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CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT- SECRETARÍA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT- FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

INFORME FINAL

“AISLAMIENTO Y MODIFICACIÓN ESTRUCTURAL DE CEMBRANOIDES 2-11 CICLIZADOS DE Briareum asbestinum, PARA POTENCIALIZAR SU

CITOTOXICIDAD Y PROPIEDADES ANTICÁNCER”

PROYECTO FODECYT No. 13-2004

OSCAR MANUEL CÓBAR PINTO Investigador Principal

GUATEMALA, ENERO DE 2009

Facultad de Ciencias Químicas Universidad de San Carlos y Farmacia

AGRADECIMIENTOS

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología –FONACYT-, otorgado por la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT- y del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología –CONCYT-, Proyecto FODECYT 13-2004.

OTROS AGRADECIMIENTOS Al equipo de investigación: Lic. Abraham Alejandro Vásquez Mencos, Lic. Jorge Alejandro Torres Flores, Licda. Ruth Yarseny Molina Gonón, Lic. Luis Hugo Santa Cruz Cruz, Br. Ana Lucrecia Gómez López. Al Dr. Abimael D. Rodríguez del Departamento de Química, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Puerto Rico, Recinto de Río Piedras. A los Laboratorios de los Departamentos de: Química Orgánica, Fisicoquímica, Unidad de Bioensayos del Laboratorio de Investigación en Productos Naturales –LIPRONAT- de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala y Química de Productos Naturales Marinos de la Universidad de Puerto Rico, Recinto de Río Piedras. Licda. Stella María Cóbar Coronado y Br. Jorge Arroyo Robles, por su apoyo en la elaboración del manuscrito “Survey of 2,11-cyclized cembranoids from Caribbean sources”, publicado en Natural Product Resarch. 2009, 23 (1), 26-43.

CONTENIDO

Página

RESUMEN 01

ABSTRACT 02

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN 03

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 04

I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS 06

I.4 METODOLOGÍA 07

PARTE II

MARCO TEÓRICO 12

PARTE III

III.1 RESULTADOS 17

III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 33

PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES 42

IV.2 RECOMENDACIONES 44

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45

IV.4 ANEXOS 49

Extracción, fraccionamiento, separación, purificación de

cembranoides 2,11-ciclizados naturales y síntesis de derivados. 49

Esquema de Aislamiento de Briareum asbestinum. 52

Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-ciclizados naturales. 53

Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-ciclizados 6-ester urocánicos. 55

Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-cicizados 6-glucosidados. 57

Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-ciclizados utilizados como comparación. 58

Survey of 2,11-ciclyzed cembranoids from Caribbean sources. 60

PARTE V

INFORME FINANCIERO 61

1

RESUMEN

Esta investigación generó conocimiento básico sobre las propiedades citotóxicas y

farmacofóricas de cembranoides 2,11-ciclizados (Asbestininos y Briarellinas), naturales y

estructuralmente modificados, aislados del gorgonio caribeño Briareum asbestinum, con

el objetivo de incrementar su citotoxicidad y posteriormente preparar extractos con

propiedades anticáncer, que contengan estos metabolitos secundarios.

La investigación se desarrolló en cuatro fases de trabajo:

En la primera fase se obtiene Briareum asbestinum colectado en aguas de “Isla de

Mona” parte norte de Puerto Rico, por el Dr. Abimael Rodríguez del Laboratorio de

Química de Productos Naturales Marinos, de la Facultad de Ciencias Naturales del

Recinto de Río Piedras de la Universidad de Puerto Rico.

En la segunda fase, se extrae, aisla, purifica e identifica cinco cebranoides 2-11

ciclizados, cuatro con un grupo hidroxilo sobre el carbono 6 de la molécula (Asbestinino

7, Asbestinino 20, 4-deoxyasbestinino G y Briarellina E) y uno con un grupo carbonilo

sobre el carbono 6 de la molécula (Asbestinino 9).

La tercera fase consistió en la síntesis orgánica de un derivado glusosidado (6-

glucósido de Asbestinino 7) y cuatro derivados 6-ester urocánicos (6-ester urocánico de

Asbestinino 7, 6-ester urocánico de Asbestinino 20, 6-ester urocánico de 4-

deoxyasbestinino G y 6-ester urocánico de Briarellina E).

La cuarta fase “estudio de la actividad citotóxica de los productos sintetizados y

de sus propiedades farmacofóricas”, permitió determinar la CL50 (Concentración Letal

Media) contra nauplios de Artemia salina de cuatro metabolitos naturales y cinco

modificados, además de las propiedades farmacofóricas de los cinco cembranoides 2,11-

ciclizados naturales aislados, los cinco modificados estructuralmente y tres utilizados

para fines de comparación.

Se concluye que la CL50 de los derivados 6-ester urocánicos es mayor que la de

aquellos análogos naturales que se encuentra ya reportada en la literatura y determinada

por la misma metodología.

El derivado 6-glucósido de Asbestinino 7 sintetizado mostró una CL50 mucho

mayor (menos tóxico) que los cuatro cembranoides naturales aislados y los cuatro

derivados 6-ester urocánicos sintetizados.

Adicionalmente, todos los cembranoides 2,11-ciclizados estudiados, presentan

propiedades farmacofóricas importantes que los ubica como probables moléculas sujetas

a posteriores estudios.

Estas propiedades se obtuvieron utilizando software de última generación y

comparando los cembranoides 2,11-ciclizados naturales aislados y sus derivados

sintetizados, con tres moléculas que poseen el mismo esqueleto carbonado que son objeto

de estudio en el FDA -Food and Drug Administration- de los Estados Unidos como

medicamentos anticáncer.

Los resultados de esta investigación demostraron la alta potencialidad que tienen

estos metabolitos secundarios de origen marino como probables medicamentos

anticáncer, ya que los derivados modificados estructuralmente, al esterificarlos con ácido

urocánico, demostraron valores de Concentración Letal Media (CL50) en contra de

nauplios de artemia salina superiores a los obtenidos del compuesto utilizado como

2

materia prima, incluso valores que se encuentran a nivel nanomolar (10-9

Molar),

comparables a los obtenidos por Eleuterobina, cembranoide 2,11 ciclizado que se

encuentra en estudios de Fase Clínica II como medicamento anticáncer en el FDA de los

Estados Unidos de América.

Se elaboró una extensa revisión bibliográfica sobre este tipo de compuestos, que

generaron una publicación científica en la revista arbitrada “Natural Product Research”

de Taylor & Francis Editores; Oscar M. Cóbar. Survey of 2,11-cyclized cembranoids

from Caribbean sources. Natural Product Research. 2009, 23 (1), 26-43. De esta forma, se contribuye con las líneas de investigación sobre “Uso de

Productos Naturales y Determinación de Principios Activos de la Comisión Técnica

Intersectorial de Salud, Estudios sobre Especies Silvestres de Flora y Fauna” de la

Comisión Intersectorial de Medio Ambiente y la generación de conocimiento básico en

Química Orgánica de la Comisión de Ciencias Básicas del Sistema Nacional de Ciencia y

Tecnología, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología y del Sistema de Investigación de

la Universidad de San Carlos de Guatemala, con probable aplicación directa a la salud de

los guatemaltecos.

ABSTRACT

Five 2,11-ciclized cembranoids was isolated from the gorgonian Briareum

asbestinum collected at Mona island, North of Puerto Rico (Asbestinins 7, 9, 20, 4-

deoxyasbestinin G and Briarellin E), four 6-ester urocanic cembranoids (6-ester urocanic

of Asbestinin 7, 6-ester urocanic of Asbestinin 9, 6-ester urocanic of 4-deoxyasbestinin G

and 6-ester urocanic of Briarellin E) and one 6-glucosyde cembranoid (6-glucosyde of

Asbestinin 7) was synthesized.

Four natural compounds (Asbestinin 7, Asbestinin 20, 4-deoxyasbestinin G and

Briarellin E) and all the four 6-ester urocanic synthetic cembranoids showed CL50 values

against A. salina at nanomolar level. The later comparable with those of Eleutherobin and

more potent that their natural homologues.

The CL50 showed by the 6-glycoside of Asbestinin 7 was at micromolar level, one

thousand less potent that its 6-ester urocanic and natural homologues.

The principal pharmacophoric properties was calculated for all the five natural

compounds isolated, the five synthesized and three natural 2,11 cyclized cembranoids of

the Sarcodyctin Class for comparison purposes.

An extensive bibliographic revision was performed on 2,11 cyclized cembranoids

literature, that generate a scientific paper published in Natural Product Research of

Taylor & Francis Editors; Oscar M. Cóbar. Survey of 2,11-cyclized cembranoids from

Caribbean sources. Natural Product Research. 2009, 23 (1), 26-43.

3

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN

Producir una cantidad adecuada y sustentable de metabolitos secundarios

bioactivos, para su posterior estudio de actividad biológica y uso medicinal es uno de los

principales retos en el estudio de la química de los invertebrados marinos.

El porcentaje de rendimiento de estos compuestos orgánicos, cuando se aislan

directamente del organismo que los produce, es bajo, obteniéndose entre 0.001 y 0.01%

de peso seco del organismo productor (10 mg de compuesto por Kg de peso seco)

(Wright, A.E. 1998).

La Síntesis Orgánica muy a menudo es inaccesible, debido a la complejidad de las

estructuras de estos metabolitos, lográndose algunas síntesis totales con rendimientos

globales del 2-3% en el mejor de los casos y sumamente costosas para su aplicación a

nivel comercial.

Se ha reportado a la fecha la síntesis de tres cembranoides 2,11-ciclizados

del Caribe Mesoamericano, Briarellinas E y F (Corminboeuf, O. et. al. 2003) y 4-

deoxyasbestinino D (Crimmins, M.T.; Ellis, J.M. 2005), obteniéndose en un 1.5-2.0 % de

rendimiento.

Experimentalmente han existido dificultades para el crecimiento de invertebrados

marinos fuera de su hábitat natural, sin embargo existen algunos ejemplos exitosos

(Ojima, I. et. al. 1999, Munro, M. et. al. 1999, Taglialatela-Scafati, O. et. al. 2002).

La fauna invertebrada marina es especialmente rica en las aguas del Caribe

Mesoamericano, situándose como la segunda barrera de arrecifes más grande del mundo,

detrás de la gran barrera de arrecifes de Australia y por encima de las aguas del Pacífico,

las que son especialmente abundantes cerca de las costas de Okinawa y las islas del Japón

y Filipinas (Faulkner, D.J. 2000).

Debido al estrés a que se ven sometidos estos invertebrados marinos, sésiles y sin

defensas físicas, biosintetizan compuestos orgánicos como mecanismos de defensa para

rechazar a sus depredadores.

Estos metabolitos secundarios poseen estructuras químicas sin precedentes y han

demostrado poseer actividad biológica hasta diez veces mayor que los aislados del mundo

terrestre, por lo que su estudio como potenciales fármacos ha crecido durante los últimos

veinte años, reportándose alrededor de 5,000 moléculas nuevas, la mayoría con potente

actividad biológica (Faulkner, D. J. 2000, Newman, D.J.; Cragg, G.M.; 2007, Blunt J.W.

et. al. 2007).

Actualmente el avance de las técnicas espectroscópicas y espectrométricas en la

elucidación estructural de moléculas orgánicas, así como en las técnicas de estudio in

vitro de actividad biológica y modelaje molecular ha permitido el desarrollo actual de

este campo (Blagg, J. 2006, Gassner, N.C. 2007).

Utilizando el conocimiento existente sobre la estructura y química de

cembranoides 2,11-ciclizados del Caribe Mesoamericano, las técnicas de aislamiento y

elucidación estructural, la metodología para determinar su citotoxicidad y propiedades

farmacofóricas, se procedió a generar conocimiento científico que ubica a estas

moléculas de origen marino como potenciales medicamentos anticáncer.

4

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La química de Productos Naturales Marinos es relativamente reciente, aislándose

más de siete mil moléculas, la gran mayoría con estructura química distinta a la

observada en el mundo terrestre y con actividad biológica hasta diez veces mayor.

En la actualidad el estudio de estos compuestos orgánicos aislados del Caribe

mesoamericano ha cobrado auge, teniéndose varios compuestos estudiándose como

probables medicamentos anticáncer en el FDA de los Estados Unidos de América e

incluso con uno de ellos ya comercializándose (Ecteinascidina 743 o Trabectedin®

).

Los cembranoides 2,11-ciclizados están poco estudiados en cuanto a su potencial

actividad biológica, existiendo únicamente el trabajo de Cinel y colaboradores sobre

Eleutherósidos (Cinel, B. et.al. 2000), de su modificación estructural con fines de

potencializar dicha actividad.

Esta investigación está orientada a generar conocimiento básico sobre las

propiedades citotóxicas de cembranoides 2,11 ciclizados (Asbestininos y Briarellinas),

estructuralmente modificados y aislados del gorgonio caribeño Briareum asbestinum, con

el objetivo de incrementar su citotoxicidad y posteriormente preparar extractos con

propiedades anticáncer, que contengan estos metabolitos secundarios.

I.2.1 Antecedentes en Guatemala.

En Guatemala, únicamente la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia realiza

investigación científica sobre la química de invertebrados marinos. El equipo de

investigación, coordinado por el Dr. Oscar Cóbar, ha realizado desde 2,002

investigaciones sobre aislamiento y elucidación estructural de metabolitos secundarios de

corales blandos (Velásquez, P.; Cóbar, O.M. 2006), estudios sobre la actividad biológica

no estudiada de estos metabolitos secundarios (Cóbar, S.M.; Cóbar, O.M. 2006), síntesis

de moléculas aisladas con el objetivo de estudiar su actividad biológica (Cóbar, O.M.;

Vásquez, A.A. 2004) y cultivo de invertebrados marinos para aislar metabolitos

secundarios activos (Cóbar, O.M. et. al. 2006).

Este es el primer trabajo que se realiza, a nivel mundial sobre modificación

estructural de Asbestininos y Briarellinas con fines de potencializar su citotoxicidad.

Adicionalmente es el primer estudio sobre las propiedades farmacofóricas in-vitro

que se realiza a nivel mundial sobre este tipo de compuestos.

I.2.2 Justificación.

El número importante de cembranoides 2,11-ciclizados, aunado a su variada y

sorprendente actividad biológica y aspectos estructurales únicos, las hacen moléculas que

deben ser sujetas a estudios profundos, tanto en su potencial farmacológico, como en el

análisis de la relación entre su estructura y actividad biológica, para planificar su síntesis

orgánica y producción a nivel macro.

I.2.3 Impacto del proyecto.

A mediano plazo puede continuar estudiándose otro tipo de actividad biológica que

permita darle una utilizad biomédica a estos compuestos, que pueden ser patentados al ser

compuestos nuevos (sin precedente en la literatura).

5

A largo plazo se pretende cultivar este gorgonio en ambientes artificiales exsitu,

para que produzca estos metabolitos y tener materia prima para producir los derivados

sintetizados e incluso poder comercializar extractos de B. asbestinum como

medicamentos naturales anticáncer a bajo costo.

No obstante ser un proyecto de investigación básica, su proyección directa al sector

salud del país es alta.

Los resultados de la investigación serán publicados en al menos una revista

arbitrada de carácter internacional, en revistas científicas nacionales y congresos

internacionales sobre la temática.

Las moléculas bioactivas sintetizadas pueden ser patentadas a nivel nacional o

internacionalmente, previo acuerdo entre el CONCYT, la Universidad de San Carlos y

los autores de la investigación.

6

I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS

I.3.1 Objetivos

I.3.1.1 General

Aislar, modificar estructuralmente y determinar la actividad citotóxica de cuatro

cembranoides 2-11 ciclizados hidroxilados, aislados del gorgonio caribeño Briareum

asbestinum.

I.3.1.2 Específicos

I.4.1.2.1 Sintetizar al menos un cembranoide 2-11 ciclizado glucosidado mediante la

reacción de O-glicosidación.

I.4.1.2.2 Sintetizar cuatro cembranoides 2-11 ciclizados ester-urocánicos mediante la

reacción de esterificación.

I.4.1.2.3 Determinar la actividad citotóxica de los derivados de los cembranoides 2-11

ciclizados sintetizados.

I.4.1.2.4 Comparar la actividad citotóxica reportada de los cembranoides 2-11 ciclizados

naturales con la obtenida de los derivados de cembranoides 2-11 ciclizados.

I.3.1.3 Hipótesis

Los cembranoides 2,11-ciclizados estructuralmente modificados poseen mayor actividad

citotóxica que los de origen natural.

7

I.4 METODOLOGIA

I.4.1 Diseño, población a estudiar y muestra.

I.4.1.1 Universo.

Se selecciona el gorgonio caribeño Briareum asbestinum, al conocerse su

composición de cembranoides 2-11 ciclizados, la metodología extractiva y la ubicación

de poblaciones de este invertebrado marino en el área de la costa atlántica guatemalteca y

del Caribe mesoamericano.

I.4.1.2 Población.

Aproximadamente 0.5 kg de peso seco de especímenes de Briareum asbestinum.

I.4.1.3. Obtención, procesamiento y transporte de la muestra de material a estudiar.

El organismo fue colectado en aguas de la Isla de Mona, Puerto Rico en 1994, a

10-15 metros de profundidad utilizando buceo, coordenadas 18º03´19.05´´ Norte y

67º45´32.00´´ Oeste, identificado por el Dr. Abimael Rodríguez.

La muestra se colocó en bolsas plásticas inmediatamente luego de colectadas y

colocadas en hieleras equipadas con hielo seco (-10oC), transportadas inmediatamente al

laboratorio.

Se procede a su liofilización (LABCONCO® de 12 litros de capacidad) para

separar el agua de mar y se pesa.

I.4.1.4. Modelo de muestreo.

Se utilizó un modelo de tipo estratificado, preferencial y por conveniencia.

Los estratos (asociaciones del gorgonio aparentemente homogéneas entre sí) se

definieron por exploraciones de buceo previas y preliminares en la expedición de colecta.

I.4.1.5.Preparación de extracto crudo.

Luego del proceso de liofilización, el organismo seco, es macerado

exhaustivamente en CHCl3/MeOH (1:1), hasta obtenerse aproximadamente 10 litros de

extracto crudo.

El extracto fluido se concentra a presión reducida a una temperatura inferior a los

45°C utilizando un evaporador rotatorio (Buchi® modelo R215), se elimina todo el

solvente utilizando una bomba de alto vacío y se pesa.

Los extractos orgánicos, fracciones, cembranoides 2,11-ciclizados naturales aislados

y sintetizados, fueron procesados en el Laboratorio de Investigación en Productos

Naturales Marinos de la Universidad de Puerto Rico, Recinto de Río Piedras, Puerto

Rico, con ubicación en 18º24´07.79´´ Norte y 66º03´00.87´´ Oeste, a 30 MSNM y una

temperatura media de 28oC y Laboratorio de Investigación de Productos Naturales de la

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de

Guatemala, ubicado en 14º36´03.55´´ Norte y 99º33´45.40´´ Oeste, a 1517 MSNM y

temperatura media de 23 oC.

8

I.4.1.6. Preparación de extractos orgánicos.

El extracto crudo seco, se suspende en agua y somete a extracción líquido/líquido con

n-hexano, luego CHCl3 y finalmente MeOH.

Se utilizan solventes grado reactivo, realizándose 4 o 5 extracciones con cada uno

I.4.2 Aislamiento de asbestininos y briarellinas (Cóbar, O.M. 1996).

I.4.2.1 Separación por Cromatografía de Exclusión de Tamaño.

El extracto n-hexánico se somete a cromatografía en columna utilizando

Biobeads® como fase estacionaria y tolueno como fase móvil. Se obtienen cuatro

fracciones, monitoreadas por cromatografía en capa fina utilizado acetato de etilo/n-

hexano (7:3) como fase móvil, siendo las fracciones 3 y 4 las ricas en Asbestininos

(Rodríguez, et. al. 1994). El extracto clorofórmico es rico en Briarellinas y Briareinas

(Rodríguez A.D.; Cóbar, O.M. 1995a).

I.4.2.2 Aislamiento y purificación vía Cromatografía en Columna y Cromatografía

Líquida de Alta Resolución –HPLC-.

Las fracciones 3 y 4 provenientes de la etapa anterior se someten a cromatografía

en columna utilizando Sílica Gel G como fase estacionaria y n-hexano/acetato de etilo

(7:3) como fase móvil. De ser necesario se purifica via HPLC (Shimadzu® modelo LC 20

AT) utilizando el mismo sistema de solventes. El extracto clorofórmico se fracciona por

el mismo método, utilizando y purifica utilizando n-hexano/acetato de etilo (8:2) y

purifica vía HPLC, utilizando MeOH/H2O (97:3 hasta 90:10 de ser necesario) en

columna de fase reversa ODS (Alltech 250 mm X 4.6 mm, tamaño de partícula de 5 m).

I.4.2.3 Identificación de cembranoides 2,11-ciclizados aislados.

Las fracciones puras obtenidas, se someten a Resonancia Magnética Nuclear de

Protón y de Carbono trece (Espectrómetro Bruker®

multinuclear modelo DRX 500,

utlizando CDCl3 como solvente) para identificarlos (Rodríguez, A.D. et. al. 1994,

Rodríguez, A.D.; Cóbar, O.M. 1995a; Rodríguez A.D.; Cóbar, O.M. 1995b).

Los compuestos obtenidos que posean un grupo hidroxilo en el carbono 6, se

utilizarán para su derivatización.

I.4.3 Modificación estructural de asbestininos y briarellinas.

I.4.3.1 Glucosidación (Toshima, K.; Tatsuta, K. 1993, Nicolau, K.; Mitchell, H. 2001,

Euzen, R. et. al. 2007).

I.4.3.1.1 Benzoilación de Asbestinino 7 (Reich, M. 2001).

60 mg de Asbestinino 7 se disuelven en una mezcla de 2.5 mL de anhidrido

benzoico disuelto en n-hexano, 2.0 mL de DCC y 2.0 mL de DMAP.

La mezcla se agita a temperatura ambiente durante 48 horas y luego remueve el

solvente por rotaevaporación.

El residuo es particionado entre agua 2.0 mL y éter dietílico 2.0 mL, se separa la

fase orgánica.

9

La fase acuosa es nuevamente particionada con 2.0 mL de éter dietílico y

combinan las fracciones orgánicas.

Las fracción orgánica combinada se rotaevapora y deseca sobre sulfato de

magnesio.

Se caracteriza el producto por su punto de fusión, 1H-RMN y peso molecular.

Se espera obtener 48.0 mg de Asbestinino 7-6-benzoilado (80% de rendimiento de

la reacción).

I.4.3.1.2 Glucosidación de Asbestinino 7-6-benzoilado.

54 mg (1 mmol) de 2,3,4,6-tetra-O-bencill-glucopiranosa (obtenida de Fluka AG,

Buchs, Suiza), 17 mg (005 mmol) de sulfato ácido de tetrabutilamonio y 34 mg (6 mmol)

de hidróxido de potasio finamente dividido, se disuelven en 15 ml of dietoxymetano y

enfría a 0° C.

A esta temperatura, 35 mg (0.06 mmol) of Asbestinino 7-6-benzoilado se añaden

a la mezcla, la cual se agita por 1 hora vigorosamente. Se añaden luego 15 mL de

benceno, se filtra el precipitado y evapora a sequedad.

El sólido se mezcla con una solución de 10 mL de agua y 5 mL de etanol,

añadiéndosele 10 mL de KOH al 50% y reflujado durante 8 horas.

La mezcla se enfría a 0oC, se lleva a pH 8 con HCl al 10% y se elimina el solvente

por alto vacío.

El residuo es mezclado con 15 mL de agua y 20 mL de acetato de etilo,

llevándose la fase acuosa a pH 5 agitándolo con HCl al 10%.

Se separa la fase orgánica y la fase acuosa se extrae una vez más con 10 mL de

acetato de etilo y combina con la fase orgánica.

La fase orgánica combinada se seca con sulfato de magnesio y evapora el

solvente.

El residuo se somete a Cromatografía en Columna utilizando Silica Gel G 60

como fase estacionaria y diclorometano/n-hexano/etanol (20:8:2).

El producto obtenido se concentra por rotaevaporación y obtiene el producto

sólido.

Se determina su punto de fusión, 1H-RMN y obtiene el peso molecular para

identificar el compuesto.

I.4.3.2 Esterificación con ácido urocánico (Tenakado, D.; Oriyama, D. 2006, Reich, M.

2001).

Aproximadamente 30 mg del asbestinino o briarellina correspondiente se disuelven

en una mezcla de 2.5 mL de ácido urocánico, 2.0 mL de DCC y 2.0 mL de DMAP se

agitan a 25oc durante 48 horas.

El exceso de reactivo se remueve por rotaevaporación y el residuo obtenido se

particiona entre agua y éter dietílico.

Los extractos etéreos combinados se desecan sobre Na2SO4 para obtener el éster

urocánico correspondiente.

10

I.4.3.3 Elucidación estructural de Cembranoides 2,11-ciclizados derivatizados

(Cóbar, O.M. 1996).

Los cembranoides 2,11-ciclizados derivatizados, se someten a Resonancia

Magnética Nuclear de Protón y de Carbono 13 para identificarlos para determinar si

efectivamente la reacción se realizó. Se espera modificaciones en ambos espectros,

específicamente señales derivadas de los carbonos de la glucosa y del ácido urocánico,

ubicados ahora en sobre el Carbono 6 del cembranoide.

Adicionalmente se somete a Espectrometría de Masas por Impacto Electrónico para

obtener el peso molecular y su patrón de fragmentación para confirmar su estructura.

I.4.3.4 Determinación de la Actividad Citotóxica de Cembranoides 2,11-ciclizados

Derivatizados (CYTED 1995).

Los derivados sintetizados son sometidos a pruebas de actividad citotóxica,

utilizando la metodología estándar del Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología

para el Desarrollo (CYTED) de 1995, este ensayo permite la estimación de la

citotoxicidad en nauplios de A. salina mediante la evaluación de al menos 3 niveles de

dilución del extracto y las fracciones a ensayar. La técnica consiste en la preparación de

un medio salino adecuado, la colocación de huevos del crustáceo en dicho medio y su

eclosión, que se resume de la siguiente manera:

Se transfiere la mayor cantidad de nauplios vivos a un erlenmeyer con medio

salino fresco.

Se preparan para cada sustancia de prueba 3 niveles de dilución (1000, 500 y 250

µg/mL) y se colocan por triplicado en 9 pozos de la microplaca, haciendo un volumen

total por pozo de 100 µL de solución a ensayar.

Posteriormente se agregan a cada pozo 100 µL de medio salino conteniendo de

10-15 nauplios y 100 µL de medio salino.

Se utilizan 3 pozos como controles negativos los que se preparan en forma

similar, utilizando como sustancia de prueba el medio de disolución de los extractos.

Luego de 24 horas, se procede a contar el número de sobrevivientes en cada

dilución, del que por diferencia con el valor inicial, se calcula el número de decesos

observados.

La Concentración Letal Media (CL50) se calcula mediante una regresión no

paramétrica utilizando el programa “Trimmed Spearman-Karber Method”, versión 1.5.

I.4.3.5 Modelaje Molecular y Propiedades Farmacofóricas de Cembranoides 2,11-

ciclizados Derivatizados.

Se realizan los estudios de Modelaje Molecular de los cembranoides 2,11-

ciclizados aislados y derivatizados:

Asbestinino 9, 4-deoxyasbestinino G y 6-ester urocánico de 4-deoxyasbestinino

G, Briarellina E y 6-ester urocánico de Briarellina E, Asbestinino 20 y 6-ester urocánico

de Asbestnino 20, Asbestinino 7, 6-ester urocánico de Asbestinino 7 y 6-glucósido de

Asbestinino 7.

Ellos fueron minimizados utilizando el Algoritmo RM1, re-parametrización de

AM1 contenido en el Programa Spartan for Windows 2006 (G.B. Rocha, R.O. Freire, A.

Simas and J.J.P. Stewart, J.Computational Chem. 2006, 27, 1101) de Wavefunction Inc.

11

De cada uno se calcularon, entre otros, los siguientes parámetros:

Energía de Formación

Momento Dipolo

Distancia entre cada uno de los enlaces de la molécula

Distancia espacial entre átomos de la molécula

Densidad Superficial

Highest Occupied Molecular Orbital -HOMO-

Lowest Occupied Molecular Orbital -LUMO-

Las propiedades farmacofóricas estudiadas de los compuestos citados son:

C log P (Indice de Solubilidad en n-octano)

TPSA (Topological Polar Surface Area)

Número de Aceptores de Protones

Número de Donadores de Protones

Número de Negativos Ionizables

Número de Positivos Ionizables

Relación átomos/enlaces

Número de Anillos

Enlaces Rotables

Atomos Aromáticos

Estas propiedades se calcularon utilizando los siguientes programas informáticos:

LigandScout v. 1.03, (No. de Serie: 14520307730892251293) de Inte:Ligand S.A.

basado en: G. Wolber and T. Langer. LigandScout: 3-D Pharmacophores Derived

from Protein-Bound Ligands and Their Use as Virtual Screening Filters J. Chem.

Inf. Model; 2005; 45(1); 160-169.

Peter Ertl, Bernhard Rohde, Paul Selzer. Fast Calculation of Molecular Polar

Surface Area Directly from SMILES. Novartis Pharma AG, ChemInformatics,

CH-4002, Basel, Switzerland. Basado en: Ertl, P., Rohde, B., Selzer, P. Fast

calculation of molecular polar surface area as a sum of fragment based

contributions and its application to the prediction of drug transport properties. J.

Med. Chem. 2000, 43, 3714-3717.

12

PARTE II

MARCO TEÓRICO

Química de Productos Naturales Marinos

Producir una cantidad adecuada y sustentable de metabolitos secundarios

bioactivos, para su posterior estudio de actividad biológica y uso medicinal es uno de los

principales retos en el estudio de la química de los invertebrados marinos.

El porcentaje de rendimiento de estos compuestos orgánicos, cuando se aislan

directamente del organismo que los produce, es bajo, obteniéndose entre 0.001 y 0.01%

de peso seco del organismo productor (10 mg de compuesto por Kg de peso seco)

(Wright, A.E. 1998).

La Síntesis Orgánica muy a menudo es inaccesible, debido a la complejidad de las

estructuras de estos metabolitos, lográndose algunas síntesis totales con rendimientos

globales del 2-3% en el mejor de los casos y sumamente costosas para su aplicación a

nivel comercial.

Experimentalmente han existido dificultades para el crecimiento de invertebrados

marinos fuera de su hábitat natural, sin embargo existen algunos ejemplos exitosos

(Ojima, I. et. al. 1999, Munro, M. et. al. 1999, Taglialatela-Scafati, O. et. al. 2002).

La fauna invertebrada marina es especialmente rica en las aguas del caribe

Mesoamericano, situándose como la segunda barrera de arrecifes más grande del mundo,

detrás de la gran barrera de arrecifes de Australia y por encima de las aguas del Pacífico,

las que son especialmente abundantes cerca de las costas de Okinawa y las islas del Japón

y Filipinas (Faulkner, D.J. 2000).

Debido al estrés a que se ven sometidos estos invertebrados marinos, sésiles y sin

defensas físicas, biosintetizan compuestos orgánicos como mecanismos de defensa para

rechazar a sus depredadores. Estos metabolitos secundarios poseen estructuras químicas

sin precedentes y han demostrado poseer actividad biológica hasta diez veces mayor que

los aislados del mundo terrestre, por lo que su estudio como potenciales fármacos ha

crecido durante los últimos veinte años, reportándose alrededor de 5,000 moléculas

nuevas, la mayoría con potente actividad biológica (Faulkner, D. J. 2000, Newman, D.J.;

Cragg, G.M.; 2007, Blunt J.W. et. al. 2007).

Actualmente el avance de las técnicas espectroscópicas y espectrométricas en la

elucidación estructural de moléculas orgánicas, así como en las técnicas de estudio in

vitro de actividad biológica y modelaje molecular ha permitido el desarrollo actual de

este campo (Blagg, J. 2006, Gassner, N.C. 2007).

Briareum asbestinum.

Briareum asbestinum (phylum Coelenterata, sub-phylum Cnidaria, clase

Anthozoa, sub-clase Alcyonaria, orden Gorgonacea, sub-orden Scleroxonia, familia

Briareidae, género Briareum, especie asbestinum) es un habitante común de las aguas

poco profundas del Caribe Mesoamericano, en donde se le encuentra en dos morfologías,

incrustada y erecta. Taxonomicamente se le ubica entre los grupos Alcyonacea y

Gorgonacea de octocorales, los que son abundantes en los arrecifes de los océanos

Pacífico y Atlántico respectivamente (Opresko, D.M. 1973, Coll, J.C. 1992, Rodríguez, A.D.

1995). El primer reporte describiendo metabolitos secundarios aislados de un espécimen

caribeño de Briareum asbestinum aparece en 1966 (Hyde, R.W. 1966) en la Disertación

13

Doctoral de R. W. Hyde en la Universidad de Oklahoma, en la que describe una serie de

diterpenos clorinados sin asignar estructuras.

John Faulkner y colaboradores reportan los primeros Asbestininos en 1980

(Stierle, D.B. et. al. 1980) y A. D. Rodríguez y O. M. Cóbar las primeras Briarellinas en

1995 (Rodríguez, A.D.; Cóbar, O.M. 1995).

A la fecha se han reportado 39 Asbestininos, la mayoría (21) aislados por O. M.

Cóbar, todos del Caribe Mesoamericano (Cóbar, O.M. 1996), 29 Briarellinas; 22 por O. M.

Cóbar y A. D. Rodríguez (Rodríguez, A.D.; Cóbar, O.M. 1995, Rodríguez, A.D.; Cóbar, O.M.

1995a, Ospina, C.A. et. al. 2003, Ospina, C.A.; Rodríguez, A.D. 2006) y 7 por Sheu y

colaboradores en aguas taiwanesas.(Wang, G. H. 2001, Wang, G. H. 2002).

En la actualidad sólo existen dos reportes de eunicelinas aisladas de organismos

del Caribe Mesoamericano; Polyanthellin A de Briareum polyanthes de Puerto Rico

(Ospina, C.A. et. al. 2003) y las Sarcodyctinas; Eleutherobin, junto con tres Eleutherósidos

de Eritrhopdium caribaeorum, de aguas del Caribe y cultivado en el Canadá (Taglialatela-

Scafati, O. et. al. 2002).

De estos metabolitos, sesenta y nueve (69) provienen de organismos del caribe

mesoamericano y fueron aislados de Briareum asbestinum (44), Briareum polyanthes

(18) y Erithropodium caribaeorum (7).

Esqueleto de Asbestinino Esqueleto de BriareinaEsqueleto de Eunicelina Esqueletos carbonados de diterpenoides de Briareum asbestinum

Cembranoides 2-11 Ciclizados.

Los cembranoides 2-11 ciclizados de origen marino, son metabolitos secundarios

presumiblemente formados biogeneticamente por la ciclización de una molécula de

cembrano (Stierle, D.B. et. al. 1980, Bernardelli, P.; Paquette, L.A. 1998).

Este grupo de compuestos se divide en cuatro familias; Eunicelinas, Briarellinas,

Asbestininos y Sarcodictinas, cuyo común origen biogenético se resume así:

Ciclización de la molécula del cembrano entre los carbonos 2 y 11, origina el

esqueleto carbonado de las Eunicelinas.

7

16

14

11

6

3

18

3

2

11

Cembrano Eunicelina

14

Posterior oxidación entre los carbonos 3 a 16 y 2 a 9, seguida de ciclización,

produce el esqueleto de Briarellina.

16

14 13

6

7911

O

O

9

BriarellinaEunicelina

1 3

6

11

14

16

7

Transposición subsecuente de metilo entre los carbonos 11 y 12 forma el

esqueleto de Asbestinino.

Asbestinino

O

O

119 7

6

3114

16

Briarellina

O

O

11 9 7

6

3114

16

De igual manera, la oxidación entre los carbonos 4 y 7 del esqueleto de

Eunicelina, seguida de posterior ciclización, origina el esqueleto de las

Sarcodictinas. 7

16

14

11

6

31

Eunicelina

9

O

11

14 13

79

Sarcodictina

4

4

Briarellinas y Asbestininos pueden sufrir posterior ruptura oxidativa entre los

carbonos 6 y 7 para producir las Secobriarellinas y los Secoasbestininos.

16

14 13

6

7911

O

O

Briarellina

16

14 13

6

7911

O

OO

H

O

Seco-briarellina

Seco-asbestinino

O

OO

H

O

11 97

63

114

16

Aabestinino

O

O

11 9 7

6

3114

16

Es esta propuesta biosintética la que se ha tomado como fundamento para

clasificar así a estos compuestos orgánicos, no obstante, existe otro criterio de

clasificación, el que engloba a Eunicelinas, Briarellinas y Sarcodictinas como parte de las

15

Cladielinas (sinónimo para varios autores de Eunicelinas) y a los Asbestininos como el

otro grupo, basado en la estructura del esqueleto carbonado de ambos grupos de

compuestos (Bernardelli, P.; Paquette, L.A. 1998).

Los cembranoides 2-11 ciclizados son metabolitos comunes en diversos géneros

de octocorales (Phylum Coelenterata, Clase Anthozoa, Sub-clase Octocorallia), entre los

que se encuentran Briareum, Eunicella, Cladiella, Solenopodium y Erithropodium entre

otros, poseen estructuras únicas, sin precedente en el mundo terrestre y una variedad de

actividades biológicas (anti-inflamatoria, citotóxica, antitumoral, antiviral e insecticida

entre otras), que los hacen promisorios futuros medicamentos (Coll, J.C. 1992, Rodríguez,

A.D. 1995, Sung P-J; Cheng M-C. 2002). En la actualidad se han reportado más de ciento cincuenta metabolitos de este

tipo, siendo los más abundantes las Eunicelinas, seguido de los Asbestininos, Briarellinas

y Sarcodictinas en su orden (Blunt, J.W. et. al. 2007).

Las Eunicelinas (Cladielinas), fueron los primeros cembranoides 2-11 ciclizados

aislados de un organismo marino, siendo Eunicelina obtenida del gorgonio del

mediterráneo Eunicella estricta en 1968 la primera reportada (Kennard, O. et. al. 1968).

Desde ese año, se han reportado alrededor de 70 Eunicelinas, la mayoría del hemisferio

norte (gran barrera de arrecifes de Australia, el Océano Índico, el Mar Mediterráneo y las

aguas del Pacífico Japonés) con una gran variedad de actividad biológica (citotóxica,

ictiotóxica, hemolítica y anti-inflamatoria, entre otras) (Kennard, O. et. al. 1968, Sung, P-J.;

Chen M-C. 2002).

CH3CH3

O

H

H

OAc

CH2CH3AcO

AcO

OAcH3C

Eunicelina (1) Los primeros Asbestininos (Asbestininos 1 al 5) fueron aislados hasta 1980 de

especimenes de Briareum asbestinum del caribe centroamericano, reportándose que

antagonizan el efecto de la acetilcolina en preparaciones de íleo de ratones de guinea a

niveles de 16 g/mL (Stierle, D.B. et. al. 1980).

En la actualidad se han reportado 39 Asbestininos, todos del caribe

mesoamericano y con actividad biológica poco estudiada, pero altamente citotóxicos en

contra varias líneas celulares cancerosas (Sung, P-J.; Chen M-C. 2002, Blunt, J.W. et. al.

2007).

Asbestinino 1

CH 3

CH 3O O C3H7

O

O

AcOH

HH

H3C

H3C

Las Briarellinas se han aislado en su gran mayoría de especimenes del género

Briareum de aguas del caribe mesoamericano, siendo Briarellina A, en conjunto con

Briarellinas B, C, D y Secobriarellina, las primeras descritas en 1995 (Rodríguez, A.D.;

Cóbar, O.M. 1995a). Se reporta en esta publicación, que Briarellina A posee citotoxicidad

contra células HeLa a valores de IC50 = 20.0 g/mL.

16

La estructura inicial de Briarellina A fue revisada y reasignada como la que se

muestra a continuación (Ospina, C.A. et. al. 2003). Actualmente se han reportado 29

Briarellinas, 22 aisladas de gorgonios del género Briareum del caribe mesoamericano

(Cóbar, O. M. 2000, Sung, P-J.; Chen M-C. 2002, Blunt, J.W. et. al. 2007,).

Seco-briarellina

CH3

H

H3C O CH3

H

O

HCH3HO

O

O H

CHO

H

HH

Briarellina A

CH2

H3C

H

H

CH3O

OOH

O C7H15

O

O

O

HO CH3H

HH

Sarcodictina A, junto con sus congéneres Sarcodictinas B, D, E y F, fue reportada en

1987 de Sarcodictyon roseum del pacífico australiano (D’Ambrosio, M. et. al. 1987)

indicándose que este compuesto posee actividad antitumoral contra una variedad de

células cancerígenas a niveles de IC50 entre 400 y 900 nM e induce polimerización de las

tubulinas y estabilización de los microtúbulos, un mecanismo de acción que actualmente

se encuentra en estudio y es por el que actúa Taxol, comercializado como medicamento

anticáncer con el nombre comercial de Paclitaxel. (Cragg, G. M.; Newman, D. J. 2004).

Actualmente se han reportado 22, la mayoría del pacífico norte y pareciera ser el grupo

que mayor actividad biológica posee, reportándose Eleutherobina con un IC50 entre 10 y

15 nM contra una variedad de células cancerosas, induciendo también la polimerización

de tubulinas y la estabilización de los microtúbulos (Boik, J. 2001, Sung, P-J.; Chen M-C.

2002, Blunt, J.W. et. al. 2007, Altmann, K-H.; Gertsch, J. 2007).

O

CH3

CH3 CH3

CH3

OHCOOMe

O

O

N

N

CH3

Sarcodictina A

17

PARTE III

III.1 RESULTADOS

III.1.1 Obtención de la Muestra

El organismo fue colectado en aguas de la Isla de Mona, Puerto Rico en 1994, a

10-15 metros de profundidad utilizando buceo, identificado por el Dr. Abimael

Rodríguez.

La muestra se colocó en bolsas plásticas inmediatamente luego de colectadas y

colocadas en hieleras equipadas con hielo seco (-10oC), transportadas inmediatamente al

laboratorio.

Se procede a su liofilización para separar el agua de mar y pesadas (peso seco del

espécimen).

Una muestra del espécimen se encuentra depositado en el Laboratorio de Química

de Productos Naturales Marinos de la Universidad de Puerto Rio, Recinto de Río Piedras,

bajo el número BAPR04-1.

III.1.2 Obtención del Extracto Crudo.

Luego del proceso de liofilización, se obtienen 480 g de peso seco de Briareum

asbestinum, que es macerado exhaustivamente en CHCl3/MeOH (1:1), hasta obtener

aproximadamente 10 litros de extracto crudo.

El extracto fluido se concentra a presión reducida a una temperatura inferior a los

45°C utilizando un evaporador rotatorio, se elimina todo el solvente utilizando una

bomba de alto vacío, se pesa, obteniéndose 57.4 g (11.96%) de extracto crudo (BAM)

III.1.3 Obtención de Extractos Orgánicos

Los 57.4 gramos de extracto crudo, se suspenden en agua y someten a extracción

líquido/líquido con n-hexano, luego CHCl3 y finalmente MeOH.

Se obtienen 42.62 g de extracto n-hexánico -BAMH- (74.25%), 8.07 g de extracto

clorofórmico -BAMC- (14.07%) y 6.70 g de extracto metanólico -BAMM- (11.68%).

III.1.4 Fraccionamiento de Extracto n-hexánico

III.1.4.1 Fraccionamiento por Cromatografía de Exclusión de Tamaño.

40.0 g del extracto n-hexánico se disuelve en tolueno y fracciona por exclusión de

tamaño utilizando BIOBEADS SX-2® como fase estacionaria, obteniéndose cuatro

fracciones: BAMH1 (12.50 g, 31.2%), BAMH2 (8.39 g, 20.9%), BAMH3 (6.98 g,

17.4%) y BAMH4 (12.13 g, 30.5%).

Las cuatro fracciones sometidas a estudio de Cromatografía en Capa Fina -TLC-,

utilizando como fase estacionaria Sílica Gel G 60 (Merck, precortadas) y fase móvil n-

hexano/acetato de etilo (70:30) determina que la fracción BAMH4 es la de mayor

contenido en cembranoides 2,11-ciclizados, por lo que se procedió a su fraccionamiento.

18

III.1.4.2 Fraccionamiento por Cromatografía en Columna y Cromatografía Líquida

de Alta Resolución -HPLC-

12.0 g de la fracción BAMH4 se someten a fraccionamiento por Cromatografía en

Columna utilizando Sílica Gel (Alltech) de tamaño de partícula entre 35 y 75

micrómetros como fase estacionaria y EtOAc/n-hexano (3:7) grado analítico como fase

móvil. (Anexo 1) Se obtienen 21 fracciones, las cuales se analizaron por Cromatografía

en Capa Fina, utilizando Sílica Gel G 60 como fase estacionaria y n-hexano/acetato de

etilo (70:30) como fase móvil. (Anexo 2)

Adicionalmente a las fracciones de mayor pureza se les realizó estudios de 1H-

RMN y 13

C-RMN para determinar las que poseen los cembranoides 2,1-ciclizados a

aislar y purificar.

III.1.5 Aislamiento y Elucidación Estructural de Cembranoides 2,11-ciclizados.

III.1.5.1 Aislamiento y Elucidación Estructural de Asbestinino 9.

La Fracción BAMH4.11 (120 mg) es sometida a HPLC utilizando MeOH/H2O

(9:1), como fase móvil y Columna ODS, como fase estacionaria, obteniéndose 48 mg de

analíticamente puro Asbestinino 9.

La identificación de la molécula se obtiene por sus señales de 1H-RMN ( 2.28,

H23; 0.22, Me 24; 5.26, H11; 5.23, H19a; 5.14 H19b) y de 13

C-RMN ( 176.3,

C21; 36.5, C22; 18.4, C23; 13.7, Me24; 146.7, C7; 114.0, C19; 72.7, C11;

206.6, C6).

Figura 1. Estructura de Asbestinino 9

O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

H3C

O

O

11

6

2119

7 O

III.1.5.2 Aislamiento y Elucidación Estructural de 4-Deoxyasbestinino G.

La Fracción BAMH4.20 es fraccionada sucesivamente vía Cromatografía en

Columna utilizando Si Gel G 60 como fase estacionaria y n-hexano/EtOAc (80:20) como

fase móvil, la tercera fracción produce 80 mg de analíticamente puro 4-deoxyasbestinino

G.

La identificación de la molécula se obtiene por sus señales de 1H-RMN ( 0.97, Me

24; 5.26, H11; 5.30, H19a; 5.16 H19b; 4.22, H6) y de 13

C-RMN ( 173.7, 146.4,

C7; 115.8, C19; 73.2, C11).

Figura 2. Estructura de 4-deoxyasbestinino G

O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

H3C

O

OH

O

11

6

2119

7

19

III.1.5.3 Aislamiento y Elucidación Estructural de Briarellina E.

La Fracción BAMH4.12 (65 mg) es sometida a HPLC utilizando MeOH/H2O (8:2),

como fase móvil y Columna ODS Ultrasphere Si-Gel, como fase estacionaria,

obteniéndose 34 mg de analíticamente pura Briarellina E.


Me20; 0.81, Me 17; 1.58, H15; 5.17, H4; 4.50, H9; 4.18, H6; 5.47, H19a;

5.17 H19b) y de 13

C-RMN ( 175.0, C21; 67.3, C16; 71.6, C4; 36.4, C15; 24.8,

C13; 10.3, Me17; 148.2, C7; 115.1, C19; 71.6, C11; 74.0, C6).

Figura 3. Estructura de Briarellina E

O

O

CH2

H3CCH3

H

HH

H

H

OH

H3COH

O

O

11

1516

421

6

7

19

9



(75:25), como fase móvil y Columna ODS Ultrasphere Si-Gel, como fase estacionaria y

luego Cromatografía en Columna utilizando Si Gel G 60 como fase estacionaria y n-

hexano/EtOAc (80:20) como fase móvil obteniéndose 38 mg de analíticamente puro

Asbestinino 20.


Me22; 4.09, H6; 5.38, H11; 5.17, H4; 5.20, H19a; 4.89 H19b) y de 13

C-RMN (

171.0, C21; 29.0, C4; 148.0, C7; 114.4, C19; 73.6, C11; 75.3, C6).


O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

H3C

OH

O

O

2122

116

19

7

4



(93:07), como fase móvil y Columna ODS Ultrasphere Si-Gel, como fase estacionaria

obteniéndose 96 mg de analíticamente puro Asbestinino 7.


Me22; 4.53, H6; 5.37, H11; 5.52, H4; 5.31, H19a; 5.14 H19b) y de 13

C-RMN (

171.0, C21; 173.0, C23; 69.5, C4; 144.4, C7; 117.2, C19; 73.6, C11; 87.0,

C6).

20


O

O

CH2

H3C OCH3

H

HH

H

H

H3C

O

OH

O

O

11 7

19

6

4

21

23

III.1.6 Glucosilación de 4-deoxyasbestinino G.

III.1.6.1 Benzoilación de Asbestinino 7.

Como producto de la esterificación con anhídrido benzoico de Asbestinino 7, se

obtienen 42 mg (70 % de rendimiento) de Asbestinino 7-6-benzoilado.

El producto posee un Punto de Fusión de 398 ± 2 oC con descomposición.

Se observan cinco señales de 1HRMN adicionales al de Asbestinino 7 en la región

de 6.95-7.42 ppm, correspondiendo al anillo aromático de la fracción del ester benzoilo y

la señal correspondiente al H6, es desplazada a campo bajo de 4.56 ppm a 5.42 ppm,

típico de haber sufrido esterificación dicha posición hidroxilada.

El Espectro de Masas de Impacto Electrónico, muestra un peso molecular de 624

umas.

Esquema 1. Benzoilación de Asbestinino 7

O

O

CH2

H3C OCH3

H

HH

H

H

H3C

O

O

O

O

O

O

O

CH2

H3C OCH3

H

HH

H

H

H3C

O

OH

O

O

1. DCC2. DMAP3. Anhidrido Benzoico

III.1.6.2 Glucosidación de Asbestinino 7-6-benzoilado.

Como producto de la reacción de glucosidación del Asbestinino benzoilado, se

obtienen 7.0 mg del Asbestinino 7-6-glucosidado (0.01 mmol, 17% de rendimiento).

El producto se descompone arriba de 225 oC.

Se observan seis señales de 1HRMN adicionales al de Asbstinino 7 en la región de

3.35 a 3.62 ppm que corresponden a los protones hidroxilados del azúcar y una a 4.57

ppm que corresponde al protón anomérico. La señal correspondiente al H6, es desplazada

a campo alto de 4.56 ppm a 3.26 ppm, típico de haber sufrido alquilación dicha posición.


umas.

21

Esquema 2. Glucosidación de Asbestinino 7-6-benzoilado

O

O

CH2

H3C OCH3

H

HH

H

H

H3C

O

O

O

O

O OH

H

HOH

H

HHO

H

OH

O

O

CH2

H3C OCH3

H

HH

H

H

H3C

O

O

O

O

O

1. 2,3,4,6-tetra-O-bencil

glucopiranosa2. (Bu4N)SO4H

3. KOH

4. HCl

III.1.7 Urocanización de 4-deoxyasbestinino G, Briarellina E, Asbestinino 20 y

Asbestinino 7.

III.1.7.1 Urocanización de 4-deoxyasbestinino G.

Como resultado de la reacción de esterificación de 35 mg (0.08 mmol) de 4-

deoxyasbestinino G con ácido urocánico, se obtienen 27 mg (0.05 mmol, 62.5% de

rendimiento) de 6-ester urocánico de 4-deoxyasbestinino G.

Por la poca cantidad de compuesto obtenido y la descomposición observada en el

derivado glucosidado de Asbestinino 7, no se procedió a tomar su Punto de Fusión.

Se observan cuatro señales de 1HRMN adicionales al de 4-deoxiyasbestinino G, una

en la región de 6.0 ppm que corresponde a uno de los protones vinílicos de la cadena

alifática del éster urocánico y tres a 7.1-7.6 ppm que corresponden al otro protón vinílico

y los protones del anillo nitrogenado del éster. La señal correspondiente al H6, es

desplazada a campo bajo de 4.22 ppm a 5.18 ppm, típico de haber sufrido esterificación

dicha posición.


umas.

Esquema 3. Esterificación con Acido Urocánico de 4-deoxyasbestinino G

O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

H3C

O

OH

O

O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

H3C

O

O

O

NH

N

O

1. DCC2. DMAP3. Acido Urocánico

III.1.7.2 Urocanización de Briarellina E.

Como resultado de la reacción de esterificación de 30 mg (0.06 mmol) de

Briarellina E con ácido urocánico, se obtienen 22 mg (0.036 mmol, 61.0% de

rendimiento) de 6-ester urocánico de Briarellina E.



Se observan cuatro señales de 1HRMN adicionales a las de Briarellina E, una en la

región de 6.2 ppm que corresponde a uno de los protones vinílicos de la cadena alifática

del éster urocánico y tres a 7.2-7.8 ppm que corresponden al otro protón vinílico y los

protones del anillo nitrogenado del éster. La señal correspondiente al H6, es desplazada a

22

campo bajo de 4.18 ppm a 5.24 ppm, típico de haber sufrido esterificación dicha

posición.


umas.

Esquema 4. Esterificación con Acido Urocánico de Briarellina E


O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

OH

H3COH

O

O

O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

O

H3COH

O

O

NHN

O

III.1.7.3 Urocanización de Asbestinino 20.


Asbestinino 20 con ácido urocánico, se obtienen 17 mg (0.034 mmol, 52.0% de

rendimiento) de 6-ester urocánico de Asbestinino 20.



Se observan cuatro señales de 1HRMN adicionales al de Asbestinino 20, una en la





posición.


umas.

Esquema 5. Esterificación con Acido Urocánico de Asbestinino 20

O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

H3COH

O

O

O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

H3CO

O

O

O

NH

N1. DCC2. DMAP3. Acido Urocánico

III.1.7.4 Urocanización de Asbestinino 7.


Asbestinino 7 con ácido urocánico, se obtienen 46 mg (0.071 mmol, 74.0% de

rendimiento) de 6-ester urocánico de Asbestinino 7.


derivado glucosidado de este mismo compuesto, no se procedió a tomar su Punto de

Fusión.

Se observan cuatro señales de 1HRMN adicionales al de Asbestinino 7, una en la


23




posición.


umas.

Esquema 6. Esterificación con Acido Urocánico de Asbestinino 7

O

O

CH2

H3C OCH3

H

HH

H

H

H3C

O

OH

O

O

O

O

CH2

H3C OCH3

H

HH

H

H

H3C

O

O

O

O

NH

N

O


III.1.8 Determinación de la actividad citotóxica de Cembranoides 2,11-ciclizados

derivatizados.

La interpretación de los resultados se realizó mediante inferencia estadística,

haciendo uso de técnicas no paramétricas, donde se utilizó para la estimación de

concentraciones inhibitorias al 50% (CI50) el método de Trimmed Spearman-Karber,

versión 1.5, para la actividad citotóxica en nauplios de A. salina.

Se determinó la actividad citotóxica contra A. salina de 6-glucósido de asbestinino

7, 6-ester urocánico de 4-deoxyasbestinino G, 6-ester urocánico de Briarellina E, 6-ester

urocánico de Asbestinino 20 y 6-ester urocánico de Asbestinino 7 los que fueron

evaluados por quintuplicado agregando 100 µL del extracto disuelto y 100 µL del agua

de mar con 10-15 nauplios (concentración final de 1mg/mL), utilizando como control

negativo 100 µL de agua de mar y 100 µL de agua de mar con 10-15 nauplios.

III.1.8.1 Tamizaje de la actividad citotóxica de Cembranoides 2,11-ciclizados a

1 mg/mL contra nauplios de A. Salina.

24

Cuadro 1. Tamizaje de actividad Citotóxica Contra Nauplios de A. salina.

Como el porcentaje de mortalidad de nauplios de A. salina en todos los compuestos fue del 100 por ciento

(CL50 menor de 1 mg/ml), se realizó la prueba nuevamente utilizando concentraciones mucho más bajas.

Fuente: Datos experimentales.

III.1.8.2 Determinación de la CL50 de Cembranoides 2,11-ciclizados.

La CL50, se calculó por el método de Trimmed Spearman-Karber v. 1.5 (Hamilton

et. al. 1977), utilizando tres diferentes concentraciones de los compuestos a evaluar (1.0,

0.5 y 0.25 g/ml), seleccionadas debido a que la literatura reporta concentraciones de

citotoxicidad para asbestininos en el rango de los 10 g/mL (Cóbar, O.M. 1996).

Cuadro 2. Concentración Letal Media de Cembranoides 2,11-ciclizados

Compuesto % de nauplios muertos

por cada concentración

CL50

g/mL

(nanomolar)

Intervalo de

Confianza

LCS-LCI al 95% 1.0 g/mL 0.50 g/mL 0.01 g/ml

4-deoxyasbestinino G 100 91 6 0.60

(1480)

0.30-0.90

6-ester urocánico de

4-deoxyasbestinino G

100 100 22 0.14

(260)

0.08-0.30

Briarellina E 100 98 9 0.40

(830)

0.10-0.70


Briarellina E

100 100 87 0.09

(150)

0.06-0.12

Asbestinino 20 100 98 8 0.50

(1320)

0.20-0.80


Asbestinino 20

100 100 24 0.12

(230)

0.09-0.16

Asbestinino 7 100 100 83 0.10

(200)

0.07-0.15


Asbestinino 7

100 100 92 0.07

(110)

0.04-0.10

6-glucósido de

Asbestinino 7

10 0 0 10.0

(14950)

7.0-13.0


Compuesto Pozo

No.1

Muertos

/Total

Pozo

No.2

Muertos

/Total

Pozo

No.3

Muertos

/Total

Pozo

No.4

Muertos

/Total

Pozo

No.5

Muertos

/Total

Total

muertos/

Total

ensayo

Nauplios

muertos

(%)

4-deoxyasbestinino G 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/50 100


4-deoxyasbestinino G

10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/50 100

Briarellina E 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/50 100


Briarellina E

10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/50 100

Asbestinino 20 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/50 100


Asbestinino 20

10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/50 100

Asbestinino 7 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/50 100


Asbestinino 7

10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/50 100

6-glucósido de

Asbestinino 7

10/10 10/10 10/10 10/10 10/10 50/50 100

25

III.1.9 Modelaje Molecular y Propiedades Farmacofóricas de Cembranoides 2,11-

ciclizados Derivatizados.

Los resultados obtenidos de los cembranoides 2,11-ciclizados naturales (se incluyen

Sarcodictina A y B y Eleutherobina) y derivatizados se presentan en las tablas siguientes:

III.1.9.1 Optimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de 4-

deoxyasbestinino G.

Cuadro 3. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de 4-deoxyasbestinino G.

O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

H3C

O

OH

O

Propiedad Valor

Fórmula Molecular C24H38O5

Peso molecular (umas) 406.58

Calor de Formación (Kcal/Mol) -224.7174837

cLogP 3.960

TPSA 64.990

No. de Aceptores 5

No. de Donadores 1

Negativos Ionizables 0

Positivos Ionizables 0

Atomos/Enlaces 68/71

Anillos 4

Enlaces Rotables 9

Atomos Aromáticos 0

Momento Dipolar (Debyes) 5.17

Fuente: Datos experimentales

III.1.9.2 Optimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de 6-ester

urocánico de 4-deoxyasbestinino G.

Cuadro 4. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de 6-éster urocánico de 4-

deoxyasbestinino G.

O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

H3C

O

O

O

NH

N

O

26

Propiedad Valor

Fórmula Molecular C31H44N2O6



cLogP 4.958

TPSA 101.770

No. De Aceptores 7

No. De Donadores 0




Anillos 5

Enlaces Rotables 13




III.1.9.3 Optimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Briarellina E.

Cuadro 5. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de Briarellina E.

O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

OH

H3COH

O

O Propiedad Valor




cLogP 4.635

TPSA 85.220

No. de Aceptores 6

No. de Donadores 2




Anillos 4

Enlaces Rotables 15



Fuente: Datos experimentales


urocánico de Briarellina E.

Cuadro 6. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de 6-ester urocánico de

Briarellina E.

27

O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

O

H3COH

O

O

NHN

O

Propiedad Valor

Fórmula Molecular C35H54O7N2



cLogP 5.633

TPSA 122.000

No. de Aceptores 8

No. de Donadores 1




Anillos 5

Enlaces Rotables 19




III.1.9.5 Optimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Asbestinino 20.

Cuadro 7. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de Asbestinino 20.

O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

H3C

OH

O

O

Propiedad Valor




cLogP 3.180

TPSA 64.990

No. de Aceptores 5

No. de Donadores 1




Anillos 4

Enlaces Rotables 7




28


urocánico de Asbestinino 20.


Asbestinino 20.

O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

H3C

O

O

O

O

NHN

Propiedad Valor




cLogP 4.178

TPSA 101.770

No. de Aceptores 7

No. de Donadores 0




Anillos 5

Enlaces Rotables 11




III.1.9.7 Optimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Asbestinino 7.


O

O

CH2

H3C OCH3

H

HH

H

H

H3C

O

OH

O

O

Propiedad Valor




cLogP 4.672

TPSA 91.290

No. de Aceptores 7

No. de Donadores 1



29


Anillos 4

Enlaces Rotables 16





urocánico de Asbestinino 7.


Asbestinino 7.

O

O

CH2

H3C OCH3

H

HH

H

H

H3C

O

O

O

O

NH

N

O

Propiedad Valor




cLogP 5.670

TPSA 128.070

No. de Aceptores 9

No. de Donadores 0




Anillos 5

Enlaces Rotables 19




III.1.9.9 Optimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de 6-glucósido de

Asbestinino 7.

Cuadro 11. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de 6-glucósido de

Asbestinino 7.

O

O

CH2

H3C OCH3

H

HH

H

H

H3C

O

O

O

O

O OH

H

HOH

H

HHO

H

OH

30

Propiedad Valor




cLogP 2.210

TPSA 170.440

No. de Aceptores 12

No. de Donadores 4




Anillos 5

Enlaces Rotables 21




III.1.9.10 Optimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Asbestinino 9


O

O

CH2

H3C CH3

H

HH

H

H

H3C

O

O

O

Propiedad Valor



Calor de Formación (Kcal/Mol) - 217.8402815

cLogP 4.168

TPSA 61.830

No. de Aceptores 5

No. de Donadores 0




Anillos 4

Enlaces Rotables 8




III.1.9.11 Optimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Sarcodictina A.

31

Cuadro 13. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de Sarcodictina A.

O

CH3

CH3 CH3

CH3

OHCOOMe

O

O

N

N

CH3

Sarcodictina A Propiedad Valor




cLogP 3.834

TPSA 112.770

No. de Aceptores 7

No. de Donadores 1




Anillos 4

Enlaces Rotables 13




III.1.9.12 Optimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Sarcodictina B.

Cuadro 14. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas Sarcodictina B.

H

H

H3C CH3

O

CH3

OH

O

O

N

N

CH3

COOEt

H3C

Propiedad Valor




cLogP 4.224

TPSA 112.770

No. de Aceptores 7

No. de Donadores 1




Anillos 4

Enlaces Rotables 14




32

III.1.9.13 Optimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Eleutherobina.

Cuadro 15. Propiedades Fisicoquímicas y Farmacofóricas de Eleutherobina.

H

HH3C

H3C CH3

O

CH3

OH

O

O

N

N

CH3

O

HO

H

H

OH

H

O

OH

O

Propiedad Valor




cLogP 3.055

TPSA 160.690

No. de Aceptores 11

No. de Donadores 2




Anillos 5

Enlaces Rotables 19




33

III.2 Discusión de Resultados

III.2.1 Obtención de la Muestra y Extractos Orgánicos.

El espécimen a trabajar fue colectado y tratado preliminarmente como lo establece

la literatura relacionada con Química de Productos Naturales Marinos y publicaciones

específicas sobre cembranoides 2,11-ciclizados.

Los procedimientos de obtención del extracto orgánico crudo se orientaron a

separar las fracciones no polares, las que se fraccionaron posteriormente utilizando

Cromatografía de Exclusión de Tamaño para separar los cembranoides de peso molecular

intermedio de otras moléculas orgánicas y clorofila.

Los protocolos de fraccionamiento del extracto crudo y obtención de los extractos

orgánicos se orientaron hacia la separación por polaridad de los distintos tipos de

metabolitos secundarios, trabajándose el extracto n-hexánico por ser el más rico en

cembranoides 2,11-ciclizados de acuerdo a la literatura y estudios realizados de

Cromatografía en Capa Fina.

El rendimiento del extracto crudo fue superior (12% vs. 9%) de lo reportado para

este organismo, debiéndose principalmente al cuidado en los procedimientos de

extracción y fraccionamiento, así como la experiencia previa del investigador principal en

el aislamiento y separación de estos metabolitos.

El rendimiento de los extractos orgánicos es ligeramente diferente a los reportados

en la literatura, ya que se buscó enriquecer el extracto n-hexánico realizando más

extracciones exhaustivas con dicho solvente, lo que produjo un 74 % de rendimiento, en

lugar del típico cercano al 50%.

Lo anterior en detrimento del extracto clorofórmico, del que se obtuvo un 14% de

rendimiento en lugar del 30% aproximadamente que se reporta en la literatura.

III.2.2 Síntesis, Aislamiento y Elucidación Estructural de Cembranoides 2,11-

ciclizados.


El aislamiento de Asbestinino 9 se realiza de acuerdo a lo reportado en la

literatura, utilizando HPLC fase reversa con columna analítica ODS como fase

estacionaria y MeOH/H2O como fase móvil.

Sin embargo debido a la solubilidad de la muestra, se utilizó una proporción de

fase móvil de 9:1 en lugar de 7:3, dando buenos resultados (40% de rendimiento del

compuesto puro con relación a la fracción purificada).

El compuesto se identifica fácilmente por sus señales de 1H-RMN y

13C-RMN

producidas por su doble enlace exocíclico, el éster butirato, la ausencia de señales

debidas a H6 y el aparecimiento del grupo carbonilo a 206 ppm y las típicas del esqueleto

de los asbestininos.

El espectro de masas de impacto electrónico del compuesto muestra al ion

molecular a m/z 404 y el fragmento a m/z 316 (pérdida del grupo butirato), que confirman

su identidad.

34

Este compuesto por no poseer un grupo hidroxilo en posición 6 (carbonilo en su

lugar), no se utilizó para derivatización, sin embargo se utilizará para confirmar su

estructura y determinar si el grupo carbonilo se encuentra en la posición 4 o 6.

III.2.2.2 Aislamiento y Elucidación Estructural de 4-Deoxyasbestinino G.

El aislamiento de 4-Deoxyasbestinino G se realiza de acuerdo a lo reportado en la

literatura, utilizando Cromatografía en Columna (CC) en fase normal, con Sílica Gel G60

como fase estacionaria y n-hexano/EtOAc (8:2) como fase móvil.

Sin embargo, debido a la solubilidad de la muestra, se utilizó únicamente una

columna de fase estacionaria, en lugar de el “tándem” 2% de MeOH en CHCl3 seguido de

n-hexano/EtOAc (85:15) que reporta la literatura.

Se obtuvo un rendimiento aceptable del 16% del compuesto puro con relación a la

fracción purificada.

El compuesto se identifica inequivocamente por sus señales de 1H-RMN y

13C-

RMN producidas por su doble enlace exocíclico, el éster butirato, la presencia de señales

debidas a H6 y C6 en la zona de 4 ppm y 90 ppm respectivamente y las típicas del

esqueleto de los asbestininos.


molecular a m/z 406, el fragmento a m/z 318 (pérdida del grupo butirato) y el fragmento

debido a la pérdida consecutiva de butirato y agua desde el ion molecular a m/z 300, que

confirman su identidad.

Parte de este compuesto será derivatizado a su éster urocánico y otra para

confirmar si posee un grupo hidroxilo o peroxilo en posición 6 de acuerdo a la hipótesis

planteada por Rodríguez y colaboradores (Rodríguez, 2006).

III.2.2.3 Síntesis, Aislamiento y Elucidación Estructural de 6-ester urocánico de 4-

Deoxyasbestinino G.

La síntesis del 6-ester urocánico de 4-Deoxyasbestinino G se realiza de acuerdo al

protocolo reportado en la literatura, el rendimiento de la esterificación es satisfactorio

(62.5% contra un 76 % reportado para urocanización de compuestos de estructura

similar).

El aislamiento del compuesto se logra al rotaevaporar el solvente remanente y

extraer en fase etérea al compuesto orgánico de acuerdo al protocolo reportado en la

literatura.

La identificación del compuesto se logra inequívocamente por sus señales de 1H-

RMN a 6.0, 7.1, 7.3 y 7.6, típicos de que el grupo urocanato se enlazó a la molécula.

El hecho de que H6 del compuesto derivatizado se desplazó 0.96 ppm a campo

bajo con relación a 4-Deoxyasbestinino G, es indicativo de que existió esterificación en

esta posición.

Su espectro de masas de impacto electrónico muestra al ion molecular a m/z 526,

el fragmento a m/z 438 (pérdida del grupo butirato), m/z 388 (pérdida del grupo

urocanato) y m/z 300 (pérdida de los grupos butirato y urocanato) a partir del ion

molecular.

35

No se tomó el punto de fusión del compuesto debido al riesgo de su

descomposición y pérdida irreversible.

III.2.2.4 Aislamiento y Elucidación Estructural de Briarellina E.

El aislamiento de Briarellina E se realiza de acuerdo a lo reportado en la literatura,

utilizando HPLC fase reversa con columna analítica ODS como fase estacionaria y

MeOH/H2O (8:2) como fase móvil.

Se obtuvo un muy buen rendimiento del 52% del compuesto puro con relación a

la fracción purificada.

El compuesto se identifica fácilmente por sus señales de 1H-RMN y

13C-RMN

producidas por su doble enlace exocíclico, el éster octanoato, la presencia de señales


esqueleto de las briarellinas.

Es importante señalar la presencia de las señales de 1H-RMN a 3.4 y 3.6 ppm y de

13C-RMN a 67 ppm, que indican que no posee el grupo lactónico típico de otras

briarellinas.


molecular a m/z 478, el fragmento a m/z 334 (pérdida del grupo octanoato) y el fragmento

a m/z 316 debido a la pérdida sucesiva de octanoato y agua, que confirman su identidad.

Parte de este compuesto será derivatizado a su éster urocánico.

III.2.2.5 Síntesis, Aislamiento y Elucidación Estructural de 6-ester urocánico de

Briarellina E.

La síntesis del 6-ester urocánico de Briarellina E se realiza de acuerdo al


(61% contra un 76 % reportado para urocanización de compuestos de estructura similar).



literatura.




bajo con relación a Briarellina E, es indicativo de que existió esterificación en esta

posición.


el fragmento a m/z 454 (pérdida del grupo octanoato), m/z 460 (pérdida del grupo

urocanato) y m/z 316 (pérdida de los grupos octanoato y urocanato) a partir del ion

molecular.




El aislamiento de Asbestinino 20 se realiza de acuerdo a lo reportado en la

literatura, inicialmente HPLC en fase reversa (columna ODS y MeOH:H2O 75:25),

36

seguido de Cromatografía en Columna (CC) en fase normal, con Sílica Gel G60 como

fase estacionaria y n-hexano/EtOAc (8:2) como fase móvil.

Se obtuvo un rendimiento bueno del 52% del compuesto puro con relación a la



13C-

RMN producidas por su doble enlace exocíclico, el éster acetato, la presencia de señales


esqueleto de los asbestininos.


molecular a m/z 378, el fragmento a m/z 318 (pérdida del grupo acetato) y el fragmento

debido a la pérdida de agua desde el ion molecular a m/z 360, que confirman su identidad.

Parte de este compuesto será derivatizado a su éster urocánico.

III.2.2.7 Síntesis, Aislamiento y Elucidación Estructural de. 6-ester urocánico de

Asbestinino 20.

La síntesis del 6-ester urocánico de Asbestinino 20 se realiza de acuerdo al


(52% contra un 76 % reportado para urocanización de compuestos de estructura similar).



literatura.




bajo con relación a Asbestinino 20, es indicativo de que existió esterificación en esta

posición.


el fragmento a m/z 438 (pérdida del grupo acetato), m/z 360 (pérdida del grupo

urocanato) y m/z 300 (pérdida de los grupos acetato y urocanato) a partir del ion

molecular.




El aislamiento de Asbestinino 7 se realiza de acuerdo a lo reportado en la literatura,

utilizando HPLC en fase reversa (columna ODS como fase estacionaria y MeOH:H2O

93:07 como fase móvil).

Se obtuvo un buen rendimiento del 48% del compuesto puro con relación a la



13C-

RMN producidas por su doble enlace exocíclico, el éster acetato, el éster octanoato, la

presencia de señales debidas a H6 y C6 en la zona de 4.5 ppm y 87 ppm respectivamente

y las típicas del esqueleto de los asbestininos.


molecular a m/z 520, los fragmentos a m/z 460 (pérdida del grupo acetato), m/z 376

37

(pérdida del grupo octanoato y el fragmento debido a la pérdida de agua desde el ion

molecular a m/z 502, que confirman su identidad.

Parte de este compuesto será derivatizado a su éster urocánico y su glucósido.

III.2.2.9 Síntesis, Aislamiento y Elucidación Estructural de 6-ester urocánico de

Asbestinino 7.

La síntesis del 6-ester urocánico de Asbestinino 7 se realiza de acuerdo al protocolo

reportado en la literatura, el rendimiento de la esterificación es excelente (72% contra un

76 % reportado para urocanización de compuestos de estructura similar).



literatura.





posición.


el fragmento a m/z 580 (pérdida del grupo acetato), m/z 502 (pérdida del grupo

urocanato) y m/z 496 (pérdida del grupo octanoato) a partir del ion molecular.



III.2.2.10 Síntesis, Aislamiento y Elucidación Estructural de 6-glucósido de

Asbestinino 7.

La síntesis del 6-ester urocánico de Asbestinino 7 se realiza de acuerdo al

protocolo reportado en la literatura en dos etapas; primero la benzoilación de asbestinino

7 y luego la glucosidación del asbestinino benzoilado.

III.2.2.10.1 Benzoilación de Asbestinino 7.


extraer en éter dietílico al compuesto orgánico de acuerdo al protocolo reportado en la

literatura, obteniéndose un buen 70% de rendimiento de reacción.


RMN a 6.9, 7.1, 7.3 y dos a 7.4 ppm, correspondientes al anillo bencénico del grupo

benzoato, indicativo de que este grupo se enlazó a la molécula.



posición.


el fragmento a m/z 564 (pérdida del grupo acetato), m/z 502 (pérdida del grupo benzoato)

y m/z 480 (pérdida del grupo octanoato) a partir del ion molecular.

38

Al tomarse el punto de fusión del compuesto puro, la muestra se descompuso

alrededor de los 398 grados centígrados, por lo que se tomó la determinación de no

obtener el punto de fusión de los demás derivados, al sintetizarse poca cantidad de

muestra y evitar así su pérdida irreversible.

III.2.2.10.2 Glucosidación de Asbestinino 7-6-benzoilado.

El producto de la reacción de glucosidación se purifica al extraerse con acetato de

etilo y rotaevaporarse el exceso del solvente de acuerdo al protocolo establecido en la

literatura.

El rendimiento de la reacción (17%) puede considerarse bueno, tomando en

cuenta que la reacción es multietapas y compleja para realizarse.

La identificación de la molécula se logra por sus señales de 1H-RMN adicionales

al de Asbstinino 7 a 3.35, 3.40, 4.47, 3.50, 3.54 y 3.62 ppm, que corresponden a los

protones hidroxilados de la glucosa. Adicionalmente el protón anomérico de la glucosa se

identifica por su señal de 1H-NMR a 4.6 ppm.

El desplazamiento a campo bajo de la señal asignada a H6 en Asbestinino 7, por

1.3 ppm es indicativo de existió glucosidación en esta posición.

Los fragmentos a m/z de 682 (ion molecular), m/z 622 (pérdida del grupo acetato),

m/z 538 (pérdida del grupo octanoato) y m/z 502 (pérdida de glucosa), confirman la

identidad del compuesto.

Al intentar tomar el punto de fusión de este derivado, este se descompuso arriba

de los 225 oC.

III.2.3 Actividad Citotóxica de Cembranoides 2,11-ciclizados.

III.2.3.1 Tamizaje inicial.

El resultado del tamizaje inicial de la actividad citotóxica contra nauplios de A.

salina, de los cuatro cembranoides 2,11-ciclizados naturales aislados, los cuatro

derivados 6-ester urocánico y el derivado 6-glucosidado, resultó en la muerte del 100 %

de los nauplios en cada ensayo a una concentración de 1 mg/mL del compuesto.

Este resultado esperado, debido a la citotoxicidad reportada en la literatura para

los cembranoides 2,11-ciclizados, originó que se bajara la concentración de los

compuestos a un rango entre 1 g/mL y 0.01 g/mL.

III.2.3.2 Tamizaje a concentraciones de entre 1 g/mL y 0.01 g/mL y determinación de

la CL50.

Al analizar los resultados de CL50 de los cembranoides 2,11-ciclizados naturales,

se observa que todos ellos tienen valores en el rango nanomolar, siendo el de menor valor

Asbestinino 7 (200 nM), luego Briarellina E (830 nM), Asbestinino 20 (1320 nM) y 4-

deoxyasbestinino G (1480 nM).

Estos valores son importantes, ya que demuestran se altamente citotóxicos y

comparables a Eleutherobina (200 nM).

39

Realizando un análisis de la relación Estructura/CL50 de los cembranoides

naturales, se puede asumir que la presencia del ester octanoato (común en Briarellina E y

Asbestinino 7) puede ser factor que determine el incremento en su citotoxicidad ante los

nauplios de A. salina.

Comparando entre sí los datos de CL50 de los cembranoides 6-ester urocánico, se

observa la misma tendencia en el orden de citotoxicidad que la observada en los

cembranoides naturales, sin embargo es importante señalar que se incrementa la

citotoxicidad entre un 15% a un 18%, siendo congruente con la hipótesis planteada de

que al urocanizar estos cembranoides en la posición 6 se incrementaría su citotoxicidad.

Al analizar las concentraciones letales medias a nivel nanomolar, se observa que

el 6-ester urocánico de Asbestinino 7 (110 nM) y el de Briarellina E (150 nM) posen

valores de CL50 inferiores a Eleutherobina (200 nM), lo que los hace muy promisorios

como probables medicamentos anticáncer, bajo el supuesto de que este último se

encuentra en Fase Clínica III en el Instituto Nacional del Cáncer en Estados Unidos -

NCI- como medicamento contra cierto tipo de cáncer.

Los otros derivados 6-éster urocánico, presentaron valores cercanos a

Eleutherobina pero superiores a ella (230 nM para Asbestinino 20 y 260 nM para 4-

deoxyasbestinino G).

Lo anterior no los descarta como potenciales medicamentos anticáncer.

Es importante observar que la similitud estructural existente entre Asbestinino 20 y 4-

deoxyasbestinino G y sus derivados 6-ester urocánico entre sí, genera citotoxicidades

similares entre sí (230 nM vs. 260 nM respectivamente).

La CL50 mostrada por el 6-Glucósido de Asbestinino 7 fue baja (14,950 nM o

14.95 M) fue pobre, lo que determinó que por la complejidad de la reacción multietapas

de síntesis, el bajo rendimiento observado en la misma y la baja cantidad de

cembranoides naturales aislados, no se sintetizaran los otros tres derivados 6-

glucosidados.

Es de hacer notar que los valores de CL50 reportados en la literatura para algunos

cembranoides 2,11-ciclizados se encuentra en el rango de 200 a 1,000 nM, con

Asbestinino 7 presentando 288 nM (Leukemia/CCRF-CEM), sin embargo fueron

calculados utilizando líneas celulares cancerosas como Breast Cancer/MCF7,

Leukemia/CCRF-CEM y Colon Cancer/HCT-116 entre otras, por que las comparaciones

con los valores de CL50 obtenidos contra nauplios de A. salina no pueden hacerse

directamente.

III.2.4 Modelaje Molecular y Propiedades Farmacofóricas de Cembranoides 2,11-

ciclizados.

III.2.4.1 Conformación de Mínima Energía.

Al comparar los parámetros fisicoquímicos obtenidos en la Optimización Geométrica,

entendiéndola como la técnica fundamental de la modelización molecular, cuyo objetivo

es obtener las conformaciones de baja energía de los compuestos estudiados, se infiere

que:

40

Dentro de los cembranoides 2,11-ciclizados naturales, la conformación de mínima

energía más alta corresponde a Asbestinino 7 (-345.6624569 Kcal/mol) y la más

baja a Asbestinino 20 (-217.1479208 Kcal/mol).

Dentro de los derivados éster urocánico corresponde el de valor más alto de

conformación de mínima energía al derivado de Asbestinino 7 (-301.9882719

Kcal/mol) y el de más baja al derivado de Asbestinino 20 (-175.0312442

Kcal/mol).

Lo anterior es congruente con que a un incremento en el peso molecular del

compuesto, su valor de mínima energía conformacional es más alto.

Comparando los valores de mínima energía conformacional del derivado éster

urocánico de 4-deoxyasbestinino G (pm 508 umas, -181.2676869 Kcal/mol) con los de

Sarcodictina B (pm 510 umas, -153.7614918 Kcal-mol), que poseen peso molecular

comparable, se observa un menor valor en Sarcodictina B, indicando que es una molécula

energéticamente más estable.

Los valores de Momento Dipolar son distintos para ambos compuestos (7.75 D para

Sarcodictina B y 5.49 D para éster urocánico de 4-deoxyasbestinino G), lo que indica que

es una molécula más polar Sarcodictina B, debido fundamentalmente a la posición del

éster urocánico en la molécula.

Los valores de Mínima Energía Conformacional como de Momento Dipolar de

ambos compuestos comparados, indican que Sarcodictina B pudiera acomodarse mejor

en el complejo que forman con las tubulinas (su mecanismo de acción) que lo que

pudiera hacer el éster urocánico de 4-deoxyasbestinino B.

III.2.4.2 Propiedades Farmacofóricas.

III.2.4.2.1 Topological Molecular Polar Surface Area (TPSA).

Este parámetro calcula la suma de las contribuciones superficiales de los

fragmentos polares de una molécula y permite predecir las propiedades de transporte de

la molécula a través de la membrana celular, con menores valores de TPSA para un mejor

transporte a través de la membrana celular.

Comparando los valores de los cembranoides 2,11-ciclizados naturales, se infiere

que el orden de mejor transporte a través de la membrana celular es Asbestinino 9 (61.83

A2), Asbestinino 20 y 4-deoxyasbstinino G (64.99 A

2), Briarellina E (85.22 A

2) y por

último Asbestinino 7 (95.29 A2), lo anterior debido a que a mayor tamaño de la molécula

es un poco más difícil su transporte, no obstante que Asbestinino 7 y Briarellina E poseen

mayor cantidad de grupos apolares (de mayor capacidad de transporte a través de

membranas celulares).

Al comparar los valores de TPSA de Sarcodictina B (112.770 A2) con el éster

urocánico de 4-deoxyasbestinino G (101.770 A2) y Eleutherobina (160.690 A

2), se

predice un mejor transporte del derivado éster urocánico incluso mejor que la molécula

siendo estudiada en Fase Clínica III en el FDA como medicamento anticáncer.

41

III.2.4.2.2 Relación de Solubilidad n-octanol/agua (cLogP).

Este valor (el logaritmo del coeficiente de partición n-octanol/agua) permite

determinar la hidrofilicidad del compuesto. Valores altos de cLogP significa bajas

hidrofilicidades y pobre absorción y permeación en membranas celulares. Generalmente

buenos valores se establecen debajo de 5.0

Los valores para los cembranoides 2,11-ciclizados naturales aislados se

encuentran entre 4.672 y 3.180, todos valores dentro del rango aceptable, con el mejor en

Asbestinino 20.

Los derivados éster urocánico sintetizados, muestran valores mas altos que sus

moléculas predecesoras, con valores entre 5.670 y 4.178, con los derivados de Briarellina

E (5.633) y Asbestinino 7 (5.670) arriba de 5.0.

Los valores de cLogP de lo derivados éster urocánicos de Asbestinino 20 (4.178)

y 4-deoxyasbestinino G (4.958) son aceptables y menores de 5.0.

Al comparar el cLogP del éster urocánico de 4-deoxyasbestinino G (4.958) y

Asbestinino 20 (4.178) con los de Sarcodictina B (4.224) y Eleutherobina (3.055), se

observa que todos están por debajo de 5.0 con un buen potencial para los derivados

urocánicos sintetizados en esta investigación.

Los otros parámetros farmacofóricos calculados (Número de Aceptores, Número

de Donadores, Grupos Negativos Ionizables, Grupos Positivos Ionizables, Relación

Átomos/Enlaces, Número de Átomos Aromáticos, Número de Anillos y Enlaces

Rotables) son comparables a los compuestos que estudia el FDA como medicamentos

anticáncer y se utilizan como insumos para el cálculo de TPSA y cLogP.

42

PARTE IV.

IV.1 CONCLUSIONES

1. Se sintetizó un derivado 6-glucósido de cembanoide 2,11-ciclizado (6-glucósido

de Asbestinino 7).

2. Se sintetizaron cuatro derivados 6-éster urocánico de cembranoides 2,11-

ciclizados (6-éster urocánicos de Asbestinino 7, Asbestinino 20, 4-

deoxyasbestinino G y Briarellina E).

3. Se determinó la actividad citotóxica contra nauplios de Artemia salina de los

cinco cembranoides 2,11-ciclizados sintetizados.

4. Los cuatro cembranoides 2,11-ciclizados ester-urocánico sintetizados, poseen

valores de CL50 a nivel nanomolar contra nauplios de Artemia salina,

comparables a Eleutherobina.

5. El cembranoide 2,11-ciclizado 6-glucósido sintetizado, posee un valor de CL50 a

nivel micromolar contra nauplios de Artemia salina, no comparable a

Eleutherobina, los cembranoides naturales y derivados 6-ester urocánicos

sintetizados.

6. Se aislaron cinco cembranoides 2,11-ciclizados de Briareum asbestinum, cuatro

con un grupo hidroxilo sobre C6 de la molécula (Asbestinino 7, Asbestinino 20,

4-deoxyasbestinino G y Briarellina E) y uno con grupo carbonilo en dicha

posición (Asbestinino 9).

7. Se determinó la actividad citotóxica contra nauplios de Artemia salina de cuatro

cembranoides 2,11-ciclizados naturales aislados.

8. Los cuatro cembranoides 2,11-ciclizados naturales aislados, poseen valores de

CL50 a nivel nanomolar contra nauplios de Artemia salina, comparables a

Eleutherobina.

9. Se calculó y graficó la conformación de mínima energía de la molécula de trece

cembranoides 2,11-ciclizados; 5 cembranoides 2,11-ciclizados naturales

(Asbestininos 7, 9, 20, 4-deoxyasbestinino G y Briarellina E), cuatro

cembranoides 2,11-ciclizados 6-éster urocánico (derivados de Asbestininos 7, 20,

4-deoxyasbestinino G y Briarellina E), un derivado de cembranoide 2,11-

ciclizado 6-glucósido (Asbestinino 7) y tres cembranoides 2,11-ciclizados tipo

sarcodictina (Sarcodictinas A y B y Eleutherobina) para utilizar como modelos de

comparación.

10. Se calculó y graficó las propiedades farmacofóricas (TPSA, cLogP, Número de

Aceptores, Número de Donadores, Grupos Negativos Ionizables, Grupos

Positivos Ionizables, Relación Átomos/Enlaces, Número de Átomos Aromáticos,

Número de Anillos y Enlaces Rotables) de la molécula de trece cembranoides

2,11-ciclizados; 5 cembranoides 2,11-ciclizados naturales (Asbestininos 7, 9, 20,

4-deoxyasbestinino G y Briarellina E), cuatro cembranoides 2,11-ciclizados 6-

éster urocánico (derivados de Asbestininos 7, 20, 4-deoxyasbestinino G y

Briarellina E), un derivado de cembranoide 2,11-ciclizado 6-glucósido

(Asbestinino 7) y tres cembranoides 2,11-ciclizados tipo sarcodictina

(Sarcodictinas A y B y Eleutherobina) para utilizar como modelos de

comparación.

43

11. Se realizó extensa revisión bibliográfica sobre lo reportado en cembranoides 2,11-

ciclizados, originándose una publicación en la revista Natural Product Research

de Taylor & Francis Cóbar, O. Survey of 2,11-cyclized cembranoids from

Caribbean sources. Natural Product Research. 2009, 23 (1), 26-43.

44

IV.2 RECOMENDACIONES

1. Sintetizar nuevos Cembranoides 2,11-ciclizados 6-derivados, para optimizar la

ruta sintética.

2. Aislar nuevamente cembranoides 2,11-ciclizados de Briareum asbestinum, para

continuar con estudios de síntesis orgánica y actividad biológica.

3. Realizar pruebas de actividad citotóxica sobre líneas celulares cancerosas para

tener datos de su CL50 más exactos y comparables con los que se estudian en el

FDA de los Estados Unidos de América como medicamentos anticáncer.

4. Efectuar estudios farmacofóricos más profundos sobre los cembranoides 2,11-

ciclizados naturales y sintéticos aislados y sintetizados en esta investigación.

45

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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49

IV.4 ANEXOS

ANEXO 1

Extracción, fraccionamiento, separación, purificación de

cembranoides 2,11-ciclizados naturales y síntesis de derivados.

1.1 Briareum asbestinum seco y liofilizado.

1.2 Bomba de alto vacío utilizada en el liofilizador

1.3 Maceración de Fracciones.

1.4 Mezclador y homogenizador del extracto crudo.

50

1.5 Rotaevaporador

1.6 Fraccionamiento de Extractos

1.7 Colección de fracciones

1.8 Monitoreo de fracciones por TLC

51

1.9 Equipo para síntesis orgánica

1.10 Equipo de RMN en Universidad de Puerto Rico

52

ANEXO 2.

Esquema de Aislamiento de Briareum asbestinum.

53

ANEXO 3

Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-ciclizados naturales.

3.1 Esquema del Farmacóforo de Asbestinino 9


3.3 Esquema del Farmacóforo de 4-deoxyasbestinino G

54


3.5 Esquema del Farmacóforo de Briarellina E

55

ANEXO 4

Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-ciclizados 6-ester urocánicos.

4.1 Esquema del Farmacóforo del 6-ester urocánico de Asbestinino 20

4.2 Esquema del Farmacóforo del 6-ester urocánico de 4-deoxyasbestinino G

4.3 Esquema del Farmacóforo del 6-ester urocánico de Asbestinino 7

56

4.4 Esquema del Farmacóforo del 6-ester urocánico de Briarellina E

57

ANEXO 5

Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-cicizados 6-glucosidados

5.1 Esquema del Farmacóforo de Asbestinino 7 6-glucosidado

58

ANEXO 6

Esquema de Farmacóforos de Cembranoides 2,11-ciclizados

utilizados como comparación.

6.1 Esquema del Farmacóforo de Sarcodictina A

6.2 esquema del Farmacóforo de Sarcodictina B

59

6.3 Esquema del Farmacóforo de Eleutherobina

Clave

Esferas rojas y verdes: Zonas de influencia de grupos polares como Nitrógeno y Oxígeno que

poseen pares de electrones no compartidos que pueden “donar”.

Se diferencian en la “profundidad” de ubicación.

Esferas amarillas: Zonas de influencia de grupos apolares (lipofílicos)

Esferas cafés: Zonas de influencia de grupos lipofílicos en sitios de mayor “profundidad” de

ubicación.

60

ANEXO 7

Survey of 2,11-ciclyzed cembranoids from Caribbean sources

61

PARTE V

V.1 INFORME FINANCIERO

Los recursos financieros fueron ejecutados globalmente en un 88.08%, incluyendo los

provenientes de la línea de financiamiento FODECYT como de la Facultad de Ciencias

Químicas y Farmacia.

En el rubro de Servicios No Personales, los renglones de Estudios, Investigaciones y

Proyectos de Factibilidad (181) es el de mayor monto, ejecutándose el 88.00%, le siguen

el de viáticos al exterior (131), elementos y compuestos químicos (261) y uso de bienes

intangibles (158).

Los tres últimos se ejecutaron en un 100%, utilizándose en los estudios de separación,

aislamiento, obtención de datos espectroscópicos y espectrométricos (Resonancia

Magnética Nuclear de una y dos dimensiones, Espectrometría de Masas y Cromatografía)

realizados en la Universidad de Puerto Rico, Recinto de Río Piedras, la adquisición de

software especializado de modelaje molecular y la adquisición de reactivos químicos

necesarios para los procesos de aislamiento y síntesis orgánica de derivados de los

cembranoides correspondientes.

En el rubro de Propiedad, Planta, Equipo e Intangibles, se ejecutó la totalidad de lo

presupuestado, adquiriéndose equipo de laboratorio con fondos de ambas instituciones,

ascendiendo a Q 37,100.00.

Se adquiere equipo para síntesis orgánica y equipo complementario al existente para la

extracción, destilación y purificación de los compuestos aislados de Briareum asbestinum

y los modificados sintéticamente en el laboratorio.

Se adjunta la ficha financiera correspondiente.

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