Curso: Biología Celular y Molecular

Oscar Nolasco Cárdenas MSc.oscarnol@hotmail.com

Noviembre 2012

ARN -historia• 1954 Severo Ochoa

descubrió la polinucleótido fosforilasa, capaz de sintetizar in vitro RNA a partir de ribonucleotidotrifosfatos: RNA polimerasa.

Ese mismo año George Gamow funda el “RNA tie club”Se reunían 2 veces al año para discutir sobre la estructura del RNA y como esta contribuye a la formación de proteínas1955 F Crick propuso su "Adapter Hypothesis“ referida a la falta de una molécula que porte el aminoácido

Reunión del “RNA tie club”, Cambridge, Inglaterra. Francis Crick (fondo, izquierda), Leslie Orgel (fondo, derecha), Alexander Rich (frente,

izquierda), y James Watson (frente, derecha).1955

ARN -historia• 1961 Marshall Nirenberg inicia sus

trabajos para descifrar el código genetico (1961-1962 The coding race: entre el laboratorio de Ochoa y Nirenberg, el primero desistió al ver que tan avanzado estaban los trabajos de Nirenberg)

• 1965 Robert Holley descubre el ARNt la molécula faltante de Crick

• 1968 Francis Crick y Leslie Orgel propusieron al ARN como la primera molécula informativa

• 1986 Thomas Cech y Sidney Altman descubrieron el ARN catalitico (self-splicing) primera evidencia sólida de primera molécula informativa

• 1993 el laboratorio de Harry Noller evidencio la participación del ARNr en la síntesis de proteínas

Marshall Nirenberg y Heinrich Matthaei. Severo Ochoa

A Esquema de la estructura cristalográfica de una ribozima “martillo”B Modelo en cinta de ribozima “martillo”

ARN es un polimero de ribonucleotidos

Azucar ribosa Enlace fosfodiester Cadenas Direccionales (5’ to 3’) 4 Bases

purines: adenina & guanina

pirimidines: citosina & uracilo

pGCUAC

G

U

A

5’ end

3’ end

1’

2’3’

4’

5’

3’

OH

-O - P –O CH2

O

H2N-C

C

C

HN

N

N

CH

C

O

N

O

O

O P O CH2

O

O

C

N

N

CHC

CH

NH2

OH

O

O

O P O CH2

O

N

CHC

O

HN

CHCO

OH

NH2

C

CN

N

N

CH

C

NHC

O

O

O P O CH2

O

OH OH

O-

o

ARN estructura

ARN tipos:Principales ARN involucrados en los procesos de transcripción y traducción:

-ARNm-ARNt-ARNr-Otros ARN en eucariotes ARNsn (ARN pequeño nuclear, ARN de edición), ARNsc (ARN pequeño citoplasmatico, micro ARN)

ARNs en E. coli

Tipo Sed. Coef. Mol. Wt. Residuos % del total ARN

mRNA 6 - 25 25,000 - 1,000,000 75 -3000 ~2

tRNA ~4 23,000 - 30,000 73 - 94 16

rRNA 5 35,000 120

16 550,000 1,542 82

23 1,100,000 2,904

rRNA es el principal componente de los

ribosomas

mRNA eucariote

mRNA procariote

tRNA tRNA estructura primaria

Secuencia lineal de 60 a 95 nucleótidos de longitud ( Comúnmente 76).

tRNA estructura secundaria La estructura de hoja de

trébol muestra los brazos y los bucles o loops.

tRNA estructura terciaria Nueve enlaces de hidrogeno

entre las bases en los bucles de simple cadena y el plegamiento de la estructura secundaria en una estructura en forma de L con el anticodon y el brazo aceptor del aminoácido en los extremos opuestos de la molécula.

Caracteristicas del tRNA1. Brazo o tallo aceptor 7-bp apareadas del 5'-terminal con 3'-terminal. Puede contener apareamientos no tipo Watson-Crick. 2. CCA cola Secuencia 3' terminal. En procariotes el CCA es transcrita, y en eucariotes CCA es adicionada post transcripcional. 3. El brazo D tallo de 4 bp que termina en un bucle o loop que contiene dihidrouridina. 4. El Brazo del anticodon tallo de 5 bp apareadas y contiene el loop del anticodon. 5. El Brazo TΨC tallo de 5 bp apareadas que contiene la secuencia TΨC donde Ψ es una pseudouridina. 6. Un brazo variable, tRNAs de clase 1 contiene 3 a 5 bases y tRNA de clase 2 contiene 13 a 21 bases formando un tallo de 5 bases apareadas 7. Las bases que han sido modificadas por metilación se encuentran fuera del anticodon. La primera base del anticodon algunas veces es modificada a Inosina (derivado de adenina) o pseudouridina (derivado de uracilo)

• Nomenclatura de tRNA-sintetasas and charged tRNAs

Catalizan la unión aminoácido - tRNA.

Aminoacido: serinetRNA : tRNAser

aminoacyl-tRNA sintetasa: seryl-tRNA sintetasaAminoacyl-tRNA: seryl-tRNAser

Aminoacil-tRNA sintetasas

Existen dos tipos de Aminoacil tRNA sintetasas clasificadas en la forma inicial de la unión del aminoacido a la adenina del CCA terminal del tRNA:

CLASE I. Aminoacila inicialmente el 2 OH de la adenina, luego por una transesterificacion esta unión se traslada al 3 OH. Comprende las sintetasas para los tRNA de los aminoacidos: Leu,Ile,Val,Cys,Met,Glu,Gln,Arg,Tyr,Trp.

CLASE II. Aminoacila el 3 OH de la adenina. Comprende las sintetasas para los tRNA de los aminoacidos: His,Pro,Ser,Thr,Asp,Asn,Lys,Gly,Ala,Phe

• Tipos de tRNA-sintetasas

La aminoacil tRNA sintetasa une una adenosina monofosfato AMP, al grupo –COOH para crear un aminoacil adenilato intermediario.

Luego el apropiado tRNA desplaza el AMP.

La aminoacil tRNA sintetasa puede realizar el proceso de relectura o proofreading valiendose de los determinantes de identidad del tRNA

Etapa de activación

Etapa de transferencia

TranscripciónLa información genética almacenada en el DNA es transcrita a una copia de RNA complementario a una de las hebras del DNA.

La hebra de ADN que ha servido como molde se denomina hebra antisentido y la otra hebra de ADN es denominada hebra codante o con sentido y la secuencia es identica a la del RNA sintetizado ( Excepto en las posicion de T que son cambiadas por U)

(5')ATGCGCTATAGCTGTTT(3')(5')ATGCGCTATAGCTGTTT(3')

(3')TACGCGATATCGACAAA(5')(3')TACGCGATATCGACAAA(5')

(5')AUGCGCUAUAGCUGUUU(3')(5')AUGCGCUAUAGCUGUUU(3')

Hebra de DNA no molde (+)codanteHebra de DNA no molde (+)codante

Hebra de DNA molde (-)antisentidoHebra de DNA molde (-)antisentido

Transcrito de RNATranscrito de RNA

Doble hebra de

DNA

Localización de transcritos

• Genoma de adenovirus, ambas hebras contienen codificación de proteínas. Muchos de los mensajeros se sintetizan inicialmente en forma de un transcrito largo que proviene de dos tercios de la

longitud del DNA. Este transcrito es modificado posteriormente.

Transcripción

• El transcripto puede ser :– RNA mensajero o mRNA; – RNA ribosomal o rRNA;– RNA de transferencia o tRNA; o – Otros RNA como ribozimas (act. Enzimatica),RNA de interferencia o

iRNA (actividades de regulación de la expresión genética), o participar en actividades postranscripcionales de edición de mRNA (gRNA).

Inicio de la transcripción• Los factores de transcripción se unen al promotor

Ka (M-1) Cualquier región DNA Promotor DNA

(no especifico) (especifico)

Core 2 X 1011

Holo 1 X 107 1013 to 1015

• La subunidad sigma de la RNA polimerasa es un Factor de iniciación que es especifico para la transcripcion de diferentes grupos de genes en E. coli

• Factor sigma mantiene estable la unión de la RNA polimerasa al promotor en el DNA

Inicio de la transcripción

La RNA polimerasa de E. coli es una proteína con múltiple subunidades:Subunidad Cantidad Rol α 2 desconocido β 1 forma el enlace fosfodiester β´ 1 se une al DNA molde σ 1 reconoce al promotor y

factores de iniciación

Sintesis de RNA: Elongación de la cadena

• La sintesis de RNA generalmente se inicia en una purina ATP or GTP (el primer nucleotido)• La cadena es sintetizada en dirección 5’ a 3’

A = T

U = A

A = T

U = A

RNA RNA

Terminación de la transcripción• Una vez que el proceso de transcripción ha comenzado

la burbuja de transcripción avanza a medida que el RNA es transcrito y se continúa hasta que la polimerasa encuentra una secuencia que induce la disociación del complejo DNA-RNA y la separación de la enzima.

• En eucariotes esta secuencia no ha sido bien estudiada, mientras que para los procariotes como E. coli se han reconocido dos tipos de señales de terminación que se diferencian por la ausencia o presencia de un factor proteico que parece reconocer dicha señal.

Terminación de la transcripción Rho independiente

• La primera de ellas, conocida como terminación independiente de rho (r), contiene una secuencia que induce a la formación de una horquilla en el transcrito de RNA de 10 a 15 nucleótidos antes del final, seguida por un tramo de poliA en la cadena molde que facilita la disociación de los elementos de la transcripción.

• En la terminación dependiente de r no se presenta el tramo de poliA, aunque sí se forma una horquilla en la que la RNA polimerasa hace una pausa y si se encuentra la proteína r presente se detiene la transcripción.

• No se conoce a detalle el mecanismo de disociación, pero en este se produce la hidrólisis de ATP por efecto de r.

Terminación Rho dependiente

• Transcripción en eucariotes

3 RNA Polimerasas en Eucariotes

RNA polimerasa I transcribe la mayoria de los genes de rRNA

RNA polimerasa II transcribe todos los genes que codifican proteinas y algunos RNA pequeños nucleares

RNA polimerasa III transcribe los genes de tRNA y genes de 5S rRNA y RNA pequeños nucleares

Reconocimiento del promotor

Varias secuencias regulatorias

Enhancer

Formación del complejo de iniciación

La fosforilación de la polimerasa II inicia y promueve la síntesis del RNA

Compuestos que inhiben el proceso de transcripción

Se une al surco menor del DNA

Se intercala entre G y C

EL TRANSCRIPTO DE mRNA EN EUCARIOTE SUFRE DIVERSOS PROCESOS POSTRANSCRIPCIONALES

Splicing Mecanismo de splicing mediado por el

splicesoma

Mecanismo

5 Capping

Proceso de

Poliadenilación

Regulación de la expresión por splicing alternativo según el tejido

Componentes requeridos para las 5 etapas principales de la síntesis de proteínas en E. coli

Fase Componente esencialActivación de aminoácidos 20 aa

20 aa-tRNA sintetasa20 o mas tRNAATPMg++

Iniciación mRNAN-formilmetionina-tRNACodon de inicio AUG30S y 50S subunidad ribosomalFactores de iniciación IF1,IF2, IF3GTPMg++

Elongación Funcional 70S ribosoma aa-tRNAs especificos por codonesFactores de elongacion EF-Tu, EF-Ts, EF-GGTPMg++

Terminación y liberación Codon de terminacion en mRNAFactores de liberacion polipeptidica RF1,RF2,RF3ATP

Plegamiento de proteína y Enzimas especificas, cofactores y otros componentes procesos postraduccionales para la remosion de residuos de iniciacion, secuencias señal

procesaciento proteolitico, modificacion de residuos terminal, unión de fosfatos,metilos, carbonilos, carbohidratos, o grupos prosteticos

El inicio de la traduccion involucra el apareamiento del mRNA y el rRNA

Shine-Delgarno (SD) es una secuencia que se presenta en muchos transcriptos

de procariotes que consta de 3-9 bases del mRNA los que se complementan con el

3’terminal del 16S rRNA

En transcriptos mRNA de eucariotes la secuencia que facilita la union inicial del

mRNA a la subunidad pequeña ribosomal es la secuencia Kozak ACCATGG o

(GCC)RCCATGG

La subunidad menor inicia la busqueda del sitio de iniciacion:

En ProcariotesIF1 previene el enlace prematuro del

aatRNA al sitio AIF2 facilita la unión del formilmetionina a la

posición P de la subunidad menor ribosomal

IF3 previene el enlace prematuro de la subunidad mayor

Eucariotes usan un complejo de multiples factores de iniciacion

eIF1 1 Reconocimiento de codon AUG codon, destabiliza complejos aberrantes

eIF1A 1 Promueve union del Met-tRNA al40S;

eIF2 3 GTPasa,

eIF2B 5 guanine nucleotide exchange factor for eIF2

eIF3 11 estabiliza la union 40S y Met-tRNA y previene

la asociación con 60S

eIF4A 1 RNA dependiente de ATPasa; esencial para

enlazar los ribosomas al mRNA

eIF4B 1 proteína de enlace al RNA; promueve la

actividad eIF4A

eIF4E 1 Se enlaza al m7G cap

eIF4F 3 cap complejo de enlace eIFs 4A, 4E, and 4G

eIF4G 1 enlaza mRNA, PABP, eIF4E, eIF4A, and eIF3

eIF4H 1 similar a eIF4B

eIF5 1 AUG reconoce y promueve actividad de

eIF2 GTPasa

eIF5B 1 GTPasa, ensambla el ribosoma

subunidades funcion

Activación del aminoacil-tRNA

Elongación

Elongación

Terminación

3’

5’

5’

3’

Transcripción y traducción ocurren simultaneamente en procariotes

Ribosome

Ribosome5’

mRNA

RNAPol.

DNA

Citoplasma

Nucleo

En Eucariotes los procesos de transcripcion y traducción ocurren en diversos compartimientos

ExportaciónG AAAAAA

RNA

Transcripción

Poros del Nucleo

G AAAAAA

Procesamiento de RNA

mRNA

Un gen de eucariote

Secuencia Terminador

Promotor/Región de Control

Sitio de iniciode transcripción

RNA Transcripto

5’ UTR Región no traducida

3’ UTRRegión no traducida

Exones

Intrones

3’5’ Exon 2 Exon 3Int. 2Exon 1 Int. 1

3’5’ Exon 2 Exon 3Exon 1 Int. 2Int. 1

3’5’ Exon 2 Exon 3Exon 1

Procesamiento del mRNA

Código genético.

El Codigo es un triplete. Un codon son 3 nucleotidos consecutivos de mRNA especifico

para 1 aminoacido.

Presenta un codon de inicio y otro de

termino. ATG para Met como codon de inicio. TAA, TAG, y TGA como codones

stop de la traduccion del

polipeptido.

El código es universal. En la evolución el código genético parece haberse congelado. La mayoría de codones tiene el mismo significado en distintos organismos. (Diferencia del

código de mitocondria en animales)

Variación de codones en mitocondriaCodonesAGA

UGA AUA AGG CUN CGGNORMAL Stop Ile Arg Leu ArgAnimales

Vertebrados Trp Met Stop + +Drosofila Trp Met Ser + +

Levaduras Saccharomyces cerevisiae Trp Met + Thr + Torulopsis glabrata Trp Met + Thr ? Schizosaccharomyces pombe Trp + + + +Hongos filamentosos Trp + + + +Tripanosomas Trp + + + +Plantas superiores + + + + TrpChlamydomonas reinhardtii ? + + + ?

? No ha sido observadoN es cualquier nucleotido+ mantiene el mismo significado

Numero de codones por aminoácido

El código es degenerado. Muchos aminoácidos tiene mas

de un codon a excepción de Met y Trp.

Codon-anticodon interacciones Degeneracion de la tercera base

Y la hipotesis del bamboleo• El apareamiento codon-anticodon es crucial en la lectura

del codigo genetico el apareamiento de bases es antiparalelo

• La hipotesis de Crick esta referida a la tercera posicion del codon, o primera posicion del anticodon (posicion de bamboleo)

• En la tercera posicion del codon pueden ocurrir apareamientos no canonicos, ocurre el bamboleo o alternacion del nucleotido sin alterar la secuencia del polipeptido

• Ventaja del bamboleo: disociación del tRNA del mRNA mas rapida

Regla del bamboleo:

1 Reconocimiento de un codon

Anticodon

Codon

2 Reconocimiento de 2 codones

Anticodon

Codon

3 Reconocimiento de 3 codones

Anticodon

Codon

Inosina = Citidina

Inosina = Uridina

Guanosina = Uridina

Inosina = Adenosina

5’ 3’

A U C

mRNA

5’ 3’

C U A G

G A U

3’ 5’ tRNAleu

mRNA

Base del bamboleo

• Un tRNAleu puede leer dos de Los codones de leucina

El codigo esta escrito en el

sentido 5’ a 3’ del mRNA

El codigo no se sobrelapa cada

nucleotido es leido una sola vez, de manera continua

en un MARCO DE LECTURA (ORF)

Marco de lectura ORF• Esta determinado por el codon de inicio AUG

• siempre el triplete siguiente es leído como un codon hasta el stop

...AGAGCGGA.AUG.GCA.GAG.UGG.CUA.AGC.AUG.UCG.UGA.UCGAAUAAA... MET.ALA.GLU.TRP.LEU.SER.MET.SER

INICIO FIN………………………………..

Inicio de un marco de lectura in procariotes and eucariotes• Puede ocurrir en codones internos AUG en mRNA procariote• En eucariotes solo puede ocurrir en el primer codon AUG

• El operon lac en E. coli se transcribe como un mRNA policistronico con multiple codones AUG

Codon de inicio antecedido del sitio Shine-Dalgarno

Codon de inicio antecedido del sitio Shine-Dalgarno

Codon interno de Met sin sitio

Shine-Dalgarno

5’ cap AUG

El codon de inicio AUG es unico posterior al 5’ cap

AUG

lac I P O lac Z lac Y lac A

AUG AUG AUGAUG

mRNA de eucariote

AUGSD AUGSDAUG5’

• TIPOS DE MUTACIONES GÉNICAS

• En el ADNSustitucion de bases

Transiciones Pu→Pu o Pi→PiTransversiones Pu→Pi o Pi→Pu

Inserciones DelecionesDuplicaciones, Inversiones, Transposiciones

• TIPOS DE MUTACIONES GÉNICASEn la proteínaMutaciones conservativas• Mutación silenciosa:Tripletes que codifican para el mismo aminoácido:

AAG(arg)→CGG(arg)• Mutación con sentido o neutra:Tripletes que codifican para aminoácidos

equivalentes distintos. AAA(lys)→AGA(arg). Ambos son aminoácidos básicosMutaciones no conservativas• Mutación cambio de sentido: aparece un nuevo triplete que codifica para un

aminoácido de distinto tipo. La proteína pierde su función si afecta su sitio catalitico• Mutación sin sentido: Aparece un triplete de terminación o stop:

CAG(gln)→UAG(stop)• Mutación con cambio de marco de lectura inserciones y deleciones cambian el

marco de lectura y la posición del codon stop)

Silenciosa Con Sentido Sin Sentido Readthrough