i

CONSEJO NACIONAL DE Secretaría Nacional CIENCIA Y TECNOLOGÍA de Ciencia y Tecnología

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA –CONCYT-

SECRETARÍA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA –SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA –FONACYT-

CENTRO DE ESTUDIOS DEL MAR Y ACUICULTURA –CEMA-

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA –USAC-

INFORME FINAL

EVALUACIÓN DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE LAS POBLACIONES DE

Atractosteus tropicus PRESENTES EN LA COSTA DEL PACÍFICO DE

GUATEMALA

PROYECTO FODECYT No. 02-2009

M.Sc. Leonel Carrillo Ovalle

Investigador Principal

GUATEMALA, DICIEMBRE DE 2016.

Centro de Estudios del Mar y Acuicultura

ii

AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro

del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología –FONACYT-, otorgado por la Secretaría

Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT- y el Consejo Nacional de Ciencia y

Tecnología –CONCYT-.

iii

Mis agradecimientos al Centro de Estudios del Mar y Acuicultura de la

Universidad de San Carlos de Guatemala, sin cuyo apoyo este proyecto no habría

alcanzado los resultados plasmados en los objetivos, en especial al Laboratorio de

Sanidad Acuícola.

Quiero externar mis más sinceros agradecimientos a la Licda. Carolina Marroquín

Mora investigadora asociada a este proyecto, especialista en los análisis de PCR, sin

quien este proyecto no hubiera sido posible.

iv

RESUMEN

En Guatemala existe una alta diversidad íctica, compuesta principalmente por

cíclidos y poecílidos, a la que se suman peces de importancia económica y ecológica

como el Atractosteus tropicus, comúnmente llamado pejelagarto o machorra. Debido a la

importancia y atractivo de la machorra, la especie ha estado bajo un excesivo régimen de

explotación (CECON, 1999). Esto aunado al deterioro de los ecosistemas donde habita,

ha disminuido significativamente las poblaciones naturales.

En respuesta, se han propuesto proyectos de investigación y manejo de la especie,

incluyendo la reproducción en sistemas controlados y la acuicultura. Sin embargo, son

pocos los estudios que se han realizado sobre su biología, y casi inexistentes los estudios

sobre su genética, limitándose principalmente a los desarrollados por la Universidad de

Juárez en Tabasco, México. Este proyecto evaluó la diversidad genética de las cuatro

poblaciones de Atractosteus tropicus identificadas en la costa del Pacífico de Guatemala

mediante la utilización de microsatélites polimórficos.

Esta evaluación determinó que los distintos grupos de animales que aún existen en

Guatemala, no pueden ser considerados como poblaciones diferentes, ya que su

variabilidad genética es limitada y los genomas de sus miembros son muy cercanos.

Adicionalmente, se determinó que el genoma de Atractosteus tropicus es muy cercano al

genoma de otros peces del mismo género.

v

ABSTRACT

There is a great diversity of fishes in Guatemala. Most of those fishes are

either cichlids or pocilids; however, there are other species like Atractosteus tropicus,

commonly named machorra o pejelagarto, that are economically and ecologically

important. Because of the economic and ecological importance of machorra, this species

has been under excessive exploitation (CECON, 1999). These pressures, added to the

deterioration of its natural habitat have greatly diminished the natural populations.

In response to this problem, different research projects have been proposed in

order to manage the species. Those projects include aspects such as reproduction under

controlled systems and aquaculture. However, there are only a few studies about the

biology of the species, and only a couple of studies of its genetics. Most of the genetic

studies of this species have been conducted by the Universidad Juárez de Tabasco,

México. Our project evaluated the genetic diversity of the four Atractosteus tropicus

natural populations identified in the pacific coast of Guatemala. Polymorphic

microsatalites were used to determine genetic diversity.

Results from this project determined that the different Atractosteus tropicus

groups that still inhabit the Gatemalan pacific coast cannot be considered different

genetic populations. Genetic variability is limited amongst populations and genomes of

fish from different groups are closely related. Additionally, it was determined that the

genome of Atractosteus tropicus is closely related to the genome of other species within

the same genus.

vi

INDICE

PORTADA i

AGRADECIMIENTOS ii

AGRADECIMIENTOS ESPECIALES iii

RESUMEN iv

ABSTRACT v

INDICE vi

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN 1

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 3

I.3 OBJETIVOS 4

I.3.1 Objetivo General 4

I.3.2 Objetivos Específicos 4

I.4 HIPÓTESIS 5

I.5 METODOLOGÍA 6

I.5.1 VARIABLES E INDICADORES 6

I.5.2 POBLACIONES Y MÉTODOS 6

1.5.3 Etapa 1 7

1.5.3.1 Identificación de zonas de habitación de A. tropicus en la

Costa del Pacífico guatemalteco y colecta de material

genético 7

1.5.3.2 Identificación taxonómica de la especie 8

vii

1.5.3.3 Desarrollo de marcadores moleculares microsatelitales

del genoma de la machorra A. tropicus 8

1.5.3.4 Extracción de ADN genómico para comparación de

poblaciones 8

1.5.3.5 Secuenciación, análisis de secuencias y diseño de

iniciadores 10

1.5.4 Etapa 2 10

PARTE II 12

MARCO TEÓRICO 12

II.1 Atractosteus tropicus 12

II.2 Historia evolutiva, biología y genética de los Lepisosteidos 12

II.3 Importancia biológica y económica de la especie 13

II.4 Importancia de los estudios de genética en peces 14

II.5 Marcadores genéticos 16

II.6 Marcadores bioquímicos o variantes proteicos 17

II.7 Marcadores moleculares 18

II.7.1 Secuencias de ADN mitocondrial (ADNmt) 19

II.7.2 Secuencias de ARN ribosomal (ARNr) 19

II.7.3 Secuencias de ADN nuclear (ADNn) 20

II.7.4 ADN satélite o satelital 21

II.8 Ventajas y desventajas de los marcadores moleculares 22

II.9 Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos 25

viii

PARTE III 30

III.1 RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 30

III.1.1 Etapa 1 30

III.1.1.1 Identificación de zonas de habitación de A. tropicus en la

Costa del Pacífico guatemalteco y colecta de material genético 30

III.1.1.2 Identificación taxonómica de la especie 36

III.1.1.3 Desarrollo de marcadores moleculares microsatelitales,

secuenciación y análisis de secuencias 38

III.1.2 Etapa 2 40

III.2 Otras actividades realizadas durante el desarrollo

del proyecto 41

PARTE IV 42

IV.1 CONCLUSIONES 42

IV.2 RECOMENDACIONES 44

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 45

IV.4 ANEXO 49

PARTE V

V.1 INFORME FINANCIERO 55

ix

INDICE DE FOTOGRAFÍAS, GRÁFICAS Y CUADROS

Cuadro No. 1. Variables e indicadores del proyecto 6

Cuadro No. 2. Comparación entre las ventajas y desventajas

de los diferentes marcadores protéicos y moleculares.

Tomado de: Arias-Rodríguez (2007a). 23 y 24

Fotografía No. 1. Pila de un hogar de la comunidad La Blanca en

el Departamento de San Marcos, donde se observa que tienen a un

Atractosteus tropicus como mascota. 31

Fotografías 2, 3 y 4. Serie de fotografías de uno de los puestos

de comercialización de productos de la pesca donde se observó

la presencia de Atractosteus tropicus adultos, saludables y bien

alimentados. 33

Figura No. 1. Imagen satelital de Laguneta la Palmilla en el

Departamento de Santa Rosa, Guatemala. Esta laguna constituye

una especie de santuario para Atractosteus tropicus, ya que

permite que la especie se refugie durante parte de su ciclo de vida

y al encontrarse dentro de una propiedad privada no es explotada

por la pesca artesanal. 35 Fotografía No. 5. Proceso de muestreo de un ejemplar vivo de

A. tropicus obtenido del Canal de Chiquimulilla en la Aldea

de Monterrico, Santa Rosa, Guatemala. La muestra consiste

en 1 cm2 de tejido de la aleta caudal fijado en alcohol

metílico 95% grado biología molecular. 36

Figura No. 2. Características de identificación taxonómica

de Lepisosteidos de la región centroamericana. Tomado de

Wiley (en FAO, 2003). 36

Fotografías 6, 7 y 8. Proceso de identificación de A. tropicus

durante los muestreos de campo. 37

Fotografía No. 9. Trabajo en el laboratorio durante la fase de

extracción de ADN genómico de las muestras colectadas. 40

Fotografías 10 y 11. Imágenes del trabajo de laboratorio desarrollado

durante el proyecto de investigación. 41

1

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN

En la pesquería costera y ribereña guatemalteca existen varias especies de peces

que son apreciadas por el precio de compra, el sabor de la carne y la versatilidad para

cocinarlas. Entre las especies nativas, el Atractosteus tropicus conocida localmente como

pejelagarto o machorra es una de las especies más sobresalientes (CECON, 1999).

Debido a su importancia y al deterioro de los ecosistemas que ésta habita, la especie está

bajo un excesivo régimen de explotación por lo que se le considera una especie

amenazada, por lo menos en algunas regiones del país (CECON, 1999).

En respuesta a la situación de la especie, se han propuesto varios trabajos de

conservación del hábitat y la especie misma, así como investigaciones sobre su

reproducción en cautiverio y cultivo (Carrillo y otros, 2011). Sin embargo, existen

pocos estudios sobre su biología, y son prácticamente inexistentes los estudios

relacionados con su genética, limitándose a estudios sobre su cariotipo (Arias-Rodríguez,

2007; Arias-Rodríguez y otros, 2009). Es por ello urgente, la aplicación de estudios

innovadores que consideren la comprensión de algunos aspectos de genética poblacional

y mendeliana como herramienta básica para el buen manejo, conservación y explotación

del recurso.

La aplicación de técnicas moleculares para determinar la diversidad genética de

organismos permite tener datos concluyentes sobre su grado de diversidad genética, y

evaluar de esta forma la situación y perspectivas de futuro. La información que se

genera, debido a su calidad y especificidad permite sentar las bases genéticas para la

conservación y reglamentación de cultivo y aprovechamiento de la especie.

Este trabajo, desarrollado en dos fases, consistió en aislar marcadores moleculares

satelitales de Atractosteus tropicus a partir de la información generada por la

secuenciación de su ADN genómico, siendo esta la primera vez, de acuerdo a la

información disponible para los autores, que ambas técnicas de biología molecular se

aplicaron en Guatemala para el estudio de genética de peces. Las secuencias encontradas

fueron comparadas con las secuencias genéticas de Atractosteus sp. reportadas en el

banco de genes (GenBank® NCBI) y se emplearon para comparar la variabilidad genética

entre las poblaciones de machorra identificadas en la costa del Pacífico de Guatemala.

Este proyecto, además de la información generada sobre la genética de

Atractosteus tropicus permitió la capacitación de profesionales del Laboratorio de

Sanidad Acuícola del CEMA-USAC en distintas técnicas y metodologías de biología

molecular que pueden ser aplicadas a otras especies nativas y cultivadas de organismos

acuáticos. Así mismo, propició la implementación de una técnica de evaluación

2

genética que puede ser utilizada en otras especies acuícolas y de importancia ecológica

para el país y para el CEMA-USAC.

Durante la investigación se determinó que las poblaciones silvestres de

Atractosteus tropicus en Guatemala son muy pequeñas y se encuentran principalmente

concentradas en lagunas o áreas inundables de los ríos caudalosos de la parte baja de la

Costa del Pacífico que son poco accesibles o tienen zonas protegidas o restringidas a la

pesca. Las zonas identificadas como zonas de habitación de estos organismos son poco

accesibles y la densidad poblacional es baja en la mayoría de ellas; por lo que no fue

posible colectar suficientes muestras para hacer una comparación genética entre las

poblaciones.

En total se identificaron cuatro poblaciones de machorra aisladas geográficamente

y con pocas posibilidades de intercambio de material genético. Las poblaciones

identificadas son: población de San Marcos ubicada en Laguna Las Palmas y La Blanca;

población de Retalhuleu ubicada en El Chico y La Barrita, Población de Escuintla

localizada en El Semillero y Sipacate; y población de Santa Rosa ubicada en Candelaria y

Monterrico, ambas en el Canal de Chiquimulilla.

Estas poblaciones presentan ligeras variaciones en su morfología, sin embargo el

análisis del material genético no evidenció diferencias significativas entre las

poblaciones, por lo que se infiere que no pueden considerarse poblaciones genéticamente

distintas, confirmándose de esta forma la hipótesis planteada para la investigación. Las

variaciones encontradas se deben, muy probablemente, a las condiciones ambientales y

disponibilidad de alimento propio de la zona que habitan.

3

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Atractosteus tropicus es una especie íctica nativa de Guatemala, el sur de México y

Centroamérica. Es una especie importante no solo en la pesca de subsistencia (CECON,

1999) sino también como una posible alternativa de especie de cultivo (Carrillo y otros,

2011). Desde hace varios años existen reportes de su sobreexplotación y del interés de

las comunidades donde normalmente habita, y de entidades ambientalistas y de gobierno,

en el cultivo o repoblación de cuerpos de agua naturales. Aunque ya se hacen trabajos de

investigación sobre la reproducción y producción acuícola de la especie, y existen

experiencias, principalmente en México, sobre su cultivo y comercialización, no se tiene

conocimiento básico sobre su genética. Este desconocimiento implica el riesgo de que si

se inicia una industria de cultivo, el impacto ecológico de la misma incluya también el

riesgo de contaminación genética de las poblaciones naturales. Si por otra parte se

iniciaran esfuerzos de repoblación, no se tiene información de línea base sobre las

poblaciones naturales que permitan evaluar el impacto de la introducción de animales

producidos de otras poblaciones o bien de reproductores en cautiverio.

El desconocimiento sobre la genética básica de peces nativos de Guatemala no se

limita a Atractosteus tropicus. Antes de este estudio, no existía en Guatemala ningún

reporte científico que evaluara la variación genética de las poblaciones de especies

nativas de peces. Esta deficiencia se debe en parte a que el país no se cuenta con

laboratorios que tengan metodologías establecidas y validadas que permitan el desarrollo

de este tipo de estudio. Este proyecto fue el primero, de acuerdo a la información

disponible a los autores, en aplicar técnicas de biología molecular para estudiar

poblaciones de peces de Guatemala.

El desarrollo de este proyecto permitió implementar una técnica que puede ser

utilizada, con algunas modificaciones menores, en cualquier otra especie de pez.

También generó espacios de capacitación al personal del Laboratorio de Sanidad

Acuícola de CEMA en técnicas de biología molecular básicas, las cuales son

herramientas esenciales en estudios de biología y genética de organismos.

4

I.3 OBJETIVOS

I.3.1 Objetivo General

Determinar y evaluar mediante la utilización de la técnica de marcadores microsatelitales

polimórficos del genoma de la machorra (Atractosteus tropicus) y la variación genética

de las diferentes poblaciones que se presentan en la Costa del Pacífico Guatemala.

I.3.2 Objetivos Específicos

Desarrollar una técnica de enriquecimiento para aislar marcadores moleculares

microsatelitales del genoma de A. tropicus (machorra), para su uso en programas de

conservación, repoblamiento y manejo de la especie.

Identificar el grado de polimorfismo de los microsatélites desarrollados y compararlos

con las secuencias genéticas registradas en el banco de genes, y las que se desarrollen

en México.

Determinar si la especie de A. tropicus que habita en el país es la misma que habita en

el Sur de México y otros países centroamericanos, a través de la comparación de la

diversidad genética encontrada en la Costa del Pacífico de Guatemala, con la

información generada en proyectos similares en México y Centro América.

Implementar la técnica de desarrollo de marcadores moleculares microsatelitales en el

Laboratorio de Sanidad Acuícola y formar recursos humanos en el uso y aplicación

de técnicas de biología molecular en estudios genéticos de organismos acuáticos.

5

I.4 HIPÓTESIS

La especie de Atractosteus tropicus que habita en los diferentes ecosistemas

acuáticos de la Costa Sur de Guatemala es la misma especie que habita el Sur de México

y los demás países de Centro América, y no existe variación genética significativa entre

las distintas poblaciones de esa región.

6

I. 5 METODOLOGÍA

El proyecto se llevó a cabo en dos etapas y se completó en aproximadamente 24

meses, de febrero de 2010 a diciembre de 2011. En la Etapa 1 se muestreó el área de

distribución de la especie y se colectó material genético de los organismos encontrados.

Este material genético sirvió para el desarrollo de los marcadores moleculares que se

utilizaron en la fase dos del proyecto. La Etapa 2 del proyecto consistió en la utilización

de los microsatélites desarrollados en la etapa uno, para la determinación de la

variabilidad genética de las diferentes poblaciones de machorra en la Costa del Pacífico

de Guatemala.

I.5.1 VARIABLES E INDICADORES

VARIABLE TIPO DE

VARIABLE

INDICADOR

Grado de polimorfismo de los

microsatélites desarrollados

Cuantitativa

Porcentaje de variación

entre marcadores

Frecuencia de microsatélites

en el genoma de cada

individuo

Especie de pez, determinada de

acuerdo a las características

merísticas y morfométricas de

clasificación taxonómica clásica

basada en claves dicotómicas

Cualitativa

Identificación de los peces

colectados durante los

muestreos de campo

utilizando claves

dicotómica de identificación

Número de personas calificadas en la

utilización de la técnica de

marcadores moleculares

microsatelitales en el Laboratorio de

Sanidad Acuícola del CEMA-USAC

Cuantitativa

Registros de trabajo en el

laboratorio, procedimientos

operativos estandarizados

para llevar a cabo los

procedimientos en las

condiciones propias del

laboratorio.

Cuadro No. 1. Variables e indicadores del proyecto.

I.5.2 POBLACIONES Y MÉTODOS

Las poblaciones objetivo de estudio de la presente investigación son los peces

comúnmente llamados machorra o pejelagarto que se encuentran en las zonas inundiables

de ríos caudalosos de la Costa del Pacífico de Guatemala.

7

Tal como se indicara anteriormente esta investigación utilizó varios métodos de

investigación, incluyendo el método deductivo analítico para determinar a partir de la

información colectada y los datos generados en el laboratorio la diversidad genética de

las poblaciones de peces estudiadas. También se utilizaron métodos analíticos de

biología molecular y métodos estadísticos básicos para la determinación del porcentaje de

ocurrencia de los diferentes marcadores moleculares en las poblaciones estudiadas y el

grado de similitud entre las secuencias de microsatélites identificadas.

1.5.3 Etapa 1

En esta etapa se llevaron a cabo varias actividades, siendo estas: identificación de

posibles zonas de habitación de la especies, muestreo de las zonas de habitación

identificadas, colecta de material genético, identificación taxonómica de la especie

usando claves dicotómicas de identificación, y desarrollo de marcadores moleculares

microsatelitales del genoma de A. tropicus.

1.5.3.1 Identificación de zonas de habitación de A. tropicus en la costa del Pacífico

guatemalteco y colecta de material genético

De acuerdo a la información bibliográfica disponible para la especie (CECON,

1999), información colectada durante investigaciones anteriores (Carrillo, 2011), y

registros anecdóticos de pescadores artesanales, se determinó que las zonas inundables de

las desembocaduras de los ríos más caudalosos de la Costa Sur, eran posiblemente las

zonas más pobladas de A. tropicus en Guatemala.

El muestreo se limitó a las zonas que cumplían con los siguientes dos requisitos:

registro, real o anecdótico de pesca de la especie; y posición geográfica aislada, lo que

suponía la posibilidad de albergar poblaciones distintas y sin posibilidad de reproducción

entre sí. La baja densidad de organismos silvestres condicionó a que la mayoría de las

muestras fueran colectadas de peces capturados por pescadores. En los casos que se pudo

colectar organismos vivos, se tomó una porción de la aleta dorsal y los animales fueron

devueltos a su hábitat natural.

Se empleó muestras de tejido de la aleta caudal (1cm2) fijado en alcohol metílico

grado biología molecular (95%). Cada tejido individual fue conservado y etiquetado en

tubos de reacción individuales. Estas muestras fueron conservadas a -20 ºC hasta que se

emplearon para la extracción de ADN.

8

1.5.3.2 Identificación taxonómica de la especie

La determinación taxonómica de los especímenes utilizados en esta investigación

se basó en los caracteres taxonómicos señalados por Miller y otros (2005).

Adicionalmente a la identificación taxonómica de los organismos colectados, se hicieron

observaciones generales respecto a su fenotipo y estado incluyendo: coloración general y

de líneas, tamaño, apariencia sobre el estado de madurez sexual, y condición general de

los animales.

1.5.3.3 Desarrollo de marcadores moleculares microsatelitales del genoma de la

machorra A. tropicus

La metodología utilizada en esta investigación es una modificación de la

metodología desarrollada por el Dr. Lenin Arias, Ph.D., de la Universidad de Juárez

Autónoma de Tabasco, quien nos asesoró durante el proyecto. Para muchos de los

procesos, incluyendo la extracción de ADN se validaron kits comerciales de biología

molecular (Merck®). La secuenciación genómica de A. tropicus fue contratada con el

laboratorio UCLA Genotyping and Sequencing Core, de la Universidad de California en

Los Angeles, California, Estados Unidos de América. La metodología de secuenciación

fue pirosecuenciación de segunda generación por “shotgun sequencing” utilizando un

equipo Titanium Shotgun-050411. La secuenciación del ADN genómico se obtuvo a

partir de ADN extraído con un kit comercial Qiagen® para tejidos. El ADN genómico

extraído se preservó en buffer TE y almacenó en hielo seco para su transporte, hasta su

secuenciación.

1.5.3.4 Extracción de ADN genómico para comparación de poblaciones

La extracción de ADN de las muestras se realizó de acuerdo al protocolo

implementado por Arias-Rodriguez (2007a) en el pez loach Japonés. La técnica consiste

en una extracción fenol-cloroformo, ligeramente modificada a la técnica clásica que fue

previamente validada para tejido de A. tropicus en el laboratorio, para asegurar la calidad

del ADN extraído (Ramírez, 2009).

En este método modificado se sigue el siguiente protocolo de extracción

(modificado de Arias-Rodríguez, 2007a):

- Macerado de las muestras individuales de tejido en tubos de reacción independientes,

debidamente identificados

- Adición de 400 µl de buffer de lisis + 10 µl de proteinasa (20 mg/ml) a cada muestra

9

- Incubación en una estufa de hibridación a 37 ºC y rotación de 11 rpm durante la

noche. Debido a que el Laboratorio de Sanidad Acuícola del CEMA-USAC no

cuenta con estufa de hibridación se utilizó un vortex en una velocidad de mezcla baja,

con una bandeja para tubos de reacción, dentro de una incubadora a 37°C para hacer

la extracción (Anexo 1).

- Adición de 50 µl de NaCl (5M) mezclando con vortex (mezclado suave),

manteniendo las muestras conservadas a 4ºC hasta la recuperación del ADN

- Recuperación de ADN: adición de 400 µl de fenol neutralizado (fenol 1:1 Buffer TE)

a temperatura ambiente 25 ºC por 20 min en estufa de hibridación con rotación de 11

rpm

- Adición de 400 µl de la mezcla de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1)

- Centrifugación a temperatura ambiente (25 ºC) por 20 min a 15000 rpm

- Recuperación de 400 µl de la capa superior (de tres que se formarán) compuesta por

ADN:Buffer de lisis

- Transferencia de 200 µl a un nuevo tubo nuevo de reacción estéril de 1.5 ml

- Repetir el procedimiento para recuperar el ADN 3 o más veces o hasta que la mezcla

de ADN:Buffer se observe totalmente transparente

- Adición a cada muestra 40 µl de acetato de sodio (3M-pH 5.2)

- Precipitación del ADN: adición a cada tubo 800 µl de etanol absoluto frío (4 ºC),

mezclar suavemente dejando las muestras por 20 min en la estufa de hibridación con

rotación de 11 rpm

- Al término del paso anterior centrifugar las muestras 4 ºC por 30 min a 15000 rpm y

consecutivamente drenar el etanol de cada tubo (evitar que el ADN precipitado en el

fondo del tubo se desprenda)

- Lavar cada muestra con 200 µl de etanol frío al 70 % evitando desprender el ADN

precipitado

- Remover los restos de etanol por centrifugación (mini-centrifuga) por 1 min cada

muestra y dejar los tubos abiertos por 15 min dentro de la campana de flujo laminar

para evitar la entrada de partículas basura en las muestras

- Adicionar a cada muestra 100 µl de buffer TE (1M tris-HCl 2ml+ 0.5M EDTA 0.4

ml+ H2O DD197.6 ml)

- Colocar en la estufa de hibridación a temperatura ambiente con rotación de 11 rpm

durante la noche para mezclar adecuadamente el ADN con el buffer TE

- Para cada muestra determinar la concentración final de ADN empleando un

espectrofotómetro para cuantificar el ADN

- Ajustar la concentración de ADN de cada muestra a 100 ng/µl empleando como

diluyente el buffer TE

- En caso de no usar las muestras inmediatamente, conservarlas a 4 ºC hasta su empleo

10

1.5.3.5 Secuenciación, análisis de secuencias y diseño de iniciadores

Posterior a la secuenciación, las secuencias de ADN se analizaron para encontrar

secuencias de cadenas complementarias, las secuencias resultantes se alinearon con

ayuda del software Nomachine NX Client y el programa BioEdit v7.0.9, por

recomendación del laboratorio de secuenciación. Las secuencias alineadas se verificaron

visualmente y con la ayuda del programa para identificar secuencias repetitivas de

nucleótidos o microsatelites. Este análisis se hizo con ayuda de las herramientas

disponibles en GenBank® (NCBI) parte de International Nucleotide Sequence Database,

Collaboration, específicamente la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search

Tool). De las secuencias encontradas se procedió a verificar los primers publicados por

otros autores utilizando el programa PrimerExpress (Marshall, 2004). Finalmente, se

analizó las secuencias aisladas con una prueba de homología, empleando en línea el

programa BLAST del banco de genes (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), para

identificar regiones correlacionadas entre secuencias identificadas en otros organismos.

1.5.4 Etapa 2

En esta etapa se procedió a evaluar la diversidad genética de las distintas

poblaciones de machorra (A. tropicus) de la Costa del Pacífico de Guatemala, utilizando

como parámetro de comparación la frecuencia de los microsatélites identificados.

Para evaluar la diversidad genética del las distintas poblaciones se utilizaron las

muestras de tejido anteriormente colectadas. El ADN se extrajo utilizando un kit

comercial de extracción que utiliza silica como sustrato de adherencia de ADN

(GeneReach Biotechnology®. Este ADN fue limpiado y purificado usando filtros de

extracción AppliedBiosystems®. Se emplearon cinco de los marcadores microsatelitales

para evaluar el grado de variación genética de las poblaciones. Debido al bajo número de

muestras para trabajar no pudieron ser analizados utilizando las medidas comunes de

heterocigosidad.

Cada reacción de amplificación fue de 10 µL, integrando los siguientes

componentes:

- 1 µL de ADN purificado

- 0.25 U de Taq DNA polimerasa (Merck®)

- 1 µL de 10X buffer + 0.2 mmol / L de mezcla de dNTP

- 1.5 mmol / L de MgCl2

- 0.2 µmol / L de cada primer

11

La reacción de amplificación (PCR) se realizó en el termociclador Applied

Biosystems serie RealTime 7300, bajo el siguiente programa:

- Desnaturalización a 96°C por 10 minutos

- 35 ciclos de los siguientes pasos: 94°C por 1 minuto, y 72°C por 1 minuto

- 5 minutos de extensión a 72°C

El ADN resultante se cada reacción fue corrido en geles de agarosa grado biología

molecular 1.5% en un equipo de electroforesis horizontal, junto con una regla molecular

de 100 pares de bases (pb) a 100 voltios por 30 minutos. Al final de la corrida los geles

fueron teñidos con bromuro de etidio y fotodocumentados para su análisis.

Debido a que no se tenía suficientes muestras de ADN de todas las poblaciones de

machorra identificadas, solo se utilizaron las muestras de las poblaciones de El Chico en

Retalhuleu; Candelaria y Monterrico en el Canal de Chiquimulilla, Santa Rosa.

12

PARTE II

MARCO TÉORICO

II.1 Atractosteus tropicus

A esta especie se le conoce como machorra, pejelagarto, pez armado o Gaspar, en

diferentes localidades de su distribución geográfica normal. Es una especie acuática

considerada como pez fósil viviente por su poca evolución comparada con otros

teleósteos. Habita en ríos, lagunas y pantanos del Sureste de México y Centroamérica

(Castillo, 2006).

Se distribuye en tres poblaciones geográficas que no son adyacentes una de otra.

Dichas poblaciones están en la vertiente Atlántica en las cuencas del Usumacinta hasta

Coatzacoalcos en el sur de México y Guatemala, y hasta más al sur en el Lago Nicaragua

y el Río San Juan y sus tributarios en Costa Rica. Otra población geográfica registrada

para la especie se extiende en la vertiente del Pacífico desde el Sur del Estado de

Chiapas, México hasta el Río Negro en Nicaragua (Miller y otros, 2005; Bussing, 1987).

En Tabasco México, estudios realizados para establecer el estado de salud de las

poblaciones silvestres de machorra en la Reserva de la Biosfera Pantanos de Centla,

señalan que se requiere incluir a la especie dentro de los programas piscícolas para

fomentar su cultivo y evitar que ingrese en la lista de especies amenazadas o en peligro

de extinción (Márquez, 2002). De acuerdo a estudios del Centro de Estudios

Conservacionistas de la Universidad de San Carlos de Guatemala –CECON- (1999) esta

especie se encuentra en peligro en el área del Canal de Chiquimulilla de Guatemala,

debido a la sobre-explotación del recurso y el deterioro de su hábitat natural.

Existe evidencia de que especies similares y emparentadas, tales como el catán

(Atractosteus spatula) (Mendoza y otros, 2000), y el manjuarí (Atractosteus tristoechus)

(León y otros, 1978) que han estado sometidos a sobreexplotación, también se consideran

como especies amenazadas en sus regiones de localización.

II.2 Historia evolutiva, biología y genética de los Lepisosteidos

Los peces Lepisosteidos, dentro de los cuales se encuentra el pejelagarto junto a

otras 6 especies, (Reséndez y Salvadores, 1983) son peces de agua dulce y pantanosa que

han habitado la Tierra desde la Era Mesozoica (Willey, 1976). Hay registros fósiles de

peces Lepisosteidos en Europa, Asia y América. Solo en Norte y Centroamérica existen

siete especies de Lepisosteidos vivientes, distribuidas seis de ellas en Norteamérica desde

el norte de México hasta el sur de Canadá (Atractosteus spatula, A. tristoechus,

13

Lepisosteus oculatus, L. platostomus, L. osseus, L. platyrhincus) y A. tropicus en

Centroamérica, desde el sureste de México hasta el sur de Costa Rica (Willey, 1976;

Nelson, 1994; Bussing, 2005; Miller y otros, 2005).

Las machorras son peces de cuerpo cilíndrico alargado, cubiertos por escamas

romboides articuladas entre sí por sus bordes. Dicha particularidad de las escamas

proporciona a estos organismos una cubierta rígida que los protege de los depredadores

(Miller y otros, 2005). Los Lepisosteidos son carnívoros, con una vejiga natatoria muy

vascularizada (que funciona como un aparato de respiración) e intestino con válvula

espiral (Nelson, 1994). Son peces ovíparos de fecundación externa. La reproducción se

lleva a cabo en sitios con vegetación abundante que sirve de sustrato para que los huevos

se adhieran (Resendez y Salvadores, 1983; Bussing, 2005).

Las machorras muestran características particulares de morfología y fisiología que

las hacen organismos muy tolerantes a condiciones extremas de temperatura y baja

concentración de oxígeno del agua (Chavez, 2003). Las hembras de esta especie muestran

mayor talla y peso que los machos (Resendez y Salvadores, 1983; Contreras y Alemán,

1987; Márquez, 2002). La proporción de sexos puede variar entre las poblaciones

naturales y domesticadas, especialmente durante la etapa reproductiva (Chávez-Lomeli y

otros, 1989).

El control artificial de la reproducción de machorras bajo condiciones de

laboratorio, con el empleo de tratamientos hormonales (Hernández, 2002) ha favorecido

la producción en masa de larvas de la especie que han servido para la repoblación de

sitios donde esta especie ha sido sobreexplotada. Actualmente, en los programas

acuícolas de México ha surgido preocupación por altos índices de mortalidad observados

durante el desarrollo embrionario y larvario, sospechándose que dicho fenómeno se debe

al alto grado de endogamia del lote de reproductores mantenidos en cautiverio por varios

años (Arias-Rodríguez, y otros, 2009).

II.3 Importancia biológica y económica de la especie

Dentro de la biodiversidad acuática conocida, los peces son uno de los grupos más

representativos e importantes de la región, por el número de especies descritas y la

importancia económica de éstos para muchas de las comunidades costeras. La utilidad de

la ictiofauna nativa guatemalteca no ha sido realmente estimada y su aprovechamiento

para cultivo es incipiente en algunas especies y en otras totalmente inexistente, debido en

parte al desconocimiento de muchos aspectos básicos de su biología.

Siendo la pesca tradicional una de las actividades de subsistencia de la mayoría de

las comunidades costeras, ríos, lagunas y áreas temporales de inundación; el impacto que

14

dicha actividad ha tenido sobre las poblaciones de peces nativos ha causado la

disminución de los volúmenes de captura (Bussing, 2005; Miller y otros, 2005). En

Guatemala A. tropicus ha sufrido sobreexplotación principalmente por la pesca excesiva

con artes no selectivas, períodos prolongados de pesca incluyendo la temporada de

reproducción, y deterioro de los sitios naturales de desove (CECON, 1999).

Entre los recursos pesqueros, de los peces nativos dulceacuícolas de las zonas

costeras algunos se destacan por su tradición de consumo. La captura y el consumo local

de la machorra constituyen una de las bases de la pesca de tipo artesanal en los ríos y

lagunas de México y también de Guatemala (Chavez-Lomeli y otros, 1989). En el área

del Canal de Chiquimulilla, uno de los ecosistemas acuáticos más importantes de la Costa

del Pacífico de Guatemala, la machorra es la especie más atrapada por los pescadores

artesanales (CECON, 1999). Esta captura para la explotación comercial y para

autoconsumo, sumada a la disminución en la disponibilidad de ecosistemas y hábitats

naturales por deterioro antropogénico, han contribuido a que la especie se considere

amenazada (CECON, 1999).

II.4 Importancia de los estudios de genética en peces

El estudio de los peces nativos con fines acuícolas y de conservación ha sido en

los últimos años, una línea de investigación fructífera en varios países debido

principalmente a la preocupación existente por los efectos desmedidos de las pesquerías

sobre los recursos naturales (Mendoza y otros, 1995; Nelson, 1994; Miller y otros, 2005).

Existe un elevado interés en el uso racional de los recursos, la conservación del medio

ambiente, y una creciente inquietud de conocer el efecto de la introducción de especies

exóticas como las tilapias, carpas, y plecostomos, sobre las poblaciones de especies

nativas, tanto dulce acuícolas como marinas.

Adicionalmente, a nivel mundial existe una demanda creciente de alimento de alta

calidad, a bajo costo de producción y que sea simultánea al desarrollo rural y económico

de las poblaciones. Esta coyuntura ha propiciado que los peces se presenten como un

grupo importante y potencial con una diversidad de especies potenciales para cultivo.

En Guatemala existen pocos estudios sobre diversidad biológica de peces, pero se

sabe que existen muchas especies de interés recreativo, ecológico y comercial. Los

estudios clásicos de taxonomía realizados en otros países permitieron la separación

acertada de la mayoría de las especies peces de América. Sin embargo, el empleo de

estudios innovadores posteriores que permitieran separar poblaciones de peces de una

especie, aún no se realizan en ninguna de las especies de peces nativos de Guatemala,

mucho menos en A. tropicus que es el único representante de su grupo en Centroamérica.

15

El empleo de herramientas citológicas, junto con la tinción diferencial de ciertas

estructuras del ADN de los cromosomas han permitido la separación de especies y

poblaciones de especies como la sardina (Astyanax scanbripinnis), y el anguila de

pantano (Synbranchus marmoratus) y algunos cíclidos de Sudamérica (Denton, 1973).

Además, se ha visto que especies con cariotipos semejantes son susceptibles de ser

hibridizadas, mientras que en caso contrario las posibilidades de cruzamiento son

biológicamente nulas en la mayoría de los casos (Arias-Rodríguez y otros, 2007b). En A.

tropicus el cariotipo de la especie ha sido determinado (Arias-Rodríguez, 2009). Sin

embargo, mayores esfuerzos son necesarios para establecer la posición que guarda las

diferencias en la estructura cromósomica de varias poblaciones de la especie.

La tipificación del genoma se aplica para la identificación de alelos en estudios de

taxonomía, fisiología y genética de varios organismos incluyendo los peces marinos y

continentales (Avise, 2004). En peces, este análisis ha sido empleado para determinar

pesos moleculares de proteínas y marcadores moleculares, caracterización de moléculas y

alelos, identificación y caracterización de diferentes poblaciones genéticas (especies,

clones, razas, linajes, etc.) (Avise, 2004). Por ejemplo, en el loach Misgurnus

anguillicaudatus usando estas técnicas fue posible identificar poblaciones y razas

genéticas de la misma especie (Arias-Rodriguez y otros, 2007).

A partir del empleo de marcadores moleculares, se ha demostrado que existen

locus y alelos que son particulares para cada especie (Avise, 2004), o de una población de

la misma especie (Arias-Rodriguez, y otros, 2007). Los marcadores genéticos han sido

empleados para el estudio poblacional, de varias especies de peces y se ha determinado la

presencia de varios fenotipos (o polimorfismo) que dependiendo de la especie y

población, pueden mostrar loci homocigotos o heterocigotos (Avise, 2004). La presencia

de homocigosis y heterocigosis en poblaciones y especies independientes, es una

herramienta indispensable para la conservación de poblaciones y selección de lotes de

reproductores para repoblación y acuicultura (Arai, 2001).

Varias especies de peces han sido evaluadas, identificadas, separadas y cotejadas

desde el punto de vista genético usando diferentes herramientas (Avise, 2004). De los

marcadores moleculares los que presentan mayor potencial de utilización en peces para

estimar variación genética en una especie, son los microsatélites o unidades repetitivas de

ADN-SSR (Avise, 2004). Con el empleo de los marcadores microsatelitales se ha logrado

la separación de varias especies de peces y otros animales, incluso la separación de

poblaciones e híbridos en una misma especie, como el loach (Misgurnus

anguillicaudatus) con un alto grado de precisión (Arias-Rodriguez, 2007a; Arias-

Rodriguez y otros, 2007b).

La variación genética de las poblaciones naturales, también puede ser detectada

por la medición de caracteres fenotípicos como los empleados en taxonomía clásica

16

(merísticos y morfométricos) para separar especies y grupos taxonómicos (Cailliet y

otros, 1986). La combinación analítica de los caracteres taxonómicos, es una herramienta

que permite detectar endemismo y variantes taxonómicas que pueden emplearse no solo

para la conservación de áreas geográficas especificas, sino también para un desarrollo

sostenido del recurso mediante selección genética y la creación de líneas con

características deseables (Kirpichnikov, 1981).

Como se ha mencionado anteriormente, el potencial de la machorra para su cultivo

y manejo es alto, debido a las características biológicas propias del grupo taxonómico al

que pertenece, que le confieren mayor resistencia y crecimiento. Algunos de los aspectos

preliminares de su cultivo y reproducción han sido abordados en México y Costa Rica y

empiezan a abordarse en Guatemala, sin embargo, dado los lineamientos globales para

utilización y manejo de recursos naturales; es de crucial importancia estimar, la variación

genética de las poblacionales de la especie antes de proponer proyectos complejos de

manejo y explotación de la especie.

II.5 Marcadores genéticos

Una de las principales publicaciones sobre taxonomía es el libro clásico The New

Sistematics (Huxley, 1940). A partir de esta publicación se ha avanzado

significativamente. Existen muchos libros y ensayos sobre quimiotaxonomía,

serotaxonomía, cariotaxonomía y otros tópicos afines como el uso de las secuencias de

proteínas y de ácidos nucleícos en taxonomía (Denton, 1973; Ayala, 1980; Cailliet y

otros, 1986).

Aunque el empleo de características merísticas y morfométricas y el estudio de la

estructura y número de cromosomas fueron vistos como dispositivos eventualmente

convincentes para el reconocimiento de relaciones entre algunas especies y a pesar del

éxito obtenido en algunas de ellas, su aplicación se vio mermada por la carencia de

pruebas estadísticas adecuadas para el análisis de los datos generados. En las últimas

cuatro o cinco décadas, estudios de serología y grupos sanguíneos, dieron un nuevo

impulso a los estudios que involucran a una gran diversidad de organismos, como las

poblaciones de peces (Ferguson y otros, 1995).

Dichos estudios pueden ser incluidos de acuerdo a lo que señalan Ferguson y

otros (1995) dentro de los primeros estudios moleculares en las poblaciones de peces y

que tuvieron como propósito la identificación de caracteres bioquímicos y moleculares en

las poblaciones naturales. En peces se desarrolló la electroforesis en gel de almidón,

junto con la tinción histoquímica que permitió la identificación de enzimas y otros

polimorfismos proteicos (Ferguson y otros, 1995).

17

Las variantes genéticas de estos marcadores, en poblaciones naturales o en

cultivo, han permitido muchos logros y avances en el área de acuicultura, entre los que

se pueden mencionar los siguientes: identificación de híbridos y especies; establecimiento

de la historia filogenética y filogeográfica de especies y poblaciones; determinación de la

estructura poblacional (y del stock de reproductores) de poblaciones explotadas;

identificación de las propiedades de líneas puras; y determinación de la contribución

individual de un lote de reproductores cuando estos son empleados en programas de

repoblación (Ferguson y otros, 1995; Zhu y otros, 2006).

También se ha podido medir los niveles de cambio y los propios cambios en la

variación genética de las poblaciones silvestres y cultivadas; estimar el tamaño real de

una población; identificar los atributos (claves) poblacionales con fines de conservación;

localizar recursos materiales para suplementación y restauración de especies; realizar

ensayos del rendimiento de lotes de peces; determinar el impacto de la introducción

deliberada e inadvertida de peces cultivados en las poblaciones naturales, establecer el

género de los individuos (de una población); determinar las estrategias de cultivo para

especies nuevas o afines a especies cultivadas; comparar el rendimiento relativo del

historial de variantes (comprobando la sobrevivencia relativa de la descendencia en

relación con los parámetros de los progenitores); eliminar el efecto de tanque en

experimentos de selección; mapear genomas; hacer mapas de recombinación; analizar

cuantitativamente de genes ligados y hacer ensayos del éxito de la manipulación del

genoma; entre otras aplicaciones (Ferguson y otros, 1995; Zhu y otros, 2006).

II.6 Marcadores bioquímicos o variantes proteicos

Los estudios iniciales que involucraron el empleo de las proteínas (como la

hemoglobina y transferina) en los 60´s, cambiaron de posición por el empleo de proteínas

enzimáticas (aloenzimas) en las que muchos estudios subsecuentes se han realizado

(Ferguson y otros, 1995; Zhu y otros, 2006). La identificación electroforética de

proteínas polimórficas ha sido empleada extensamente para investigar la variación de

poblaciones de peces silvestres y domesticadas (Moav y otros, 1976), así como también

la variación generacional en programas de selección en ostras (English y otros, 2000). El

procedimiento de identificación consiste en que después de haber sido teñida una enzima,

un número variable de bandas pueden presentarse en los extractos (de un tejido dado) de

cada individuo. Estas bandas son llamadas isoenzimas y pueden corresponder de acuerdo

con English y otros (2000) a lo siguiente:

a) Los productos de la expresión de varios genes en varios loci

b) Los productos de expresión de varios alelos de un gen dado en un locus dado

c) Moléculas producidas por cambios conformacionales de una molécula proteica dada

d) Moléculas sintetizadas por un gen o grupo de genes, que ha sufrido varias

transformaciones pos-traducción.

18

Las proteínas que difieren en su carga eléctrica neta pueden separarse mediante

técnicas de electroforesis en gel, pero no todos los cambios de aminoácidos en la

estructura primaria pueden detectarse con esta técnica, si no sólo los que determinan

diferencias en la carga eléctrica de las proteínas y ocasionalmente aquellos que cambien

la conformación de las mismas (Zhu y otros, 2006). Por esta razón y debido también a la

redundancia del código genético no todas las diferencias alélicas pueden identificarse por

electroforesis de las proteínas correspondientes, subestimándose así la variación genética

hasta en un 60 % (Zhu y otros, 2006).

Sin embargo, las proteínas que se pueden distinguir mediante la electroforesis son

siempre producto de diferentes alelos (Moav y otros, 1976). Por esta razón una de las

principales limitaciones de las variantes proteicas como marcadores genéticos es el bajo

nivel de polimorfismo en algunas especies y poblaciones, aunque un considerable número

de proteínas polimorficas han sido identificadas en algunas especies, otras especies han

mostrado niveles bajos de variabilidad (Ferguson y otros, 1995).

II.7 Marcadores moleculares

Esta tecnología basada en la biología molecular tiene como fundamento el

aprovechar las características estructurales y funcionales de los ácidos nucleicos que

constituyen el material genético de los seres vivos y en cuya secuencia de bases está

contenida toda la información que requiere un organismo para llevar a cabo sus

funciones vitales (Zhu y otros, 2006).

Los atributos de los ácidos nucleicos han permitido un incremento substancial en

el empleo de las herramientas de las que dispone actualmente la biología molecular para

el análisis directo del ADN y ARN de tal forma que ahora es posible analizar el ADN

nuclear (ADNn) y ARN ribosomal (ARNr) de organismos vivos y muertos. Estas

técnicas se han utilizado principalmente para el análisis molecular de una secuencia de

ADN o ARN o bien en el análisis molecular de todo un cromosoma (o genoma

bacteriano) (Ferguson y otros, 1995).

El desarrollo de la amplificación del ADN empleando la reacción en cadena de la

polimerasa –PCR- ha dado cabida a la posibilidad de analizar cambios en las

poblaciones de peces (y todos los seres vivos susceptibles de ser analizados) empleando

material archivado, y además ha dado vida nueva a muchos colecciones de animales,

incluyendo los laboratorios de pesquerías, especímenes de museo en todo el mundo

(Ferguson y otros, 1995). Estas técnicas son, sin embargo, de alto costo y de requieren de

ciertas destrezas técnicas. Sin embargo, el estudio del ADN ofrece un número

aparentemente ilimitado de avances prácticos en relación con el empleo de las proteínas.

Los marcadores moleculares de mayor empleo son los que se mencionan a continuación.

19

II.7.1 Secuencias de ADN mitocondrial (ADNmt)

Esta es una de las primeras técnicas moleculares que incluye el uso de

endonucleasas de restricción para comparar secuencias de ADN. Las propiedades del

ADNmt, permiten de acuerdo con Ayala (1980) y Avise (2004):

a) Que este sea más fácil de purificar que cualquier segmento específico de ADN

nuclear, debido a una densidad de flotación poco frecuente, un alto número de

copias y de su presencia en un organelo diferente al núcleo

b) El ADNmt es fácil de caracterizar porque es pequeño y carece de muchos de los

rasgos complejos del ADN nuclear (tales como intrones y secuencias repetitivas)

c) El ADNmt está distribuido universalmente en el reino animal y es notablemente

uniforme en contenido genético

d) Los tipos de cambio evolutivo que sufre el ADNmt son relativamente simples, son

principalmente sustituciones de bases y adiciones mutacionales de longitud que se

acumulan principalmente en las regiones pequeñas no codificadoras

e) El ADNmt tiene una tasa de cambio mucho más rápida que el ADN nuclear

f) Hasta donde se sabe el ADNmt se hereda maternalmente y todos los organismos

son haploides con respecto al tipo de ADNmt trasmitido

g) La recombinación no existe en el ADNmt, esta propiedad, aunado a las

características anteriores sugieren que el ADNmt es un marcador molecular

importante de tomarse en cuenta en el reconocimiento de las especies y

poblaciones.

Desde el punto de vista filogenético, la carencia de recombinación del ADNmt

como marcador, lo hacen susceptible de ser empleado como un organizador individual

dentro de linajes de matriarcados incluso después del entrecruzamiento (Ferguson y otros,

1995; Avise, 2004).

II.7.2 Secuencias de ARN ribosomal (ARNr)

El estudio de las relaciones filogenéticos y de la variación genética de una especie y

población de organismos también se ha efectuado empleando el ácido ribonucleico

(ARN), en especial el ácido nucleico ribosomal (ARNr) (Farias y otros, 2000; Avise,

2004).

20

El uso de este ácido se ha generalizado simultáneamente al del ADN nuclear. Los

argumentos que comúnmente se manejan a favor del empleo del ARNr son los siguientes:

a) El ARNr es fácil de aislar en cantidades adecuadas

b) El ARNr parece haber mantenido una función constante durante espacios de tiempo

evolutivo muy extensos en los diferentes linajes, de esta forma es enteramente

comparable

c) Por lo menos en alguna parte de su secuencia el ARNr ha cambiado con suficiente

lentitud, como para que la secuencia ancestral no haya sido modificada totalmente

d) El empleo del ARNr garantiza que las secuencias comparadas representan genes

transcritos a ARNm y no genes menores e inactivos

e) El ARNr 5S´ es particularmente adecuado para el análisis de las relaciones

genealógicas entre organismos muy distantemente relacionados en virtud de los

atributos, que le confieren una baja tasa de sustitución de nucleótidos y de la

similitud básica de la estructura entre todos los organismos, así como una longitud

casi igual (de aproximadamente 120 nucleótidos) lo que permite alinear fácilmente

sus secuencias para la construcción de dendogramas filogenéticos.

II.7.3 Secuencias de ADN nuclear (ADNn)

En células animales y vegetales, el ADN forma una estructura de doble hélice

donde las cadenas individuales que la constituyen son complementarias y antiparalelas,

complementarias por que los 4 desoxinucleótidos forman parejas y antiparalelas por que

una de las cadenas corre de 3´→5´ y la otra de 5´→3´. El apareamiento entre las bases A-

T y G-C se debe a que cuando estas se encuentran frente a frente en las cadenas

antiparalelas, se forman puentes de hidrógeno, estos puentes de hidrógeno se pueden

romper elevando la temperatura o mediante la acción de proteínas (Farias y otros, 2000;

Avise, 2004).

El ADN queda entonces como dos cadenas sencillas independientes. A este

evento se le llama desnaturalización y es reversible (Farias y otros, 2000). Si se dan las

condiciones apropiadas las cadenas complementarias pueden volver a reunirse. En el

proceso de reunión, las cadenas que se unen formando la doble hélice pueden tener

orígenes diferentes, en este caso la doble cadena formada es en realidad un híbrido

(proceso conocido como hibridación) (Farías y otros, 2000). La puesta en práctica de este

fenómeno puede emplearse para detectar en una muestra heterogénea de ADN la

presencia de una secuencia especifica (identificación de parentesco entre individuos de

un mismo género o especie), para esto se requiere tener copias de la secuencia que se

desea encontrar. Estas copias se marcan de alguna manera que nos permita confirmar la

formación de las moléculas híbridas. A las cadenas marcadas se les llama sondas porque

son utilizadas para buscar en la muestra la cadena con secuencia complementaria

21

(secuencia blanco) (Karp, 2002). El procedimiento de hibridación consta de los siguientes

pasos: transferencia, marcado de la sonda, hibridación y detección de los híbridos.

II.7.4 ADN satélite o satelital

Los marcadores proteicos y de ADNmt, están basados en cambios en la

secuencia de ADN, generalmente como resultado de mutaciones puntuales que

involucran la sustitución de bases (Ferguson y otros, 1995). Recientemente se ha prestado

atención a otro tipo de variación de marcadores moleculares que difieren en el número

de copias repetidas de un segmento de ADN (Ferguson y otros, 1995; Avise, 2004). Estas

secuencias son llamadas ADN satélite. El ADN satélite es un marcador que se

caracteriza por ser una fracción del ADN genómico de los organismos eucariotas que

difiere (suficientemente) en su composición de bases de la mayoría de los fragmentos de

ADN, debido a que es altamente repetitivo y rico en timina y citosina (Neff y otros,

2000; Avise, 2004). Ferguson y otros (1995) y Avise (2004) clasifican estas secuencias

de acuerdo a su tamaño en:

Satélites: compuestos de unidades de varios cientos de pares de bases repetidas cientos o

millones de veces.

Minisatélites: secuencias de ADN de entre 9 a 100 pares de bases en longitud que son

repetidas de dos a varios cientos de veces en un locus dado.

Microsatélites: tienen una unidad de longitud de 1 a 6 pares de bases, repetidas varios

cientos de veces en un cada locus.

Estos autores también definen al polimorfismo de un solo nucleótido como el

grado de variación se muestra en uno o varios nucleótidos (Ferguson y otros, 1995;

Avise, 2006).

Los primeros estudios que involucraron pruebas generalizadas de minisatélites,

mostraron simultáneamente varios loci que dieron como resultado bandas múltiples de

ADN (fingerprints), pero debido a que el número de loci detectados y la asignación de

locus a los alelos individuales no fueron observables directamente, los análisis

estadísticos estándar de las poblaciones no pudieron ser aplicadas a esos datos (Ferguson

y otros, 1995). Sin embargo, el grado de heterocigocidad, distancias genéticas y medidas

de diversidad si pueden ser obtenidas de tales patrones (Ferguson y otros, 1995; Avise,

2004). Actualmente el progreso y aplicación de los marcadores moleculares y el

desarrollo de primers, ha incrementado el número de estudios que involucran el empleo

de marcadores microsatelitales, colectivamente conocidos como “variable number

tandem repeat loci” (VNTRs por sus siglas en inglés) (Neff y otros, 2000; Avise, 2004).

22

El ADN satélite es un grupo de marcadores genéticos con alto índice de

versatilidad que ha encontrado aplicaciones en muchos estudios de ecología, evolución y

conservación (Neff y otros, 2000; Avise, 2004). En biología pesquera estos marcadores

son ampliamente usados para los siguientes tipos de ensayos (Neff y otros, 2000):

determinación del tamaño efectivo de un lote poblacional, identificación de un grupo de

individuos (lote), evaluación del nivel de entrecruzamiento, evaluación de la estructura

poblacional y flujo genético, estudios de parentesco y caracteres cuantitativos (Neff y

otros, 2000).

II.8 Ventajas y desventajas de los marcadores moleculares

La identificación correcta de especies, poblaciones e individuos dentro de un lote

de reproductores es de suma importancia en los programas de manejo y conservación de

una especie biológica. La mayoría de los atributos que se toman en cuenta para el buen

manejo y conservación de una especie, están contenidos en su genoma. Dicho genoma

muestra una gran variedad de rasgos (marcadores) que permiten un monitoreo adecuado

de la especie. Estos atributos pueden ser empleados con ciertas limitaciones, en función

de la disponibilidad de recursos y aspectos técnicos (Arias-Rodríguez, 2009).

Para hacer uso de los diferentes marcadores moleculares que existen, es necesario

conocer algunas de sus características. Las principales se resumen a continuación:

23

Cuadro No. 2. Comparación entre las ventajas y desventajas de los diferentes

marcadores protéicos y moleculares.

MARCADOR VENTAJAS DESVENTAJAS

Proteínas - Las muestras pueden ser analizadas con rapidez

- Bajo costo de los reactivos

- Técnicas sencillas de aprender

- Las proteínas tienen función conocida

- Algunos loci están sujetos a selección

- Base de datos amplia para

varias especies

- Colecta del tejido y almacenamiento (fresco o

congelado) para que las

proteínas reaccionen

- Se requiere de varios tejidos

en cantidades grandes

(sacrificio del especimen)

- Bajo número de alelos por locus

- Solo proteínas pueden ser identificadas con tinciones

histoquímicas

- Algunos loci están sujetos a una selección significativa

- El análisis de los patrones

pueden ser difíciles de

identificar (especialmente en

los poliploides)

- Algunos la señalan como una metodología anticuada (con

bajos fundamentos)

DNA - Se emplea un solo tejido, en

pequeñas cantidades

- La amplificación por PCR permite cantidades

pequeñísimas de tejido

- Permite el empleo de escamas y especimes de

museo

- El tejido puede ser preservado en etanol

- Hay cientos de marcadores

potenciales

- Algunos loci son multialelicos

- Algunos loci no codifican y no están sujetos a selección

- Las mutaciones no resultan en proteínas que puedan dar

movilidad electroforética

- Relativamente lento y caro

- Difícil de entender

- Muy poca información comparativa disponible

24

MARCADOR VENTAJAS DESVENTAJAS

Microsatélites

- Pueden ser amplificados por

PCR

- Se emplea poco tejido

- Todos los alelos pueden ser discriminados

- Las secuencias existentes de dinucleótidos, son más

fáciles de aislar que la de los

minisatélites

- Se pueden conocer con

rapidez por medio de

secuenciadores automáticos

- Bandas-artefacto

especialmente con dinucleótidos

repetidos

- Se requiere de geles de acrilamida

- Allelos no amplificados dan homocigotos falsos y nulos

- Susceptibles de contaminación

- No todos los microsatélites

son altamente variables

Minisatélites - Separación en geles de

agarosa

- Corrimiento rápido de las

muestras (un solo filtro

permite correr hasta seis

muestras)

- Pocos problemas técnicos en las rutinas de trabajo

- Número grande de alelos para algunos loci

- No todos los alelos se pueden separar

- Solo alelos pequeños se

pueden tratar por PCR

- Se requiere de muchas destrezas técnicas y también se

requieren técnicos expertos

VNTRs

- Alta tasa de mutación y estadios alelicos múltiples,

muy variables

- No codifican, no están influenciados por la

selección

- Cientos de loci dispersos en todo el genoma

- Requiere de clonación para producir sondas o información de

la secuencia.

- Sondas especificas para un locus/iniciadores específicos para

el género en estudio.

- Información disponible limitada de los mecanismos

evolutivos.

Tomado de: Arias-Rodríguez (2007a.).

25

II.9 Métodos de secuenciación de ácidos nucleicos

Las técnicas de secuenciación del ADN se utilizan para determinar el orden de los

nucleótidos (A adenina, T timina, C citosina, G guanina) en la molécula de ADN, o en

una región particular de la molécula de ADN. La secuenciación del genoma ha ayudado

considerablemente en el estudio de la genética de poblaciones.

Aunque han existido técnicas de secuenciación de proteínas desde la década de

1950, las técnicas de secuenciación de ADN se desarrollaron hasta mediados de la década

de 1970. La estructura de doble hélice del ADN se conocía desde hacía

aproximadamente 15 años antes de la determinación de la primera secuencia de ADN de

forma experimental. Las dificultades en la secuenciación del ADN se debieron

principalmente a que las diferentes moléculas de ADN tienen propiedades químicas

similares, son mucho más largas que las cadenas polipeptídicas de las proteínas, y no se

conocían ADNasas específicas.

Antes de secuenciar el ADN se secuenció el ARN ya que algunas moléculas de

ARN, particularmente el ARN de transferencia eran pequeñas y se podían purificar

individualmente, además de conocerse ARNasas base-específicas y de que se

desarrollaron métodos análogos a los que se utilizaron para secuenciar proteínas. En

1970 se descubrieron las enzimas de restricción, lo que se constituyó un paso importante

en el desarrollo de métodos de secuenciación de ADN. Las enzimas de restricción

reconocen y cortan el ADN en secuencias específicas de entre 4 y 6 bases de largo

generalmente. El uso de enzimas de restricción permitió desarrollar un método general

para fragmentar moléculas largas de ADN en pequeñas piezas que podían separarse por

agarosa. A partir de ese momento la secuenciación genética ha pasado por lo que los

expertos en biología molecular consideran tres generaciones de técnicas.

La primera generación de secuenciación de ADN surgió en dos grupos distintos

de investigación distintos, en forma simultánea. Uno de estos grupos fue el grupo de

Walter Gilbert en la Universidad de Harvard. El otro grupo fue el grupo de Frederick

Sanger en la Universidad de Cambridge. Los secuenciadores Sanger y Gilbert se

consideran técnicas de primera generación. Estas primeras técnicas de secuenciación

eran considerablemente caras y tomaban tiempo. Otra de sus desventajas era que

utilizaban nucleótidos con etiquetas radioactivas, lo cual representaba riesgo a los

usuarios.

El método original de Sanger, publicado por Sanger y Coulson, se conoce como el

método “más-menos” (“plus-minus” method). Este método permitía la secuenciación de

fragmentos de ADN utilizando la enzima ADN polimerasa de E. coli. Siete años después

de la publicación del método de “más-menos” Sanger hizo una nueva publicación con

26

Nicklen y Coulson; este nuevo método mejoraba el método original, se utilizó en el

proyecto de secuenciación del genoma humano que se completó en el 2003 y fue el más

utilizado durante los 30 años siguientes. Por el desarrollo de este método de

secuenciación Frederick Sanger obtuvo su segundo Premio Novel en Química.

El método de Sanger era básicamente una modificación de una reacción de

replicación de ADN in vitro. Muchas de las tecnologías de secuenciación masiva utilizan

el principio de nucleótidos terminadores descrito por Sanger. Los componentes que se

requerían en esta reacción eran: ADN diana, polimerasa de ADN, primer (iniciador o

cebador) de la región de ADN inmediata anterior a la secuencia que se quiere replicar,

dNTPs y ddNTPs. La utilización de los ddNTPs es lo que distingue la secuenciación de

Sanger de cualquier otra reacción de replicación.

La secuenciación Sanger se basa en el uso de cadenas terminales, ddNTPs que se

agregan a las cadenas en proceso de alargamiento de ADN y terminan su síntesis en

diferentes puntos. En la mayoría de las reacciones la polimerasa agregará el dNTP

correcto a la secuencia creciente que ADN que se está sintetizando in vitro. En algunos

sitios, al azar, se agregará un ddNTP en lugar del dNTP. Si se agrega suficiente ADN

diana en la premezcla de la reacción, cada cadena sintetizada tendrá el ddNTP insertado

en un sitio aleatorio diferente y habrá por lo menos un ADN terminado en cada uno de

los diferentes nucleóticos a lo largo de la cadena, mientras la reacción esté ocurriendo

(por cerca de 900 nucleótidos bajo condiciones normales).

Los ddNTPs terminales tienen etiquetas fluorescentes fijadas covalentemente.

Cada uno de los cuatro ddNTPs tiene una etiqueta diferente, de forma que cada ddNTP

diferente fluorecerá de diferente color. Después de terminar la reacción, las secuencias de

ADN se separan por electroforesis de capilaridad de acuerdo a su tamaño. Cuando cada

segmento de diferente tamaño sale de la columna de capilaridad, un láser estimula la

etiqueta fluorescente del extremo terminal del nucleótido. De acuerdo al color que

resulta de la fluorescencia, una computadora lleva el registro del orden en que aparecen

los nucleótidos terminales, de esta forma se leen las secuencias completas del ADN

utilizado como diana.

El método de Gilbert, o de Maxam y Gilbert se publicó antes que el método de

Sanger. De acuerdo a los autores el procedimiento determinaba la secuencia nucleotídica

de un ADN marcado radioactivamente en un extremo, cortándolo con agentes químicos

en cada una de las bases. El corte parcial de cada base generaba un set de fragmentos

marcados desde el extremo marcado hasta la base donde fueron clivados. Utilizando

geles de poliacrilamida y separando dichos fragmentos por tamaño es posible determinar

la secuencia de la molécula de ADN. El método original de Maxam y Gilbert estaba

27

limitado por la capacidad de resolución de los geles de poliacrilamida y presentaba la

posibilidad de secuenciar 100 bases de ADN.

Tanto el método de Sanger como el método de Gilbert se conocían como primera

generación de secuenciadores y han caído en desuso debido al costo y el tiempo de

trabajo. La secuenciación de Sanger producía únicamente varios cientos de secuencias de

nucleótidos por reacción, además de las desventajas anteriormente descritas.

En 1986 Hood y colaboradores, en colaboración con Applied Biosystems,

publicaron el primer reporte de automatización de la secuenciación de ADN, que

establece la secuenciación con terminadores fluorescentes como variante del método de

Sanger. Esta variante utiliza una molécula fluorescente diferente unida a cada

dideoxinucleótido y permite realizar la reacción en un único tubo, permitiendo que la

secuencia sea leída por una computadora. Las secuencias obtenidas con esta variante

eran de entre 500 y 1000 nucleótidos.

La mayoría de las técnicas de segunda generación, conocidas en inglés como

“next-generation sequencing” generan bloques de secuencias aún más pequeñas que las

secuencias generadas con la primera generación de secuenciadores. Los genomas están

conformados por cromosomas que tienen decenas de miles de millones de pares de bases.

Estos genomas pueden secuenciarse únicamente en pequeños fragmentos y los

fragmentos tienen que ordenarse en el orden correcto para generar una secuencia

ininterrumpida, el genoma. La mayoría de los proyectos de secuenciación trabajados

con técnicas de segunda generación utilizan la técnica de secuenciación de genoma

completo conocida como “shutgun sequencing”.

La secuenciación shotgun es una técnica para determinar la secuencia de

cromosomas completos y genomas completos. La técnica se conoce formalmente como

“Whole genome Shotgun secuencing” y se acredita a Craig Venter. Se basa en la

producción al azar de fragmentos del ADN de todo el genoma. Estos fragmentos se

clonan en plásmidos y secuencian en ambas hebras. Una vez obtenidas las secuencias,

éstas se alinean y ensamblan para formar contigs basándose en las secuencias que se

sobreponen. El ensamblaje final de las secuencias se hace con programas de

bioinformática. Estos programas ordenan los fragmentos encontrando segmentos

terminales de secuencias que se sobreponen.

La secuenciación de genoma completo utilizando esta técnica involucra aislar

muchas copias del ADN cromosomal de interés. Como resultado, cada copia del mismo

cromosoma se fragmenta en diferentes puntos y los fragmentos de un solo cromosoma se

sobrepondrán unos con otros. Cada fragmento se secuencia y se emplean algoritmos

28

generados por computadora para comparar todos los fragmentos y para determinar cuál se

sobrepone a cuál. Al alinear las regiones sobrepuestas, un proceso conocido como

“tiling” la computadora encuentra las secuencias continuas más largas posibles a partir de

los fragmentos generados. Finalmente, se ensambla la secuencia completa de los

cromosomas.

La secuenciación shutgun frecuentemente se parea con la pirosecuenciación,

técnica que también corresponde a la segunda generación de secuenciadores, o “next

generation sequencing (NGS)”. La pirosecuenciación es un método de secuenciación de

ADN basado en el monitoreo, en tiempo real de la síntesis de ADN. Todo el proceso de

pirosecuenciación se realiza in vitro. Fue originalmente publicado en 2005 en Nature, y

llevado al mercado por la empresa 454 (posteriormente comprada por Roche).

De acuerdo a la publicación original del método, éste era escalable y con un

rendimiento significativamente mayor que los métodos de electroforesis capilar. El

equipo comercial permitía secuenciar 25 millones de bases con 99% de precisión en una

corrida de 4 horas, lo que significaba un rendimiento 100 veces superior a la cantidad de

bases secuenciadas con los secuenciadores más grandes de Applied Biosystems.

El método de pirosecuanciación consiste de cuatro pasos:

Fragmentación del ADN (o ARN)

Ligación de oligonucleótidos (adaptadores) en cada uno de los extremos

Amplificación clonar (mediante PCR de emulsión)

Secuenciado por síntesis usando un protocolo de pirosecuenciación optimizado en

un soporte sólido y en escala de picolitros

La secuenciación Illumina corresponde, según algunos autores a la tercera generación

de secuenciación de ADN. Otros autores prefieren incluir este método de secuenciación

entre los métodos conocidos como métodos de secuenciación masiva. Se le conoce con

ese nombre por la empresa que comercializó la técnica, aunque otras compañías tienen

secuenciadores similares. Los secuenciadores Illumina utilizan nucleótidos terminadores

marcados con moléculas fluorescentes, al igual que en la Secuenciación de Sanger.

Las principales diferencias del método Illumina respecto al método convencional son

la capacidad de realizar millones de secuencias en cada corrida; y la posibilidad de

eliminar la fluorescencia una vez obtenida la imagen y desbloquear el carbono 3´ de

modo que pueda aceptar una nueva base para continuar la reacción de secuenciación,

haciendo que la incorporación de un nucleótido terminador sea reversible; obteniendo

longitudes de onda menores; mayor capacidad de realizar secuencias en paralelo; y como

resultado obtener hasta 6X1012 secuencias en una corrida.

29

Similar a los métodos antes desarrollados el método Illumina inicia con una

fragmentación del ADN y una posterior ligación de adaptadores. Luego continúa con una

amplificación en superficie sólida conocida como “flow cell”, donde también se hace la

reacción de secuenciación. Durante la reacción, a diferencia de la pirosecuenciación, se

ofrecen los cuatro nucleótidos terminadores marcados cada uno con un fluorocromo

diferente, al igual que en el método de Sanger. Luego de un lavado se obtienen las

imágenes y se obtiene la primera base de cada cluster. Luego se elimina el fluorocromo y

se desbloquea el carbono 3, permitiendo que un nuevo nucleótido pueda extender la

cadena de ADN que se está sintetizando. Otra vez los cuatro nucleótidos terminadores

marcados son ofrecidos a los clusters, comenzando un nuevo ciclo.

Existen otros métodos y tecnologías de secuenciación masivas desarrolladas por

diferentes compañías. Algunas de ellas corresponden a la tercera generación de

secuenciadores ya que permiten la secuenciación a partir de una única molécula de ADN

en tiempo real (SMRT y Helicos) y algunas incluso teóricamente no tienen límite en

cuanto al largo de las moléculas secuenciales generadas, pudiendo eventualmente

secuenciar cromosomas enteros (Pacific Biosciences). La tecnología de Ion Torrent se

basa en el registro de los cambios de pH producidos durante la incorporación de bases

durante la síntesis de ADN medidos mediante micropHímetros.

La secuenciación Illumina involucra más de quinientos millones de reacciones de

secuenciación simultáneas en una sola lámina y utilizando un único equipo. Cada

reacción se analiza separadamente y las secuencias generadas a partir de cada una de las quinientas millones de reacciones se almacenan en un programa de bioinformática. Cada

una de las secuenciaciones es una reacción de replicación modificada, incluye

nucleótidos maracods con fluorescencia pero no se requiere de nucleótidos dideoxy

terminales. Esta técnica utiliza una reacción de replicación modificada y utiliza

nucleótidos con etiquetas fluorescentes.

30

PARTE III

III.1 RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En años recientes se han utilizado marcadores genéticos y otras técnicas

moleculares en la evaluación de aspectos genéticos de especies silvestres y domesticadas,

e incluso muestras fósiles de animales y plantas. Estos estudios han permitido, entre

varias cosas, determinar la relación genética entre especies, evaluación de poblaciones en

peligro de extinción, determinación del flujo genético entre poblaciones, evaluación de

estructura genética y definición de unidades genéticas para conservación (Lamprea y

otros, 2004). Estas técnicas aunque muy valiosas, con frecuencia se encuentran con la

limitación de que el análisis de los datos requiere de muestras de varios organismos, con

frecuencia un mínimo de 30, para ser representativas de las poblaciones y para hacer

comparaciones entre grupos.

El presente estudio utilizó marcadores moleculares satelitales para determinar si la

especie de pez localmente conocido como machorra o pejelagarto (Atractosteus tropicus)

es la misma que habita en el Sur de México y si existía flujo genético entre las diferentes

poblaciones silvestres localizadas en la Costa Sur de Guatemala. Los microsatélites son

secuencias de repetición en tándem de 1 a 6 pares de bases y han demostrado ser útiles en

este tipo de estudio debido a su amplia distribución en el genoma de todos los

organismos; además de ser selectivamente neutros y de fácil manejo en el laboratorio

(Lamprea y otros, 2004).

III.1.1 Etapa 1

III.1.1.1 Identificación de zonas de habitación de A. tropicus en la costa del Pacífico

guatemalteco y colecta de material genético

En la primera fase del proyecto, realizada durante el año 2010, se determinó que

la especie todavía se encuentra presente en los principales ríos de la Costa Sur de

Guatemala. Los criterios de selección de las zonas de muestreo fueron: registros

anecdóticos de la presencia de la especie; y zonas inundables de ríos caudalosos. De

acuerdo a estos criterios de definieron las siguientes zonas de muestreo:

a. Costa del Departamento de San Marcos inundada por el Río Naranjo.

b. Costa del Departamento de Retalhuleu, inundada por el sistema de los Ríos

Ocós y Tilapa, que confluyen en el Área de Protección Especial Manchón

Guamuchal.

c. Desembocadura del Río Nahualate, en la zona de El Semillero, Departamento

de Escuintla.

31

d. Canal de Chiquimulilla, en los Departamentos de Escuintla y Santa Rosa.

Todas las zonas donde se reportó la presencia de la especie comparten las

siguientes características: se encuentran dentro de áreas privadas o zonas de protección

donde la pesca está prohibida o restringida; y el acceso es limitado a las zonas inundables

es limitado durante los meses de mayor lluvia, que coinciden con las épocas de

reproducción de la especie.

En el Departamento de San Marcos, pescadores artesanales reportan que las

mayores concentraciones de peces se encuentran en las localidades de La Blanca y Las

Palmas. Ambas localidades tienen sistemas inundables por aguas del Río Naranjo. El

acceso a las zonas de ubicación de los peces es difícil, ya que se encuentran dentro de

fincas de cultivo de caña. La densidad problacional en estas zonas se estima baja y en

disminución, de acuerdo a lo reportado por los pescadores artesanales de la zona. El

consumo de este producto es limitado en la zona y en muchos casos las personas

conservan a los peces como mascotas y para ornato (Fig. No.). De estas localidades

solamente se colectaron 5 muestras de tejido, todas de animales vivos que se conservaban

en tanques o pilas de casas.

Fotografía No. 1. Pila de un hogar de la comunidad La Blanca en el Departamento de San

Marcos, donde se observa que tienen a un Atractosteus tropicus como mascota.

Las poblaciones encontradas en el Departamento de Retalhuleu se concentran en

las comunidades de El Chico y La Barrita, rivereñas a los ríos Ocós y Tilapa, que

desembocan dentro del sistema de la Zona de Protección Especial Manchón Guamuchal.

La Zona de Protección Especial Manchón Guamuchal es la reserva de humedales más

extensa de la Costa Sur de Centroamérica. Esta reserva fue declarada Sitio RAMSAR

por servir de paso y descanso para numerosas especies migratorias, además de su

32

biodiversidad local. En los reportes y estudios de la pesca artesanal de esta zona de

protección especial no se reporta la presencia de A. tropicus, posiblemente debido a que

estos estudios se concentran principalmente en los productos de la pesca dentro de la

zona de estuario y la costa (Sánchez-Castañeda, 2000).

En esta zona la pesca artesanal es la principal actividad económica de las

comunidades. Los productos de la pesca se aprovechan en su totalidad para

comercializarse a través de acopiadores o para consumo directo (Sánchez Castañeda,

200). En el caso de A. tropicus, éste no se extrae dentro del área de la Zona de

Protección Especial, sino de las zonas inundadas de los ríos que desembocan dentro del

humedal. Las machorras que se extraen de esta zona no se comercializan localmente,

sino que se transportan hacia San Marcos, especialmente Ocós, donde se acopian para su

posterior comercialización.

Se muestrearon peces provenientes de zonas inundadas de los ríos Ocós y Tilapa,

las comunidades El Chico y la Barrita, respectivamente. Estas dos poblaciones de A.

tropicus parecen ser de las más grandes del país, especialmente la comunidad de El Chico

de donde se obtuvieron muestras de 40 peces. De la comunidad La Barrita se obtuvieron

10 muestras. Todas estas muestras fueron obtenidas de peces extraídos por pescadores

artesanales y que eran transportadas a San Marcos para ser comercializadas en el

altiplano del país, principalmente en San Juan Ostuncalco, Quetzaltengo donde se utiliza

para preparar tamales de machorra los que se consideran un platillo local muy especial.

Todos los organismos muestreados en estas comunidades se observaron sanos y

bien alimentados, lo que sugiere que estas poblaciones son saludables. También se

observó que todos los organismos que se encontraban disponibles para la venta en ese

momento correspondían a peces adultos, sexualmente maduros.

33

Fotografías 2, 3 y 4. Serie de fotografías de uno de los puestos de comercialización de productos

de la pesca donde se observó la presencia de Atractosteus tropicus adultos, saludables y bien

alimentados.

En la desembocadura del Río Nahualate, en la comunidad de El Semillero,

Departamento de Escuintla se detectó la presencia de otra comunidad aparentemente

pequeña de A. tropicus. Los pescadores artesanales, y pobladores locales indican que

esta especie es muy preciada por lo que la presión de pesca que se ha ejercido es alta y la

población está muy mermada. Es difícil observar organismos adultos, en la mayoría de

los casos se observan peces jóvenes de tallas pequeñas con poco valor comercial, por lo

que cuando son capturados incidentalmente con frecuencia son devueltos al río. Debido a

esta condición no se considera, actualmente, en esta zona un producto comerciable.

En el Canal de Chiquimulilla se encontraron varias poblaciones, o posibles

subpoblaciones de A. tropicus. En el Municipio de Sipacate, Departamento de Escuintla

se encontró un número reducido de organismos que son extraídos por pescadores

artesanales y comunidades locales para autoconsumo. El excedente y durante los meses

de mayor abundancia que coinciden con la mayor precipitación pluvial el excedente se

comercializa en el mercado de Santa Lucía Cotzumalguapa. De esta población no fue

34

posible obtener muestras ya que los tejidos a los que se tuvo acceso se encontraban muy

deteriorados y no se extrajo ADN de los mismos.

En las aldeas de Candelaria y Monterrico del Departamento de Santa Rosa se

encontraron las poblaciones más abundantes de machorra de la Costa Sur de Guatemala.

Sin embargo, no todos los peces se observaban bien alimentados y algunos parecían

ligeramente flacos. La abundancia de organismos en estas zonas coincide con la

inundación de zonas de manglar, en estas épocas de abundancia los pobladores locales la

conservan utilizando la técnica de seco-salado, y la comercializan localmente. De estas

poblaciones se obtuvieron 40 muestras de cada una.

En la siguiente imagen se observa La Laguneta la Palmilla. Esta laguna se

encuentra dentro de una finca privada. Durante los meses de verano, varios de los

canales y quineles se secan, limitando la comunicación entre la laguna y el Canal de

Chiquimulilla. En los meses de lluviosos, estos canales se inundan y la comunicación

entre la laguna y el Canal de Chiquimulilla permanece abierta, permitiendo el

desplazamiento de los animales hacia la zona costera. Este desplazamiento de los

animales coincide con la temporada de reproducción, permitiendo que las larvas y

alevines se desarrollen en la zona del Canal de Chiquimulilla donde hay mayor

disponibilidad de alimento natural. Cuando el nivel del agua empieza a bajar, por

diminución de las lluvias y caudal de los ríos, los peces migran de vuelta a La Laguneta

la Pamilla, la que se convierte en una especie de santuario de protección de la especie en

esta zona.

Todos los organismos muestreados en estas poblaciones se encontraban vivos,

fueron capturados con ayuda de pescadores artesanales locales y se devolvieron al Canal

de Chiquimulilla después de medirlos, y de obtener las muestras de aleta caudal.

35

Figura No. 1. Imagen satelital de Laguneta la Palmilla en el Departamento de Santa Rosa,

Guatemala. Esta laguna constituye una especie de santuario para Atractosteus tropicus, ya que

permite que la especie se refugie durante parte de su ciclo de vida, y al encontrarse dentro de una

propiedad privada, no es explotada por la pesca artesanal.

A pesar de que el Departamento de Jutiapa se encuentra dentro del área de

distribución de la especie, no se encontraron referencias bibliográficas o anecdóticas de

presencia de la especie en este Departamento, por lo que no se muestreó ninguno de los

ríos caudalosos de esta zona.

En total se tomaron 136 muestras de aleta caudal de A. tropicus fijadas en alcohol

metílico 95% grado biología molecular, procedentes de 6 poblaciones diferentes, todas de

la Costa Sur de Guatemala.

36

Fotografía No. 5. Proceso de muestreo de un ejemplar vivo de A. tropicus obtenido del Canal de

Chiquimulilla en la Aldea de Monterrico, Santa Rosa, Guatemala. La muestra consiste en 1 cm2

de tejido de de la aleta caudal fijado en alcohol metílico 95% grado biología molecular.

III.1.1.2 Identificación taxonómica de la especie

La determinación taxonómica de los especímenes utilizados en esta investigación

se basó en los caracteres taxonómicos señalados por Miller y otros (2005), y a las

características de identificación taxonómica recomendadas para Lepisosteidos por Wiley

(En FAO, 2003).

Figura No. 2. Características de identificación taxonómica de Lepisosteidos de la región

centroamericana. Tomado de Wiley (en FAO, 2003).

37

Fotografías 6, 7 y 8. Proceso de identificación de A. tropicus durante los muestreos de campo.

Después de la evaluación de las características de los organismos encontrados, se

determinó que todos los peces evaluados pertenecen a la misma especie, y son

Atractosteus tropicus correspondientes a la siguiente clasificación taxonómica:

Familia: Lepisosteidae

Orden: Lepisosteiformes

Clase: Actinopterygii

Género: Atractosteus

Especie: tropicus

Nombres comunes: machorra, pejelagarto, pez armado, el más común en

Guatemala es machorra.

38

Entre las distintas poblaciones evaluadas se observaron variaciones ligeras de

coloración y en algunos casos la intensidad de las manchas laterales. Sin embargo, no se

observaron características que sugieran que estos cambios en la coloración se deban a

condiciones distintas a la alimentación o condiciones ambientales locales. También es

posible que algunos de los cambios de coloración observados se deban al tiempo de

refrigeración de los organismos. Sin embargo, las observaciones de cambio sugieren que

existen variaciones normales en la genética y adaptaciones a las condiciones locales. Los

peces incluidos en este estudio forman parte de la población geográfica registrada para la

especie que se extiende en la vertiente del Pacífico desde el Sur del Estado de Chiapas,

México hasta el Río Negro en Nicaragua (Miller, 1954; Bussing, 1998).

La presente investigación confirma la hipótesis planteada de que la especie de

Atractosteus tropicus que habita en los diferentes ecosistemas acuáticos de la Costa Sur

de Guatemala evaluados es la misma especie que habita el Sur de México y los demás

países de Centro América. Sin embargo no fue posible establecer la variación genética

entre poblaciones, debido al bajo número de muestras analizado.

III.1.1.3 Desarrollo de marcadores moleculares microsatelitales, secuenciación y

análisis de secuencias

En los peces primitivos, dentro de los cuales se cuenta a la machorra (A. tropicus),

objeto de este estudio, los estudios de genética han sido pocos en comparación con los

realizados en otros grupos taxonómicos como los salmónidos. Los estudios disponibles

indican en general que estos peces comparten características de tipo citogenético como

son presencia de cromosomas birrámeos y microcromosomas, ambos tipos en mayor o

menor abundancia dependiendo de la especie en particular (Arias-Rodríguez, y otros,

2009).

Arias-Rodríguez y otros (2009) describieron el cariotipo de A. tropicus por medio de

tinción de Giemsa de 295 preparaciones cromosómicas en mitosis de larvas y adultos.

Estos autores encontraron el número diploide de cromosomas 2n=56 cromosomas. Ocho

pares de cromosomas metacéntricos, cuatro pares de cromosomas submetacéntricos, ocho

pares teleocéntricos y ocho pares telocéntricos, no encontrando diferencias sexuales,

observando variación en el número de cromosomas desde 46 hasta 64 elementos

cromosómicos en larvas relacionando la variación cromosómica con microcromosomas

móviles.

La metodología de trabajo originalmente planteada para esta investigación proponía

el desarrollo de marcadores moleculares satelitales utilizando la siguiente secuencia de

procesos: extracción de ADN genómico, digestión de ADN, selección de fragmentos y

ligación de adaptadores, creación de una biblioteca de ADN enriquecida, clonación del

39

ADN-PCR enriquecido y secuenciación y análisis de secuencias. Todos estos pasos para

poder diseñar los iniciadores o cebadores.

Sin embargo durante el curso de la investigación se hizo viable, y económicamente

posible la contratación de la secuenciación del ADN genómico de A. tropicus. Como se

indica en la metodología, la secuenciación se hizo con el laboratorio UCLA Genotyping

and Sequencing Core de la Universidad de California en Los Angeles, California, Estados

Unidos de América. La metodología de secuenciación empleada fue pirosecuenciación

de segunda generación por “shotgun sequencing” utilizando un equipo Titanium Shotgun

-050411.

La información de la secuenciación fue subida al servidor del laboratorio UCLA

Genotyping and Sequencing Core data server. Para descargar y analizar la información

se utilizó el programa gratuito Nomachine NX client (de libre acceso, disponible en:

http:www.nomachine.com), y el programa BioEdit V7.0.9 teniendo de esta forma acceso

al servidor del laboratorio. Con ayuda del Dr. Lenin Arias-Rodríguez de la Universidad

de Juárez Autónoma de Tabasco y el apoyo del personal técnico del laboratorio de la

UCLS se identificaron las secuencias microsatelitales.

El tamaño del genoma de A. tropicus se estimó en 2C=2.780.02±0.02 (pg). Se

identificaron cuatros sets de microsatélites, agrupados de la siguiente forma:

a) AAAT, AACT, AAGT, CAT, AGAT;

b) AAT, ACT, ATC, AAC, AAG, TG, AG;

c) AAAC, AAAG, AATC; y

d) AATG, ACAG, ACCT, ACTC, ACTG.

Estas secuencias fueron comparadas con 81 secuencias registradas actualmente en el

GenBank® (NCBI) para especies cercanas. De estas 81 secuencias, 30 están registradas

para A. spatula, la especie genéticamente más cercana registrada en esta base de datos.

De los cuatro sets de microsatélites se determinó que diez secuencias microsatelitales son

similares a las encontradas en A. spatula, de acuerdo a los registros de la colección

principal CoreNucleotide. Este análisis se hizo con ayuda de las herramientas

disponibles en GenBank® (NCBI) parte de International Nucleotide Sequence Database,

Collaboration, específicamente la herramienta BLAST (Basic Local Alignment Search

Tool).

Al comparar los sets de microsatélites identificados se determinó que eran

prácticamente idénticos a los reportados para A. spatula por Moyer, Sloss, Kreiser, y

Feldheims (2009), por lo que se procedió a utilizar los primers (iniciadores) de estos

autores en las pruebas de variabilidad genética. Nueve de los iniciadores de estos autores

son polimórficos en Lepisosteus oculatus y L. osseus.

40

III.1.2 Etapa 2

Para poder realizar el análisis de diversidad genética entre poblaciones se requería

de un mínimo de 40 muestras de ADN genómico, en buenas condiciones, de cada una de

las poblaciones. Debido al bajo número de muestras colectadas de cada una de las

poblaciones no fue posible establecer la frecuencia alélica y número de alelos por área de

colecta en cada marcador microsatelital o locus analizado. Por lo cual no fue posible

establecer la variación genética en cada población. Se determinó únicamente la presencia

o no de cada uno de los microsatélites en cada una de las muestra, mediante la separación

de bandas en geles de electroforesis.

Este análisis determinó que todos los microsatélites se encontraban presentes en

todas las poblaciones evaluadas. Las secuencias de nucleótidos generadas fueron

alineadas, sin embargo solamente se analizó heterocigosidad observada y esperada (Ho y

He, respectivamente) entre las poblaciones de Monterrico, Candelaria y El Chico, donde

se contaba con 40 muestras distintas. Este análisis se hizo con el programa GENEPOP

(P>0.005) determinándose que no existe diferencia significativa en la frecuencia de

microsatélites entre las poblaciones evaluadas, por lo que no pueden considerarse

unidades genéticas separadas (Lamprea y otros, 2004).

Fotografía No. 9. Trabajo en el laboratorio durante la fase de extracción de ADN genómico de

las muestras colectadas.

Al plantearse originalmente esta investigación también se esperaba poder comparar las

secuencias genéticas identificadas con secuencias genéticas de la especie identificadas por

colegas de la Universidad de Juárez Autónoma de México. Sin embargo, el proyecto de

41

investigación que iba a generar tales secuencias no fue financiado, por lo que esta parte del

trabajo no pudo completarse.

III.2 OTRAS ACTIVIDADES REALIZADAS DURANTE EL DESARROLLO DEL

PROYECTO

Dentro de los objetivos de este proyecto se buscaba implementar la técnica de desarrollo

de marcadores moleculares microsatelitales en el Laboratorio de Sanidad Acuícola de CEMA y la

formación de recurso humano en el uso y aplicación de técnicas de biología molecular en estudios

genéticos de organismos acuáticos. Resultado de este trabajo se capacitó a cuatro personas y se

generaron los Procedimientos Operativos Estandarizados (POEs) para las técnicas de: preparación

de kits de colecta; colecta de material genético para desarrollo de microsatélites; extracción de

ADN genómico; amplificación e identificación de material genético utilizando las técnicas de

PCR y electroforesis horizontal. Estos POEs, los procedimientos resumidos de trabajo y los

registros de verificación de trabajo quedaron disponibles en las instalaciones del Laboratorio de

Sanidad Acuícola.

Durante el desarrollo del trabajo también fue posible gestionar la donación de un equipo

de electroforesis horizontal al CEMA.

Fotografías 10 y 11. Imágenes del trabajo de laboratorio desarrollado durante el proyecto de

investigación.

42

PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES

Utilizando técnicas de identificación convencionales y la técnica molecular de

microsatélites polimórficos del genoma de Atractosteus tropicus, se determinó

científicamente que los peces de agua dulce identificados comúnmente como

Machorras o Pejes Lagarto que habitan en los sistemas acuáticos de la Costa del

Pacífico de Guatemala son miembros de la especie Atractosteus tropicus. La

evaluación del genoma de esta especie permitió determinar que los grupos que

habitan en la costa del Pacífico de Guatemala no pueden considerarse, desde el punto

de vista genético, como poblaciones diferentes.

Se desarrolló una técnica molecular de análisis del genoma de Atractosteus tropicus

utilizando marcadores microsatelitales que puede ser utilizada en programas de

conservación, repoblamiento y manejo de la especie.

Aunque no fue posible determinar el grado de polimorfismo de los microsatélites

identificados en el genoma de Atroctosteus tropicus, se determinó que las secuencias

microsatelitales identificadas se encuentran también presentes en el genoma de

Atractosteus spatula, registradas en el banco de genes. No fue posible hacer

comparaciones con otros microsatélites registrados del genoma de A. tropicus, ya que

no se encontraron registros de marcadores moleculares genómicos de la especie en los

bancos de genes disponibles.

De acuerdo a las características fenotípicas dominantes en los organismos extraídos

de diferentes áreas de la costa del Pacífico de Guatemala, se identificaron tres grupos

de A. tropicus, delimitados por las características geográficas de los lugares que

habitan. Aunque estos grupos de peces presentan características fenotípicas

ligeramente distintas, se asume que éstas se deben a condiciones ambientales propias

del lugar que habitan, ya que no se encontró diferencia significativa en la frecuencia

alélica de los marcadores moleculares de los grupos evaluados. Los grupo de peces

identificados se encuentran presentes en: Laguna Las Palmas y La Blanca, San

Marcos; estuarios El Chico y La Barrita en Retalhuleu; el Semillero y Sipacate,

Escuintla; Canal de Chiquimulilla, concentrándose en las aldeas de Candelaria y

Monterrico, en Santa Rosa.

43

Utilizando técnicas convencionales de clasificación taxonómica de peces, basadas en

características morfométricas y merísticas, se determinó que la especie de peces

identificados como A. tropicus que habita en la costa del Pacífico de Guatemala es la

misma que se reporta para los demás países del área centroamericana y el sur de

México.

En el Laboratorio de Sanidad Acuícola del Centro de Estudios del Mar y Acuicultura

de la Universidad de San Carlos de Guatemala, se implementó la técnica de

evaluación de poblaciones de peces utilizando marcadores moleculares

microsatelitales. El laboratorio cuenta con el equipo, la capacidad analítica y los

procedimientos establecidos para implementar la técnica en otras especies de peces.

44

IV.2 RECOMENDACIONES

A los investigadores y entidades relacionadas con los recursos naturales,

especialmente los recursos acuáticos de Guatemala donde se encuentra presente

Atractosteus tropicus, utilizar la técnica de análisis del genoma desarrollada en la

presente investigación.

A los investigadores y entidades relacionados con el manejo de los ecosistemas y

zonas donde habita Atractosteus tropicus implementar programas regionales de

manejo con las autoridades y entidades de los países que forman parte de la

distribución de la especie, ya que se determinó que en todos estos países habita la

misma especie.

A los investigadores y comunidad del Laboratorio de Sanidad Acuícola del Centro de

Estudios del Mar y Acuicultura de la Universidad de San Carlos de Guatemala,

implementar mecanismos de colecta de información sobre poblaciones y distribución

de especies acuáticas a partir de la pesca y venta de productos acuáticos en los

mercados. En esta investigación se evidenció que estas fuentes de información son

importantes en la orientación de las áreas y temporadas de muestreo.

Continuar con los esfuerzos e investigación para el manejo de Atractosteus tropicus

en Guatemala, ya que las poblaciones rurales de la costa del país reconocen y valoran

la especie debido a la larga historia de consumo que existe en algunas de las

comunidades costeras y en otras comunidades que utilizan este pescado dentro de su

gastronomía.

No descartar el valor de las técnicas de clasificación taxonómica y sistemática clásica

de especies, ya que los investigadores creemos que éstas deben ser el primer paso en

la identificación y estudio de peces, aún cuando se utilicen técnicas moleculares para

la identificación y estudios poblacionales.

45

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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49

IV.4 ANEXO

Anexo 1. Debido a que el Laboratorio de Sanidad Acuícola no cuenta con una estufa de

hibridación de adaptó un vortex (agitador), con una bandeja para tubos de reacción dentro

de una incubadora ajustada a 37°C o a temperatura ambiente, según el procedimiento

establecido para cada reacción.

PROTOCOLO DE

TRABAJO

No.

TITULO:

COLECTA DE MATERIAL GENÉTICO PARA

DESARROLLO DE MICROSATÉLITES

Protocolo Resumindo para Trabajo

PROYECTO

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REDACCIÓN REVISIÓN APROBACIÓN

TA. Mario Hernández Lic. Carolina Marroquín M.Sc. Leonel Carrillo Ovalle

Marzo de 2010 Abril de 2010 Abril de 2010

1. Materiales Pinzas pequeñas, de acero inoxidable. De punta fina, preferentemente con dientes de ratón Tijeras de disección pequeñas, de acero inoxidable Tubos de reacción de 1.5 o 2.0 mL de volumen Marcador permanente de punta fina de color oscuro (negro o azul) Bolsa de cierre hermético Algodón Pizeta o botella plástica con boca delgada para dispensar líquidos con facilidad Etiquetas para rotular o en su defecto masking tape grueso Guantes para la persona que colecta Recipiente de transporte (caja plástica o de cartón grueso)

En los casos en que sea necesario extraer a los animales del agua y el sitio de colecta no cuente con sus propios materiales.

Atarraya pequeña Quecha (chachanga) Cubeta plástica de por lo menos 20 litros de volumen

Reactivos y soluciones

Alcohol metílico 95% (solución que se compra) Alcohol etílico 70% Anestésico adecuado para la especie

Equipos Cámara fotográfica para documentar el procedimiento GPS si se requiere geoposicionar el sitio de colecta de la muestra

En los casos en que se requiera de información morfométrica de los animales:

Ictiómetro o cinta métrica Balanza con baterías cargadas, capacidad mayor a 200 g

2. Procedimiento Previo a la visita de colecta

a. Asegúrese de que tiene un compañero para que lo acompañe en el trabajo b. Llene suficientes tubos de reacción con 1.0 mL de alcohol metílico 95% c. Prepare una pizeta con metanol 95% para poder agregar más fijador en los casos que sea necesario d. Prepare lotes de 40 tubos en bolsas de cierre hermético individuales e. Empaque por lo menos 30 tubos adicionales sin alcohol f. Revise que tiene todos los materiales necesarios para la colecta, incluyendo registros y equipo de

documentación

PROTOCOLO DE

TRABAJO

No.

TITULO:

COLECTA DE MATERIAL GENÉTICO PARA

DESARROLLO DE MICROSATÉLITES

Protocolo Resumindo para Trabajo

PROYECTO

FODECYT 02-2009

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TA. Mario Hernández Lic. Carolina Marroquín M.Sc. Leonel Carrillo Ovalle

Marzo de 2010 Abril de 2010 Abril de 2010

Preparación del área de trabajo a. Asegúrese de que cuenta con un área de trabajo apropiada para colocar todos los materiales y manipular a

los organismos sin causarles daño. Verifique que la ventilación sea adecuada para no inhalar los vapores del alcohol

b. Verificar que cuenta con todos los insumos necesarios para trabajar y que tiene a mano el número adecuado de tubos para la colecta

Colecta de información general

a. En el cuaderno de campo y en el registro de colecta proceda a iniciar el registro de la colecta que está realizando

b. Asigne un código a las muestras por colectar c. Colecta la información morfométrica que requiera de los animales, preferentemente antes de la colecta de

tejido o inmediatamente después de la misma, para no interferir con el proceso de colecta de muestra de material genético

Colecta de organismos

a. Colectar a los animales de acuerdo al método más apropiado para el sitio de colecta b. Anestesiar a los animales que no estén en condiciones de manipulación sin anestésico, o c. Sacrificar a los animales que no serán regresados al medio natural usando una sobre-dosis de anestésico d. En el caso de las muestras que se colecten de pescadores asegúrese de que los animales están todavía en

buen estado y que no existe descomposición de la carne Colecta de muestra de tejido

a. Con la tijera limpia proceda a cortar una sección no menor a 1 cm² de tejido de la aleta caudal. Asegúrese de que tiene suficiente tejido blando en la muestra

b. Sumerja la muestra de tejido en un tubo de reacción c. Identifique el tubo de acuerdo al código asignado para la muestra d. Agregue más alcohol si lo considera necesario y si tiene suficiente espacio en el tubo e. Limpie la tijera con un algodón humedecido con alcohol etílico 70%, asegúrese de repetir este procedimiento

después de cada muestra Identificación y transporte de muestras

a. Una vez concluido el proceso de colecta de tejido, asegúrese que todas las muestras están debidamente identificadas, verifique la legibilidad de los números que pudieron ser borrados o no estar claros

b. Introduzca las muestras, de acuerdo al lote que correspondan en bolsas de cierre hermético individuales por lote de muestras

c. Identifique la bolsa de acuerdo al lote de muestras que contiene d. Prepare una etiqueta de papel o masking tape con la identificación de la muestra y adhiérala al exterior de la

bolsa con los tubos de reacción e. Introduzca esta bolsa identificada dentro de una bolsa de cierre hermético de mayor tamaño e identifíquela

con la misma información de la bolsa interior f. Coloque sus muestras en un recipiente de transporte adecuado. No es necesario transportarlas en frío

PROTOCOLO DE

TRABAJO

No.

TITULO:

COLECTA DE MATERIAL GENÉTICO PARA

DESARROLLO DE MICROSATÉLITES

Protocolo Resumindo para Trabajo

PROYECTO

FODECYT 02-2009

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REDACCIÓN REVISIÓN APROBACIÓN

TA. Mario Hernández Lic. Carolina Marroquín M.Sc. Leonel Carrillo Ovalle

Marzo de 2010 Abril de 2010 Abril de 2010

Posterior a la colecta, en el laboratorio a. Verifique la identificación de los diferentes lotes de muestras colectados b. Proceda a cambiar las bolsas de transporte y las etiquetas si la calidad de las mismas ya no es adecuada c. Revise cada muestra individual y verifique que el volumen de alcohol es el adecuado y que el mismo no se

encuentre turbio d. En caso de que el alcohol esté turbio, cambie el alcohol por alcohol nuevo e. Conserve las muestras, preferentemente en refrigeración (4°C) hasta su utilización

a. Tamaño de muestras

Muestra de tejido: no menor a 1 cm², sin incluir, preferentemente tejidos óseos o cartilaginosos. Para estudios genéticos se prefiere que estas muestras sean colectadas de la aleta caudal Muestra poblacional: consistente de 40 muestras de tejido individuales 3. Diagrama de flujo el proceso

ACTIVIDAD RESPONSABLE OBSERVACIONES Persona que colecta conocer área, # de muestras Investigador principal Trabajo de Gabinete Persona que colecta in situ Persona que asiste Persona que asiste verificar que se tiene toda la Información según boleta de campo Persona que colecta Esta es la etapa más crítica Persona que asiste Persona que colecta Trabajo en el laboratorio Investigador a cargo del Trabajo en el laboratorio

Preparación previa

de materiales

Preparación de área

de trabajo

Colecta de información

general y de animales

Colecta de tejido

Identificación de

muestras

Identificación de

muestras

PROTOCOLO DE

TRABAJO

No.

TITULO:

IDENTIFICACIÓN DE MATERIALES DEL

PROYECTO

PROYECTO

FODECYT 02-2009

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REDACCIÓN REVISIÓN APROBACIÓN

Lic. Carolina Marroquín M.Sc. Leonel Carrillo M.Sc. Leonel Carrillo

Noviembre de 2010 Noviembre de 2010 Noviembre de 2010

1. OBJETIVO Llevar un buen control de los insumos de trabajo que se adquieren con los fondos del proyecto FODECYT 02-2009. Cumplir con las recomendaciones del Asesor Técnico de SENACYT. 2. ALCANCE Todos los insumos (equipo, materiales fungibles, reactivos, cristalería, Etc.), así como muestras, procedimientos, documentos y resultados que se compren, generen u obtengan como parte del trabajo del proyecto FODECYT 02-2009, titulado: “Evaluación de la diversidad genética de las poblaciones de Atractosteus tropicus presentes en la costa del Pacífico de Guatemala”. 3. RESPONSABLES Investigador principal: M.Sc. Leonel Carrillo Ovalle Investigador asociado: M.Sc. Dora Carolina Marroquín Mora 4. DEFINICIONES Insumos: reactivos, materiales fungibles, papelería Reactivos: materiales químicos Cristalería: instrumentos de medición, empaque, transporte o almacenaje de reactivos y/o insumos Muestras: material genético y/o biológico Procedimientos: documentos que describen actividades del proyecto Documentos: documentos físicos y/o electrónicos que contengan información referencial, documental o que de alguna forma tenga relación con el proyecto Resultados: información generada como resultado directo o indirecto del proyecto 5. PROCEDIMIENTO - Identifique todos los materiales sujetos a este procedimiento que pertenezcan al proyecto - Identifique en forma clara y visible todos estos materiales. Asegúrese de utilizar etiquetas o marcador

indeleble - Almacene los materiales de forma adecuada y separada a los demás materiales del laboratorio 6. FORMULARIOS Y REGISTROS Listados de materiales del laboratorio y del proyecto. Listado de muestras. Cuaderno de campo.

Nombre del Proyecto:

No. del Proyecto:

SUB DESCRIPCION MONTO MONTO DE MONTO

GRUPO GRUPO RENGLON SENACYT CONTRAPARTIDA TOTAL

1 SERVICIOS PERSONALES

181 Estudios, investigacioones y proyectos de factibilidad 101.295,68 101.295,68

SOLICITADO Este rubro incluye una hora de trabajo del investigador principal, una hora del investigador asociado y la contratación de cuatro horas para un laboratorista.

CONTRAPARTIDA El investigador principal y el investigador asociado también laboran para la Universidad de San Carlos de Guatemala con lo que se completan las horas de trabajo en el proyecto.

1 PUBLICIDAD, IMPRESIÓN Y ENCUADERNACION 0,00

122 Impresión, encuadernación y reproducción 2.000,00 2.000,00

CONTRAPARTIDA la totalidad de los gastos de este rubro fueron cubiertos por el Centro de Estudios del Mar y Acuicultura de la Unviersidad de San Carlos de Guatemala

13 VIATICOS Y GASTOS CONEXOS 0,00

133 Viáticos en el interior 6.250,00 6.250,00

CONTRAPARTIDA la totalidad de los gastos de este rubro fueron cubiertos por el Centro de Estudios del Mar y Acuicultura de la Unviersidad de San Carlos de Guatemala

18 SERVICIOS TECNICOS Y PROFESIONALES 0,00

189 Otros estudios y/o servicios 0,00

SOLICITADO En este rubro se cancelaron los servicios de secuenciación del laboratorio de la UCLA

24 PRODUCTOS DE PAPEL, CARTON E IMPRESOS 0,00

241 Papel de escritorio 485,55 200,00 685,55

26 PRODUCTOS QUIMICOS Y CONEXOS 0,00

261 Elementos y compuestos químicos 50.952,51 12.000,00 62.952,51

262 Combustibles y lubricantes 5.000,00 5.000,00

266 Productos medicinales y farmaceuticos 3.650,00 3.650,00

268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc 13.000,00 13.000,00

269 Otros productos químicos y conexos 27.000,00 27.000,00

29 OTROS MATERIALES Y SUMINISTROS 0,00

291 Útiles de oficina 1.000,00 1.000,00

292 Útiles de limpieza y productos sanitarios 446,00 446,00

295 Útiles menores médico-quirúrgicos y de laboratorio 3.560,08 3.560,08

SOLICITADO el monto solicitado servirá para la compra de un juego de micropipetas (hasta 1, 5, 20, 200 y 1000 µl), dos tijeras de disección y dos espátulas de laboratorio

CONTRAPARTIDA el Centro de Estudios del Mar y Acuicultura de la Universidad de San Carlos de Guatemala aportará los útiles menores de oficina necesarios para este proyecto

32 MAQUINARIA Y EQUIPO 0,00

323 Equipo médico-sanitario y de laboratorio 3.000,00 3.000,00

Gastos de Administración 10% 27.279,60 27.279,60

SOLICITADO Este monto servirá para la compra de un termociclador punto final y dos cámaras electroforéticas una horizontal y una vertical

CONTRAPARTIDA El Centro de Estudios del Mar y Acuicultura aportará todos los equipos necesarios para la preparación, extracción y almacenamiento de las muestras, tejidos y material genético

TOTAL 184.019,42 73.100,00

El aporte total recibido de CONCYT asciende a Q.184,019.42. El aporte total de la contraparte asciende a Q.73,100.00. El costo total del proyecto es de Q.257,119.42.

El aporte de CONCYT corresponde al 71.57% del costo total del proyecto, y el aporte de CEMA-USAC al 28.43% restante.

Evaluación de la diversidad genética de las poblaciones de Atractosteus tropicus presentes en la Costa del Pacífico de

02 -- 2009

Nombre del Investigador Principal: M.Sc. Héctor Leonel Carrillo Ovalle

Nombre de la Unidad Ejecutora: Centro de Estudios del Mar y Acuicultura, Universidad de San Carlos de Guatemala