Biosensores basados en Nanotubos de Carbono con aplicaciones en Biotecnolog ía Clínica
BIOSENSORES PARA LA DETERMINACIÓN RÁPIDA Y...
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CURSO: CONTAMINANTES EMERGENTES EN EL SIGLO XXI
BIOSENSORESPARALADETERMINACIÓNRÁPIDAYPORTABLEDEMICOTOXINAS
29– Septiembre- 2016
MICOTOXINAS: CONTAMINANTES EMERGENTES
Las micotoxinas son un grupo muy amplio y variado de moléculas tóxicas,producidas como metabolitos secundarios por hongos filamentosos, y que puedencontaminar a un grupo muy amplio de alimentos.
Castillo, J.R., Vidal-JC , et al., Electrochemical Affinity Biosensors for Detectionof Mycotoxins: A Review, Biosens. Bioelectr. 49 (2013) 146-158
Aflatoxins (Aspergillus)
(Aspergillus & Penicillium)
Zearalenone(Fusarium)Fumonisina B1 (Fusarium)
Deoxinivalenol (Fusarium)
Ocratoxina A
Tricotecenos
MÉTODOS RÁPIDOS PARA LA DETERMINACIÓN DE MICOTOXINAS
ELISAs
INMUNOSENSORES
Electroquímicos(VOLT,AMP,EIS)
Fluorescencia(FP,IAC-FLD,F.O.)
APTASENSORES
FlujoLateral(LFDs) SPR
Microfluídica(Lab-on-a-chip)
BIOSENSORESYMÉTODOSRÁPIDOS
Anticuerpos Aptámeros
• Extracción (aislamientomicotoxina)• Tratamientosencillodelamuestra• Evitarinterferenciasdematriz• Selectividaddelligando• Sensibilidad(<ppb´s)• Determinaciónrápida• Bajo coste (instrumentaciónsencilla)• Portabilidad(in-situ)• Determinaciónmúltiple• Kits comerciales• Sistemasdealerta(screening)
QCM
ELISAsELISAs
LODs ≈ 0.1-1 ng mL-1
• Kits ELISAs comerciales
Lector ELISABio-Rad - 680
enzyme linked immuno-sorbent assays
• Portabilidad(in-situ)• Micotoxinas másimportantes• Tiemposmedida:~ 0,5-4h.• Sensibilidadysencillez• Screening /Cuantitativos.
EnsayocompetitivoAmplificaciónenzimática
mpELISAs
mpELISAs
mpEIA
(TMB)Rd
(TMB)Ox
Muestra (extracto micotoxina)
MIC
MIC
OTAFB1DON
Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,Rapiddtm.ofrecent COCusewith mpEIA inserum,salivaandurine fluids,J.Pharm.Biomed.Anal.125(2016)54-61
GEAS:GrupodeEspectroscopía AnalíticaySensores(UZ)
KITS INMUNOSENSORES ELECTROQUÍMICOS Y ESPECTROFOTOMÉTRICOS
BIOSENSORES
Biosensores para micotoxinas
Muestra
Biorreconocimiento Transducción
electronics
Anticuerpos
Aptámeros
• Óptica (FM)• Electroquímica• QCM• SPR
Señal Analítica = f(c)
Afinidad
Catalíticos
Enzimas (inhibición)
BIOSENSORES: TRANSDUCCIÓN ELECTROQUÍMICA
A. B.+
FB1 mAb-FB1FB1-HRP MBs-PrG
HQ+H2O2
pBQ
HQ2 e-+
Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,Anal.Meth.7(2015)3742-3749
Fumonisina B1
• LOD:0,58±0,05ng mL-1 FB1• EC50:4,34±0,15ng mL-1 FB1• Range:0,70-54ng mL-1 FB1
• 7-13%RSD
TRANSDUCCIÓN MULTI-ELECTROQUÍMICA
• Multi-potenciostato• Multi-micotoxinas• Nanoestructuración
• Arrays serigrafiados (8X)
Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,Amulti-electrochemical competitive immunosensor forsensitive COCdtm.inbiological samples,Electroanal.28(2016)685-694
Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,An electrochemical immunosensor for OTAdetermination inwines based on amAb andparamagnetic microbeads,Anal.Bioanal.Chem.403(2012)1585-1593
SPCEsscreen-printed carbon electrodes
NANOESTRUCTURACIÓN
Lananoestructuración mejoralaspropiedadesdelbiosensor (inmunosensor)
Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,Improved electrochemical immunosensor for OTAwith abiotinilated mAb captureprobe andAuNPs nanotructuring,Anal.Meth.3(2011)977-984
• mAb-OTA-bi• OTA-BSA-AuNPs• OTA:0,15– 10ng mL-1
• LOD:0,10ng mL-1 OTA• %RSD:10%
• pAb-OTA• OTA-BSA-AuNPs• OTA:0,9– 9ng mL-1• LOD(sinAuNPs):0,86 ng mL-1 OTA• LOD(AuNPs):0,20 ng mL-1 OTA• %RSD:10,6%y8,0%• Recuperaciones:105%
Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,OTAnanostructured electrochemical immunosensorsbased on pAb andAuNPs coupled tothe antigen,Anal.Meth.2(2010)335-341
MÉTODOS RÁPIDOS: FLUORESCENCIA DE POLARIZACIÓN
FPIA • Fasehomogénea (rapidez)• Noesprecisoseparación(lavado)• Velocidadderotación• Instrumentosportables(1sóla micotoxina,1𝛌em)• Tiempodevidafluorescencia:tdesdeexc.aemis.(~4ms.)• Alineamientodipolosconlaluzpolarizada,tiempoemis.• 1ªaplicaciónFPIA(myctx):2001(FB1enmaíz)• tincubación:2-10min.(fasehomogénea)
3min.(extract.)+2min.(FPIA)
ensayocompetitivo
MYCTX LODs ó EC50
Aflatoxinas EC50: 28 ng mL-1
DON LOD: 100 𝜇g kg-1; EC50 ~ 20 ng mL-1
FB1 LOD: 500 𝜇g kg-1
OTA LODs ~ 0,5 - 10 ng mL-1
ZEA LODs ~ 70 - 130 𝜇g kg-1
T-2 + HT-2 LODs ~ 8 𝜇g kg-1
Másinformación:
Maragos,C.etal.,Fluorescence polarizationimmunoassays for rapid,accurate andsensitive determination ofmycotoxins,WorldMyc.J.7(2014)479-489
MÉTODOS RÁPIDOS: Inmunosensores de fibra óptica
Ondaevanescente(interfase)(𝞰 ext.menor)
• Altaespecifidad• Portabilidad(miniaturización)• Medidasentiemporeal• Faltadesensibilidad• Influencia𝞰 disolventes
Másinformación:
Maragos,C.etal.,Fiber-optic immunosensor for mycotoxins,NaturalToxins 7(1999)371-376Leung,A.etal.,Areview offiber-optic biosensors,Sens.Act.B125(2007)688-703
Ejemplo:FB1:EC50=25 𝜇gg-1 (LOD=3,2𝜇gg-1)
AFB1:<2ng mL-1
EC50=5𝜇gg-1 (LOD=0,4𝜇gg-1)
IAC
MÉTODOS RÁPIDOS: IACs (FM)
Columnas de inmunoafinidad(IACs)
OchratestDONTestFumonitest
LODs ≈ 0.01-5 ng/mL(Fluorescencia intrínseca de la micotoxina)
• Limpieza/preconcentración enHPLC-FLD(MS)• Determinaciónposterior(FM,VOLT,Biosensores)• Mejoradelaselectividadysensibilidad.
• MenoresLODs.• Evitamoselefectodelamatriz enlatécnicainstrumental.
Másinformación:
Zheng,M.Z.etal.,Areview ofrapid methods for theanalysis ofmycotoxins,Mycopathologia 161(2006)261-273
MÉTODOS RÁPIDOS: MISPE - FLD
Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,Anal.Lett.45(2012)51-62
• OTA:3-18ng mL-1 OTA• LOD:1,2ng mL-1OTA• Recovery:93±9%(cereal)• Dynamic binding capacity:118±9ng OTA/45mgMIP
MIPs
INMUNOSENSORES: MICROBALANZA DE CUARZO
• Viscoelasticidad• FIA•Noetiquetado
Modelización:Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,Anal.Bioanal.Chem.394(2009)575-582
QCM
OTA:10-128ng mL-1LOD:8ng mL-1
EcuaciónSauerbray
DISPOSITIVOS DE FLUJO LATERAL (LFDs)
• Tirasreactivas(NC,f.vidrio)• Cut-off level (+ó -)• Myctx:1epítopo• Ensayocompetitivo• Sencillez,rapidez,estabilidad• Usoin-situ.Comerciales.• Semi-cuantitativos(screening)• Multiple testlines• 5-10min.
LFDs
Sample pad Membrane pad
DispositivosInmunocromatográficos
PROPIEDADES ANALÍTICAS: LFDs
LFDs
Fuente:Nimal,J.etal.,Mycotoxin detection – Recent trends atgloballevel,J.ofIntegrative Agriculture 14(2015)2243-2264
Fuente:Song,S.etal.,MultiplexLFDfor mycotoxin determination,Anal.Chem.66(2014)4995
DON+ZEA+AFB1
INMUNOSENSORES SPR
• Inmunosensores para(múltiples)micotoxinas
• Serequieremuypocovolumen(~𝜇L)
• Reutilizaciónsensorchip
• Cinéticamicotoxina-anticuerpo
• Noserequiereetiquetado(inmunosensor)
• MiniaturizacióndelainstrumentaciónSPR(in-situ).
• Myctx (PM<700Da<<10kDa):sandwich,indirect.competitive.
ResonanciadePlasmón superficial(Inmunosensores)
SensorChipMásInformación:Ying,L.etal.,Review:Recent developments andapplicationsofSPRbiosensors for the detection ofmycotoxins infoodstuffs,Food Chem.133(2012)1548-1554
Micotoxinas LODs(ngg-1)
AFB1+ZEA+FB1+DON 0,2/0,01/50/0,5
OTA 0,01
T-2,HT-2 25
• Monocadenas oligonucleótidos(ssDNA,RNA)• MétodoSELEX(~1995):Selectividad• Mayorestabilidadvs.anticuerpos• Síntesismáseconómica• Sensiblesaenzimasnucleasas• OTA,FB1,AFB1(aptámeros).
APTÁMEROS: APTASENSORES PARA MICOTOXINAS
-C-G--A-T-
LFDs
Señal
ELIMAs
Aptámeros:
Másinformación:
Yang,X.etal., Review:Application ofAptamer Identification Technology inRapidAnalysis ofMycotoxins,Chin.J.Anal.Chem 41(2013)297-306.
Sampleloading
APTASENSORES
Castillo,J.R.,Vidal,J.C.,etal.,Biosens.Bioelectr.26(2011)3254-3259
• OTA:0,7-8,8ng mL-1• LOD:0,07±0,01ng mL-1• RSD:8%
OTAvs.OTB
BIOCHIP ARRAYS
Másinformación:
Oswald,S.etal.,Automated regenerable microarray-basedimmunoassay for rapid parallel quantification ofmycotoxins incereals,Anal.Bioanal.Chem.405(2013)6405-6415.
• Inmunoensayo múltiple(indirecto)• Spottingover adefined surface.• Chip:di-amino-PEGsobresuperficievidrio
• Quimiluminiscencia.• Aflatoxinas (B1,B2,G1,G2),OTA,DON,FB1• Extracciónmúltiple(MeOH:Agua,80:20,V:V)• a-IgG-HRP(luminol,H2O2).• Tiempototal:19min.
• Re-utilizaciónbiochip:50veces.
Array biosensor optical assays
Avidin (silanized)coated glass slide(PDMStemplate)biosensor array.Eachpattern:21x1x2.5mm. (LxWxH)
Micotoxina LODs(µgkg-1) Linearrange(µgkg-1)
OTA 1,1 1,7–15,4
AFB1 0,9 2,6–11,6
FB1 159 168-2216
DON 40,5 76-1173
MICROFLUÍDICA: LAB-ON-A-CHIP
• 𝜇TAS(1980´s)• Lab-on-a-chip• Preparaciónmuestra,filtración,reacción,detección.
• Canalesmicrofluídicos:10-200𝜇m• Consumomenordereactivos• Tiempos(incubación,medida)menores.
Másinformación:
Fang,K.,Application ofmicrofluidic “lab-on-a-chip”for the detectionofmycotoxins infoods,Trends inFood Sci.Tech.46(2015)252-263
Unchipmicrofluídico típico
DeterminacióndeZEA
PDMS
CURSO: CONTAMINANTES EMERGENTES EN EL SIGLO XXI
Gracias por su atención
BIOSENSORESPARALADETERMINACIÓNRÁPIDAYPORTABLEDEMICOTOXINAS
29deSeptiembrede2016
CURSO: CONTAMINANTES EMERGENTES EN EL SIGLO XXI
BIOSENSORESPARALADETERMINACIÓNRÁPIDAYPORTABLEDEMICOTOXINAS
29deSeptiembrede2016
InformaciónadicionalparaelCurso
ELISAs COMERCIALES
ExisteungrannúmerodekitsELISAScomercialesparatodotipodemicotoxinas
INFORMACIÓN ADICIONAL
ELISAs
BIOSENSORES PARA MICOTOXINAS
Fuente:Anal.Chim Acta902(2015)12-33
INFORMACIÓN ADICIONAL
Algunostiposdebiosensoresparaladeterminacióndemicotoxinas
MÉTODOS RÁPIDOS: IACs
Fuente:Turner,N.W.etal.,Review – Analytical methods for determination ofmycotoxins:An update (2009-2014),Anal.Chim.Acta901(2015)12-33
EjemplosdelusodeColumnasdeInmunoafinidad
INFORMACIÓN ADICIONAL
Fuente:Anal.Chim.Acta901(2015)12-33
PROPIEDADES ANALÍTICAS: APTASENSORES
OTA/FB1/AFB1Aptámerosseleccionados:
INFORMACIÓN ADICIONALAptasensores paramicotoxinas
BIOSENSORES DE FUSARIUM
Fuente:Lin,X.etal.,Review - Advances inBiosensors,Chemosensors andAssaysfor the Determination ofFusariumMycotoxins,Toxins 8(2016)161-181
Másinformación:Xu,L.etal.,Review:Mycotoxin determination infoods using advanced sensorsbased on antibodies or aptamers,Toxins 8(2016)239-255
Biosensores paramicotoxinas Fusarium
INFORMACIÓN ADICIONAL
PROPIEDADES ANALÍTICAS
Fuente:Anal.Chim.Acta901(2015)12-33
Polímerosmodeladosmolecularmente(MIPs)
Biosensores deinhibiciónenzimática
INFORMACIÓN ADICIONAL