BIOTECNOLOGÍA PARA EL DESARROLLO...
61
BIOTECNOLOGÍA PARA EL DESARROLLO SUSTENTABLE DE LA PISCICULTURA EN AGUAS CONTINENTALES. Por Emmerik MOTTE, Mario CUEVA, Jorge MEDINA, María Elena BERMUDES, Eric MIALHE, Virna CEDEÑO.
Transcript of BIOTECNOLOGÍA PARA EL DESARROLLO...
BIOTECNOLOGÍA PARA EL DESARROLLO SUSTENTABLE DE LA PISCICULTURA EN AGUAS CONTINENTALES.
Por Emmerik MOTTE, Mario CUEVA, Jorge MEDINA, María Elena BERMUDES, Eric MIALHE, Virna CEDEÑO.
Desembarques totales globales aumentaron: 18 mtm (1950) 158mtm (2012)
Producción mundial de la pesca de captura y la acuicultura
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
2001950
1953
1956
1959
1962
1965
1968
1971
1974
1977
1980
1983
1986
1989
1992
1995
1998
2001
2004
2007
2010
2013
2016
2019
2022
2025
Mil
lon
es d
e T
m.
Producción mundial de acuicultura supera los 90,4 mtm, de los cuales 70,5 mtm, destinado al consumo humano, + 5,8% entre 2000-2013 (FAO 2014). AL&C ↗ 10% Se producen 78% más peces, 308% más crustáceos y 60% más moluscos que hace 20 años.
91,3 mtm
158 mtm
42,2%
Producción mundial de la acuicultura
La producción en agua continental: alrededor de 63% en 2012 (41,9 mtm) En 2010, la producción en agua dulce represento el 58.1% del valor de la producción global.
La tasa de crecimiento anual promedio de la producción dulceacuícola entre 2000 y 2010 fue de 7.2%, comparado con 4.4% para la producción acuícola marina.
Retos de la producción mundial de la acuicultura
Producción Rentable de Animales Sanos con un Impacto Ambiental Limitado mejorar las tasas de crecimiento , mejorar la eficacia de la alimentación mejorar la reproducción, disminuir las pérdidas causadas por las enfermedades, mejorando la respuesta inmune, mejorar las técnicas de diagnóstico y las medidas profilácticas.
La Revolución Biotecnológica “Omics” y mejor nutrición puede acelerar la consecución de estos objetivos.
La FAO proyectó que, para satisfacer las necesidades de la población humana, la producción total debería aumentar a 181mtm, con 161mtm para consumo humano (2022).
Aumentar Eficiencia en la Producción de las especies cultivadas. Para lograrlo Amplios esfuerzos en investigación en acuicultura.
La Biotecnología Moderna ó Biotecnología Molecular
Actual y Futura Moderna Tradicional
La biotecnología moderna, basada en la aplicación de nuevos métodos moleculares y estudios celulares, con técnicas de “ingeniería genética”– es una ciencia fascinante que tiene un potencial enorme para responder a los problemas de la producción acuícola.
Diagnóstico molecular, cultivo celular,
domesticación de microorganismos, …
Genómica y Metagenómica, Transcriptómica, Proteómica;
Valorización de moléculas, Edicion de genomas (TALENs,
CRISPR/Cas9), …
Procesos de fermentación (Ej.: productos panificados, bebidas alcohólicas [vino,
cerveza] y lácteos [quesos, yogures], …
MALDI TOF TOF Mass Imaging
Electroforesis 2D
Micro-Arrays Secuenciación, PCR, Q-PCR …
Del gen a la proteína y tecnologías “ómicas”
Aplicaciones de la biotecnología en ambientes marinos y acuáticos: Diagnósticos moleculares,
Certificación de reproductores , ovas y larvas, Tratamientos y vacunas de nueva generación,
Domesticación de microorganismos,
Mejoramiento genético y marcadores eQTLs,
Control de la reproducción, sexaje,
Nuevas alternativas de nutrición,
Obtención de nuevos productos a partir de la biodiversidad marina y acuática.
BIOTECNOLOGÍA AZUL ó BIOTEC. ACUÁTICA
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
PCR Real-Time PCR LAMP
Inmunostrip
útiles cuando los microorganismos son difíciles de cultivar, ya que permiten
su identificación sin necesidad de aislarlos.
Herramientas biotecnológicas: - Inmuno-diagnósticos con Mabs - PCR y variantes, Real-Time PCR, LAMP - Secuenciación del ADN Diagnóstico rápido, sensible y preciso.
Aplicación para identificación de Bacterias, Rickettsias, Micobacterium, Parásitos, Hongos, Virus... Genotipificación, id. de factores de virulencia y resistencia a tratamientos.
Aquabirnavirus: Necrosis Pancreatica Infecciosa “IPNv”
Novirhabdovirus: Necrosis Hematopoyética Infecciosa “IHNv” Septicemia hemorrágica viral “VHS”
Iridovirus: Necrosis Hematopoyética Epizoótica “EHNv” , Linfocistis virus
Isavirus
Herpesvirus: Channel Catfish Disease “Herpesvirosis”
“viral encephalopathy and retinopathy” “viral nervous necrosis”.
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
Alineamiento de Secuencias Las secuencias conservadas se analizan en un editor de alineamientos
Todas las secuencias se alinean mecánicamente y se editan manualmente
IPNv1 IPNv2 IPNv3 IPNv4 IPNv5 IPNv6 IPNv7
Selección de primers
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
Ventajas: - Alta sensibilidad - Alta especificidad - Rapidez
35 a 40 ciclos Millones de copias
Reacción en cadena de la polimerasa “PCR”
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
REVERSE TRANSCRITASE PCR“RT-PCR”
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
Lanes 2 to 4: fish infected with Y. ruckeri ; Lanes 5 to 7: fish infected F. psychrophilum ; Lanes 8 to 10: fish infected A. salmonicida ; Lanes 11 to 13: control fish with PBS; lane 14: non template control; Lane 15: fish from a Y. ruckeri outbreak; Lanes 16 to 18: fish from F. psychrophilum outbreaks
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
ISA: anemia infecciosa del salmón; VHS: septicemia hemorrá-
-gica vírica; VER: retinopatía y encefalopatía vírica;
IPN: necrosis pancreática infecciosa; IHN: necrosis hemorrá-
-gica infecciosa; CC: viremia del pez gato;
SD: enfermedad del sueño.
Gen amplificado Gen amplificado
Gen amplificado
Agente Agente
Agente
Tipo de ensayo Tipo de ensayo
Tipo de ensayo
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
- La Real-Time PCR detecta a acumulación del producto durante la reacción. - La detección y cuantificación de agentes fluorescentes en “tiempo real”. - La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad Cuantificación
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
SYBR Green
Taq-man
• Basado en la utilización de una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena (Bst)
• Reacción auto-cíclica a temperatura constante
• Alta eficiencia de amplificación (109-1010 veces en 15-60 min)
NOTOMI et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. 2000
Electroforesis
Turbidez
Fluorescencia
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
Síntomas: Peces débiles con descoloración oscura, abrasiones en la piel, y degeneración ocular. Mortalidades en 2011, 2013, …..
Resultados: Es un nuevo virus, patógeno emergente de tilapia. La caracterización del genoma Diagnostico por PCR y estudios epidemiológicos.
Tilapia lake virus (TiLV) genoma de 10-segmentos de ARN(-). El mas grande tiene homologías con la subunidad PB1 del virus de influenza C. 9 segmentos extremos con secuencias conservadas encontradas en otros orthomyxoviruses. La replicación y transcripción ocurre en el hígado y sistema nervioso.
Desde 2009, mortalidades masivas en Israel y Ecuador. Evidencia de un nuevo orthomyxo-like virus estos brotes.
1) Diagnóstico molecular y estudios epidemiológicos
Láser (337nm)
Cámara
Microplaca
Zona de aceleración TOF1
Fuente de ionización 1
Fuente de iones 2
Zona de decaimiento TOF2
Detector
Selector de iones
Detector lineal
Espejos de iones (Reflectrón)
Pila de desaceleración
El MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time-Of-Flight Mass)
Alta capacidad de análisis Alta sensibilidad Alta precisión en la determinación de masas moleculares proteicas.
Poderosa técnica micro-analítica esencial que permite determinar con gran precisión la masa de moléculas por medio de la medida de la relación masa/carga (m/z).
Proteómica: MALDI-TOF MS
Proteómica: Identificación de virus y su caracterización
Espectros de péptidos de la capside viral
SDS-PAGE de proteínas obtenidas
de muestras infectadas (I)
y no infectadas (U).
La espectrometría de masa sola o combinada con otras técnicas, permite la separación e identificación de proteínas y péptidos simultáneamente.
Gel de electroforesis 2D para proteínas
a) Individuo No Infectado b) Infectado
Proteómica “MALDI-TOF/TOF”
Secuenciación de la proteína por
HPLC-MS/MS
(Identificación de la proteína de
cápside del virus X)
Proteómica: Identificación de virus y su caracterización
Identificación del espectro de cepas
bacterianas.
Proteómica: Identificación de virus y su caracterización
Flavobacterium columnare
F. psychrophylum
Vibrio anguilarum
Yersinia ruckeri
2) Prevención de enfermedades y
Domesticación de microorganismos benéficos
Prevención de enfermedades infecciosas: - Certificación de los genitores, alevines, ovas - Vacunación - Uso de probióticos
Prevención de enfermedades: Certificación de genitores y
ovas
Prevención de enfermedades: Certificación de genitores y
alevines
La primera vacuna descubierta fue la usada para combatir la viruela por Edward Jenneren ,1796.
VACUNAS VIVAS Vacunas heterólogas Vacunas atenuadas
VACUNAS INERTES (NUEVA GENERACIÓN) Más seguras y eficaces
Vacunas inactivadas Vacunas de antígenos recombinantes Vacunas de ADN Péptidos sintéticos
Prevención de enfermedades: Vacunas
Prevención de enfermedades: Vacunas de ADN
Prevención de enfermedades: Vacunas
Prevención de enfermedades: Vacunas
PATÓGENO GEN PLÁSMIDO PEZ
VHSV Glico protein pcDNA (Invitrogen)
Promotor CMV Trucha arcoriris
IHNV Glico protein pcDNA (Invitrogen)
Promotor CMV Trucha arcoriris
NNV Viral P pET24a Larvas de bacalao
HIRRV Glico protein
N protein
pCI-neo (Promega)
pcDNA 3.1(Invitrogen)
Promotor CMV
Lenguado japonés
LCDV Major Capsid protein pEGFP-N2 (Invitrogen) Lenguado japonés
RSIV Major Capsid protein pCI-neo (Promega) Dorada
IPNV Viral Protein 2
Viral Protein 3, SegA
pEGFP-N1 (Clontech Lab)
Promotor CMV Zebra
Aeromonas
hydrophila
Outer Menbrane
Protein TS pQE30-UA Carpa india
Vibrio anguillarum Menbrane Protein 38 pcDNA3.1
Promotor CMV
Corvina
Robalo asiático
Mycobacterium
marinum
Fibrinogen-binding
protein A
pcDNA3.1
Promotor CMV
Robalo rayado
híbrido
Prevención de enfermedades: Vacunas
Vacunas de nueva generación : Mapeo de Epítopes
El alto grado de mutaciones en las proteínas estructurales hacen difícil el desarrollo de vacunas. Los epítopes más conservados y preseleccionados por la bioinformática pueden ser candidatos para el desarrollo de péptidos vacunas
Estructura terciaria de la glicoproteína E viral
EPITOPE MAPPING
Vacunas de nueva generación : Mapeo de Epítopes
Prevención de enfermedades: Domesticación µorg. benéficos
Prevención de enfermedades: Domesticación µorg. benéficos
Garantizan una mejor supervivencia y productividad.
Producción de biomasa - Estudios de los Bioflocs
Análisis moleculares: Caracterización de cepas de interés Expresión de genes de interés → Nutrición, → Nitrificación → Colonización
Análisis proteómicos: Quorum sensing Interacciones microbianas Metabolitos de interés
Microbioma
Metagenómica
Identificación de comunidades microbianas
Prevención de enfermedades: Domesticación µorg. benéficos
Domesticación µorg. Benéficos Metagenómica
Marcador de Bacillus spp. = endoglucanase
Caracterización de bacterias benéficas por MALDI-TOF
Detección del péptido “leader” de nisina Z por MALDI TOF MS
Análisis Molecular Instantáneo de microbios por “MALDI-TOF imaging”, obtenido en agares.
Interacción entre Bacillus subtilis y Streptomyces coelicolor
Imaging de bacterias por MALDI-TOF
Gnotobiología
Aislamiento, caracterización molecular y domesticación
de microorganismos
naturalmente asociados al tracto digestivo
para la prevención de enfermedades bacterianas
y el incremento de la productividad.
Prevención de enfermedades: Domesticación µorg. benéficos
Criterios de Selección: - Forma – Tinción de Gram - Amilasa, Proteasa y Lipasa - Lactonasa (QUORUM-QUENCHING) - Pruebas de antagonismo
Extracción del ADN
Amplificación de los genes
16SrRNA and rpoB
Análisis de
secuencias
Animales silvestres
Aislamiento de
unidades
formadoras de
colonias
Homogeneización
y suspensión de
secciones del
intestino
DNA
Sequencer
Prevención de enfermedades: Domesticación µorg. benéficos
Pruebas de
cultivo in vivo
Cepa L-A 1 Cepa L-A 2 Mezcla L-A 1/2
Resistencia
a patógenos
Incremento
del
crecimiento
y de la
sobrevivencia
Células inmunes
y expresión de
genes
inmunitarios
Infección
experimental con
vibrios patógenos
Pruebas
in vitro Pruebas in vitro
Prevención de enfermedades: Domesticación µorg. Benéficos
Convencionalización
Análisis 3D espacio-temporal de la
colonización mono- y multi-específica
Día de eclosión Día 1 post-eclosión Día 2 post-eclosión Día 3 post-eclosión
Colonización controla por una cepa
probiótica de Lactobacillus en
Dicentrarchus labrax
Seguimiento de la apertura de la boca en la vieja azul “Aequidens rivulatus”
Prevención de enfermedades: Domesticación µorg. Benéficos
Convencionalización
Hasta inicio alim., alevines mantenidos en agua estéril en baldes de (8Lt)
Densidad= huevos /balde con1lt agua al inicio
Inoculación de bacteria día 2 post-eclosión, 104UFC/mL , cada 2 días.
Desde 1 dph hasta 30 dph (1mes)
1
0,81 0,89 0,85
1,04 1
1,19 1,12
1,19
1,36
1
1,46
1,26
1,40 1,31
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
controle B. cereus B. pumilus B. megaterium Mix
Survival gain
Biomass gain
Weight gain 1
Aumento de la biomasa y peso individual en el primer mes de
cultivo, en un 36% and 31%, respectivamente.
Tilapia (O. niloticus)
convencionalizada
1 1,05 1,07 1,08
0,89
1,29
0,86
2,05
1
1,26
1,00 1,06 1,07 0,95
2,34
1
1,2
0,93 0.98
0,83
1,18 1,13
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Controle B. cereus B. pumilis …
Lysinibacillus sp. Exiguobacterium sp. Kurthia sp.
Enterobacter sp. Acinetobacter sp. …
Ext. Tracto VA B. megaterium Bacillus sp. …
B. pumilus Bacillus sp. …
Survival gain Biomass gain Weight gain
Hasta inicio alim., alevines mantenidos en agua estéril en baldes de (8Lt)
Desinfección de huevos fertilizados y alevines..
Densidad= 100 alevines/balde con1lt agua al inicio.
Inoculación de bacteria día 2 post-eclosión, 104UFC/mL , cada 2 días.
Aumento sobrev. 105%, biomasa 134% y peso individual 20%
Con bacterias Gram +, amilasa, proteasa ylactonasa (+).
Vieja azul (Aequidens rivulatus)
convencionalizada
Mejoramiento genético
Enfoque de la Transcriptómica y Proteómica para la identificación, caracterización, y la detección de genes y péptidos específicos de peces.
Pruebas moleculares
Microarrays
Real-Time PCR
Cuantificación
de la
expresión de
genes.
Genómica funcional: Transcriptómica / Proteómica
Ensayos con diferentes dietas o variaciones en nutrientes para medir el efecto sobre los genes Id. de Biomarcadores
Selección asistida por Biomarcadores
Ef1 Ef2 Ef3 Muestras
Real-Time PCR Cuantificación precisa del nivel de expresión de los genes (Digestión, Transp. Nutrientes, Metabolismo proteico, lipídico, Hormonal, Sist. innmune, etc).
DIETA A DIETA B
“Chip” de ADN
Transcriptómica Expresión diferencial de genes
- Altas mortalidades ocurren durante el desarrollo larval Destete
Comprender el desarrollo larval es de importancia para poder definir una correcta alimentación y condiciones de cultivo. La ontogenia de las funciones esenciales como: la digestión, la osmoregulación, la inmunidad y el metabolismo han sido extensamente investigadas durante el desarrollo larval de peces, a nivel de los componentes celulares, enzimas, metabolitos y la expresión de génica.
Transcriptómica Expresión diferencial de genes
Fig- Agrupamiento hierárquico global de >400 familias de genes diferencialmente expresados durante el desarrollo larval de la lubina Europea. Rojo: AUMENTO y Verde: Reducción de la expresión relativa (Adapted from Darias et al. 2008).
Grupos de genes Co-expresados
1era fase, días 7 a 23 post-eclosión: - Genes involucrados en desarrollo visual
y neuronal. - Genes del metabolismo aeróbico.
2da fase, días 25 a 43 post-eclosión: - Grupos de genes relacionados con la
osificación y desarrollo muscular. - Metabolismo anaerobico y maduración
del tracto digestivo.
Transcriptómica Expresión diferencial de genes
Proteomica funcional: Mass Imaging
Revisión de la edición de genoma por TALEN y CRISPR/Cas9
Ó
Edición de genomas: Mutagenesis dirigida
Edición de genomas: Mutagenesis dirigida
Domesticación de nuevas especies
Aplicaciones de la GnRH en la producción acuícola Adelantar / retrasar / extender, la estación de reproducción natural; Sincronizar el lote de reproductores; Mejorar la cantidad y la calidad de la espermación; Mejorar la ovulación de las hembras (hidratación y de liberación de los ovocitos) Inducir una primera reproducción / maturación (Domesticación).
La GnRH : Hormona liberadora de Gonadotropinas La GnRH es un decapeptido bien conservado en los vertebrados. Liberación de manera pulsada en el organismo. El tamaño pequeño del gen permite su manipulación y también una posible síntesis artificial del decapeptido.
Determinación genética del sexo de los reproductores Largo tiempo de mantenimiento antes la madurez sexual. No presencia de caracteres sexuales secundarios fácilmente identificables. Determinación genética y ambiental del sexo. Mejorar el comportamiento de los reproductores : - Sexo Ratio optimo - Inducir un cambio de sexo en función de la necesidad (Especies hermafroditas) Estudio de los genes del determinismo genético:
-DMRT1, DMY, Cyp19, Sox9, etc… Diagnóstico temprano (antes de la pubertad) Dosificación de hormonas en el plasma (periodo de reproducción).
Desarrollo de poblaciones mono-sexo Reversión hormonal, temperatura, Ginogenesis /Androgenesis
Poliploidía (control de la fertilidad) Triploidía, Tetraploidía…
Domesticación de nuevas especies
Domesticación de nuevas especies
- Transcriptómica - Proteómica
Los nutrientes
afectan a la expresión de genes y a las
funciones celulares.
Food-Omics: Nutrigenética y Nutrigenómica
Desafíos de Nutri-ómica en Acuacultura
Nuevas alternativas para reemplazar harinas y aceites de pescado: - Harinas de origen vegetal - Hidrolisados obtenidos de co-productos (desechos de carne y acuícolas,
menudencias, plumas, sangre), o subproductos de desechos animales = Fuente de péptidos de cadenas cortas (di, tri-péptidos) y amino ácidos libres, péptidos bioactivos…
Propiedades importantes: - Mejor absorción, digestión y asimilación… - Mejor atractabilidad (inosina) y sabor agradable… - Actividades antioxidantes (carotenoïdes, carnosina “dipéptido de
histidina”, ) y antimicrobianas (péptidos ricos en cisteínas, arginina)…
Calidad de las harinas (peptidos cortos) y aceites (contenido de PUFAs).
Genes asociados con la absorción de nutrientes = peptide transporter, glucose transporter...
Inmuno-Nutrición, Control de la Reproducción, etc…
= Alternativas para la producción de ácidos grasos poli-insaturados (PUFAs) de tipo “omega-3” (ácido docosahexaenóico [DHA] y ácido eicosapentaenóico [EPA]).
a Dunaliella sp. 100x, b Chaetoceros sp. 100x,
c Chlorella sp., d Haematococcus sp.,
e Spirulina sp.
Células de cepa de Schizochytrium sp. (Traustoquítrido) presantando numerosos
cuerpos lipídicos.(Bara 20 μm).
(MICRO)ALGAS PROTISTAS MARINOS (Traustoquítridos)
Desarrollo de la acuacultura social y popularización de biotecnología acuícola
Desarrollo de la acuacultura social y popularización de biotecnología acuícola
GRACIAS POR SU ATENCION
Guayaquil - Ecuador
Teléfonos: (593-4) 2610613
Celulares: (09-423806) - (099-516186)
e-mail: [email protected]
www.conceptoazul.com.ec
Tumbes - Perú
Calle Philipinas 212
Teléfonos: 522559
Celulares: 072 972 701 484
e-mail: [email protected]
EL FUTURO DE LA ACUICULTURA ESTA EN LA BIOTECNOLOGÍA La Revolución “Ómica”
