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Fundamento de Anlisis de alimentos Protenas

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Alberto Luis Huaman Huaman 65

CAPITULO V

DETERMINACION DE

PROTEINA EN ALIMENTOS

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Objetivos: Conocer el fundamento de las tcnicas de determinacin de protena

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5.1 PROTEINA

Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en las clulas, ms del 50%

del peso seco de la clula son protenas. Estn constituidas, fundamentalmente, por C,

H, O y N y casi todas tienen tambin azufre. Algunas tienen, adems, otros elementos

qumicos y en particular: P, Fe, Zn o Cu. El elemento ms caracterstico de las protenas

es el nitrgeno. Son los compuestos nitrogenados por excelencia de los seres vivos. De

todos los compuestos nitrogenados en los alimentos, la parte ms importante desde el

punto de vista nutricional son las protenas. El trmino prtidos incluye: Protenas,

Pptidos, Aminocidos.

La importancia radica en conocer con fines nutricionales (aminocidos esenciales) y

propiedades organolpticas y de textura en productos agroalimentarios de origen animal

en el control de calidad: alergas a ciertas protenas (gluten).

La mayor parte de los procedimientos de determinacin de protena total se basan en la

determinacin del nitrgeno + procedimentos de clculo empricos aproximados.

Las protenas son heteropolimeros formados por unidades menores llamados

aminocidos. Los aminocidos (aa) estn ligados en secuencia formando una cadena

polipeptdica, esta cadena es la base de la protena y es llamada de estructura primaria.

Las protenas son extremadamente importantes en la nutricin por que suministran

aminocidos esenciales al organismo. Los aminocidos son llamados esenciales, pues el

organismo no es capaz de sintetizarlos, en la digestin ya la rompe la cadena de

protenas y los aminocidos libres son absorbidos y usados en la sntesis de nuevas

protenas. Son aminocidos esenciales: valina, leucina, isoleucina, metionina,

fenilalanina, triptfano, treonina, lisina, arginina, histidina. En el procesamiento de

alimentos las protenas tambin presentan propiedades importantes como la capacidad

de gelificacin (gelatina), capacidad de emulsificacin (protena de clara de huevo),


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capacidad de retencin de agua (protena de soya). Los pptidos, oligopeptidos y

polipeptidos son como siguen:

Pptido: hasta 50 aminocidos. Oligopptido: pptido pequeo. Polipptido: pptido grande. Protenas oligomricas: formadas por sub unidades idnticas llamadas

protmeros.

Protenas sencillas y conjugadas (grupo prosttico)

Figura 5.1: Estructura de una protena

El nitrgeno es el elemento qumico que permite diferenciar las protenas de otros

compuestos, particularmente de grasas y carbohidratos.

Sin embargo, la fraccin de protena del sistema biolgico no es la nica fuente de

nitrgeno ya que puede derivarse tambin de ppticos, aminocidos libres y compuestos

nitrogenados de naturaleza no proteica (generalmente presentes en menor proporcin).

Por ello al determinar el contenido de nitrgeno en un sistema biolgico se califica de

nitrgeno total y al utilizar este dato para calcular el porcentaje de protena del sistema

se califica de cruda.

La determinacin del nitrgeno sigue siendo el mtodo analtico ms til para

cuantificar la fraccin de protenas sin interferencias de carbohidratos y lpidos. Si el

objetivo es conocer el porcentaje de protena, se determina el contenido de nitrgeno

total en la muestra a objeto del estudio, luego se precipita la fraccin de protenas y se

cuantifica el nitrgeno no proteico del sobrenadante.


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Nitrgeno proteico: La diferencia con el contenido de nitrgeno total permite

establecer el contenido de nitrgeno proteico.

Para calcular el contenido de protena cruda en funcin al contenido de nitrgeno

total, se recurre al factor de conversin, definido en funcin del tipo de alimento. El

factor representa el contenido de nitrgeno por 100 g de protenas en ese sistema. El

factor 6,25 es el ms comnmente usado.

La protena cruda es una de las determinaciones que integra la Composicin proximal o Anlisis prximo de los alimentos. La fraccin de protena cruda de los sistemas alimenticios, es importante desde el punto de vista nutricional, de las propiedades

organolpticas de los alimentos.

5.2 PROTEINA EN PRODUCTOS LACTEOS

La maduracin es la etapa del proceso de elaboracin del queso durante la cual la

cuajada fresca se transforma en una masa homognea y se desarrollan las caractersticas

organolpticas tpicas del queso: aspecto, textura, sabores, aroma. Esto se debe a una

serie de cambios bioqumicos, de reacciones glicolticas, lipolticas y proteolticas, estas

ltimas como las principales causantes de los cambios de textura durante la maduracin

del queso (Fox, 1999).

La protelisis en el queso se produce por la accin de las enzimas presentes: las

proteinasas de la leche, las enzimas coagulantes, los cultivos iniciadores y otros

microorganismos que se desarrollan en el queso (Snchez-Ponte, 2003). Dentro de la

protelisis se distinguen la protelisis primaria, que es la responsable de la textura

blanda caracterstica al principio de la obtencin de la cuajada, y la protelisis

secundaria, en la que se generan pptidos de pequeo tamao y alta hidrofobicidad que

detectados por los receptores del sabor producen la sensacin de amargor. Estos

pptidos sirven como substratos precursores para las proteinasas y peptidasas

bacterianas que los transforman en pptidos ms pequeos y aminocidos libres

(Ferrandini Banchero, 2006) como se mencion anteriormente.

Los aminocidos, provenientes de la degradacin de las protenas durante la maduracin

del queso, pueden variar en cantidad e incluso en los tipos de aminocido debido al

catabolismo de aminocidos. Por estas transformaciones pueden encontrarse

aminocidos ausentes en las protenas de la leche, como es el caso de la ornitina por

degradacin del cido glutmico. En el esquema general del catabolismo microbiano de

los aminocidos en la maduracin de los quesos propuesto por Hemme et al. (1982) se

encuentra que en una primera etapa los aminocidos podran ser degradados por cuatro

grupos de enzimas: descarboxilasas, transaminasas, desaminasas y liasas. Estos

productos podran continuar degradndose hasta la formacin de compuestos voltiles

tales como el amoniaco, cetonas, aldehdos, cidos, o compuestos azufrados que forman

parte del aroma de la mayora de los quesos (Curtin y McSweeney, 2004).

Para el estudio qumico de la maduracin de quesos son utilizados como ndices de

maduracin la determinacin de fracciones de nitrgeno soluble (NNC: Nitrgeno no

casenico, Nitrgeno No Proteico: NTCA y Nitrgeno soluble en cido fosfotngstico:

NPTA), que proporcionan informacin de la extensin global de la protelisis.


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El NNC corresponde a los compuestos de nitrgeno solubles a pH 4,6; y se define como

nitrgeno no casenico, ya que las casenas son insolubles a ese pH, stos son

producidos fundamentalmente por el cuajo y aumentan durante la maduracin. Dentro

de los NNC tambin entran las protenas del suero y las peptonas proteosas, solubles a

pH 4,6; aunque su contribucin es relativamente menor. Por otro lado, las -casenas son insolubles a pH 4,6. El cido tricloroactico (TCA) es un precipitante de protenas

que ha sido ampliamente utilizado como ndice de maduracin en quesos. Yvon et al.

(1989) hallaron que todos los pptidos con menos de siete residuos de aminocidos eran

solubles en TCA al 12 %. La renina es responsable de la produccin de parte del

nitrgeno soluble en TCA 12 %, pero las proteinasas y peptidasas del cultivo iniciador

tambin contribuyen considerablemente a la formacin del nitrgeno soluble en TCA

12%. El cido fosfotngstico (PTA) es un precipitante de protenas muy selectivo. El

nitrgeno soluble en PTA (1,0; 2,5; 5,0; 6,0 y 6,5 %) ha sido ampliamente utilizado

como ndice de aminocidos libres en queso, slo aminocidos libres y pptidos

menores son solubles en PTA 5 % (Snchez-Ponte, 2003).

Para evaluar la protelisis de los quesos durante el perodo de maduracin, se utilizan

como ndices:

- El Nitrgeno soluble a pH 4,4 4,6: tambin llamado Nitrgeno No Casenico (NNC).

- El Nitrgeno soluble en cido tricloroactico al 12 %, tambin llamado Nitrgeno No Proteico (NTCA).

- El Nitrgeno soluble en cido fosfotngstico 5 % (NPTA).

Los mtodos utilizados para el fraccionamiento y la determinacin de las fracciones

nitrogenadas fueron descriptos por Ard y Polychroniadou (1999) y Btikofer, Regg y

Ard (1993). La determinacin de Nitrgeno tanto en las muestras de queso como en las

distintas fracciones nitrogenadas se realiza por el mtodo de Kjeldahl. Los resultados se

expresan como % del Nitrgeno total.

5.2.1 Nitrgeno soluble en agua

La fraccin de nitrgeno soluble en agua (NS), est formada por aquellos pptidos y

aminocidos originados al hidrolizarse las protenas (casenas).

El procedimiento de anlisis est basado en el mtodo de Kuchroo y Fox (1982): se

homogenizan 10 g de muestra con 50 mL de agua destilada mediante un Ultraturax. A

continuacin la muestra se mantienen en un bao mara de agua a 40C/30 minutos,

centrifugndose a 3000 xg/30 minutos a 20C. Se enfra con hielo durante media hora y

se filtra a travs de filtro Whatman N40. Una alcuota de 2 mL es utilizada para la

determinacin de nitrgeno, segn la tcnica de Kjeldahl

5.2.2 Nitrgeno soluble en cido fosfotungstico

Esta fraccin est formada por pptidos de peso molecular menor de 600 daltons. El

mtodo seguido para su obtencin ha sidopropuesto por Butikofer y col. (1993).

A una alcuota de 10 mL del filtrado del nitrgeno soluble en agua, se aaden 10 mL de

una mezcla de partes iguales de cido fosfotungstico al 10% y cido sulfrico al 25%,


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preparada inmediatamente antes de ser utilizada. Se deja reposar durante 24 horas hasta

que se produzca la precipitacin. Despus de filtra a travs de papel Whatman N 42,

realizando el Kjeldahl en 5 mL de filtrado.

5.3 DETERMINACIN DE PROTENA POR MTODOS NO EXTRACTIVOS

Mtodo Kjeldahl

Mtodo Nessler

Mtodo Dumas

5.3.1 Determinacin cuantitativa de nitrgeno total (Mtodo Kjeldahl)

La determinacin de la protena en una muestra es basada en la determinacin de

nitrgeno. Generalmente es realizada por el proceso de digestin Kjeldahl (autor del

mtodo: Johan Kjeldahl). Este mtodo determina el contenido de nitrgeno orgnico, o

sea, el nitrgeno proveniente de otras fuentes adems de la protena, tales como:

nucleicos, alcaloides, lpidos y carbohidratos nitrogenados. Como estos otros

componentes generalmente estn presentes en cantidades menores, el mtodo Kjeldahl

es un mtodo qumico til en la determinacin de protena.

En un anlisis elemental de un alimento, lo ms frecuente y menos complejo es

investigar la protena bruta de los diferentes aminocidos o protenas especficas. No

obstante, los procedimientos ms utilizados no determinan directamente esta protena,

sino el contenido en nitrgeno, que se expresa como nitrgeno total y que se obtiene

mediante una combustin lquida en la que, en un primer paso, el nitrgeno de la

muestra se convierte en sulfato amnico, el cual luego se transforma en amoniaco. Este

amoniaco se destila y se valora en una solucin cido normalizado.

Esta tcnica desarrollada por Kjeldahl, se ha convertido en mtodo de referencia con

mltiples modificaciones. Determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto al

nitrgeno proteico como al no proteico. La determinacin de protenas por anlisis

elemental de nitrgeno comprende lo siguiente:

Mineralizacin (mtodo Kjeldahl). Determinacin de nitrgeno en forma de NH4+ o

NH3 (Mtodo Nessler; Electrodos selectivos sensibles a NH; Mtodo Dumas). Otro

mtodo (neutrnico y protnico). Los mtodos se basan en medidas de la cantidad de

nitrgeno liberado por las protenas.

Fundamento

Se caracteriza por el uso de ebullicin, cido sulfrico concentrado que efecta la

destruccin oxidativa de la materia orgnica de la muestra y la reduccin del nitrgeno

orgnico a amonaco el amonio es retenido como bisulfato de amonio y puede ser

determinado in situ o por destilacin alcalina y titulacin.

El fundamento de la etapa de mineralizacin es la conversin de la materia orgnica

proteica en in amonio. Este mtodo se basa en la combustin en hmedo de la muestra

por ebullicin con cido sulfrico concentrado y en presencia de catalizadores


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metlicos, la materia orgnica se oxida a CO2 y H2O, mientras que la parte de cido se

reduce a SO2.

Ventajas del mtodo de Kjeldhal

Apropiada para varios tipos de productos. Alta fiabilidad. Usado como mtodo de referencia.

Desventajas del mtodo de Kjeldhal

Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.

Uso de catalizadores txicos o caros.

Eleccin del factor de conversin.

Dificultades qumicas y prcticas

Digestin prolongada.

Conversin cuantitativa de nitrgeno a amonaco.

Espumosidad excesiva.

Accin corrosiva de cido sulfrico sobre el sistema de extraccin de humos.

Consideraciones ambientales respecto a descarga de humos y contaminacin de aguas con catalizadores metlicos.

Soluciones

Aumentar relacin sulfato de potasio/cido sulfrico (1 g.l ml) T 370-410C.

Uso de catalizadores metlicos.

Uso de H2O2.

Catalizadores metlicos utilizados

a) Oxido de mercurio

Ventaja

Oprima recuperacin de nitrgeno Desventajas

Txico. Alto costo.

Contaminacin de aguas.

Formacin de compuesto estable con amonaco el que debe ser descompuesto con adicin de tiosulfato de sodio.

b) Selenio o mezcla de sulfato de cobre y selenio

Desventaja

El selenio puede producir prdida de nitrgeno.


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c) Mezcla de sulfato de cobre y dixido de titanio

Ventajas

til en anlisis de cereales. Uso a gran escala como rutina. Desventaja

Menos efectiva en recuperar nitrgeno.

Determinacin de amonio

El amonio en el digestor puede ser determinado por diversos mtodos:

a) Adicin de exceso de lcali al digestor, destilacin del amonio y titulacin. b) Mezcla alcalina de fenol con hipoclorito de sodio que da una coloracin azul con

amonio.

c) Mezcla alcalina de salicilato de sodio, nitroprusiato de sodio e hipoclorito de sodio que da una coloracin verde esmeralda brillante con amonio.

d) Determinacin electromtrica usando un electrodo de ion especfico y una solucin de hidrxido de sodio al 1 %.

Factor f

Las protenas contienen una cantidad de nitrgeno que se puede relacionar con la

cantidad de protena por unos factores de conversin emprico de correccin f se multiplica este factor por el valor total de N obtenido en la determinacin analtica. La

Tabla 1 presenta algunos ejemplos del factor f

Por lo tanto, en las protenas, por trmino medio, debe haber un 16% de nitrgeno

(100/16 = 6,25). La AOAC recomienda el uso del factor 6,25 para todas las muestras

excepto harina y derivados.

Tabla 5.1. Factores de conversin de nitrgeno a protena para algunos alimentos.

Alimento % N en protena Factor

Huevo o carne 16.0 6.25

Leche 15.7 6.38

Trigo 18.76 5.33

Maz 17.70 5.65

Avena 18.66 5.36

Soya 18.12 5.52

Arroz 19.34 5.17

Productos lcteos 15.7 6.38

(Nielsen, 1998)


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La protena bruta se halla multiplicando el nitrgeno total (N) por un factor, que se ha

calculado considerando los componentes bsicos de un gran nmero de muestras del

mismo alimento, y expresando el resultado como protena. Alguno de estos factores,

universalmente aceptados, son los siguientes.

Si el resultado fuera expresado en % de protena el factor usado debe ser indicado.

El contenido de nitrgeno se determina despus de mineralizacin o pirlisis de la muestra.

El mtodo de mineralizacin fue introducido por Kjeldahl (1883) y es el ms generalizado y utilizado en mtodos de referencia y oficiales.

Problema: presencia en las muestras de nitrgeno no proteico.

Normalmente, se convierte el amonio formado en amonaco a pH bsico, y se destila recogindolo sobre un exceso medido de HCl.

Para convertir el nitrgeno a protena se emplea el factor de 6,25 el cual proviene de la

consideracin de que la mayora de las protenas tienen una cantidad aproximada de

16% de nitrgeno.

25,6Nitrogeno de 16

Pr100

g

oteinagFactor (6.1)

En el trabajo de rutina se determina mucho ms frecuentemente la protena total que las

protenas o aminocidos individuales. En general, el procedimiento de referencia

Kjeldahl determina la materia nitrogenada total, que incluye tanto las no protenas como

las protenas verdaderas (Aurand et al., 1987).

El mtodo se basa en la determinacin de la cantidad de Nitrgeno orgnico contenido

en productos alimentarios, compromete dos pasos consecutivos:

a) La descomposicin de la materia orgnica bajo calentamiento en presencia de cido sulfrico concentrado.

b) El registro de la cantidad de amoniaco obtenida de la muestra

Durante el proceso de descomposicin ocurre la deshidratacin y carbonizacin de la

materia orgnica combinada con la oxidacin de carbono a dixido de carbono. El

nitrgeno orgnico es transformado a amoniaco que se retiene en la disolucin como

sulfato de amonio. La recuperacin del nitrgeno y velocidad del proceso pueden ser

incrementados adicionando sales que abaten la temperatura de descomposicin (sulfato

de potasio) o por la adicin de oxidantes (perxido de hidrgeno, tetracloruro,

persulfatos o cido crmico) y por la adicin de un catalizador (Nollet, 1996).

En la mezcla de digestin se incluye sulfato sdico para aumentar el punto de ebullicin

y un catalizador para acelerar la reaccin, tal como sulfato de cobre. El amoniaco en el

destilado se retiene o bien por un cido normalizado y se valora por retroceso, o


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en cido brico y valora directamente. El mtodo Kjeldahl no determina, sin

embargo, todas las formas de nitrgeno a menos que se modifiquen adecuadamente;

esto incluye nitratos y nitritos (Pearson, 1993).

a) Procedimiento de determinacin de Protena cruda. Mtodo de Kjeldahl (AOAC Official Method 2001.11)

Digestin:

322242 2alimento elen del Pr NHOHSOCOSOHoteinaRCATALIZADO

El nitrgeno transformado en NH3 se combina con la parte restante del cido sulfrico

para formar el sulfato de amonio.

244423 )(NHSOSOHNH

Finalmente queda:

2424242 )(NH CO H roteina SOSOSOP

De acuerdo al contenido de nitrgeno, se pesa una porcin de la muestra preparada que

contenga 0,2 - 0,3 g de muestra, luego agregar 1 g del catalizador de oxidacin (mezcla

de sulfato de potasio: 1g y sulfato de cobre: 0,25g) para acelerar la reaccin agregar 2,5

a 3,0 mL de cido sulfrico concentrado.

Colocar el baln de digestin en la cocina y calentar en forma suave el matraz en

posicin inclinada hasta que deje de hacer espuma. Despus se mantiene una ebullicin

enrgica durante dos horas. Se deja enfriar (nota 3). La digestin termina cuando el

contenido del baln est completamente cristalino (si es necesario aadir gotas de

perxido) es cuando la digestin es muy lenta y difcil.

Destilacin

El nitrgeno que est en forma de sulfato de amonio, se ataca con un lcali fuerte que es

la soda castica (NaOH) para liberar el amoniaco y despus de la condensacin lograda

con la parte del refrigerante, el hidrato de amonio se recibe en un vaso precipitado.

En el destilador ocurre:

OH NH Na 2)(NH 2342424 SONaOHSO

El vaso de precipitado contiene: cido brico, con los siguientes indicadores (Tashiro)

de pH rojo de metilo y verde de bromocresol, formndose borato de amonio en el vaso.

En el condensador ocurre:

324333 NH BOH NH BOH


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1. Enfriar al aire, agregar 5 mL de agua destilada.

2. Pasar el contenido del baln digestor al destilador y haciendo un lavado al baln con 5 a 10 mL de agua y luego agregar 5 mL de la solucin de NaOH al 80%

con sumo cuidado y cerrar la vlvula (en copa debe quedar una pequea

cantidad de NaOH).

3. Conectar el refrigerante y recibir el destilado en un erlemeyer de 125 mL conteniendo 5 mL de la mezcla de cido brico ms indicador de pH. La

destilacin termina cuando ya no pasa ms amoniaco y luego de 7 min titular

con cido clorhdrico valorado (aprox 0.05N) y anotar el gasto.

NOTA: En destilacin tomar tiempo cuando empieza a virar de rojo a verde 7

minutos y termina la destilacin.

Titulacin

Se hace con cido sulfrico clorhdrico de normalidad conocida, el cido clorhdrico

reacciona con el borato de amonio. En el punto final ya no hay borato de amonio y un

pequeo exceso de cido clorhdrico provocar un cambio de pH y por consiguiente el

viraje de la mezcla (verde a rosado).

Es necesario adicionar un catalizador y realizar el ataque a temperatura alta (hasta 370-

410C segn autores). Catalizadores estudiados: Ms conocidos: Hg, Cu, Fe, Se, Ti o

mezclas. Otros aditivos: K2SO4 o Na2SO4 sustancias para aumentar la temperatura de

ebullicin de la mezcla de reaccin. Tiempo total necesario para la mineralizacin

(hasta 3 horas para unos pocos gramos de muestra).

Recibiendo en HCl OH NaCl lNH NH 244 CNaOHHClCl

Recibiendo en H3BO3 ClNH OH NH 433324 BHClBOH

La muestra recibida en el vaso con la solucin de cido brico valorar con cido

clorhdrico 0.05N y tomar nota del gasto de HCl obtenido.

Clculos

%N2 = mL de HCl x Normalidad x meq.del N2 x100 / g (muestra)

1) %N2 = mL de HCl x 0,05 x 0,014 x100 / g (muestra)

2) % Protena = %N2 x Factor

b) Determinacin de nitrgeno no proteico

Pesar con exactitud 0,5-1 gr de muestra y dispersarla en 10 mL de agua destilada.

Agregar 10 mL de cido tricloroactico 24%, homogeneizar y centrifugar. Tomar una

alcuota de sobrenadante lmpido y determinar N por el mtodo de Kjeldahl.


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c) Determinacin de nitrgeno bsico voltil (ndice de putrefaccin de crnicos)

Fundamento: El pH de msculo de pescado fresco est entre 6,6 y 6,8 (lo conserva en

el momento de la muerte). Despus de muerto se acumula cido lctico, provocando

cada de pH, pero como en el msculo hay compuestos con carcter buffer, no permiten

que se vea ese descenso. Por descomposicin del msculo se acumulan amonaco,

dimetilamina y trimetilamina. Si en ese momento se produce contaminacin bacteriana,

entonces comenzar a subir el pH (primero lentamente y rpido al final), en condiciones

extremas de deterioro puede llegar a 7,5 - 8,0. Ocurre un proceso de autolisis que lleva

al aminocido:

R-CH-NH2-COOH CO2 + R-CH2-CH2-NH2

Decarboxilasas

Aminooxidasas

NH3 +R-CH2-OOH

(Algunos son voltiles y

arrastrables por agua)

Hay accin sobre el xido de trimetilamina que existe en algunos peces de agua salada.

El lctico en el msculo es reductor y acta sobre el O=N(CH3)3 (precursor).

CH3 CH3

I Enzimas I

H-C-OH + 2 O=N(CH3)3 2 N(CH3)3 + COOH + CO2 + H2O

I microbianas bsico voltil

COOH voltil

Ac. Lctico xido trimetilamina.

Se sabe que se produce la HN(CH3)2 pero no se conoce el precursor.

d) Determinacin de Nitrgeno lcali lbil: Mtodo de Kofranyi (1950. Milchwissenschafts, 51-54 Vol. 2). Determinacin de protenas en leche por

destilacin directa.

Fundamento: Es un mtodo rpido basado en la liberacin de amonaco cuando la

leche es calentada a ebullicin en solucin alcalina. La mayor parte del amonaco

liberado proviene de la rpida hidrlisis de glutamina y asparagina.

Determinacin: colocar en un baln Kjeldahl 10 mL de leche, 20 mL de BaCl2 10 %

(usar propipeta) y 70 mL de NaOH 32%. Destilar durante 6 min (exactamente medidos

a partir del inicio de la ebullicin), recogiendo sobre 100 mL de BO3H3 2 %. Titular el

destilado con SO4H2 0.1N, usando como indicador 6 a 8 gotas de una solucin 0.016 %

de rojo de metilo y 0.083 % de verde de bromocresol en alcohol. Calcular el porcentaje

de protena (p/p) utilizando una curva de calibracin que relaciona el % protenas con

los mL de H2SO4 0.1N gastados.


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Curva de calibracin: se obtiene siguiendo el procedimiento anterior pero con

muestras de leche con contenidos de protena conocidos. Para obtener las distintas

muestras de leche se parte de una leche entera a la que se le midi el % de protenas por

el mtodo de Kjeldhal; con esta leche se hacen diluciones o se agrega casena para

obtener las concentraciones proteicas deseadas. El contenido de protenas que cubra el

rango de la curva de calibracin, debe ser de 1 a 4 % (p/v).

NOTA: Actualmente los anlisis en leche se realizan siguiendo la metodologa

especificada en las normas IDF, de la Federacin Internacional de Lechera (FIL). Para

la determinacin del contenido de protenas se utiliza el mtodo de Kjeldhal, utilizando

cido brico para recoger el destilado.

5.3.2 Mtodo Nessler: Determinacin del N2 en forma de NH4+ o NH3

El mtodo presenta las siguientes caractersticas:

Basado en medidas colorimtricas sobre la propia muestra mineralizada.

Genera en presencia de NH4+ (NH3 en medio bsico) un complejo de color entre amarillo y rojo:

OHKIHgOINHKOHHgIKNH 22423 27232

Se puede mejorar la sensibilidad por destilacin previa del amonaco pero se alarga el tiempo del proceso global

Si se realiza la reaccin sobre el mineralizado directamente se debe aadir un agente enmascarante de los metales interferentes (habitualmente CN- que

compleja a los metales inhibidores de la reaccin)

Electrodos selectivos sensibles a NH+

Un electrodo que contiene NH4+ y una membrana permeable a NH3, que la atraviesa y

desplaza el equilibrio:

OHNHOHNH 424

Cuando se alcanza el equilibrio dentro del electrodo, el potencial de ste es proporcional

a la concentracin de amonaco en la disolucin de muestra

5.3.3 Mtodo de dumas

En este mtodo se hace una combustin de la muestra (entre 700 y 800C) y el

nitrgeno procedente de esta combustin se separa y cuantifica mediante cromatografa

de gases con detector de conductividad trmica. De este modo, podemos estimar la

cantidad de nitrgeno en la muestra, hallar su porcentaje multiplicando por n factor,

calcular el nmero de protenas.


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El mtodo presenta las siguientes caractersticas:

Se basa en la calcinacin de la muestra en presencia de oxido de cobre, se eliminan posteriormente todos los gases (CO2 y H2O) excepto el nitrgeno (N2)

que se mide de forma volumtrica.

Aplicaciones como mtodo micro con sistemas que permiten analizar hasta muestras de 1g en tiempos de anlisis cortos (unos 5 minutos por muestra).

Tiempo de anlisis de unos 4 minutos/muestra.

En este mtodo, al igual que en el anterior, se determina todo tipo de nitrgeno en la

muestra, por lo que en ocasiones, el porcentaje de protena se estima por encima del

valor real. Adems, en este caso, el aparato es caro. Como ventaja tiene que es un

mtodo rpido.

Fundamento

Se caracteriza por pirlisis completa de la muestra y medicin del contenido de

nitrgeno de los gases de combustin.

El nitrgeno puede ser medido con manmetro despus de absorber el dixido de

carbono en una solucin alcalina o por conductividad trmica en mtodos

automatizados.

Ventaja

Muestra equivalencias satisfactorias al compararlo con el mtodo de Kjeldahl en

anlisis de forrajes y alimentos infantiles, aunque con valores levemente mayores.

Desventajas

Incluye nitrgeno inorgnico. Requiere pequeas cantidades de muestra 5-50 mg,

finamente dividida y homognea para minimizar el error de muestreo.

Este mtodo no puede aplicarse a material hmedo por lo que debe efectuarse un secado

previo.

5.4 DETERMINACIN DE PROTENA POR MTODOS EXTRACTIVOS COLORIMTRICOS (ESPECTROFOTOMETRA)

En general, no hay un mtodo completamente satisfactorio para medir la concentracin

de protenas en una muestra. La eleccin del mtodo depende de la naturaleza de la

protena, de los otros componentes de la muestra problema, de la rapidez y sensibilidad

deseada. En este trabajo prctico se vern dos de los mtodos que se usan

corrientemente para medir concentraciones de protenas, Biuret y Lowry.

La mayora de las protenas muestran una absorcin a 280 nm., la cual se atribuye al

grupo fenlico de la tirosina y al grupo indlico del triptofano. La cuantificacin de

protenas basada en la absorcin en la regin de UV, tiene la ventaja de que no es

necesario utilizar reactivos y la muestra no se daa o destruye durante la determinacin.


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Se toma en cuenta la absorcin del disolvente, ya que este puede absorber en la misma

regin. Este mtodo sufre interferencias de compuestos que contengan anillos de purina

y pirimida. Se realiza una comparacin con una protena estndar, de la que se debe

conocer su composicin (Nollet, 1996)

Figura 5.2: Estructura qumica de los aminocidos aromticos

5.4.1 Mtodo de Biuret

Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los

enlaces peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de

coloracin es directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos)

y la reaccin es bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La

sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de

protenas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).

La producen los pptidos y las protenas, pero no los aminocidos, ya que se debe a la

presencia del enlace peptdico (-CO- NH -) que se destruye al liberarse los aminocidos.

Cuando una protena se pone en contacto con un lcali concentrado, se forma una

sustancia compleja denominada Biuret. Debido a dicha reaccin fue que observamos

que al agregar el reactivo de sulfato de cobre mas solucin de protena, precipito una

coloracin violeta. Quedando en el fondo del tubo una tonalidad azul cielo reaccin

positiva. Precipitando a una coloracin amarilla la reaccin nos torna negativa al no

haber presencia de protenas.

El mtodo comprende un ensayo colorimtrico de un paso donde se cuantifica la

formacin de un complejo estable entre protenas y cobre (II). El complejo presenta un

color violeta caracterstico, que se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da

por la coordinacin de un tomo de cobre con cuatro tomos de nitrgeno. El complejo

se basa en la desprotonacin de los grupos amida para formar el enlace con el cobre (II)

o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de electrones

libres de los tomos de oxgeno y de nitrgeno del pptido (Figura 5.3).

Las protenas y pptidos reaccionan con iones de cobre en solucin alcalina, formando

un quelato color violeta de configuracin desconocida. La intensidad de color es


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directamente proporcional a la concentracin de protenas presente en la muestra (rango

de 1000g-10000g).

Despus de la adicin del reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una

coloracin de Biuret estable; es necesario considerar la posible influencia de

aminocidos libres que forman buffer en configuracin tris y amoniaco (Nollet, 1996)

Protena cobre complejo Cu-protena

Color violeta

Figura 5.3: Estructura del complejo entre el cobre y los enlaces peptdicos

En solucin alcalina el Cu+2 reacciona con el enlace peptdico de las protenas dando un

color purpreo que se cuantifica espectrofotomtricamente (540nm). Como estndar se

utiliza una solucin de albmina.

Procedimiento: Rpido Simple Econmico Especfico de protenas: la reaccin la dan los enlaces

peptdicos.

No es un procedimiento absoluto: es necesario hacer una calibracin para cuantificar:

Con patrones (normalmente BSA, Bovine Serum Albumine) Por comparacin con procedimientos de referencia, Kjeldhal.

Longitud de onda de medida: entre 540 y 650 nm, segn las protenas presentes (habitualmente a 550 nm).


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Reactivos de Biuret: Mucha variedad disponible. Disoluciones de Cu (II) en medio alcalino con adicin de un complejante como tartrato para evitar la

precipitacin.

Poco cuestionado, dentro de los mtodos qumicos, ya que no hay prcticamente ningn constituyente de los alimentos que pueda dar interferencia importante, al

ser la reaccin especfica del enlace peptdico. Quizs, su baja sensibilidad (en

otros campos).

Tambin se puede aplicar el procedimiento por adicin directa de los reactivos en medio KOH sobre la muestra finamente dividida: extraccin y reaccin de

determinacin al mismo tiempo.

Como llevar a cabo la evaluacin: Prepare una solucin o suspensin de la muestra de aproximadamente de ~ 0.2 g en 10 mL de agua. Colocar unas gotas

de 1.5 M NaOH (una solucin coloreada baja) y 2 gotas de 0.1 M CuSO4 (una

solucin coloreada azul). Una evaluacin positiva es indicado por: un intenso

color azul/purpura es debido al ion cobre complejo reaccionado con el grupo

amino de la protena.

Reactivos

A. Reactivo de Biuret: Disolver 1.9 g de CuSO4.5H2O y 3,35 g de Na2EDTA en 350 mL de agua destilada. Agregar lentamente y con

agitacin constante 100 mL de solucin fresca de NaOH 5 mol/L. Aforar

a 500 mL con agua destilada.

B. Solucin patrn de protenas: preparacin comercial, generalmente de 6g/dl.

C. Muestras: suero o plasma de diferentes especies animales.

Usted trabajar con muestras biolgicas. Una regla de oro preventiva es trabajar

cualquier muestra biolgica como potencialmente infecciosa. El uso de guantes es

recomendado. Si ocurre algn derrame, avise inmediatamente al instructor ms cercano.

Procedimiento

Precaucin:

1) Se obtienen muestras de plasma o suero por centrifugacin de la sangre total de diferentes especies animales, utilizando citrato de sodio al 3.8% como

anticoagulante o sin anticoagulante.

2) Rotular 3 tubos de ensayo como muestra, patrn y blanco reactivo. Aadir a cada tubo:


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Tubo

blanco

Tubo

estndar(patrn) Tubo muestra

Reactivo Biuret 2 mL 2 mL 2 mL

Agua destilada 20 L - -

Estandar 6g/dl - 20 L -

Muestra - - 20 L

3) Mezclar e incubar los tubos por 10 minutos a temperatura ambiente.

4) Leer la absorbancia a una longitud de onda de 550 nm en el espectrofotmetro o en el fotmetro a 540nm.

Notas

A. El color del complejo proteico es estable al menos por 1 hora.

B. La ley de Beer y Lambert se cumple hasta los 10g/dl

Clculos

PatrnAbsoteinaPatron Abs.

muestra la de . totalPr (5.9)

Equipos y materiales

Espectrofotmetro (visible)

Celdas para espectrofotmetro

bao termostatizado

termmetro.

16 tubos de ensayo

gradillas

pipetas graduadas de 5 ml

pipetas graduadas de 1 ml

pizeta.

vaso precipitado de 250 ml

vaso precipitado de 100 ml

Reactivos.

Reactivo de Biuret: Solucin estndar de ovoalbmina al 5% en NaCl 9%. Reactivo de cobre alcalino (RCA). Reactivo Folin (RF) Ovoalbmina Albmina de suero de bovino (BSA).


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Procedimiento

De acuerdo a la tabla 5.2:

1) Prepare una batera de tubos enumerados. 2) Agregue el volumen indicado de la solucin de ovoalbmina estndar o

muestra problema con una pipeta graduada de 1 mL.

3) Agregue el volumen indicado de agua con una pipeta graduada de 1 mL. 4) Agregue 4,0 mL del reactivo de Biuret con una pipeta graduada de 5 mL. 5) Agite y espere 20 minutos a temperatura ambiente para la formacin del

complejo coloreado.

6) Mida la absorbancia de los tubos en un espectrofotmetro a 540 nm, previa calibracin del equipo con el blanco.

Tabla 5.2: Resultados del ensayo

TUBO

Ovoalbmina

(mL)

H2O

(mL)

R. BIURET Absorbance Concentration

5% MP (mL) %

1 B 0,0 --- 1,0 4,0

2 S 1,0 --- 0,0 4,0

3 S 0,8 --- 0,2 4,0

4 S 0,6 --- 0,4 4,0

5 S 0,4 --- 0,6 4,0

6 S 0,2 --- 0,8 4,0

7 MP --- 1,0 MP1 0,0 4,0

8 MP --- 1,0 MP2 0,0 4,0

9 MP --- 1,0 MP3 0,0 4,0

De acuerdo a los datos:

7) Calcule la concentracin de la ovoalbmina en los tubos (2S 6S). 8) Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentracin. 9) Obtenga la ecuacin de la recta y el coeficiente de regresin por regresin

lineal.

10) Construya una grfica absorbancia versus concentracin, trace la recta obtenida por regresin.

11) Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las cubetas mediante la ecuacin 5.7.

12) Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones originales considerando las diluciones realizadas en el ensayo (Ecuacin 5.8).

Recuerde que Cx (Ecuacin 5.7) corresponde a CF (Ecuacin 5.8).

Cuando se conoce por bibliografa el coeficiente de extincin de un compuesto (, E1%), o ste es estimado experimentalmente, midiendo la absorbancia (AX) de una muestra del

compuesto de concentracin desconocida (CX) se puede calcular su concentracin

(ecuacin).


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lcAoAX

x

Medida de la celda L = 1 cm

En esta forma se obtiene la concentracin (Cf) de la muestra problema en la cubeta, para

obtener la concentracin original (Ci) se debe considerar las diluciones correspondientes

al ensayo usado la ecuacin.

ffii cvcv * *

5.4.2 Mtodo de Lowry

El mtodo de Lowry et al. (1951) combina la reaccin de Biuret con la reduccin del

reactivo de Folin-Ciocalteu (cidos fosfomolbdico y fosfotngstico) por la oxidacin de

tirosina, triptofano, cistena, cistina de las cadenas polipeptdicas (Nielsen, 1988). El

proceso de oxido-reduccin se acompaa de la formacin de un color azul

caracterstico. Est sujeto a muchas interferencias. Se utiliza fundamentalmente en

orina.

Figura 5.4: Esquema general de las reacciones que se llevan a cabo en el mtodo de

Lowry.

Los quelatos de cobre en la estructura del pptido facilitan la transferencia de electrones

de los grupos funcionales amino al cromforo cido. Este mtodo es til para

determinar pequeas cantidades de protena en una disolucin. El desarrollo de color es

dependiente en gran cantidad del pH, que se debe mantener entre 10 y 10.5 (Nollet,

1996)

Uno de los ms conocidos y utilizados para la determinacin de protenas en alimentos

(y otras muestras biolgicas). Basado en la interaccin de las protenas con el reactivo

de Folin (tungstato, molibdato y fosfato) en medio alcalino (pH 10-10.5) y con Cu (II).


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Reaccin debida principalmente a la presencia de aminocidos fcilmente oxidables

como la tirosina, cistena y triptfano. Reaccin entre el enlace peptdico y el cobre

(como Biuret) y despus una oxidacin con el reactivo de Folin por parte del grupo

fenol, tiol,... y el fosfomolibdato: color azul (500-750 nm). Mtodo con muy alta

sensibilidad (hasta 100 veces ms sensible que el mtodo de Biuret) y una relativa

especificidad: pocas interferencias importantes. Procedimiento emprico: intensidad de

color vara con los aminocidos presentes y condiciones analticas (tiempo de

incubacin, pH,...). Inconvenientes: mtodo destructivo, largo y que requiere la

incubacin de la muestra entre la adicin de los diferentes reactivos.

De acuerdo a la Tabla 5.3:

1. Prepare una batera de tubos enumerados. 2. Agregue los volmenes indicados de la solucin de seroalbmina de bovino

(BSA) estndar o muestra problema con una pipeta graduada de 1 mL.

3. Agregue los volmenes indicados de agua con una pipeta graduada de 1 mL. 4. Agregue 1,0 mL del reactivo alcalino (RCA) con una pipeta de 1 mL. Espere 10

minutos exactos.

5. Despus de los 10 minutos, agregue 4,0 mL del reactivo de Folin con una pipeta de 5 mL y mezcle.

6. Caliente los tubos por 5 minutos exactos a 55C en el bao termostatizado. 7. Enfre y lea en el espectrofotmetro a 650 nm, previa calibracin con el blanco.

Tabla 5.3: Resultados del ensayo

Tubo

BSA

(mL)

H2O

(mL)

R.C.A

.

(mL)

R.F. Abs. Conc.

0,4 mg/mL MP (mL) %

1B ---- --- 1,0 1,0 4,0

2S 0,1 --- 0,9 1,0 4,0

3S 0.2 --- 0,8 1,0 4,0

4S 0,3 --- 0,7 1,0 4,0

5S 0,4 --- 0,6 1,0 4,0

6S 0,5 --- 0,5 1,0 4,0

7MP --- 0,5 MP1 0,5 1,0 4,0

8MP --- 0,5 MP2 0,5 1,0 4,0

9MP --- 0,5 MP3 0,5 1,0 4,0

De acuerdo a los datos:

8. Calcule la concentracin de BSA en los tubos (2S 6S). 9. Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentracin. 10. Obtenga la ecuacin de la recta por regresin lineal y el coeficiente de regresin. 11. Construya una grfica absorbancia versus concentracin, trace la recta obtenida

por regresin.

12. Calcule las concentraciones de las muestras problemas en la cubeta mediante la ecuacin 6.7.


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13. Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones originales considerando las diluciones realizadas en el ensayo (Ecuacin 6.8).

5.4.3 Mtodo turbidimtrico

La turbidez producida cuando una protena se mezcla con alguno de los precipitantes

comunes (cido tricloroactico 3-10%, cido sulfosaliclico y ferrocianuro de potasio en

cido actico). Uso para protenas en bajas concentraciones se puede utilizar como un

ndice de la concentracin de protenas. Las tcnicas turbidimtricas son rpidas y

convenientes, sin embargo las principales desventajas que presentan es que las protenas

difieren en la velocidad de precipitacin as como no permiten diferenciar entre

protenas y compuestos insolubles en cidos tales como cidos nucleicos (Layne, 1957).

Mezclar 1 mL de la solucin problema con 4 mL de alguna de las siguientes soluciones:

cido sulfosaliclico al 2.5%

cido tricloroactico al 5%

Ferrocianuro de potasio 0.75% y adicionar una gota de cido actico

Dejar reposar durante 10 min a temperatura ambiente.

Medir espectrofotomtricamente la turbidez a 600 nm, utilizando un blanco con 1 mL

de agua tratada de la misma manera.

La concentracin de protenas se calcula a partir de una curva patrn preparada

con albmina bovina srica en concentraciones de 0,1 a 1,0 mg/mL, tratadas de

la misma manera con los reactivos.

5.4.4 Unin de colorantes

Controlando el pH y la fuerza inica del medio los grupos funcionales cidos y bsicos

de las protenas pueden interactuar con grupos orgnicos de carga opuesta. Al realizarse

la unin se presenta coloracin o bien un cambio de sta. Comnmente se usan

colorantes sulfonados los cuales reaccionan a pH cido con el grupo -amino de la lisina y el grupo guanidina de la arginina, el imidazol de la histidina y un nmero

limitado de -amino terminales (Nollet, 1996).

Fundamento: formacin de un precipitado (par inico insoluble) entre la protena y

ciertas molculas orgnicas coloreadas (colorantes orgnicos).

Resultados comparables a los del Kjeldahl. Ventajas: + rpido que Kjeldahl, sin reactivos txicos, automatizacin, simple. Inconvenientes: coste inicial alto, problemas con representatividad de la

muestra

Separar el precipitado del sobrenadante por centrifugacin o filtracin y por

comparacin entre la absorvancia inicial de la disolucin de colorante y la absorvancia


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del sobrenadante, determinar la concentracin de colorante precipitado y relacionarlo

con protenas.

Colorantes cidos (por ejemplo con grupos sulfnicos) que reaccionan con los grupos

bsicos de las protenas a pH bajo (~ 2) ya que se encuentran protonados.

Procedimientos totalmente empricos. Definir y controlar rigurosamente las condiciones

experimentales para garantizar la calidad de los resultados.

Principal ventaja: rapidez, con equipos comerciales a 100 muestras por hora, sin

necesidad de manipulacin experta ni uso de reactivos altamente corrosivos.

Tabla 5.4. Comparacin entre los mtodos usados para determinacin de protenas

Mtodo Ventajas Desventajas

Kjeldahl

Es apropiado para varios tipos de productos

Su alta confiabilidad y disponibilidad

Est incluido en los mtodos aprobados por las

organizaciones

internacionales

Llega a ver interferencia de compuestos nitrogenados no proteicos

Durante la digestin se produce demasiado humo

Uso de catalizadores caros

txicos

Baja sensibilidad

Tarda demasiado tiempo

Absorcin

a 280nm

Rpida y no destructiva

No se necesitan reactivos

Alta sensibilidad

Baja dependencia de la respuesta de la seal a la

composicin del aminocido

Baja interferencia de cidos nucleicos y nucletidos.

La interferencia de otros

compuestos que absorban en UV

Se necesita usar muestras limpias y lmparas relativamente nuevas

Biuret

No hay interferencia de aminocidos libres

Pequea influencia de la composicin del aminocido

en el desarrollo de color

La operacin es simple y se puede manejar nmero

grande de muestras

Interferencia de amoniaco, buffer, detergentes

Baja sensibilidad

Lowry

Alta sensibilidad

Fcil de operar

Fcil de manejar un gran nmero de muestras

Dependencia del color con la composicin del aminocido

Interfieren un buen nmero de compuestos

Inestabilidad del reactivo Folin-Ciocalteau a pH alcalino

La curva estndar no es lineal para altas concentraciones de protenas por lo tanto es

necesario diluir mucho antes de medir

(Nollet, 1996)


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5.5 DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS INSTRUMENTAL

Tabla 5.5. Tcnicas de anlisis instrumental para determinar protenas

Tcnica Caractersticas del mtodo

Esp

ectr

ofo

tom

etri

a

UV

Protenas: absorcin en el UV entre190 y 290 nm Medida de la absorcin a 280 nm (evitar problemas instrumentales a

longitudes de onda ms bajas, 200-215 nm muy sensible)

Absorcin debida fundamentalmente a: tirosina, triptfano y fenilalanina, que se encuentran en cantidades semejantes en las protenas

Tcnica muy utilizada en bioqumica y en control de fraccionamiento de protenas por LC

Mtodo simple, rpido y no destructivo

Fluorescencia

UV

Emisin de radiacin a 340 nm despus de excitacin a 275-280 nm (Triptfano)

Aplicar directamente sobre suspensiones Rpido y no destructivo.

Turbidimetria,

nefelometra

Suspensiones de protenas con los precipitantes habituales de protenas (cido tricloroactico, ferricianuro o cido sulfosaliclico

Los resultados dependen mucho de la reproducibilidad de las condiciones experimentales

Electrodos

especficos de

protenas

Un electrodo especfico con una membrana de Ag2S mide el contenido en protenas con grupos SH en medio alcalino

5.6 DETERMINACIN DE SUSTANCIAS NITROGENADAS NO PROTEICAS

Inters en la determinacin de las sustancias nitrogenadas presentes en los alimentos

diferentes de las protenas. Este grupo incluye: Aminocidos, Aminas (heterocclicas),

Nitrosamines, Derivados inorgnicos (NH4+, NO3

- y NO2-).

- Contribuir al valor nutricional de los alimentos, etc... (aminocidos) - Relacionadas con procesos que pueden modificar la calidad (degradacin,...) - Compuestos txicos: N-nitrosamines, Aminas Aromticas Heterocclicas

(HAAs) o Acrilamida con actividad txica, mutagnica o carcinognica

- Derivados inorgnicos del nitrgeno: amonaco, nitrato y nitrito - Primera etapa: eliminar las protenas de las muestras (o extractos de muestra):

Precipitacin (con agentes precipitantes de protenas como TFA); Dialisis (muy

adecuada para obtener muestras representativas de N no proteico);

Ultracentrifugacin (sedimentar las protenas)

- Los extractos libres de protenas se pueden analizar para determinar los compuestos nitrogenados no proteicos

- Nitrosaminas (cancergenas)


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5.7 EJERCICIOS RESUELTOS

1. Un alimento es analizado de la siguiente manera:

Para Humedad: se pes las placas petri con un peso = 2,345 g

Placa ms muestra fresca= 4,456

Placa ms muestra seca= 4,247

Protena: se pes una muestra de 0,217 g; gasto de HCl 0,05N de 20,152 mL

Grasa: Peso de la muestra fue 5,254g, el peso del baln vaco fue de = 24,657g

El peso del baln ms muestra extrada de grasa fue= 24,734g

Ceniza: Peso de capsula fue de 27,845 g

Peso de capsula ms muestra fue de= 29,844g

Peso de capsula ms ceniza = 27,865 g

Determinar la composicin qumica en porcentaje y en base seca por 100g de muestra

seca.

Solucin

%,x,

,x

,-,

,-, % Humedad 909100

1112

2090100

34524564

24744564

alimento masa

agua g

%50,6100 *

217,0

0,014 0,05 0,1522 % N

40,63% 6,25 x 50,6Protena %

%465,11005,254

24,657-24,734 Grasa % x

%0,110027,845-29,844

27,845-27,865 Ceniza % x

%005,4711,46540,639,90- 100 totales % tosCarbohidra

Cantidades en masa es:

Muestra fresca (g) Agua (g) m.s.(g) Proteina (g) Grasa (g) Ceniza(g) CHOS + otros (g)

2.11 0.209 1.901 0.858 0.028 0.021 0.994

2. Se analizaron 15 g de muestra para determinar el contenido de protena cruda por el mtodo de Kjeldahl, gastndose 25 mL de H2SO4 0,2 M para titular el NH3

liberado.

Calcular:

a) El contenido de nitrgeno total


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b) El porcentaje de protena cruda

Use el factor 6,25

Solucin

Para cuantificar el nitrgeno total en los alimentos y en la materia orgnica en

general se requiere la conversin completa del nitrgeno en su forma nativa a

nitrgeno gaseoso o a una sal inorgnica de amonio (estado totalmente reducido del

nitrgeno).

Nitrgeno total -----------protena cruda

xMN MN 0,4 0,2 x 2

% Nitrgeno total

933,0100 *

15

0,014 0,4 52 % N

Protena cruda

5,836,25 x 933,0Pr % oteina

3. Se realiz la determinacin de nitrgeno total en 1,0 g de muestra, habindose gastado en la titulacin del amonaco liberado; 5,6 mL de HCl 0,1 N. Luego se

realiz una segunda determinacin en 1,0 g de muestra, pero habiendo precipitado

previamente, con cido tricloro actico (TCA), en la fraccin de protena, se

gastaron 1,3 mL de HCl 0,1 N. Calcular los porcentajes de:

a) Nitrgeno total b) Protena cruda c) Nitrgeno proteico d) Protena b) Nitrgeno no proteico

Use el factor de protena 6,38

Solucin


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==========================================================================================================


100 * muestra

meq N %

g

GN

a) Nitrgeno total

784,0100 *

1

0,014 0,1 ,65 % N

b) Protena cruda

5,00196,38x 784,0Pr % oteina

c) Nitrgeno proteico

182,0100 *

1

0,014 0,1 ,31 % N

d) Protena

84,36,38 x 182,0Pr % oteina

e) Nitrgeno no proteico

Nitrgeno no proteico (%) = % Nitrgeno total - % nitrgeno proteico

% Nitrgeno no proteico = 0,784 0,182 = 0,602

4. Se pes de una cpsula porcelana vaca fue 40,5602 g, la cpsula ms la muestra peso 50,6872 g y despus de desecar a 100 C por cinco horas, se obtuvieron los

siguientes valores:

Primera pesada = 48,2594 g

Segunda pesada = 48,2584 g

Tercera pesada = 48,2582 g

De la muestra seca se tom el 50% y se determin el contenido de protena cruda

por el mtodo de Kjeldahl. El NH3

destilado se recogi en 50 mL de H2SO4 0,05

M y se titul el exceso de cido con 25 mL de NaOH 0,1 N.

Calcular el porcentaje de protena cruda en base hmeda. Use el factor 6,25.

Solucin

Porcentaje de nitrgeno total en la muestra seca

%909,0100 *

849,3

0,014 0,1 52 % N


==============================================================

==========================================================================================================


5,6833%6,25 x 909,0Pr % oteina

Realizando el balance de materia se tiene:

Porcentaje de protena en muestra inicial del alimento es:

100muestra de g

protena de g protena de % x

%32,410010,127

0,4375 protena de % x

5. Para determinar el contenido de protena cruda de una muestra de pan desecado parcialmente (10% de humedad) se pesaron 2 g de muestra y se gastaron 21,1 mL

de HCl 0,1 N en la titulacin de NH3

destilado. Qu volumen de cido se habra

gastado si se pesa la misma cantidad de muestra pero con un contenido de humedad

de 35%?

Solucin

90%) ms % (

HCl mL 21,1 muestra g 2 10%) (%H

Muestra

Para el primer caso

Xg = 10,127 g ( muestra de alimento fresco)

Xg = 7,698 g (muestra desecada)

Agua = 2,429 g

Protena = 5,6833% g de protena = 0,05683 x 7,698 =0,4375 g (en 7,698g)

Otros = 7,2605 g


==============================================================

==========================================================================================================


100 * muestra

meq N %

g

GN

1,477% 100 *

2

0,014 0,1 1,12% N

%23,96,25 x 477,1Pr % oteina

g 0,1846 2 x 0,0923 proteina de g

Calculo de muestra con 35% de humedad = 2 x 1,25 = 2,5

Realizando el balance se tiene

Calculo de porcentaje de protena en muestra con 35 % de humedad

100muestra de g

protena de g protena de % x

%385,71002,5


Si la muestra con 35 % de humedad contiene 7,385% de protena cuanto de HCl de

0,1N se gastar en 2 g de muestra.

6,25 x %%385,7 N

Muestra ( H = 35 %) = 2,5g

Muestra ( H= 10%) = 2,0 g

Agua = 25%

% Protena = 9,23% g de protena = 0,0923 x 2 =0,1846g ( en 2g)

Otros =1,8154


==============================================================

==========================================================================================================


1,1816% % N

100 * muestra

meq N %

g

GN

100 *

2

0,014 0,1 %1816,1

G

mL 88,160,1N HCLGasto

6. Se desea gastar entre 20 25 mL de H2SO

4 0,05 M en la titulacin del NH

3

obtenido de un Kjendahl. Qu cantidad de dicha muestra habra que pesar

sabiendo que la muestra tiene un contenido de protena del 2%? Use factor 6,25

Solucin

Tomaremos el promedio del gasto= 22,5 mL

6,25 x %Pr % Noteina

6,25 x %2 % N

0,32% % N

100 *

Meq. N %

muestrag

GastoN

100 *

0,014. 0,1 5,2232,0 %

muestrag

mL

g 9,84 muestra de g

7. Despus de desecar un determinado peso de muestra, esta se redujo a 13,50 g y luego de desgrasado a 11,25 g. Sabiendo que la humedad de la muestra era 10%, se

le pide calcular:

a) El % de grasa

b) El % de protena cruda en la muestra original, sabiendo que se tomo 1/5 de la

muestra desecada y desgrasada para la determinacin de protena, la cual una

vez digerida y destilada gasto 8,5 mL de H2SO

4 0,2 M para titular el NH

3

liberado.

Solucin

Para determinar grasa por extraccin en alimentos, este debe estar seco, si es as 13,50 g

corresponde a materia seca.


==============================================================

==========================================================================================================


90% ms

10%H Xg 1 Peso

seca g 13,5 2 MuestraPeso

g 2,25 grasa

Desgrasado

desgrasada seca g 11,25 3 MuestraPeso

Entonces haciendo el balance 13,50 g corresponde al 90% que es materia seca y por lo

tanto para 100 % de materia ser:

gX 1590

100 x 13,50 g

Porcentaje de grasa

%15100muestra de g 15

grasa de g 2,25 Grasa % x

Porcentaje de protena en muestra seca y desgrasada

gg 25,225,115

1 muestra de

100 *

Meq. N %

muestrag

GastoN

2,1156% 100 * 25,2

0,014 0,4 5,8 % N

%22,136,25 x 1156,2Pr % oteina Porcentaje de protena en muestra seca

desgrasada

Haciendo el balance queda as:


==============================================================

==========================================================================================================


Entonces porcentaje de protena en base a la muestra original ser:

100muestra de g

protena de g protena de % x %

%92,910015


Peso 1 Xg = 15 g ( muestra original)

Peso 2 Xg = 13,5 g (muestra desecada)

Peso 3 Xg = 11,25 g ( muestra desgrasada)

Agua = 1,5 g

Grasa = 2,25 g

Protena = 13,22 % = g de protena = 0,1322 x 11,25

=1,48725 g ( en 11,25g)

en muestra

desgrasada

Otros

= 9,76275 g


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5.8 EJERCICIOS PROPUESTOS

1. En que se fundamenta del Mtodo Kjeldahl en la determinacin de protena en alimentos?

2. Complete la reaccin siguiente de la etapa de digestin

322242alimento elen del Pr NHOHSOCOSOHoteina

RCATALIZADO

3. Complete la siguiente reaccin

2224423 )( SOCONHSOSOHNH

4. Complete la siguiente reaccin de destilacin:

OH NH Na )(NH 234242 SONaOHSO

5. Complete la siguiente reaccin de destilacin en la determinacin de protena.

32333 NH BOH NH BOH

6. La siguiente reaccin es el fundamento de determinacin de protena por el mtodo de: -----------------------

Protena cobre complejo Cu-protena

Color violeta

7. Explique el fundamento de determinacin de protena del mtodo Nessler.

8. Explique el fundamento de determinacin de protena del mtodo Dumas.

9. Explique el fundamento de determinacin de protena del mtodo Biuret.

10. Explique el fundamento de determinacin de protena del mtodo Lowry.

11. Por qu se llama protena bruta al contenido proteico de un alimento determinado por el mtodo de Kjeldhal?

12. Qu masa de carne se habr pesado en la determinacin del contenido acuoso de


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la misma si se sabe que el % de humedad es de 50 % y la diferencia de masa entre

la muestra seca y la muestra es de 1,5320 g?

Rta: masa carne = 3,064 g

a) Si se recoge el destilado en 50,0 ml de H2SO4 valorado y se titula con NaOH valorado, el % de N en la muestra se calcula como:

muestra

basecido

m

fNVfNVN

100*14*

1000

****%

b) Si se recoge el destilado en 50 ml de solucin saturada de cido brico (solucin 2 % de cido brico) y se titula con cido valorado, el % de N en la muestra se

calcula como:

muestra

cido

m

fNVN

100*14*

1000

**%

13. Escriba las ecuaciones de titulacin correspondientes a ambos casos, a) y b). A partir de ellas, deduzca las ecuaciones ya presentadas. Justifique el empleo de

indicador de rango de viraje pH= 5,1 en ambas titulaciones.

14. Calcula el % proteico de un producto alimenticio sabiendo que la muestra se analiz segn el mtodo de Kjeldhal y los datos de laboratorio fueron:

Masa muestra = 0.6020 g

H2SO4 0,1 N : V = 50,0 ml; f = 1,010

NaOH 0,1 N . V = 33,5 ml, f = 1,020

Factor conversin de N a protena = 6,25

Rta.:% proteico = 23,7 %

15. Se quiere conocer el % de protena en una muestra de pescado. La determinacin de N se realiz por el mtodo de Kjeldahl, pero el destilado se recogi en una

solucin de cido brico 3% y se titul con HCl 0,1N, obtenindose los siguientes

resultados:

Vol. de HCl (0,1N f = 0,999) = 18,1 ml

Masa de pescado = 0,8324

Factor de conversin de N a protena: 6,25

Rta.: 19,0%

16. Llega un producto crnico al laboratorio y Ud. debe comprobar que el contenido de protena del mismo es de 15%. Indique qu masa de muestra pesara para

realizar la determinacin de N por el mtodo de Kjeldahl. Ud. dispone en el

laboratorio del siguiente material:

H2SO4 0,1 N f = 1,010, NaOH 0,1 N f = 0,990, tiene a su disposicin buretas de 50,0 ml y sabe que el factor de conversin de N a protena en el producto es 6,38

Rta.:la respuesta no es nica, pero la masa debe ser aproximadamente 1,2 g.


==============================================================

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17. Se ha preparado una hamburguesa que contiene carne vacuna y harina de soja como nicos ingredientes. Se quiere saber cunta harina de soja se emple en la

mezcla, si se tiene la siguiente informacin:

% Protena (hamburguesa) = 25 % (sobre producto desgrasado)

% Grasa (hamburguesa) = 20%

% Protena (carne) = 18%

% Protena (harina de soja) = 40%

Cantidad de carne utilizada = 30 g

Rta.: 3g o 9%

18. Sobre una muestra de producto crneo que contiene 2% de NaNO2 y 1,5 % de NH4Cl se realiza una determinacin de N por el mtodo de Kjeldahl. Calcule el %

de protena (considrese que salvo los compuestos sealados, todo el N restante es

proteico)

Datos

Pesos atmicos N: 14; O: 16; Na: 23, Cl: 35,5; H: 1

Masa de muestra = 0,6200 g

Vol (H2SO4 0,1 N f=1,010) = 50,00 ml

Vol.( NaOH 0,1N f= 1,045) = 32,30ml

f de conversin de N a protena = 6,25

Rta.: 21.19

19. Calcular el contenido proteico de un aislado de soja (AS) empleado en la elaboracin de un producto alimenticio. El producto contiene 60% de AS, 18 % de

agua; 4 % de almidn de maz, 150 ppm de nitrito de sodio, saborizantes y

colorantes (que no contienen sustancias nitrogenadas). El factor de conversin de

N a protenas en el AS es 6,28 y los datos de laboratorio correspondientes al

dosaje de protenas del producto alimenticio segn Kjeldhal fueron:

H2SO4 0,1 N : V = 35,0 ml; f = 0,9998

Masa muestra = 0,7325 g

Rta. . 70 % de protena en el AS.

20. Se presenta un nuevo alimento infantil que contiene como principales ingredientes cereales, leche en polvo y azcar. El producto est fortificado con hierro y mezcla

de aminocidos. El fabricante declara un agregado mnimo de 700 mg de

aminocidos por 100 g de producto y, para comprobarlo, se lleva a cabo la

determinacin de Kjeldhal sobre el producto terminado. Determine si el producto

contiene la cantidad de aminocidos declarada por el fabricante, teniendo en

cuenta los siguientes datos del laboratorio:

Nota: Considere que no hay ms compuestos nitrogenados que los mencionados en el

enunciado.

Masa de muestra = 1,2042

El destilado se recoge en H2SO4 valorado:

H2SO4 0,1 N : V = 50,0 ml; f = 1,0110

NaOH 0,1 N . V = 29,3 ml, f = 1,0010


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Se sabe que:

a) El contenido de Nitrgeno proveniente del cereal representa el 50 % del Nitrgeno total del producto.

b) El producto contiene 25 % de leche en polvo. c) El % de N en la mezcla de aminocidos es del 16 %.

Otros datos:

Factor conversin de N a protena en el cereal = 5,70

Factor conversin de N a protena en la leche en polvo = 6,38

% de protena de la leche en polvo = 29,0 %

Rta.: no cumple porque el contenido de aminocidos es de 610mg/100 g de producto.

21. Se dispone de una muestra cuya composicin es la siguiente:

Anlisis %

Agua 14%

Nitrgeno 2,28%

Hidrato de carbono 47,5%

Fibra cruda 5%

Ceniza 0,58% (en base seca)

Grasa 20%

Se quiere saber cul es el factor de conversin de nitrgeno a protena de esta muestra.

Considere que todo el nitrgeno es proteico.

Rta.: 5,7

22. En el anlisis de Protena en un alimento: se pes una muestra de 0,217 g; gasto de HCl 0,05N de 20,152 mL. Determine la cantidad de protena bruta.

23. Se analizaron 15 g de muestra para determinar el contenido de protena cruda por el mtodo de Kjeldahl, gastndose 25 mL de H2SO4 0,2 M para titular el NH3

liberado. Calcular:

a) El contenido de nitrgeno total

b) El porcentaje de protena cruda

Use el factor 6,25

24. Se realiz la determinacin de nitrgeno total en 1,0 g de muestra, habindose gastado en la titulacin del amonaco liberado; 5,6 mL de HCl 0,1 N. Luego se

realiz una segunda determinacin en 1,0 g de muestra, pero habiendo precipitado

previamente, con cido tricloro actico (TCA), en la fraccin de protena, se

gastaron 1,3 mL de HCl 0,1 N. Calcular los porcentajes de:

a) Nitrgeno total

b) Nitrgeno no proteico

c) Nitrgeno proteico

d) Protena

e) Protena cruda

Use el factor de protena 6,38


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25. Se pes de una cpsula porcelana vaca fue 40,5602 g, la cpsula ms la muestra peso 50,6872 g y despus de desecar a 100 C por cinco horas, se obtuvieron los

siguientes valores:

Primera pesada = 48,2594 g

Segunda pesada = 48,2584 g

Tercera pesada = 48,2582 g

De la muestra seca se tom el 50% y se determin el contenido de protena cruda

por el mtodo de Kjeldahl. El NH3

destilado se recogi en 50 mL de H2SO

4 0,05

M y se titul el exceso de cido con 25 mL de NaOH 0,1 N. Calcular el porcentaje

de protena cruda en base hmeda. Use el factor 6,25.

26. Para determinar el contenido de protena cruda de una muestra de pan desecado parcialmente (10% de humedad) se pesaron 2 g de muestra y se gastaron 21,1 mL

de HCl 0,1 N en la titulacin de NH3

destilado. Qu volumen de cido se habra

gastado si se pesa la misma cantidad de muestra pero con un contenido de

humedad de 35%?

27. Se desea gastar entre 2025 mL de H2SO

4 0,05M en la titulacin del NH

3 obtenido

de un Kjendahl. Qu cantidad de dicha muestra habra que pesar sabiendo que la

muestra tiene un contenido de protena del 2%? Use factor 6,25

28. Despus de desecar un determinado peso de muestra, esta se redujo a 13,50 g y luego de desgrasado a 11,25 g. Sabiendo que la humedad de la muestra era 10%,

se le pide completar los cuadros: El % de protena cruda en la muestra original,

sabiendo que se tom 1/5 de la muestra desecada y desgrasada para la

determinacin de protena, la cual una vez digerida y destilada gasto 8,5 mL de

H2SO

4 0,2 M para titular el NH

3 liberado.

29. Complete el siguiente cuadro: Nombre E Kcal Agua Proteina Grasa Carbohidratos Carbohidratos Fibra Fibra Ceniza 100 g

Totales Disponibles cruda dietaria muestra

Achita, kiwicha o achis 343 9.2 12.8 6.6 2.5 9.3 2.3

Arroz pilado o pulido cocido 115 72.2 2.4 0.1 0.1 0.1

Arroz blanco corriente 358 13.4 7.8 0.7 0.4 0.5

Arroz con cscara 325 11.9 5.9 2 9.9 4.1 4.5

Avena envasada 380 6.1 13.7 4.7 0.5 4.2

Avena, hojuela cocida 54 87.1 1.3 0.5 0.2 0.2

Avena, hojuela cruda 326 8.8 13.3 4 1.7 10.6 1.7

Caihua amarilla 344 12 14.3 5 9.4 5.9

Caihua gris 343 12.4 14 4.5 9.8 5.1

Caihua, hojuelas de 376 8.1 17.6 8.3 10.2 5.3

Caihua parda 343 12.2 13.8 3.5 11 4.3

Cebada con cscara 289 9.7 8.4 2 7.3 17.3 2.4

Cebada, llunka de (morn americano) 252 18.5 1.9 0.7 1.3 17.3 1.8

Cebada, mashka o machica 306 10 8.6 0.7 6.6 10.1 3.3

Cebada para mote, pelada 328 15.4 8.2 1.1 1.3 2

Cebada tostada, harina integral 282 5.6 8.68 3.2 25.4 2.5

Cebada perlada o resbalada cocida 60 81 1 0.1 0.1 3.8 0.2

Cebada perlada o resbalada cruda 281 13.3 5.3 0.6 0.5 15.6 1

Cebada tostada y molida (chaquepa) 349 9.9 7.7 0.8 5.3 1.9

Chancay (bizcocho) 355 19.4 8.8 6.9 1.1 0.5

Fideo crudo fortificado con hierro 337 12.1 9.4 0.2 0.5 3.2 0.6


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5.9 BIBLIOGRAFIA

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