Du”.

MATERIAL:- Tubos de ensaye- Tubo con anticoagulante (EDTA)- Pipeta Pasteur- Suero anti - “D”- Suero de Coombs (anti – gamma globulina o anti – globulina humana)- Centrífuga

PROCEDIMIENTO:

1.- Preparar una suspensión de eritrocitos problema lavados al 5 %.2.- Tomar una gota de la suspensión al 5% y colocarla en un tubo de

ensaye, agregar una gota del suero anti – D e incubar durante 15 minutos a 37 ºC.

3.- Observar la presencia o ausencia de aglutinación: En caso negativo continuar con tres lavados de la muestra con solución

salina. En caso positivo se termina el procedimiento y se reporta Rh POSITIVO. 4.- Al residuo ya lavado se le agrega una gota del suero de Coombs,

mezclar e incubar durante 30 min. A 37 ºC.5.- Observar la presencia de aglutinación.

INTERPRETACION:

Presencia de aglutinación Reportar variedad Du Positiva Sin aglutinación Reportar Variedad Du Negativa

ACTIVIDAD:

1.- Explica la relevancia clínica de ésta prueba

2.- Esquematiza la estructura bioquímica del Ag D

3.- ¿Qué es el suero de Coombs y que papel juega en ésta determinación?

PRACTICA 7 DETERMINACION DE ANTIGENOS FEBRILES

FUNDAMENTO: La prueba se basa en una reacción inmunológica entre los anticuerpos séricos y el antígeno correspondiente produciendo una reacción de aglutinación macroscópica.

OBJETIVO: El Alumno recuerda y aplica la identificación de antígenos bacterianos mediante una reacción de aglutinación como criterio para aceptar o descartar a un donador al comprobar la ausencia o presencia de éstos respectivamente en una muestra de suero.

MATERIAL: REACTIVOS:Tubos de ensaye 13X100 Muestra de sueroPlaca de vidrio Tifico O y HAplicadores Paratifico A y BGradilla Proteus OX-19Pipeta serológica de 1 ml Brucella abortusPipeta PasteurTubo al vacío sin anticoagulanteLámpara

PROCEDIMIENTO:1.- Llevar los reactivos a temperatura ambiente antes de realizar la prueba.2.- Rotular la placa según el Ag a investigar3.- Depositar en la placa de vidrio 0.04 ml del suero problema (el cual debe ser totalmente claro para la prueba), 0.02, 0.01 y 0.005 de forma secuenciada en cada uno de los sitios marcados para cada Ag. 4.- Mezclar el frasco del Ag con movimientos circulares sobre la mesa para homogeneizar la suspensión y agregar una gota (30 μl) de cada Ag en uno de los sueros previamente depositados. 5.- Mezclar el Ag y el suero utilizando un aplicador diferente para cada una de las cantidades de suero.6.- Girar la placa manualmente o utilizando un agitador mecánico (120 rpm) durante 2 minutos.7.- Realizar la lectura utilizando una fuente de luz directa y observar la aglutinación macroscópica de acuerdo a la siguiente tabla de algutinación:

4+ Aglutinación del 100% de los organismos3+ Aglutinación del 75 % de los organismos2+ Aglutinación del 50 % de los organismos1+ Aglutinación del 25 % de los organismosNeg. Aglutinación del 0 % de los organismos

INTERPRETACIÓN:El título del suero será la inversa de la dilución más alta en donde se observa una aglutinación del 50 % de organismos (2+).

VO LUMEN DEL SUERO TITULO0.0l4 ml 1:400.02 m 1:800.01 ml 1:1600.005ml 1:320

ACTIVIDAD:

1.- ¿Qué tipo de respuesta inmunológica induce la infección por éstos microorganismos?

2.- ¿Por que se utiliza el Ag OX-19 de Proteus y que bacteria nos permite identificar en ésta prueba?

3.- ¿Qué es la reacción de Huddleson y que permite detectar?

4.- ¿Qué es un título de anticuerpos?

5.- ¿Que limitaciones presenta el procedimiento?

6.- ¿Por qué a la Brucelosis o fiebre de malta también se le denomina Fiebre ondulante?

PRACTICA 8 PRUEBA DE V.D.R.L. PARA IDENTIFICACIONDE SIFILIS

METODO CUALITATIVO

FUNDAMENTO: La prueba de V.D.R.L. es una prueba de floculación no treponémica microscópica que es utilizada para detectar y cuantificar reaginas, un Ac anti-lipídico (cardiolipina y lectina) encontrado en el suero o plasma de personas con sífilis y ocasionalmente en personas con infecciones agudas o crónicas en otras condiciones aparte de la sífilis.

OBJETIVO: El alumno recuerda y aplica el procedimiento de la prueba de V.D.R.L. como criterio para aceptar o descartar a un donador en función del resultado obtenido al analizar una muestra de suero.

MATERIAL: REACTIVOS:Tubo al vacío sin anticoagulante Suero problemaPlaca horadada para V.D.R.L. Reactivo para V.D.R.L.MicroscopioPipeta serológica desechablePipeta Pasteur

PROCEDIMIENTO:1.- Rotular los pocillos de la placa como Muestra, Control Positivo y Control negativo.2.-En uno de los pocillos de la placa de vidrio, dispensar 0.05 ml del suero con pipeta desechable3.- En pocillos diferentes y previamente marcados colocar una gota de suero control positivo y negativo, extender sobre la superficie del anillo.4.- Añadir una gota del Ag en suspensión estabilizado previamente y resuspendido, en cada una de las muestras utilizando la aguja No. 21 sin bisel.5.- Agitar la muestra durante 4 minutos con movimientos ondulatorios. 6.- Pasados los 4 minutos leer inmediatamente al microscopio con objetivo de 10X.

INTERPRETACIÓN:POSITIVO: Presencia de floculación mediana o grande, comparable con el control Positivo.

NEGATIVO: Ausencia de floculación.

ACTIVIDAD:

1.- ¿Que es la cardiolipina y por que se utiliza para el diagnóstico de sífilis?

2.- ¿Qué métodos son en la actualidad utilizados para el diagnóstico de sífilis, enlista en orden decreciente de importancia clínica?

3.- ¿Qué es la floculación?

4.- ¿Qué otro método nos permite identificar de forma eficaz y rápida ésta enfermedad?

PRACTICA 9 IDENTIFICACIÓN DE VIH Y HCV

METODO: INMUNOCROMATOGRAFICO CUALITATIVO

FUNDAMENTO: La prueba se basa en poner en contacto una muestra de suero con un conjugado de Ag viral-oro coloidal (VIH o HCV) embebido en el pocillo de muestra el cual reacciona con los Ac presentes en la muestra formando un complejo Ac-Ag-conjugado, la mezcla emigra a lo largo de la tira de prueba el cual es captado por un Ag de VIH recombinante inmovilizado en una membrana y formando una banda colorida en la región de prueba.Una muestra negativa no produce una banda colorida debido a la ausencia del complejo conjugado de oro coloidal/anticuerpos (anti-VIH o anti-HCV).Los Ag utilizados en la prueba de conjugado son proteínas recombinantes altamente inmunoreactivas de VIH-1 y VIH-2.Una banda coloreada en la región control aparece al final de la prueba sin considerar el resultado de la prueba. Esta banda control es el resultado de la unión del conjugado de oro coloidal al anticuerpo viral (VIH o VIH) inmovilizado en la membrana. La banda control indica que el conjugado de oro coloidal es funcional.

OBJETIVO: El alumno recuerda y aplica el procedimiento inmunocromatográfico para identificación de virus (VIH y HCV) dentro del proceso de selección del donador, a fin de dar seguridad a la sangre para donación.

MATERIAL: REACTIVOS:Tubo al vacío sin anticoagulante Suero ProblemaVial de reacción para VIH y HCV Solución de lavado para VIH y HCVPipeta PasteurTubo de ensaye 13X100Gradilla

PROCEDIMIENTO:1.- No abrir los sobres sellados hasta que se esté listo para la prueba. Dejar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente.2.- Sacar el cartucho de su sobre y colocarlo en una superficie seca.

3.- Identificar los cartuchos para cada muestra o control.

4.- Colocar una gota de muestra o control (con el gotero proporcionado) en el pocillo S. 5.- Posteriormente agregar 1 gota del diluyente en el pocillo S (para prueba de VIH) y en el pocillo D (para prueba de HCV).

INTERPRETACION:POSITIVO: Tanto la banda de prueba como la banda control se colorea de rojo púrpura.

NEGATIVO: Solo la banda control aparece de color rojo púrpura en la membrana.

INVALIDO: siempre tendrá que haber una banda color rojo púrpura en la región de control independientemente del resultado de la prueba. Si la banda control no se observa la prueba se considera inválida. Repetir la prueba empleando un nuevo cartucho.

C C C C CT T T T T

Positivo Negativo Inválido

ACTIVIDAD:

1.- ¿Que es un método inmunocromatográfico?

2.- ¿Qué muestras pueden ser utilizadas para éste método?

3.- ¿Cuál es la importancia clínica de realizar éstas determinaciones en una unidad de donación?

PRACTICA 10 IDENTIFICACIÓN DE HBsAg

FUNDAMENTO: Inmunoensayo de oro coloidal cuya reacción es tipo “sandwish”, que detecta el Ag de superficie de la Hepatitis B en muestras de sangre total, suero o plasma. El anti-HBsAg es inmovilizado en la región de prueba de la membrana de nitrocelulosa. Durante el ensayo la muestra inicial reacciona con el complejo del Ac monoclonal-conjugado de oro coloidal en el área de la muestra. Esta mezcla emigra a través de la membrana por acción capilar y reacciona con el anti- HBsAg en la región de prueba. Si la muestra contiene HBsAg se formará una banda coloreada en ésta región. Si no hay Ag en la muestra no se formará la línea, indicando un resultado negativo. Una banda coloreada siempre se formara en la región control lo que indica que el resultado de la prueba es válido.

OBJETIVO: El alumno conoce el procedimiento cualitativo para identificar HBsAg aplicando el método inmunocromatográfico a una muestra de suero, con el fin de evaluar a un donador y asegurar la confiabildad de una unidad de donación.

MATERIAL: REACTIVOS:Tubo al vacío sin anticoagulante Suero ProblemaVial de reacción para VIH y HCV Solución de lavado para VIH y HCVPipeta PasteurTubo de ensaye 13X100Gradilla

PROCEDIMIENTO:1.- No abrir los sobres sellados hasta que se esté listo para la prueba. Dejar que los reactivos y las muestras alcancen la temperatura ambiente.2.- Sacar el cartucho de su sobre y colocarlo en una superficie seca.3.- Identificar los cartuchos para cada muestra o control.4.- Colocar tres gotas de muestra o control (con el gotero proporcionado) en el pocillo S. 5.- Interpretar resultados a los 15 minutos exactos.

INTERPRETACION:POSITIVO: Tanto la banda de prueba como la banda control se colorea de rojo púrpura.NEGATIVO: Solo la banda control aparece de color rojo púrpura en la membrana. INVALIDO: siempre tendrá que haber una banda color rojo púrpura en la región de control independientemente del resultado de la prueba. Si la banda control no se observa la prueba se considera inválida. Repetir la prueba empleando un nuevo cartucho.

C C C C CT T T T T

Positivo Negativo Inválido

ACTIVIDAD:

1.- ¿Qué recomendaciones se hace para utilizar sangre total en éste procedimiento?

2.- ¿Qué es el HBsAg?

3.- ¿Qué ventajas ofrece una técnica de ELISA sobre una inmunocromatografía?

4.- Describe las variantes del procedimiento de ELISA y esquematiza el Fundamento de cada uno.

PRACTICA 11 PRUEBA DE COOMBS DIRECTA

FUNDAMENTO:Los anticuerpos incompletos se unen fácilmente con los sitios antigénicos de los eritrocitos revistiéndolos pero sin dar muestra de aglutinación, los Ac son antiglobulínicos (suero de Coombs) los eritrocitos revestidos IN VIVO, con un isoanticuerpo incompleto (anti-Rh, anti-Kell, anti-Duffy) resulta en una aglutinación de éstos eritrocitos.

OBJETIVO: El alumno aprende y comprende la técnica, con el fin de identificar una muestra de paciente sensibilizado y conozca así como sus implicaciones clínicas.

MATERIAL: REACTIVOS:Tubo al vacio con EDTA Muestra problema anticoaguladaTubos de ensaye 13X100 Eritrocitos control Rh pos y neg al 2%Pipeta Pasteur con bulbo Suero anti-D dil. 1:20Pipeta volumétrica de 10 ml Suero de CoombsIncubadora, termo block o termobaño Solución Salina Fisiológica (SSF)CronómetroCentrífuga

MUESTRA PROBLEMA: Eritrocitos lavados (generalmente de un lactante materno sensibilizado, o de paciente politransfundido). Se prepara en suspensión al 2% de eritrocitos. Agregar en un tubo de ensaye rotulado como problema: 7 ml de SSF mas de 5 a 10 gotas de la muestra sanguínea. Mezclar y centrifugar a 1500 RPM durante 1 min. Decantar cuidadosa y totalmente el sobrenadante y repetir el lavado 2 veces más. Preparar la suspensión al 2% en medio salino mezclando 2 gotas de los eritrocitos problema lavados mas 5 ml de SSF.

REACTIVO ANTI-D DILUCIÓN 1:20: Mezclar 1 gota de Anti-D mas 1 ml de SSF.

PROCEDIMIENTO:

CONTROL NEGATIVO

CONTROL POSITIVO

PROBLEMA

Anti-D Dil. 1:20 1 gota 1 gota --------------------Eritrocitos Rh (-) 2% 2 gotas ------------------- --------------------Eritrocitos Rh (+) 2% ------------------- 2 gotas --------------------Lavar 3 veces el sedimento agregando SSF a la mitad del tubo, centrifugar a 1500 RPM / 2 min y decantar lo mas posible. Suero de Coombs 2 gotas 2 gotas 2 gotasEritrocitos Problema al 2 %

------------------ ------------------ 2 gotas

Mezclar y centrifugar a 1000 RPM / 1 min. Observar presencia de aglutinación macro y microscópicamente.

INTERPRETACION:

Coombs Directo Positivo: Presencia de AglutinaciónCoombs Directo Negativo: Ausencia de Aglutinación

ACTIVIDAD:1.- Esquematiza los diferentes tipo de Inmunoglobulinas

2.- Esquematiza la reacción Ag-Ac en la prueba de Coombs directa e indirecta

3.- ¿Que clase de Inmunoglublinas son las que se encuentran presentes en el suero de Coombs?

4.- ¿En que pacientes suele dar positiva ésta prueba y por que?

5.- ¿Antes de realizar un Coombs Directo que es lo primero que se debe verificar?

PRACTICA 8 PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA

FUNDAMENTO: Los anticuerpos incompletos conocidos o desconocidos se unen fácilmente con los sitios antigénicos de los eritrocitos revistiéndolos pero sin dar muestra de aglutinación. Al adicionar suero con anticuerpos antiglobulínicos (suero de Coombs) estos forman un puente con los anticuerpos (globulinas) de los eritrocitos revestidos IN VITRO, con isoanticuerpos completos (anti-Rh, anti-Kell, anti-Duffy) presentes en el suero de la madre o eritrocitos transfundidos resultando la aglutinación de los eritrocitos revestidos.

OBJETIVO: El alumno aprende y comprende la técnica para realizar la prueba de Coombs indirecta, a fin de identificar una sensibilización in-vivo por una reacción de incompatibilidad previa al proceso, incrementando con esto sus conocimientos confirmando su desempeño en el banco de sangre.

MATERIAL: REACTIVOS:Tubos de ensaye 13X100 Muestra del suero problemaPipeta Pasteur con bulbo Eritrocitos Rh pos al 2%Pipeta volumétrica de 10 ml y 1 ml Suero anti-D dil. 1:20Incubadora, termo block o termobaño Suero de CoombsCronómetro Solución Salina Fisiológica (SSF)Centrífuga

MUESTRA PROBLEMA: Suero de la madre o del paciente politransfundido.

ERITROCITOS CONTROL: Eritrocitos lavados Rh pos. Se prepara en suspensión al 2% de eritrocitos. Agregar en un tubo de ensaye rotulado como problema: 7 ml de SSF más de 5 a 10 gotas de la muestra sanguínea. Mezclar y centrifugar a 1500 RPM durante 1 min. Decantar cuidadosa y totalmente el sobrenadante y repetir el lavado 2 veces más. Preparar la suspensión al 2% en medio salino mezclando 2 gotas de los eritrocitos control lavados más 5 ml de SSF.

REACTIVO ANTI-D DILUSIÓN 1:20: Mezclar 1 gota de Anti-D más 1 ml de SSF.

PROCEDIMIENTO:

Numere del 1 al 12 tubos 13X100. 2.- Deposite 0.1 ml de SSF en los tubos del 2 al 10. 3.- Añadir 0.1 ml de suero problema a los tubos 1 y 2. 4.-A partir del tubo 2, preparar la dilución en razón progresiva doble tomando 0.1 ml de la mezcla del tubo 2 y pasarlo al 3, mezclar y tomar nuevamente 0.1 ml de la mezcla del tubo 3 y pasarlo al tubo 4 y así sucesivamente hasta el tubo 10, del cual se desechara el volumen correspondiente a 0.1 ml de la mezcla.

Tubos problema(del 1 al 10)

Control Positivo Control Negativo

Eritrocitos Rh (+) 0.1 ml a cada tubo 2 gotas 2 gotasAnti-D dil. 1:20 ---------------- 2 gotas -----------------Mezclar e incubar 60 min / 37 º C los 12 tubos.Centrifugar 1 min / 1500 RPM, realizar la primera observación para verificar la presencia de aglutinación o hemólisis. Lavar 3 veces con SSF, centrifugando 1 min / 1000 RPM. Decantar lo más posible.Suero de Coombs 1 gota 1 gota 1 gotaMezclar y centrifugar 1 min / 1000 RPM, realizar la segunda observación buscando la presencia de aglutinación.

INTERPRETACION:

COOMBS INDIRECTO NEGATIVO: Sin aglutinación en la 1ª y 2ª observación

COOMBS INDIRECTO POSITIVO: Con aglutinación en la 2ª observación.

ANTICUERPOS SALINOS POSITIVOS: Con aglutinación en la 1ª observación.

ACTIVIDAD:

1.- ¿A que hace referencia una prueba de Coombs Indirecta positiva?

2.- ¿Qué diferencia hay en la interpretación de un Coombs directo y uno Indirecto?

3.- ¿Para que utilizas el suero Anti-D diluido 1:20 en ésta prueba?

PRACTICA 9 PRUEBAS DE COMPATIBILIDAD:

PRUEBAS CRUZADAS

Importancia de las pruebas cruzadas y de la búsqueda de anticuerpos

RESUMEN

Las pruebas cruzadas y la búsqueda de anticuerpos son de suma importancia, ya que permiten que los antígenos y anticuerpos puedan ser detectados y estudiados en el laboratorio; nos ayudan a prevenir la transfusión de sangre incompatible, y proveen al paciente de máxima seguridad y beneficio. Antes de realizar cada procedimiento es muy importante contar con un excelente control de calidad, el cual nos permitirá verificar todos los procesos y etapas que influirán en la detección de los anticuerpos. Las pruebas cruzadas normalmente se llevan a cabo en cuatro fases: lectura rápida, lectura de 37º, lectura 37º/Coombs, validación con eritrocitos sensibilizados. El medio que rodea la prueba está muy relacionado con los potenciadores y con la fuerza iónica que favorece la reacción antígeno-anticuerpo, por lo que debe ser capaz de detectar anticuerpos activos a bajas temperaturas y diferenciar entre reacciones positivas verdaderas y falsas. La investigación de anticuerpos irregulares libres en suero se debe realizar por lo menos con dos técnicas. Una segunda técnica puede ser un medio hiperproteico como albúmina, o enzimas como bromelina o LISS, siendo esta última la más eficaz.

Prueba de compatibilidad

La prueba cruzada mayor incluye técnicas que permiten demostrarla ausencia de anticuerpos regulares e irregulares de importancia clínica en el suero del receptor contra eritrocitos del donador.La prueba cruzada menor detecta anticuerpos en el suero del receptor, particularmente cuando se pretende transfundir sangre total proveniente de un donador con antecedentes propiciadores de aloinmunizaciòn. (embarazos o transfusiones previas).

El auto testigo cosiste en poner en un tubo debidamente identificado suero del paciente y suspensión de glóbulos rojos del mismo al 5%,incubado y leído con los mismos pasos de la prueba cruzada.

FUNDAMENTO:Las pruebas de compatibilidad son un procedimiento de Laboratorio que permite conocer si existe compatibilidad serológica entre la sangre de una persona donante y la de un receptor.

OBJETIVO: Que el alumno aprenda el procedimiento y comprenda el fundamento de la técnica para las pruebas cruzadas, a fin de evidenciar las reacciones de incompatibilidad entre el donador y receptor y de ésta manera dar un servicio de calidad aportando una unidad de sangre segura.

MATERIAL: REACTIVOS:Tubos al vacío sin anticoagulante Sangre del DonadorTubos al vacio con EDTA Sangre del ReceptorGradilla Albúmina 22%Tubos de ensaye 13X100 BromelasaPipeta Pasteur Suero de CoombsPizeta con SSFIncubadora

PROCEDIMIENTO:1.- Verificar que las muestras estén etiquetadas: Donador y Receptor2.- Lavar los eritrocitos 3 veces con solución salina 3 minutos a 3400 rpm3.- Se rotulan los tubos para llevar acabo las pruebas.

Ms Ma Mb ms ma mb ATgR donador 2 g 2g 2g ---- ---- ---- ----gR receptor ---- ---- ---- 2g 2g 2g 2gSuero/Plasma donador

---- ---- ---- 2g 2g 2g ----

Suero/Plasma receptor

2 g 2g 2g ---- ---- ---- 2g

Albumina al 22% ---- 3g ---- ---- 3g ---- ----Bromelasa ---- ---- 3g ---- ---- 3g ----Mezclar y centrifugar 15 seg a 3400 rpm.Observar presencia de aglutinación o hemólisis. Para albumina y bromelasa centrifugar 45 segundos.

Fase I

Se dejan a Ta de 15 a 30 min

Se incuba a 37ºC de 15 a 30 min.

Mezclar y centrifugar 15 segundos a 3400 rpm.Observar presencia de aglutinación. Para albumina y bromelasa centrifugar 45 segundos.Lavar los eritrocitos de todos los tubas 3 veces con SSF 3 min a 3400rpmSuero de Coombs 2g 2g 2g 2g 2g 2g 2gMezclar y centrifugar 15 segundos a 3400 rpm.Observar presencia de aglutinación. Si no hay aglutinación o hemólisis, se agrega a cada tubo una gota de células sensibilizadas para verificar el consumo.

OBSERVAR: Se observa el sobrenadante en busca de hemólisis, después agitando suavemente e inclinando el tubo para apreciar cualquier aglutinación, por débil que sea, se debe deshacer completamente el botón celular.

Fase II

Fase III

INTERPRETACION:

INCOMPATIBLE: En caso de observarse hemólisis o aglutinación en cualquiera de las fases. (Pero se debe proceder a determinar el porque de la incompatibilidad).

NOTA: Después de agregar las células control, se deberá apreciar una aglutinación, de no ser así la prueba no se puede dar por válida y tendrá que repetirse.

A los plasmas, plasmas frescos-congelados, y concentrados plaquetarios, se les deberá correr la prueba menor.

VALORACION DE LAS REACCIONES CRUZADAS

1.-Aglutinacion en todos los tubos. a) Incompatibilidad ABO: en este caso la aglutinación será particularmente importante en el tubo con suero a temperatura ambiente. b) Presencia en el suero de poliaglutinina. c) Contaminación de los glóbulos del donador.

2.- Aglutinacion en el tubo de suero a temp. ambiente solamente.Indica con toda probabilidad un anticuerpo en frio, por ejemplo aglutininas en frio de las infecciones virales. Este tipo de aglutinación habitualmente carece de importancia siempre y cuando los otros tubos sean negativos. Es preciso estudiar el titulo y la especificidad de cualquier hemolisina de este tipo.

3._Aglutinacion en los tubos de albumina y de coombs.Casi seguramente se debe a un anticuerpo caliente. La sangre debe considerarse como incompatible.Debe estudiarse el titulo y la especificidad del anticuerpo.

4._Positividad de la prueba de Coombs solamente. Lo mas probable es que también se deba a un anticuerpo incompleto caliente(ejemplo anti-Kell) se considera la sangre como incompatible ACTIVIDAD:1.- Describe cada una de las reacciones transfuncionales

• Reacciones hemolíticas

• Reacción transfusional infecciosa

• Reacciones alérgicas

• Reacciones pirogénicas

• Reacción clínica

2.- Menciona que tipos de anticuerpos son detectados en las pruebas cruzadas.

3.- Identifica las condiciones y los factores que influyen en los resultados de las reacciones Ag-Ac

BIBLIOGRAFIA:

DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO CLINICO por el laboratorio, John Bernard Henrry, MASSON-SALVAT, Barcelona, España.

METODOS DE LABORATORIO, Lynch Raphael, editorial INTERAMERICANA, México, D.F.

EL MANUAL DE MERCK DE DIAGNOSTICO Y TERAPEUTICA, Editorial OCEANO/CENTRUM, 9ª EDICIÓN.

DIAGNÓSTICO CLÍNICO POR EL LABORATORIO, Tood-Sanford, SALVAT Editores, 6ª Edición, Barcelona, España.