beneito.pdf

DEPARTAMENT DE QUIMICA ANALITICA

DESARROLLO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD DE SURFACTANTES Y ADITIVOS EN PRODUCTOS DE LIMPIEZA Y DE HIGIENE PERSONAL. MIRIAM BENEITO CAMBRA

UNIVERSITAT DE VALÈNCIA Servei de Publicacions

2011

Aquesta Tesi Doctoral va ser presentada a València el dia 28 d’octubre de 2011 davant un tribunal format per:

- Dr. Michael Lämmerhofer - Dra. Coral Barbas Arribas - Dr. Alain Berthod - Dr. José Javier Laserna Vázquez - Dra. María Celia García Álvarez-Coque

Va ser dirigida per: Dr. Guillermo Ramis Ramos Dr. José Manuel Herrero Martínez ©Copyright: Servei de Publicacions Miriam Beneito Cambra I.S.B.N.: 978-84-370-8800-6

Edita: Universitat de València Servei de Publicacions C/ Arts Gràfiques, 13 baix 46010 València Spain

Telèfon:(0034)963864115

FACULTAT DE QUÍMICA

DEPARTAMENT DE QUÍMICA ANALÍTICA

DESARROLLO DE MÉTODOS ANALÍTICOS PARA EL CONTROL DE

CALIDAD DE SURFACTANTES Y ADITIVOS EN PRODUCTOS DE

LIMPIEZA Y DE HIGIENE PERSONAL

Memoria para alcanzar el grado de Doctor (Doctorado Europeo) presentada por:

Miriam Beneito Cambra

Directores: Dr. Guillermo Ramis Ramos Dr. José Manuel Herrero Martínez

Valencia, 2011

I

D. Guillermo Ramis Ramos, catedrático del Departamento de Química Analítica

de la Universidad de Valencia y D. José Manuel Herrero Martínez, profesor

titular del mismo departamento,

Certifican

Que la presente memoria, que lleva por título “Desarrollo de métodos analíticos

para el control de calidad de surfactantes y aditivos en productos de limpieza y

de higiene personal” constituye la Tesis Doctoral de Dña. Miriam Beneito

Cambra.

Asimismo, certifican haber dirigido y supervisado tanto los distintos aspectos del

trabajo, como su redacción.

Burjassot, Junio de 2011

Guillermo Ramis Ramos José Manuel Herrero Martínez

III

Esta tesis se ha realizado gracias a una beca V-Segles-Empresa

entre la Universitat de València y Químicas Oro

V

A mi familia

VII

AGRADECIMIENTOS

La realización de esta Tesis Doctoral no habrá sido posible sin la ayuda y

el apoyo de un gran número de personas:

En primer lugar, quisiera agradecer a mis Directores, el Dr. Guillermo

Ramis Ramos y al Dr. José Manuel Herrero Martínez, por su ayuda y dedicación.

Su confianza, apoyo y paciencia han sido fundamentales para poder llevar a cabo

este proyecto.

A si mismo, quisiera dar las gracias al Dr. Ernesto F. Simó Alfonso, por su

contribución al desarrollo de mi trabajo y por haber estado dispuesto a apoyarme

cuando lo he necesitado.

También quisiera agradecer a Dña. Marisa Cañellas y D. Miguel Ángel

Chamorro de Químicas Oro por esta oportunidad que se me ha brindado y la

paciencia durante estos años.

Cómo no también agradecer a todos aquellos que, de un modo u otro

hicieron posible mi estancia en la Universidad de Viena, y principalmente al Dr.

Wolfgang Lindner y Dr. Michael Lämmerhofer, DANKE SCHÖN.

Por otro lado, agradecer a mis compañeros del Laboratorio 10, con los que

he compartido tantas cosas…. cosas buenas, otras no tan buenas, agobios,

preocupaciones, trabajo y momentos de diversión (¿os acordáis de Keops?):

Aarón, Alex, Amparo, Anna, Claudia, Cristina, Elisa, Enrique, Hugo, Isabel,

Iván, Laura, María N., María V., Pascuali, Patty, Pietro, Roberto, Sandra,

Tamara, Victoria, Virginia y Yanelis. A la Dra. Mª Jesús (MariJesu!!!!! Que ja

casi ho tinc, no m’asfixies!!! Moltes gràcies per tot, pels consells, xarradetes i

espentes quan fan falta). Todos y cada uno, estáis muy presentes, muchas gracias

por todo. A todos los demás compañeros y profesores del Departamento, con los

IX

que ha sido una verdadera satisfacción relacionarme y trabajar. También dar las

gracias a toda la gente con la que compartí muchos momentos en Viena, los

compañeros de laboratorio y otra gente que estuvo ahí, en especial al Dr. Xavier

Subirats, moltes gràcies per tot, el teu suport, ànim i consells son molt valuosos

per a mi.

También agradecer a mis amigos, los de siempre: Amara, Amparo,

Enrique, John, Jose (Teuler), Mª Mar, Montse, Oscar, Rafa, Ramón, Rebeca,

Vicente y sin olvidar las últimas incorporaciones (Aharón, Alexis y Nayara),

muchas gracias por estar siempre ahí, apoyarme y motivarme para seguir hacia

delante. A todos los amigos de la facultad, que tantas horas hemos compartido en

los pasillos, clases, cafetería y por ahí, gracias por entenderme, apoyarme y

aguantarme. Dar las gracias también a Pilar y Rosa, que tantos años

compartiendo el mismo piso, al final une mucho, muchas gracias por todos

aquellos años y por continuar manteniendo esa amistad.

Y como no, agradecer también a mi familia: mis abuelos, tíos y primos,

por demostrar siempre tanto interés en mi trabajo y por estar ahí, y en especial a

mis padres, quienes siempre han estado a mi lado y me han apoyado en los

momentos difíciles, muchas gracias por vuestra ayuda incondicional en todos los

aspectos. Y como no, a mi tío Batiste, tu no podies faltar, gràcies per tot, ja veus,

tenim algo positiu.

A todos vosotros, y a los que aunque no haya nombrado han sido

partícipes de que todo haya llegado a buen fin, GRACIAS.

X

ÍNDICE

Capítulo I – Introducción…………………………………..…..………… xx1

I.1. Detergentes……………………………………………….……...… xx3

I.1.1. Introducción………………………………………….……..... xx3

I.1.2. Componentes en las formulaciones de

los productos de limpieza…...………………………....……… xx3

I.2. Surfactantes………………………………………………...………. x12

I.2.1. Introducción………………………………………………….. x12

I.2.2. Clasificación de los surfactantes……………………….…….. x14

I.2.3. APGs……………………………………………….………… x20

I.2.4. Alcoholes no-etoxilados y etoxilados………………..………. x25

I.2.5. AESs……………………………………………….…………. x29

I.3. Polímeros………………………………………………….……….. x31

I.3.1. Introducción………………………………………………….. x31

I.3.2. Polímeros en detergentes……………………….……………. x34

I.3.3. PVP-NO……………………………………………...………. x36

I.3.4. PVP…………………………………………………………… x37

I.3.5. PVA………………………………………...………………… x37

I.3.6. Métodos de análisis de polímeros...…………………….……. x38

I.4. Enzimas………………………………………………….…………. x41

I.4.1. Introducción………………………………………………….. x41

I.4.2. Proteasas……………………………………………...………. x43

I.4.3. Amilasas………………………………………...……………. x45

I.4.4. Lipasas……………………………………….……………….. x46

XII

I.4.5. Celulasas………………..……………………………....…….. x47

I.5. Técnicas analíticas………………………………………….……… x49

I.5.1. LC…………………………………………………………..… x49

I.5.1.1. Medida de parámetros cromatográficos………...……. x52

I.5.2. CE…………………………………………………………….. x56

I.5.2.1. Mecanismo de separación en CE……………………... x56

I.5.2.2. EOF…………………………………………………… x57

I.5.2.3. Movilidad y tiempo de migración…………………….. x58

I.5.2.4. Técnicas de electroseparación capilar…………..…… x59

I.5.3. CEC……………………………………………………….….. x60

I.5.3.1. Instrumentación en CEC………………….………….. x60

I.5.3.2. Columnas empleadas en CEC……………………...… x62

I.5.3.3. Polimerización de columnas monolíticas

basadas en ésteres de metacrilato y acrilato……….…. x64

I.5.3.4. Caracterización de materiales monolíticos…..………. x65

I.5.4. MS……………………………………………………………. x66

I.5.4.1. Fuentes de iones………………………………………. x68

I.5.4.2. Analizadores de masas……………………………….. x70

I.5.4.3. Acoplamiento de una técnica

de separación a un MS………………………………... x72

I.5.4.4. Resolución………………………….………………… x73

I.5.5. NMR………………………………………………………….. x73

I.5.5.1. Espectrómetro de NMR………………..……………… x75

I.5.5.2. NMR de 1H……………………………………………. x76

I.5.5.3. NMR de 13

C……………………………...……………. x78

XIII

I.5.6. Algunas técnicas de tratamiento estadístico de datos………… x79

I.5.6.1. Análisis clasificatorio supervisado……….………...... x79

I.5.6.2. LDA…………………………………………….…….. x80

Capítulo II – Objetivos y plan de trabajo…..…………………….…….. x83

II.1. Surfactantes…………………………………………….……….… x85

II.1.1. APGs………………………………………………...……… x85

II.1.2. Alcoholes………………………………………….………… x86

II.1.3. AES………………………………………………………….. x87

II.2. Polímeros………………………………………………………….. x87

II.2.1. PVP-NO………………………………………….………….. x87

II.2.2. PVP……………………………………………..…………… x88

II.2.3. PVA……………………………………….………………… x88

II.3. Enzimas……………………………………………...……………. x89

II.3.1. CZE……………………………………………….…………. x89

II.3.2. Aminoácidos por infusión directa en MS………………..….. x89

II.3.3. Aminoácidos derivatizados con OPA-NAC…………...……. x90

II.3.4. Digestos con tripsina………………………………………… x90

II.4. Columnas monolíticas…………………………………………….. x91

II.4.1. Columnas monolíticas de LM

fotopolimerizadas usando LPO como iniciador………...…….. x91

II.4.2. Comparación de iniciadores para la preparación

de columnas monolíticas de metacrilato para CEC………..... x91

XIV

Capítulo III – Materiales y métodos…….................................................. x93

III.1. Surfactantes…………………………………………….………… x95

III.1.1. APGs……………………………………………..…………. x95

III.1.1.1. Estándares, materias primas y otras muestras…..…. x95

III.1.1.2. Reactivos de uso general……………………………. x95

III.1.1.3. Instrumentación y condiciones de trabajo………..… x95

III.1.1.4. Preparación de estándares y muestras…………...… x96

III.1.2. Alcoholes………………………………………………….... x97

III.1.2.1. Estándares, materias primas y otras muestras……... x97

III.1.2.2. Reactivos de uso general…………………….……… x98

III.1.2.3. Instrumentación y condiciones de trabajo………….. x98

III.1.2.4. Preparación de estándares y muestras……..………. x99

III.1.3. AESs..………………………………………………………. 101

III.1.3.1. Estándares, materias primas y otras muestras….….. 101

III.1.3.2. Reactivos de uso general……………………...…….. 101

III.1.3.3. Instrumentación y condiciones de trabajo…….……. 102

III.1.3.4. Preparación de estándares y muestras………….….. 103

III.2. Polímeros sintéticos……………………………………………… 106

III.2.1. PVP-NO……………………………………………..……… 106

III.2.1.1. Estándares, materias primas y otras muestras…...… 106

III.2.1.2. Reactivos de uso general……………………………. 107

III.2.1.3. Instrumentación y condiciones de trabajo………….. 107

III.2.1.4. Preparación de estándares y muestras…………..…. 108

III.2.2. PVP……………………………………………………….… 108

III.2.2.1. Estándares, materias primas y otras muestras……... 108

XV


III.2.2.3. Instrumentación y condiciones de trabajo………..… 109

III.2.2.4. Preparación de estándares y muestras……………... 110

III.2.3. PVA……………………………………………………….... 111


III.2.3.2. Reactivos de uso general…………………….……… 111

III.2.3.3. Instrumentación y condiciones de trabajo……..…… 111

III.2.3.4. Preparación de estándares y muestras……………... 114

III.3. Enzimas………………………………………………………..…. 114

III.3.1. CZE…………………………………………………………. 114

III.3.1.1. Estándares, materias primas y otras muestras…..…. 114


III.3.1.3. Instrumentación y condiciones de trabajo……….…. 116

III.3.1.4. Preparación de estándares y muestras………..……. 117

III.3.2. Aminoácidos por infusión directa en MS……………….…. 118


III.3.2.2. Reactivos de uso general………………………..….. 118

III.3.2.3. Instrumentación y condiciones de trabajo………….. 119

III.3.2.4. Preparación de estándares y muestras………….….. 119

III.3.2.5. Construcción de las matrices de entrenamiento

y evaluación…………………………………….....…. 121

III.3.2.6. Selección de variables predictoras para la

construcción de un modelo de LDA…………...….…. 122

III.3.3. Aminoácidos derivatizados con OPA-NAC……………..…. 123


III.3.3.2. Reactivos de uso general……………………..….…. 124

XVI



III.3.4. Digestos con tripsina…………………………………….…. 126


III.3.4.2. Reactivos de uso general……………………..….…. 126



III.4. Columnas monolíticas…………………………………………..... 128

III.4.1. Monómeros, agentes entrelazantes, iniciadores,

estándares y reactivos de uso general…………………..….. 128

III.4.2. Tratamiento de columnas……………………………..……. 129

III.4.2.1. Acondicionado de columnas…………………..……. 129

III.4.2.2. Preparación de columnas monolíticas……..………. 130

III.4.3. Instrumentación y condiciones de trabajo…….……………. 132

Results……………………………………………….……….……............ 135

Chapter IV – No ionic surfactants in cleaning products….……………. 137

IV.1. APGs……………………………………………….……….……. 139

IV.1.1. APGs by HPLC-MS…………………………..……………. 139

IV.1.1.1. Optimisation of working conditions using

continuous infusion MS…………………..…….……. 141

IV.1.1.2. Separation of APGs by HPLC–MS

in isocratic conditions……………………..…...……. 141

IV.1.1.3. Separation of APGs by HPLC–MS

with gradient elution………………………...….……. 144

IV.1.1.4. Quantitation studies…………………………...……. 146

XVII

IV.1.2. Fragmentation of D-Glucose and AMGs…………..………. 150

IV.1.2.1. Optimization of the IT-MS detection conditions…… 152

IV.1.2.2. Fragmentation of D-Glucose and their isotopic

forms using MSn……………………………..………. 153

IV.1.2.3. Fragmentation of AMGp using MSn………….....…. 157

IV.1.2.4. Fragmentation of AMGf using MSn……………....... 159

IV.2. Non-ethoxylated and ethoxylated alcohols………………...……. 162

IV.2.1. Chromium(VI) oxide oxidation of non-ethoxylated

and ethoxylated alcohols for determination by ESI-MS……. 162

IV.2.1.1. Optimization of the infusion medium………….……. 164

IV.2.1.2. Relative sensitivity of carboxylic and

ethoxy-carboxylic acids as a function of n and m….... 166

IV.2.1.3. Oxidation yields of primary non-ethoxylated alcohols

and extraction recoveries of the corresponding

carboxylic acids…………………………………….... 168

IV.2.1.4. Influence of water concentration

on the oxidation yield…………………………..……. 169

IV.2.1.5. Oxidation yields of ethoxylated alcohols………...…. 171

IV.2.1.6. Application to industrial and

environmental samples……………………………….. 173

Chapter V – Anionic surfactants…………………………………...……. 179

V.1. AESs……………..………………………………………………... 181

V.1.1. Determination of FAEs and AESs by SAX separation,

derivatization with a cyclic anhydride and HPLC………..…. 181

V.1.1.1. Derivatization and HPLC separation

of the derivatives……………………………….….…. 184

V.1.1.2. Optimization of the SAX separation of

the surfactant classes……………………………...…. 186

XVIII

V.1.1.3. Calibration studies………………………………..…. 190

V.1.1.4. Application to industrial raw materials

and commercial products……………………………. 193

V.1.1.5. Seawater analysis………………………………....…. 194

Chapter VI – Synthetic polymers…………………………………..……. 197

IV.1. PVP-NO……………………..………………………...…………. 199

VI.1.1. Characterization of PVP-NO by FSCE and MEKC…..……. 199

VI.1.1.1. FSCE studies in the absence and presence of PEA…. 202

VI.1.1.2. Discussion on the results obtained by FSCE…….…. 206

VI.1.1.3. MEKC studies in the absence and

presence of PEA……………………………………... 208

VI.1.1.4. Discussion on the results obtained by MEKC………. 210

VI.1.1.5. Quantitation studies and application to

real samples using FSCE…………………………….. 215

VI.2. PVP…………………..…………………………………………... 217

VI.2.1. Characterization and determination of PVP by

complexation with an anionic azo-dye and NECEEM….…. 217

VI.2.1.1. Electropherograms of PVP in

the presence of anionic azo-dyes…………...…..……. 219

VI.2.1.2. Formation rate of the PVP–CR complexes…………. 222

VI.2.1.3. Application of NECEEM principles

to the interpretation of the electropherograms

of PVP–dye mixtures….........................................…. 223

VI.2.1.4. Influence of MW on the location and shape

of the peak of the PVP–dye complexes…………..…. 226

VI.2.1.5. Determination of the maximal stoichiometry

of the PVP–dye complexes…..…………………...…. 228

XIX

VI.2.1.6. Influence of MW on the mobility of

the PVP–CR complexes at low q values….……...…. 231

VI.2.1.7. Determination of PVP–dye stability constants…....... 233

VI.2.1.8. Analytical applications…………………………...…. 235

VI.3. PVA………………………………………………………..…..…. 239

VI.3.1. Evaluation of MW and tacticity of PVA by

NECEEM of a polymer and a dye………………………..…. 239

VI.3.1.1. Effect of PVA on the UV–Vis absorption

spectrum of CR………………………………..…..…. 241

VI.3.1.2. Selection of working conditions……………….....…. 242

VI.3.1.3. Maximal stoichiometry of the PVA–CR complex

and its relationship with log MW and tacticity….…... 244

VI.3.1.4. Structure of the complex……………………...….…. 247

VI.3.1.5. Influence of Mw and tacticity on

the electrophoretic mobility of the complex…………. 250

VI.3.1.6. Stability and dissociation rate

constants of the complex……………………...….…. 254

Chapter VII – Enzymes…………………………………………….….…. 259

VII.1. Intact enzymes by CE……………………………………..……. 261

VII.1.1. Identification of enzymes for the detergent

industry by CZE of the intact proteins……………..………. 261

VII.1.1.1. CZE with a basic BGE………………………..……. 263

VII.1.1.2. CZE with an acid BGE…………………….………. 264

VII.1.1.3. Relative sensitivities and application to

enzyme identification………………………………. 266

VII.1.1.4. Influence of surfactants commonly used in the

formulation of cleaning products…………….…….. 267

XX

VII.2. Classification of enzymes by MS……........................………….. 269

VII.2.1. Rapid classification of enzymes in

cleaning products by hydrolysis, MS and LDA……………. 269

VII.2.1.1. Mass spectra and normalization of the variables….. 271

VII.2.1.2. Construction of LDA models…………………….…. 272

VII.2.1.3. Evaluation of the prediction capability of

the optimal LDA model………………………….…. 276

VII.3. Classification of enzymes by HPLC-UV-Vis………………...…. 276

VII.3.1. Enzyme class identification in cleaning products by

hydrolysis followed by derivatization with

o-phthaldialdehyde,HPLC and LDA……………...….……. 276

VII.3.1.1. Optimization of OPA–NAC derivatization and

chromatographic conditions………………….……. 278

VII.3.1.2. Data matrices and construction and

evaluation of the LDA models………………………. 280

VII.4. Tryptic digests of enzymes, columns comparation……..………. 284

VII.4.1. Comparison of microparticulate and monolithic

columns for RP-LC of tryptic digests of

industrial enzymes in cleaning products……..……….……. 284

VII.4.1.1. Study of intact enzymes and tryptic digests using

a ProSwift polymeric monolithic column…..….……. 287

VII.4.1.2. Study of tryptic digests of enzymes using

microparticulate and silica monolithic columns...…. 290

VII.4.1.3. Influence of matrixes commonly used

in Cleaning product formulations………….…….…. 295

Chapter VIII – Monolithic columns…………………………….…….…. 297

VIII.1. Monolithic columns of LM……………….………………...…. 299

VIII.1.1. Photo-polymerized LMA monolithic columns

for CEC using LPO as initiator……………………..……. 299

XXI

VIII.1.1.1. Preparation and characterization of

columns photo-initiated with LPO…………...……. 301

VIII.1.1.2. Comparison of LPO and AIBN as

initiators for photo-polymerization……………….. 311

VIII.2. Comparison of photo-initiators for

methacrylate monolithic columns………………………………. 316

VIII.2.1. Comparison on photo-initiators for the preparation

of methacrylate monolithic columns for CEC…...….……. 316

VIII.2.1.1. Preparation and characterization of LM

columns photo-initiated with AIBN or DMPA….…. 317

VIII.2.1.2. Preparation and characterization of LMA

columns photo-initiated with BPO or LPO……..…. 324

Capítulo IX – Conclusiones generales……………………………..……. 329

IX.1. Surfactantes………………………………………………………. 331

IX.1.1. APGs………………………………………….……………. 331

IX.1.1.1. Separación y determinación de APGs

por LC con detección ESI-MS…………...…………. 331

IX.1.1.2. Estudio de fragmentación de la D-Glucosa

y los AMG en presencia de iones de

sodio en IT-MS……………………………...………. 333

IX.1.2. Alcoholes……………………………………………...……. 335

IX.1.2.1. Oxidación de alcoholes no etoxilados y

etoxilado con cromo(VI) y posterior

determinación por ESI-MS…..……………………... 335

IX.1.3. AES…………………………………………………...……. 341

IX.1.3.1. Determinación de FAEs y AESs por separación

mediante SAX, derivatización con un

anhídrido cíclico y LC……………………….………. 341

XXII

IX.2. Polímeros sintéticos………………………………….……..……. 344

IX.2.1. PVP-NO……………………………………………………. 344

IX.2.1.1. Caracterización de PVP-NO por CE y MECK..……. 344

IX.2.2. PVP…………………………………………………………. 347

IX.2.2.1. Caracterización y determinación de PVP

por complejación con un azo-colorante

aniónico seguida de NEECEM…………………...…. 347

IX.2.3. PVA……………………………………………………...…. 350

IX.2.3.1. Evaluación de la MW y tacticidad del PVA

mediante NEECEM de mezclas

polímero-colorante…………………….………….…. 350

IX.3. Enzimas……………………………………………………….…. 354

IX.3.1. CZE………………………………………………...………. 354

IX.3.1.1. Identificación de enzimas de la industria de la

detergencia por CZE de enzimas intactas………...…. 354

IX.3.2. Aminoácidos por infusión directa en MS……………….…. 356

IX.3.2.1. Clasificación rápida de enzimas en productos

de limpieza por hidólisis aminoácidos, MS y LDA…. 356

IX.3.3. Aminoácidos derivatizados con OPA-NAC………….……. 357

IX.3.3.1. Identificación de la clase de las enzimas

presentes en los productos de limpieza

mediante hidrólisis seguida de

derivatización con OPA-NAC, HPLC y LDA………. 357

IX.3.4. Digestos con tripsina………………………………….……. 359

IX.3.4.1. Comparación de columnas microparticuladas

y monolíticas para RP-LC de digestos trípticos de

enzimas industriales en productos de limpieza..……. 359

XXIII

IX.4. Columnas monolíticas……………………………………………. 362

IX.4.1. Columnas monolíticas de LMA para CEC……………...…. 362

IX.4.1.1. Columnas monolíticas de LMA para CEC

utilizando LPO como iniciador……...………...……. 362

IX.4.1.2. Comparación de fotoiniciadores para

la preparación de columnas monolíticas

de metacrilato para CE…......................................…. 364

Capítulo X – Referencias…………………………………………………. 367

Abreviaturas………………………………………………………………. 399

Anexo I

Separation and determination of alkylglycosides by liquid

cromatography with electrospray mass spectrometric detection…. xA3

Anexo II

Study of the fragmentation of D-Glucose and

Alkylmonoglycosides in the presence of sodium

ions in an Ion-Trap Mass Spectrometer…....................................... A13

Anexo III

Chromium(VI) oxide oxidation of non-ethoxilated and

ethoxilated alcohols for determination by electrospray

ionization mass spectrometry………………………………….…. A31

Anexo IV

Characterization of poly(4-vinylpyridine-1-oxide) by

free-solution capillary electrophoresis and

micellar electrokinetic chromatography…….................................. A41

XXIV

Anexo V

Characterization and determination of poly(vinylpyrrolidone)

by complexation with an anionic azo-dye and

nonequilibrium capillary electrophoresis……………………...…. A51

Anexo VI

Evaluation of molecular mass and tacticity of polyvinyl alcohol

by non-equilibrium capillary electrophoresis of

polymer-dye equilibrium mixtures………………………….……. A61

Anexo VII

Rapid classification of enzymes in cleaning products by hydrolysis,

mass spectrometry and linear discriminant analysis………...……. A71

Anexo VIII

Enzyme class identification in cleaning products by hydrolysis

followed by derivatization with o-phthaldialdehyde,

HPLC and linear discriminant analysis……………………..……. A79

Anexo IX

Photo-polymerized lauryl methacrylate monolithic columns

for CEC using lauroyl peroxide as initiator……………...………. A87

Anexo X

Comparison on photo-initiators for the preparation

of methacrylate monolithic columns

for capilary electrochromatography…....................................……. A99

XXV

CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN

Capítulo I. Introducción

3

I.1. Detergentes

I.1.1. Introducción

El jabón es conocido desde las culturas antiguas (egipcios y sumerios),

siendo usado tanto para lavar la ropa como para el aseo personal. Los jabones se

obtenían mediante saponificación de grasas vegetales o animales con cenizas

vegetales o minerales como la sosa cáustica. Hasta el siglo XV, uno de los

principales núcleos de vida social en las ciudades europeas eran los baños

públicos. En los siglos posteriores, los baños fueron considerados inmorales y el

jabón pasó a ser algo a evitar. Se vestía la misma ropa durante semanas y los

malos olores se tapaban con perfumes. En Europa, el jabón no volvió a apreciarse

hasta bien entrado el siglo XVIII, cuando los médicos se dieron cuenta de la

importancia de la higiene para la salud. Por otro lado, la industrialización y las

importaciones de grasas baratas facilitaron la fabricación de jabones a gran escala

[Ramírez-Corrales, 2006].

Los detergentes (en latín, detergere significa limpiar) son mezclas de

diferentes sustancias cuya finalidad es disolver la suciedad o las impurezas de un

objeto sin corroerlo. En 1907, una compañía alemana fabricó el primer

detergente al añadir sales sódicas de perborato, silicato y carbonato al jabón

tradicional [www.ambientum.com]. A partir de 1930 se empezaron a sintetizar

detergentes derivados de la industria del petróleo. Posteriormente se descubrieron

otros ingredientes que daban al conjunto una mayor capacidad limpiadora.

I.1.2. Componentes en las formulaciones de productos de limpieza

Para lograr su papel limpiador, un detergente debe producir numerosos

fenómenos, los cuales dependen del tipo de sustrato y de las condiciones de

lavado. Así, se han diseñado fórmulas específicas capaces de actuar con


4

eficiencia en casos particulares, y fórmulas generales con resultados más o

menos satisfactorios en la mayoría de los casos. En la composición química de

productos de limpieza, además de los surfactantes, que constituyen la principal

materia activa de la formulación, se encuentran aditivos de muy distintos tipos.

La composición difiere en función del uso industrial o doméstico del producto.

En las formulaciones existe un gran número de componentes cuyos papeles se

complementan uno a otro, a menudo con un efecto de sinergia. A continuación se

comentan los diferentes tipos de componentes que se encuentran en

formulaciones de detergentes, así como el papel que éstos desempeñan.

A) Surfactantes

Los surfactantes actúan como agentes humectantes del sustrato, modifican

la tensión superficial del agua y emulsionan las partículas de suciedad. En

algunas aplicaciones se usan las propiedades bactericidas de ciertos surfactantes

en formulaciones desinfectantes [Showell, 2006].

B) Agentes secuestrantes (builders)

Estos agentes tienen como propósito mejorar la acción limpiadora del

surfactante mediante varios efectos. Su principal acción es secuestrar los cationes

divalentes del agua dura (calcio, magnesio) para evitar su interacción con los

surfactantes. La eliminación se hace en forma soluble (quelato), por

precipitación, o por intercambio iónico. Otra de las acciones de los “builders” es

mantener el pH de la disolución del detergente a un valor alcalino, neutralizar los

ácidos grasos libres y formar jabones in-situ en la interfase. También aumentan el

potencial (negativo) de superficie de los textiles y de las manchas, y por tanto,

inhiben la redeposición de la suciedad. Dentro de los agentes secuestrantes se

encuentran los compuestos inorgánicos solubles, como el tri(poli)fosfato


5

(Na5P3O10) y el pirofosfato (Na4P2O7) sódicos, así como los silicatos (xNa2O –

ySiO2) y el carbonato sódico (Na2CO3). Por su parte, los compuestos inorgánicos

insolubles, como las zeolitas (alumino-silicatos naturales o sintéticos), como el

aluminosilicato sódico (Na2O – Al3O3 – 2SiO2 – xH2O) eliminan los cationes

divalentes por intercambio iónico [Showell, 2006].

C) Jabones como agentes dispersantes de calcio

Muchas formulaciones detergentes líquidas y en polvo para lavadoras

contienen sales alcalinas de ácidos grasos, es decir jabones, cuyo papel es reducir

la formación de espuma. Los jabones tienen excelentes propiedades limpiadoras,

son seguros y fácilmente biodegradables; sin embargo, son muy sensibles a los

cationes divalentes, especialmente al calcio, con el cual producen sales insolubles

en agua. Los agentes dispersantes de jabones de calcio son surfactantes aniónicos

o anfóteros que se co-micelizan con los jabones para formar disoluciones que no

precipitan en aguas duras [Salager, 1988].

D) Agentes antirredeposición

Estas sustancias impiden que las suciedades separadas de los tejidos

durante el lavado vuelvan a depositarse sobre los mismos. Los agentes

antirredeposición más utilizados son la carboximetilcelulosa, y otros derivados

no iónicos de la celulosa. Comercialmente también se utilizan polímeros

sintéticos como PVP, PVA y algunos copolímeros de éstos [Salager, 1988].

E) Agentes espumantes y no espumantes

Contrariamente a la creencia general, la producción de espuma no tiene

nada que ver con el poder detergente. En ciertos usos, como champús o

detergentes para las manos, la generación de grandes volúmenes de espuma es un


6

factor deseable. Son muchos los surfactantes capaces de generar y mantener la

espuma en ausencia de suciedad, sin embargo, ésta fácilmente desaparece en

presencia de suciedad, especialmente en presencia de grasa. Para mantener la

espuma a lo largo del uso del detergente se añaden agentes espumantes como el

lauril sulfato sódico, y surfactantes no iónicos nitrogenados [Salager, 1988;

Showell, 2006]. Sin embargo, en otras aplicaciones, la generación de espuma es un

inconveniente. Por ejemplo, en los lavavajillas, un elevado volumen de espuma

puede interferir en la rotación del brazo, provocando una degradación del

rendimiento. En estos casos se utilizan agentes no espumantes y antiespumantes,

que evitan la formación o aceleran la desaparición de la espuma. Entre los

agentes utilizados para el control de la espuma suelen emplearse surfactantes

etoxilados no iónicos y jabones, y antiespumantes compuestos por partículas de

sílice coloidal en suspensión, junto con aceites de silicona (polidimetil siloxano)

[Salager, 1988; Showell, 2006].

F) Agentes blanqueadores

La obtención de blancura en textiles es quizás una de las propiedades más

importantes para el consumidor. En el mercado existen dos tipos de agentes

blanqueadores para textiles, ambos con propiedades oxidantes: los hipohaluros,

como el hipoclorito de sodio, y las sales inorgánicas peroxigenadas, como el

perborato de sodio y el peróxido de sodio estabilizado con carbonato sódico

(percarbonato). Los agentes blanqueadores oxidantes deben ser intrínsecamente

inestables para cumplir con su función (oxidar), paradójicamente, al mismo

tiempo deben ser estables cuando están almacenados, solos o en la mezcla

detergente. El hipoclorito es un agente blanqueador más activo y agresivo que el

perborato, siendo particularmente eficaz en la oxidación de sustancias que

contienen nitrógeno. Además de poseer una acción blanqueadora (aún a baja


7

temperatura), es un efectivo bactericida. Por su acción sobre las sustancias

nitrogenadas no puede conservarse en forma de polvo o de líquido en

formulaciones detergentes que contengan sales de amonio, aminas, amidas, etc.

Por ello se suele emplear como un ingrediente aparte. Respecto a las sales

inorgánicas preoxigenadas, se usa el perborato de sodio tetrahidrato

(NaBO3·4H2O), el percarbonato o carbonato de sodio peroxihidrato

(2Na2CO3·3H2O2), y el peroximonosulfato de potasio (KHSO5). El perborato y

otras sales semejantes exhiben una acción blanqueadora menos agresiva que el

hipoclorito, y son sólidos compatibles con la gran mayoría de los componentes

de los detergentes en polvo [Salager, 1988; Showell, 2006].

G) Blanqueantes ópticos

El grado de blancura obtenido mediante agentes blanqueadores se puede

exaltar mediane el blanqueado óptico. Los blanqueadores ópticos son colorantes

orgánicos poliaromáticos que absorben luz ultravioleta y emiten una luz azulada

en el visible mediante fluorescencia. A la luz del sol, añaden un tono azulado que

compensa el tono amarillento de los tejidos, por lo que mejora la blancura o

“profundidad” de los colores. Según la función a la que se destinen, poseen

grupos polares más o menos importantes para adsorberse sobre fibras hidrofílicas

como el algodón, o hidrófobas como el poliéster. Se han desarrollado agentes

fluorescentes solubles en agua y resistentes al hipoclorito u otros blanqueadores,

gracias a que los átomos de nitrógeno de dichas sustancias están situados en

estructuras altamente aromáticas de tipo benzotriazol o benzofurano [Salager,

1988].


8

H) Suavizantes

Después de un lavado con detergentes sintéticos formulados con agentes

secuestrantes, el textil seco presenta una superficie que no es agradable al

contacto con la piel. El residuo de los surfactantes sintéticos adsorbidos aumenta

la carga estática de las fibras, y la ausencia de sustancias con acción lubricante

vuelve al textil relativamente rígido. Los agentes suavizantes contrarrestan

ambos fenómenos, ya que por una parte reducen la carga estática, y por otra

depositan una capa lubricante. Muchos surfactantes catiónicos producen estos

efectos, pero son incompatibles con los surfactantes aniónicos utilizados en la

mayoría de las formulaciones, por lo que deben usarse por separado. Los mejores

suavizantes de este tipo son las sales de alquil amonio cuaternario y de

imidazolio. Existe una tendencia hacia la producción de formulaciones que

contengan agentes suavizantes compatibles con los agentes limpiadores. Estos

suavizantes son surfactantes con cierto carácter catiónico que se absorben sobre

las fibras textiles, siendo a la vez compatibles con surfactantes aniónicos

comúnmente empleados. Para este fin se usan surfactantes no iónicos con un

grupo nitrogenado, o también algunos surfactantes anfóteros, normalmente

conteniendo un grupo amido-amina (que también actúan como dispersantes de

jabones de calcio) [Salager, 1988; Showell, 2006].

I) Enzimas

Se utilizan uso en las formulaciones de detergentes para eliminar las

manchas, gracias a la rotura catalítica de componentes específicos de las mismas.

Las proteasas, encargadas de la degradación de las proteínas, son las más

comunes en la mayoría de los detergentes. Sin embargo, también se emplean

otras enzimas como las amilasas (degradan el almidón), lipasas (degradan

lípidos) y celulasas (degradan la celulosa). Estas enzimas son capaces de


9

degradar rápidamente manchas en un medio de pH alcalino y a temperaturas de

hasta 60°C. Están diseñadas para ser activas a temperatura ambiente, siendo

particularmente utilizadas en detergentes líquidos [Salager, 1988; Showell, 2006].

J) Polímeros

El uso de polímeros ha ido aumentando a medida que las formulaciones de

detergentes han evolucionado. Los polímeros han venido a sustituir a los fosfatos

que fueron cayendo en desuso a causa de su elevado impacto ambiental. Se han

usado principalmente polímeros de tipo poliacrilato, con el fin de remplazar a

agentes secuestrantes como el tripolifosfato de sodio. La carboximetilcelulosa

fue también uno de los primeros polímeros utilizados para este fin. Los éxitos

obtenidos con los polímeros para otros propósitos ha impulsado la aparición de

un gran número de éstos [Zini, 1999]. Entre otros muchos usos, se han

comercializado nuevos dispersantes y polímeros que inhiben la transferencia de

color entre los tejidos. Por cada polímero comercializado, existen otros muchos

patentados, lo que pone de manifiesto el interés dentro de este área [Showell, 2006;

Watson, 2006].

K) Espesantes

A menudo es conveniente modificar la reología, es decir, la consistencia

de la formulación del detergente en condiciones dinámicas, lo que tiene

importantes consecuencias prácticas. Así por ejemplo, los lavavajillas contienen

espesantes que ayudan a mantener en suspensión el fosfato y otras sustancias que

de otra forma quedarían separadas de la fase líquida. El espesado puede

conseguirse a partir de electrolitos inorgánicos, como por ejemplo, NaCl, arcillas

como la laponita o hectorita, o polímeros de un elevado peso molecular como la

carboximetilcelulosa y las gomas de guar o xantana. Existen polímeros


10

particularmente efectivos como espesantes en las formulaciones de detergentes

para uso doméstico. Por ejemplo, los modificadores reológicos de la serie

Carbopol® (Lubrizol) han demostrado ser excepcionales viscosantes, agentes de

suspensión y estabilizadores en una gran variedad de productos de cuidado

personal. La mayoría de estos polímeros son homo- y copolímeros de ácido

acrílico de alta masa molecular, entrecruzados con un polialquenil poliéter

[Showell, 2006].

L) Perfumes

En un sentido técnico los perfumes no añaden un mayor poder detergente

a los formulados, sin embargo, desde el punto de vista del consumidor

representan un factor importante, ya que según el aroma parece que el detergente

funcione mejor. El olor es una característica que debe ser cuidadosamente tratada

en la formulación de los detergentes para la aceptación del producto por parte de

los consumidores. Los perfumes son complejas mezclas de compuestos

orgánicos, por ejemplo, el perfume de un detergente puede estar compuesto por

30, 50 o incluso más de 100 compuestos. Esta compleja naturaleza puede dar

lugar a complejas interacciones con el resto de componentes del detergente, que

pueden afectar tanto al perfume como a las sustancias activas. En detergentes de

uso doméstico, particularmente para lavavajillas y desinfectantes, se incorporan

perfumes, la mayoría de los cuales son terpenos, cuyo esqueleto está compuesto

de 2, 3 ó más unidades del isopreno (2-metil-butadieno) [Salager, 1988; Watson,

2006].


11

M) Disolventes

La selección de los disolventes empleados en las formulaciones de

detergentes depende de la naturaleza de las sustancias activas presentes en los

formulados, de la aplicación final del detergente y del factor económico. El agua

es el disolvente más ampliamente empleado en muchas de las formulaciones de

detergentes para uso doméstico e industrial. Sin embargo, muchas de las

sustancias activas comúnmente empleadas en formulación de detergentes

presentan una limitada solubilidad en agua, por lo que se requiere la adición de

un co-solvente (como el etanol) o de un hidrótopo (como el cumeno sulfonato)

[Showell, 2006].

N) Hidrótopos

En los detergentes líquidos, en ocasiones es necesario incluir hidrótopos

para garantizar la estabilidad del detergente en un amplio intervalo de

temperaturas. Los hidrótropos son sustancias hidrofílicas con un grupo apolar,

cuya función es aumentar la solubilidad de los surfactantes en formulaciones

líquidas. Los hidrótropos no tienen propiedades surfactantes por ellos mismos,

pero actúan como co-solubilizadores a alta concentración. Los más utilizados son

los sulfonatos de tolueno, etilbenceno y xileno [Salager, 1988; Showell, 2006].

O) Bactericidas

Ciertas fórmulas desinfectantes contienen bactericidas, los cuales pueden

ser surfactantes anfóteros que actúan también como agentes dispersantes de

jabones de calcio. También se usan compuestos catiónicos que presentan un

efecto suavizante por sus propiedades antiestáticas. Los desinfectantes pueden

también contener productos clorados bactericidas y sustancias con propiedades

desodorantes [Salager, 1988]. En los detergentes líquidos, especialmente en los


12

más diluidos, donde el agua constituye una gran parte del volumen total del

producto, es normal que la formulación incluya un agente antibacteriano

(normalmente un bacteriostático) que alargue el tiempo de vida del producto

[Watson, 2006].

P) Agentes anticorrosión

En las formulaciones de detergentes también se pueden encontrar agentes

anticorrosión, con el objetivo de proteger las partes metálicas de las máquinas o

sistemas de lavado. Generalmente, se usa el silicato de sodio que además posee

un papel secundario como “builder” [Salager, 1988].

I.2. Surfactantes


La palabra surfactante deriva de la contracción de los términos surface-

active-agent (superficie-activo-agente) y engloba a una serie de especies

químicas capaces de modificar las propiedades de las interfases de los líquidos

(acuoso o no acuoso) en los que están presentes. Las propiedades características

de estas moléculas residen en su carácter anfifílico, esto es, de la presencia de

una parte hidrofílica y otra hidrofóbica en la molécula. Los surfactantes se

concentran en la superficie libre del líquido y en las interfases entre fases

inmiscibles, disminuyendo la tensión superficial. El cambio en la tensión

superficial afecta a la capacidad para formar emulsiones, a la mojabilidad, al

poder dispersante, a la detergencia y a las propiedades solubilizantes.

Los surfactantes poseen una estructura molecular típica, esencialmente

lineal y asimétrica, con dos zonas, una hidrofóbica y la otra hidrofílica. La parte

hidrófobica es una cadena alifática, lineal o ramificada, conteniendo en general


13

entre 10 y 18 átomos de carbono. En los productos naturales y en los de

transformación química predominan las cadenas no ramificadas, mientras que en

los derivados del petróleo y los obtenidos por síntesis (usualmente a partir del

carbón) existen multitud de cadenas ramificadas. Por su parte, el resto hidrófilo,

determinante de la solubilidad en agua, puede ser un grupo polar de carácter

ácido tal como un grupo sulfato, sulfonato o carboxilato, o de carácter básico

como una amina, una sal de amonio cuaternario o el ion piridinio, aunque

también puede ser un grupo polar no iónico. Los surfactantes, ya sean naturales o

sintéticos, organizan el medio formando micelas y otras microestructuras,

cambian la solubilidad de compuestos hidrofóbicos y modifican el entorno de los

constituyentes del medio. Sobre las propiedades surfactantes de un compuesto

influyen, además de la propia naturaleza del grupo hidrófilo, la situación que éste

ocupa en la molécula. En principio se puede distinguir:

Posición terminal: la estructura molecular es polar y totalmente asimétrica. El

grupo hidrófilo puede estar unido directamente al hidrófobo, o entre ambos

puede existir un resto de carácter alifático o aromático que posea cierto carácter

hidrófilo. Si la cadena hidrófoba tiene una longitud adecuada, estas estructuras

muestran básicamente carácter detergente.

Posición central: el grupo hidrófilo se intercala en cualquier punto de la cadena

hidrófoba, aunque si en ella existen puntos reactivos (enlaces dobles, grupos

hidroxilo, etc.) tiende a ocupar esos lugares. Conforme el grupo hidrófilo está

más centrado en la cadena, más mermada se encuentra la capacidad detergente

del compuesto.

Varios grupos hidrófilos: en una cadena pueden estar presentes varios grupos

hidrófilos, lo que exalta notablemente la solubilidad del surfactante en agua. Sin

embargo, esta estructura proporciona propiedades dispersantes al surfactante.


14

I.2.2. Clasificación de los surfactantes

Atendiendo a su carga, los surfactantes pueden dividirse en cuatro clases:

aniónicos, catiónicos, no iónicos y anfotéricos [Oldenhove de Guertechin, 1999].

Aunque todos los surfactantes en sí mismos presentan sus particularidades, hay

algunas características comunes a cada clase.

A) Aniónicos

Se caracterizan por tener un grupo hidrófilo cargado negativamente, es

decir, el grupo hidrófilo tiene carácter ácido y forma fácilmente un anión. Los

más antiguos y conocidos son los jabones. Los surfactantes aniónicos son los más

utilizados y han sido considerados como “el caballo de batalla” en el mundo de

los detergentes. En consecuencia, su producción es elevada, siendo además muy

económicos. Suelen distinguirse las siguientes familias: ABS, AS, AES, APES,

AOS, alquil sulfonatos, α-sulfonatos de ácidos grasos (iónicos y ésteres de

alquilo), mono- y di-alquil sulfosuccinatos y sulfonatos derivados del petróleo

(Fig. I.1).

Los surfactantes aniónicos son especialmente beneficiosos en cuanto a su

acción limpiadora, que se apoya en el hecho de que muchas superficies se

encuentran cargadas negativamente, por lo que no pueden quedarse adsorbidos

sobre las mismas, impidiendo así la redeposición de sustancias indeseables. En

función de la naturaleza del grupo funcional que presenta la carga, muestran una

resistencia variable hacia la hidrólisis. Así por ejemplo, los sulfatos se hidrolizan

con facilidad, mientras que los sulfonatos son muy estables. Algunos surfactantes

aniónicos, presentan la propiedad de generar fases acuosas viscosas, pudiendo ser

empleados como espesantes. Una limitación de los surfactantes aniónicos es su

tendencia a precipitar en presencia de iones calcio y magnesio, que abundan en

las aguas duras, si bien, los AESs son mucho menos sensibles a los cationes


15

alcalinos que los ASs. Por otro lado, la baja solubilidad y las particulares

propiedades de las interfaces de los precipitados de sulfato de magnesio son

explotadas de forma positiva a la hora de optimizar el rendimiento de los

detergentes.

CH3(CH2)nCOO- Na+

n + 1 = 10 – 18

Jabones

SO3- Na+CH

CH3(CH2)m

CH3(CH2)n

n + m= 7 – 11

ABSCH3(CH2)nOSO3

- Na+

n + 1 = 12 – 18

ASCH3(CH2)n(OCH2CH2)mOSO3

- Na+

AES

(OCH2CH2)mOSO3- Na+OR

m = 1 – 8 R: cadena alquílica

APES

CH3(CH2)nCH CH(CH2)mSO3- Na+

m+ n = 9 – 15

AOS

CH3(CH2)nSO3- Na+

Alquil sulfonatos

ROOCCH SO3- Na+

ROOCCH

Alquil sulfosuccinatos

Fig. I.1. Estructura y nomenclatura de las principales familias de

surfactantes aniónicos.

B) Catiónicos

Los surfactantes catiónicos tienen el grupo hidrófilo de carácter básico.

Suelen agruparse en derivados grasos de amida, amidoaminas, imidazolinas,

derivados del petróleo, nitrilos cíclicos alifáticos, aromáticos, compuestos no

nitrogenados, poliméricos catiónicos y óxidos de amina. En la Fig. I.2 se muestra

la estructura y nomenclatura de las principales familias de surfactantes

catiónicos.


16

CH2NH+

CH3

CH3

(CH2)nCH3

n + 1 = 7 – 18

Sales de alquilbencildimetilamonio

NH+

CH3

CH3

(CH2)nCH3

n + 1 = 7 – 18

Sales de alquilfenildimetilamonio

N+

CH3

CH3

CH3R1 N+

CH3

R2

CH3R1

R1, R2: cadenas alquílicas

Sales de alquil trimetil y dialquildimetil amonio

N+ (CH2)nCH3

n + 1 = 12 – 14

Sales de alquil piridinio


surfactantes catiónicos.

Los surfactantes catiónicos de importancia industrial son compuestos

grasos nitrogenados y, especialmente, compuestos con nitrógeno cuaternario

[Wittcoff, 1987]. Son de poca utilidad en procesos de limpieza, ya que al presentar

la mayoría de las superficies carga negativa, los cationes se retienen sobre ellas

en lugar de solubilizar la suciedad adherida. Sin embargo, y debido a estas

mismas propiedades, poseen numerosas aplicaciones especializadas. Por

ejemplo, las aminas y los compuestos cuaternarios inhiben el crecimiento de

microorganismos como bacterias y algas. Además las aminas grasas primarias y

las aminopropilaminas grasas se utilizan como inhibidores de la corrosión, y en

la limpieza de metales, cuando se utiliza HCl para disolver el óxido. La amina se

orienta en la interfase entre el metal y la disolución ácida, con las colas

hidrófobas comprimidas entre sí, formando una capa protectora de una o dos

moléculas de espesor. Esta capa es tan cerrada que evita el ataque del metal

limpio por parte del exceso de ácido. Otra aplicación más de los compuestos

grasos nitrogenados, y que depende de la actividad de la superficie y orientación


17

de los iones del surfactante, es el suavizado de textiles. El surfactante catiónico

se adsorbe y orienta en la interfase formada entre el textil y el agua. También,

tienen afinidad por la superficie del cabello, utilizándose como acondicionadores

y suavizantes en productos que se aplican después del lavado, para contrarrestar

así el efecto apelmazante de los surfactantes aniónicos.

C) No iónicos

En esta clase de surfactantes, el grupo hidrófilo no es capaz de ionizarse y

formar sales. Los surfactantes no iónicos son especialmente útiles por su baja

susceptibilidad a los iones Ca2+ y Mg2+ del agua dura. Aprovechando su

compatibilidad con especies iónicas, se suelen mezclar con surfactantes

aniónicos, dando lugar a asociaciones beneficiosas. Por ejemplo, los surfactantes

no iónicos ayudan a solubilizar las sales de calcio o magnesio de los surfactantes

aniónicos. El balance entre la parte hidrofílica e hidrofóbica en estos surfactantes

se obtiene teniendo en consideración la cantidad y naturaleza de las unidades

polares y la parte hidrofóbica de la molécula (longitud de la cadena

hidrocarbonada). La parte hidrófila de la molécula es casi siempre una cadena de

unidades de EO. Los grupos éter le proporcionan la polaridad necesaria para

garantizar su solubilidad en agua por aceptación de puentes de hidrógeno. Los

FAEs son los surfactantes no iónicos más empleados en productos de limpieza,

cosméticos, herbicidas, etc. Los APEs, principalmente OPEs y NPEs, también

poseen una cadena de unidades de EO, pero a diferencia de los FAEs, absorben

en el UV. La aplicación de los APEs en detergentes está sometida a restricciones

legales, debido a la difícil eliminación biológica (escasa biodegradabilidad) de

los metabolitos más hidrófobos, concretamente, alquifenoles no etoxilados y

monoetoxilados. Los FAEs lineales se biodegradan más rápidamente que los

APEs. Además, tienen mejores propiedades de detergencia que los ABS sobre


18

muchos tipos de suciedad y sobre la mayoría de las telas, y son especialmente

eficaces para eliminar la grasa de las fibras sintéticas. También actúan bien en

frío, por lo que actualmente aparecen en las formulaciones de los detergentes

domésticos como uno de sus principales y más ferecuentes componentes. Los

derivados de aminas, amidas (FAA) y ésteres de ácidos grasos, son también

bastante empleados en productos de aseo corporal. Así por ejemplo, la

dietanolamida de coco posee buenas propiedades espumantes, estabilizando la

espuma de los surfactantes aniónicos. Finalmente, los surfactantes no iónicos a

base de azúcares (APGs) tienen una biodegradabilidad sumamente rápida, baja

toxicidad y alta tolerancia desde el punto de vista dermatológico. Además,

pueden elaborarse a partir de materias primas naturales. En la Fig. I.3 se muestra

la estructura y nomenclatura de las principales familias de los surfactantes no

iónicos.

CH3(CH2)nO(CH2CH2O)mH

FAEs(CH2CH2O)mHOR

m = 2 – 100

APEs

RCHN

O

(CH2CH2O)mH

(CH2CH2O)nH

R: cadena alquílica

FAAs

OHOHO

OH

HOH2C

O

OOHO

OH

HOH2C

m

(CH2)nCH3

n = 8 – 18 m = 0 – 3

APGs


surfactantes no iónicos.


19

D) Anfotéricos

Finalmente las moléculas que tienen simultáneamente grupos con carácter

ácido y básico son surfactantes anfóteros o iones dobles. Son compuestos con

una estructura con una carga positiva y otra negativa simultáneamente sobre la

misma molécula. Algunos de estos compuestos tienen grupos ácidos o básicos

débiles, por lo que pueden comportarse como aniónicos o catiónicos en función

del pH. Usualmente se emplean junto con otros surfactantes (aniónicos o

catiónicos) para resaltar las propiedades deseadas, como puede ser la detergencia

o la formación de espuma. Son especialmente utilizados en la formulación de

productos de aseo personal (gel de baño, champús, etc.) por su suavidad y

compatibilidad con la piel, siendo menos irritantes que los surfactantes catiónicos

y aniónicos. La formulación de estos productos es complicada por la posible

precipitación del surfactante anfótero cuando el pH está próximo a su punto

isoeléctrico. Pueden utilizarse, junto con NaOH, en limpiadores alcalinos para

superficies grasas, y como limpiadores ácidos junto con HCl para superficies

oxidadas, debido a que son estables y funcionales en un amplio intervalo de pH.

Un número importante de surfactantes anfóteros son compuestos naturales

ampliamente conocidos, como por ejemplo la lecitina. Una familia adicional de

surfactantes anfóteros que presentan un grupo amonio cuaternario son las

alquilbetaínas (Fig. I.4).

N+CH2COO-

CH3

R

CH3C17H35COOCH2

CH2OPCH2CH2N+CH3

CH3

CH3

O-

O

C17H35COOCH2

LecitinaR: cadena alquílica

Alquil betaínas


surfactantes anfotéricos.


20

I.2.3. APGs

Los APGs son surfactantes no iónicos obtenidos a partir de materiales

renovables (glucosa y ácidos grasos) [Koch, 1993; Balzer, 1996; Hill, 1997; Rybinski,

1998; Balzer, 2000; Biermann, 1993]. Se obtienen a partir de la alquilación de

cadenas cortas de glucósidos procedentes de la alcoholisis ácida de polisacáridos

como el almidón. Para su producción se han estudiado dos vías, la síntesis directa

o un proceso de transacetalización en dos pasos [Varvil, 2009]. Los oligómeros se

distinguen por la longitud de la cadena de alquilo, el número de unidades de

glucosa y la isomería [Oldenhove de Guertechin, 1999]. En la Fig. I.5 se muestran

los efímeros de anillo de los alquilmonoglucósidos.

Alquil-α-D-glucopiranósido

Alquil-β-D-glucofuranósido

Alquil-β-D-glucopiranósido

Alquil-α-D-glucofuranósido

OH

OHOHC

H

H

OH H

H

CH2OH

OCnH2n+1

1

23

45

6

OH

OHOHC

H

H

OH H

H

CH2OH

OCnH2n+1

1

23

45

6

O

H

H

H

H

H

HO

OH

CH2OH

OHOCnH2n+1

1

23

45

6O

H

H

H

HH

HO

OH

CH2OH

OH

OCnH2n+1

1

23

45

6

Fig. I.5. Estructura de los epímeros e isómeros del anillo de los

alquilmonoglucósidos.

Tres tipos de isomería están presentes en los APGs: estereoisomería

(epímeros α-y β-), isomería del anillo (unidades de glucósido, que pueden ser

glucopiranósidos o glucofuranósidos), y con excepción de los AMGs, isómeros

de posición (con predominio de las uniones interglucosídicas 1,4 - y 1,6- [Beneito-


21

Cambra, 2007]). Los diferentes oligómeros se pueden abreviar como CnGm,

donde n es el número de átomos de carbono en la cadena alquílica, y m el número

de unidades de glucosa. Cuando es necesario distinguir entre piranósidos y

furanósidos, en la presente memoria se emplea una "p" o una "f", al igual que se

añadirá α- ó β- para distinguir entre los diferentes epímeros, así por ejemplo, α-

C8G1p, hace referencia al oligómero α-octilmonoglucopiranósido.

A) Propiedades y aplicaciones

Los APGs se sintetizan controlando las condiciones para obtener

principalmente estructuras donde la cadena glucosídica presente un DP

comprendido entre 1,2 y 1,7 unidades, y cadenas alquílicas que se hallen en el

intervalo de 8 a 14 átomos de carbono [Willing, 2006]. Se obtienen así mezclas

industriales muy complejas que contienen principalmente AMGs, con cantidades

importantes de alquildiglucósidos y menos importantes de otros APGs [Oldenhove

de Guertechin, 1999]. La presencia de numerosos grupos hidroxilo en las

moléculas de glucosa asegura la completa solubilidad de la molécula en agua

[Partearroyo, 1991]. Los APGs con 16 o más átomos de carbono en la cadena

alquílica son menos importantes, ya que son insolubles en agua cuando su DP es

inferior a 2, siendo solubles cuando está por encima de 5 [Willing, 2006].

Además de la buena solubilidad en agua, presentan puntos de nube

(temperatura a la que los surfactantes se separan en dos fases) a temperaturas

generalmente superiores a 100ºC; son poco sensibles a la presencia de

electrolitos y raramente se ven influenciados por los cationes presentes en aguas

duras [Oldenhove de Guertechin, 1999]. Este tipo de surfactantes son buenos

emulsificantes, especialmente para moléculas como los aceites naturales y las

grasas. Los APGs proporcionan buenas propiedades de mojado y formación de

espuma, siendo sus propiedades espumantes superiores a la de los alcoholes


22

etoxilados [Oldenhove de Guertechin, 1999]. Por estas propiedades favorables, así

como por la sinergia con otros surfactantes, y compatibilidad tanto

medioambiental como dermatológica [Willing, 2006], son ampliamente utilizados

en productos de limpieza e higiene personal [Balzer, 1996; Rybinski, 1998;

Biermann, 1993; García, 1997; Uppgard, 2000], aunque también se han utilizado en

la industria del petróleo y del gas [McGregor, 2004].

B) Métodos de análisis

Dado que los APGs se están convirtiendo en unos surfactantes cada vez

más interesantes por los diversos aspectos comentados anteriormente, tiene

interés el desarrollo de métodos para su caracterización y cuantificación [Thiele,

2005]. La cantidad total de APGs se puede determinar por hidrólisis seguida de

derivatización con antrona (9,10-dihidro-9-cetoantraceno) y colorimetría

[Buschmann, 1995; Buschmann, 1996-B], valoración potenciométrica [Buchmann,

1996-A], espectrometría de infrarrojo cercano [Kim, 2001] e hidrólisis enzimática

[Kroh, 1999]. Los APGs se han determinado en muestras ambientales mediante

hidrólisis, seguida de destilación de los alcoholes y derivatización [Meissner,

1999]. Para la concentración de los APGs de muestras de agua se emplean

cartuchos de SPE C18, utilizando metanol para la elución de los mismos [Steber,

1995]. Se han descrito separaciones utilizando TLC con fases C8 y C18

[Buschmann, 1996-B; Buchmann, 1996-A; Buschmann, 1996-C; Spilker, 1996; Klaffke,

1998]. Los isómeros de los APGs pueden separarse sin derivatizar mediante GC a

alta temperatura, o bien, con una sililación previa [Rybinski, 1998; Buchmann, 1996-

A; Spilker, 1996; Billian, 1998]. Las formas piranósidas y furanósidas pueden

distinguirse por los diferentes fragmentos obtenidos mediante GC-MS [Billian,

1998]. Se ha empleado también MEKC con detección electroquímica para la

determinación de APGs en champú [Hübner, 2006]. Se han descrito distintos

procedimientos de HPLC con derivatización post-columna y detección


23

fotométrica [Kramer, 1992], refractométrica [Klaffke, 1998], ELSD [Buschmann,

1996-B; Buchmann, 1996-A; Lafosse, 1992; Czichocki, 2002; Armari, 2003] o por MS

[Czichocki, 2002; Eichhorn, 1999; Klaffke, 1999; Kühn, 2004]. Se ha descrito el

comportamiento cromatográfico de los alquilglucopiranósidos en columnas C8,

C18, fenil y PVA [Lafosse, 1992], y se han realizado estudios comparativos

empleando columnas de sílice, C18 y PVA [Czichocki, 2002]. Eichhorn y Knepper

[Eichhorn, 1999] utilizaron HPLC-MS con ESI para determinar APGs en aguas

fluviales y residuales fortificadas. Utilizando una columna C18 y elución en

gradiente con ACN/agua, es posible resolver los epímeros α- y β- y los isómeros

de anillo. Los alquilglucopiranósidos pueden distinguirse de los

alquilglucofuranósidos por su distinta afinidad por el +4NH . Kuhn y Neubert

[Kühn, 2004] usaron HPLC-ESI-QTOF-MS con una columna C18, fase móvil

MeOH/agua y elución en gradiente para caracterizar mezclas industriales de

APGs; sin embargo, no llegaron a resolver los isómeros.

C) Estudios de fragmentación de glucosa y oligosacáridos

Las técnicas de fragmentación como el CID son poderosas herramientas

para la elucidación estructural de oligosacáridos. Con este fin se han empleado

iones alcalinos y iones amonio [Harvey, 2000-A; Harvey, 2000B; Chiarelli, 1987;

Cancilla, 1999; Harvey, 1997; Harvey, 1994; Kováčik, 1995; Penn, 1996; Asam, 1997],

cationes divalentes [Harvey, 2001; Madhusudanan, 2005] y sales de hierro [Carlesso,

2000; Carlesso, 2001], sin embargo, las fragmentaciones con mayor sensibilidad y

las que más información permiten obtener son aquéllas que emplean iones sodio

y calcio [Harvey, 2000-A; Harvey, 2000-B; Harvey, 2001]. La fragmentación de los

oligosacáridos también se ha estudiado utilizando ITMS [Zaia, 2004], y también

se han realizado análisis de carbohidratos mediante MALDI-MS [Harvey, 2006].


24

Al emplear bajas energías de fragmentación, y de acuerdo con la

nomenclatura de Domon-Costello [Zaia, 2004; Domon, 1988], la rotura de los

enlaces glucosídicos produce principalmente fragmentos B e Y (Fig. I.6) [Asam,

1997; Creaser, 2002]. Todas las uniones secuenciales de polisacáridos lineales o

ramificados pueden analizarse a partir de los fragmentos [Asam, 1997; Harvey,

2001; Zaia, 2004]. Por su parte, la utilización de altas energías de fragmentación

produce roturas de anillo, lo cual proporciona información adicional de las

uniones [Harvey, 2000-A; Harvey, 2000-B; Harvey, 2001; Cancilla, 1999; Asam, 1997;

Zaia, 2004; Creaser, 2002].

O

HO

OH

CH2OH

OH

O

1

23

4

56

CnH2n+10,2A

0,2X

Terminación reductora

Y0

Z0

B1 C1

OH

OHO

OH

CH2OH

1

23

4

5

6

O CnH2n+1

Fig. I.6. Estructura de los α-epímeros de AMGp (izquierda) y AMGf

(derecha). Se indican ejemplos de la nomenclatura de las fragmentaciones.

Los enlaces del anillo están numerados en el sentido de las agujas del reloj

comenzando por cero tras el oxígeno. En los β-epímeros, a diferencia de

los α-epímeros, los grupos –H y –OR en el átomo de carbono 1 están

invertidos.

En cuanto a los espectros CID de monosacáridos y sus derivados, se han

demostrado diferencias estereoquímicas de monosacáridos en presencia de Zn2+

[Gaucher, 1998] y ion cloruro [Carlesso, 2000]. También se han distinguido

isómeros posicionales y diastereoisómeros de monosacáridos sulfatados

[Minamisawa, 2005] y se han comparado los espectros de la D-glucosa y 2-

fluorodesoxiglucosa [Macášek, 2003]. Utilizando el espectro de CID, varias

pentosas y hexosas, incluyendo sus esteroisómeros, pueden diferenciarse en


25

función de la competición en los procesos de fragmentación [March, 2005].

Berman y colaboradores utilizaron el análisis multivariante de los datos de TOF-

SIMS para distinguir entre varias furanosas, así como entre varias piranosas

[Berman, 2006]. Sin embargo, la fragmentación CID ha sido poco utilizada para

distinguir isómeros de anillo. El tamaño del anillo de la última unidad en el

extremo no reductor de los oligosacáridos se ha relacionado con la abundancia de

los iones [M + Na-90]+ y [M + Na-104]+ en el espectro CID [Kováčik, 2001].

Usando TOF-SIMS, los monosacáridos con anillos de cinco miembros fueron

más estables que los correspondientes de seis miembros, dando diferentes

perfiles de pico en la fragmentación [Berman, 2006].

I.2.4. Alcoholes no etoxilados y etoxilados

Los alcoholes primarios son componentes comunes en muchas muestras,

tanto biológicas como industriales, además de estar presentes a nivel de trazas en

el medio acuático. Los alcoholes grasos se obtienen mediante la hidrogenación

catalítica de los ácidos grasos correspondientes o de sus ésteres. La industria

actualmente se concentra en la hidrogenación de ésteres de alcoholes grasos y

ácidos grasos. Debido a que los aceites y grasas usadas como materia prima son

una mezcla de ácidos grasos de distinta longitud de cadena, se obtienen como

productos alcoholes de número de carbonos variable [Sad, 2007]. Los alcoholes

grasos a su vez se emplean también como materia prima en la producción de

importantes clases de surfactantes, incluyendo AESs, FAEs y sulfonatos de

alcoholes grasos etoxilados [Farm, 2006.]. Tal como se ha indicado anteriormente,

los FAEs se obtienen en forma de complejas mezclas de oligómeros con la

estructura:

CH3(CH2)n-1(OCH2CH2)mOH

que puede abreviarse como CnEm, donde n adopta valores entre 8 y 18 y m, entre

0 y 30, el valor medio de EO se representa como m .


26


En los últimos años, los surfactantes basados en alcoholes grasos han

ganado importancia en el mercado de detergentes debido a sus excelentes

propiedades de lavado y su superior biodegrabilidad. Los alcoholes con una

cadena hidrocarbonada de entre 10 y 18 carbonos (alcoholes grasos) son potentes

feromonas, mientras que los de mayor masa molecular son componentes

esenciales en las ceras de las plantas [Bianchi, 1995]. La importancia industrial de

los alcoholes deriva de su uso generalizado como disolventes y cargas

(espesantes) en productos industriales y del hogar. Actualmente, los alcoholes

grasos derivados de materias primas renovables son usados en la producción de

surfactantes no iónicos, como los ASs, AESs, FAEs y APGs [Marcomini, 1996;

Fielder, 1989; Sparham, 2005]. Otro de los campos de aplicación de los alcoholes

grasos es la industria de los cosméticos, donde se emplean en la formulación de

jabones líquidos, champús, acondicionadores, cremas y lociones [Sad, 2007].

En cuanto a los FAEs, son los surfactantes no iónicos más empleados en

productos de limpieza, siendo también utilizados en la formación de cosméticos,

estabilizantes o dispersantes de herbicidas, etc. Los grupos éter proporcionan la

polaridad necesaria para garantizar su solubilidad en agua. Si bien la cadena de

EO no es tan polar como un grupo ionizado, un conjunto de 5 a 10 unidades de

EO puede alcanzar una notable capacidad hidrófila. Los FAEs son excelentes

agentes humectantes, compatibles tanto con surfactantes aniónicos como

catiónicos, y su detergencia no se reduce en presencia de iones metálicos como

Ca2+ o Mg2+. Tienden a ser líquidos o ceras con bajo punto de fusión y, por

consiguiente, son difícilmente utilizables en la formulación de detergentes en

polvo. Otro de sus inconvenientes es su tendencia a precipitar a temperaturas

elevadas o fuerzas iónicas altas, debido a la menor solvatación de la cadena de

EO en comparación con los grupos iónicos. Además, a temperaturas más


27

elevadas, se reduce el peso estadístico de las conformaciones polares de la

cadena de EO, de manera que la zona polar pierde buena parte de su carácter

hidrofílico. En estas condiciones, el surfactante se separa del medio acuoso

formando otra fase (punto de nube). Los FAEs lineales se caracterizan, a grandes

rasgos, por el intervalo de valores de n (también llamado “corte hidrofóbico”), y

por el número medio de unidades de EO; sin embargo, tanto para el control de

calidad industrial como medioambiental, se requiere información sobre la

distribución de los oligómeros. La caracterización de los FAEs es importante

porque sus propiedades fisico-químicas, así como el riesgo ambiental que

comportan, vienen fuertemente condicionadas por las distribuciones de sus

cadenas hidrofóbica e hidrofílica [Marcomini, 1996; Rudewicz, 1986; Eadsforth, 2006;

Belanger, 2006; Van Compernolle, 2006; Ribosa, 2007; Jurado, 2007].

Una clase especial de FAEs incluye compuestos de masa molecular baja

(tanto n como m < 4). Estos compuestos conocidos como cellosolves, se utilizan

por ejemplo, como aditivos anticongelantes en combustibles para aviación y

como disolventes en algunas formulaciones para limpiadores [Cheremisinoff,

2003].


Los cellosolves y los alcoholes grasos con una cadena igual o menor a 26

átomos de carbono se han determinado con éxito mediante GC [Nichols, 2006], sin

embargo, los FAEs con m > 4, no pueden determinarse por GC debido a su

limitada volatilidad [Rudewicz, 1986; Crescenzi, 1995; Battersby, 2001]. El principal

inconveniente de los métodos de HPLC para la determinación de alcoholes

grasos y FAEs ha sido la falta de un detector adecuado [Rudewicz, 1986; Petrovic,

2001]. Este problema se ha resuelto en parte con la introducción de detectores

como el de índice de refracción [Kudoh, 1984; Mengerink, 1991; Cho, 2003;


28

Trathnigg, 2002] y el ELSD [Mengerink, 1991; Heinig, 1998; Bear, 1988; Miszkiewicz,

2000; Miszkiewicz, 1996-B; Kamiusuki, 2000], sin embargo, los LODs en el detector

de índice de refracción son altos, mientras que la sensibilidad del ELSD se ve

mermada para compuestos volátiles como alcoholes no etoxilados y oligómeros

de FAEs con un bajo grado de etoxilación (m < 3) [Miszkiewicz, 1996-A; Bernabé-

Zafón, 2006]. Los LOD más bajos se consiguen mediante procesos de

derivatización pre-columna con agentes cromogénicos y fluorogénicos

[Marcomini, 1996; Schmitt, 1990; Kiewiet, 1995; Lemr, 1994; Zanette, 1996; Lemr, 1996;

Sun, 1997; Hoffman, 2004-A; Lemr, 2003; Okada, 1991; Okada, 1992; Hoffman, 2004-B;

Bachus, 2003; Desbène, 2005; Heinig, 1996-A; Micó-Tormos, 2008-A; Micó-Tormos,

2008-B; Micó-Tormos, 2009; Zu, 2010].

En la determinación de FAEs mediante MS, la formación de aductos con

iones positivos, ya sea utilizando la fuente ESI o APCI, resulta problemática

debido a la disminución de la sensibilidad conforme disminuye m lo que es

especialmente notable para m < 4. Finalmente, los alcoholes no etoxilados (m =

0) no pueden detectarse por MS [Rudewicz, 1986; Crescenzi, 1995; Petrovic, 2001; Zu,

2010; Chiron, 2000; Sherrard, 1994; Dunphy, 2001; Cassani, 2004; Sparham, 2005].

Para superar este inconveniente se han desarrollado procedimientos de

derivatización, en los que se adiciona un cromóforo y/o una carga permanente a

los oligómeros de los FAEs [Lemr, 1994; Lemr, 1996; Lemr, 2003; Desbène, 2005;

Heinig, 1996-A; Zu, 2010; Dunphy, 2001; Cassani, 2004; Sparham, 2005]. Sin

embargo, la derivatización de FAEs no es una tarea sencilla, ya que se requiere

un medio anhidro [Okada, 1992; Zu, 2010; Dunphy, 2001; Barry, 2003], existiendo un

mayor riesgo de interferencia tanto por el exceso de reactivo como por los

subproductos de la reacción [Sun, 1997; Hoffman, 2004-A; Micó-Tormos, 2008-A;

Micó-Tormos, 2008-B; Dunphy, 2001]. Por otra parte y debido al alto riesgo de

perder oligómeros con bajos valores de m por volatilización, el contenido de agua

de las muestras debe reducirse con precaución, lo que aumenta el tiempo de


29

análisis [Dunphy, 2001]. Sin embargo, en la derivatización con anhídridos cíclicos

se tolera la presencia de pequeñas cantidades de agua en las muestras [Micó-

Tormos, 2008-A; Micó-Tormos, 2008-B; Micó-Tormos, 2009; Zu, 2010].

I.2.5. AESs

Los AESs son una clase de surfactantes aniónicos ampliamente utilizados

en productos de limpieza e higiene corporal [Fiedler, 1989]. Se obtienen por

esterificación de FAEs, utilizando trióxido de azufre o ácido clorosulfónico. La

estructura molecular de los AESs está formada por una cadena de hidrocarburo

unida a una cadena de EO con un grupo sulfato en el extremo [Strain, 1959; Suter,

1944; Arthur D. Little, 1991]. Estos compuestos raramente son sustancias puras,

tratándose generalmente de mezclas, lo que es debido a la materia prima

(alcoholes) y a que su grado de etoxilación es un valor medio. Los AESs se

obtienen como complejas mezclas de oligómeros con la estructura:

-3 2 -1 2 2 3CH (CH ) (OCH CH ) OSOn m

que se puede abreviar como CnEmS, donde n adopta valores entre 12 y 16,

mientras que m suele oscilar entre 0 y 3, el valor medio de EO se representa

como m .


Las disoluciones acuosas de sulfatos muestran un comportamiento

especial, debido a que su viscosidad, primero aumenta por adición de electrolitos

como el cloruro de sodio en bajas concentraciones, disminuyendo con adiciones

posteriores. La máxima viscosidad, en cuanto a la concentración de la sal a

añadir, depende de la estructura del éter sulfato. En comparación con los ASs, los

correspondientes AESs son más solubles en agua y muestran mejor la tolerancia

a la presencia de iones Ca2+ y Mg2+. La introducción de una cadena de EO en el


30

AS tiende a aumentar el poder espumante del surfactante, especialmente en agua

dura, ya que permite un aumento de la adsorción interfacial. También se mejoran

las propiedades humectantes y emulsionantes. Por ello se usan en las

formulaciones de jabón en barras, en diversos productos cosméticos y

farmacéuticos y en el tratamiento de textiles [Salager, 2004; Spilker, 2005].


Las principales características de estos surfactantes (viscosidad,

detergencia, formación de espuma y compatibilidad con la piel), así como su

impacto ambiental, dependen de la distribución de cadenas de alquilo y EO

[Arthur D. Little, 1991; Tadros, 2005; Marcomini, 1996; Rudewicz, 1986; Eadsforth,

2006; Belanger, 2006; Van Compernolle, 2006; Ribosa, 2007; Jurado, 2007]. Por lo

tanto, tiene interés el desarrollo de métodos para su caracterización y

determinación. Sin embargo, debido a la complejidad de las muestras, la falta de

cromóforos, y los amplios intervalos de polaridad de los oligómeros, el análisis

de AESs no es fácil. Además, la ausencia de estándares comerciales de AESs

dificulta su determinación.

La determinación de AESs puede realizarse con el método del azul de

metileno, en el que se determina el contenido total de surfactantes aniónicos

[Llenado, 1983]. Para determinar ASs y AESs se ha utilizado la cromatografía de

pares iónicos con detección UV indirecta [Boiani, 1987; Shamsi, 1995], la

cromatografía iónica con detección conductimétrica [Pan, 1995; Nair, 1998] y la

HPLC con derivatización post-columna y detección fluorimétrica [Smedes, 1982-

A]. Para la detección UV indirecta de AESs con separación previa por HPLC se

han utilizando tampones acuosos con agentes reveladores UV como el veronal

[Nielen, 1991], el sulfonato de naftaleno [Romano, 1991; Shamsi, 1994], el sulfonato

de tolueno [Shamsi, 1995] o los ácidos benzoico y p-hidroxibenzoico [Heinig, 1996-

B]. También se ha llevado a cabo la determinación de AESs mediante GC tras


31

hidrólisis de los analitos con ácidos diluidos para obtener sus correspondientes

alcoholes y alcoholes etoxilados, seguida de derivatización a trimetil sililéteres

[Sones, 1979; Kirby, 1975]. En otro método se utiliza GC-FID, con derivatización

previa de los AESs a sus correspondientes bromuros de alquilo [Neubecker, 1985].

La determinación de AESs mediante HPLC-ESI-MS se ha aplicado a diversas

matrices ambientales como aguas, lodos de depuradora y sedimentos marinos

[Popenoe, 1994; Bruno, 2002; Lara-Martín, 2005].

I.3. Polímeros


Un polímero es una macromolécula constituida por la unión repetida de

pequeñas unidades (monómeros) a través de enlaces covalentes. Ejemplos de

polímeros de origen natural son las proteínas (seda, enzimas, colágeno), los

polisacáridos (almidón, celulosa) y los ácidos nucleicos, los cuales cumplen

funciones específicas en los seres vivos. Dentro de los polímeros sintéticos, el

más simple es el polietileno, siendo el etileno el monómero a partir del cual se

forma. La unidad estructural que se repite a lo largo de la cadena polimérica se

denomina unidad repetitiva, y la reacción en la cual los monómeros se unen entre

sí para formar el polímero se denomina polimerización. Los polímeros consisten

en mezclas de moléculas de distintas longitudes de cadena, y por ello se habla de

la MW promedia.


32

A) Clasificación de los polímeros

Existen diferentes formas de clasificar a los polímeros:

i) Según su composición:

- Homopolímeros: Formados por una única unidad repetitiva. Por ejemplo, el

polimetacrilato de metilo, donde el único monómero se repite.

- Copolímeros: formados por más de una unidad repetitiva. Por ejemplo,

aquéllos que están formados por 2 monómeros, pudiendo las unidades

repetitivas distribuirse de distintas maneras a lo largo de la cadena del

polímero. Por ejemplo, siendo A una unidad repetitiva y B otra, pueden

disponerse: al azar (ABBBBABABBAAABBA), de forma alternada

(ABABABABABABABAB) o por bloques (AAAABBBAAAABBB). Los

copolímeros presentan propiedades intermedias entre las de los homopolímeros

que se formarían a partir de cada tipo de monómero por separado.

ii) Según su estructura:

- Lineales: formados por monómeros difuncionales. Ejemplo: polietileno,

poliestireno.

- Ramificados: se requiere el agregado de monómeros trifuncionales, por

ejemplo, glicerol.

- Entrecruzados: se forma un material compuesto por una molécula

tridimensional continua, unida por enlaces covalentes. Por ejemplo, resinas

urea- formaldehído y fenol-formaldehído.

iii) Según la reacción de polimerización:

- Polimerización por reacción en cadena (o adición): se genera una partícula

reactiva (radical, anión o catión) a partir de una molécula de monómero, y ésta

se adiciona a otro monómero de manera repetitiva.


33

- Polimerización por crecimiento en pasos (o condensación): los monómeros que

reaccionan tienen un grupo funcional reactivo en cada extremo de la molécula y

la unión entre los monómeros requiere la pérdida de una molécula pequeña,

normalmente agua.

B) Estereoisomería en polímeros vinílicos

La tacticidad (del griego taktikos, orden) o estereoregularidad de los

polímeros es la organización estructural espacial de un polímero, esto es la

disposición que adquieren los sustituyentes en el espacio. Así cuando un par de

sustituyentes R adyacentes apuntan en la misma dirección en el espacio, la pareja

o díada se denomina m, mientras que si los sustituyentes apuntan en direcciones

contrarias del espacio se tiene una pareja o díada r (Fig. I.7).

A

n

B

n

C

n

R H H HR R

H HH RRR

HH HR R R

R H H HR R

H HH RRR

HH HR R R

Díada m

Díada r

Fig. I.7. Estructura de los polímeros isotácticos (A), sindiotácticos (B) y

atácticos (C).

Cuando se considera un mayor número de grupos R adyacentes, existen

tres ordenamientos posibles con respecto al plano del esqueleto carbonado del

polímero:


34

i) Isotáctico: con todos los grupos R hacia el mismo lado de la cadena

polimérica extendida (Fig. I.7-A).

ii) Sindiotáctico: con los grupos R alternando a uno y otro lado (Fig. I.7-B).

iii) Atáctico: con los grupos R distribuídos al azar (Fig. I.7-C).

El tipo de estereoregularidad se establece en la reacción de polimerización

y no es posible convertir un estereoisómero en otro por simple rotación de los

enlaces sigma a lo largo de la cadena polimérica.

I.3.2. Polímeros en detergentes

Se pueden enumerar varias características importantes que los polímeros

pueden ofrecer, y que en distinto grado, pueden ayudar a obtener como resultado

final un buen lavado. Existen polímeros que se emplean en el formulado de

detergentes que actúan como agentes para la prevención de la re-deposición de

suciedad, secuestradores de los iones calcio y magnesio, agentes dispersantes y

otros que actúan como DTI (inhibidores de la redeposición de colorantes) [Zini,

1999].

A) Agentes antirredeposición

El efecto de los polímeros en las operaciones de lavado se conoce desde

los años 60 del siglo XX. La eliminación de las manchas de las superficies es una

compleja combinación de procesos físico-químicos como disolución,

desplazamiento y desorción. Estos procesos son reversibles y las partículas de

suciedad pueden readsorberse sobre los tejidos tras permanecer en la disolución

de lavado. Para evitar esto, se utilizan en las formulaciones componentes que

garanticen un rendimiento óptimo de la dispersión de la suciedad en la

disolución. Sin embargo, las propiedades de la superficie pueden variar

considerablemente, existiendo diferentes afinidades entre las fibras y los


35

diferentes tipos de suciedad, dependiendo principalmente de la polaridad. Así, las

partículas que se eliminan fácilmente de fibras de polaridad intermedia pueden

ser fuertemente adsorbidas por fibras tanto hidrofílicas como hidrofóbicas,

provocando un envejecimiento de los distintos tejidos tras numerosos lavados

[Waldhoff, 2005]. Para evitar estos iconvenientes, las formulaciones contienen

polímeros que interactúan fuertemente tanto con las partículas de suciedad en la

disolución de lavado, como con las fibras textiles, sobre las que se adsorben de

manera irreversible. En ambos casos, se impide la redeposición de la suciedad.

Los polímeros derivados de la celulosa y del almidón son los más utilizados

como agentes antirredeposición, aunque también se pueden emplear otros como

el PVP o PVA.

B) Agentes secuestrantes

Los agentes secuestrantes enmascaran los cationes divalentes del agua

dura, evitando su interacción con los surfactantes. Los polímeros también

utilizados con este fin suelen ser homopoliacrilatos o copolímeros de acrílico y

maleico [Zini, 1999].

C) Agentes inhibidores de la transferencia de color

Desde los años 90 del siglo XX, la industria de los detergentes ha lanzado

al mercado varios polímeros solubles en agua con capacidad para inhibir

parcialmente la transferencia de color de unos tejidos a otros durante el proceso

de lavado [Bertleff, 1998; Oakes, 2003-A]. Estos polímeros, denominados DTIs,

actúan atrapando los colorantes desprendidos, manteniéndolos en disolución, y

por lo tanto, previniendo su redeposición en los tejidos. Estos polímeros

muestran una fuerte afinidad con los grupos funcionales aromáticos. Los DTI,

quedan adsorbidos sobre los colorantes en las aguas de lavado, mediante una


36

combinación de interacciones dipolo-dipolo inducido y π-π, previniendo

eficazmente la redeposición del color [Jäger, 1991]. Los DTI están constituidos

por monómeros con residuos ricos en electrones y fuertemente bipolares o

fácilmente polarizables, por lo general, heterociclos aromáticos o alifáticos con

sustituyentes vinílicos. Los polímeros que se utilizan con este fin suelen ser PVP

y PVP-NO y también el copolímero PVP-PVI.

I.3.3. PVP-NO

El PVP-NO es un polímero empleado como DTI en las formulaciones de

detergentes. Durante años, se usó principalmente PVP y sus copolímeros, sin

embargo, la eficacia de estos polímeros para atrapar colorantes se reduce en

presencia de surfactantes aniónicos [Oakes, 2003-A]. Por esta razón, se han

desarrollado nuevas generaciones de DTIs, con propiedades superiores de

complejación, y con mayor tolerancia frente a los surfactantes aniónicos. Un DTI

de nueva generación relativamente común es el PVP-NO, obtenido a partir de

una polimerización radicalaria de la 4-vinil-piridina utilizando AIBN como

iniciador, seguida de oxidación con peróxido de hidrógeno (Fig. I.8) [Lee, 1996].

Los diferentes tipos de PVP-NO comercial para detergencia están constituidos

por especies con masas moleculares entre 9 y 36 kDa, que corresponden a

cadenas de polímero que contienen desde 75 hasta 300 monómeros,

respectivamente [Oakes, 2003-A; www.ispcorp.com].

O-

N+

CH2 - CH

nN

CH2 CH

4-vinilpiridina PVP-NO

Fig. I.8. Estructura de la 4-vinilpiridina y del PVP-NO.


37

I.3.4. Poli(vinilpirrolidona)

De la primera polimerización de la N-vinilpirrolidona se obtuvo un

polímero soluble, el PVP (Fig. I.9), patentado en 1939. La polimerización se

realiza mediante radicales libres en agua o en 2-propanol, utilizando como

iniciador peróxido de hidrógeno o un peróxido orgánico, respectivamente [Bühler,

2005].

N

CH CH2 H

O

H

n

N

C H CH2

O

N-vinilpirrolidona PVP

Fig. I.9. Estructura de la N-vinilpirrolidona y del PVP.

El PVP es un polímero no iónico que puede aplicarse en gran variedad de

campos gracias a características como su solubilidad en agua, así como en

diversos disolventes orgánicos polares, buena afinidad con diferentes polímeros y

resinas, alta higroscopicidad, capacidad de formación de películas, buena

adherencia a diversos sustratos y posibilidad de formar complejos/quelatos

[www.shokubai.co.jp]. El PVP es un polímero versátil utilizado en cosméticos,

textiles, tintes, productos farmacéuticos y adhesivos [Frauenfelder, 1974; Sheth,

1985]. En la formulación de productos de limpieza, el PVP se emplea como DTI,

mantenimiento los colorantes desprendidos durante el lavado en disolución, por

lo que inhibe su transferencia a otros tejidos presentes en el lavado [Bertleff, 1998;

Oakes, 2003-A; Oakes, 2003-B; Oakes, 2005].

I.3.5. Alcohol polivinilico

El PVA (Fig. I.10) es un polímero sintético obtenido por primera vez en

1924 por Hermann Staudinger, mediante la hidrólisis del PVAcO con hidróxido


38

de potasio en etanol [Gallardo, 1999]. El PVA presenta un amplio abanico de

aplicaciones en medicina, cosmética, alimentación, farmacia, detergencia, etc.,

como consecuencia de propiedades tales como su inocuidad, alta

biocompatibilidad y solubilidad en agua [Park, 2010]. Según la ruta de síntesis, se

obtienen PVAs con diferentes tacticidades, como corresponde a una estructura

que presenta centros quirales adyacentes repetidos a lo largo de la cadena

polimérica.

CH2 CH

O

C O

CH3 n

CH2 CH

OH n

PVAcO PVA

Fig. I.10. Estructura del PVAcO y del PVA.

El PVA es un polímero capaz de complejar cationes metálicos como Cu2+,

y de formar ésteres con algunos aniones como borato, titanato, antimoniato y

vanadato. En disolución acuosa, los complejos polímero-catión tienen

propiedades similares a las observadas en las disoluciones de polielectrolitos

(especies con cargas positivas o negativas). La carga de los grupos PVA-catión

puede provocar la ionización de la molécula de agua [Tsujimoto, 2002].

I.3.6. Métodos de análisis de polímeros

Durante los últimos años, la CE se ha aplicado a la caracterización y

determinación de polímeros sintéticos [Gallardo, 1999; Cottet, 2005].

Principalmente, la FSCE y la CGE han sido empleadas para separar

polielectrolitos y polianfolitos (especies con cargas tanto positivas como

negativas), y la MEKC se ha usado para separar polímeros no cargados [Gallardo,

1999]. Tanto la FSCE como la MEKC proporcionan información sobre el


39

comportamiento de polímeros en disolución, y permiten estimar

cuantitativamente algunas de las disoluciones de polímeros [Bohrisch, 2000].

Gallardo y col. [Gallardo, 1999] separaron por MEKC una fracción mayoritaria en

metacrilato y otra rica en vinilpirrolidona a partir de copolímeros no iónicos.

También, el empleo de MEKC ha proporcionado información sobre el progreso

de la síntesis, naturaleza y composición de copolímeros iónicos [Aguilar, 2002].

Por otro lado, en CGE es posible conseguir la discriminación por masa molecular

de polímeros iónicos mediante un proceso de tamizado molecular, a través de un

BGE que contiene un polímero no iónico, como el PEG [Grosche, 2000] o

derivados de celulosa, como dextrano u otros polisacáridos [Bohrisch, 2000; Clos,

1998; Starkweather, 2000; Welch, 2001].

En FSCE, la movilidad electroforética para polielectrolitos de cadena

corta es función de la longitud de la cadena, de modo que la movilidad se

incrementa cuantos más monómeros cargados existan en la misma. Sin embargo,

la movilidad alcanza un máximo y después comienza a decrecer cuando el

polielectrolito cambia su conformación extendida a la enrollada u ovillada. En el

caso de polielectrolitos más largos, la relación masa/carga permanece constante,

y el polímero migra con una movilidad que se denomina “de drenaje libre”

[Cottet, 2000], proporcionando un pico único en FSCE [Bohrisch, 2000; Grosche,

2000]. No obstante, algunos polímeros pueden dar dos o más señales a diferentes

tiempos de migración en lugar de un pico único. Así por ejemplo, se ha

demostrado la formación de micelas en disolución acuosa de copolímeros

compuestos por cadenas largas polianiónicas de polisulfonato de estireno y

cadenas hidrofóbicas cortas de polietileno-propileno [Cottet, 2001]. En estos

copolímeros, las cadenas libres (unímeros) presentan una movilidad elevada (en

términos absolutos), mayor que la movilidad de los polímeros micelizados.


40

Además, el pico del polímero micelizado es más ancho que el pico del polímero

libre, lo que se ha atribuido a cierta dispersión en el número de agregación.

Gyorffy y col. [Györffy, 1998] analizaron un copolímero aniónico de PVP-

NO y ácido maleico mediante FSCE, encontrando un pico estrecho seguido de

uno más ancho. Para explicar este comportamiento se propuso la existencia de

dos componentes en el polímero. Utilizando SEC y FSCE, Štepánek y col.

[Štepánek, 2001] demostraron que algunos copolímeros forman micelas en

disolución, y que éstas se encuentran en equilibrio dinámico con los unímeros.

Además, se demostró que el equilibrio micelas-unímeros está cinéticamente

ralentizado en medio acuoso, donde las micelas se comportan como

nanopartículas independientes.

Para la caracterización de polímeros mediante CE puede emplearse la

técnica descrita por S. N. Krylov y col. [Berezovski, 2002; Krylov, 2003; Drabovich,

2006; Lin, 2008; Krylov, 2006; Krylov, 2007], desarrollada inicialmente para estudiar

las interacciones entre una proteína o un fragmento de DNA con un marcador

fluorescente. En dicha técnica, denominada NECEEM, los enlaces no covalentes

de marcadores fluorescentes se equilibran con una proteína diana o con DNA, y

la mezcla se inyecta en el capilar. Se obtiene una banda debida al complejo

seguida del pico producido por el exceso de marcador libre. Además, entre

ambas señales se obtiene una región intermedia, con el aspecto de una caída

exponencial, debida al marcador liberado por el complejo durante la separación

electroforética siguiendo una cinética de pseudo-primer oden. La formación de

complejos entre polímeros solubles, como PVP, y azocolorantes, se conoce desde

hace décadas [Frauenfelder, 1974].

Otra técnica empleada para la caracterización de los polímeros es la NMR,

con la que puede determinarse la tacticidad o estereoregularidad de los polímeros

[Moritani, 1972.; Wu, 1977]. La espectrofotometría UV-Vis se ha utilizado para la


41

determinación de copolímeros, siempre y cuando al menos uno de los

monómeros presente un grupo cromóforo. Por ejemplo, el copolímero de

metacrilato de metilo y acenaftileno se pueden caracterizar por esta técnica

[Sánchez, 2000; Skoog, 1994]. También se han caracterizado ciertos polímeros

naturales mediante la formación de complejos polímero-ion coloreado [Berezovski,

2002; Krylov, 2003; Drabovich, 2006; Lin, 2008; Krylov, 2006; Krylov, 2007].

Una técnica habitual para caracterizar especies de elevada masa molecular

es la SEC [Sánchez, 2000; Skoog, 1994]. Otras técnicas, como la viscosimetría

capilar [Sánchez, 2000.; Skoog, 1994] o la osmometría de presión de vapor [Karimi,

2008], también pueden emplearse para la caracterización de polímeros, ya que los

resultados obtenidos pueden correlacionarse con la masa molecular y otras

propiedades de los polímeros. Algunos polímeros empleados como DTI, en

particular la PVP, también pueden determinarse mediante pirólisis seguida de

GC-MS [Uchiyama, 1998].

I.4. Enzimas


Las enzimas aparecieron en el mercado de los productos de limpieza en la

década de 1960, para ayudar a eliminar las manchas proteicas. Hoy en día, la

presencia de diferentes enzimas en las formulacioens mejora la detergencia, ya

que facilitan la degradación de grandes y complejas moléculas tales como las

proteínas, almidones y grasas. Los productos de reacción obtenidos tras la

actuación de las enzimas son más solubles en las aguas de lavado, por lo que son

arrastrados más fácilmente por los surfactantes. Por otro lado, las enzimas

también ayudan a mantener la blancura y brillo en los tejidos, así como a


42

clarificar los colores, ya que pueden eliminar las fibras desprendidas de los

tejidos (pelusa) [Crutzen, 1999].

La incorporación de las enzimas a los detergentes en polvo es muy

habitual, siendo menos frecuente en detergentes líquidos, por la mayor dificultad

para preservar su estabilidad. Tampoco suelen usarse en patillas de jabón ni en

lavamanos, debido a su inestabilidad durante los procesos de fabricación, y por

posibles procesos de irritación cutánea. Los detergentes enzimáticos representan

un 30% del consumo mundial total de detergentes, el 80% del mercado en USA

[Krawczyk, 1996] y un 85% en Europa [Whalley, 1994].

El amplio uso de enzimas en detergentes se justifica por sus favorables

características:

- Su alto rendimiento a bajas concentraciones favorece el desarrollo de

detergentes cada vez más concentrados.

- Su ventajosa relación precio/efectividad.

- Su excelente perfil medio-ambiental.

Las enzimas son proteínas que se producen en todas las células vivas. Son

las responsables de la catálisis de muchas reacciones químicas biológicas, que

generalmente tienen lugar a bajas temperaturas y a pH neutro o cercano al neutro,

con una alta eficiencia y especificidad [Krawczyk, 1995]. Las enzimas presentes en

los detergentes no son tan específicas. Por ejemplo, las enzimas proteolíticas

(proteasas) son menos discriminantes y aumentan la velocidad de rotura de

muchas proteínas. Del mismo modo, las enzimas amiolíticas (amilasas) ayudan a

fragmentar los almidones, las enzimas lipolíticas (lipasas) catalizan la hidrólisis

de los triglicéridos y las enzimas celulíticas (celulasas) ayudan a romper la

celulosa. La mayor velocidad de rotura de moléculas grandes, procedentes de

comida, secreciones corporales, etc, a moléculas más pequeñas y solubles hace

que las enzimas faciliten la eliminación de varias manchas que de otra manera


43

serian difíciles de quitar sólo con los detergentes. También cabe mencionar que

al actuar como catalizadores, las enzimas suelen ser muy efectivas a bajas

concentraciones (menos de 0,1% en peso de enzima en el detergente) [Crutzen,

1999].

Las enzimas utilizadas en los detergentes son producidas por cepas de

baterias resitentes a medios alcalinos, que producen, por lo tanto, enzimas que

también son resistentes a pHs altos. Además se trata de enzimas exocelulares, es

decir, que son secretadas por las bacterias en el medio circundante. Por lo tanto,

estas enzimas pueden ser aisladas sin necesidad de romper las células

bacterianas, lo que hace que su extracción y purificación sea fácil y poco costosa.

Las enzimas son sensibles a algunos de los ingredientes presentes en los

detergentes, tanto durante el tiempo de almacenaje del producto como en el agua

de lavado. Dentro de ellos, los surfactantes catiónicos son los más perjudiciales,

aunque éstos no son muy utilizados [Baas, 1997]. Los surfactantes aniónicos,

especialmente los ABS, también degradan las enzimas, mientras que los

surfactantes no iónicos no las desestabilizan [Bahn, 1987]. Las enzimas se

desactivan por la presencia de agentes oxidantes, sin embargo, son más estables

en productos que contienen sólo perborato sin ningún tipo de activador. Aún en

este caso, la oxidación de las enzimas durante el tiempo de almacenaje puede

resultar un problema.

I.4.2. Proteasas

Las proteasas son las enzimas encontradas mayoritariamente en los

detergentes. Como se ha descrito anteriormente, las proteasas catalizan la rotura

de largas proteínas en moléculas más pequeñas, como péptidos o aminoácidos,

que pueden ser más fácilmente eliminadas por los surfactantes. Según la posición

activa, las proteasas pueden clasificarse en dos grupos:


44

i) Endopeptidasas: rompen los enlaces peptídicos dentro de la cadena

polipeptídica, dando lugar a péptidos solubles en agua.

ii) Exopeptidasas: rompen los enlaces peptídicos terminales, obteniéndos

aminoácidos libres.

También pueden ser clasificadas en función de las diferentes cepas de

Bacillus, las cuales exhiben diferentes sensibilidades en función del pH, y

distintas resistencias frente a los demás ingredientes de los detergentes. Las

enzimas procedentes del Bacillus licheniformis, como por ejemplo la Alcalase

(Novo Nordisk) o la Maxatase (Genencor), ofrecen una excelente relación

coste/prestaciones, especialmente a bajas temperaturas y a un pH moderado (pH

7-10). Otras proteasas, procedentes del Bacillus lentus/alcalophilus, como la

Esperase, la Savinase (Novo Nordisk) y el Maxacal (Genencor), presentan una

mayor actividad a pH más alto, y una mejor resistencia al pH, con un intervalo de

pH óptimo entre 8 y 12. También difieren de otras proteasas en su masa

molecular y en el punto isoeléctrico. Estas proteasas también presentan una

mayor estabilidad y actividad a altas temperaturas, así como una mejor eficacia

en presencia de perborato, pero también tienen una mayor sensibilidad a la

presencia de surfactantes aniónicos [Crutzen, 1999; Maurer, 2005].

La actividad proteolítica se puede estimar mediante una gran variedad de

métodos [Sarath, 1989]. Numerosos métodos utilizan la degradación de la

hemoglobina o la caseína como “proteínas estándar” para medir dicha actividad

[Maurer, 1997]. Hasta ahora, todas las proteasas empleadas en detergentes

pertenecen a la familia de la subtilisina [Egmond, 1997; Bott, 1997]. Las proteínas

de esta familia tienen una estructura tridimensional y un tamaño casi idénticos.

Las diferentes variantes de la enzima se distinguen sólo por pequeñas variaciones

en la secuencia de aminoácidos producidos de forma natural, o bien, mediante

ingeniería genética [Ballinger, 1998]. Estas modificaciones pueden dar lugar a


45

pequeñas diferencias en el punto isoeléctrico, y a ligeros cambios en los

electroferogramas obtenidos mediante enfoque isoeléctrico, electroforesis en gel

o capilar [Vinther, 1992-A]. Cuando estas pequeñas diferencias no son suficientes

para la identificación de la enzima, es necesario recurrir a un método de

asociación o la secuenciación completa de la proteína para resolver el problema

[Christianson, 1994]. En algunas variantes de proteasas el residuo de metionina en

la posición 222 se ha sustituido por un residuo de aminoácido más estable frente

a la oxidación, lo que conduce a un aumento de la estabilidad en el periodo de

almacenaje. Estas proteasas se pueden identificar y determinar mediante

oxidación con peróxido de hidrógeno en un tampón de ácido bórico [Estell, 1985].

I.4.3. Amilasas

Las amilasas aumentan la eficacia de los detergentes ayudando a disolver

las manchas constituidas mayoritariamente por almidón, si bien, la mejora en la

eficacia limpiadora es menor que la obtenida con proteasas. Estas enzimas son α-

amilasas de origen bacteriano (Bacillus licheniformis) que catalizan la hidrólisis

de los enlaces α-1,4 glicosídicos de la amilosa y la amilopectina en dextrinas,

oligosacáridos y azúcares, dando lugar a moléculas solubles. Las amilasas

presentan una mayor estabilidad frente a pHs alcalinos y a temperaturas altas que

las proteasas. Para mantener la actividad de las amilasas, el medio debe contener

suficiente concentración de ion Ca2+, necesaria para estabilizarlas frente a la

desnaturalización y al ataque de las proteasas [Crutzen, 1999].

Las amilasas pueden detectarse mediante el uso de tabletas de Phadebas®

o productos similares constituidos por almidón entrecruzado, insoluble y

coloreado; en presencia de amilasa se produce su degradación, con formación de

dextrinas y liberación de colorantes solubles. Hasta ahora, las principales

amilasas usadas en detergentes derivan del Bacillus licheniformis, cuya enzima


46

natural es termoestable. Mediante ingeniería genética, se han desarrollado

variantes de dicha enzima que mejoran su estabilidad frente a la oxidación

(Duramyl®, Purastar OxAmTM), mostrando además un mejor rendimiento que la

variante natural original, especialmente en los detergentes para lavavajillas. Estas

variantes de la amilasa pueden identificarse por su capacidad de resistir una

incubación en tampones que contienen peróxido de hidrógeno, perborato o

percarbonato [Estell, 1985; Maurer, 2005].

I.4.4. Lipasas

Los triglicéridos son los principales constituyentes de las manchas

procedentes de grasas animales y aceites vegetales. Las lipasas empleadas en

detergencia catalizan la hidrólisis de los enlaces éster de los principales

componentes de las grasas, los TAGs. Por lo tanto, las lipasas ayudan a eliminar

las manchas grasas, las cuales se adhieren fuertemente a los tejidos, y además

evitan su redeposición durante el lavado. Las lipasas son una buena muestra de la

cooperación enzima-surfactante. Estas enzimas actúan a temperaturas a las cuales

la solubilización de las grasas por parte de los detergentes es baja. La reacción

enzimática conduce a una mezcla de diglicéridos, monoglicéridos y glicerol, los

cuales son menos hidrofóbicos que los materiales originales, siendo por tanto

más fácilmente arrastrados por los surfactantes [Crutzen, 1999].

La primera lipasa industrial, Lipolase®, de la casa comercial Novo, y

aislada del hongo Humicola lanuginosa, apareció en el mercado en 1988. Gracias

a la ingeniería genética, la Lipolasa puede ser producida con buenos

rendimientos a partir del inofensivo microorganismo Aspergillus oryzae. En

relación con la acción limpiadora, la lipasa difiere de proteasas y amilasas, ya

que se necesitan varios lavados para observar sus beneficios [Aaslyng, 1991;

Gormsen, 1991]. La diferencia es debida al efecto del agua en la actividad lipídica:


47

la enzima es poco activa cuando el contenido de agua en los tejidos está por

debajo del 5%, o por encima del 80%, siendo máxima con un contenido de agua

del 80% [Gormsen, 1991]. Este nivel de agua se alcanza durante el proceso de

secado, por lo que la cantidad de material graso que permanece en el tejido

durante el primer lavado es alta, sin embargo, durante el segundo lavado los

triglicéridos que han sido hidrolizados son eliminados mucho más fácilmente

[Crutzen, 1999].

En cuanto al análisis cualitativo, las lipasas pueden detectarse mediante

incubación con laurato o palmitato de p-nitrofenilo, con la subsiguiente aparición

del color amarillo del p-nitrofenol [Brockmann, 1981; Novo Nordisk, 1995; Martinelle,

1996; Pencreac’h, 2001; Eggert, 2000]. El ensayo enzimático es extremadamente

sensible y debe ser controlado por la elevada probabilidad de falsos positivos

debidos a la actividad de fondo de la Humicola, o por la autolisis del sustrato. En

electroforesis en gel, la enzima puede teñirse con ésteres de naftilo, como por

ejemplo el acetato de α-naftilo [Stander, 2000; Sims, 1965; Maurer, 2005]. Ya que

las lipasas hidrolizan específicamente a los TAGs en ácidos grasos libres y

glicerol, se pueden determinar por valoración de los ácidos grasos que se han

liberado durante la incubación de un estándar [Brockmann, 1981; Novo Nordisk,

1995; Martinelle, 1996; Maurer, 2005]. Por otro lado, también pueden determinarse

por detección fluorimétrica los componentes alcohólicos (glicerol) previo

marcaje con resorufina [Junge, 1983]. En todos los casos, es necesario calibrar los

métodos utilizando la correspondiente lipasa como estándar.

I.4.5. Celulasas

Todas las enzimas consideradas hasta el momento solubilizan las manchas

por la degradación de los principales constituyentes. Las celulasas ejercen un rol

bastante diferente y proporcionan otros beneficios: suavidad de las fibras,


48

luminosidad del color, propiedades antipelusa y antirredeposición [Maurer, 1998].

Estos beneficios son resultado de la eliminación de microfibras formadas en la

superficie de los tejidos de algodón [Christensen, 1987]. Estos efectos son

acumulativos, incrementándose de forma considerable con el número de ciclos de

lavado realizados [Whalley, 1994]. Las celulasas catalizan la hidrólisis de las

uniones 1,4-β-glucosídicas de la celulosa. Las celulasas empleadas en

detergencia son mezclas de endocelulasas, las cuales degradan aleatoriamente las

cadenas de celulosa, y exocelulasas, que atacan los extremos de las cadenas de

celulosa, liberando glucosa y celobiosa (un disacárido). Puesto que este último

compuesto inhibe la actividad de la exocelulasa, las formulaciones también

contienen β-glucosidasas, que transforman la celobiosa en glucosa [Boyce, 1986;

Crutzen, 1999]. Las celulasas son las enzimas con mayor grado de variabilidad

entre las distintas clases de enzimas utilizadas en detergentes. Así, las celulasas

pueden obtenerse a partir de Humicola insolens, diversas especies de los géneros

Trichoderma, Thielavia o Melanocarpus, o varias especies de Bacillus, así como

a partir de hongos.

Las celulasas se pueden detectar mediante el uso de métodos de tinción

basados en el CR o en el azul de tripán. Estos métodos, bien conocidos en el

ámbito de la Bioquímica Analítica [Cantwell, 1983; Bartley, 1984], se basan en la

formación de complejos entre el colorante y las cadenas de glucosa. También se

han descrito métodos de análisis de celulasas basados en la derivatización

cromogénica de la celulosa [Fernley, 1963; McHale, 1981]. La identificación de

celulasas separadas previamente mediante electroforesis está basada en la

utilización de 5-bromoindoxil-β-D-cellobiosido, que se hidroliza a 5-

bromoindoxilo, el cual reacciona con el colorante Rojo Rápido (Fast Red),

previamente acoplado a la celulosa mediante un enlace azo [Chernoglazov, 1989].

La carboximetilcelulosa, derivado soluble de la celulosa, es también ampliamente


49

utilizada para el ensayo de la actividad de la celulasa. Este sustrato es específico

para la endo-1,4-β-glucanasa. Sólo la actividad de las endoglucanasas es

relevante para la función que desempeñan las celulasas dentro de los detergentes,

mientras que las exocelulasas (celobiohidrolasas) desempeñan una función

limitada o nula [Ghose, 1987]. Además, tampoco se ha observado sinergismo entre

exocelulasas y endoglucanasas [Eriksson, 1985]. Por tanto, la actividad

predominante de las endoglucanasas justifica la utilización de la carboxicelulasa

como el estándar más adecuado para la determinación de la actividad de las

celulasas. La carboxicelulasa se determina mediante la medición del aumento de

azúcares reducidos o la disminución de la viscosidad de la disolución. El método

basado en la disminución de la viscosidad tiene la ventaja de ser robusto, pero

presenta el problema de ser laborioso y difícil de automatizar [Maurer, 2005].

I.5. Técnicas analíticas

I.5.1. LC

La cromatografía líquida es un método físico de separación en el cual los

componentes a separar se distribuyen entre dos fases: la fase estacionaria, que

permanece fija, y la fase móvil, que se mueve en una dirección definida. Un

sistema cromatográfico (Fig. I.11) se compone al menos de un sistema de

bombeo, un dispositivo para la introducción de la muestra o inyector, una

columna y un detector, y un sistema adecuado para la adquisición de datos y

control.

Las bombas empleadas en LC pueden ser de dos tipos: bombas isocráticas

o bombas de gradiente. Los módulos de bombas para gradiente generan,

mediante su control programado, mezclas de composición variable. Según el tipo


50

de bomba, las mezclas se preparan a baja o a alta presión, siendo distintas las

características, ventajas y limitaciones de cada tipo.

Fase móvil

Inyección de lamuestra

Columna particulada o monolítica

Sistema dereparto

InyectorDetector

Residuo

Cromatograma

tRConc.

A B CRegistrode datos

Fig. I.11. Diagrama de bloques de los componentes esenciales de un

cromatógrafo de líquidos.

Tanto en LC como en otras técnicas analíticas, la muestra se inserta en el

flujo de corriente de la fase móvil a través de un bucle de inyección mediante una

válvula de 6 vías y 2 posiciones, que puede ser manual o automática. El

contenido del bucle se intercala entre el módulo de bombas y la entrada de la

columna.

El tipo de columna a emplear dependerá del mecanismo de retención con

el que se desee trabajar. Los tipos de LC más habituales son:

i) Cromatografía de reparto: se utiliza una columna con una fase líquida

enlazada. Dependiendo de las polaridades relativas de las fases móvil y

estacionaria, se distinguen dos modalidades: RP, cuando la fase estacionaria es

apolar y la fase móvil es polar, o bien NP, cuando la fase estacionaria es polar y

la fase móvil es apolar. Un modo especial de cromatografía en fase normal es el

HILIC, en el que la fase móvil es menos polar que la fase estacionaria, si bien

mantiene su miscibilidad con agua.


51

ii) Cromatografía iónica: la fase estacionaria es un intercambiador catiónico o

aniónico de tipo ácido fuerte, base fuerte, ácido débil o base débil.

iii) Cromatografía de exclusión molecular: como fase estacionaria se utilizan los

poros de un sólido microporoso o de un gel.

Por otro lado, es importante desgasificar los disolventes para prevenir la

formación de burbujas en el equipo. Para ello, los cromatógrafos líquidos suelen

incluir un desgasificador en línea, insertado antes del paso de la fase móvil por el

módulo de bombas.

Las técnicas de detección más empleadas en LC son la espectrofotometría

UV-Vis y la MS. Como detectores alternativos se utilizan los de índice de

refracción, así como los detectores evaporativos. Para aplicaciones específicas se

usan los detectores amperométricos y fluorimétricos. Finalmente, la detección

conductimétrica es habitual en cromatografía iónica. En espectrofotometría UV-

Vis, la señal es proporcional a la concentración molar del soluto, cuya

absortividad molar depende de la naturaleza del grupo o grupos absorbentes.

Cuando los LODs no son lo suficientemente bajos, se utilizan técnicas de

preconcentración, o se exalta la absortividad de los solutos aumentando su

conjugación por derivatización. Los detectores espectrofotométricos obedecen a

dos tipos de diseño: longitud de onda variable y DAD. En los primeros, se

selecciona una longitud de onda de medida fija, mientras que los segundos son

capaces de barrer todo el intervalo del espectro UV-Vis varias veces por

segundo. En este último caso, el monocromador, está situado después del paso de

la radiación por la muestra, de modo que sobre ésta incide radiación de todas las

frecuencias. Después del paso del haz por la muestra, se dispersa la radiación

transmitida, de modo que cada fotodiodo mide la intensidad correspondiente a un

pequeño intervalo de longitudes de onda.


52

En MS, el detector proporciona información de alto nivel sobre las

estructuras moleculares de los analitos, permitiendo distinguir grupos

funcionales, elementos químicos e isótopos, de acuerdo con los valores m/z de

los iones y sus fragmentos iónicos. Un detector de MS acoplado a un

cromatógrafo puede diferenciar compuestos con características de retención muy

similares, siendo posible identificarlos y/o cuantificarlos aunque sólo estén

parcialmente resueltos, o incluso no resueltos en absoluto.

Más recientemente, se han introducido modalidades cromatográficas que

implican miniaturización, bien en el tamaño de la columna o en el diámetro de

partícula. Entre las ventajas de estas técnicas, cabe citar la reducción de los

tiempos de análisis, del consumo de reactivos, del volumen de residuos

generados y del tamaño de muestra. A su vez, se pueden obtiener mejoras en la

sensibilidad (los LODs son menores), y mayores eficacias. Entre sus desventajas,

hay que indicar las mayores exigencias instrumentales, como el uso micro-

bombas y micro/nano-nebulizadores.

I.5.1.1. Medida de parámetros cromatográficos

Para llevar a cabo una separación cromatográfica, el analista debe

establecer si se puede separar adecuadamente al analito del resto de componentes

de la muestra, y si la cantidad en la que se halla es suficiente como para poderlo

detectar y/o determinar. El tiempo que transcurre desde la inyección hasta la

detección de un analito es su tiempo de retención o tR. Por su parte, el factor de

capacidad o retención relativa (k) expresa la retención neta en unidades de tiempo

muerto, t0, o tiempo que tarda en eluir un compuesto que no presenta retención:

0

0,

t

ttk iR

i

−= (E.I.1)

donde tR,i es el tiempo de retención del analito i. El intervalo óptimo de valores

de k se sitúa entre 1 y 5, si bien valores entre 0,2 y 10 son aceptables. Valores de


53

k inferiores a 0,2 indican poca retención, preferencia excesiva del soluto por la

fase móvil. Por el contrario, valores de k superiores a 20 indican una retención

demasiado alta, producida por una preferencia excesiva del soluto por la fase

estacionaria, lo que implica tiempos de análisis muy largos y en general picos

anchos y de baja altura, difíciles de detectar y de medir con precisión, y por

tanto, con LODs mayores de lo deseable.

La capacidad de un sistema cromatográfico para distinguir entre dos

solutos se expresa mediante el factor de selectividad αi,j, que se calcula como el

cociente entre las retenciones relativas de ambos solutos:

i

jji k

k=,α (E.I.2)

siendo i y j dos picos adyacentes, e i el soluto menos retenido.

El grado de separación entre dos solutos se mide mediante la resolución,

R:

)(5,0,,

ji

jRiR

ww

ttR

+−

= (E.I.3)

siendo wi y wj las anchuras de las bases de los picos de los compuestos i y j.

Por su parte, la eficacia describe el grado de ensanchamiento de bandas en

relación al volumen de retención. Se obtiene una elevada eficacia cuando los

picos se mantienen estrechos a pesar de haber requerido un volumen elevado de

fase móvil para su elución. La eficacia global de un sistema se describe mediante

el número de platos teóricos (N), y la eficacia por unidad de longitud por la altura

equivalente a un plato teórico (H), o por su inversa (1/H).

Para un soluto determinado, N puede calcularse a partir de las expresiones:

2

16

⋅=w

tN R y

2

2/1

54,5

⋅=

w

tN R (E.I.4)

donde tR es el tiempo de retención del soluto y w y w1/2 son la anchura de la base


54

del pico y su anchura a media altura, respectivamente. Por su parte, H se

relaciona con N a través de la expresión:

H

LN = (E.I.5)

donde L es la longitud de la columna.

La ecuación de Van Deemter describe las contribuciones a H, esto es,

indica como los diversos factores de construcción y funcionamiento de la

columna influyen sobre la eficacia. Para el caso de columnas microparticuladas

tanto en HPLC como en CEC, se tiene la expresión simplificada siguiente:

uCu

BAH ⋅++= (E.I.6)

donde u es la velocidad lineal promedia de la fase móvil.

El término A de la ecuación de van Deemter se conoce como difusión de

remolino o torbellino, y se debe a la distinta longitud de los caminos recorridos y

a las distintas velocidades de los solutos en su avance por el lecho

cromatográfico (Fig. I.12, parte A). La contribución al ensanchamiento de

bandas se debe a que las moléculas se mueven a distinta velocidad según la

anchura del camino seguido. Además, la fase móvil que avanza por el centro de

los “canales” se mueve más rápidamente que la que avanza pegada a las paredes.

Esta contribución a H es función sólo de la geometría del relleno, esto es, no

depende de u .

Término A

● ●

●● ●

●● ●

● ●

●

●●

●

●●●

●●

●

BA Término A

● ●

●● ●

●● ●

● ●

●

●●

●

●●●

●●

●

BTérmino A

● ●

●● ●

●● ●

● ●

● ●

●● ●

●●

●

● ●

●

●●

●●●

●●

●

BAAA

●●

●●

●

●● ●

●

●●

●

●●

●●

● ●

●

●

●

●

●

●

●

●

●●

●

A B

Fig. I.12. A) Difusión de remolino y B) difusión molecular longitudinal.


55

El término B representa la difusión molecular longitudinal (en la dirección

axial), que es debida a la difusión de los solutos a nivel molecular (Fig. I.12,

parte B). Esta difusión es proporcional a la difusibilidad de los solutos y al

tiempo de residencia de la muestra en la columna. Conforme aumenta el tiempo

de permanencia, mayor es la difusión, y por tanto el término B sólo cobra

importancia a velocidades de flujo bajas. Esta dependencia con el tiempo de

permanencia se refleja en la proporcionalidad inversa de esta contribución

repecto a u .

El término C corresponde a la contribución combinada de las velocidades

de transferencia de masa en la fase móvil y en la fase estacionaria (CM y CS). Este

término es proporcional a u ya que el avance de la fase móvil compite en

términos de velocidad con las transferencias de masa del soluto entre ambas

fases, de modo que la importancia del término C aumenta con la velocidad de la

fase móvil al ser menor el tiempo de equilibrado entre ambas fases. La lentitud o

retraso con la que se efectúan las transferencias de masa después de cada “etapa”

de avance de la fase móvil origina un ensanchamiento de la zona ocupada por el

soluto.

Los términos A y C de la ecuación de van Deemter indican que la eficacia

de la columna puede mejorarse utilizando partículas de fase estacionaria más

pequeñas, o también rellenos más uniformes. La forma de la curva de van

Deemter proporciona información acerca de la calidad del empaquetado o relleno

de la columna cromatográfica. Cuanto menores sean las contribuciones de los

términos A y C mayor será el número de platos teóricos a una determinada

velocidad de la fase móvil. En la Fig. I.13 se muestra una representación típica

de esta ecuación.


56

u

AA

Velocidad lineal promedia

Altu

ra e

quiv

ale

nte

a un

pla

to t

eóric

ouC

u

BAH ⋅++=

uC ⋅

u

B

Uóptima

Fig. I.13. Representación de H frente a ū (curva de van Deemter).

I.5.2. CE

La CE es una técnica de separación que se basa en la migración diferencial

de especies cargadas en el seno de un tubo capilar y en presencia de un campo

eléctrico. La fuerza que impulsa el flujo en CE se genera en la misma pared

interna del capilar mediante el fenómeno conocido como electroómosis [Landers,

1994; Li, 1992; Camilleri, 1993; Heiger, 1992; Brown, 1995; Rogan, 1993].

I.5.2.1. Mecanismo de separación en CE

La velocidad que adquiere un soluto cargado en el seno de un campo

eléctrico es proporcional al campo:

v = µe E (E.I.7)

donde v es la velocidad del ion, µe la movilidad electroforética del mismo y E el

campo eléctrico aplicado. La movilidad electroforética es una constante

característica del ion en un determinado medio. Viene determinada por el balance

entre la fuerza electrostática, Fe, y las fuerzas de rozamiento, Ff:

Fe = q E (E.I.8)

Ff = 6πrηv (E.I.9)


57

donde r es el radio efectivo del ion hidratado o solvatado y η es la viscosidad de

la disolución. Cuando se alcanza el estado estacionario, ambas fuerzas son de la

misma intensidad pero signo opuesto, por lo que:

µe = q/ (6πrη) (E.I.10)

De esta ecuación se deduce que las partículas con mayor densidad de carga

eléctrica tendrán movilidades mayores. La movilidad se considera positiva

cuando el ion se dirige al cátodo. La movilidad medida en función del tiempo de

migración se conoce como movilidad aparente o efectiva (µap), y difiere de la

intrínseca o electroforética cuando se observa en presencia de EOF no nulo. La

movilidad aparente corresponde a la suma de las movilidades electroforética y

electroosmótica, siendo la velocidad total de las partículas cargadas la suma de

sus velocidades electroforética y electroosmótica:

v = ve + vEOF = µapE = (µe +µEOF)E (E.I.11)

I.5.2.2. EOF

El EOF es uno de los principales fenómenos que afectan a las

separaciones electroforéticas. En contacto con un medio acuoso, la superficie del

capilar de sílice tiene generalmente un exceso de carga negativa que es debido a

la ionización de los grupos silanol. Para capilares de sílice fundida, el EOF se

puede controlar reduciendo o aumentando el número de grupos silanol en forma

ionizada. Así, el EOF es prácticamente nulo por debajo de pH 3, y aumenta con

el pH. Para la sílice se tiene: log Kmedio ≈ 5,5.

Los iones que se encuentran en la disolución tienden a neutralizar la carga

de la superficie del capilar, formando una doble capa eléctrica, y creando una

diferencia de potencial residual conocida como potencial zeta. La primera capa, o

capa de adsorción primaria, está fuertemente retenida, pero sobre ella se

establece una capa difusa en la que predominan los iones del signo contrario al


58

potencial zeta de la superficie. Esta segunda capa está menos retenida, por lo que

puede moverse por aplicación de una diferencia de potencial, y en su movimiento

arrastra a todo el líquido. En la Fig. I.14 se representa esquemáticamente este

fenómeno.

+++++++++++++++++++++ +++

++

++

++

+

+

+

+

++

+

++

+

+

+

+ +

-

-

--

-

--

- -

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+

+++ +

++

++

++

+

+

+

+ +

+

++

+

+

+

++

--

-

- ---

-

--

--

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

--

-

-

-

--

--

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-+ EOF -

Capa de adsorción primaria

Capa difusa

Fig. I.14. Esquema de la generación de EOF por aplicación de campo

eléctrico.

La velocidad del EOF (vEOF) es proporcional al campo:

vEOF = µEOFE (E.I.12)

donde µEOF es la movilidad electroosmótica que es proporcional al potencial zeta

sobre la superficie:

µEOF = εζ/η (E.I.13)

donde ζ es el potencial zeta o densidad de carga residual sobre la superficie de la

pared interna del capilar, y ε es la permisividad eléctrica o constante dieléctrica

del medio. La µEOF depende de la naturaleza de la pared del capilar y de la

composición del medio, especialmente del pH y de la fuerza iónica. El potencial

zeta es función de la carga por unidad de superficie, y depende también del pH, y

de la concentración y la naturaleza de todos los iones presentes.

I.5.2.3. Movilidad y tiempo de migración

El tiempo que un soluto necesita para migrar desde el punto de inyección

hasta el punto de detección se denomina tiempo de migración. El tiempo de

migración se relaciona con los siguientes parámetros experimentales:


59

tV

lL

tE

lap ==µ (E.I.14)

donde la µap es la movilidad aparente, V es el voltaje aplicado, l es la longitud

efectiva del capilar o distancia desde la entrada hasta el detector, L es la longitud

total del capilar, t es el tiempo de migración y E es el campo eléctrico aplicado.

I.5.2.4. Técnicas de electroseparación capilar

La electroseparación capilar abarca diversas técnicas caracterizadas por su

gran versatilidad. Las técnicas más utilizadas son:

A) FSCE o CZE

En la FSCE o CZE, el capilar se llena sólo con el BGE, y la separación

tiene lugar gracias a las diferentes movilidades electroforéticas de los solutos. La

selección del BGE es extremadamente importante, ya que la selectividad de la

separación depende en gran medida de su naturaleza. Los reactivos utilizados

deben cumplir las siguientes condiciones:

i) Buena capacidad amortiguadora en el intervalo de pH requerido.

ii) Baja absorbancia a la longitud de onda de detección.

iii) Baja movilidad electroforética de sus componentes para minimizar la

corriente.

B) MEKC

La MEKC fue introducida en 1984 por Terabe y col. [Terabe, 1984; Terabe,

1989; Terabe, 1992; Otsuka, 1989], y se utiliza para separar especies sin carga

eléctrica neta. La separación se basa en las diferencias de las constantes de

asociación entre solutos y micelas. El BGE contiene un surfactante iónico a

concentración superior a su CMC. Tanto las micelas como los iones libres del

surfactante experimentan interacciones hidrofóbicas y electrostáticas con los


60

solutos. Las especies no cargadas que interaccionan con las micelas adquieren

movilidad, distinguiéndose del EOF, y las que no interaccionan se mueven con el

mismo. Se puede aplicar también a especies iónicas, si bien, en este caso el

mecanismo de separación es mixto, cromatográfico y electroforético a la vez.

I.5.3. CEC

La CEC es una técnica analítica de separación en fase líquida que combina

la elevada eficacia de la CZE con la alta selectividad y reproducibilidad

proporcionadas por la HPLC. En CEC, la separación se lleva a cabo en columnas

capilares rellenas total o parcialmente con una fase estacionaria. Como en CZE,

el EOF es generado por el campo eléctrico. Para que se genere EOF debe

asegurarse la presencia de cargas sobre la superficie del relleno de la columna.

Por otro lado, el EOF es el responsable del bombeo en CEC y en otras técnicas

de electroseparación. El bombeo mediante el EOF da lugar a un perfil plano de

velocidades en el seno de la fase móvil, a diferencia del perfil parabólico que se

obtiene cuando el bombeo es por presión externa, como en HPLC. El perfil plano

del flujo es uno de los factores que permite obtener elevadas eficacias.

En CEC el mecanismo de separación es doble [Rathore, 1996]. Por un lado,

hay un mecanismo cromatográfico, ya que se produce un reparto de los solutos

entre una fase móvil y una estacionaria. Por otro lado, los solutos iónicos también

se separan mediante un mecanismo electroforético, esto es, en base a las

diferencias de movilidad electroforética, por lo que la naturaleza del relleno de la

columna determina el EOF e influye sobre la selectividad de la separación.

I.5.3.1. Instrumentación en CEC

Un instrumento para CEC (ver el esquema de la Fig. I.15) está constituido

básicamente por una fuente de alto voltaje, un sistema de suministro de


61

disolvente y/o muestras en los viales de entrada y de salida de la columna, una

columna capilar con una fase estacionaria en la cual se genera el EOF y también

tiene lugar la separación electrocromatográfica, un compartimento isotérmico

para la columna capilar, y un sistema de detección capaz de registrar los perfiles

de concentración de los analitos en el eluyente.

Fuente decampo eléctrico

Fuente depresión

BGE

Capilarrelleno

Detector

Fig. I.15. Esquema de un instrumento de CEC.

La misma instrumentación utilizada en CE sirve para CEC, si bien, en este

caso se debe de disponer de un sistema de presurización de los viales de entrada

y salida. Esta presurización es necesaria para evitar la formación de burbujas, que

podrían interrumpir la corriente. Las burbujas pueden originarse por diversas

causas, ya sea por diferencias locales en la velocidad del EOF [Rathore, 1998], en

el campo eléctrico, por pérdida del gas atrapado en los poros de la fase

estacionaria, o por gas formado electroquímicamente [Carney, 1999], por

calentamiento [Knox, 1988; Tsuda, 1987], o en el caso de columnas empaquetadas,

por la presencia de las fritas que mantienen la integridad estructural del relleno

[Rebscher, 1994]. La presurización se puede aplicar sobre el vial de entrada o en el

de salida, aunque generalmente se aplica sobre ambos viales, ya que así se

asegura un flujo reproducible. Para presurizar los viales se usa un gas inerte,

normalmente N2, a presiones próximas a 10 bares. Para obtener resultados

reproducibles en CEC, es necesario el control de parámetros como la temperatura


62

de la columna, el voltaje aplicado y la presión. En los equipos comerciales de

CE, estos parámetros se controlan automáticamente, lo que da lugar a mejoras

significativas de la reproducibilidad y seguridad de las separaciones.

La espectrofotométrica UV-Vis es la técnica de detección más utilizada en

CEC [Choudhary, 2000; Rozing, 2001; Devowsky, 2002; Cahours, 2002], siendo

posible trabajar también en el modo de detección indirecto. La detección se

realiza en la misma columna, utilizando como celda de detección una pequeña

sección de la misma, adyacente al relleno, y de la cual se ha retirado la capa

protectora de polímero. Otras técnicas de detección también ampliamente

utilizadas son la fluorescencia inducida por láser [Wall, 2002; Horstkötter, 2002; Liu,

2001], y la MS [Shamsi, 2004; Klampfl, 2004; Barceló-Barrachina, 2004].

I.5.3.2. Columnas empleadas en CEC

Las columnas para CEC se preparan normalmente a partir de capilares de

sílice fundida con diámetros internos comprendidos entre 100 y 200 µm. En base

a las diferencias en los soportes cromatográficos, se pueden distinguir tres tipos

de columnas: abiertas, empaquetadas y monolíticas.

Las columnas monolíticas, constituidas por un lecho continuo, poseen una

estructura porosa que permite trabajar en HPLC con caudales elevados, y por

tanto, obtener separaciones rápidas sin que ello conlleve un aumento excesivo de

la presión necesaria para mantener el caudal, a diferencia de lo que sucede con

las columnas particuladas. En CEC las columnas monolíticas constituyen

igualmente una alternativa a las empaquetadas, con algunas interesantes ventajas.

Así, dada su estructura continua, no es necesario el empleo de fritas en los

extremos del lecho monolítico, ya que éste está anclado directamente sobre la

pared del capilar mediante enlaces covalentes. Además, pueden prepararse in

situ, por lo que la fabricación de lechos monolíticos es relativamente sencilla en


63

comparación con las técnicas de empaquetado de partículas.

Las columnas monolíticas pueden clasificarse en dos categorías

principales, de sílice y poliméricas. Las columnas de sílice se preparan usando la

tecnología sol-gel. La estructura de un monolito de sílice muestra esqueletos

interconexionados que crean una distribución determinada de poros.

Por otro lado, la preparación de las columnas monolíticas poliméricas se

lleva a cabo fácilmente mediante el relleno de las columnas capilares con una

mezcla de polimerización constituida por monómeros, un agente entrelazante

(cross-linker), una mezcla porogénica de disolventes y un iniciador radicalario.

La hidrofobicidad del monolito resultante se puede controlar seleccionando la

naturaleza del monómero [Liao, 1996; Palm, 1997]. El EOF se asegura mediante la

presencia de monómeros derivados de los ácidos acrílico o sulfónico, o mediante

sales de amonio cuaternario en la mezcla de polimerización [Ericson, 1999]. La

polimerización se inicia por medios térmicos, químicos o mediante radiación

UV.

Para evitar cualquier desplazamiento del monolito a lo largo de la

columna, es necesario anclar el polímero a la pared interna del capilar. Para ello,

antes de introducir en el capilar la mezcla de polimerización, se silaniza la pared

interna del mismo. Con este fin, en la mayor parte de los casos, se utiliza 3-

(trimetoxisilil)propil metacrilato (silano binding).

Para construir monolitos se han utilizado diferentes tipos de polímeros,

pudiendo distinguirse principalmente entre los derivados de acrilamida,

poliestireno y ésteres de metacrilato o acrilato. En las primeras columnas

monolíticas que fueron descritas se utilizó acrilamida y metacrilamida [Hjertén,

1989; Fujimoto, 1995; Hoegger, 2001]. Estos polímeros se preparan por

polimerización de acrilamida, metacrilamida o sus derivados en presencia de

metilenbisacrilamida o piperazina diacrilamida como agentes entrelazantes. Las


64

columnas monolíticas basadas en poliestireno [Gusev, 1999; Petro, 1996] se

obtienen por polimerización de estireno o sus derivados con divinilbenceno como

agente entrelazante. Los monolitos basados en ésteres de metacrilato [Merthar,

2003; Zhang, 2003; Peters, 1998-A; Peters, 1998-B] se preparan mediante

polimerización de butilmetacrilato u otros ésteres derivados del metacrilato,

empleando etilenglicol dimetacrilato como agente entrelazante.

I.5.3.3. Polimerización de columnas monolíticas basadas en ésteres de

metacrilato y acrilato

Las columnas monolíticas basadas en polimetacrilato son las más

extendidas y mejor caracterizadas, habiendo sido ampliamente desarrolladas por

Svec y col. [Peters, 1998-A; Peters, 1998-B], quienes han descrito aplicaciones tanto

en HPLC como en CEC. Los polímeros de metacrilato y acrilato poseen

características mecánicas y químicas que los hacen altamente apropiados como

fases estacionarias. Son estables en un amplio intervalo de valores de pH (2–12),

a diferencia de las fases estacionarias basadas en sílice, que se degradan con gran

facilidad por encima de pH 9. Su síntesis es rápida y sencilla, siendo posible

partir de monómeros de polaridades muy diversas.

La polimerización de los monolitos basados en ésteres de metacrilato y/o

acrilato se realiza mediante una reacción radicalaria, iniciada generalmente por

una temperatura elevada, por irradiación UV, o por agentes químicos a

temperatura ambiente. Para la iniciación térmica de la polimerización se suele

adicionar a la mezcla de monómeros AIBN [Peters, 1998-A; Peters, 1998-B; Chirica,

2001], peróxido de benzoilo [Xie, 1997], u otros peróxidos [Cantó-Mirapeix, 2008-D].

Svec y col. [Peters, 1998-A; Peters, 1998-B] han demostrado que las

propiedades cromatográficas (eficacia, selectividad, permeabilidad, etc) de estos

materiales pueden alterarse variando la composición de la mezcla de


65

polimerización, lo que constituye una vía interesante, no sólo para el desarrollo y

optimización de las separaciones cromatográficas, sino para sus aplicaciones de

interés ambiental, bioquímico e industrial.

I.5.3.4. Caracterización de materiales monolíticos

Los materiales monolíticos se pueden caracterizar estudiando tanto sus

propiedades morfológicas como electrocromatográficas. Existen numerosas

técnicas que proporcionan información acerca de la influencia de diversos

factores sobre las propiedades morfológicas de los materiales monolíticos

Para el estudio de las propiedades morfológicas de los materiales

monolíticos, existen numerosos métodos y herramientas analíticas. Entre ellas

cabe citar la SEM [Baeuml, 2002], la porosimetría de intrusión de mercurio

[Doneanu, 2002], la adsorción/desorción de nitrógeno, evaluada mediante la

ecuación de Brunauer-Emmet-Teller [Brunauer, 1938] y la permeabilidad

cromatográfica. Las columnas monolíticas utilizadas a lo largo de esta Tesis

Doctoral se han caracterizado principalmente mediante SEM, por lo que esta

técnica se comenta más extensamente a continuación.

Mediante SEM se obtienen imágenes de la estructura de un material.

Sobre la superficie del material se enfoca un haz de electrones. Este haz barre la

superficie del material, produciendo principalmente la emisión de electrones

secundarios de baja energía y electrones retrodispersados de mayor energía,

recogiéndose ambos mediante adecuados sistemas de detección [Aballe, 1996]. La

información obtenida varía según las características del detector empleado. Los

electrones secundarios se forman en una delgada capa superficial, del orden de 5

a 10 nm de espesor. La señal está constituida en parte por electrones que emergen

de la muestra con una energía inferior a 50 eV. El número de electrones de este

tipo es suficientemente elevado como para establecer un buen contraste entre las


66

estructuras que se quieren describir. Por otra parte, al tratarse de electrones de

baja energía, pueden desviarse fácilmente de su trayectoria emergente inicial, y

se puede obtener información de zonas que no están a la vista del detector. Esta

particularidad es fundamental para otorgar a la señal la posibilidad de aportar una

información tridimensional de la topografía de la muestra, siendo quizás la

característica más conocida de esta técnica.

Por otro lado, la principal utilidad de la señal de electrones

retrodispersados, compuesta por aquellos electrones que emergen de la muestra

con una energía superior a 50 eV, reside en que su emisión depende fuertemente

del número atómico de los elementos de la muestra. Por esta razón, dos zonas

con distinta composición química se revelarán con distinta intensidad, aunque no

exista ninguna diferencia de topografía entre ellas.

Para aplicar SEM la muestra a analizar debe estar seca. En caso contrario,

la baja presión existente en el microscopio causaría la evaporación de los

componentes volátiles que saldrían despedidos violentamente, alterando la

estructura de la muestra. Además, la superficie debe ser conductora, lo que se

consigue recubriéndola con una película de un material conductor. Para ello, se

utilizan técnicas de pulverización catódica a alto vacío. Por otro lado, la reducida

estabilidad térmica de los polímeros limita el voltaje que puede aplicarse para

obtener las imágenes.

I.5.4. MS

La MS es una técnica de aplicación general, capaz de suministrar

información sobre la composición cualitativa y cuantitativa, tanto de analitos

orgánicos como inorgánicos, en muestras complejas. Los espectros de masas se

obtienen por conversión de los componentes de una muestra en sus respectivos


67

iones en fase gas, que se separan en función de su relación m/z, siendo la señal

analítica la abundancia o intensidad para cada valor m/z.

En la Fig. I.16 se muestra un esquema de los componentes principales de

un espectrómetro de masas.

Muestra

Sistema deentrada

Sistema deentrada

Fuente de ionesFuente de ionesAnalizador de masas

Analizador de masas

DetectorDetector

Procesador de la señal

Procesador de la señal

Dispositivo de lectura

Dispositivo de lectura

Sistema de vacío

Sistema de vacío

10-5 - 10-8 torr

Fig. I.16. Componentes de un espectrómetro de masas.

Como se ilustra en la figura, un espectrómetro de masas está formado en

primer lugar por un sistema de entrada, que permite la introducción de una

pequeña cantidad de muestra en el espectrómetro. El sistema de entrada elegido

será diferente según se quieran introducir muestras sólidas, líquidas o gaseosas.

La muestra se puede introducir de manera discreta mediante una jeringa o una

sonda directa, o de forma continua mediante el acoplamiento con un sistema de

inyección en flujo o mediante un sistema cromatográfico o electroforético.

Junto al sistema de entrada, la fuente de iones es la encargada de convertir

los componentes de la muestra en iones por bombardeo con electrones,

moléculas, fotones o por otros medios. En muchas ocasiones el sistema de

entrada y la fuente de iones están combinados en un único componente. Una vez

producidos los iones, éstos son acelerados hacia el analizador por aplicación de

campos eléctricos. En el analizador de masas los iones se separan en base a su

relación m/z, de forma que llegan al detector en diferentes momentos. Esta


68

pequeña corriente de iones se amplifica mediante el transductor, normalmente un

multiplicador de electrones que puede estar combinado con un multiplicador de

fotones [Rubinson, 2001; Skoog, 1996]. Estos cuatro componentes se encuentran,

generalmente, dentro de un sistema de vacío, a unas presiones de 10-7 – 10-10 atm,

necesarias para evitar colisiones con el gas de fondo u otras moléculas. Sólo en

algunos casos, el vacío se aplica tan sólo al analizador de masas y al detector. Por

último, una vez registrada la señal analítica, se procede a su procesado y análisis,

obteniéndose el espectro de masas. En el espectro de masas se muestran las

cantidades de masa recogidas a valores crecientes de la relación m/z. Cada pico

del espectro proporciona información sobre la masa de un determinado

fragmento de la molécula que lo originó. Para las fuentes habituales en HPLC y

CE, y para los espectros obtenidos en modo positivo, el fragmento de mayor

tamaño suele ser la molécula sin fraccionar con pérdida de un electrón, M+•, o

con la adición de un protón, [M+H]+, u otro catión.

I.5.4.1. Fuentes de iones

Las fuentes de iones más habituales son las siguientes [Rubinson, 2001]: EI,

CI, ESI, APCI, APPI, ICP y FAB. Dentro de estas, las fuentes más utilizadas en

el acoplamiento LC-MS, son la ESI, la APCI y la APPI. En esta sección sólo se

explica la fuente ESI, que es la que se ha empleado en alguno de los trabajos de

esta Tesis.

Dos características importantes de la ESI (Fig. I.17) son la generación de

iones en fase gas en la misma forma en que se encuentran en disolución, y la

relativa facilidad para impedir la entrada de grandes cantidades de disolvente en

el analizador de masas. Por esta última razón, la ESI es una fuente muy utilizada

en los acoplamientos HPLC-MS. En ESI la disolución de la muestra fluye a

través de una aguja hueca. La aguja se encuentra sometida a un campo eléctrico


69

elevado respecto a las paredes de la cámara de nebulización, por lo que se forman

pequeñas gotas con carga eléctrica. La aguja tiene dos flujos concéntricos, el

interior que lleva la muestra, y el exterior que lleva un gas que ayuda a la

formación del aerosol. Las gotas que poseen carga neta son atraídas hacia un

electrodo a través del espacio abierto de la cámara de nebulización. En la cámara,

las gotas se mueven en contra del gas de secado, que evapora parte del

disolvente.

Gas nebulizador

Aerosol

Entrada del capilar

Iones

Gas de secado

Fig. I.17. Esquema de una fuente ESI.

Como consecuencia de este proceso, el volumen de las gotas disminuye y

los iones de la superficie se ven forzados a aproximarse unos a otros. En un

momento dado, la repulsión de los iones se hace mayor que la tensión superficial

que mantiene unidas a las gotas y éstas se rompen (explosión de Coulomb). De

estas gotas se generan los iones en fase gas, que son atraídos hacia el orificio de

entrada del analizador de masas por la acción de un segundo campo eléctrico.

Dependiendo de la polaridad de este campo, en el analizador de masas entran

sólo los aniones (operación en modo negativo) o sólo los cationes (modo

positivo). Los procesos de generación de iones y evaporación del disolvente

tienen lugar en la superficie de las gotas, y cualquier cambio en la misma puede

ser muy importante. La fuente de ionización por electronebulización puede


70

producir iones con carga múltiple, lo que permite el análisis de compuestos de

elevada masa.

I.5.4.2. Analizadores de masas

La función de los analizadores de masas es la de separar iones con

diferentes relaciones m/z [Rubinson, 2001]. Existen diferentes tipos de

analizadores, y el poder de resolución del espectrómetro de masas dependerá

principalmente de las prestaciones del analizador. Los analizadores de masas más

ampliamente utilizados en HPLC y CE son el cuadrupolo (simple o triple), la IT

y el de tiempo de vuelo. En esta sección sólo se explica la trampa de iones, por

ser la empleada en algunos de los trabajos de esta Tesis.

Una IT permite analizar cationes y aniones en un amplio intervalo de

valores de m/z. Mediante la acción de campos eléctricos y magnéticos, los iones

se pueden confinar en un espacio reducido durante largos periodos de tiempo. Un

diseño sencillo de trampa de iones consiste en un electrodo en forma de anillo y

un par de electrodos colectores (electrodos de entrada y de salida). Al electrodo

anular se le aplica un potencial de radiofrecuencia variable, mientras que los

electrodos colectores están a potenciales alternos adecuados para estabilizar las

órbitas de los iones en el plano transversal o plano del anillo. Los iones que

tienen el valor apropiado de m/z se mueven en órbitas estables, cuyo radio

depende de un valor de m/z, dentro de la cavidad formada por el anillo.

Los iones procedentes de la fuente de ionización se introducen a través de

una abertura practicada en el electrodo colector superior, quedando atrapados en

órbitas estacionarias (Fig. I.18). A continuación, se desestabilizan mediante una

rampa de potencial continuo superpuesta al potencial alterno del electrodo de

salida. Los iones dejan la cavidad del anillo a través del electrodo de salida,


71

pasando al detector. En una IT, el proceso de carga y transmisión de iones al

detector es discontinuo.

Incremento de V

Eyección secuencial

Captura de iones

Fig. I.18. Esquema de funcionamiento de una IT.

Gas nebulizador

Entrada

Nebulizador

Desecho

Gas de secado

Vaporización y ionización

(ESI)

EnfoqueAnalizador

(IT)Detección

Fig. I.19. Esquema de un espectrómetro de masas con fuente ESI y

analizador IT.

La capacidad de retener iones en la IT permite obtener conjuntos de iones

hijos, que se pueden aislar o fragmentar para barrer espectros de segunda

generación o MS2. A su vez, los iones resultantes pueden ser de nuevo aislados y

fragmentados para barrer espectros de tercera generación o MS3, y así


72

sucesivamente. Las fragmentaciones en el interior de la IT se consiguen mediante

colisiones con moléculas de He.

En la Fig. I.19 se muestra un esquema de las diferentes partes de un

espectrómetro de masas compuesto por una fuente ESI y un analizador IT.

I.5.4.3. Acoplamiento de una técnica de separación a un MS

Los MS se pueden acoplar con GC, LC, SFC o con sistemas de CE o

CEC. Para mostrar todos los componentes eluidos en la separación se representa

un TIC. La intensidad en el TIC es la suma de las respuestas del detector a todos

los iones presentes en cada momento. También se pueden representar

cromatogramas a determinados valores de m/z, uno o varios. Estos se pueden

obtener de dos formas: como SIMs y, a partir de los datos almacenados en un

TIC, como EICs.

Cuando el cromatograma se registra a un valor m/z único (o a unos pocos

valores de m/z), en lugar de hacer un barrido en un intervalo de m/z, la técnica se

denomina SIM. Esta monitorización proporciona un límite de detección

considerablemente menor que un EIC, especialmente si el EIC se ha obtenido a

partir de un barrido muy amplio de valores de m/z. Además, un SIM permite

simplificar la señal en cromatogramas complejos que presenten numerosas

interferencias.

Para introducir en el espectrómetro el efluente procedente de un

cromatógrafo líquido o de una separación electroforética, es necesario utilizar

una interfaz adecuada. La misión de la interfaz es eliminar en lo posible la fase

móvil sin distorsionar el perfil de concentraciones de los analitos. Actualmente,

las fuentes ESI, APCI y APPI son las interfaces más utilizadas en los

acoplamientos HPLC-MS, CE-MS y CEC-MS. Una limitación de los

acoplamientos LC-MS o CE-MS es que los modificadores de la fuerza eluyente,


73

los tampones o electrolitos de fondo deben ser volátiles, para reducir en lo

posible los límites de detección y minimizar las posibles interferencias en el

espectrómetro.

I.5.4.4. Resolución

La capacidad de un espectrómetro de masas para distinguir entre masas

similares se expresa normalmente en términos de resolución, R, que se define

como:

R = m/∆m (E.I.15)

Siendo m la masa nominal del primer pico, e ∆m el poder resolutivo del

espectrofotómetro que se define como la anchura del primer pico a una fracción

dada de la altura, con frecuencia a un 10% o a un 50%.

La resolución que se necesita en un espectrómetro de masas depende en

gran parte de su aplicación. Por ejemplo, para diferenciar entre iones de la misma

masa nominal pero con diferentes masas exactas, se necesitan equipos de elevada

resolución.

I.5.5. NMR

La espectroscopía de NMR fue desarrollada a finales de los años cuarenta

para estudiar los núcleos atómicos. En 1951, se descubrió que la espectroscopía

de resonancia magnética nuclear podía ser utilizada para determinar las

estructuras de los compuestos orgánicos. Esta técnica espectroscópica puede

utilizarse sólo para estudiar núcleos atómicos con un número impar de protones o

neutrones (o de ambos). Esta situación se da en núcleos de una docena de

elementos, entre ellos los de 1H, 13C, 19F y 31P. Este tipo de núcleos son

magnéticamente activos, es decir poseen espín no nulo. En el seno de un campo


74

magnético estos núcleos se comportan como pequeños imanes, pudiendo adquirir

un movimiento de precesión, cuyos niveles están cuantizados.

En ausencia de campo magnético, los espines nucleares se orientan al azar.

Sin embargo, cuando una muestra se coloca en un campo magnético, los núcleos

con espín positivo se orientan en la misma dirección del campo, en un estado de

mínima energía denominado estado de espín α, mientras que los núcleos con

espín negativo se orientan en dirección opuesta a la del campo magnético, en un

estado de mayor energía denominado estado de espín β. Existen más núcleos en

el estado de espín α que en el β siendo esta diferencia suficiente para establecer

las bases de la espectroscopía de NMR.

La diferencia de energía entre los dos estados de espín α y β, depende de

la fuerza del campo magnético aplicado H0. Cuanto mayor sea el campo

magnético, mayor diferencia energética habrá entre los dos estados de espín.

Cuando una muestra es irradiada brevemente por un pulso intenso de radiación,

los núcleos en el estado de espín α son promovidos al estado de espín β. Esta

radiación se encuentra en la región de las radiofrecuencias (rf) del espectro

electromagnético, por ello se le denomina radiación rf. Cuando los núcleos

vuelven a su estado inicial, emiten señales cuya frecuencia depende de la

diferencia de energía (∆E) entre los estados de espín α y β. El espectrómetro de

NMR detecta estas señales y las registra como una gráfica de frecuencias frente a

intensidad, que es el llamado espectro de NMR. El término NMR procede del

hecho de que los núcleos están en resonancia con la radiofrecuencia de la

radiación rf. Es decir, los núcleos pasan de un estado de espín a otro como

respuesta a la radiación rf a la que son sometidos. La siguiente ecuación muestra

la dependencia entre la frecuencia de la señal (ν) y la fuerza del campo

magnético H0 (medida en Teslas, T).

02HhhE

πγν ==∆ (E.I.16)


75

donde h es la constante de Planck y γ el radio giromagnético. El valor de este

último depende del tipo de núcleo que se está irradiando.

I.5.5.1. Espectrómetro de NMR

En la Fig. I.20 se muestran de forma esquemática los principales

componentes de un equipo para medidas de NMR.

Tubo con muestra

Espectro de NMR

Imán superconductor

Detector y

AmplificadorGenerador de

radiofrecuencia y ordenador

Fig. I.20. Esquema de un espectrómetro de NMR.

Como se aprecia, el espectrómetro de NMR consta de cuatro partes: un imán con

un controlador que produce un campo magnético preciso y estable, un transmisor

de radiofrecuencias, un detector para medir la absorción de energía de rf de la

muestra, ordenador y un registrador para obtener el espectro de NMR.

Para obtener un espectro de NMR, se coloca una pequeña cantidad del

analito en un disolvente en un tubo de vidrio largo que se sitúa dentro del campo

magnético. El campo magnético se mantiene constante mientras un breve pulso

de radiación rf excita a todos los núcleos simultáneamente. Dado que el corto

pulso de radiofrecuencia cubre un amplio intervalo de frecuencias, los protones

individualmente absorben la radiación de frecuencia necesaria para entrar en

resonancia (cambiar de estado de espín). A medida que dichos núcleos vuelven a


76

su posición inicial emiten una radiación de frecuencia igual a la diferencia de

energía entre estados de espín. La intensidad de esta frecuencia disminuye con el

tiempo a medida que todos los núcleos vuelven a su estado inicial. Un ordenador

recoge la intensidad respecto al tiempo y convierte dichos datos en intensidad

respecto a la frecuencia. La operación matemática conocida como transformada

de Fourier (FT) permite realizar dicha conversión entre los dominios del tiempo

y de la frecuencia.

I.5.5.2. NMR de 1H

Hasta ahora se ha descrito el concepto de resonancia de un núcleo aislado

dentro de un campo magnético, pero los núcleos se encuentran rodeados de

electrones que los protegen parcialmente del campo magnético externo al que se

ven sometidos. Los electrones se mueven generando un pequeño campo

magnético inducido que se opone al campo magnético externo. En cualquier

molécula, la nube electrónica que existe alrededor de cada núcleo actúa como

una corriente eléctrica en movimiento que, como respuesta al campo magnético

externo, genera una pequeña corriente inducida que se opone a dicho campo. El

resultado es que el campo magnético que realmente llega al núcleo es más débil

que el campo externo, por tanto, se dice que el núcleo está apantallado. Este

apantallamiento es importante desde el punto de vista experimental, ya que el

campo magnético efectivo (Hef) que siente un protón dentro de una molécula es

siempre menor que el campo externo, y por lo tanto, para que el núcleo entre en

resonancia dicho campo externo debe ser mayor.

Si todos los protones (1H) de una molécula estuvieran apantallados de

igual forma, todos entrarían en resonancia con la misma combinación de

frecuencia y campo magnético. Sin embargo, los protones se hallan dentro de

entornos electrónicos diferentes y, por tanto, diferentemente protegidos o


77

apantallados. Por lo general, los efectos de apantallamiento de las nubes

electrónicas que rodean a cada protón son diferentes, lo que provoca diferentes

frecuencias de emisión. El resultado es un espectro de diversas frecuencias donde

cada conjunto de núcleos específicos da origen a una señal única de NMR. Las

variaciones en las frecuencias de absorción de NMR, que tienen lugar debido al

distinto apantallamiento de los núcleos, reciben el nombre de desplazamientos

químicos (unidades δ ó ppm).

En la práctica, es difícil medir con suficiente exactitud y en términos

absolutos el campo magnético al que un protón absorbe, lo que impide distinguir

tipos de protones individuales, ya que las absorciones entre uno y otro tipo sólo

varían en unas pocas milésimas. Un método más exacto para expresar

desplazamientos químicos es determinar el valor respecto a un compuesto de

referencia que se añade a la muestra. La diferencia en la intensidad del campo

magnético necesario para la resonancia de los protones de la muestra y de los

protones de referencia se puede medir con mucha exactitud. El compuesto de

referencia más común en NMR es el TMS ((CH3)4Si). Como el silicio es menos

electronegativo que el carbono, los grupos metilo del TMS son relativamente

ricos en electrones, estando sus protones fuertemente apantallados. Como

consecuencia, estos protones absorben a una intensidad de campo mayor que el

resto de protones enlazados al carbono o a otros elementos, de manera que casi

todas las señales de NMR aparecen a campos más bajos. Además, todos los

protones del TMS absorben con el mismo desplazamiento químico dando una

única absorción intensa. Las escala más común de desplazamiento químico es la

escala δ, en la que la absorción del TMS se define como 0,00 δ. La mayor parte

de los protones absorben a campos menores que el TMS, de modo que la escala δ

aumenta hacia los campos menores. La mayoría de las señales de protones (1H)

varían entre 0 y 12 δ, mientras que las señales del 13C varían de 0 a 250 δ.


78

I.5.5.3. NMR de 13C

La resonancia magnética nuclear del 13C es complementaria a la del 1H.

Esta última se utiliza para deducir la estructura del esqueleto carbonado,

observando para ello los entornos magnéticos de los átomos de hidrógeno,

mientras que la espectroscopía de RMN del 13C determina el entorno magnético

de los átomos de carbono.

Aproximadamente el 99% de los átomos de carbono en una muestra

natural son del isótopo 12C. Este isótopo posee un número par de protones y un

número par de neutrones, por tanto, no tiene espín magnético y no puede dar

lugar a señales de NMR. El isótopo de 13C menos abundante tiene un número

impar de neutrones, lo que le confiere un espín magnético de 172, igual al del

protón. La espectroscopia de NMR de 13C es menos sensible que la de 1H, debido

a que sólo el 1% de los átomos de carbono presentes posee espín no nulo y a que,

además, la frecuencia de resonancia del 13C, para un campo magnético dado, es la

cuarta parte de la que se da en la RMN del 1H.

Los desplazamientos químicos del carbono son de 15 a 20 veces mayores

que los del hidrógeno, debido a que el carbono está directamente unido a los

átomos que resultan ser bien apantallantes o desapantallantes. Además, las

señales en el espectro del 13C son líneas verticales aisladas, es decir, no hay

desdoblamientos de espín-espín. Esto se debe a que sólo el 1% de los átomos de

13C entran en resonancia, ya que la probabilidad de que un núcleo de 13C sea

adyacente a otro núcleo de 13C es muy pequeña.


79

I.5.6. Algunas técnicas de tratamiento estadístico de datos

I.5.6.1. Análisis clasificatorio supervisado

En el análisis clasificatorio supervisado, se construyen modelos capaces

de pronosticar la pertenencia de un objeto a una categoría a partir de variables

cuantitativas o de escala. La matriz de datos contiene al menos una variable

categórica, que indica la categoría a la que pertenece cada objeto y que constituye

la respuesta o variable que se quiere predecir, y una o más variables de escala que

describen otras tantas características de los objetos y que se utilizan como

predictoras.

Para construir el modelo, es necesario disponer de una muestra de objetos

cuya categoría sea conocida y para los que también se conozcan los valores de

las variables predictoras. La pertenencia de los objetos a las categorías puede ser

supuesta, esto es, puede tratarse de una hipótesis a comprobar. La asignación de

los objetos a las categorías debe ser exhaustiva (todos los objetos pertenecen a

alguna categoría) y mutuamente exclusiva (ningún objeto pertenece a más de una

categoría). Estos objetos forman el conjunto de entrenamiento (training set), con

el cual se construye el modelo de clasificación. Una vez construido, el modelo se

utiliza para predecir la categoría de nuevos objetos a partir de la medida de las

predictoras. La predicción sobre un conjunto de evaluación (evaluation set)

permite validar el modelo, que luego se aplicará a predecir la categoría de las

muestras problema.

Se utilizan diversos tipos de técnicas clasificatorias, tales como el análisis

discriminante, que puede ser lineal (LDA) o cuadrático (QDA) y la técnica de las

ANN.


80

I.5.6.2. LDA

En LDA se utiliza un algoritmo que busca funciones o vectores

discriminantes, esto es, combinaciones lineales de las variables manifiestas que

maximizan la varianza entre categorías, a la vez que minimizan las varianzas

intra-categorías. Para construir el modelo, es necesario asignar los objetos del

conjunto de entrenamiento a una categoría dada. Para ello, se añade una variable

categórica a la matriz de datos conteniendo tantas categorías como sean

necesarias. El LDA estima los coeficientes a1, a2, …, am de la función

discriminante lineal, f, que es capaz de predecir la pertenencia de los objetos a

una u otra categoría:

mmxaxaxaf +++= ...2211 (E.I.17)

Las funciones discriminantes se contruyen de una en una, buscando las

direcciones del espacio que hacen máxima la expresión:

I

D

SC

SC='λ

donde SCD es la suma de cuadrados de las distancias euclídeas entre los objetos

que pertenecen a distintas categorías en la dirección que indica la función

discriminante buscada, y SCI es la suma de los cuadrados de las distancias

euclídeas entre los objetos que pertenecen a la misma categoría, también en la

dirección de la función discriminante. A partir de q categorías se obtienen q-1

funciones discriminantes (aunque si el número de variables predictoras, N, es

menor que q, se obtendrán N-1 funciones discriminantes). Las funciones

discriminantes se obtienen en orden decreciente de su valor de λ’, y manteniendo

la ortogonalidad entre ellas.

La función λ’ no está acotada, por lo que varía ampliamente con el

número de objetos y con la separación entre ellos. Por ello, en lugar de

maximizar λ’, se suele minimizar la lambda de Wilks, que se define como:

(E.I.18)


81

DI

IW SCSC

SC

+=

+=

'11

λλ

Esta función toma valores entre 0 y 1. Categorías bien resueltas proporcionan

valores de λw próximos a 0, mientras que categorías solapadas dan valores de λw

cercanos a la unidad.

(E.I.19)

CAPÍTULO II

OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO

Capítulo II. Objetivos y plan de trabajo

85

La presente Memoria se enmarca dentro de una de las líneas de

investigación del grupo, financiada principalmente por el MICINN y fondos

FEDER (proyecto CTQ2007-61445, cuyo investigador principal es el Dr.

Guillermo Ramis), y cuyo objeto general es el desarrollo de métodos analíticos

para el control industrial y ambiental de componentes de los productos de

limpieza. En consecuencia, el objetivo principal de los trabajos presentados en

esta Memoria es la puesta a punto de métodos de análisis rápidos y fiables para

diferentes analitos de la industria de la detergencia. La presente Memoria puede

dividirse en cuatro grandes bloques. El primer bloque está dedicado a los

surfactantes, tanto no iónicos como aniónicos (capítulos IV y V). El segundo y

tercer bloque están dedicados a los polímeros sintéticos (capítulo VI) y a las

enzimas (capítulo VII), utilizados en productos de limpieza. Por último, y

entroncando con otra de las líneas de investigación del grupo, uno de los bloques

de esta Memoria está dedicado a la preparación de columnas monolíticas para

CEC. En particular, en este bloque se muestra el trabajo realizado en el campo de

la optimización de columnas, con el objeto de aplicar dichas columnas a la

separación de digestos de enzimas obtenidos con tripsina, trabajo actualmente en

desarrollo, y que por razones de tiempo no se incluye en esta Memoria.

II.1. Surfactantes

II.1.1. APGs

Se propone el desarrollo de métodos para la separación y determinación de

APGs. El estudio de la separación de mezclas de APGs se llevó a cabo mediante

HPLC-MS usando columnas de alquilamida y cianopropilo, con mezclas

ACN/agua como fases móviles. Se optimizaron las condiciones de elución para

conseguir la resolución completa de epímeros (α- y β-) e isómeros de anillo


86

(piranósidos y furanósidos) de los APGs, tanto en materias primas industriales

como en productos manufacturados. Asimismo, se estudió la influencia de

distintos parámetros en los factores de respuesta de los APGs. Los

procedimientos establecidos se aplicaron a la caracterización y determinación de

APGs en productos de aseo personal.

Por otro lado, se propone el estudio de la fragmentación secuencial de los

AMGs, que son los principales componentes de los APGs industriales. La

producción industrial de APGs conduce a mezclas que, además de contener

importantes cantidades de AMGp, (isómeros de anillo con 6 miembros)

presentan pequeñas aunque significativas concentraciones de AMGf (isómeros

de anillo con 5 miembros). Así pues, se obtendrán y describirán los espectros

CID tanto para los AMGp como para AMGf, utilizando diferentes formas

isotópicas de la glucosa para ayudar a su interpretación. Para la obtención de los

espectros, se empleó infusión directa en MS-IT, o bien, HPLC-MS-IT.

II.1.2. Alcoholes

Se pretende el desarrollo de un procedimiento de derivatización que

permita aumentar la sensibilidad de los alcoholes no etoxilados y etoxilados por

ESI-MS-IT. Para ello, los alcoholes primarios serán previamente oxidados a sus

correspondientes ácidos carboxílicos con el reactivo de Jones. Los extractos se

infundirán directamente en ESI-MS-IT. El estudio se extenderá a FAEs y a los

disolventes conocidos como Cellosolves, que al oxidarse proporcionan los

correspondientes ácidos etoxi-carboxílicos. Los procedimientos establecidos se

aplicarán a la caracterización y determinación de alcoholes grasos en muestras

complejas, tales como cosméticos y productos de aseo personal, así como a

muestras ambientales como agua de mar.


87

II.1.3. AES

En trabajos anteriores del grupo de investigación en el seno del cual cual

se ha realizado la presente Tesis, y en el marco de una de sus líneas de

investigación, se desarrollaron diferentes procedimientos para la determinación

de FAEs mediante RP-HPLC-UV, previa derivatización de los alcoholes con un

anhídrido cíclico [Micó-Tormos, 2008-A; Micó-Tormos, 2008-B; Micó-Tormos, 2009;

Micó-Tormos, 2010]. Sin embargo, se ha observado que los anhídridos cíclicos

causan la derivatización tanto de FAEs como AESs, dando lugar a exactamente

los mismos derivados, en concreto, los hemiésteres del ácido correspondiente al

anhídrido utilizado. Se pretende desarrollar un método para la separación,

caracterización y determinación mezclas de FAEs y AESs en muestras tanto

industriales como ambientales. Para ello la separación de las dos familias de

surfactantes se llevará a cabo mediante SPE utilizando un cartucho SAX. Tras la

optimización de los parámetros de extracción se emplearán las técnicas de

derivatización anteriormente publicadas con diferentes anhídridos cíclicos.

Finalmente se separarán los oligómeros obtenidos mediante HPLC-UV. El

método resultante se aplicará a la caracterización y determinación de FAEs y

AESs en muestras de diferente naturaleza.

II.2. Polímeros

II.2.1. PVP-NO

Se estudiará la migración característica del PVP-NO, tanto en FSCE como

en MEKC. Estas dos técnicas pueden proporcionar información sobre el

comportamiento cualitativo de polímeros en disolución, así como información

cuantitativa sobre muestras que contienen estos aditivos. Se discutirá la

naturaleza de las señales obtenidas en base a los estudios de la bibliografía, así


88

como a los nuevos resultados. Para prevenir la adsorción del polímero sobre las

paredes del capilar se utilizará PEA, que en disoluciones ácidas existe como ion

doble de baja masa molecular (sin carga eléctrica neta). Este tipo de aditivo

puede usarse en elevadas concentraciones sin causar un aumento significativo de

la conductividad del BGE. Finalmente, se demostrará la utilidad de la FSCE para

determinar este polímero en aditivos comerciales para el lavado de textiles.

II.2.2. PVP

Se pretende desarrollar de un método para la caracterización y

determinación de PVP en productos de limpieza mediante CZE. Dado que la

movilidad electroforética del PVP es casi cero, se emplearán colorantes azoicos

que formen complejos con el polímero. Estos sistemas pueden interpretarse a la

luz de los estudios de Krylov y col., con aplicación de los principios en que se

basa la técnica conocida como NECEEM. A partir de los datos obtenidos y en

base a los estudios de la bibliografía, se buscarán diferentes parámetros

analíticos. Posteriormente los procedimientos establecidos se aplicarán a la

caracterización y determinación de PVP en productos de limpieza y formulados

farmacéuticos.

II.2.3. PVA

Siguiendo con la determinación de polímeros no iónicos mediante técnicas

de CE, se pretende el desarrollo de un método para la caracterización y

determinación de este polímero. Dado que la movilidad electroforética del PVA

es casi cero, al igual que se ha indicado más arriba para el PVP (apartado II.2.2),

se emplearán colorantes que formen complejos coloreados y cargados con el

PVA, seleccionando los colorantes que mejores resultados proporcionen;


89

finalmente, se interpretarán los resultados aplicando los principios de la

NECEEM.

II.3. Enzimas

II.3.1. CZE

Se pretende examinar enzimas intactas (proteínas nativas) mediante CZE

con detección UV, como medio de clasificación e identificación de enzimas. Se

estudiarán las cuatro clases principales de enzimas utilizadas en productos de

limpieza: proteasas, amilasas, lipasas y celulasas. Para ello, las enzimas se

precipitarán con acetona, se redisolverán e inyectarán en el equipo de CE. Dado

que la carga y estructura de las proteínas dependen en gran medida del pH, y con

el objetivo de reunir más información para la identificación de enzimas, se

emplearán dos BGEs diferentes, uno a pH ácido y otro a básico. Se utilizará el

ensayo de Bradford para medir las concentraciones de proteína en las diferentes

enzimas industriales (seleccionando el BSA como proteína de referencia).

II.3.2. Aminoácidos por infusión directa en MS

Se pretende desarrollar un método rápido y simple para la clasificación de

enzimas presentes en productos de limpieza (proteasas, lipasas, amilasas y

celulasas). Para ello, se llevará a cabo su precipitación con acetona, seguida de

hidrólisis ácida, para obtener así los aminoácidos constituyentes. Los

correspondientes digestos de aminoácidos serán infundidos en ESI-MS-IT. Las

abundancias de los iones procedentes de los diferentes aminoácidos se utilizarán

para construir modelos de LDA, capaces de distinguir entre las diferentes clases

de enzimas.


90

II.3.3. Aminoácidos derivatizados con OPA-NAC

Se pretende desarrollar un método para la identificación de las clases de

enzimas en la industria de los detergentes. Para ello, las enzimas concentradas

industriales y las presentes en productos de limpieza se aislarán por precipitación

con acetona y se hidrolizarán con HCl. Los aminoácidos resultantes se

derivatizarán con OPA en presencia de NAC, y sus perfiles de concentración

serán establecidos por RP-HPLC con detección UV-Vis. A partir de las áreas de

los picos observados en los cromatogramas se construirán modelos LDA capaces

de predecir la clase de enzima: proteasa, lipasa, amilasa o celulasa. Los conjuntos

de entrenamiento se construirán a partir de los concentrados industriales de

enzimas, como también mediante bases de detergente aditivadas con enzimas.

II.3.4. Digestos con tripsina

Siguiendo en la línea de intentar identificar las diferentes enzimas

utilizadas en las formulaciones de productos de limpieza, se pretende buscar un

método alternativo basado en la digestión con tripsina, seguida de separación de

los péptidos resultantes por RP-HPLC con detección UV-Vis. Se compararán los

perfiles peptídicos obtenidos en los digestos utilizando diferentes soportes

cromatográficos, incluyendo columnas monolíticas comerciales (tanto

poliméricas, como de sílice) y columnas partículadas (tanto con relleno

convencional como con relleno de partículas con tecnología corteza-núcleo

(“shell-core”). Bajo las condiciones óptimas, se llevará a cabo el análisis de los

digestos con tripsina de enzimas de diferentes clases. Se utilizarán parámetros

como el número de picos, capacidad de pico y resolución global para evaluar

cada lecho cromatográfico. El método propuesto se aplicará tanto a la

caracterización de las enzimas presentes en bases de detergentes aditivadas,

como en detergentes comerciales.


91

II.4. Columnas monolíticas

II.4.1. Columnas monolíticas de lauril metacrilato fotopolimerizadas usando

LPO como iniciador

Se pretende describir la preparación de columnas monolíticas para CEC

usando LMA como base para sintetizar el polímero. La polimerización se llevará

a cabo mediante radiación UV utilizando LPO como iniciador. Para obtener

resultados satisfactorios se optimizará la composición de la mezcla de

polimerización (es decir, relaciones de monómeros/porógenos y

monómeros/agente entrelazante, así como la composición de los disolventes

porogénicos). La caracterización morfológica de las columnas se llevará a cabo

mediante fotografías SEM. Las prestaciones de estas columnas desde el punto de

vista de CEC se realizará mediante medida de los factores de retención y

eficacias de una serie de analitos no cargados. Además, se compararán las fases

estacionarias obtenidas mediante fotopolimerización con las obtenidas con

iniciación térmica.

II.4.2. Comparación de iniciadores para la preparación de columnas

monolíticas de metacrilato para CEC

Se describirá la preparación de columnas monolíticas de LMA para CEC

utilizando diferentes fotoiniciadores radicalarios. Los iniciadores a estudiar serán

AIBN, DMPA, BPO y LPO. Se estudiará la influencia de cada iniciador y su

contenido en una mezcla 1,4-butanodiol/1-propanol como disolventes

porogénicos. La caracterización morfológica de las columnas se realizará

mediante fotografías SEM. Además, se evaluarán sus prestaciones

cromatográficas mediante la medida de la retención y la eficacia de mezclas de

analitos no cargados.

CAPÍTULO III

MATERIALES Y M ÉTODOS

Capítulo III. Materiales y métodos

95

III.1. Surfactantes

III.1.1. APGs

III.1.1.1. Estándares, materias primas y otras muestras

Se utilizaron como estándares metil-α- (>99%), metil-β- (>99%), hexil-β-

(>98%), octil-α- (>98%), octil-β- (>99%), decil-β- (>99%) y dodecil-β-D-

glucopiranósidos (>99%, Fluka, Buchs, Suiza). En los estudios de determinación

de APGs se empleó el nonil-β-D-glucopiranósido (>99%, Glycon Bioch. GmbH.

Biotechnol., Luckenwalde, Alemania) como patrón interno. En los estudios de

fragmentación de la glucosa y APGs también se empleó D-glucosa anhidra

(Fluka, Buchs, Suiza), D-glucosa-13C6 (99% átomos de 13C), D-glucosa-6,6-d2

(98% de átomos deuterados), D-glucosa-1-13C (99% átomos 13C) (Sigma-

Aldrich, Steinheim, Alemania). También se usaron las mezclas comerciales de

APGs Glucopone 215 CS UP y Plantacare 818 UP (Fluka). Los productos de

cuidado personal como crema de manos y champú para niños se adquirieron en

establecimientos locales.

III.1.1.2. Reactivos de uso general

Los diferentes disolventes empleados fueron de grado HPLC. Se utilizó

ACN, MeOH, HAcO, HCl, NaHCO3 (Scharlab, Barcelona, España), NaAcO

(Sigma–Aldrich, Steinheim, Alemania) y agua desionizada (desionizador

Barnstead, Sybron, Boston, MA, USA).

III.1.1.3. Instrumentación y condiciones de trabajo

Se empleó un espectrómetro de masas 1100 Series VL IT-MS, provisto de

una fuente ESI (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania). Para infusión


96

directa en MS se empleó una bomba de jeringa (kdScientific, Holliston, MA,

USA) con la cual se mantuvo un flujo constante de entrada de 0,3 mL h−1 (5 µL

min−1). En HPLC, se empleó una columna de alquilamida (100 mm × 2,1 mm, 3

µm ID, Supelco, Bellefonte, USA) y una de cianopropilo (75 mm × 3 mm, 3 µm

ID, Supelco). Como fases móviles se utilizaron mezclas de ACN/agua, que

contenían 40 mM de tampón HAcO/NaAcO (pH 4,7), a un flujo de 0,2 mL

min−1. Para acelerar la elución isocrática con fases móviles que contenían un

20% de ACN también se empleó un flujo de 0,4 mL min−1. El intervalo de

barrido de masas fue de m/z 50–800, siendo el voltaje del capilar de 4 kV. Se

utilizó el valor de m/z del ion más abundante como “masa objetivo” cuando se

inyectaban mezclas de estándares, y el valor m/z correspondiente a [M+Na]+

cuando se inyectaban los estándares. En todos los casos, el máximo de carga de

la trampa de iones fue de 3×104 cuentas, con un tiempo máximo de acumulación

de 300 ms. En los experimentos de infusión directa, los espectros se obtuvieron

promediando la señal durante 2 min. Como gas de nebulización y de secado se

empleó nitrógeno (generador Gaslab NGLC MS 20, Equcien, Madrid, España).

La nebulización se efectuó a 25 psi y 8 L min−1, y la temperatura del gas de

secado fue de 300 ºC. Como gas de colisión se utilizó He (C-50, Carburos

Metálicos, Aranjuez, España). Se empleó el software Agilent LC/MSD ver. 4.2

para el tratamiento de datos. Para obtener los espectros de MS de alta resolución

se empleó un VG Autospec (VG Analytical, Micromass Instruments,

Manchester, UK) provisto de una fuente FAB.

III.1.1.4. Preparación de estándares y muestras

Las disoluciones de estándares y de los APGs comerciales se prepararon a

una concentración de 1000 µg mL−1 en MeOH/agua 50:50 (v/v), excepto para el

estándar C12G1, cuya concentración fue de 500 µg mL−1 por razones de


97

solubilidad. En infusión directa, las disoluciones fueron diluidas en proporción

50:50 (v/v) con una mezcla de MeOH/agua 50:50 (v/v) conteniendo NaAcO 20

mM. En HPLC, se emplearon concentraciones de 2000 µg mL−1 de Glucopone y

Plantacare en mezclas 50:50 (v/v) de MeOH/agua. Una crema de manos y un

champú para niños se diluyeron en proporción 1:100 con una mezcla 50:50 (v/v)

de MeOH/agua. Las disoluciones inyectadas se pasaron a través de filtros de

nylon de 0,45 µm de tamaño de poro (Albet, Barcelona). Los volúmenes de

inyección en HPLC fueron de 20 µL. Los espectros de alta resolución se

obtuvieron con disoluciones diluidas de D-glucosa y hexil, octil- y decil-β-D-

glucopiranósido en 50:50 (v/v) MeOH/agua.

III.1.2. Alcoholes


Los alcoholes primarios no etoxilados y etoxilados se designarán como

CnEm como se indica en la sección I.2.4. Los ácidos carboxílicos y

etoxicarboxílicos provenientes de la oxidación con óxido de cromo(VI) de los

alcoholes primarios no etoxilados y etoxilados, respectivamente, se designarán

como CnEmA.

Como estándares se emplearon los alcoholes no etoxilados: C3E0

(Scharlab, Barcelona, España), C8E0, C10E0, C12E0, C14E0, C16E0 y C18E0

(Fluka, Buchs, Suiza); los alcoholes etoxilados: C2E1, C4E2, C8E1, C12E1,

C12E2, C18E1 (Fluka), C12E3, C12E4, C12E5, C12E6 (suministrados por C.

Solans, CSIC, Barcelona); los ácidos carboxílicos: C2E0A, C3E0A, C8E0A,

C10E0A, C12E0A (Fluka), C14E0A, C16E0A y C18E0A (Sigma-Aldrich,

Steinheim, Alemania) y los ácidos etoxicarboxílicos: C1E1A, C1E2A, C1E3A y

C2E1A (Fluka). También se empleó la mezcla comercial FINDET 10/18 (una


98

mezcla de oligómeros C10Em con un EO promedio nominal de 6, y que contiene

aproximadamente un 20% de agua, Molins-Kao, Barcelona). Los cosméticos y

productos para el cuidado corporal fueron adquiridos en las tiendas locales. Las

muestras de agua de mar se recogieron en contenedores de polietileno, en una

playa cerca a la zona urbana de La Pobla de Farnals (Valencia, España).


Los diferentes disolventes empleados fueron de grado HPLC. Se utilizó

HAcO, MeOH, acetona, acetato de etilo, ACN, HCl y H2SO4 (Scharlab),

butilamina (Fluka), TMBA (como patrón interno, Sigma-Aldrich), sulfito de

sodio anhidro, y el óxido de cromo(VI) (Panreac, Barcelona), todos de grado

analítico. También se empleó agua desionizada (véase apartado III.1.1.2).


Se emplearon un espectrómetro de masas y una bomba de jeringa para la

infusión directa de las muestras (véase apartado III.1.1.3). El intervalo de barrido

de masas fue de m/z 50–800, en los modos NI y PI. El voltaje del capilar fue de 4

kV, el voltaje de la segunda máscara se fijó en 6 V, mientras que el voltaje de la

primera máscara se selecciona automáticamente en función de la masa objetivo.

La nebulización se efectuó a 15 psi y 3 L min−1, y la temperatura del gas de

secado fue de 250ºC. En los estudios de cuantificación, la intensidad máxima

(tanto de los analitos como del patrón interno) se determinaron utilizando la masa

de cada pico como “masa objetivo” para reducir al mínimo la influencia de éste

parámetro en la sensibilidad. Otros parámetros o métodos de trabajo son los

indicados en el apartado III.1.1.3. Para estudiar el efecto de la temperatura sobre

el rendimiento de la reacción, se utilizó un baño de agua equipado con una sonda

de temperatura (RTC+ETS-D4, IKA, Staufen, Alemania).


99


A menos que se indique lo contrario, el reactivo de Jones se preparó con

6,7 g de CrO3 y 6 mL de ácido sulfúrico, completando el volumen hasta 50 mL

con agua [Burke, 1999]. Las disoluciones madre de los estándares se prepararon

disolviendo los alcoholes (50 mg de cada uno) en acetona (25 mL). Alícuotas de

250 µL de estas disoluciones se introdujeron en tubos de centrífuga provistos de

tapón de rosca, añadiéndose 3 mL de acetona y 1 mL del reactivo de Jones, este

último fue añadido gota a gota con agitación constante a temperatura ambiente.

Tras 5 minutos, se adiciona 0,5 mL de HCl 2M, obteniéndose una disolución de

sales de cromo(III). El exceso de reactivo de Jones, indicado por el color amarillo

de la disolución, se eliminó añadiendo, con agitación, unos 150 mg de Na2SO3.

Posteriormente, se añadió 4 mL de acetato de etilo. La mezcla se agitó para

favorecer la extracción y luego se centrifugó para acelerar la separación en dos

fases. La fase superior transparente e incolora (con un volumen aproximado de 7

mL) contiene los ácidos carboxílicos y etoxicarboxilicos en un medio de acetato

de etilo/acetona (4:3; v/v). Las sales de cromo(III) permanecen en la fase acuosa

(capa inferior) con un volumen de aproximadamente 1 mL. A alícuotas de 2 mL

de la fase orgánica se les añadió 0,2 mL de una disolución acuosa de butilamina

(0,33 M) que contenía TMBA (5,5 mM), este último incorporado como patrón

interno. Esta mezcla se introdujo directamente en el equipo MS.

Para la preparación de la mezcla industrial FINDET 10/18, y las muestras

de productos cosméticos y de cuidado personal, se tomó 1 y 2 g,

respectivamente, se añadió 10 mL de acetona, la mezcla se agitó magnéticamente

durante 10 min, se centrifugó y se tomaron alícuotas del sobrenadante (3 mL).

Como se estudia en la sección IV.2.1, la reducción de la cantidad de agua antes

de la adición del reactivo de Jones es un factor importante para obtener unos

altos rendimientos de la oxidación. Por este motivo, para muestras con un alto


100

contenido de agua se tomaron volúmenes más pequeños del sobrenadante (0,25 -

1 mL); estas alícuotas fueron diluidas con acetona hasta un volumen final de 3

mL.

El análisis de agua de mar se realizó tomando dos muestras de 5 L cada

una. Un volumen de 2 L, tomado de la parte superior de cada contenedor, se pasó

a través de cartuchos de SPE (C18, 500 mg/ 6 mL, 55 µm, 140 Å, Phenomenex,

Torrance, CA, USA) a un flujo de 5 mL min-1. Estos cartuchos se eluyeron con

tres porciones de 2 mL de acetona. El volumen de los eluatos se redujo de 6 a

unos 3 mL por evaporación en corriente de nitrógeno a temperatura ambiente.

Tras la evaporación, se efectuó la oxidación y extracción, tal como se ha descrito

antes. Para construir un blanco de referencia, se tomó un tercer volumen de 2 L

de agua de mar, y se procedió a extracción (SPE) y reducción del eluato a 3 mL,

como anteriormente se ha indicado. En el procedimiento de oxidación de este

eluato, el reactivo de Jones fue sustituido por ácido sulfúrico diluido, siendo el

resto del procedimiento de oxidación y de extracción el indicado previamente.

Los espectros MS de los extractos de acetato de etilo/acetona se

registraron en modo NI, y se midieron las abundancias de los iones [M-H]- de los

ácidos carboxílicos y etoxicarboxílicos. En los estudios de rendimiento de

oxidación-extracción, los espectros también se obtuvieron en modo PI, y los

picos de los iones [M+H]+ correspondientes a los alcoholes etoxilados se

compararon con los espectros de los correspondientes ácidos etoxicarboxílicos

obtenidos en modo NI. Para obtener espectros en modo PI, alícuotas de 1 mL de

los extractos de acetato de etilo/acetona se acidificaron con 0,1 mL de HCl 2 M

(en lugar de la disolución de butilamina), esta disolución se diluyó con 1 mL de

ACN, y se infundió en la interfaz ESI del MS. Cuando fue necesario, se empleó

el TMBA como patrón interno, ya que proporciona los picos [M-H]- y [M+H]+ en

los modos NI y PI, respectivamente.


101

III.1.3. AESs


Como estándares de FAEs se emplearon: C8E0, C12E0, C14E0 (Sigma-

Aldrich, Steinheim, Alemania) y Dehydol LT-7 (mezcla comercial industrial de

FAEs, 12 ≤ n ≤ 18, m = 7, Cognis, Monheim, Alemania). Como estándares de

AESs se emplearon: C8E0S, C12E0S (SDS) (Fluka, Buchs, Suiza) y una mezcla

industrial comercial nominalmente lauril sulfato, si bien otros residuos de alcohol

graso están también presentes en cantidades importantes (LES, 12 ≤ n ≤ 18,

m =3, suministrado por Químicas Oro). Con el objetivo de estudiar posibles

interferencias con otras clases de surfactantes comúnmente empleados en las

formulaciones, se utilizaron las mezclas comerciales de LAS (mezcla industrial

de oligómeros con 10 ≤ n ≤ 13) y SAS (mezcla industrial de oligómeros con 14 ≤

n ≤ 16) (suministrados por Químicas Oro). Otras muestras industriales de AESs

fueron suministradas por Químicas Oro e Industria Jabonera Lina (Torras de

Cotillas, Murcia, España). Los detergentes comerciales fueron adquiridos en las

tiendas locales. Las muestras de agua de mar se recogieron en contenedores de

polietileno, en una playa cerca a la zona urbana de La Pobla de Farnals

(Valencia, España).


Se utilizaron los siguientes disolventes (grado HPLC) y reactivos (grado

analítico): MeOH, HAcO, ACN, NH3, DMSO (Panreac, Barcelona, España),

anhídrido ftálico (≥ 99%), urea (99,5%) (Fluka), HCl, anhídrido difénico (98%) y

1,4-dioxano (99,8%, Sigma-Aldrich). También se empleó agua desionizada

(véase apartado III.1.1.2).


102


Se empleó un cromatógrafo de líquidos (HP 1100, Agilent, Waldbronn,

Alemania), constituido por una bomba cuaternaria, un desgasificador en línea, un

compartimento termostatizado de columnas, un muestreador automático y un

DAD. Cuando fue necesario, el cromatógrafo se acopló a un espectrómetro de

masas 1100 Series VL IT-MS, provisto de una fuente ESI (véase apartado

III.1.1.3). La columna empleada fue una C8 del tipo núcleo fundido (Ascentis-

Express, 2,7 µm, 15 cm x 4,6 mm de ID, Supelco, Bellefonte, PA, USA). La

elución se llevó a cabo mediante la mezcla de dos disoluciones que contenían

ACN/agua, con un 50% (A) y un 100% de ACN (B), en presencia de un 0,1% de

HAcO en ambas mezclas. El flujo fue de 1 mL min-1, y a no ser que se indique lo

contrario, la fase móvil se varió de forma lineal de A a B en 50 minutos. Los

volúmenes de inyección fueron de 20 µL, siendo las alícuotas filtradas

previamente mediante un filtro de nylon (Albet, Barcelona) de 0,45 micras de

tamaño de poro. La detección se realizó a 230 ± 10 nm con una referencia fijada

a 360 ± 60 nm. Las áreas de los picos se midieron con el software ChemStation

para LC v.10.02 (Agilent). Cuando fue necesario, se utilizó HPLC-MS, con un

rango de barrido de masas de m/z 100–900 en modo NI. El voltaje del capilar fue

de 4 kV, el voltaje de la segunda máscara se fijó en 6 V, mientras que el voltaje

de la primera máscara se seleccionó automáticamente en función de la masa

objetivo. La masa objetivo se fijó a un valor de m/z de 400. La nebulización se

efectuó a 35 psi y 7 L min−1, y la temperatura del gas de secado fue de 300 ºC.

Otros parámetros o condiciones de trabajo son las indicadas en el apartado

III.1.1.3. También se emplearon los siguientes cartuchos de SPE (Phenomenex,

CA, EE.UU.): Strata C18-E (500 mg/ 6 mL, 55 µm, 140 Å) y Strata SAX (1000

mg/ 6 mL, 55 µm, 70 Å). Cuando fue necesario, parte de los disolventes fueron

evaporados en una centrífuga a vacío (miVac, Genevac, Ipswich, Reino Unido).


103


Para los estudios de calibración, se prepararon disoluciones madre de

C8E0 y C12E0 (2 mg mL-1) en 1,4-dioxano. También, se utilizaron disoluciones

madre de C8E0S y C12E0S (2 mg mL-1) en 1,4-dioxano con un 7% de DMSO

para facilitar su disolución. Por otro lado, en los estudios de separación con

cartuchos SAX, se prepararon disoluciones madre de C14E0 y C12E0S (5 mg

mL-1) en MeOH. Estas disoluciones madre se utilizaron para preparar las mezclas

de 0,5 mg mL-1 de cada estándar, en medios con diferentes proporciones de

MeOH/agua (20:80, 50:50 y 80:20, todos como v/v). Para los estudios de

separación en SAX, también se prepararon disoluciones concentradas (40 mg

mL-1) de mezclas industriales de FAEs (Dehydol LT-7) y AES (LES), así como

mezclas de las mismas (aproximadamente 20 mg mL-1 de cada clase de

surfactante) en 50:50 MeOH/ agua. Alícuotas de 1 mL de estas disoluciones se

diluyeron a 5 mL con las cantidades adecuadas de MeOH y agua, para obtener

mezclas con diferentes proporciones MeOH/ agua (20:80, 50:50 y 80:20).

En el análisis de productos comerciales (detergentes), se llevó a cabo una

etapa de limpieza, previa a la separación con los cartuchos SAX. Para ello, se

pesaron 0,1 g del detergente y se diluyó hasta 25 mL con agua. Esta disolución se

pasó por un cartucho de SPE C18, previamente acondicionado con agua. La

elución se efectuó con dos alícuotas, primero una de 2,5 mL de MeOH/ agua

50:50, seguida de otra de 2,5 mL de MeOH/ agua 80:20. Tras la elución, se

añadió la cantidad de agua necesaria para reducir la concentración de MeOH al

50% antes de la separación de las dos clases de surfactantes el cartucho SAX. El

análisis del agua de mar se realizó tomando dos muestras de 5 L cada una. Un

volumen de 2 L, tomado de la parte superior de cada contenedor, se pasó a través

de cartucho de SPE C18, a un flujo de unos 5 mL min-1. La elución del cartucho


104

SPE C18, se efectuó como se ha indicado anteriormente en la elución de los

detergentes.

El procedimiento optimizado de la separación con el cartucho SAX para

SPE se indica en el esquema de la Figura III.1 . En primer lugar, el cartucho

SAX se acondicionó con una mezcla 50:50 MeOH/ agua. Luego, la muestra que

contiene FAEs y AESs en un medio MeOH/ agua 50:50, se pasó a través del

mismo. Con esta operación los AESs se quedan retenidos en el cartucho,

mientras que la mayoría de los FAEs son eluidos (fracción 1). El cartucho se lavó

con el mismo medio MeOH/ agua 50:50, para eliminar así los restos de cationes

(fracción 2), quedando los AES retenidos fuertemente sobre los sitios activos del

cartucho catiónico. Una pequeña parte de los FAEs más hidrofílicos también

eluyen con la fracción 2. Seguidamente, el cartucho se lavó con una mezcla

MeOH/ agua (80:20); el mayor contenido de MeOH de esta mezcla facilita a la

elución de los oligómeros más hidrofóbicos de los FAEs, constituyendo la

fracción 3. Las fracciones de FAEs 1 + 2 + 3 se combinan en un único tubo con

tapón de rosca de 15 mL. La elución de los AES de los cartuchos SAX se realizó

con mezclas MeOH:HCl, en diferentes proporciones, utilizando HCl acuoso

concentrado. Para ello, la fracción 4 formada por los AESs hidrofílicos se eluye

con una mezcla MeOH:HCl 80:20 (concentración de ácido en la mezcla, 2,4 M).

Los AESs más hidrofóbicos (fracción 5) se eluyen con una mezcla MeOH:HCl

95:5 (concentración de ácido en la mezcla, 0,6 M). Las fracciones de AESs 4 + 5

se combinan en un segundo tubo con tapón de rosca de 15 mL. Seguidamente

esta última fracción combinada se neutraliza gota a gota con NH3 acuoso

concentrado en presencia de una gota de fenolftaleína al 1% en MeOH, , hasta

viraje del indicador. Las disoluciones de FAEs y AESs recogidas fueron

evaporadas bajo corriente de nitrógeno. La eliminación de los últimos restos de

disolvente se realizó en una centrífuga evaporadora a vacío.


105

FAEs + AESs (50:50 MeOH:H2O)

SA

X

50:50 MeOH:H2O (eliminación de cationes)

80:20 MeOH:H2O (FAEs hidrofílicos)

80:20 MeOH:HCl (AESs hidrofílicos)

95:5 MeOH:HCl (AESs hidrofóbicos)

Fracción 1 (FAEs hidrofílicos)

Fracción 2

Fracción 3

Fracción 4

Fracción 5

Eluatos de FAEs:Fracciones 1 + 2 + 3

combinadas

Evaporación de disolventes

Neutralización

Eluatos de AESs:Fracciones 4 + 5

combinadas

Evaporación de disolventes

Fig. III.1. Esquema de separación de los FAEs y AESs, empleando un

cartucho de SPE tipo SAX. Fracciones eluidas: FAEs (1), disolución de

lavado para eliminación de cationes (2), FAEs hidrofóbicos (3), AESs

hidrofílicos (4) y AESs hidrofóbicos (5).

Se utilizaron los procedimientos de la bibliografía para la derivatización de los

FAEs con anhídridos ftálico [Micó-Tormos, 2008-B] y difénico [Micó-Tormos, 2009].

En este trabajo, se evaluó la aplicación de estos mismos procedimientos a la

derivatización de AESs que tienen lugar, mediante una reacción de

transesterificación, de acuerdo con los esquemas de reacción de la Figura III.2 .

Tras la evaporación de los disolventes, se llevaron a cabo las derivatizaciones de

FAEs y AESs en sus respectivos tubos. Para ello, a cada uno de los tubos se

añadió 0,25 g de urea finamente molida, 2 mL de 1,4-dioxano, y 1 g del

anhídrido ftálico o 0,5 g del difénico. El anhídrido ftálico se empleó para las

muestras industriales o comerciales, mientras que el difénico se utilizó para

derivatizar las muestras ambientales. Los tubos con la mezcla de reacción, se

agitaron e introdujeron en un baño termostático de aceite de silicona a 105 º C

durante 90 min. Tras enfriar a temperatura ambiente, los residuos fueron

disueltos por adición de 10 mL de una mezcla MeOH/ agua 2:1, que contiene 0,1

M de NH3, sin embargo, sólo 2 mL de dicha mezcla se añadieron a los extractos


106

de agua de mar derivatizados. Las disoluciones se inyectaron inmediatamente o

se almacenaron a -20 ºC hasta su inyección.

+

R OH

R O SO3-

o +

H2O

o

SO3

OO O COO-

OO O

COO-

o

Fig. III.2. Esquemas de reacción para la esterificación de FAEs y

transesterificación de AESs con los anhídridos ftálico y difénico.

III.2. Polímeros sintéticos

III.2.1. PVP-NO


Se utilizaron muestras de PVP-NO (Chromabond S-403E, 9-17 kDa, con

polímeros constituidos por unos 74 - 140 monómeros, International Specialty

Products, Colonia, Alemania). Con el objetivo de estudiar posibles interferencias

con diferentes clases de surfactantes comúnmente empleados en las

formulaciones, se utilizaron las mezclas comerciales Dehydol LT-7 (mezcla de

FAEs, Cognis, Düsseldorf, Alemania), LAS, LES y p-isopropil sulfonato de

sodio (cumeno sulfonato de sodio, sustancia incorporada a las formulaciones por

sus propiedades como hidrótopo). Estos tres últimos componentes fueron

suministrados por Químicas Oro.


107


Se emplearon los siguientes reactivos H3PO4 (Panreac, Barcelona),

NaH2PO4, Na2HPO4, NaOH, HAcO, NH4AcO (Probus, Badalona, España),

acetona, MeOH (Scharlab, Barcelona), PEA, óxido de mesitilo (Fluka), SDS

(Merck, Darmstadt, Alemania). También se empleó agua desionizada (véase

apartado III.1.1.2).


Se empleó un sistema de electroforesis capilar HP3D (Agilent,

Waldbronn, Alemania) provisto de detector espectrofotométrico de fila de

diodos, y capilares de sílice fundida (Polymicro, Phoenix, AZ, USA) de 33,5 cm

(25 cm de longitud efectiva) × 50 µm ID (375 µm OD). Los capilares nuevos

fueron acondicionados a 60 ºC con NaOH 1 M, NaOH 0,1 M y agua durante 10

minutos cada uno. Posteriormente, la temperatura del capilar se redujo a 25 ºC, y

se pasó el BGE durante 10 min más. Diariamente, antes de iniciar la sesión de

trabajo, el capilar se lavó sucesivamente con disoluciones de ácido fosfórico 1 M

y 20 mM durante 15 minutos cada vez, seguido del BGE durante 10 min más.

Entre inyecciones, el capilar se lavó con el BGE durante 10 min. La inyección

fue hidrodinámica, aplicando 50 mbar × 3 s. Las separaciones se llevaron a cabo

a +20 y -20 kV en ausencia y presencia de PEA, respectivamente. La detección

se realizó a 214 y 276 nm. El BGE se preparó semanalmente, conservándolo a 4

ºC. Antes de las inyecciones, las disoluciones se pasaron a través de un filtro de

nylon de 0,45 am de diámetro de poro (Albet).

Para las medidas de tensión superficial se empleó un método basado en la

masa de un número fijo de gotas [Mukherjee, 1971]. Las gotas se generaron

mediante un capilar de vidrio de extremo plano y de 3 mm de diámetro externo,

sostenido en posición vertical por un soporte colocado sobre la mesa


108

antivibratoria de la balanza. Para cada medida se tomó el peso de 40 gotas de

disolución (por triplicado), a temperatura ambiente (22 ºC). La calibración se

realizó con agua (tensión superficial, 72,4 mN m-1 a 22 ºC) [Lide, 2003].


Se preparó una disolución madre de PVP-NO de 10 mg mL-1 en una

mezcla de 50:50 (v/v) MeOH/ agua. Los productos comerciales de limpieza se

diluyeron en proporción 1:100 con una mezcla 50:50 (v/v) de MeOH/ agua y se

inyectaron en el sistema de CE.

III.2.2. PVP


Los estándares de PVP (Fig. I.9), con unas masas moleculares promedio

de MW = 10, 27,9, 40, 160 y 360 kDa se obtuvieron de Fluka (Buchs, Suiza),

mientras que aquellos con MW = 60 y 400 kDa fueron suministradas por

International Specialty Products (Colonia, Alemania). Los productos de limpieza

y farmacéuticos, se obtuvieron en los comercios locales.


Se emplearon los colorantes azoicos RC (Panreac, Barcelona, España) y

AB (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania); cuya estructura se muestra en la Fig.

VI.9. También se utilizaron tetraborato de sodio decahidratado, acetona (Sigma-

Aldrich) como marcador del EOF, así como otros reactivos de grado analítico, y

agua desionizada (véase apartado III.1.1.2).


109


Para el sistema de electroforesis capilar HP3D, capilares y acondicionado

de los capilares nuevos, véase el apartado III.2.1.3. Diariamente, antes de iniciar

la sesión de trabajo, el capilar se lavó sucesivamente con disoluciones de NaOH

0,1 M y agua durante 10 minutos en cada caso, seguido del BGE durante 10 min

más. Entre inyecciones, el capilar se lavó con NaOH 0,1 M y agua, durante 2 y 3

minutos, respectivamente, seguido por el BGE durante 5 minutos más. El BGE

estaba compuesto por Na2B4O7·10H2O 25 mM, con el pH ajustado a 9,0 por

adición de HCl 0,1 M. Todas las disoluciones se pasaron a través de filtros de

nylon de 0,45 µm de tamaño de poro (Albet, Barcelona, España). La inyección

fue hidrodinámica, aplicando 50 mbar × 2 s. Las separaciones se llevaron a cabo

a 15 kV (polaridad positiva) a una temperatura de 25 ºC. La detección se realizó

a 215 nm, así como a una longitud de onda cercana al máximo de absorción para

los colorantes, tanto en presencia como en ausencia de un exceso de PVP. Las

longitudes de onda seleccionadas para CR y AB fueron 500 y 565 nm,

respectivamente.

Los espectros de absorción UV-Vis se registraron empleando un

espectrofotómetro UV-Vis modelo 8453 (Agilent Technologies), utilizando una

celda de cuarzo de 1 mm de camino óptico (Hellma, Müllheim, Alemania). Los

espectros de los colorantes se obtuvieron con disoluciones compuestas por 0,1

mM del colorante y 25 mM de tetraborato sódico en agua. Los espectros de los

complejos de PVP-colorante se obtuvieron en el mismo medio, después de la

adición de 100 µg mL-1 (0,9 mM en monómeros) del PVP de 60 kDa. El espectro

de esta mezcla se registró cada 10 minutos durante 5 horas, con el fin de estudiar

el grado de formación de los complejos PVP-CR con el tiempo. A menos que se

indique lo contrario, las mezclas de PVP-colorante se mantuvieron a temperatura

ambiente durante un mínimo de 5 horas antes de la inyección en el capilar de CE.


110


Se prepararon disoluciones madre acuosas de los colorantes azoicos (5

mM) y PVP de distintas MW (40 mg mL-1), y a partir de ellas se prepararon

disoluciones más diluídas, también en agua. Se construyeron curvas de calibrado

externas para la determinación de PVP mediante la representación del área de la

banda del complejo PVP-colorante (véase el método de medida de la misma en la

sección VI.2.1.1) frente a la concentración de monómeros de PVP. A tal efecto,

las concentraciones de PVP utilizadas fueron 100, 250, 500, 1000 y 1500 µg mL-

1. Las curvas de calibrado interno se obtuvieron mediante la adición de 250 y 500

µg mL-1 de PVP a las disoluciones de las muestras. Dos bases de detergente, cuya

composición viene dada en la Tabla III.1 , se fortificaron con PVP 60 kDa,

obteniéndose una concentración final de 0,99 y 0,97% (en peso) para las bases I

y II, respectivamente.

Tabla III.1 . Composición de las bases de detergente empleadas en este trabajo

(porcentajes en peso).

Componente Base I (%) Base II (%)

AS 5 -

AESa - 8

Oleina 7 3,5

FAEb 11 4

SDS - 4

Cumeno sulfonato sódico 1,5 -

Agua y otrosc 75,5 80,5

a Cadenas entre 12 y 18 átomos de carbono y número medio de EO 3. b Cadenas entre 12 y 18 átomos de carbono y número medio de EO 7. c Componentes minoritarios como KOH, trietanolamina, bactericidas y perfume.

A continuación, se pesaron 0,5 g de cada mezcla y se añadió 4 mL de una

disolución 5 mM de CR, completándose el volumen a 5 mL con agua. Alícuotas

de esta disolución se inyectaron en el equipo de CE. Con los productos de


111

limpieza y farmacéuticos se siguió el mismo procedimiento que el descrito con

las bases de detergente. La cuantificación se realizó a partir de una curva de

calibración externa obtenida con el CR y el PVP de 60 kDa. Todas las

inyecciones se realizaron por triplicado.

III.2.3. PVA


Los estándares de PVA (Fig. I.10) utilizados presentan las siguientes MW

y porcentajes de monómeros residuales acetilados (nac × 100%, valores entre

paréntesis): 15 (0,0%), 49 (0,1%) y 100 (12,5%) kDa (Fluka, Buchs, Suiza), y 31

(10,8%), 61 (1,5%), 130 (10,8%), 145 (0,6%) y 205 (10,8%) kDa (Sigma–

Aldrich, Steinheim, Alemania).


Se empleó el colorante azoico RC (Panreac, Barcelona, España), cuya

estructura puede verse en la Fig. VI.9. Se utilizaron tetraborato de sodio

decahidratado, acetona (Sigma-Aldrich) como marcador del EOF, dimetil

sulfóxido deuterado (DMSO-d6, Sigma–Aldrich) así como otros reactivos de

grado analítico. También se empleó agua desionizada (véase apartado III.1.1.2).



de los capilares nuevos, véase el apartado III.2.1.3. Diariamente, antes de iniciar

la sesión de trabajo, el capilar se lavó sucesivamente con disoluciones NaOH 0,1

M y agua durante 5 minutos cada uno, seguido del BGE durante 10 min más.

Entre inyecciones, el capilar se lavó con NaOH 0,1 M y agua durante 2 y 3


112

minutos, respectivamente, seguido por el BGE durante 5 minutos más. Al

finalizar cada sesión de trabajo, el capilar se lavó con agua y HCl 0,1 M durante

10 min en cada caso, con agua 5 minutos más, y con NaOH 1 M seguido de más

agua durante 20 min más cada uno. El BGE estaba compuesto por

Na2B4O7·10H2O 25 mM, ajustándose a pH 9,0 con HCl 0,1 M. Todas las

disoluciones se pasaron a través de filtros de nylon 0,45 µm de tamaño de poro

(Albet, Barcelona, España). Las disoluciones con PVA no se filtraron para evitar

que el polímero se quedara retenido en el filtro. La inyección fue hidrodinámica,

aplicando 50 mbar × 3 s. Las separaciones se llevaron a cabo a 15 kV (polaridad

positiva) y a 25 ºC. La detección se realizó a 500 nm, longitud de onda cercana al

máximo de absorción de los colorantes en ausencia de PVA.

Los espectros UV-Vis se obtuvieron tanto con el equipo de CE, como con

un espectrofotómetro (indicado en la sección III.2.2.3). Para obtener los

espectros en CE, el capilar se rellenó con una disolución de bórax 20 mM que

contenía CR 4 mM y concentraciones crecientes de PVA (muestra de MW = 49

kDa). En el espectrofotómetro, para no saturar la señal, se emplearon las

disoluciones anteriores diluidas en un factor 1:40 (0,1 mM CR). El tiempo de

pre-equilibrado de los complejos PVA-CR se estudió tanto por CZE como por

espectrofotometría.

La tacticidad (estereorregularidad) de las muestras de PVA se estableció

registrando los espectros de NMR 13C con un espectrómetro de NMR Ultrashield

DRX 400 (Bruker, Silberstreifen, Alemania). Para ello, las muestras de PVA se

deshidrataron en una centrífuga evaporadora a vacío durante 8 horas a 60 ºC

(miVac, Genevac, Ipswich, Reino Unido) y se prepararon disoluciones de PVA

al 1% con DMSO-d6. Se acumularon 2 × 104 espectros en todos los casos. Las

estructuras de las tres posibles tríadas en una cadena de PVA (mm, rm y rr) se

muestran en la Figura. III.3 .


113

A

n

HO HO HOH H H B

n

HO H HH OH OH C

n

HO H HOH OH H

Fig. III.3. Estructuras de las tres posibles tríadas en una cadena de PVA:

(A) mm, (B) rm y (C) rr.

Los porcentajes de cada tríada se estimaron a partir de las áreas relativas de los

tres multipletes que se encuentran dentro del rango de 64-69 ppm [Moritani, 1972;

Wu, 1973; Wu, 1977; Fukae, 2000]. En la Figura III.4 , se representan los

porcentajes de las triadas rr encontrados en las muestras, frente el porcentaje de

las tríadas mm. En la misma figura, se representaron también datos obtenidos de

diversas publicaciones [Moritani, 1972; Wu, 1973; Wu, 1977; Fukae, 2000].

▲ ▲

▲

2

6

20

30

40

20 25 70mm %

31 (1.67)

61 (1.72)

15 (1.39)

100 (1.09)

145 (1.04)49 (1.05)

205 (0.71)

15

130 (0.85)rr%

H M

L

Fig. III.4. Porcentajes de las triadas rr y mm, estimados por 13C NMR en

las muestras de PVA empleadas en este trabajo (♦). Los números que se

encuentran junto a los símbolos (♦), son la MW (kDa) y la relación rr/mm

(valores entre paréntesis). Los otros símbolos corresponden a datos

bibliográficos [Moritani, 1972; Wu, 1973; Wu, 1977; Fukae, 2000] para muestras

de PVA altamente sindiotáctico (●), atáctico (▲) y altamente isotáctico (○).

Como se observa en esta figura, las muestras de PVA utilizadas en este trabajo

resultaron agrupadas como sigue: un grupo de tres muestras con proporciones


114

rr/mm dentro del rango 1,72 - 1,39, otro grupo de tres muestras dentro del rango

1,09 - 1,04 y finalmente, las dos muestras con mayor MW mostraron los menores

valores de la relación rr/mm, en concreto 0,85 y 0,71. Para facilitar la discusión

en la sección IV.3, estos grupos se denominaron en función de la relación rr/mm

como H (alto), M (medio) y L (bajo).


Se prepararon disoluciones madre acuosas de RC (5 mM) y PVAs de

distinta MW (10 mg mL-1, 227 mM en monómeros), preparándose diluciones y

mezclas de los mismos con los tampones adecuados.

III.3. Enzimas

III.3.1. CZE


Los concentrados de enzimas industriales utilizados en esta sección se

muestran en la Tabla III.2 . Estos fueron suministrados en forma líquida o como

sólidos granulares. Para el estudio de posibles interferencias y efectos de la

matriz se utilizaron las siguientes mezclas industriales comerciales: Dehydol LT-

7 (mezcla de FAEs, Cognis, Düsseldorf, Alemania), LAS y LES (donados por

Químicas Oro).


115

Tabla III.2 . Clase, nombre comercial, fabricante, sección de esta memoria en la

que se utilizan las diferentes enzimas estudiadas, así como el conjunto asignado

para la construcción de modelos de LDA en las secciones indicadas.

Clase Nombre comercial Fabricantee Sección Proteasa Alcalase 2,5 L Novozymes VII.1; VII.2c; VII.3b,c; VII.4 Savinase 16L, Type EX Novozymes VII.1; VII.2d; VII.3d Everlase 16 L, Type EX Novozymes VII.1; VII.2d; VII.3d; VII.4 Esperase 8.0 L Novozymes VII.1; VII.2d; VII.3d Polarzyme 12Ta Novozymes VII.3d Bioproteasa L 450 Biocon VII.2d; VII.3c Bioproteasa L 800 Biocon VII.2d; VII.3c Enziprot 450L ChemWorld VII.2c; VII.3d Deterzyme L 660 Enmex VII.2c; VII.3d Deterzyme Apy L 560 Enmex VII.2d; VII.3d Properase 1600L Genencor VII.3d Purafect Prime HA Genencor VII.2d; VII.3d Properase 4000Da Genencor VII.3d Excellase 2250Da Genencor VII.3d Purafect OX 8000Da Genencor VII.3d Amilasa Termamyl Ultra 300L Novozymes VII.1; VII.2c; VII.3b,c Duramyl 300 L, Type DX Novozymes VII.1; VII.2c; VII.3d; VII.4 Stainzyme 12L Novozymes VII.1; VII.2d; VII.3c Enziamilasa ChemWorld VII.2c; VII.3c Purastar ST 15000L Genencor VII.2d; VII.3d; VII.4 Purastar ST 6000Da Genencor VII.3d Celulasa Endolase 5000L Novozymes VII.1; VII.2c; VII.3d Carezyme 4500L Novozymes VII.1; VII.2c; VII.3b,c Celluzyme 0,7Ta Novozymes VII.1; VII.2d; VII.3d Deterzyme CL-5 Enmex VII.2c; VII.3c; VII.4 Puradax HA 400Ea Genencor VII.3d; VII.4 Puradax EG 7000L Genencor VII.2d; VII.3c Lipasa Lipolase 100L, Type EX Novozymes VII.1; VII.2c; VII.3c; VII.4 Lipex 100L Novozymes VII.1; VII.2c; VII.3b,c; VII.4 Lipolase 100Ta Novozymes VII.2c; VII.3c Lipex 100Ta Novozymes VII.2d; VII.3d

a Muestras suministradas como sólidos granulados (el resto de muestras son líquidas). b Se emplean tanto como materia prima industrial como para aditivar las bases de

detergente (Tabla III.3 ). c Empleado en el conjunto de entrenamiento. d Empleado en el conjunto de evaluación. e Donadas por las correspondientes casas comerciales: Novozymes (Bagsvaerd,

Dinamarca), Biocon (Bangalore, India), ChemWorld (Barcelona, España), Enmex

(Tlalnepantla, México), Genencor (Rochester, NY, USA)


116


Se empleó IDA, urea, PVA de MW media de 70 a 100 kDa (Sigma, St.

Louis, MO, EE.UU.), y HEC con una MW media de 27 kDa (Polysciences,

Warrington, PA, EE.UU.). También se utilizaron NaOH y sodio tetraborato

decahidrato (Probus, Badalona, España), acetona (Scharlau, Barcelona, España) y

sódio dihidrógeno fosfato (Panreac, Barcelona, España). El contenido de proteína

de las muestras se calculó por el método de Bradford [Bradford, 1976] utilizando

el “Protein Quantification Kit Rapid” (Fluka, Buchs, Suiza) y la BSA (Fluka)

como estándar. También se empleó agua desionizada (desionizador Barnstead,

Sybron, Boston, MA, USA)



de los capilares nuevos, véase apartado III.2.1.3. Para trabajar en medio básico,

se utilizó un BGE compuesto por NaH2PO4 50 mM, Na2B4O7 25 mM y PVA al

0,1%, ajustado a pH 9,0 con NaOH 0,1 M. Al comienzo de cada sesión de

trabajo, el capilar se lavó con NaOH 0,1 M y agua durante 5 minutos cada uno, y

10 minutos más con el BGE. Entre inyecciones el capilar se lavó con el BGE

durante 10 min. Las separaciones con el BGE básico se realizaron a 25 º C a 15

kV (polaridad positiva). Para trabajar en medio ácido, se empleó un BGE

compuesto por 50 mM de IDA (pH = 2,30 a 25 ºC), HEC al 0,5% y urea 6 M

(pHaparente = 3,1). Diariamente, antes de iniciar la sesión de trabajo, el capilar se

lavó con el BGE ácido durante 30 minutos y entre inyecciones el capilar se lavó

durante 5 minutos con el mismo BGE. La temperatura del capilar se fijó a 25 ºC

y separaciones se realizaron a 25 kV (polaridad positiva), lo que dio lugar a una

corriente típica de 30 mA. Para ambos BGEs, las disoluciones de las posiciones

anódica y catódica se renovaron tras cada serie de cinco inyecciones [Bossi, 1999].


117

Los BGEs se pasaron a través de filtros de nylon de 0,45 micras de tamaño de

poro (Albet, Barcelona, España). Para las inyecciones hidrodinámicas se

aplicaron 50 mbar × 2 s. La señal se monitorizó a 214 nm.

Para medir la absorbancia a 600 nm en el ensayo de Bradford, se empleó

un espectrofotómetro UV-Vis modelo 8453 (Agilent Technologies), utilizando

una celda de cuarzo de 1 cm de camino óptico (Hellma, Müllheim, Alemania). El

contenido proteico en las distintas muestras se obtuvo siguiendo el protocolo

descrito en el “Protein Quantification Kit Rapid” (Fluka). Los resultados

obtenidos con las diferentes enzimas, expresados como porcentaje de BSA se

indican en la Tabla VII.1 .


Los concentrados de enzimas industriales líquidas con contenidos entre 1-

10% de proteína, fueron diluidos con agua para obtener disoluciones de

aproximadamente un 0,01% de proteína. A partir de estas disoluciones, se

tomaron alícuotas de 1 mL y se les añadió 4 mL de acetona. Tras agitación, se

centrifugó a 5500 rpm × 4 min, se descartó el sobrenadante, y los precipitados se

disolvieron en 1 mL de agua o de urea 3 M, en función de que la muestra se fuese

a inyectar en el BGE básico o ácido, respectivamente. Para las enzimas

comercializadas granuladas, se pesó aproximadamente 1 g y se añadió 5 mL de

agua. La suspensión resultante se agitó vigorosamente, se sonicó durante 15

minutos, y se centrifugó a 5500 rpm durante 4 minutos, tomándose una alícuota

del sobrenadante. A continuación, se adoptó el procedimiento anteriormente

descrito para concentrados líquidos de enzima.

Para establecer el contenido de proteína según el ensayo de Bradford

[Bradford, 1976], se preparó una disolución de BSA de 4000 µg mL-1 (0,4%) en


118

urea 3 M. A partir de esta disolución se preparó una curva de calibrado de nueve

puntos en un intervalo de 10 a 2000 µg mL-1 (0,001 a 0,2%).

También se estudiaron las interferencias ocasionadas por los surfactantes

más utilizados en la formulación de productos de limpieza. Para ello, a

disoluciones que contenían un 5% de LAS, LES o Dehydol LT 7, se les añadió

un 0,01% de enzima. La separación de las enzimas de estas disoluciones se

realizó tomando alícuotas de 5 mL y añadiendo 20 mL de acetona. Tras

agitación, se centrifugó a 5500 rpm durante 4 min, se descartó el sobrenadante y

el precipitado resultante se diluyó en 1 mL de agua o urea 3 M, según se fuese a

inyectar en el BGE básico o ácido, respectivamente.

III.3.2. Aminoácidos por infusión directa en MS


Los concentrados de enzimas industriales utilizados en este trabajo se

muestran en la Tabla III.2 , siendo suministrados en forma líquida o como

sólidos granulares. También, se empleó Dehydol LT-7 (mezcla de FAEs, Cognis,

Düsseldorf, Alemania), LES, oleina y cumeno sulfonato sódico (donados por

Químicas Oro). Dos detergentes para lavado de textiles que contenían proteasa

(según declaraba el fabricante) se obtuvieron en los comercios locales.


Se empleó acetona, etanol (Scharlau, Barcelona, España) y HCl (37%)

(Panreac, Barcelona, España). También se empleó agua desionizada (véase

apartado III.1.1.2).


119


Se emplearon un espectrómetro de masas (otros detalles en III.1.1.3) y una

bomba de jeringa para la infusión directa de las muestras (véase apartado

III.1.1.3). Las condiciones de trabajo en el espectrómetro de masas se adaptaron

de trabajos de la bibliografía [Peris-Vicente, 2005; Lerma-García, 2007]. El rango de

barrido de masas en el modo PI fue de m/z 50–300. El voltaje del capilar fue de

3,5 kV, el voltaje de la primera y segunda máscara fue de 19.6 y 6 V,

respectivamente. La nebulización se efectuó a 25 psi y 8 L min−1, y la

temperatura del gas de secado fue de 250 ºC. La masa objetivo se fijó a m/z 122

([M+H] + para la cisteína). Otros parámetros o métodos de trabajo son los

indicados en el apartado III.1.1.3. El tratamiento estadístico de los datos

espectrales se realizó con el paquete estadístico SPSS (v. 12.0.1; Statistical

Package for the Social Sciences Inc., Chicago, IL, USA).


Para los concentrados de enzimas industriales, tanto líquidos como

sólidos, se siguieron dos procedimientos adaptados de la bibliografía [Gimeno-

Adelantado, 2002; Peris-Vicente, 2005]. Para los concentrados industriales líquidos

de enzimas se pesó alrededor de 1 g en un tubo con tapón de rosca, se añadieron

4 mL de acetona, y se recogió el precipitado por centrifugación. Se desechó el

sobrenadante y se añadieron 200 µl de HCl 12 M, manteniéndose este tubo bien

cerrado a 110 ºC durante 24 h. Para las enzimas suministradas como sólidos

granulares, se pesó alrededor de 1 g, se añadieron 5 mL de agua, y la suspensión

se sometió a sonicación durante 15 min. Tras centrifugación se tomó 1 mL del

sobrenadante, llevándose a cabo la precipitación e hidrólisis enzimática como la

descrita para los concentrados líquidos de enzima.


120

Para el estudio de las posibles interferencias causadas por la matriz, se

prepararon dos bases de detergente cuya composición viene dada en la Tabla

III.3 . Unos 5 g de las bases de detergente fueron aditivadas con 50 µL o 50 mg,

de concentrado líquido o granulado industrial de enzimas, respectivamente. Para

hacer las extracciones de enzimas a partir de las bases de detergente, o de los

detergentes comerciales, se tomaron porciones de unos 5 g, se añadieron 20 mL

de acetona y se agitó, separándose el precipitado por centrifugación. El residuo

se disolvió en 1 mL de agua, y se efectuó una reprecipitación con 4 mL de

acetona. El precipitado se hidrolizó tal y como como se ha indicado

anteriormente para los concentrados líquidos de enzimas industriales.

Tabla III.3 . Composición de las bases de detergente empleadas en este trabajo (%

en peso).

Componente Base I (%) Base II (%)

AES 5 10

Oleína 10 5

FAE 10 15

Sodio Cumeno sulfonato 5 5

Agua 70 65

Tras la hidrólisis ácida de la muestra, el residuo se agita con 5 mL de una

mezcla EtOH/HCl (0,1 M) 1:1 (v:v). La suspensión se hace pasar por un filtro de

nylon de 0,45 µm y se infunde directamente en el espectrómetro de masas, o se

conserva a -20 ºC hasta su uso. Se hidrolizaron tres alícuotas de todos los

concentrados industriales de enzimas, las bases de detergentes aditivadas y los

productos de limpieza, realizándose asimismo un mínimo de tres infusiones por

alícuota.


121

III.3.2.5. Construcción de las matrices de entrenamiento y evaluación

Como se indica en la Tabla III.2 , se utilizaron tres concentrados

industriales diferentes, dentro de cada una de las cuatro clases de enzimas, para

construir el conjunto de entrenamiento. Por lo tanto, cada categoría contenía el

mismo número de muestras (y los espectros correspondientes) que las demás

categorías, para evitar que un peso excesivo en una de las categorías conduzca a

un modelo incorrecto. Cada enzima se precipitó e hidrolizó tres veces de forma

independiente, y cada hidrolizado se infundió también por triplicado, pero en el

conjunto de entrenamiento sólo se incluye la media de los datos obtenidos en las

tres infusiones. De esta forma, la variación interna de las diferentes categorías se

redujo, lo que es importante para reducir el número de variables seleccionadas

por el algoritmo que utiliza el SPSS para la construcción del modelo. Por lo

tanto, el conjunto de entrenamiento I estaba constituido por los datos de 36

objetos (4 clases de enzimas × 3 enzimas de cada clase × 3 hidrolizados de cada

enzima × un promedio de las tres infusiones de cada hidrolizado).

Para evaluar la posible influencia de las matrices de la muestra,

generalmente productos de limpieza, las dos bases de detergente de la Tabla

III.3 , fueron aditivadas con tres concentrados industriales de enzimas de cada

categoría, y se procesaron como se ha indicado anteriormente. Así pues, el

conjunto de datos II contenía 72 objetos (2 bases de detergente × 4 clases de

enzimas × 3 enzimas de cada clase × 3 hidrolizados de cada enzima × un

promedio de las tres infusiones de cada hidrolizado). Como se comentará

posteriormente en la sección VII.2, el conjunto de datos II, fue utilizado para

evaluar los modelos construidos con el conjunto de datos I, sin embargo,

posteriormente los datos de los conjuntos I y II fueron utilizados conjuntamente

para mejorar la capacidad de predicción de los modelos.


122

Por último, el conjunto de datos III fue construido a partir de todos los

datos espectrales de los concentrados industriales de enzimas y productos de

limpieza que no se incluyeron en la construcción de los conjuntos anteriores

(Tabla III.2 ). Este tercer conjunto contenía 42 objetos (12 concentrados

industriales de enzimas más 2 detergentes comerciales × 3 hidrolizados de cada

enzima × un promedio de las tres infusiones de cada hidrolizado).

III.3.2.6. Selección de variables predictoras para la construcción de un modelo

de LDA

El LDA, es una técnica de clasificación supervisada, siendo una excelente

herramienta para obtener los vectores que muestran la resolución máxima entre

las diferentes clases o categorías. En un LDA se obtienen los vectores que hacen

mínima la lambda de Wilks, λW [Vandeginste, 1998]. La λW es una función de las

distancias euclídeas entre los puntos medidos en la dirección de los vectores

(funciones discriminantes) que constituyen el modelo. Usando el SPSS, las

distancias euclídeas se miden en un espacio normalizado, donde todas las

variables de entrada tienen una media de cero y uno de desviación estándar. Para

obtener λW, la suma de los cuadrados de las distancias euclídeas entre todos los

puntos pertenecientes a la misma categoría se divide por la suma total de

cuadrados. Los valores de λW cercanos a cero se obtienen con categorías bien

separadas, mientras que la presencia de por lo menos un par de categorías

superpuestas conduce a valores de λW próximos a uno. Mediante el uso de LDA

se construyen hasta N-1 funciones discriminantes, donde N es el valor más bajo,

entre el número de variables predictoras o el número de categorías.

Para seleccionar las variables predictoras a incluir en los modelos, se

utilizó el algoritmo “paso a paso” del SPSS. El valor de λW disminuye cada vez

que una variable predictora con un poder discriminante significativo (de acuerdo


123

a las categorías establecidas) se incluye en el modelo. De acuerdo con el

algoritmo “paso a paso”, una variable predictora se incorpora al modelo, cuando

tras su inclusión en el mismo, se supera un umbral, Fin. El criterio Fin es un

ensayo F que compara la reducción de varianza residual producida por la entrada

de la variable con la varianza residual que queda. Sin embargo, la entrada de un

nuevo predictor modifica la reducción de varianza residual debida a las demás

predictoras presentes en el modelo. Por esta razón, tras la inclusión de una nueva

predictora, se aplica un criterio de rechazo, Fout, para decidir si la predictora debe

ser eliminada del modelo. El proceso termina cuando no hay predictoras que

puedan entrar o ser eliminadas del modelo. Inicialmente se tomaron los valores

de probabilidad que emplea el SPSS por defecto, siendo 0,05 y 0,10 para los

criterios Fin y Fout, respectivamente.

III.3.3. Aminoácidos derivatizados con OPA-NAC


La Gly y los siguientes levo-aminoácidos fueron utilizados como

estándares: Ala, Arg, Asp, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Tyr, Val y

Cys (Sigma). Otros aminoácidos como el Trp, Asn y Gln, no se incluyeron en

este estudio, ya que el primero se destruye completamente durante la hidrólisis

ácida, y la Asn y la Gln, se convierten en Asp y Glu [Hurst, 2002]. Los

concentrados de enzimas industriales utilizados en este trabajo se muestran en la

Tabla III.2 . Dehydol LT-7 (mezcla de FAEs, Cognis, Düsseldorf, Alemania),

LES, oleína y sodio cumeno sulfonato (donados por Químicas Oro). Dos

detergentes para lavado de textiles que contenían proteasa (según declaración del

fabricante) se obtuvieron en los comercios locales.


124


Se empleó acetona, etanol (Scharlau, Barcelona, España) y HCl (37%)

(Panreac, Barcelona, España). También se emplearon otros reactivos como OPA,

NAC (Fluka, Buchs, Switzerland), ácido bórico (Panreac, Barcelona, España) y

ácido cítrico anhídrido (Sigma, St. Louis, MO, USA). También se empleó agua

desionizada (desionizador Barnstead, Sybron, Boston, MA, USA)




termostato para la columna, un muestreador automático y un detector UV-Vis de

longitud de onda variable. La columna empleada fue una Kromasil C18 (5 µm,

25 cm x 4 mm de ID, Análisis Vínicos, Tomelloso, España). Los gradientes de

elución, incluyendo el gradiente óptimo multi-segmentado (Tabla VII.3 ), se

obtuvieron mezclando dos disoluciones que contenían agua con ACN al 5% y

50% (mezclas A y B, respectivamente), ambas tamponadas con ácido

cítrico/citrato sódico 5 mM a pH 6,5. El flujo de la fase móvil fue de 1 mL min-1,

y los volúmenes de inyección fueron de 5 µL. La detección se realizó a 335 nm.

Las áreas de los picos se midieron con el software ChemStation para LC v.10.02

(Agilent). Para la normalización de las variables, así como para transferir los

datos al paquete estadístico SPSS (v. 12.0.1; Statistical Package for the Social

Sciences Inc., Chicago, IL, USA) se empleó el programa Excel (Microsoft). El

SPSS fue empleado también para el tratamiento estadístico de los datos

espectrales. Para la selección de las variables predictoras que se incluyeron en los

modelos, se utilizó el algoritmo “paso a paso” (sección III.3.2.6) del paquete


125

estadístico SPSS, donde se adoptaron inicialmente los valores de Fin y Fout, 3,84 y

2,71, respectivamente.


Se siguieron los mismos procedimientos de hidrólisis y extracción de

enzimas comentados en la sección III.3.2.4. En este caso, se hidrolizaron dos

alícuotas de cada concentrado de enzima industrial, base de detergente aditivada

o muestra comercial. Las dos alícuotas hidrolizadas se diluyeron y derivatizaron

como se indica a continuación, realizándose una inyección de cada alícuota.

El reactivo de derivatización estaba compuesto por una mezcla que

contenía OPA 1,25 × 10-2 M y NAC 2,5 × 10-2 M, tamponada con una disolución

de ácido bórico/sodio borato 1 M a pH 9,5. El reactivo de derivatización se

protegió con papel de aluminio y fue conservado a 4 ºC, renovándose

semanalmente. La derivatización se realizó directamente por la adición de 1 mL

de la disolución de OPA-NAC a una alícuota de 100 µL de los hidrolizados. Para

identificar los picos correspondientes a cada aminoácido a lo largo del

cromatograma, se prepararon disoluciones de un aminoácido o también mezclas

de dos o tres aminoácidos (1000 µg mL-1 de cada) que fueron derivatizados como

anteriormente se ha explicado. Tras la derivatización, estas disoluciones fueron

usadas tanto para inyectar directamente o para aditivar los hidrolizados cuando

fue necesario. En la Figura III.5 se muestra la reacción de derivatización de los

aminoácidos.

H2N

R1

H

COOH

Aminoácido

+H

H

O

O

OPA

+ N

Isoindol

COOH

R1

S HNO

HO

OHO

HS HNO

HO

OH

O

NAC

Fig. III.5. Reacción de formación de isoindoles.


126

III.3.4. Digestos con tripsina


Se utilizó tripsina de páncreas bovino y BSA (Fluka, Buchs, Suiza). Los

concentrados de enzimas industriales utilizados en esta sección están indicados

en la Tabla III.2 . También se empleó Dehydol LT-7 (mezcla de FAEs, Cognis,

Düsseldorf, Alemania), LES, oleina y sodio cumeno sulfonato (donados por

Químicas Oro), así como otros componentes empleados para preparar las bases

de detergentes empledas en este trabajo (Tabla III.1 ). Dos detergentes

comerciales que contenían proteasa (según declaración del fabricante) se

adquirieron en los comercios locales.


Se empleó TFA (≥ 99,5%), DTT y (NH4)HCO3 (Sigma-Aldrich, Viena,

Austria), ácido fórmico (98-100%, Riedel de Haen, Seelze, Alemania), así como

ACN grado HPLC y acetona (VWR, Viena).




termostato para la columna, un muestreador automático y DAD. El sistema

HPLC estaba equipado con un inyector automático termostatizado, que permitó

que las muestras se mantuviesen a 5 ºC hasta su inyección. Las principales

características de las columnas estudiadas se presentan en la Tabla III.4 . La

elución se llevó a cabo usando mezclas de dos disoluciones que contenían agua y

ACN (fases A y B, respectivamente), ambas en presencia de un 0,1% de TFA. A

menos que se indique lo contrario, la elución se efectuó en dos pasos, un primer


127

paso isocrático con 1% de B durante 5 minutos, seguido de un gradiente lineal

del 1 al 40% de B durante los siguientes 58 minutos. Los volúmenes de inyección

fueron de 5 µL y los flujos se modificaron para obtener la misma velocidad lineal

(1,3 mm/s) en todas las columnas. La detección se realizó a 214 y 280 nm.

Tabla III.4 . Columnas empleadas en este trabajo.

Características ProSwift Chromolith Gemini 5 µm Gemini 3 µm Kinetex

Tipo Monolítica poliméricaa

Monolítica sílice (C18)

Particulada (C18)

Particulada (C18)

Particulada (C18)

Tamaño de partícula (µm)

- - 5 3 2,6

Dimensiones, longitud × ID (mm)

50 × 4,6 100 × 4,6 150 × 4,6 150 × 3 100 × 3

Fabricante Dionex Merck Phenomenex Phenomenex Phenomenex a Columna monolítica de fenil-poliestireno.


Los concentrados de enzimas industriales líquidas fueron diluidos en un

factor 1:10 con una disolución de (NH4)HCO3 40 mM (pH = 8,5). Para las

enzimas suministradas como sólidos granulares, se pesaron 0,2 g, se añadió 1 mL

de agua, y se sonicó la suspensión durante 15 minutos. Tras centrifugar, se tomó

una alícuota del sobrenadante y se trató como se ha indicado para los

concentrados líquidos de enzima. Se preparó una disolución de BSA de 3,5 mg

mL-1 en el tampón de (NH4)HCO3. La digestión se efectuó de la siguiente

manera: se tomaron alícuotas de 100 µL de cada enzima diluida y de la

disolución de BSA, y se añadieron 5 µL de una disolución de DTT 200 mM. Esta

mezcla se dejó reaccionar bajo agitación a 100 ºC para reducir los grupos

disulfuro. Tras dejar enfriar a temperatura ambiente, se añadieron 25 µL de una

disolución de tripsina de 0,5 mg mL-1 preparada en el mismo tampón. La mezcla

se digiere durante toda la noche a 37 ºC, utilizando un mezclador termostático

con agitación. La digestión se detiene por adición de 5 µL de ácido fórmico al


128

10%. Los digestos resultantes se filtraron a través de un filtro de 0,2 µm Phenex

RC (Phenomenex, Torrance, IL, USA) y se inyectaron en el cromatógrafo.

También se preparó un blanco de muestra siguiendo el mismo protocolo, pero en

esta ocasión la alícuota de 100 µL de enzima diluida fue sustituida por el mismo

volumen de tampón.

Se pesaron alrededor de 2 g de las bases de detergente y de los detergentes

comerciales. Las bases de detergente se aditivaron con 20 µL de una enzima

concentrada industrial. Las enzimas fueron precipitadas por adición de 10 mL de

acetona con agitación. Tras eliminar el sobrenadante, el precipitado se aisló por

centrifugación a 4000 rpm × 10 minutos, y se disolvió en 200 µL de agua. Esta

disolución se re-precipitó con 1 mL de acetona y el precipitado se aisló por

centrifugación a 13400 rpm × 10 min. El residuo se disolvió en 100 µL del

tampón de (NH4)HCO3 y se llevó a cabo la digestión como se ha indicado

anteriormente.

III.4. Columnas monolíticas

III.4.1. Monómeros, agentes entrelazantes, iniciadores, estándares y

reactivos de uso general

Para la preparación de columnas monolíticas se emplearon los siguientes

reactivos: LMA, EDMA, META (al 75% en agua), 1,4-butanodiol, metacrilato

de 3-(trimetoxisilil)propilo (como reactivo enlazante o silano binding), LPO y

DMPA (Aldrich, Milwaukee, WI, USA), 1-propanol, ACN y MeOH (Scharlau,

Barcelona, España); AIBN, BPO y Tris fueron suministrados por Fluka (Buchs,

Suiza). Se utilizó tiourea como marcador del EOF, una mezcla de PAHs

conteniendo pireno, antraceno, naftaleno, fluoreno, benzo[a]antraceno y

benzo[k]fluoranteno (Riedel de Haën, Seelze, Alemania), y una mezcla de


129

alquilbencenos conteniendo tolueno, etilbenceno, n-propilbenceno, n-

butilbenceno, n-pentilbenceno y n-hexilbenceno. Como estándares de prueba se

utilizaron los siguientes solutos básicos: anilina, 4-nitroanilina, N,N-

dimetilanilina, 2,4,6-trimetilanilina y piridina (Aldrich). Se utilizó agua

desionizada obtenida con un desionizador Barnstead (Sybron, Boston, MA,

USA).

III.4.2. Tratamiento de columnas

III.4.2.1. Acondicionado de columnas

Antes de rellenar las columnas con las disoluciones que contienen las

mezclas para la síntesis de monolitos, se procede a modificar la superficie interna

del capilar de sílice. Esta operación tiene como objeto favorecer el anclaje

covalente del monolito a dicha superficie interna. Para ello se siguió el

procedimiento descrito por Fréchet y col. [Peters, 1997]:

Los capilares que se emplearon eran de sílice fundida con dimensiones

375 µm OD × 100 µm ID, con la capa externa transparente a la radiación UV

(Polymicro Technologies, Phoenix, Arizona, USA). Por una sección de capilar de

4 m de longitud se hicieron pasar sucesivamente, mediante la ayuda de una

jeringa Hamilton conectada a una bomba de jeringa (kd Scientific, Holliston,

MA, USA), las siguientes disoluciones a un caudal de 200 µL min-1 (salvo que se

especifique lo contrario):

1. Acetona, hasta ver aparecer algunas gotas a la salida del capilar, para

asegurar la limpieza de la pared interna.

2. Agua nanopura, hasta la eliminación completa de la acetona.

3. NaOH 0,2 M, hasta observar pH básico a la salida del capilar.

4. Agua nanopura, hasta eliminar el NaOH, para evitar cambios bruscos del


130

pH.

5. HCl 0,2 M, hasta observar pH ácido a la salida del capilar.

6. Agua nanopura, hasta pH neutro a la salida del capilar, para eliminar los

restos de ácido.

7. EtOH hasta olor persistente, con el fin de eliminar el agua y evitar la

hidrólisis del reactivo enlazante (silano-binding) que se adiciona en la

siguiente etapa.

8. Disolución de reactivo enlazante (silano-binding) al 20% (m/v) en EtOH,

acidulado con ácido acético hasta pH 5; el enlazante se pasa a un caudal de

0,25 µL min-1 durante 60 min.

9. Acetona, para eliminar el exceso de reactivo enlazante.

Para finalizar, se aplicó una corriente de nitrógeno para secar el capilar,

dejándose en estas condiciones durante 24 h hasta completar la reacción de

condensación de los grupos silanol con el reactivo enlazante (silano-binding).

Tras este periodo, se retiró la fuente de nitrógeno y se sellaron los extremos del

capilar con sendos tapones, con el fin de evitar la hidrólisis de los enlaces

siloxano.

III.4.2.2. Preparación de columnas monolíticas

Los monolitos se preparan mediante polimerización de mezclas de un

monómero base (LMA), un agente entrelazante (EDMA), un monómero con

carga para la generación del EOF (META), y disolventes porogénicos, siendo los

empleados aquí el 1,4-butanodiol y el 1-propanol. Estas mezclas se preparan

mediante la pesada de cada uno de sus componentes en una balanza analítica.

Las mezclas se polimerizan mediante fotoionización. Los iniciadores

empleados fueron AIBN, DMPA, BPO y LPO. Antes de iniciar la

polimerización, y con el fin de eliminar el oxígeno disuelto de las disoluciones,


131

éstas se sonican durante 10 minutos y se purgan con nitrógeno durante 10 min

más.

Los capilares, previamente pre-acondicionados, fueron cortados en trozos

de 33,5 cm de longitud, rellenándose un segmento de 8,5 cm de longitud con las

mezclas de polimerización. Una vez rellenos los segmentos, se sellan los

extremos del capilar mediante tapones y se procede a la polimerización. En el

caso de la fotopolimerización los capilares se sometieron a una irradiación de 0,9

J/cm2 durante 10 minutos dentro de una cámara UV equipada con cinco lámparas

UV (5 × 8 W, 254 o 365 nm). La lámpara UV de 254 nm fue empleada para

polimerizar con todos los iniciadores, a excepción del AIBN para el que se

utilizó radiación de 365 nm [Peters, 1998-A; Eeltink, 2005; Geiser, 2007; Ngola, 2001].

Una vez terminada la polimerización, se cortaron ligeramente los extremos de las

columnas resultantes para liberar restos adheridos a los tapones, y garantizar la

homogeneidad del relleno.

A continuación, las columnas se desobstruyeron con MeOH y la ayuda de

una bomba de HPLC, eliminando tanto los disolventes porogénicos como los

posibles monómeros sin reaccionar, y los oligómeros no incorporados a la

estructura del monolito. A continuación, se cortaron las porciones de capilar

necesarias para ajustar la posición de la ventana óptica a 8,5 cm de uno de los

extremos, y también para que la longitud total del capilar fuera de 33,5 cm.

Cortar un extremo también garantiza una sección transversal del monolito

perpendicular al eje longitudinal del capilar en dicho extremo. Finalmente, antes

de la inyección de estándares o muestras, se hace pasar fase móvil a través del

capilar durante 30 min.


132

III.4.3. Instrumentación y condiciones de trabajo

Los ensayos de CEC se realizaron con un equipo de electroforesis capilar

Agilent, modelo HP3D (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania), dotado de

un DAD, y de un sistema auxiliar capaz de suministrar hasta 10 bar de presión

externa de nitrógeno sobre ambos extremos del capilar simultáneamente. La

presurización del capilar es importante para evitar la aparición de burbujas que

cortarían el paso de corriente eléctrica por el mismo. Para la adquisición de los

datos se utilizó el software ChemStation (Rev. A.10.01, Agilent).

Con el fin de proceder a su acondicionado con la fase móvil, la columna se

colocó en el equipo de CEC y se equilibró con la fase móvil a 25 ºC,

incrementándose el voltaje progresivamente en el rango de 5 a 25 kV,

presurizando en todo momento los viales de entrada y salida a 10 bares, hasta

observar una señal analítica y una corriente estables. Esta etapa de equilibrado

tuvo una duración de 45-60 min, dependiendo de las características de flujo de

cada columna. Para los ensayos de CEC se empleó, cuando fue necesario, una

muestra de tiourea como marcador del EOF.

Las separaciones se realizaron a 25 ºC y a varios voltajes. En todos los

casos se utilizó nitrógeno para presurizar ambos viales a 1 MPa. Se preparó una

disolución de Tris en agua a pH 8.0 ajustado con HCl 1 M. Las fases móviles

fueron preparadas mezclando el tampón de Tris con diferentes proporciones de

ACN y agua para obtener disoluciones con una concentración constante de 5 mM

de Tris. Se preparó una mezcla de seis PAHs (pireno, antraceno, naftaleno,

fluoreno, benzo[a]antraceno, benzo[k]fluoranteno) y tiourea (100 – 200 µg mL-1,

de cada sustancia) para evaluar el funcionamiento de las columnas. La inyección

de la mezcla de PAHs se hizo de forma electrocinética (5 kV × 3 s), y la

detección se fijó a 214 y 254 nm.


133

La morfología de los materiales monolíticos se estudió mediante el

empleo de un microscopio electrónico de barrido Hitachi modelo S-4100

(Ibaraki, Japón), provisto de un sistema de captación de imágenes EMIP 3.0.

Previamente, se metalizó la superficie expuesta de la sección de las columnas con

un depósito de oro y paladio. Para ello, se utilizó un recubridor por pulverización

BIORAD modelo SC-500 (Hemel, Hempstead, Reino Unido).

RESULTS

CHAPTER IV

NON IONIC SURFACTANTS

IN CLEANING PRODUCTS

Chapter IV. No ionic surfactants in cleaning products

139

IV.1. APGs

IV.1.1. APGs by HPLC-MS

The APGs are non-ionic surfactants produced from renewable materials

(glucose and fatty alcohols) [Koch, 1993; Balzer, 1996; Balzer, 2000; Hill, 1997;

Rybinski, 1998; Biermann, 1993]. Owing to their favourable properties in terms of

foaming performance, synergism with other surfactants, and environmental and

skin compatibility, they are widely used in cleaning and personal care products

[Balzer, 1996; Rybinski, 1998; Biermann, 1993; García, 1997; Uppgard, 2000], and in

the oil and gas industry [McGregor, 2004]. APGs are industrially obtained as

complex mixtures of alkylpoliglucosides. The oligomers are distinguished by the

alkyl chain length, the number of glucose units and the isomerism (Fig. I.5).

Three types of isomerism are present: stereoisomerism with α- and β-epimers,

ring isomerism (pyranoside and furanoside forms), and positional isomers, with

predominant 1,4-and 1,6-interglucosidic linkages between glucose units.

The total amount of APGs can be determined by hydrolysis followed by

derivatisation with anthrone and colorimetry [Buschmann, 1995; Buschmann, 1996-

B], potentiometric titration after sulfonation with the SO3–DMF complex

[Buchmann, 1996-A], near-infrared spectrometry [Kim, 2001] and enzymatic

hydrolysis [Kroh, 1999]. APGs can be determined in environmental samples after

hydrolysis, followed by distillation of the alcohols and fluorogenic derivatisation

[Meissner, 1999]. The separation by thin layer chromatography on C8 and C18

phases has been described [Buchmann, 1996-A; Buschmann, 1996-B; Buschmann,

1996-C; Spilker, 1996; Klaffke, 1998]. Underivatised alkylmonoglycosides can be

separated with isomer resolution using high-temperature GC [Rybinski, 1998;

Spilker, 1996]. APGs have been also separated by GC after silylation [Buchmann,

1996-A; Spilker, 1996; Billian, 1998]. The pyranoside and furanoside forms can be


140

distinguished by the different fragments obtained by GC–MS [Billian, 1998].

Micellar electrokinetic chromatography with electrochemical detection has been

applied to the determination of APGs in shampoo [Hübner, 2006]. To implement

the photometric detection of APGs after HPLC separation, several post-column

chromogenic derivatisation procedures have been described [Kramer, 1992].

Alternatively, refractive index detection [Klaffke, 1998], ELSD [Buchmann, 1996-A;

Buschmann, 1996-B; Lafosse, 1992; Czichocki, 2002; Armari, 2003] or MS detection

[Czichocki, 2002; Eichhorn, 1999; Klaffke, 1999; Kühn, 2004], can be used. The

chromatographic behaviour of alkylglucopyranoside standards using C8, C18,

phenyl and polyvinylalcohol columns has been described [Lafosse, 1992], and the

separation of APGs with silica, C18 and polyvinylalcohol columns have been

compared [Czichocki, 2002]. Eichhorn and Knepper [Eichhorn, 1999] have used

HPLC–MS with an ESI to determine APGs in spiked river and waste waters.

Using a C18 column and gradient elution with ACN/water, the α- and β-epimers

and the ring isomers were resolved. Alkylglucopyranosides can be further

distinguished by their higher affinity to form [M+NH4]+ adducts with respect to

alkylglucofuranosides. Kuhn and Neubert [Kühn, 2004] have used HPLC–ESI-

QTOF–MS with a C18 column, a MeOH/water mobile phase and gradient

elution, to characterize industrial mixtures of APGs; however, isomers were not

resolved.

In this section, the HPLC separation of APG mixtures using either an

alkylamide or a cyanopropyl column, with ACN/water mixtures as mobile

phases, was studied. The alkylamide column in isocratic conditions was adequate

to separate alkylmonoglucosides with full resolution between epimers and ring

isomers. Retention was lower on the cyanopropyl column, but equilibration time

was much shorter. Using the cyanopropyl column with gradient elution the ring

isomers were also resolved. The influence of the alkyl chain length on the


141

response factors was studied. The procedures were applied to the characterization

and determination of APGs in toiletries.

IV.1.1.1. Optimization of working conditions using continuous infusion MS

Using continuous infusion MS in the NI mode, peaks of the [M−H]− ions

of the standards and the components of Glucopone and Plantacare were obtained.

In the PI mode, the corresponding [M+H]+ and [M+Na]+ peaks were observed.

The [M+ Na]+ peaks largely predominated when NaAcO was added to the

infused solution. Maximal intensity was obtained with 20 mM NaAcO. The PI

mode, which gave peak intensities ca. 20 times larger than those obtained with

the NI mode, was selected. Glucopone and Plantacare showed several groups of

[M+Na]+ peaks, each of them corresponding to the oligomers with a given

number of glucose units, up to m = 6. Within each group, two large peaks

corresponding to the C8Gm and C10Gm oligomers, and a small one due to the

C12Gm oligomer, were observed. The intensity also decreased as m increased.

Using infusion of the Glucopone solution, the dry gas flow, spray temperature

and spray pressure were optimized.

IV.1.1.2. Separation of APGs by HPLC–MS in isocratic conditions

The alkylamide column and a mixture containing 20:80 ACN/water in the

presence of the HAcO/NaAcO buffer were first used. The EICs at the m/z values

observed in the infusion spectra were examined. The AMGp standards gave

single chromatographic peaks, and complex chromatograms were obtained for

the technical grade mixtures. As shown in Fig. IV.1 for Glucopone, a complete

separation of the four C8G1 isomers (α- and β-epimers, and ring isomers, on the

EIC at m/z 315) was achieved.


142

0 10 20 30 40 50 Time (min)

m/z 315

m/z 477

α-C8G1p

β-C8G1p

α-C8G1fβ-C8G1f

0.5

1.0

1.5

Ab

un

da

nce

x 1

07

C8G2

Fig. IV.1. EIC of Glucopone. The alkylamide column was used. The

mobile phase contained water with 20% ACN in the presence of 40 mM

HAcO/NaAcO buffer of pH 4.7. The flow rate was 0.4 mL min−1.

The epimers and ring isomers of C10G1 and C12G1 appeared also resolved at

longer retention times (not shown). Also, a partial separation of the isomers of

the alkyldiglucosides (C8G2) was evidenced (EIC at m/z 477). The identification

of α- and β-C8G1p was made by injecting solutions of the corresponding

standards. As far as we know, standards of APGf are not available; however, the

two peaks of low intensity which appeared at longer retention times than the α-

and β-C8G1p peaks on the m/z 315 trace, were attributed to the corresponding α-

and β-C8G1f isomers. Retention should be higher for these isomers as a

consequence of the longer –CH(OH)CH2OH chain bound to the

alkylglucofuranoside ring in comparison with the –CH2OH chain of the

alkylglucopyranosides.

Next, to reduce the analysis time of the C10Gn and C12Gn isomers, the

ACN concentration in the mobile phase was increased. With 30% ACN (Fig.


143

IV.2), the α- and β-epimer pairs of C8G1 were not resolved, but the four isomers

of C10G1 were resolved within 20 min. As also shown in Fig. IV.2, the presence

of alkyldiglycosides (C8G2 and C10G2) and alkyltriglycosides (C8G3) with

partial isomer resolution was evidenced.

0 2 4 6 8Time (min)

m/z 315

C8G1p

C8G1f

m/z 505

C10G2

m/z 639

C8G3

m/z 477

C8G20.5

1.0

Abu

ndan

ce x

106

1.5

12 14 16 18 20

m/z 343

α-C10G1p

α-C10G1f

Time (min)

β-C10G1p

β-C10G1f

Fig. IV.2. EIC of Glucopone. The alkylamide column was used. The


HAcO/NaAcO buffer of pH 4.7. The flow rate was 0.2 mL min−1.

The chromatograms of Plantacare were similar to those of Glucopone, but with

higher proportions of the C10Gm and C12Gm oligomers with respect to those of

C8Gm (not shown). A chromatogram of a baby shampoo, eluted with 50%

acetonitrile, is shown in Fig. IV.3. The ring isomers of the AMGs of C8G1,

C10G1, C12G1 and C14G1 were resolved. The α- and β-epimers of C12G1f,

C14G1p and C14G1f were also resolved. The isomers of the alkyldiglycosides

C8G2, C10G2 and C12G2 were partially resolved.


144

0 2 4 6 80

0.5

1

1.5

10 14 18

Ab

un

da

nce

x 1

07

2

Time (min)

m/z 371

m/z 343

m/z 315

m/z 399

m/z 477

m/z 505

2.5

m/z 533

C8G1p

C8G1f

C10G1p

C10G1f

C12G1p

α-C12G1f

C8G2

C10G2

C12G2

β-C12G1f

α-C14G1p

β-C14G1p 16Time (min)18 20

α-C14G1f

β-C14G1f

m/z 399

Fig. IV.3. EIC of a baby shampoo. The alkylamide column was used. The


HAcO/NaAcO buffer of pH 4.7. The flow rate was 0.2 mL min−1. The inset

shows the m/z 399 trace with the intensity axis multiplied by 50.

Retention was much weaker with the cyanopropyl column; for instance,

using 20% ACN, the C8G1 isomers were eluted within 6 min (not shown). Using

95 and 100% water in the mobile phase, the C8G1 isomers appeared within 30

and 40 min, respectively. In all cases, the ring isomers were well resolved, but

the epimer pairs were poorly resolved with this column.

IV.1.1.3. Separation of APGs by HPLC–MS with gradient elution

The alkylamide column and mobile phases containing 60:40 (A) or 90:10

(B) ACN/water (v/v) in the presence of the HAcO/NaAcO buffer were used.

Mobile phase A was first pumped until stabilization of the pressure, thus the

Plantacare solution was injected and the composition of the mobile phase was


145

linearly varied from A to B in 20 min. The AMGs were separated with partial

resolution between the epimers, and with excellent resolution between the ring

isomers, within 12 min (not shown). However, the re-equilibration of this column

was observed to be rather slow. Pumping of mobile phase A during several hours

was required to achieve reproducibility between successive injections.

0 4 8 12Time (min)

0

2

4

Abu

ndan

ce x

107

C8G1p

C8G1f

C10G1p

C10G1f

C12G1p

C12G1f

C14G1p

C14G1f

C16G1p

C16G1f

m/z 315 m/z 343 m/z 371m/z 399

m/z 427

13Time (min)

14

m/z 427

Fig. IV.4. EIC of Plantacare. The cyanopropyl column was used. The

composition of the ACN/water mobile phase (also containing 40 mM of

the HAcO/NaAcO buffer of pH 4.7) was linearly varied from 25 to 90%

acetonitrile in 15 min. The flow rate was 0.2 mL min−1. The inset shows

the m/z 427 trace with the intensity axis multiplied by 20.

Using the cyanopropyl column, mobile phases containing 25:75 (A) and

90:10 (B) ACN/water (v/v) in presence of the acetic acid/sodium acetate buffer,

were used. The mobile phase was linearly varied from A to B in 15 min. As

shown in Fig. IV.4 for Plantacare, all the AMGs, from C8G1 up to C16G1, were

separated within 14 min. The epimer pairs were not resolved, but a good

resolution between the ring isomers was achieved. Successive injections of the


146

sample were performed after pressure stabilisation (15 min). Excellent

reproducibility of the chromatograms was obtained. The chromatogram of a hand

cream, which has a rather complex matrix, showed the resolved peaks of the ring

isomers of C12G1 and C14G1 (Fig. IV.5). A

bu

nd

an

ce x

105

10 12 140

2

4

6

8

Time (min)

C12G1p

C12G1f

C14G1p

m/z 371 m/z 399

C14G1f

Fig. IV.5. EIC of a hand cream. The cyanopropyl column was used. The

composition of the ACN/water mobile phase (also containing 40 mM of

the HAcO/NaAcO buffer of pH 4.7) was linearly varied from 25 to 90%

ACN in 15 min. The flow rate was 0.2 mL min−1.

IV.1.1.4. Quantitation studies

The calibration curves were obtained using the cyanopropyl column in the

optimized gradient elution conditions. Solutions containing a mixture of the

standards (β-pyranosides C1G1, C6G1, C8G1, C10G1 and C12G1), in the

presence of 50 µg mL−1 β-pyranoside C9G1 as internal standard, were injected.

Mixtures of the α-pyranosides of C1G1 and C8G1 were also injected. The


147

concentration of the standards was varied from 10 to 120 µg mL−1 (from ca. 60–

600 µM for C1G1 to 30–360 µM for C12G1). In all cases, the calibration curves

gave a good linearity, with r2 > 0.99 (6 points per curve).

As shown in Fig. IV.6, the relative sensitivities of the β-epimers (or

response factors, calculated by using α-C1G1p as reference) increased almost

linearly from C1G1 to C8G1, reached a maximum at C10G1 and decreased for

C12G1. Relative rather than absolute sensitivities were plotted in this figure to

enhance the differences between the standards, independently from detector

sensitivity and some working conditions. A range of relative sensitivities for

C14G1 was also plotted on Fig. IV.6. This range was obtained by injecting

Plantacare, and using the sum of the areas of the C14G1p and C14G1f peaks, and

the composition given by the manufacturer (6.1–9.5% total C14G1 for a 51–53%

pure product), to calculate the relative sensitivity range. As deduced from Fig.

IV.6, this range indicated a further decrease of the relative sensitivity for alkyl

chains longer than 12 carbon atoms. Since a range of concentrations was not

declared (Table IV.1), the relative sensitivity for C16G1 could not be calculated.

The influence of the mobile phase composition on the relative sensitivities

was also studied. For this purpose, a 20:80 (A’) or a 75:25 (B’) ACN/water (v/v)

mixtures, containing 20 mM NaAcO and 20 mM HAcO, were used. Dilutions of

the stock solutions of the standards were prepared using both A’ and B’. The

dilution factor was 1:20, but 1:10 was used for C12G1. All the diluted solutions

also contained 50 µg mL−1 of the internal standard, β-C9G1p. The autosampler

was directly connected with the ESI source with a PEEK tube in the absence of

the separation column, and the solutions were injected successively using A’ and

B’ as mobile phases. No significant differences between the peak areas obtained

with mobile phases A’ and B’ were observed. Thus, the differences among the

response factors observed in Fig. IV.6 should be attributed to the length of the


148

alkyl chains rather than to the increase of the acetonitrile concentration along the

elution gradient.

Rel

ativ

e se

nsi

tivity

4

8

12

16

0 4 8 12

0

10

30

50

70

90

LOD

(µM

)

n

Fig. IV.6. Relative sensitivities (left axis and dashed line) of α- (■) and β-

alkylglycopyranosides (♦) with respect to β-C1G1, and LODs (▲, right

axis and dotted line) vs. the number of carbon atoms in the alkyl chain, n

(β-C9G1p used as internal standard). All values were obtained from pure

standards, but for C14G1 the two points delimit the range of relative

sensitivity, which was estimated from its concentrations in Plantacare (6.1–

9.5% C14G1 for a 51–53% pure product, as declared by the manufacturer).

Taking into account that Na+ is bound to the same oxygen as the alkyl

chain [Klaffke, 1999], the increase of the relative sensitivity from C1G1 up to

C10G1 can be due to stabilization of the adduct by the higher electronic density

provided by the longer alkyl chain. The smaller volatility, the formation of ion-

pairs or micellization are possible explanations for the sensitivity decrease when

the alkyl chain has 12 and 14 carbon atoms. Thus, the response factor can be

approximately predicted by linear interpolation within the C1G1–C10G1 range,

but not when n > 10. Owing to the large differences, large systematic errors


149

should be expected if calibration is not performed by using all the appropriate

CnG1 standards.

The relative sensitivities of the α-epimers of C1G1p and C8G1p with

respect to β-C1G1p (used as a reference compound) were also plotted on Fig.

IV.6. The α-epimer/β-epimer sensitivity ratio was 0.995 for C8G1, but 0.43 for

C1G1. Thus, the response factor of the α-epimer was less than half that of the β-

epimer for C1G1, approaching to the sensitivity of the corresponding β-epimer

for longer alkyl chains. This can be explained by a lower ability of the α-epimer

of C1G1 to bind Na+ with respect to the β-epimer. Further, the higher electronic

density on the oxygen atom bound to the chain could explain both the sensitivity

increase when the alkyl chain becomes longer, and the small sensitivity

differences between the C8G1 epimers. Small or negligible systematic errors

should be expected by using the calibration curve of a CnG1 epimer (n ≥ 6) to

predict concentrations of the other epimer, or the sum of the concentrations of the

two epimers.

The LODs were obtained as the concentrations giving a peak area equal to

three times the standard deviation of the calibration points with respect to the

regression straight-line (standard deviation of the residuals). As observed in Fig.

IV.6, the LODs were 85 µM for C1G1 and of ca. 25 µM from C6G1 up to

C12G1, which agrees with the higher response factors of the latter. Also, from

the standard deviation of the residuals, the limits of quantitation (as the

concentrations giving a 10% precision in the determination of the analytes) were

280 µM for C1G1 and 80 µM from C6G1 up to C12G1.

When the industrial products were analyzed, significant differences

between the peak area ratios of the respective furanoside/pyranoside forms were

observed. Thus, integration of the areas for the C10G1 and C12G1 isomer pairs

showed that this ratio was 0.12 – 0.13 for Glucopone and the baby shampoo, 0.26


150

– 0.30 for Plantacare and ca. 0.04 for the hand cream. Thus, the

furanoside/pyranoside concentration ratio can be used to characterize industrial

samples. However, owing to the lack of standards, only the total concentration of

each CnG1 group of isomers was obtained. For this purpose, the sum of the peak

areas of the pyranoside and furanoside forms, and the calibration curve of the

corresponding β-pyranoside standard, were used. For Plantacare, the calibration

curves predicted concentrations within the ranges declared by the manufacturer

(Table IV.1). The analysis of a baby shampoo gave 0.5% C8G1, 0.2% C10G1,

and 0.6% C12G1. The peaks of the C14G1 isomers were also observed in the

chromatograms of this sample.

Table IV.1. Declared and found concentrations of alkylmonoglucosides in

Plantacarea

Compound Declared (%) Found (%)

C6G1 Max. 0.26 0.06

C8G1 12.2 – 15.9 13.0

C10G1 7.6 – 11.7 9.7

C12G1 18.9 – 22.3 18.9

C14G1 6.1 – 9.5 –

C16G1 Max. 2.12 –

a Range from minimal up to maximal declared concentrations multiplied by

minimal (51%) and maximal (53%) declared purity, respectively.

IV.1.2. Fragmentation of D-Glucose and AMGs

CID fragmentation constitutes a powerful tool for the structural

elucidation of oligosaccharides. Alkaline ions and ammonium [Harvey, 2000-A;

Harvey, 2000-B; Chiarelli, 1987; Cancilla, 1999; Harvey, 1994; Harvey, 1997; Kováčik,

1995; Penn, 1996; Asam, 1997], divalent cations [Harvey, 2001; Madhusudanan,

2005], and iron salts [Carlesso, 2000; Carlesso, 2001] have been used; however, the


151

most informative fragmentation with maximal sensitivities has been obtained

with sodium and calcium ions [Harvey, 2000-A; Harvey, 2000-B; Harvey, 2001]. The

fragmentation of oligosaccharides using IT-MS [Zaia, 2004] and the application of

MALDI-MS to the analysis of carbohydrates and glycoconjugates [Harvey, 2006]

have been reviewed.

When using low fragmentation energies, and according to the Domon–

Costello nomenclature [Zaia, 2004; Domon, 1988] (see Fig. I.6), the cleavage of the

glucosidic bonds produces mainly B and Y fragments [Asam, 1997; Creaser, 2002].

Entire linkage sequences of linear and branched polysaccharides can be

elucidated by analyzing the fragments [Asam, 1997; Harvey, 2001; Zaia, 2004].

Using higher fragmentation energies, cross-ring cleavages, which provide

additional linkage information, are also produced [Harvey, 2000-A; Harvey, 2000-B;

Harvey, 2001; Cancilla, 1999; Asam, 1997; Zaia, 2004; Creaser, 2002].

Less attention has been paid to the CID spectra of monosaccharides and

their derivatives. The stereochemical differentiation of monosaccharides in the

presence of Zn2+ [Gaucher, 1998] and iron chloride [Carlesso, 2000] has been

demonstrated. The positional isomers and diastereomers of sulfated

monosaccharides have been distinguished [Minamisawa, 2005]. The CID spectra of

D-glucose and 2-fluorodeoxyglucose have been compared [Macášek, 2003]. Using

CID spectra, several pentoses and hexoses, including stereoisomers, were

differentiated by the ratio of competing fragmentation processes [March, 2005].

Multivariate analysis of TOF-SIMS has been used to distinguish among several

furanoses, as well as among several pyranoses [Berman, 2006]. However, studies

addressed to distinguish five- from six-membered ring isomers using CID

fragmentation are rather scarce. The ring size of the last unit at the non-reducing

end of oligosaccharides has been related to the abundance ratio of the [M+Na-

90]+ and [M+Na-104]+ ions of the CID spectrum [Kováčik, 2001]. Using TOF-


152

SIMS, five-membered ring monosaccharides were more stable than the

corresponding six-membered ring isomers, also giving different peak profiles

upon fragmentation [Berman, 2006].

APGs, which are industrially produced as complex mixtures from glucose

and fatty alcohols, constitute an important class of nonionic surfactants [Hill,

1997; Rybinski, 1998; Balzer, 2000]. Because of their foaming performance,

synergism with other surfactants, and environmental and skin compatibilities,

APGs are widely used in cleaning and personal care products [Rybinski, 1998;

García, 1997; Uppgard, 2000] and in the oil and gas industry [McGregor, 2004]. The

aim of this work was to study the ion-trap stepwise fragmentation of AMGs,

which are the major components of industrial APGs. Also, the industrial

production of APGs leads to mixtures containing major amounts of AMGp, and

minor but significant concentrations of their five-membered ring isomers, AMGf.

Thus, in this section we describe the CID spectra of both AMGp and AMGf,

using several isotopic forms of D-glucose to assist interpretation. The successive

MS2, MS3 and pseudo-MS4 spectra of D-glucose, D-glucose-13C6, D-glucose-6,6-

d2, D-glucose-1-13C and AMGp having up to 12 carbon atoms in the alkyl chain

were obtained, at increasing fragmentation energies, with an ESI-IT-MS.

Standards of the corresponding AMGf were not available; however, previous

separation of a commercial mixture of APGs by HPLC, and their MS and MS2

spectra were obtained on-line.

IV.1.2.1. Optimization of the IT-MS detection conditions

Using infusion in the IT-MS, both [M+H]+ and [M+Na]+ ions were

observed to predominate in the PI spectra of D-glucose, the AMGp standards and

Glucopone. The spectrum of Glucopone showed the predominant peaks of the

octyl- and decyl-monoglucosides, plus the peaks of the corresponding


153

diglucosides and triglucosides with lower abundances. Concerning to the alkyl

chain length, the octyl- and decylglucopyranosides predominated, the

corresponding octyl- and decylglucofuranosides showing much lower

concentrations. Optimization of the IT-MS detection conditions was performed

using Glucopone solutions. The abundance of the [M+Na]+ ions largely increased

when sodium acetate was added to the MeOH/water solutions. The abundance of

the [M+Na]+ ions increased with the Na+ concentration, and a plateau was

reached within the 10 – 20 mM range. Then, the drying gas flow, spray

temperature and spray pressure were optimised in the presence of 20 mM

NaACO for a maximal intensity of the [M+Na]+ peaks of the AMGs of

Glucopone. The rules to nomenclature of fragmentation are given in section I.2.3.

IV.1.2.2. Fragmentation of D-Glucose and their isotopic forms using MSn

Using continuous infusion of the standard solutions in the optimized

detection conditions, the MS2 spectra of D-glucose, D-glucose-13C6, D-glucose-

6,6-d2 and D-glucose-1-13C were obtained at increasing fragmentation energies.

In Fig. IV.7, the MS2 spectra of the [M+Na]+ ions of D-glucose and D-glucose-

13C6, both obtained at an energy of e = 0.45, are given. Using this fragmentation

energy, the peak of the parent ion was still observed together with the peaks of

next ion generation. By comparing the MS2 spectra of D-glucose and D-glucose-

13C6, it is deduced that the m/z 185 peak of D-glucose corresponds to an ion with

six carbon atoms. This peak was interpreted as due to a loss of a water molecule

from the [M+Na]+ parent ion (m/z 203). At lower m/z values, the MS2 spectra of

D-glucose showed an abundant peak at m/z 143 and a weak one at m/z 113,

which according to MS2 spectrum of D-glucose-13C6 (Fig. IV.7, part B),

corresponded to ions with four and three carbon atoms, respectively.


154

Inte

nsi

ty x

103

116

147

209

413

599

0

0.5

1

1.5

100 200 300 400 500 600m/z

191563

577

[M+

Na

]+

B

Inte

nsi

ty x

103

0

0.5

1

1.5

113

143

203

413

557

593

100 200 300 400 500 600m/z

571185

[M+

Na

]+

A

Fig. IV.7. MS2 spectra of the [M+Na]+ parent ion of (A) D-glucose (m/z

203) and (B) D-glucose-13C6 (m/z 209), both obtained at e = 0.45 (♦, parent

ions).

By comprehensively computing all the possible cross-ring cleavages leading to

an m/z 143 positive ion with four carbon atoms, the following possibilities were

found: 0,2A, 1,3X, 2,4X and 0,4X; however, by using the corresponding [M+Na]+

peak as parent ion, the MS2 spectrum of D-glucose-6,6-d2 (not shown) yielded a

peak at m/z 145. This indicated that carbon atom 6 was retained by the m/z 143

ion fragment of D-glucose. This excluded the 0,4X fragmentation. Further, the

MS2 spectrum of D-glucose-1-13C (not shown) presented a peak at m/z 143,

which evidenced that carbon atom 1 was not present in this ion fragment. This

definitely excluded all the X fragmentations. Therefore, the m/z 143 ion of the

MS2 spectrum of D-glucose should be exclusively produced by a 0,2A

fragmentation. The two possible structures of this fragment ion are shown in Fig.

IV.8.


155

Similarly, the 0,3A, 1,4A, 0,3X and 1,4X fragmentations, plus a 3,5X

fragmentation followed by loss of a water molecule, are possible routes leading

to an m/z 113 ion. However, the MS2 spectrum of D-glucose-6,6-d2 showed a

peak at m/z 115, indicating that carbon atom 6 should be retained by the m/z 113

ion of D-glucose. Further, the spectrum of D-glucose-1-13C showed a peak at m/z

113, indicating that carbon atom 1 should be excluded from the composition of

this ion. Thus, according to the spectra, only the two fragments obtained by a 0,3A

fragmentation (Fig. IV.8) are possible to explain the formation of the m/z 113

ion.

0,2Am/z 143

0,3Am/z 113

Na+

O

OH

5

4

6 OH

H

Na+OH

O

HO

5

4

6

OH

HO

OH

ONa+

5

4

6

3

OH

HO

O

OH

H

Na+

5

4

6

3

Possible structuresCross-ring cleavage

Fig. IV.8. The two possible structures of the m/z 143 and m/z 113 ions of

the MS2 spectrum of the [M+Na]+ parent ion of D-glucose, produced by 0,2A and 0,3A cross-ring cleavages, respectively.

Concerning to the abundant m/z 413 peak which was present in the MS2

spectrum of the [M+Na]+ parent ion of D-glucose, no shifts with respect to the

equivalent spectra obtained with either D-glucose-13C (Fig. IV.7, part B), D-

glucose-6,6-d2 and D-glucose-1-13C (not shown) were observed. This indicated

the absence of fragments of glucose in the composition of the m/z 413 peak.

However, this abundant peak was also present in the MS2 spectra of all the

AMGs, and peaks showing the mass of the unfragmented molecules plus 413 m/z


156

units also appeared in the spectra of both D-glucose and all the AMGs. For these

reasons, further efforts to interpret the m/z 413 peak were performed. First, MS2

spectra of the [M+Na]+ parent ion of D-glucose were obtained both in the

absence of MeOH, and also using 20 mM NaHCO3 instead of 20 mM NaAcO. In

both cases, an m/z 413 ion, with a similar abundance as that observed using 50%

MeOH and 20 mM NaAcO, was obtained. Therefore, the presence of MeOH,

AcO- or HAcO in the composition of the m/z 413 ion was also discarded. On the

other hand, the m/z 413 peak was not observed when a 20 mM NaAcO solution

in the absence of D-glucose was infused. Thus, the m/z 413 peak was formed

only in the presence of D-glucose or an AMG, and could contain Na+, OH- and

H2O, but not carbon atoms.

Thus, fragmentation of the m/z 413 ion yielded peaks at m/z 301 and 189,

which corresponded to two successive losses of 112 Da, in the MS3 spectrum.

These losses could correspond to the uncharged fragment NaOH·4H2O. A peak at

m/z 171 which was attributed to a loss of water with respect to the m/z 189 ion

was also observed. Further fragmentation of the m/z 301 ion was achieved by

setting the compound stability parameter at 300%. Again, the m/z 189 and 171

ions were exclusively observed on this pseudo-MS4 spectrum. Then, all the

possible combinations of Na+, OH- and H2O (up to 20 units of each, respectively)

matching m/z 413, with the restriction of having a single positive charge, were

computed. The following single combination was found: 4 Na+ + 3 OH- + 15

H2O. However, the exact mass of this combination, 413.1257 Da, did not match

with the m/z values of the peaks observed in the high-resolution spectra of D-

glucose (413.2341 Da) and the AMGp (413.2349 - 413.2406 Da). Thus, no more

efforts to interpret the m/z 413 peak were done.

As deduced from the comparison of the MS2 spectra of Fig. IV.7, parts A

and B, the ion of D-glucose at m/z 593 had six carbon atoms. A likely


157

explanation is the formation of an adduct containing a molecule of D-glucose

plus the m/z 413 ion (m/z = 413 + 180 = 593). The MS2 spectra obtained from the

[M+Na]+ parent ions of D-glucose-6,6-d2 and D-glucose-1-13C (not shown) gave

equivalent peaks at m/z 595 and 594, respectively, which agreed with this

composition. Similarly, the D-glucose peaks at m/z 571 and 557 (Fig. IV.7, part

A) were interpreted as coming from the m/z 593 adduct by gain of a molecule of

water and loss of NaOH, and by loss of two molecules of water, respectively.

These m/z 571 and 557 ions also showed shifts of +6, +2 and +1 Da when the

MS2 spectra were obtained with D-glucose-13C6, D-glucose-6,6-d2 and D-

glucose-1-13C, respectively, which agrees with the proposed compositions.

IV.1.2.3. Fragmentation of AMGp using MSn

As summarized in Table IV.2, and as showed in Fig. IV.9 for octyl-GP, the

MS2 spectra of the [M+Na]+ parent ions of the AMGp exhibited peak patterns

similar to those of D-glucose, but with a few significant differences. Thus, the

m/z 185 ion, which was present in the MS2 spectra of D-glucose and all the

AMGp, and which was interpreted as a loss of water in D-glucose, should

correspond to the loss of the alkyl alcohol in the AMGp (B1 fragmentation).

Differently from D-glucose, which can undergo water losses at several locations,

in the AMGp the alkyl alcohol chain is exclusively bound to carbon atom 1. The

m/z 143 ion, which was present in the MS2 spectra of all the AMGp, can be

exclusively formed by a 0,2A fragmentation. Owing to the presence of the alkyl

chain, this m/z value did not matched with the possible fragment ions obtained by

other cross-ring cleavages. This also agrees with the 0,2A cross-ring cleavage

deduced above for D-glucose. The MS2 spectra of all the AMGp also showed an

m/z 129 ion which was not present in the MS2 spectra of D-glucose. This m/z 129

ion was weak for methyl-MGp and abundant for the other AMGp. This suggested


158

that the presence of the hydrocarbon chain was necessary to stabilize the

resulting non-ionic fragment. By computing all the possible combinations of C,

H, O and Na giving rise to an m/z 129 ion with a positive charge, the two

following possibilities were found: C4H10O3Na+ and C3H6O4Na+; however, a 2,5A

fragmentation is the only way to produce the former ion in a single step, whereas

the less likely concurrence of at least two fragmentations, 3,5X and C1, are

required to obtain the latter.

Table IV.2. Ions observed on the MS2 spectra of the AMGp (m/z values).

Ion \ n 1 6 8 10 12

2,5A 129 129 129 129 129 0,2A 143 143 143 143 143 B1 185 185 185 185 185 [M+Na]+ 217 287 315 343 371 Unknown 413 413 413 413 413 [M+413-2H2O]+ 571 641 669 697 725 [M+413+H2O-NaOH]+ 585 655 683 711 739 [M+413]+ 607 677 705 733 761 Others 235 209

249 209 235 275

235 309

291 315

Concerning to the peaks at large m/z values, and as also occurred with D-

glucose, they matched with the following compositions: [M+413]+,

[M+413+H2O–NaOH]+ and [M+413–2H2O]+, where M = 180 + n 14 (n = carbon

atoms in the alkyl chain). Thus, analogously to that proposed for D-glucose, they

were attributed to the formation of adducts of the m/z 413 ion with a molecule of

the corresponding alkyl-GP, and to related ions produced by further gains and

losses of water and NaOH.

As also indicated in Table IV.2, in comparison to the MS2 spectrum of D-

glucose, a few additional ions which depended on the length of the alkyl chain

were also observed in the MS2 spectra of the AMGp. The m/z 235 ion of methyl-

MGp can be attributed to the gain of water to yield [M+Na+H2O]+. For octyl-


159

MGp, the abundant m/z 275 ion (Fig. IV.9) could be due to a loss of NaOH to

yield [M-OH]+. Finally, significant differences between the MS2 spectra of the α-

and β-epimer pairs of methyl- and octyl-MGp were not observed.

Inte

nsi

ty x

104

0

1

2

3

100 200 300 400 500 600 700m/z

129

235

275

315

413705

669683143185

209

Fig. IV.9. MS2 spectrum of the [M+Na]+ parent ion (♦) of octyl-MGp

obtained at e = 0.80.

IV.1.2.4. Fragmentation of AMGf using MSn

Because of the lack of standards, the MSn spectra of AMGf could not be

obtained by continuous infusion in the IT-MS. Instead of this, injections of

Glucopone using HPLC with MS and MS2 detection were performed. Isocratic

elution with mobile phases constituted by ACN/water mixtures, also containing

the sodium acetate buffer, was employed. Using 40 % ACN, the ring isomers of

the octyl- and decyl-MGp were well resolved in a short time. The extracted ion

chromatograms at the m/z values of the [M+Na]+ ions of the octyl- and decyl-

MGs are shown in Fig. IV.10. Then, HPLC with MS2 detection, with an increase

of the fragmentation energy between injections, was used. The MS2 total ion

chromatograms (MS2-TIC), and the MS2 spectra at the retention times of the


160

octyl-MGp and octyl-MGf peaks, are shown in Fig. IV.11. At low fragmentation

energies (e < 0.6), the peak area of octyl-MGp was much higher than that of

octyl-MGf (see the MS-TIC chromatograms of Fig. IV.10, which correspond to

MS2-TIC with e = 0); however, at increasing energies, the peak area of the octyl-

MGp decreased at a higher rate than that of the octyl-MGf.

0

0.5

1.0

1.5

Inte

nsi

tyx

108

octyl-MGp

octyl-MGf

decyl-MGp

decyl-MGfm/z 315 m/z 343

2 4 6Time (min)

1 3 5 7

Fig. IV.10. Chromatogram of Glucopone obtained using MS detection. The

traces are the extracted ion chromatograms at the m/z values of the

[M+Na]+ ions of the octyl- and decyl-monoglucosides. Isocratic elution

with a 40:60 ACN/water mobile phase containing 20 mM NaAcO and 20

mM HAcO at 0.3 mL min-1 was performed.

As shown in Fig. IV.11, left part, the area of the octyl-MGp peak was even

smaller than that of the octyl-MGf peak when e = 0.80. Also, as observed in Fig.

IV.11, right part, the MS2 spectra of the alkyl-MGf differed ostensibly from

those of the corresponding alkyl-MGp. Thus, in comparison with the octyl-MGf,

the m/z 413 ion and its adducts with unfragmented molecules were more

abundantly formed by the octyl-MGp. The differences between the MS2-TICs

indicated an easier fragmentation of the alkyl-MGp compared to the alkyl-MGf.


161

Inte

nsity

x 1

04

oct

yl-M

Gp

oct

yl-M

Gf

50

100

150

2

4

1 2 3Time (min)

1

2

e = 0.7

e = 0.8

e = 0.9

315

143

143315

185413 705

100 300 500 700m/z

143

315185 413

705

315

20

80

413

octyl-MGpe = 0.7

0.5

1

185316

315

413

669705

683

0.2

0.6

100 300 500 700m/z

185

413

669

705683

315

oct

yl-M

Gp

octy

l-MG

p

oct

yl-M

Gf

octy

l-MG

f

octyl-MGfe = 0.7

octyl-MGfe = 0.8

octyl-MGpe = 0.8

octyl-MGpe = 0.9

octyl-MGfe = 0.9

Fig. IV.11. Total ion HPLC-MS2 chromatograms of Glucopone recorded at

the indicated fragmentation energies (left), and corresponding MS2 spectra

at the retention times of the peaks (right). The [M+Na]+ ions of octyl-MGp

and octyl-MGf (m/z 315) were used as parent ions (♦). Other conditions as

in Fig. IV.10.

On the other hand, as also deduced from the MS2 spectra of Fig. IV.11,

the cross-ring cleavage at 0,2A to give the m/z 143 ion was much more likely in

the alkyl-GFs than in the alkyl-GPs. This could be due to a lower stability of the

five-membered furanoside rings in comparison to the six-membered pyranoside

rings. Finally, as also observed in Fig. IV.11, the alkyl-GPs and alkyl-GFs

showed a similar trend to lose the alkyl chain giving rise to the m/z 185 ion.


162

IV.2. Non-ethoxylated and ethoxylated alcohols

IV.2.1. Chromium(VI) oxide oxidation of non-ethoxylated and ethoxylated

alcohols for determination by ESI-MS

Primary alcohols are common components of many biological and

industrial samples, in addition to being present at trace levels in the aquatic

environment. Alcohols in the C10–C18 range (fatty alcohols) are potent

pheromones while those with higher molecular masses are essential components

of plant waxes [Bianchi, 1995]. The industrial importance of alcohols derives from

their widespread use as solvents and fillers in industrial and household products,

while fatty alcohols are common ingredients of body-care and cosmetic products

[Farm, 2006]. Fatty alcohols also serve as the raw materials in the production of

important surfactant classes, including alkyl ether sulfates and sulfonates, and

FAEs [Farm, 2006.]. FAEs are mostly obtained from renewable resources as

complex mixtures of oligomers with the structure: CH3(CH2)n–1(OCH2CH2)mOH.

A special class of ethoxylated alcohols comprises those of low molecular

mass (both n and m <4). These compounds, known as cellosolves, are used, for

example, as anti-icing additives in aviation fuels and as solvents in cleaning

solutions [Cheremisinoff, 2003]. GC has been successfully employed for the

determination of cellosolves and nonethoxylated alcohols with ≤ 26 carbon atoms

[Nichols, 2006], but not FAEs with m >4, due to the limited volatility of these

compounds [Rudewicz, 1986; Crescenzi, 1995; Battersby, 2001]. The major drawback

of HPLC methods for FAEs has been the lack of an adequate detector [Rudewicz,

1986; Petrovic, 2001]. Although this problem was partially resolved through the

introduction of refractive index [Kudoh, 1984; Mengerink, 1991; Cho, 2003;

Trathnigg, 2002] and ELSD methods [Mengerink, 1991; Heinig, 1998; Bear, 1988;

Miszkiewicz, 2000; Miszkiewicz, 1996-B; Kamiusuki, 2000], the LODs are high for the


163

former, while the sensitivity of ELSD is poor for volatile compounds such as

non-ethoxylated alcohols (m = 0) and FAE oligomers with a low degree of

ethoxylation (m <3) [Miszkiewicz, 1996-A; Bernabé-Zafón, 2006]. Finally, low LODs

are achieved with chromogenic and fluorogenic pre-column derivatization

procedures [Marcomini, 1996; Schmitt, 1990; Kiewiet, 1995; Lemr, 1994; Zanette, 1996;

Lemr, 1996; Sun, 1997; Hoffman, 2004-A; Lemr, 2003; Okada, 1991; Okada, 1992;

Hoffman, 2004-B; Bachus, 2003; Desbène, 2005; Heinig, 1996-A; Micó-Tormos, 2008-A;

Micó-Tormos, 2008-B; Micó-Tormos, 2009; Zu, 2010].

In the determination of FAEs by PI-MS with ESI or APCI interfaces,

problems arise because the sensitivity of these methods decreases with

decreasing m; thus, sensitivity is low when m <4, and non-ethoxylated alcohols

(m = 0) are not detected [Rudewicz, 1986; Crescenzi, 1995; Petrovic, 2001; Zu, 2010;

Chiron, 2000; Sherrard, 1994; Dunphy, 2001; Cassani, 2004; Sparham, 2005]. To

overcome this problem, derivatization procedures, in which a chromophore or a

permanent charge is added to the oligomers, have been described [Lemr, 1994;

Lemr, 1996; Lemr, 2003; Desbène, 2005; Heinig, 1996; Zu, 2010; Dunphy, 2001;

Cassani, 2004; Sparham, 2005].

However, the derivatization of FAEs is difficult because it requires an

anhydrous medium [Okada, 1992; Zu, 2010; Dunphy, 2001; Barry, 2003], and there is

an increased risk of interference from both the reagent excess and the by-

products of the reaction [Sun, 1997; Hoffman, 2004-A; Micó-Tormos, 2008-A; Micó-

Tormos, 2008-B; Dunphy, 2001]. Furthermore, owing to the high risk of losing

oligomers with low m values by volatilization, the water content of the samples

must be reduced with particular care, which increases analysis time [Dunphy,

2001]. Derivatization with cyclic anhydrides is, by contrast, tolerant to the

presence of small amounts of water in the samples [Micó-Tormos, 2008-A; Micó-

Tormos, 2008-B; Micó-Tormos, 2009; Zu, 2010].


164

Chromium(VI) oxide (CrO3) in aqueous media containing sulfuric or

acetic acid (Jones’ reagent) is a well-known reagent used in the oxidation of

primary alcohols to carboxylic acids [Hudliký, 1990; Burke, 1999]. The carboxylate

group has a low molar absorptivity and is therefore of little interest for UV-Vis

detection, but can be detected with high sensitivity by MS, particularly when the

alkyl chain contains a large number of carbon atoms [Holčapek, 2005]. In this

section, the determination of non-ethoxylated primary alcohols by MS, previous

oxidation to carboxylic acids with the Jones’ reagent, was studied. In the

proposed procedure, the reagent excess was removed with sodium sulfite, and the

oxidized alcohols were separated from the resulting chromium(III) salts by

extraction in ethyl acetate-acetone. After addition of an amine to increase pH,

and water to further enhance ionization of the carboxylate groups, the extracts

were directly infused in the ESI source of the MS. The study was also extended

to FAEs and cellosolves, which yielded the corresponding ethoxy-carboxylic

acids. Application to the characterization and determination of fatty alcohols in

complex samples, such as cosmetics and body care products, and in

environmental samples as seawater, was also demonstrated.

IV.2.1.1. Optimization of the infusion medium

In order to increase ionization of the carboxylate groups, and therefore to

enhance sensitivity in the NI mode, the influence of the addition of butylamine,

water and ACN to the ethyl acetate-acetone extracts, was studied. A stock

solution of four standards (C12E0A, C14E0A, C16E0A and C18E0A, 200 µg

mL-1 each) in a 4:3 (v/v) ethyl acetate-acetone mixture was prepared. Aliquots of

this solution were diluted in a 1:1 ratio to obtain the following media: (a) ethyl

acetate and acetone in a 4:3 ratio; (b) as in a but in the presence of 30 mM

butylamine; (c) as in b but the medium contained also 10% water; and (d) as in b


165

but the medium contained also both 10% water and 40% ACN. These solutions

were infused in the MS, and the abundances of the [M-H] - ions were measured.

As shown in Fig. IV.12, sensitivity of the fatty acids increased as n

increased, and also varied largely with the nature of the infusion medium. Thus,

sensitivity increased ca. 5 times when butylamine was added to the extracts (Fig.

IV.12, from a to b). This was probably due to ionization of the acids in a

medium with a higher pH. Sensitivity further increased ca. 360 times when water

was also added (Fig. IV.12, from b to c).

C12E0A

C14E0A

C16E0A

C18E0A

0.0

0.4

0.8

1.2

Abu

nda

nce

x 1

07

a b c d

100 x

Fig. IV.12. Negative-ion MS relative sensitivities for four fatty acids (n =

12, 14, 16 and 18, 100 µg mL-1 each) in several media: (a) ethyl acetate and

acetone in a 4:3 ratio; (b) as in a but in the presence of 30 mM butylamine;

(c) as in b but containing also 10% water; and (d) as in b but containing

both 10% water and 40% acetonitrile. In a and b, the bar lengths were

multiplied by 100.

This should be mainly attributed to ionization enhancement upon increasing the

permittivity (dielectric constant) of the alkalinized medium. Remarkably, the

addition of water produced a much larger sensitivity increase than that observed

by solely increasing the pH of the extracts. This suggests that water was rather

scarce in the ethyl acetate-acetone extracts. Retention of most water into the


166

water-rich layer during extraction could be due to the large concentrations of

both mineral acids and chromium(III) and sodium salts, which should made ionic

strength to be very large. In a different series of experiments, up to 13% water

was added to 4:3 ethyl acetate-acetone mixtures before observing two-phase

separation. Then, as indicated in the recommended procedures, an aqueous

butylamine solution up to a final concentration of 10% was added to the extracts

before obtaining NI mode spectra. Finally, sensitivities were only slightly higher

in the presence of 40% ACN.

IV.2.1.2. Relative sensitivity of carboxylic and ethoxy-carboxylic acids as a

function of n and m

Relative sensitivities are useful in the qualitative interpretation of MS

spectral profiles of unknown samples. They are also necessary to avoid bias in

predicting alcohol concentrations after calibration with a standard different from

the addressed alcohol. To estimate the relative sensitivities of carboxylic and

ethoxy-carboxylic acids at increasing values of both n and m, the [M-H]- peaks of

the standards in ethyl acetate-acetone containing butylamine and water, and at

several concentrations of each acid (0, 100, 200 and 400 µg mL-1), were

measured in the NI mode. Relative sensitivities with reference to the internal

standard were calculated as follows:

[ ]is

ii MI

If = (E.IV.1)

where Ii and Is are the abundances of the [M-H]- ion of the compound of interest

and the internal standard, respectively, and [M] i is the molar concentration of the

compound. As shown in Fig. IV.13, part A, relative sensitivities increased as the

alkyl chain increased. This agreed with the reported APCI-MS response factors

of fatty acids [Holčapek, 2005]. Standards of ethoxy-carboxylic acids having large

values of both n and m are not commercially available; then, only the relative


167

sensitivities of a few ethoxy-carboxylic acids with low values of both n and m

(cellosolves) could be studied. As also shown in Fig. IV.13, parts A and B,

relative sensitivity of ethoxy-carboxylic acids was higher than that of the

corresponding non-ethoxylated carboxylic acids, and increased when either n or

m increased.

A

log

f i

-3

-2

-1

0

0 4 8 12 16n

••

♦♦

♦♦

♦♦

♦♦♦♦

♦♦

m = 0

m = 1

m = 3m = 2

log

f i

B

-3

-2

-1

0

0 1 2 3m

♦♦

♦♦

♦♦

n = 1n = 2

Fig. IV.13. NI MS relative sensitivities of carboxylic and ethoxy-

carboxylic acids versus the number of carbon atoms in the alkyl chain, n,

and at increasing values of the number of EO units, m (A), and vice versa

(B). Relative sensitivities in logarithmic scales, log fi, are given with

reference to the internal standard (TMBA).


168

IV.2.1.3. Oxidation yields of primary non-ethoxylated alcohols and extraction

recoveries of the corresponding carboxylic acids

Recovery of carboxylic acids with short and large chain lengths during the

extraction step, independently from the yield of the previous oxidation step, was

first evaluated. For this purpose, the proposed procedure was applied to solutions

of C3E0A and C14E0A in acetone, and the NI mode spectra were measured. The

abundance of the [M-H]- ions was compared to that obtained by using standard

solutions of the acids in the ethyl acetate-acetone extraction medium. Recoveries

were 100% (duplicated extractions).

Then, in order to study oxidation yields, the proposed procedure was

applied to a series of standard solutions containing increasing amounts of C10E0

in acetone. The concentrations used corresponded to 0, 100, 200 and 400 µg mL-1

in the infused solutions (duplicated points). Using the NI mode, the abundance of

the [M-H]- ions was measured. A regression straight-line with an excellent

linearity (r2 > 0.999, calibration curve A) was obtained. The standard deviation

of the residuals was used to calculate the standard deviation of the slope [Miller,

2000]. Assuming a zero intercept, and in relative terms, this standard deviation

was 1.3% of the slope, which corresponded to a confidence limit of 3.0% (95%

confidence level, two-sided). Using increasing concentrations of the

corresponding carboxylic acid, C10E0A, a linear relationship (r2 > 0.999,

calibration curve B) was also obtained. The ratio of the slopes of the two

calibration curves (as A/B) was 1.016. Thus, the oxidation yield of C10E0 was

not statistically different from 100%.

The influence of the addition rate of the Jones’ reagent was also studied.

For this purpose, aliquots of the C10E0 solution in acetone were oxidized

according to the proposed procedure, but the manual dropwise addition of the

Jones’ reagent was substituted by manual quick addition, and also by slow


169

addition with a syringe pump under stirring during 40 min. The abundance of the

[M-H] - ions, measured in the NI mode, was compared to that obtained using

calibration curve B (expected concentration in the infused solutions, ca. 200 µg

mL-1). Either, dropwise or slow addition of the Jones’ reagent equally led to a

100% yield.

The influence of the reaction temperature during oxidation was also

investigated. Alcohols with a short (C3E0) and a large (C12E0) chain length

were used. A water bath was used to set the initial temperature of the reaction

mixture. Then, the Jones’ reagent was added, and after extraction the abundance

of the [M-H]- ions was measured. The ion abundances did not increase nor

decrease by regulating the initial temperature of the reaction mixture to 25, 35

and 55 ºC.

IV.2.1.4. Influence of water concentration on the oxidation yield

To study the influence of water concentration on the oxidation yield of

non-ethoxylated alcohols, two series of experiments were done. In all cases, a

C10E0 stock solution in acetone was used, and the proposed procedure was

applied, but with the modifications which are next indicated. First, the Jones’

reagent was prepared in the presence of decreasing water concentrations; for this

purpose, water was substituted by increasing concentrations of acetic acid

[Hudliký, 1990; Burke, 1999]. Aliquots of the C10E0 stock solution were further

diluted using acetone, and the proposed procedure was applied; however,

oxidation was performed with the series of Jones’ reagent prepared with

increasing acetic acid concentrations (decreasing water concentrations). Second,

aliquots of the C10E0 stock solution were diluted with acetone-water mixtures

containing increasing amounts of water, instead of using pure acetone. Jones’

reagent prepared in aqueous sulfuric acid, as indicated in the proposed procedure,


170

was added to these solutions. In all cases, the NI spectra were obtained, and

internal standard correction using TMBA was applied.

As shown in Fig. IV.14, the yield was maximal when the reagent was

prepared as indicated in the proposed procedure, and decreased moderately when

water was partially substituted by acetic acid (Fig. IV.14, part A).

40

60

80

100

20 40 60 80

H2O % in the Jones’ reagent

Oxi

datio

n y

ield

, %

A

0 25 50 75 10040

60

80

100

Initial H2O % in the sample solution

B

Oxi

dat

ion

yiel

d,

%

Fig. IV.14. Reaction yield of C10E0 in the presence of different water

concentrations during oxidation. The Jones’ reagent was prepared by

substituting water by increasing concentrations of HAcO (A), and the

analyte was dissolved in acetone-water mixtures with increasing amounts

of water instead of using pure acetone (B).

Oxidation yield also decreased when the Jones’ reagent was added to C10E0

solutions containing increasing amounts of water (Fig. IV.14, part B).

Therefore, in the recommended procedure, industrial samples containing water

(i.e. cosmetics and body care products) were diluted with acetone. In addition,


171

after centrifugation, a low-volume aliquot of the supernatant was further diluted

with acetone before Jones’ reagent was added.

IV.2.1.5. Oxidation yields of ethoxylated alcohols

The oxidation yield of a short-chain ethoxylated alcohol, C2E1, was first

studied. For this purpose, the C2E1-C2E1A pair of standards was used. The

proposed procedure was first applied to a series of solutions containing

increasing C2E1 concentrations, and the abundance of the [M-H]- ions were

measured in the NI mode. As performed above for C10E0, the slope of this

calibration curve was compared with that obtained using increasing C2E1A

concentrations. These two straight-lines were highly linear (r2 > 0.999), but the

slopes differed, indicating an oxidation yield of ca. 65%. As also observed for

C10E0, this yield was not modified by increasing or decreasing the addition rate

of the Jones’ reagent (both sudden manual addition and slow addition with a

syringe pump under stirring during 40 min). The yield was not modified either by

increasing the reaction time to more than 2 hours after addition of the Jones’

reagent (before removing the reagent excess with sodium sulfite). The influence

of the sample temperature before addition of the Jones’ reagent was also studied.

Using a C4E2 solution, a constant 65% yield was obtained at 25, 35 and 55 ºC.

The oxidation yield of fatty alcohols with an increasing degree of

ethoxylation was studied. For this purpose, standards of the C12Em series were

used. Standards of the corresponding ethoxylated fatty acids were not available,

which hindered the comparison of the abundances of the [M-H]- ions obtained in

the NI mode. Instead, abundances of the [M+H]+ ions obtained in the PI mode

were measured. The proposed procedure was applied, and the abundance of the

[M+H] + ion of the remaining non-oxidized FAEs was compared to that of the

corresponding ethoxy-carboxylic acid. As shown in Fig. IV.15, two intense


172

peaks corresponding to the C12E3 - C12E3A pair were observed in the spectrum

obtained after oxidation of C12E3. The peak of the remaining non-oxidized

C12E3 was higher than that of C12E3A; however, taking into account that the

C12E3/C12E3A sensitivity ratio in the PI mode was close to 1.8, an oxidation

yield of ca. 60% was calculated. Two other low intensity peaks, corresponding to

the [M+H]+ ions of the C12E2 - C12E2A pair, were also observed. These two

peaks were attributed to loss of an EO unit during oxidation. From the peak

abundances, this side-reaction amounted to less than 4% of the initial C12E3

concentration. Along the C12Em series, oxidation yield, which was 100% for

C12E0, decreased to ca. 65 and 60% when m = 2 and 4, respectively. The

oligomers with m = 5 and 6 also gave a ca. 60% yield.

300 m/z 350

[C12E2+H]+

0

1

2

3

Ab

un

da

nce

x 1

06

[C12E2A+H]+

[C12E3+H]+

[C12E3A+H]+

Fig. IV.15. PI MS spectrum of C12E3 after oxidation with Jones’ reagent

showing the [M+H]+ peaks of the C12E3 – C12E3A and C12E2 – C12E2A

pairs. Target mass of the ion trap was set at m/z 275 to enhance the

abundances of the diethoxylated species.


173

Finally, ethoxylated alcohols of the CnE1 and CnE2 series were used to

study the influence of n from n = 2 to 18. In all cases, ca. 65% yields were

obtained. In addition to the expected peaks, two additional peaks due to the FAE

with loss of an EO unit, and its corresponding ethoxy-carboxylic acid, were

observed. However, yields for this side reaction were small (4-8% of the initial

amount of the FAE).

IV.2.1.6. Application to industrial and environmental samples

A) Industrial raw materials

The NI mode spectrum of industrial raw material FINDET 10/18 showed the

intense peaks of the oxidized oligomers of the C10Em series, including the non-

ethoxylated alcohol, C10E0 (Fig. IV.16). All these peaks were not observed on

the NI mode spectrum obtained without previous oxidation of the sample (not

shown). Also without oxidation, peaks of the [M+H]+ ions of ethoxylated

alcohols were observed on the PI mode spectrum, but sensitivity was small for m

= 1 and 2, and a peak for C10E0 was not observed (spectrum not shown). Thus,

the proposed procedure is particularly useful for the quick identification of non-

ethoxylated fatty alcohols at low concentrations. However, owing to ion

suppression effects, previous separation by HPLC or CE should be recommended

for quantitative purposes. Quantitative evaluation of mixtures of FAEs by the

proposed procedure is also burdened by bias due to the 4-8% breakdown of the

EO chain during oxidation (with loss of an EO unit), as well as by lack of

available standards of ethoxylated fatty acids, which hinders the determination of

response factors of the oligomers.


174

Abu

nd

ance

x 1

06

1

3

300 500 700m/z

IS

[C1

0E

0A-H

]- [C1

0E

1A-H

]-

[C10

E2A

-H]-

[C1

0E

3A-H

]-

[C10

E4A

-H]-

[C1

0E

5A-H

]-

[C1

0E6A

-H]-

[C1

0E7A

-H]-

[C1

0E

8A-H

]-

[C1

0E9A

-H]-

[C10

E10

A-H

]-

[C10

E11

A-H

]-

[C1

0E

12A

-H]-

[C10

E13

A-H

]-

Fig. IV.16. NI MS spectrum of the industrial surfactant FINDET 10/18

after oxidation with Jones’ reagent. The peaks of the [M-H]- ions of the

oxidized oligomers of the C10Em series are labelled (IS = internal

standard).

B) Body care and cosmetic products

The proposed procedure was also applied to the body care and cosmetic

products of Table IV.3. In the NI mode, all these samples showed the intense

[M-H] - peaks of C16E0A and C18E0A (cetyl and stearic acids), as well as those

of other fatty acids. By applying again the proposed procedure but with addition

of diluted sulfuric acid instead of Jones’ reagent (CrO3 was not added), the peaks

of these fatty acids were absent, or present with much lower abundances. The

spectrum of a varicose vein cream is shown in Fig. IV.17. In this sample, the

abundances of the peaks of C16E0A and C18E0A increased ca. 30 and 10 times,

respectively, upon oxidation with the Jones’ reagent. The procedure was then

applied to the determination of C16E0 and C18E0 in the commercial products of


175

Table IV.3. Solutions of C16E0A and C18E0A were used to construct external

calibration curves (6 duplicated points). To check possible matrix effects,

internal calibration by the standard addition method was also applied; for this

purpose, two duplicated calibration points per sample were performed (with

addition of alcohol standards to the samples before the oxidation step).

0

2

4

200 250

[C16E0H-H]-

[C18E0H-H]-

IS

300m/z

Ab

un

da

nce

x 1

06

Fig. IV.17. NI MS spectrum of a commercial varicose vein cream after

oxidation with Jones’ reagent showing the peaks of the cetyl and stearic

acids resulting from the oxidation of the cetyl and stearic alcohols,

respectively.

As shown in Table IV.3, most samples showed satisfactory agreement between

the alcohol contents found by external and internal calibration. Limits of

detection (LODs) for C16E0 and C18E0 in the varicose vein cream, calculated as

the concentration corresponding to a net signal equal to three times the standard

deviation of the blank, were 0.1 and 0.03%, respectively. However, taken into

account that the extract of this sample was diluted in a 1:40 ratio before infusion


176

in the MS, LODs of 25 and 7.5 µg per gram of sample, respectively, were

calculated.

Table IV.3. Mass percentages of cetyl and stearic alcohols found in several

commercial samples by external and internal (standard addition) calibration (ND =

not detected).

C16E0 (%) C18E0 (%) Sample External Internal External Internal Shampoo 0.71 0.80 ND ND Hair conditioner 0.55 0.35 0.25 0.24 Lip protector stick 0.66 0.69 0.34 0.34 Deodorant stick ND ND 5.0 5.6 Body-care oil 0.10 0.16 0.15 0.15 Varicose-vein cream 3.8 3.3 2.0 2.6

C) Seawater

The presence of saturated and unsaturated fatty alcohols at the µg L-1 level

has been reported in seawater samples taken from coastal and high seas [Parrish,

1992; Tolosa, 2003; Belanger, 2009]. As shown in Fig. IV.18, peaks which could

correspond to linear fatty alcohols with zero, one and two double bonds, and to

phytol (a common diterpenoid), were observed in the spectra of the oxidized

extracts obtained with seawater. These peaks were present with much lower

abundances in the spectrum of the seawater extract which was not oxidized with

the Jones’ reagent. In Fig. IV.18, ratios calculated by dividing the ion

abundances obtained after application of the proposed procedure to the seawater

extract, by those obtained without oxidation with the Jones’ reagent (reference

sample), are indicated between parentheses.


177

Ab

und

anc

e x

106

C12

:2 (

600

)

C16

:0 (

30)

C18

:1 (

10)

C20

:2 (

92)

C22

:0 (

2)

C24

:2 (

10)

C26

:2 (

30)

0

0.5

1.0

200 300 400m/z

1.5

C12

:1 (

140

)C

12:

0 (1

3)

C14

:0 (

8)

C16

:1 (

16)

C18

:0 (

15)

C20

:1 +

phy

tol (

13)

C20

:0 (

4)

C22

:2 (

25)

C2

2:1

(4)

C26

:1 (

12)

Fig. IV.18. NI MS spectrum of a seawater extract after oxidation with

Jones’ reagent. Several peaks could be ascribed to common saturated and

unsaturated fatty acids and to phytol, is indicated (e.g., C18:1 is

octadecenoic acid). Numbers within parentheses are abundance ratios

between the addressed peak in this spectrum and in the spectrum of the

seawater extract not oxidized with the Jones’ reagent.

CHAPTER V

ANIONIC SURFACTANTS

Chapter V. Anionic surfactants

181

V.1. AESs

V.1.1. Determination of FAEs and AESs by anionic exchange separation,

derivatization with a cyclic anhydride and HPLC

FAE and AES are two important surfactant classes, widely used in

cleaners and body care products [Fiedler, 1989]. FAE are industrially obtained as

complex mixtures of oligomers with the following structure (shortened below as

CnEm):

CH3(CH2)n–1(OCH2CH2)mOH

where n is the number of carbon atoms in the alkyl moiety of the molecule, and

m is the number of EO groups. FAE mixtures obtained from vegetal oils contain

linear hydrocarbon chains with even values of n, whereas both linear and

branched chains, with even and odd values of n, can be found in FAE obtained

from mineral oils [Sparham, 2005; Marcomini, 1996].

On the other hand, AES are obtained by esterification of FAE with either

sulfur trioxide or chlorosulfonic acid. Then, FAE and AES have essentially the

same molecular structure, with a hydrocarbon chain attached to an EO chain, but

AES oligomers end with a sulfate group in substitution of the –OH group of FAE

oligomers [Strain, 1959; Suter, 1944; Arthur, 1991]:

Na+CH3(CH2)n–1(OCH2CH2)mOSO3-

Accordingly, AES oligomers are shortened below as CnEmS. Important

characteristics of both FAE and AES, including viscosity of their aqueous

solutions, detergency, foam formation and skin compatibility, as well as their

environmental impact, depend on the variable distributions of both the alkyl and

EO chains [Marcomini, 1996; Arthur, 1991; Tadros, 2005; Rudewicz, 1986; Eadsforth,

2006; Belanger, 2006; Van Compernolle, 2006; Ribosa, 2007; Jurado, 2007]. Both the

hydrocarbon cut (range of n for the predominant hydrocarbon series) and m


182

(average number of EO units) are important in industrial quality control. Thus,

methods for their characterization and determination are required; however,

owing to the complexity of the sample matrices, lack of chromophore, and wide

ranges of polarity and volatility of the oligomers, the analysis of FAE and AES,

which are usually found in complex mixtures with other surfactant classes, is not

an easy task. In addition, the unavailability of commercial standards constitutes

an added difficulty of AES analysis.

In determination of FAE, the low volatility and thermal instability of long

EO chains limit the use of GC to the oligomers with m < 4 [Rudewicz, 1986;

Crescenzi, 1995], and owing to the high volatility of the oligomers with short EO

chains, the employ of HPLC with ELSD provides biased distributions

[Miszkiewicz, 1996-A; Bernabé-Zafón, 2006]. In addition, the PI MS response factors

for underivatized FAE oligomers decrease ca. two orders of magnitude when m

decreases from 4 to 1 [Sparham, 2005; Rudewicz, 1986; Crescenzi, 1995; Dunphy,

2001]. Further, non-ethoxylated alcohols (m = 0) are not detected in a mass

spectrometer [Sparham, 2005; Rudewicz, 1986; Crescenzi, 1995; Bernabé-Zafón, 2006;

Dunphy, 2001; Sherrard, 1994]. Underivatized FAE can be also characterized and

determined using isocratic elution and a refractive index detector [Trathnigg,

1993; Trathnigg, 1994; Trathnigg, 2004; Trathnigg, 2005], but selectivity is poor and

the limits of detection are large. Derivatization procedures designed to increase

volatility of FAE oligomers, followed by GC analysis have been proposed

[Marcomini, 1996; Kiewiet, 1996; Hübner, 2007]. Several derivatization procedures

for FAE, addressed to add a chromophore or a charge to the oligomers, followed

by HPLC [Marcomini, 1996; Dunphy, 2001; Hoffman, 2004-B; Sun, 1997; Zanette,

1996; Lemr, 2003; Desbène, 2005] or CE [Sparham, 2005; Bernabé-Zafón, 2006;

Dunphy, 2001; Lemr, 2003; Desbène, 2005; Wallingford, 1996; Heinig, 1998], have

been also described. FAE derivatives have been separated by either NP- or RP-


183

HPLC using UV-Vis [Marcomini, 1996; Kiewiet, 1996; Zanette, 1996; Bachus, 2003;

Micó-Tormos, 2008-A; Micó-Tormos, 2008-B; Micó-Tormos, 2009] or MS detection

[Crescenzi, 1995; Bernabé-Zafón, 2006; Levine, 2005; Jandera, 1998; Krogh, 2002].

On the other hand, nonspecific determination of AES and other anionic

surfactants can be jointly performed by the methylene blue active substance

method [Llenado, 1983]. Non-ethoxylated alkyl sulfates have been studied using

ion pair chromatography with indirect UV detection [Boiani, 1987; Shamsi, 1995],

ionic chromatography with conductimetric detection [Pan, 1995; Nair, 1998] and

HPLC with post-column ion-pair formation followed by membrane phase

separation and fluorimetry [Smedes, 1982-B]. Also, conversion of AES to the

corresponding alkyl bromides followed by GC-FID [Neubecker, 1985], as well as

HPLC coupled to ESI-MS [Popenoe, 1994; Bruno, 2002; Lara-Martín, 2005], have

been applied to the determination of AES in waters, sewage sludge and marine

sediments.

In former works of research group, we have developed procedures for the

RP-HPLC-UV determination of FAE previous derivatization with a cyclic

anhydride [Micó-Tormos, 2008-A; Micó-Tormos, 2008-B; Micó-Tormos, 2009; Micó-

Tormos, 2010]. However, we have observed that cyclic anhydrides also derivatize

AES to yield exactly the same derivatives as FAE, i.e. the hemiesters of the

alkyl- or alkyl-ethoxy residues. Thus, the peaks corresponding to the sum of both

FAE and AES oligomers are obtained on the chromatograms if the two surfactant

classes are present in the samples. Therefore, in this work, a procedure for the

separation of these two surfactant classes, followed by the independent

derivatization of each class with a cyclic aromatic anhydride, and RP-HPLC-UV

determination of the derivatized oligomers, was developed. Separation of the two

surfactant classes was achieved by SPE on a SAX cartridge. Then, using either

phthalic or diphenic anhydride, FAE are esterified and AES are transesterified.


184

Separation of the derivatized oligomers was achieved by RP-HPLC using

gradient elution with ACN/ water in the presence of 0.1% acetic acid. The

proposed method was applied to the analysis of FAE and AES in commercial

products (liquid cleaners) and environmental samples (seawater extracts).

V.1.1.1. Derivatization and HPLC separation of the derivatives

As shown in Fig. V.I, an industrial mixture of AES (LES) was

quantitatively derivatized at 105 ºC in about 70 and 50 min using phthalic and

diphenic anhydrides, respectively. Similar results were reported for the

esterification of FAE [Micó-Tormos, 2008-B; Micó-Tormos, 2009]. Thus, to assure

derivatization of the two surfactant classes, 90 min was selected. Chromatograms

of Dehydol LT-7 and LES, obtained by previous derivatization with phthalic

anhydride, are shown in Fig. V.2.

Re

lativ

esu

mof

pea

ka

reas

0

40

80

0 40 80

Reaction time (min)

Formation ofdiphenates

Formation ofphthalates

100

60

20

Fig. V.1. Relative sum of the chromatographic peak areas of the derivatives

of all the oligomers given by an industrial AES (LES) sample versus

reaction time using phthalic (rhombus and dashed line) and diphenic

anhydrides (squares and dotted line). Each point represents an independent

derivatization performed at 105 ºC in 1,4-dioxane.


185

Both chromatograms showed the successive hydrocarbon series at increasing

values of n, from n = 10 to 18. Hydrocarbon series having exclusively even

values of n were observed with Dehydol LT-7, but significant amounts of the n =

13 and 15 odd series were also present in LES. The large difference between the

peak profiles of the same hydrocarbon series for Dehydol LT-7 and LES is due to

the different average EO number, namely m = 7 for Dehydol LT-7 and m = 3

for LES. The elution order of the oligomers within the series, which is indicated

in the Fig. V.2 for the n = 12 series, was established with UV-Vis detection, by

injecting standards of derivatized oligomers, and was also confirmed by HPLC-

MS using extracted ion chromatograms (EICs, not shown).

0

100

200

300

Ab

sorb

an

cea

t 230

nm

(mA

U)

An = 12

n = 14n = 16 n = 18

n = 12

C12E2C12E3

C12E1+

C12E4

C12E7

C12E9C12E8

C12E6

C12E0+

C12E5

10 20 30 400

100

200

300

Time (min)

B

n = 18n = 16n = 15

n = 14

n = 13C12E2S

C12E3S

C12E1S+

C12E4S

C12E7S

C12E9S

C12E8S

C12E6S

C12E0S+

C12E5S

Fig. V.2. Chromatograms obtained after derivatization of Dehydol LT-7

(A) and LES (B) with phthalic anhydride. In both cases, ca. 40 mg were

derivatized and final volume before injection was 12 mL. Elution with a

linear gradient from 50 to 100% ACN in 50 min at 25ºC. The insets show

peak identifications for the n = 12 series.


186

Except for m = 0 and 1, the oligomers within the series eluted by following the

order of decreasing m. The consecutive pairs of oligomers were also fairly well

resolved; however, the peaks of the oligomers with m = 1 and 0 overlapped with

other oligomers within their respective hydrocarbon series. At 25 ºC and for the n

= 12 and 14 series, overlapping of the pairs m = 1 and 4, and m = 0 and 5, was

produced. Reversion of the elution order for m = 1 and 0 within the hydrocarbon

series has been explained as due to the rigidity of the short hydrophilic moiety of

these oligomers of the EO chain, which hinders intramolecular solvation, thus

making their hydrophobicity to decrease with respect to the oligomers with m ≥ 2

[Micó-Tormos, 2008-A; Micó-Tormos, 2008-B; Micó-Tormos, 2009; Micó-Tormos, 2010].

V.1.1.2. Optimization of the SAX separation of the surfactant classes

Since derivatization of both FAE and AES leads to the same derivatives, a

previous separation of both surfactant classes was implemented. For this purpose,

the method proposed by Fendinger et al. for alkylsulfate analysis in water was

modified [Fendinger, 1992]. The SAX separation procedure was optimized to

achieve quantitative isolation of the two surfactant classes, including both

hydrophilic (low n and high m values) and hydrophobic (high n and low m

values) oligomers. Conditioning of both sample and SAX cartridge with 80:20

MeOH/H2O led to the coelution of part of the AES jointly with the FAE. Thus,

according to the optimized scheme of Fig. III.1 and section III.1.3.4,

conditioning was performed with 50:50 MeOH/H2O. In this medium, partial

elution of FAE, but without coelution of AES oligomers, was achieved.

Solubilization of the most hydrophobic oligomers, together with disruption of

FAE-AES mixed micelles, was also procured with 50% MeOH. At this point of

the procedure, an increase of the MeOH concentration to 80% to complete FAE

elution led to the partial coelution of AES. Coelution was avoided by washing


187

the cartridge with additional portions of 50% MeOH. In this way, residual

cations from the sample (mostly, Na+) were washed away, thus strongly fixing

AES on the SAX cartridge before increasing the hydrophobicity of the medium.

Experiments performed with LES in 50% MeOH showed the absence of AES

oligomers in the chromatograms obtained by increasing MeOH concentration to

80% after washing the cartridge first with more 50% MeOH.

Ab

sorb

ance

at 2

30 n

m(m

AU

)

Time (min)

0

100

200

300

A

0

20

40

10 20 30 40

B

Fig. V.3. Chromatograms of Dehydol LT-7 derivatized with phthalic

anhydride: (A) FAE oligomers eluted with 50:50 MeOH:H2O (combined

fractions 1 and 2 of Fig. 1); (B) FAE oligomers eluted with 80:20

MeOH:H2O (fraction 3 of Fig. III.1). Chromatographic conditions as in

Fig. V.2; other details as indicated in section III.1.3.3.

As shown in Fig. V.3, application of the optimized procedure to a Dehydol LT-7

solution led to the elution of an 82% and an 18% FAE with 50% (fractions 1 + 2

of Fig. III.1) and 80% MeOH (fraction 3 of Fig. III.1), respectively. Further, in

comparison to the expected oligomer distribution for Dehydol LT-7, the 80%


188

MeOH fraction showed a higher proportion of the hydrophobic oligomers,

including both oligomers with large values of n, and oligomers with low values

of m within the series. A residual amount of 0.4% of the total FAE was obtained

after washing the cartridges with two additional 4-mL volumes of 80:20

MeOH/H2O.

Next, AES were eluted using HCl solutions in MeOH as a means to

achieve both high concentrations of Cl- and a highly hydrophobic medium.

According to the chromatograms shown in Fig. V.4, which were obtained using

LES, a 62% of the AES oligomers was eluted with 80:20 MeOH:HCl (Fig. V.4,

part A, fraction 4 of Fig. III.1). An additional 35%, containing a higher

proportion of hydrophobic oligomers than the former fraction, was eluted by

increasing MeOH to 95% (Fig. V.4, part B, fraction 5 of Fig. III.1). Total

elution of LES oligomers was checked by washing the cartridge with two

additional 4-mL volumes of both 80:20 and 95:5 MeOH:HCl; in this way, a

residual 3% AES was recovered (chromatogram not shown). As indicated in the

optimized procedure (Fig. III.1 and section III.1.3.4), the combined 4 + 5

fractions containing the AES were neutralized with concentrated ammonia to

prevent the release of acid fumes during solvent evaporation. Finally, the isolated

FAE and AES fractions were derivatized and injected. Application of this

procedure to mixtures of Dehydol LT-7 and LES (ca. 20 mg each) according to

the scheme of Fig. III.1, gave rise to chromatograms of the FAE and AES

fractions closely resembling the chromatograms given in Fig. V.2, which were

obtained by directly derivatizing and injecting Dehydol LT-7 and LES solutions.

In addition, the optimized procedure, including the SAX separation into

two fractions, was also independently applied to Dehydol LT-7 and LES

solutions. For Dehydol LT-7 (ca. 40 mg), the chromatogram obtained from the

combined fractions 1 + 2 + 3 (see Fig. III.1) was closely similar to that observed


189

in Fig. V.2, part A, whereas the chromatogram obtained with the combined

fractions 4 + 5 showed no significant peaks. Therefore, FAE were quantitatively

retained in the combined fractions 1 + 2 + 3.

Time (min)

0

50

100

0

20

20 30 40

Abs

orb

ance

at 2

30

nm

(mA

U)

A

B

Fig. V.4. Chromatograms of LES derivatized with phthalic anhydride: (A)

AES oligomers eluted with 80:20 MeOH:HCl (fraction 4 of Fig. III.1); (B)

AES oligomers eluted with 95:5 MeOH:HCl (fraction 5 of Fig. III.1).

Chromatographic conditions as in Fig. V.2; other details as indicated in

section III.1.3.3.

Similarly, using LES, the chromatogram obtained for the combined fractions 4 +

5 was closely similar to that observed in Fig. V.2, part B. On the other hand, the

chromatogram obtained with the combined fractions 1 + 2 + 3 showed a series of

small peaks which followed the same pattern as that observed in Fig. V.2, part

B, but with much smaller peak areas. This later chromatogram was attributed to

the FAE impurities which are always present in industrial AES, due to the non-

quantitative sulfatation of FAE during AES manufacture. The total peak area


190

obtained from fractions 4 + 5 of LES, divided by the total peak area obtained

from fractions 1 + 2 + 3 indicated a molar percentage of ca. 1.2 % FAE in the

LES sample.

V.1.1.3. Calibration studies

Standard solutions of C8E0, C12E0, C8E0S and C12E0S were

independently used to construct independent calibration curves for FAE and

AES. For each standard, the proposed derivatization procedure was applied to

series of solutions containing increasing concentrations, ranging from 0.06 up to

1.7 mM in the injected solutions (six solutions per standard). Plotting the areas,

an excellent linearity was obtained for all the standards (r2 > 0.999). Further, the

slopes of the calibration plots obtained with the four standards did not differ

significantly from each other, i.e. the maximal slope difference was 1%.

Therefore, sensitivity was the same for non-ethoxylated alcohols and

alkylsulphates, independently from the length of the alkyl chain. The similarity

of the slopes indicated both a high degree of derivatization, presumably close to

100%, for the two surfactant classes. Further, since AES are quantitatively

converted to the same derivatives as those obtained with FAE, then, the UV-Vis

response factors of the FAE oligomers, which were established in previous work

for the derivatives obtained with the phthalic [Micó-Tormos, 2008-B] and diphenic

anhydrides [Micó-Tormos, 2009], should be also valid for the corresponding

derivatized AES oligomers. This is of practical interest, because standards of

non-ethoxylated fatty alcohols are widely available, whereas non-ethoxylated

alkylsulfates are rare and expensive. Further, FAE oligomers with m > 0 are

commercially available, which does not occur with the corresponding AES

oligomers. Thus, in sections V.1.4 and V.1.5, the unexpensive and widely

available dodecyl alcohol (C12E0) was exclusively used as a standard to evaluate


191

without bias total surfactant class concentrations, hydrocarbon series and

distribution and average EO numbers (m ) of the complex mixtures of FAE and

AES oligomers found in industrial and environmental samples.

For this purpose, six duplicated calibration points, up to 1.7 mM C12E0

were obtained using the peak areas. Then, the proposed procedure was applied to

the samples of Table V.1. A pair of chromatograms per sample, corresponding to

the FAE and AES fractions, was obtained in duplicate, and all the peak areas

were measured.

Table V.1. Declared and found composition for industrial samples.

a In mass percentages; the average EO number, m number found for each AES

sample is indicated between parentheses.

Overlapping of the m = 0 and 1 peaks with the m = 5 and 4 peaks, respectively,

within their respective hydrocarbon series, made necessary to establish an

indirect way of estimating the individual areas corresponding to these oligomers.

To estimate first the area of the m = 5 and m = 4 peaks by interpolation is

straightforward and sufficiently accurate for most applications. Interpolation is

possible at 25 ºC due to the perfect overlapping of the peaks by pairs of

oligomers (m = 0 with m = 5, and m = 1 with m = 4) [Micó-Tormos, 2008-B]. As

shown in Fig. V.5, the peak areas of the m = 5 and 4 oligomers were estimated

by non-linear interpolation of the peak areas of the 2 ≤ m ≤ 3 and m ≥ 6

oligomers of their respective hydrocarbon series. Thus, the peak areas of the


192

Dehydol LT-7 (m = 7) and LES (m = 3) fitted well to the cubic equation, and to

exponential equations of the form A=be-am, respectively.

Number of EOs

0

2 4 6 8

Rel

ativ

ear

ea

10 12

1

□ □

□□

◊

◊

◊◊

◊ ◊ ◊

◊◊ ◊

◊

◊

◊

◊

◊◊

◊

◊

n = 12mFAE, = 7

n = 14

n = 14

♦

■

♦

■

■■

♦

♦

♦ ♦ ♦♦♦

♦♦

n = 12mAES, = 3

Fig. V.5. Estimation of the uncorrected peak areas of the m = 4 and 5

oligomers of the n = 12 and 14 series in: Dehydol LT-7 (empty symbols,

solid lines by cubic interpolation); LES (full symbols, dashed lines by

exponential interpolation). Experimental (rhombus) and interpolated peak

areas (squares).

For simplicity, when the peak areas of the m = 4 and 5 oligomers of the n = 12

and 14 series of Dehydol LT-7 were estimated, the contribution of the oligomers

with m > 13 of the n = 14 and 16 series (see Fig. V.2), respectively, was

neglected. Then, the peak areas of the m = 0 and 1 oligomers were obtained by

difference. All the peak areas were next divided by the tabulated response factors

of the respective oligomers [Micó-Tormos, 2008-B; Micó-Tormos, 2009], and the

molar concentrations of the oligomers were obtained by dividing the corrected

peak areas by the slope of the C12E0 calibration curve. Then, the average EO

number, m , was calculated from the molar distribution of the oligomers. Total


193

mass concentrations of the surfactant classes, and the mass distribution of

hydrocarbon series, were finally calculated by taking into account the molar

masses of the oligomers and the dilution factor in the injected solutions.

V.1.1.4. Application to industrial raw materials and commercial products

As indicated in Table V.1, a 70% generic LES and liquid laundry

products containing mixtures of several surfactant classes were analyzed. The

common anionic surfactants SAS and LAS were studied as potential

interferences. These anionic surfactants should be retained together with the AES

in the SAX cartridge; however, application of the procedure to a SAS sample

gave a chromatogram with no additional peaks with respect to that of the reagent

blank. Also, a 1:1 mixture of LES and a SAS sample (ca. 20 mg each) gave rise

to a chromatogram which was undistinguishable from that of LES. Then, SAS

showed no reaction with the anhydrides and did not cause interference either. On

the other hand, LAS are aromatic surfactants which absorb in UV-Vis. The

HPLC separation of a LAS sample in the conditions used to separate FAE and

AES derivatives lead to a series of large and wide bands, close to the dead

volume, on the chromatogram of the AES fraction. Further, this pattern was not

modified by application of the derivatization procedure to a LAS sample; then,

LAS did not react either with phthalic anhydride. Application of the procedure to

a mixture of LAS and LES gave rise to a chromatogram showing the bands of

LAS followed by the expected peak pattern of the derivatives of the LES

oligomers; however, the absorbance due to the LAS bands decreased largely

before the elution time corresponding to the AES hydrocarbon series with n = 8

(chromatogram not shown). Therefore, LAS did not cause interference either in

the evaluation of the AES series of industrial interest (n ≥ 8). The determination

of residual FAE in industrial AES is important to control both the sulfation


194

process and the quality of the final product. As indicated in Table V.1,

application of the proposed procedure to the 70% generic LES sample showed a

65% AES and a residual 1.2% FAE. According to the data given in Table V.1,

the proposed procedure is also useful for the characterization and determination

of both FAE and AES in commercial cleaners.

V.1.1.5. Seawater analysis

Application of the proposed procedure using diphenic anhydride to

seawater extracts led to the chromatograms shown in Fig. V.6.

0

20

40

22 24 26

Time (min)

0

2

4

6

0

20

30 32 34

Time (min)

0

2

4

0

4

8

12

Abs

orba

nce(

mA

U)

22 24 260

1

2

3

Inte

nsity

×10

5

Time (min)

AFAEn = 12

BAESn = 12

CAESn = 14

4

05

4

3

0

2

15

4

3

0

21

Fig. V.6. Chromatograms of a seawater extract obtained by derivatization

with diphenic anhydride and using UV-Vis (upper parts) and MS detection

(EICs, lower parts): (A) FAE, n = 12 series; (B) AES, n = 12 series; (C)

AES, n = 14 series. The numbers at the peaks are m values. Elution

conditions: linear gradient from 60 to 90% ACN in 50 min at 25ºC.

Using both UV-Vis and MS detection, the seawater samples showed measurable

amounts of several FAE oligomers of the n = 12 series, and several AES


195

oligomers of the n = 12 and n = 14 series. According to the C12E0 calibration

curve, 0.25, 2.3 and 0.99 µg L-1 were found in seawater for C12E0, C12E0S and

C14E0S, respectively (calculated as 1500 times less than in the injected solutions).

Then, the proposed method was capable of distinguishing the oligomers of the two

surfactant classes in the seawater, AES being present at higher concentrations than

FAE. This could be due to the faster biodegradation of FAE in comparison to

AES. This also indicates that previously reported data for FAE in environmental

samples, obtained by methods based on derivatization with anhydrides, actually

informed about the sum of FAE and AES. Due to the labitity of the ester bond of

AES, the same problem could bias the FAE concentrations reported by using other

derivatization reagents. Therefore, where appropriate, the reported data should be

revised.

CHAPTER VI

SYNTHETIC POLYMERS

Chapter VI. Synthetic polymers

199

VI.1. PVP-NO

VI.1.1. Characterization of PVP-NO by FSCE and MEKC

Several water-soluble polymers capable of partially inhibiting the

unwanted dye transfer from colored to white fabrics are used as additives in

laundry products [Bertleff, 1998; Oakes, 2003]. These polymers, which are called

DTIs, act as dye scavengers, keeping the washed-off dyestuffs in solution, thus

helping in the prevention of redeposition on the fabrics. For years, PVP and their

copolymers have been mainly used; however, the dye scavenger efficiency of

these polymers is reduced in the presence of anionic surfactants [Oakes, 2003]. For

this reason, new generations of DTI, with superior complexing properties and a

higher tolerance to anionic surfactants, have begun to be employed. A relatively

common DTI of the new generation is PVP-NO (see structure in Fig.

VI.1).Molecular masses between 9 and 36 kDa, which correspond to polymer

chains constituted by ca. 75 and 300 monomers, respectively, are found in

different types of commercial PVP-NO for laundry [Oakes, 2003; Household

Industrial and Institutional Cleaning, 2006].

In spite of the use of increasing amounts of polymers in laundry and other

applications, analytical methodologies for quality control of these compounds

and for the evaluation of their environmental impact have been scarcely reported.

In addition, the study of the interaction of polymers with surfactants in aqueous

solution is important for both fundamental research and industrial application. In

this work, the migration characteristics of PVP-NO in both FSCE and MEKC

have been studied. The determination of the polymer in commercial additives for

laundry is also demonstrated.

CE has been widely applied to the separation of biopolymers and to the

characterization and determination of synthetic polymers [Gallardo, 1999; Cottet,


200

2005]. Mainly, FSCE and CGE have been employed to separate polyelectrolytes

(polymers with either positive or negative charges) and polyampholytes

(polymers with both positive and negative charges), and MEKC has been used to

separate non-charged polymers [Gallardo, 1999]. The application of FSCE, CGE

and MEKC to the analysis of synthetic polymers has been reviewed [Cottet, 2005].

Both FSCE and MEKC can provide useful information about the behavior of

polymers in solution, as well as quantitative information [Bohrisch, 2000].Using

MEKC, Gallardo et al. [Gallardo, 1999] were able to separate two different

components of a non-ionic copolymer, i.e. a fraction rich in methacrylate and

another one rich in vinylpyrrolidone. MEKC has been also used to obtain

information about the synthesis progress, nature and composition of ionic

copolymers [Aguilar, 2002]. On the other hand, in CGE, molecular mass

discrimination of ionic polymers is achieved by sieving through a BGE which

contains a non-ionic polymer, such as a PEG [Grosche, 2000], a cellulose

derivative, dextran or other polysaccharides [Bohrisch, 2000; Clos, 1998;

Starkweather, 2000; Welch, 2001].

In FSCE, and for short-chain polyelectrolytes, the electrophoretic mobility

is a function of the chain length. Thus, the mobility increases as more charged

monomers are added to the chain; however, the mobility reaches a maximum and

begins to decrease when the polyelectrolyte changes from the rod-like to the coil

conformation. Finally, for longer polyelectrolytes the charge-to-mass ratio

become constant, and the polymer migrates with the so-called free draining

mobility [Cottet, 2000]. Therefore, over a given chain length, and independently of

the chain length range, a polyelectrolyte gives a single peak in FSCE [Bohrisch,

2000; Grosche, 2000]. However, due to additional effects, some polymers can

actually give two or more signals at different migration times rather than a single

peak.


201

Thus, copolymers composed by a long polyanionic chain bound to a short

hydrophobic chain have shown to form micelles in aqueous solutions [Cottet,

2001]. Using FSCE, two peaks, which were attributed to the very slow rate of

exchange between the free and aggregated or micellized states of the polymer in

comparison to the time scale of electrophoresis, were observed. The free chains

of the polymer (the unimers) exhibited a larger mobility (in absolute values) than

the micellized polymer. Further, the peak of the micellized polymer was broader

than that of the free polymer, which was attributed to scatter in the aggregation

numbers.

Using FSCE and a PVP-NO/ maleic acid anionic copolymer, Györffy et

al. [Györffy, 1998] also found a narrow peak followed by a wider one. The

presence of two components in the polymer was proposed, but the possible

nature of the components was no further discussed. Using both SEC and FSCE,

Štěpánek et al. [Štěpánek, 2001] have shown that some copolymers form micelles

in solution, and that the micelles coexist in a mobile equilibrium with the

unimers. Further, the unimer-micelle equilibrium was shown to be kinetically

frozen in aqueous media, the micelles behaving as independent nanoparticles.

In this work, a narrow peak was obtained for PVP-NO solutions using

both FSCE and MEKC; however, at least an additional broad band was also

present in most electropherograms. The nature of the signals obtained is

discussed at the sight of both the studies reported in the literature and the new

results. In addition, low-molecular-mass zwitterions, including trimethylglycine

(betaine) and sarcosine, have been used for a long time to reduce adsorption in

the FSCE separation of proteins [Bushey, 1989]; however, betaine and sarcosine

have carboxylate groups, which hinders their application below pH 5–6. Thus, to

separate proteins in more acidic media (pH 2–5), PEA has been used [Chen, 1992].


202

In this work, PEA is used to reduce adsorption of PVP-NO in phosphate buffers

of acidic pH.

VI.1.1.1. FSCE studies in the absence and presence of PEA

Separation of PVP-NO was first tried in the absence of PEA. As shown in

Fig. VI.1, using positive polarity and an acid BGE (10 mM HAcO, pH 4), a large

peak located after the EOF marker peak was observed. Two narrow peaks plus a

broader band in the middle were observed at pH 7 (10 mM NH4AcO)

(electropherograms not shown). All the peaks and band at both pH 4 and 7

showed the spectrum of the polymer (see the insets in Fig. VI.1).

EOF

0 2 4 6 8 10Time (min)

0

20

40

Ab

sorb

ance

at 2

14

nm

(mA

U)

Ab

s. (

mA

U)

0

20

40

200 300 400

0

4

8

λ (nm)

O-

N+

CH2 - CH

n

Fig. VI.1. Electropherograms of an EOF marker (mesityl oxide) and PVP-

NO (2000 µg/mL) obtained using positive polarity and a BGE containing

10 mM HAcO (pH 4). The insets show the chemical structure of PVP-NO,

and the UV spectra at both the peak maximum and at the baseline location

indicated by an arrow.

Taking into account the large molecular masses of this polymer (9–17 kDa), and

its nominally nonionic nature, a single peak at the EOF migration time was

actually expected. However, as discussed below in Section VI.1.1.2, the


203

electropherograms and associated spectra indicated the presence of at least two

PVP-NO components or forms in the solutions, these forms also exhibiting non-

zero net electrophoretic mobilitites.

The reproducibility of the migration time and area of the PVP-NO peak at

pH 4 was 1.8 and 7.2%, respectively, and similar values were obtained for the

peaks and band at pH 7 (n = 5). However, as revealed by recording the UV

spectra along the baseline after the PVP-NO peaks, a drawback was the presence

of severe peak tailing due to adsorption (see the insets in Fig. VI.1). Then, FSCE

in the presence of large concentrations of PEA was tried.

The program SPARC [Hilal, 1995] output the following pKa values for the

ionization of PEA: 1.07, 5.75 and 8.91; thus, the PEA species without a net

charge predominates, at least on a 9:1 basis, within the 2.07–4.75 pH range.

Therefore, a BGE containing 20 mM H3PO4 (pH 2.2) was used to investigate the

effect of the PEA concentration on the migration behavior of PVP-NO and the

EOF. As shown in Fig. VI.2, using this BGE in the presence of increasing PEA

concentrations, PVP-NO gave a large narrow peak (after an initial small peak)

within the anionic migration region. A broader band at the beginning of the

cationic migration region (immediately after the peak of the EOF marker) was

also observed. Both the large narrow peak and the band exhibited the spectrum of

the polymer. Except when otherwise indicated, adsorption along the baseline

after the peak locations was not detected by using 150 mM or higher PEA

concentrations.

Contrary to what occurred in Fig. VI.1, negative polarity was required in

Fig. VI.2 to observe the PVP-NO peaks. As revealed by using acetone as a

marker, the EOF was reversed in the presence of large PEA concentrations. The

negative EOF could be due to the formation of esters between the phosphate

groups of PEA and the silanols. This would lead to the predominance of the


204

positively charged amino groups of PEA covering the capillary walls, thus

reversing the EOF.

Time (min)

Abs

orba

nce

at 2

14

nm(m

AU

)

0 4 8 12

0

20

40

C

A

B

Fig. VI.2. Electropherograms of 1000 µg/mL PVP-NO, obtained using

negative polarity and a BGE containing 20 mM H3PO4 (pH 2.2) and the

following PEA concentrations: 150 (A), 250 (B) and 350 mM (C). The

arrow shows the location of the peak of the EOF marker (acetone).

The electroosmotic mobility increased (in absolute values) rapidly up to 150 mM

PEA, reaching a plateau between 225–350 mM PEA (triplicate points, not

shown). The net electrophoretic mobility of PVP-NO (according to the large

narrow peak) progressively increased (in absolute values) when the PEA

concentration was increased from 150 to 200 mM. At PEA concentrations higher

than 225 mM and up to 300 mM, PVP-NO showed an almost constant mobility.

Baseline disturbances were produced with PEA concentrations over 300 mM;

accordingly, further studies were made using 250 mM PEA. The contribution of

PEA to the capillary current was negligible.


205

Then, the influence of pH in the presence of 250 mM PEA was studied.

First, H3PO4 (pH 2.2) was substituted by NaH2PO4 (pH 3.0). The net mobility of

the large PVP-NO peak increased, which suggested an intensification of the

anionic character of the polymer. As shown by comparing the electropherograms

of Fig. VI.2, part B and Fig. VI.3, the intensity of the broad band near the EOF

migration time also increased at rising pHs, and it was partially resolved in

several bands. Some of these bands were clearly located within the cationic

migration region.

Both the migration time and area of the large narrow peak of PVP-NO

were highly reproducible (0.3 and 2.4%, respectively). On the contrary, as also

shown in Fig. VI.3, along successive replicated injections on the same capillary

the broad band showed a progressive shifting towards shorter migration times.

As discussed below in Section VI.1.1.2, the large narrow peak and the broader

band were attributed to two forms of PVP-NO in solution. The progressive

shifting of the broad band along successive injections could be due to residual

adsorption of the corresponding form of the polymer. In fact, adsorption was not

observed in Fig. VI.3, parts A and B, but the spectrum of the polymer was

observed at migration times longer than that of the band in Fig. VI.3, parts C to

E. Significant differences regarding pH 3.0 were not observed at pH 4.3

(obtained using Na2HPO4). The concentration of NaH2PO4 (pH 3.0) was also

varied within the 5–40 mM range; however, significant differences regarding 20

mM were not observed either.

Significant variations of the shapes of the peak and band were not

observed at increasing capillary temperatures, from 25 to 45ºC

(electropherograms not shown); however, the large narrow peak appeared at

slightly shorter migration times. Thus, the net electrophoretic mobility of this


206

peak varied from -17.6 to -18.2 and -19.7 (in 109 m2·s–1·V–1) when the capillary

temperature was increased from 25 to 35 and 45ºC, respectively.

Time (min)

Ab

sorb

an

cea

t 276

nm

(mA

U)

0 4 8 12 16

0

40

80

120

160

200A

B

C

D

E


negative polarity and a BGE containing 250 mM PEA and 20 mM

NaH2PO4 (pH 3.0). From (A) to (E), successive replicated injections on the

same capillary. The arrow shows the location of the peak of the EOF

marker (acetone).

VI.1.1.2. Discussion on the results obtained by FSCE

PVP-NO has large molecular masses and does not contain ionizable

groups, thus, a single narrow peak at the EOF migration time should be expected

using FSCE. Instead of this, a peak with a well-defined anionic behavior was

observed in Figs. VI.1-VI.3, and at least an additional broad band with a weak

cationic behavior was observed in Figs. VI.2 and VI.3. As next discussed, and as


207

supported by other reports from literature, the anionic character of PVP-NO can

be explained by the separation of charges along the N-O bond, and the

subsequent formation of a ionizable complex with water. A possible explanation

for the additional broad band is the presence of a micellized form of the polymer.

The nitrogen and oxygen atoms of pyridinium oxides exhibit a remarkable

separation of the respective positive and negative charges [Ochiai, 1953]. This

charge separation has been also demonstrated in PVP-NO [Okamoto, 1998].

According to viscosity and light scattering measurements in solution, PVP-NO

has been shown to behave like a polyelectrolyte, rather than as a noncharged

polymer [Okamoto, 1998; Lee, 1996]. This behavior has been attributed to the

presence of strong interparticle forces, which result from the charge separation

across the N-O bond [Lee, 1996]. In addition, PVP-NO has been observed to

exhibit a remarkable electrodonating character, which has been explained by

means of resonant structures [Yamamoto, 1996]. Further, PVP-NO solutions in

water have a non-zero electrical conductivity (2.8·10–7–3.4·10–6 S/cm), which

contrasts with the electrically insulating properties of the corresponding non-

oxidated poly(4-vinylpyridine) (<10–14 S/cm) [Yamamoto, 1996]. Finally, purified

PVP-NO fractions gave solutions with pHs as low as 3.4–4.5 when solved in

water, which was attributed to the formation and subsequent ionization of a PVP-

NO/water complex [Okamoto, 1998].

The formation and subsequent ionization of a PVP-NO/water complex

fully agrees with the net anionic electrophoretic mobility of the large narrow

PVP-NO peak observed in this work. Further, the acidity of some N-O bonds

along the polymer chain can be enhanced by the presence of neighboring N-O

bonds, as occurs with polycarboxylic acids [Györffy, 1998], which would lead to a

range of pKa values along the polymer. This would also explain the increase of


208

the net anionic mobility showed by this PVP-NO peak (in absolute terms) at

rising pH values from 2.2 to 3.0 (Figs. VI.2, part B and VI.3).

Another point to be explained is the presence of the broad bands near the

EOF migration time. At the sight of the previous studies [Cottet, 2001; Györffy,

1998; Štěpánek, 2001], a possible explanation is the presence of associated forms

of the polymer. These associated or aggregated forms could coexist with the free

form (the unimers) in a very slow or frozen equilibrium between them, as

reported for some copolymers [Štěpánek, 2001]. Since PVP-NO has not well-

defined hydrophobic and hydrophilic regions, association cannot be produced by

the action of the hydrophobic forces. However, in the case of PVP-NO, the likely

alternative is association through strong dipole-dipole interactions.

VI.1.1.3. MEKC studies in the absence and presence of PEA

The MEKC behavior of PVP-NO using 60 mM SDS was first studied in

the absence of PEA. As shown in Fig. VI.4, a small peak, followed by a large

peak with a shoulder and by a second large peak at longer migration times, was

observed in an acid medium (20 mM H3PO4, pH 2.2). These peaks were observed

using negative polarity. As discussed above for FSCE, the presence of two peaks

can be explained by the coexistence of a free and an aggregated form of PVP-

NO. The EOF should be small at this low pH, thus the PVP-NO peaks along the

anionic migration time region can be explained as due to association of the two

PVP-NO forms with the SDS micelles. The SDS concentration was varied within

the 20–100 mM range. Electropherograms similar to that shown in Fig. VI.4

were obtained; however, a major drawback was the poor reproducibility of the

migration time of the second large peak. Along replicated injections of the same

solution, this peak appeared at progressively longer migration times. This


209

problem was not overcome by conditioning the capillary between injections with

hot NaOH solutions, as indicated in section III.2.1.3 for new capillaries.

A

bs. a

t 21

4 nm

( m

AU

)

0 4 8

0

100

50

Time (min)

Fig. VI.4. Electropherogram of 2000 µg/mL PVP-NO, obtained using

negative polarity and a BGE containing 20 mM H3PO4 and 60 mM SDS.

The two large peaks and the shoulder showed the spectrum of the polymer.

Lack of reproducibility was attributed to adsorption, then, the behavior of PVP-

NO at increasing SDS concentrations was studied in the presence of 250 mM

PEA. Under these conditions, and using pH 3.0 (20 mM NaH2PO4), PVP-NO

showed the reproducible but complex behavior which is outlined in Fig. VI.5.

Between 1 and 3 mM SDS (Figs. VI.5, parts A and B), a single peak at

increasingly longer migration times was observed. With 3 mM SDS, a new broad

band at a short migration time, and a new narrow peak, began to appear. The

band increased with 5 mM SDS, and reached a constant intensity within the 20–

60 mM SDS range (Figs. VI.5, parts C-F). The narrow peak was large at 5–20

mM SDS (Figs. VI.5, parts C and D), and appeared at longer migration times

and became broader at higher SDS concentrations (Figs. VI.5, parts E and F).

Using 20 mM SDS and 35ºC (instead of 25ºC), an electropherogram similar to

that shown in Fig. VI.5, part D was obtained, but with the large narrow peak

located at a longer migration time (ca. 10 min). A possible explanation of the

results summarized in Fig. VI.5 is next given and discussed.


210

Time (min)0 10 20 30

Abs

orb

an

cea

t 2

76

nm

(mA

U)

0

100

200 A

B

C

D

E

F


negative polarity and a BGE containing 250 mM PEA, 20 mM NaH2PO4

(pH 3.0) and increasing SDS concentrations. From A to F: 1, 3, 5, 20, 30,

60 mM SDS, respectively.

VI.1.1.4. Discussion on the results obtained by MEKC

The association between SDS micelles and non-ionic polymers, such as

PEG and PVP, has been studied by measuring the decrease of the surface tension

as the concentration of the SDS increases, and by other techniques [Cabane, 1977;

Arai, 1971]. According to Cabane [Cabane, 1977], PEG forms mixed micelles with

SDS. Mixed PEG-SDS micelles have a definite composition, with the excess

material, whether polymer or SDS, being present as free polymer molecules or

regular SDS micelles, respectively. When SDS is added to a solution of the

polymer, two concentrations, x1 and x2, mark the beginning and the completion of

the association of SDS with PEG, respectively. The association process starts

abruptly above a certain surfactant concentration, x1, which is lower than the

CMC, and saturates abruptly above another surfactant concentration, x2, where


211

the coverage of the polymer by adsorption of surfactant molecules along its chain

is completed up. Beyond x2 the surface tension of the solution is close to that of a

solution containing regular surfactant micelles. The difference, x2 - x1, measures

the amount of surfactant bound to the polymer.

According to NMR studies [Cabane, 1977], PEG is attached to the

hydrocarbon/water interface of the mixed PEG-SDS micelles, with some

monomers of the polymer replacing water molecules in the vicinity of the head of

the SDS molecules. About 10% of the monomers of the polymer are thought to

be directly bound to the micelles, while the others form loops in the surrounding

water. At the saturation point, x2, depending on the polymer concentration, and

independently from the polymer molecular mass, the composition corresponded

to 3.3–4.1 PEG monomers for one SDS molecule.

Arai et al. [Arai, 1971] also found two transition points on the surface

tension vs. SDS concentration curves when recorded in the presence of PVP.

Association of SDS with PVP to form mixed micelles began at an SDS

concentration 40% lower than the CMC. The PVP/SDS weight ratio at the point

where adsorption was completed, x2, was 1:2.3, regardless of the PVP

concentration. This corresponded to 1.1 PVP monomers for one SDS molecule.

According to literature, PVP-NO also interacts strongly with the SDS

micelles. Thus, the inhibition of the dye scavenger capability of PVP-NO in the

presence of SDS and other anionic surfactants has been attributed to

displacement of the dye from the polymer/dye complex to form a

polymer/surfactant complex [Oakes, 2003-A]. Using MEKC, Gyorffy et al.

[Györffy, 1998] also found a strong interaction between SDS micelles and an

anionic PVP-NO/maleic acid copolymer. In a UV-Vis spectroscopic study,

Oakes et al. [Oakes, 2003-C] have shown that PVP-NO binds SDS micelles. Since

the hydrophobic region of PVP-NO (the hydrocarbon skeleton) is not well


212

separated from the hydrophilic regions, the interaction was explained by the

formation of mixed polymer/SDS micelles, in which short segments of the

polymer occupied substantial parts of the micelles. As illustrated in Fig. VI.6, in

these parts of the micelles, a segment of the hydrocarbon skeleton was proposed

to be located inside the micelle, and the polar pyridine N-oxide groups were

assumed to be positioned among the SDS sulfate groups. Since a single polymer

molecule can bind several micelles, mixed aggregates containing a number of

SDS micelles was proposed to be formed [Cabane, 1977; Arai, 1971; Oakes, 2003-

C].

O-

N+O-

SO2

O

Fig. VI.6. Scheme adapted from ref. [Oakes, 2003-C], showing the likely

structure of a free PVP-NO/SDS mixed micelle.

Curves of the surface tension against the SDS concentration, obtained both

in the absence and in presence of 1000 µg mL-1 PVP-NO, are shown in Fig. VI.7.

These measurements were made in the conditions of Fig. VI.5, that is, in the

presence of both 20 mM NaH2PO4 and 250 mM PEA. In the absence of the

polymer, the CMC of SDS was 1.8 mM. This parameter, which is 8.3 mM in

pure water, decreases in the presence of salts [Phillips, 1955; Thèvenot, 2005],

which is consistent with the value obtained. Two transition points, indicating the


213

beginning and end of the association process of PVP-NO with the SDS micelles,

were observed in the presence of 1000 µg mL PVP-NO.

30

40

50

60

70

0 0.5 1 1.5log ([SDS]+1)

Su

rfac

ete

nsi

on

(mN

m-1)

Fig. VI.7. Surface tension plotted against log([SDS]+1), where [SDS] is

the SDS concentration in mM (the 1 was added to plot the [SDS] = 0

point). Data obtained both in the absence (○, dotted lines) and in the

presence of 1000 µg mL-1 PVP-NO (∆, continuous lines).

The first point, x1, was located at 0.48 mM SDS, which corresponds to a

concentration a ca. 70% lower than the CMC. This indicates a strong interaction

between the polymer and SDS. The second point, x2, was placed over the CMC,

at 9.7 mM SDS. The difference (x2-x1) corresponded to 0.9 PVP-NO monomers

for one SDS molecule taking part in the mixed micelles. This value is close to

that reported for the formation of PVP/SDS mixed micelles, 1.1 [Arai, 1971].

Assuming that PVP-NO would behave in a similar way as PEG, a mixed micelle

would have about 70 SDS molecules with only a 10% of the polymer taking part

of the micelles [Cabane, 1977]. If this were true, 0.9 PVP-NO monomers for one

SDS molecule would correspond to 6.3 PVP-NO monomers per mixed micelle,

which is quite realistic. This value was used to draw the scheme of Fig. VI.6.


214

On the other hand, according to the FSCE discussion of above, and in

agreement with the results of Štěpánek et al. [Štěpánek, 2001], two forms of the

polymer, namely, the free polymer and the pure polymer aggregates, probably in

a very slow-rate equilibrium between them, could be present in the aqueous

solutions of PVP-NO, in the absence of SDS. Further, in agreement with the

study of Oakes et al. [Oakes, 2003-C], both the free and the micellized polymer

forms could bind SDS micelles. Thus, it seems reasonably to assign the narrower

peaks of the electropherograms of Figs. VI.4, part A, VI.5, part C and D to the

association between the free polymer and SDS micelles, and the broader band at

a shorter migration time to the association between the aggregated polymer and

SDS micelles. In this latter, band broadening could be explained by scatter of the

aggregation number. The presence of two types of PVP-NO/SDS aggregates

could explain the persistent presence of a peak and a band (or group of bands) in

most electropherograms, being also compatible with the presence of the two

transition points observed in Figs. VI.7.

The EOF should be almost zero at the low pH used; however, as indicated

above, an anionic (reversed) EOF was observed in the presence of large PEA

concentrations. Thus, the reduction of this cathodic EOF produced by the

presence of increasing SDS concentrations could be enough to explain the

broadening and shifting effects on the large narrow peak observed in Fig. VI.5,

parts A and B. The first transition point of Fig. VI.7, x1, approximately

coincided with the appearing of the new peak and band between Fig. VI.5, parts

A and B. Thus, the sudden formation of two new peaks between 3 and 5 mM

SDS could be attributed to the simultaneous formation of both free polymer/SDS

and aggregated polymer/SDS mixed micelles.

Since the EOF was very low in the conditions of Fig. VI.5, parts B to F,

the short migration times of the band and peak indicated that the polymer species


215

had high anionic mobilities. These can be explained by both the negative charge

of the free polymer, and the association of the free and aggregated polymer forms

with the SDS micelles. As shown in Fig. VI.5, parts E to F, the band assigned to

the associated PVP-NO/SDS mixed micelles showed no further changes of shape

and location at higher SDS concentrations. On the contrary, the peak assigned to

the free polymer/SDS mixed micelles was progressively broader, and appeared at

longer migration times as the SDS concentration increased. An explanation for

this behavior was not found.

VI.1.1.5. Quantitation studies and application to real samples using FSCE

Intra- and inter-day repeatabilities of the large and narrow polymer peak in

the presence of 20 mM NaH2PO4 and 250 mM PEA were measured by

performing successive injections of a 1000 µg mL-1 PVP-NO solution. The

results are given in Table VI.1. A calibration curve was constructed by injecting

seven standard solutions within the 50–2000 µg mL-1 range, and by measuring

the peak area. Excellent linearity (r > 0.993) and an LOD of 23 µg mL-1 (S/N =

3) were obtained (Table VI.1).

The FSCE method was applied to the determination of PVP-NO in two

different commercial DTI concentrates for laundry. A representative

electropherogram is shown in Fig. VI.8. This electropherogram was closely

similar to those given in Figs. VI.2, part B and VI.3, which were obtained in the

same conditions, but it showed an additional intense peak (marked with an

asterisk in the figure). This peak increased upon spiking the sample with cumene

sulfonate, which is a common hydrotropic additive of cleaning products. The

other narrow peak and the broader bands at longer migration times showed the

spectrum of the polymer, and increased upon spiking the sample with PVP-NO.


216

According to the calibration curve, the area of the narrow PVP-NO peak

corresponded to 161 µg mL-1 in the injected solution, and to 1.53% in the sample.

Table VI.1. Migration time and peak area repeatabilities, efficiency and LOD for

the large narrow peak of PVP-NO.

Parameter Value

Migration time repeatabilities 0.30a), 1.0b)

Peak area repeatabilities at 1000 µg/mL 2.4a), 5.5b)

N, m–1 80 000

LOD, µg/mL (S/N = 3) 23

a) Intraday as RSD % (n = 5). b) Interday as RSD % (n = 3 × 5).

4 8 12 16 200

0

20

Time (min)

Abso

rba

nce

at 2

14 n

m(m

AU

)

*

Fig. VI.8. Electropherogram of a commercial additive for laundry obtained

using negative polarity and a BGE containing 20 mM NaH2PO4 and 250

mM PEA. The sample was 1:100 diluted with 50:50 v/v MeOH/water. The

arrow shows the location of the peak of the EOF marker (acetone), and the

asterisk identifies the peak of cumene sulfonate.

Attempts of detecting 500 µg mL-1 PVP-NO in the presence of non-ionic

and anionic surfactants were also made. Thus, the PVP-NO narrow peak was not

disturbed by the presence of a 5% of FAEs (Dehydol LT-7); however, it was not


217

detected when the sample solution contained a 5% of an anionic surfactant (both

LAS and LES were tried).

VI.2. PVP

VI.2.1. Characterization and determination of PVP by complexation with an

anionic azo-dye and NECEEM

A variety of nonaqueous and aqueous CE methods for the characterization

and determination of synthetic polyelectrolytes, including CZE, CGE and CIEF

methods, have been described [Clos, 1998; Grosche, 2000; Borisch, 2000; Engelhardt,

2004; Cottet, 2005]. In CGE, solutions of nonionic polymers are used as sieving

media to separate polyelectrolytes [Welch, 2001]. However, as far as we know, CE

methods for the characterization and determination of nonionic polymers have

not been reported. To analyze PEGs by CZE, previous derivatization with an

anhydride, which provides both a chromophore and charge, has been used

[Wallingford, 1996; Barry, 1998]; however, most nonionic synthetic polymers

cannot be easily derivatized.

PVP is a versatile hydrophilic polymer which is widely used for a variety

of purposes, including cosmetics and toiletries, textiles and dyes,

pharmaceuticals and adhesives [Frauenfelder, 1974; Sheth, 1985]. In the

formulation of cleaning products, PVP is used as a dye scavenger, keeping the

washed-off dyestuffs in solution, thus inhibiting the unwanted dye transfer from

coloured to white fabrics [Bertleff, 1998; Oakes, 2003-A; Oakes, 2003-B; Oakes, 2005].

The determination of PVP has been carried out in urine and blood serum by

precipitation with iodine and titration with thiosulfate [Dwyer, 1964], and by

infrared absorptiometry [Behen, 1964]. PVP has been determined in foods,

cosmetics and laundry products by preconcentration on silicagel followed by


218

complex formation with an anionic azo-dye and colorimetry [Frauenfelder, 1974].

A spectrophotometric procedure for the determination of PVP in waste water of

pharmaceutical plants, based on formation of a coloured complex with a dye, has

been also reported [Chmilenko, 2001-A]. PVP can be also determined in

pharmaceutical preparations by direct injection of the sample in a RP-HPLC

column [Jones, 2004]; however, this entails a high risk of getting PVP

permanently retained by the stationary phase.

Over half a century, studies concerning to the complexation of anionic

organic dyes by PVP, with special reference to total number of binding sites

available for the interaction, free energy and heat of interaction, and changes in

the shape of polymer molecule, have been carried out [Sheth, 1953; Hansen, 1954;

Barkin, 1955; Frank, 1957; Luck, 1958; Molineux, 1961; Runge, 1996; Chmilenko, 2001-

B; Oakes, 2003-C]. The aim of this work was to develop a CE method for the

determination of PVP in cleaning products. Since the electrophoretic mobility of

nonionic PVP is almost zero, mixtures containing PVP and an anionic azo-dye

were prepared and injected in the capillary. A band due to the PVP–dye

complexes followed by a peak due to free dye was observed. The

electropherograms were interpreted in the light of the theory developed by

Krylov and co-workers [Berezovski, 2002; Krylov, 2003; Drabovich, 2006; Lin, 2008;

Krylov, 2006; Krylov, 2007], which described the method of nonequilibrium CE of

equilibrium mixtures (NECEEM) for the study of protein–probe and DNA–

protein interactions. In NECEEM, non-covalently bound fluorescent probes are

equilibrated with a target protein or DNA, and the mixture is injected in the

capillary. In this work, application of NECEEM to the study of the interaction

between PVP and an azo-dye is demonstrated. Information about the average

molecular mass of the polymer, and the maximal stoichiometry, average stability

constant and dissociation rate of the polymer–dye complexes, can be obtained. In

addition, the method was applied to the characterization and determination of


219

PVP in commercial cleaners and pharmaceutical preparations. The proposed

method should also be useful to characterize and determine other synthetic and

natural nonionic polymers by using the appropriate probes.

VI.2.1.1. Electropherograms of PVP in the presence of anionic azo-dyes

Two anionic bisazo-dyes (Fig. VI.9), which form with PVP stronger

complexes than single azo-dyes, were selected. The electropherogram of a CR

solution is shown in Fig. VI.10, part A. In the same figure, parts B–F, a series

of electropherograms showing the effect of the addition of increasing CR

concentrations to a PVP solution, are given. In the absence of CR, PVP absorbed

only at low wavelengths, and its electrophoretic mobility was close to zero (Fig.

VI.10, part B, trace obtained at 215 nm).

PVP

Acid Blue 113 (AB)

NN

NN

SOO O- Na+

NH

SO

ONa+ O-

N

CH C H2 H

O

H

n

N

NH2

SNa+ O- O

O N NN

S

O- Na+O

O

H2NCongo Red (CR)

Fig. VI.9. Molecular structures of PVP and the azo-dyes used in this work.


220

A

0 2 4 6 8 10

0

20

40

60

B

Time (min)

Ab

sorb

an

ce (

mA

U)

Ca

Da

Ea

F a

G a

6

4.5

3.0

2.25

1.12

Fig. VI.10. Electropherogram of 0.5 mM CR (A) and electropherograms of

500 µg mL−1 PVP of 60 kDa (4.5 mM in monomers) without an azo-dye

(B), and in the presence of the following CR concentrations: 0.75 (C), 1

(D), 1.5 (E) and 2 mM (F). Trace G was obtained with 4 mM AB. The

numbers on the traces are the values of q (monomer/dye molar ratio). The

traces were recorded at 215 (B), 500 (A, C–F) and 565 nm (G). On each

trace, the arrow indicates the location of the EOF marker peak. The area at

the left half of the peak of the PVP–dye complexes, a, was used to estimate

the total area of this band (a = APVP–D/2).

A significant parameter in all the experiments along this work was the

monomer/dye molar ratio, which will be indicated by q throughout the article. At

increasing CR concentrations (decreasing values of q), the band appeared at

increasing migration time values after the EOF time. The band was also


221

progressively divided into two peaks which showed a large absorptivity in the

visible region, with their respective maxima at ca. 505 and 485 nm, respectively.

At q < 4, the peak with a lower migration time was Gaussian shaped, whereas the

other peak was asymmetric (Fig. VI.10, parts E to F). Resolution between the

two peaks, and their areas at 500 nm, increased as q decreased; however, the area

of the Gaussian shaped peak remained constant when q < 4. The asymmetric

peak continued increasing, approaching the migration time of CR at q <4 (Fig.

VI.10, parts E and F). Interpretation of the electropherograms was made in the

light of both the UV–Vis spectra of the free dye and the PVP–CR complexes,

which were obtained with a conventional spectrophotometer, and the NECEEM

theory (see Section VI.2.1.3).

Using a conventional spectrophotometer, the absorption spectrum of CR

showed two maxima located at 340 and 487nm (ε = 16,845 and 21,400 M−1 cm−1,

respectively). Upon addition of an excess PVP (0.91 mM in monomer giving q =

9.1), the band at 340 nm was only slightly modified, but the maximum of the

other band shifted from 487 to 505 nm. The molar absorptivity of this band also

increased from 21,400 to 24,000 M−1 cm−1. Batochromic shifts between 7 and 19

nm have been reported for the 500–650 nm band of azo-dyes upon complexation

with PVP [Scholtan, 1953; Runge, 1996], which agrees with the 18 nm shift found

in this work for the formation of the PVP–CR complexes. Accordingly, the

Gaussian shaped peak of the electropherograms of PVP–dye mixtures (Fig.

VI.10, parts B to F), was attributed to the corresponding PVP–dye complexes,

and the asymmetric peak at a longer migration time to the free dye. As also

shown in Fig. VI.10, when q < 4, the asymmetric peak was close to the location

of the free dye peak obtained in the absence of the polymer (trace A). There are a

large number of potential binding sites along a PVP molecule. Thus, the increase

in the peak area of the complexes at rising dye concentrations was attributed to


222

an increased number of bound sites along the PVP molecules. The increasing

mobility of the complexes at increasing dye concentrations (at decreasing q

values up to q = 4) was also attributed to the same cause.

On the other hand, at q > 4 (Fig. VI.10, parts C and D), the peak of the

free dye ions was located at a migration time which was only slightly higher than

that of the PVP–CR complexes. Further, a similar behaviour was observed by

injecting PVP–AB mixtures. The peak due to the free dye was expected at longer

migration times, namely, at 6.4 and 9.5 min for CR and AB, respectively;

however, a peak close to these locations was obtained only when q < 4. As

further discussed in Section VI.2.1.3, this, as well as the presence of an

intermediate exponential region when q < 4, were explained by applying

NECEEM concepts.

VI.2.1.2. Formation rate of the PVP–CR complexes

The formation rate of the PVP–CR complexes was first studied

spectrophotometrically. For this purpose, a mixture containing 0.1 mg mL−1 60

kDa PVP (0.91 mM in monomers) and 0.1 mM CR (q = 9.1) was prepared, and a

spectrum every 10 min was obtained. The band at 487 nm shifted progressively

to 505 nm, and the molar absorptivity also increased in a process which lasted ca.

40 min. No further modifications of the spectrum were observed during the

following 5 h. Then, another mixture containing 1 mg mL−1 60 kDa PVP (9.1

mM in monomers) and 4 mM CR (q = 2.25) was prepared, and aliquots were

injected in the capillary at increasing times after preparation. In these

experiments the peak area of the PVP–CR complexes reached some stability 3 h

after preparation of the mixtures. At the same time, the mobility of the complexes

increased, also reaching a plateau between 3 and 5 h after preparation. The

slower formation of the complexes when monitored using CE instead of the


223

spectrophotometer could be due to the different values of q (9.1 vs. 2.25).

However, conformational changes of the complexes, leading to an increase in

their stability, could take place during several hours after preparation of the

mixture. As deduced from application of NECEEM principles, conformational

changes which could be blind to a spectrophotometer, could be revealed by the

electropherograms. Thus, on the electropherograms, an increase of the peak area

of the PVP–CR complexes at increasing time values after preparation could be

due not to an increase of the concentration of the complexes, but to a slower

dissociation rate. This point is further commented upon in the next section.

Except when otherwise indicated, in all the experiments presented in this work,

the vials containing all the solutions were maintained in the carrousel of the CE

instrument at ca. 25 ºC during a minimum of 5 h before injection.

VI.2.1.3. Application of NECEEM principles to the interpretation of the

electropherograms of PVP–dye mixtures

According to Krylov and co-workers [Berezovski, 2002; Krylov, 2003;

Drabovich, 2006; Lin, 2008; Krylov, 2006; Krylov, 2007], when a target–probe

complex is injected in the capillary, due to the violation of the equilibrium

conditions during migration, at least two peaks and an intermediate exponential

region should be obtained. The two peaks are due to the remaining target–probe

complex at the time of detection, and to the equilibrium concentration of the free

probe. The exponential region is due to the probe which is liberated from the

complex during migration. A third peak and its corresponding exponential

region, due to the equilibrium concentration of the free target and to the target

liberated during migration, respectively, will also appear if detection conditions

sensitive to the target are used. The peaks of the target–probe complex, free

probe and free target, should appear at the migration time values corresponding


224

to their respective electrophoretic mobilities. Since both target and probe are

carried away from the complex during migration, the complex dissociation rate

depends exclusively on its concentration. For this reason, a first-order kinetics,

which gives rise to an exponential liberation of both target and probe, is

followed. The stability constant of the target–probe complex can be established

by measuring the peak area of the free probe, and the sum of the peak areas of

the remaining complex and the exponential region. Correction of the areas is

necessary if the complex and the probe have different sensitivities (e.g. different

fluorescence quantum yields or different molar absortivities). Finally, kinetic

information related to the complex dissociation rate can be obtained from the

exponential profile of the intermediate region.

The PVP–dye mixtures used in this work gave rise to electropherograms

which closely resembled to those described for protein–probe and DNA–protein

complexes when injected in NECEEM conditions. As shown in Fig. VI.10, parts

C to G, the Gaussian peak attributed to the PVP–dye complexes was followed by

an exponential region which ended abruptly at the long migration time side;

however, a peak due to the equilibrium concentration of free dye could not be

distinguished in the electropherograms of Fig. VI.10. This was attributed to the

use of q values not sufficiently close to the maximal stoichiometry of the

complexes, which as shown later in Section VI.2.1.5, was q = 4. In fact, in Fig.

VI.10, this ratio was 4.5 and 3.0 for traces D and E, respectively. At large q

values, the excess PVP should reduce the equilibrium concentration of the free

dye below its detection limit. On the other hand, at too low values of q, the large

equilibrium dye concentration could not be distinguished from the much lower

amount of dye liberated by the complexes. However, as shown in Fig. VI.11, a

peak of the free dye, separated from the beginning of the exponential region, was


225

clearly observed in all the electropherograms when mixtures with q values

ranging from 3.1 to 4.4 were injected.

0

40

Abs

orb

ance

(m

AU

) B

3.1

4.0

A

0

20

Abs

orb

ance

(m

AU

)

3.1

4.0

5 61

2

3

4

Time (min)

Ae

AD

Time (min)

2 4 6 8

0

80

Abs

orb

ance

(m

AU

) C

3.1

4.0

Ae

AD

5 70

2

4

6

Time (min)6

7.0 7.50

10

Time (min)

Ae

AD

Fig. VI.11. Electropherograms of PVP of 10 (A), 60 (B) and 360 kDa (C)

with 4 mM CR at the values of q (monomer/dye molar ratios) indicated on

the traces. The insets show how the areas corresponding to AD and Ae were

established. The electropherograms were recorded at 500 nm. Other details

as in Fig. VI.10.

In order to characterize the PVP–dye complexes, three areas should be

measured: (i) the area of the remaining PVP–dye complexes, APVP–D; (ii) the area


226

due to the equilibrium concentration of the free dye, AD; and (iii) the area due to

the dye liberated from the complexes during separation, Ae. The values of these

three areas were measured as next explained. As indicated in Fig. VI.10, the

maximum of the PVP–dye peak was first located, and the area of the left half of

this peak was taken as APVP–D/2. Then, as indicated in Fig. VI.11 for the

experiments performed at 3.1 ≤ q ≤ 4.4, the area at the right of the small dip of

the asymmetric peak was assigned to the equilibrium concentration of the free

dye, AD. Finally, the area of the exponential region, Ae, was calculated as the total

area minus (APVP–D + AD). These areas were used below in sections VI.2.1.5 and

VI.2.1.7 to estimate the maximal stoichiometry and average stability constant of

the PVP–dye complexes, respectively.

VI.2.1.4. Influence of MW on the location and shape of the peak of the PVP–

dye complexes

As deduced from the electropherograms of Figs. VI.10 and VI.11, when q

< 4 (the dye was in excess in relation to the saturation point), the mobility of the

PVP–dye complexes was independent of the molecular mass of the polymer.

This agreed with the model of repeating units of polymer binding individual ions.

A single peak, at a migration time independent from the polymer molecular mass

should be obtained for sufficiently long polyelectrolytes; further, differences in

the mobility of large ionic polymers due to different MW values should be

obtained only upon addition of a sieving medium to the BGE [Cottet, 2005].

As shown below in section VI.2.1.8, the peak areas of the complexes

increased linearly with the monomer concentration, but were essentially

independent of MW. However, as observed in Figs. VI.11, the shape of the peak

of the PVP–dye complexes varied with MW. In fact, the height/width ratio of the

peaks increased with both MW and the PVP concentration. Thus, a method to


227

estimate MW was immediately derived. In Fig. VI.12, part B, the logarithm of

the height/width ratio (in mAU min−1, and estimated as indicated in Fig. VI.12,

part A ) divided by the PVP concentration (CPVP in µg mL−1) was plotted against

log MW.

B

1.22.2

3.1

3.64

-2.5

-1.5

-0.5

4 4.5 5 5.5log MW

log

(h/w

) -

log

CP

VP

0

40A

2 4 Time (min)

Ab

sorb

ance

(mA

U)

h

w1/2

Fig. VI.12. Logarithmic plot of (h/w)/CPVP against MW; h and w are the

height and base width of the peak of the PVP–CR complexes, which were

measured as indicated in part A (w =2w1/2). The units used were mAU, min

and mg mL−1 for h, w and CPVP, respectively. The dashed lines indicate

confidence limits for a significance of 0.05. The legend in part B indicates

the q values of the series. Other details as in Fig. VI.11.

This plot is useful to predict MW using electropherograms obtained at q < 4

(excess dye in relation to the saturation point). These predictions should be

particularly accurate at low MW values, where both a high slope of the curve and


228

a reduced dispersion of the points are observed. This relationship between peak

shape and MW could be due to the increase in the stability of the complexes as

MW increased. However, another possible reason could be an increase in the

polydispersity of the PVP–dye complexes as MW decreased.

VI.2.1.5. Determination of the maximal stoichiometry of the PVP–dye

complexes

To estimate the maximal stoichiometry of the PVP–dye complexes, the

dye concentration was increased while the PVP concentration was maintained

constant. Then, the APVP–D values and the remaining area, (Ae + AD), were plotted

against the dye/monomer molar ratio (1/q). The plot corresponding to CR and 60

kDa PVP is shown in Fig. VI.13, part A. The peak area of the PVP–CR

complexes increased until reaching an approximately constant value at which

saturation of the polymer with the dye was produced. On the other hand, the

remaining area, (Ae + AD), increased only slightly at low values of 1/q, and

increased steeply after saturation. This agreed with the complexation of all the

available dye by the polymer at large q values, whereas the dye added to the

solution over the saturation point remained free. As shown in Fig. VI.13, part B,

the absolute mobility of the PVP–CR complexes increased as the dye

concentration in the complexes increased, reaching a constant value immediately

after the saturation point. A higher absolute mobility of the complexes should be

attributed to the increase of their charge density as a result of the increasing dye–

polymer ratios. Mixtures of CR with PVP, and AB with PVP, at all the available

values of MW, gave plots which were closely similar to those shown in Fig.

VI.13, parts A and B. In all cases, the increase in both the peak area and

mobility of the PVP–CR and PVP–AB complexes pointed out to q ≈ 4.0 ±0.5 at

the saturation point (1/q ≈ 0.25 ± 0.04 in Fig. VI.13).


229

1/q (reverse of the monomer/ dye ratio)

µ(-

108 )

(m

2 s-1

V-1

)

0

1

2

3

0 0.2 0.4 0.6

B

27.9 kDa PVP60 kDa PVP400 kDa PVP

Rel

ativ

e AP

VP

-CRva

lues

0

100

200

300

0

500

1000

A

Rel

ativ

e Ae

+ A

Dva

lues

60 kDa PVP

Fig. VI.13. Area (APVP–D, rhombus and continuous line) (A) and

electrophoretic mobility (B) of the peak of the PVP–CR complexes at

increasing CR concentrations, keeping a constant monomer concentration

of 4.5 mM. In A, the squares and dashed lines correspond to Ae + AD (right

scale). The MW values are indicated on the plots. The electropherograms

were recorded at 500 nm.

Next, the PVP concentration was increased, while the dye concentration

was maintained constant. As shown in Fig. VI.14, part A for the CR complexes

with 60 kDa PVP, the peak area of the complexes increased at increasing q

values. This plot, and similar plots obtained with PVP having other MW values, as

well as by using AB, also indicated the formation of a complex with a maximal

monomer: dye molar ratio of q ≈ 4. A difference with respect to Fig. VI.13, part

A, was the linearity of the relationship between APVP–D and the PVP

concentration, at least up to q = 3.5. Linearity was attributed to saturation of the


230

polymer in the presence of an excess dye in this region of the curves. As shown

later in this work, this was of interest for the CE determination of the polymer.

Another feature of Fig. VI.14, part A, which was not observed in Fig. VI.13,

part A , was an abrupt increase of the peak area of the PVP–CR complexes

immediately before reaching the saturation point.

2.0

2.5

3.0

0 2 4 6

B

µ(-

108 )

(m

2 s-1

V-1)

27.9 kDa PVP60 kDa PVP400 kDa PVP

q (monomer/ dye molar ratio)

0

400

800

1200

0

A1000

Rel

ativ

eA

PV

P-C

Rva

lues

Rel

ativ

eA

e+

AD

valu

es

60 kDa PVP

Fig. VI.14. Area (APVP–D, rhombus and continuous lines) (A) and

electrophoretic mobility (B) of the peak of the PVP–CR complexes at

increasing PVP concentrations, and at a constant CR concentration of 4

mM. Other details as in Fig. VI.13.

This could be due to a higher stability of the complexes in the vicinity of the

saturation point, where a more favourable conformation could exist; however, a

slower dissociation rate of the complexes could also contribute. As also observed

in Fig. VI.14, part A, the remaining area, (Ae + AD), decreased at increasing PVP


231

concentrations, approaching zero when q > 4, as expected from the increasing

amount of complexed dye.

In Fig. VI.14, part B, the variation in the electrophoretic mobility of the

PVP–CR complexes at increasing PVP concentrations while maintaining a

constant CR concentration (increasing q values), was plotted. At q values well

below the saturation point, the mobility of the PVP–CR complexes did not vary,

showing a perturbation (a local decrease of the absolute mobility) when the

saturation point was approached. Finally, the absolute mobility of the complexes

decreased steadily in the presence of an excess PVP. Therefore, Fig. VI.14, part

B also suggested a conformation change of the PVP–CR complexes in the

vicinity of the saturation point. Extrapolation of the approximately linear regions

at low and high values of q pointed out to values of the saturation point close to q

= 4. As also shown in Fig. VI.14, part B, the absolute mobility of the PVP–CR

complexes when q > 4 decreased with a higher absolute slope as greater was MW.

This agreed with the curves of Fig. VI.13, part B, where at 1/q values

approaching zero, lower absolute slopes as higher was MW were observed. Series

of experiments performed with either CR or AB and PVP samples at all the

available values of MW, led to plots closely similar to those shown in Fig. VI.14,

parts A and B. Both the peak areas and the mobility of the PVP–AB complexes

also indicated a saturation point close to q = 4 for this dye.

VI.2.1.6. Influence of MW on the mobility of the PVP–CR complexes at low q

values

The relationship between the initial slopes of the curves in Fig. VI.13,

part B (variation of the absolute mobility of the complexes vs. increasing values

of 1/q) and MW was studied. To obtain accurate values of the initial slopes of the

curves, series of experiments constituted by five triplicated points per series at


232

500–2000 µg mL−1 PVP, and at 1/q values equal to zero, 0.05 and 0.1 were

performed. These series were monitored at 215 nm. The curves were fitted to the

cubic equation, and for each curve, the initial slope was obtained as the

regression coefficient of the first grade term. A plot of the initial slopes against

log MW is shown in Fig. VI.15. Although with some dispersion, this plot showed

a decrease in the initial slopes when log MW increased. The possible reasons of

this behaviour are discussed next.

0

100

200

4 5 6log MW

∆µ

/ ∆(1

/q)

at (

1/q)

≈0

Fig. VI.15. Initial slopes of the curves in Fig. VI.13, part B (variation in

the mobility of the complexes vs. 1/q) plotted against log MW. Data

obtained as indicated in the text.

First, at a constant q value, and at increasing values of MW, a lower absolute

mobility of the complexes could be produced by a lower amount of dye

complexed by the polymer. However, attending to the peak area of the PVP–dye

complexes, the opposite behaviour was actually observed when

electropherograms at constant 1/q values were compared. In fact, the APVP–D

values indicated an increase in the degree of complex formation as MW increased,

which agreed with the increased stability of the complexes at increasing MW

values (section VI.2.1.7). Second, the surface area: volume ratio of the PVP–CR


233

complexes should decrease as MW increases; however, this should lead to an

increase in the absolute mobility of the complexes at increasing values of MW.

Again, the opposite behaviour was actually observed in Figs. VI.13, part B and

VI.15, thus suggesting that the absolute mobility of the complexes at low values

of 1/q should be influenced by another factor. This factor could be the location of

the bound dye ions closer to the surface of the complexes, which would increase

their zeta potential. A higher zeta potential should be more important at low

molecular masses, since the surface area:volume ratio of the complexes probably

decreases as MW increases.

VI.2.1.7. Determination of PVP–dye stability constants

Although the NECEEM theory was developed to be applied to protein and

DNA complexes with fluorescent probes, to adapt it to the CE of polymer–dye

mixtures with spectrophotometric detection is straightforward. Thus, the

equilibrium concentration of free dye is proportional to AD:

[ ] Deq

D

AD

bε= (E.VI.1)

where bεD is the optical path multiplied by the molar absorptivity of the dye. The

equilibrium molar concentration of the complexes is dependent on APVP–D and Ae

as follows:

[ ] PVP D eeq

PVP D D

A APVP D

b bε ε−

−

− = + (E.VI.2)

where εPVP–D is the average molar absorptivity of the complexes, which should be

calculated with reference to the molar concentration of the complexed dye. This

is equivalent to considering that a dye ion is complexed on a 1:1 basis by a group

formed by a fixed number of monomers, complexing polymer units, or binding

sites. In this way, the possible influence of a stoichiometry different from 1:1 is

ruled out. The ratio of the two equilibrium molar concentrations is:


234

[ ][ ]

( / )eq PVP D D PVP D e

Deq

PVP D A AR

D A

ε ε− −− += = (E.VI.3)

The stability constant, Ka, is given by:

[ ] [ ]0 0

11(1 )

a

RK

C DR

+=+ −

(E.VI.4)

where [C]0 and [D]0 are the analytical molar concentrations of the complexing

polymer units and the dye, respectively. Since the maximal stoichiometry of the

PVP complexes with CR and AB is 4:1, we have:

[ ] [ ]0 04

NC PVP= (E.VI.5)

where N is the average number of monomers and [PVP]0 is the analytical

concentration of the polymer in mol L−1. To estimate Ka values, series of

electropherograms obtained at q values ranging from 3.1 to 4.5, and at increasing

MW values, were used. The values of APVP–D, AD and Ae were measured as

indicated in sections III.2.2.3 and VI.2.1.2. The εD/εPVP–D ratio was measured at

500 nm; for this purpose, a conventional spectrophotometer was used (Section

III.2.2.3).

The values of log Ka are given in Table VI.2. From top to bottom in

Table VI.2, it is deduced that log Ka varied with q, showing a maximum value at

the saturation point (q = 4) and decreasing slightly at higher q values. It should

be indicated that this variation could be partially due to systematic errors

associated to the difficulty in estimating AD independently from Ae; however, the

presence of the perturbations observed in Fig. VI.14, parts A and B, suggests

that more stable complexes were actually formed in the vicinity of the saturation

point than at other values of q.


235

Table VI.2. Stability constants, log Ka, for the PVP–CR complexes using PVP

with different molecular masses and at increasing q values.

MW (kDa)

q 10 27.9 40 60 360 400

3.1 4.35±0.05 4.29±0.01 4.33±0.01 4.30±0.01 4.30±0.01 4.45±0.02

3.6 5.01±0.05 - 5.04±0.05 5.22±0.03 4.17±0.71 5.46±0.07

4.0 5.04±0.03 4.94±0.12 5.23* 5.43±0.12 4.73±0.14 5.66±0.06

4.5 4.67±0.08 4.35±0.01 5.09* 4.99±0.11 4.82±0.15 5.23±0.11

* n = 2; the other values are means with n = 3.

In addition, the log Ka values given in Table VI.2 also showed that the stability

of the complexes when q = 4 increased with MW. Finally, it should be noted that

owing to the Joule heating, the values in Table VI.2 were obtained at a capillary

temperature which was actually higher than 25ºC [Evenhuis, 2009].

VI.2.1.8. Analytical applications

The increase in the peak area of the PVP–CR complexes at increasing PVP

concentrations, when an excess dye is present (q < 4), was used to quantify the

polymer. Calibration curves were constructed using either CR or AB and PVP

standards at all the available MW values. As indicated in section III.2.2.4, the

maximal PVP concentrations used were 1500 µg mL−1, which corresponded to a

maximal value of q = 3.4 (at a safe distance from the saturation ratio). Linear

calibrations were obtained in all cases (r2 > 0.98). As shown in Table VI.3, PVP

samples with different MW values gave similar sensitivities, although for

unknown reasons the 160 and 400 kDa PVP standards gave sensitivities higher

than the other standards. Therefore, systematic errors can be occasionally

produced by applying the proposed procedure when a PVP standard different

from the PVP contained in the sample is used for calibration. In addition, the

possible interference of an anionic surfactant was studied. For this purpose,


236

mixtures containing 1000 µg mL−1 60 kDa PVP and 4 mM of either CR or AB

were injected both in the absence and presence of a 5% SDS. When SDS was

present, the peak shape and area of the PVP–CR complexes were not modified,

but the peak area of the PVP–AB complexes was reduced largely. In addition to

electrostatic repulsion between the PVP–dye complexes and SDS, the polar

amino groups of CR could also contribute to the lack of matrix effect observed

when SDS was present in the sample solution.

Table VI.3. Relative slopes of the external calibration curves obtained with PVP

solutions of different MW values.

MW (kDa) CR AB

10 0.94 0.87

27.9 0.95 0.96

40 1.07 1.01

60a 1.00 1.00

160 1.54 1.57

360 0.92 0.93

400 1.28 2.00

a) Taken as reference.

PVP of 60 kDa is commonly used in the formulation of colour care

cleaning products, thus the calibration curve constructed with this PVP and CR

(r2 = 0.997) was used in the quantitation studies that followed. First, two

detergent bases with the composition given in Table III.1 were spiked with 60

kDa PVP, mixed with CR as indicated in section III.2.2.4, and injected. An

electropherogram of spiked detergent base II, recorded at 215 and 500 nm, is

shown in Fig. VI.16. The interference of the peaks due to several sample

components was removed by using 500 nm. Using external calibration, the

found/expected PVP concentrations were 1.67/0.99% and 1.19/0.97% for

detergent bases I and II (Table III.1 ), respectively. Using internal calibration


237

with two standard additions, the found/expected concentrations were 1.18/1.17%

and 0.62/0.97%, respectively. Thus, the matrix effect due to the detergent

components was partially reduced using internal calibration. Then, the curve of

Fig. VI.12, part B was used to predict MW in the spiked samples. The values MW

= 51 and 60 kDa were obtained for detergent bases I and II, respectively.

3.0 4.00

10

20

0 2 4 6

0

50

100

150

Time (min)

Ab

sorb

an

ce(m

AU

)

A

B

Ab

s. 5

00 n

m(m

AU

)

Time (min)

215 nm

500 nm

Fig. VI.16. Electropherograms of detergent base II spiked with ca. 1% 60

kDa PVP. Data obtained at 215 (A) and 500 nm (B). The inset shows the

peak of the PVP–CR complexes for a series of calibration points.

Several commercial cleaning products and pharmaceutical preparations

were also analyzed. To reduce iodine, drops of an ascorbic acid aqueous solution

were added to the topical antiseptic until decolouration. Then, aliquots of the

samples were mixed with 4 mM CR and injected. The PVP concentrations,

predicted by using external calibration with 60 kDa PVP as standard, are given in

Table VI.4. The found values agree with the expected concentrations for colour

care liquid cleaners, which may contain up to 1% PVP [Prud’homme de Lodder,


238

2006]. The concentrations found for the cough syrup and the antibacterial tablet

were well within the usual ranges, namely 0.5–5% as binders in tablets and <5%

for dispersing agents in syrups [Rowe, 2005]. Finally, the declared amount of PVP

in the topical antiseptic was 10%. Then, the plot of Fig. VI.12, part B was used

to predict the MW values of Table VI.4. Values below 35 kDa were predicted for

the laundry cleaners. Owing to the interference of the surfactants, these values

were probably lower than the actual values. A large value (MW = 400 kDa) was

obtained for the cough syrup, which was attributed to the presence of the anionic

azo-dye amaranth (E123). This dye could form also complexes with PVP with a

mobility similar to that of the PVP–CR complexes, thus contributing to the peak

area. Finally, MW = 22 and 16 kDa were predicted for the antibacterial tablet and

topical antiseptic, respectively. The actual MW values in these products are to be

expected along wide ranges [Rowe, 2005].

Table VI.4. PVP concentrations predicted using external calibration with 60 kDa

PVP and MW values estimated by applying the plot of Fig. VI.12, part B.

MW (kDa) Concentration (%wt) MW (kDa)

Laundry cleaner I 0.89 35

Laundry cleaner II 0.31 10

Laundry cleaner III 0.45 <10

Cough syrup 0.95 400

Antibacterial tablet 2.42 22

Topical antiseptic 12.4 16


239

VI.3. PVA

VI.3.1. Evaluation of MW and tacticity of PVA by NECEEM of a polymer

and a dye

A variety of nonaqueous and aqueous CE methods for the characterization

of synthetic polyelectrolytes, including CZE, CGE and CIEF, have been

described [Clos, 1998; Grosche, 2000; Borisch, 2000; Engelhardt, 2004; Cottet, 2005].

Using CE, information about size, shape, surface charge and formation of

intramolecular associates can be gained [Engelhardt, 2004]. Further,

polyelectrolytes have been separated by CGE using solutions of nonionic

polymers as sieving media [Borisch, 2000; Engelhardt, 2004; Cottet, 2005; Welch,

2001; Starkweather, 2000; Cottet, 1997]. Models describing the electrophoretic

mobility of polyampholytes in free solution CZE have been developed [Long,

1998], and CZE has been also used to study both the polymerization degree and

the sulfonation rate of polyestyrenesulfonates [Cottet, 2000]. MECK has been used

to characterize highly charged polysaccharides (heparins) [Stefansson, 1994], and

polyacrylic acids [Collet, 1996], as well as to study the synthesis progress and

composition of ionic copolymers [Aguilar, 2002]. However, the characterization of

non-charged polymers using CE has been scarcely investigated. In this

connection, polyethylene glycols have been analyzed by CZE previous

derivatization with an anhydride, which provides chromophore groups and

electrical charges at both polymer ends [Wallingford, 1996; Barry, 1998]. In a

previous work [Beneito-Cambra, 2009-A], we described a CZE method to

characterize and evaluate PVP; for this purpose, we used the azo-dye CR which

forms a charged and colored PVP–CR complex. The electropherograms of PVP–

CR mixtures were interpreted at the light of the NECEEM theory, which was

developed by Krylov et al. [Berezovski, 2002; Krylov, 2003; Drabovich, 2006; Lin,


240

2008; Krylov, 2006; Krylov, 2007] to obtain information about proteins and DNA

fragments using fluorescent markers.

PVA is a synthetic polymer which is widely used for a variety of purposes

within the fields of cosmetic, pharmaceutical and food technologies.

Dependingonthe route of synthesis, PVA with a different tacticity is obtained.

Tacticity or stereoregularity is a characteristic feature of those polymers which

have repeating adjacent chiral centers along the main chain. Tacticity depends on

the class percentages of pairs of adjacent monomers or diads. The two possible

classes of diads are: m or meso (with the same orientation) and r or racemic (with

opposite orientation). Accordingly, three classes of units constituted by three

adjacent monomers or triads can exist: mm, mr and rr . The relative percentages

of mm, mr and rr triads, established by 1H NMR, or preferably by 13C NMR, are

normally used to evaluate PVA tacticity [Sánchez, 2000; Moritani, 1972; Wu, 1977;

Fukae, 2000; Wu, 1973].

As far as we know, CE methods for PVA characterization have not been

reported, and the possibility of evaluating the tacticity of polymers using CE

methods has not been investigated either. In this work, we have applied the

NECEEM principles to the study of the electropherograms obtained by injecting

PVA–CR mixtures. The formation of complexes between PVA and azo-dyes has

been known for decades [Fraunenfelder, 1974; Ikkai, 1996; Atkin, 2001; Ikkai, 1994;

Tsujimoto, 2002]. When excess borate was added to both the injected PVA–CR

mixtures and the BGE, the expected NECEEM pattern for a mixture of a non-

charged macromolecule and a charged marker was obtained. Commercial PVA

samples with different molecular masses, also differing in tacticity, were studied.

The electropherograms of PVA–CR mixtures provided information about the

electrophoretic mobility, maximal stoichiometry, thermodynamic stability

constant and pseudo first-order dissociation rate constant of the PVA–CR


241

complex. These parameters were observed to depend on both molecular mass and

tacticity of PVA.

VI.3.1.1. Effect of PVA on the UV–Vis absorption spectrum of CR

The formation of PVA–CR complexes has been described [Fraunenfelder,

1974; Ikkai, 1996; Atkin, 2001; Ikkai, 1994; Tsujimoto, 2002]. As indicated in section

III.2.3.3, the formation of the complexes was first studied by filling the capillary

with PVA–CR mixtures containing 20 mM borax. As illustrated in Fig. VI.17 for

the 49 kDa PVA sample, the UV–Vis spectrum of a 4 mM CR solution was

largely modified when the mixture also contained increasing PVA

concentrations.

300 400 500 600

Wavelength (nm)

400

200

0

Abs

orba

nce

(mA

U)

600

q = 0

q = 9

q = 12

q = 3

q = 6

Fig. VI.17. UV–Vis absorption spectra obtained by filling the capillary

with solutions containing 20 mM borax, 4 mM CR and the following PVA

concentrations (49 kDa): 0, 12, 24, 36 and 48 mM (the resulting q values

are indicated on the traces).

Thus, from q = [monomer]/[dye] = 0 to 6, the molar absorptivity at the maximum

of the main absorption band increased in a ca. 30%, and a large bathochromic


242

shift of about 40 nm was also observed (from 479 to 519 nm). Similarly, an

intensity increase of ca. 55% and a bathochromic shift of ca. 50 nm (from 489 to

539 nm) were observed with a conventional spectrophotometer when 0.4 mM

PVA was added to a 0.1 mM CR solution (spectra not shown). This implies a

major change in the physico-chemical environment of CR [Olsen, 1975]. The large

modification of the CR spectrum could be partially due to replacing of water

molecules attached to the polar locations of CR by the polar groups of the

polymer; however, as discussed below in section VI.3.1.4, another possible

reason is the stacking of dye ions in proximity to each other within the structure

of the PVA–CR complex. An absorptivity decrease at all wavelengths was also

observed when q > 6. This could be due to an increase of the refraction index of

the solution or to the optical screening of the dye in the presence of a large

polymer excess.

VI.3.1.2. Selection of working conditions

In Fig. VI.18, traces A to D, electropherograms of mixtures of CR (4mM)

and PVA (15 kDa, increasing concentrations) obtained in a BGE containing 25

mM borax are given. The injected mixtures were also equilibrated with borax;

however, 20 mM borax was used to preserve sample stacking. Pre-equilibration

with borax improved peak repeatability. In Fig. VI.18, traces E and F,

electropherograms obtained by injecting 2.5 and 4 mM CR solutions,

respectively, in the absence of PVA, are also shown. Truncation of the peak for

the 4 mM CR solution was attributed to the local concentration increase

produced by stacking, followed by precipitation of the dye. Truncation of this

peak was not observed when PVA was present in the injected solution with q ≥ 1.

According to the NECEEM theory, when a solution containing an uncolored

macromolecule and a colored charged marker is injected into the capillary, two


243

peaks with a superimposed exponential decay region in the middle should be

observed [Berezovski, 2002; Krylov, 2003; Drabovich, 2006; Lin, 2008; Krylov, 2006;

Krylov, 2007]. Thus, in Fig. VI.18, traces A to D, the first band was attributed to

the PVA–CR complex, and the peak that followed was assumed to be contributed

by both the initial CR excess in free form and the dye released by the complex

during migration (contributing mainly to the left half of the peak). As q increased

(from traces A to D), the area of the band due to the PVA–CR complex

increased, and the area of the peak due to the free dye decreased. Above q ≈ 4 the

electropherograms showed the single band of the complex, which progressively

widened when q further increased (trace D). In addition, a BGE containing 20

mM Na2HPO4 (pH 10) instead of borax was tried. Mixtures containing 4 mM CR

and 16 mM PVA (q = 4) were injected; however, a low intensity wide band due

to the PVA–CR complex, and a large peak and exponential decay due to the free

dye, were observed (electropherograms not shown). Thus, owing to the better

shape and higher intensity of the complex band, the BGE containing a borax

excess was preferred.

The time required to equilibrate the mixtures before injection was studied.

For this purpose, aliquots of a solution containing 20 mM borax, 4 mM CR and

16 mM PVA monomers (49 kDa, q = 4) were injected at regular time intervals

after mixing the reagents. The area due to the remaining complex, APVA-D, was

estimated as indicated in Fig. VI.18, traces A to D, by doubling the area of the

left half of the complex band. The rest of the area, due to both the initial free dye

and the dye released by the complex during migration, was measured as

ATotal−APVA-D. A slow increase of APVA-D (ca. 8%), a decrease of the rest of the

area (ca. 20%), and a small increase of the electrophoretic mobility of the

complex (ca. 4%), were observed during the first 2 h after mixing the reagents

(sequence of electropherograms with time, not shown). This suggested a slow


244

reorganization of the complex involving an increase of complex stability and

compactness, or a decrease in its dissociation rate, or both processes at a time.

Thus, to obtain reproducible electropherograms in the experiments that followed,

sample injection was performed with a delay of ca. 2–3 h after mixing the

reagents.

0

100

200

Abs

orb

ance

at 5

00

nm

(mA

U)

Time (min)0 2 4 6 8

C q = 3

B q = 2

q = 1AEOF

300

q = 9D

APVA-D / 2

EF

Fig. VI.18. Electropherograms of mixtures of CR (4 mM) and PVA (15

kDa, increasing concentrations) (A to D). The q values are monomer/dye

molar ratios. The procedure used to calculate APVA-D (used to construct Fig.

VI.19) is indicated on the traces. Traces E and F are electropherograms of

2.5 and 4 mM CR, respectively. The BGE contained 25 mM borax (pH 9),

and all the injected solutions contained 20 mM borax.

VI.3.1.3. Maximal stoichiometry of the PVA–CR complex and its relationship

with log MW and tacticity

Series of electropherograms also obtained with 4 mM CR and increasing

PVA concentrations (increasing q values) were used to estimate the saturation

point or maximal stoichiometry of the PVA–CR complexes, qsat, for all the PVA


245

samples. As shown in Fig. VI.19 for the 15 kDa PVA sample, when q was

increased the area of the PVA–CR complex, APVA-D, increased linearly up to q ≈

4, and the rest of the total area decreased proportionally. When q ≥ 5, that is,

above the saturation point, the peak due to the excess dye was not observed any

longer, and APVA-D decreased steadily. This agreed with the decrease in the

absorptivity of the complex which was observed by recording spectra at large q

values (Fig. VI.17).

0

100

0 2 4 6 8 10q = [monomer] / [CR]

Atotal – APVA-D

APVA-D

Fig. VI.19. Relative areas obtained from electropherograms of a series of

solutions containing 4 mM CR and increasing PVA (15 kDa)

concentrations in the presence of 20 mM borax. Other conditions as in Fig.

VI.18. The continuous and dashed lines join points corresponding to the

area assigned to the PVA–CR complex (APVA-D, estimated as indicated in

Fig. VI.18) and the rest of the area under the peaks, respectively.

The other PVA samples behaved similarly, although with differences in the

location of the saturation point indicating the maximal stoichiometry of the

complex. In order to establish the saturation point of PVA complexes, qsat, as

accurately as possible, mixtures with q values close to the expected qsat values


246

were injected; however, repeatability of the electropherograms was poor when q

≈ qsat. Therefore, the qsat values used in the discussion that follows were

established for the different PVA samples as the point where the linear

extrapolation of the decrease of ATotal−APVA-D crossed zero (Fig. VI.19, dashed

line).

In Fig. VI.20 (full symbols), the qsat values obtained in this way for the

PVA samples were plotted against log MW. As observed, H samples formed a

clearly resolved group with respect to the M+L samples (see section III.2.3.3).

Also, within each tacticity group, qsat decreased as log MW increased. Further, the

upper and lower limits of the qsat range were similar for the H and M+L sample

groups, starting at qsat ≈ 4.9 at a low molecular mass, and decreasing down to qsat

≈ 3.5 at a large molecular mass. The two L samples, which had very large

molecular masses, gave both qsat values close to 3.5. Thus, qsat decreased from

ca. 4.9 to ca. 3.5 at increasing molecular masses, but this variation took place at

different log MW values depending on tacticity.

5.0

1.5 2.0

4.5

4.0

3.5

Log MW

q sa

tand

q sa

t,c

Fig. VI.20. Plots of the maximal stoichiometry of the complex against log

MW without (qsat, full symbols) and with correction for the acetyl

percentage (qsat,c, empty symbols). Symbols indicating tacticity groups: H

(diamonds), M (circles) and L (triangles).


247

Next, a correction of the qsat values, thus to take into account the different

proportions of residual acetyl groups in the PVA samples was tried. The molar

proportions of residual acetyl groups per mol of monomers, nac, for the PVA

samples used in this work, were given in section III.2.3.1. In a PVA molecule,

acetyl groups could reduce the number of OH groups which are actually

available to link the dye ions. Thus, in nac × 100% acetylated PVA, only

(1−nac)×100% of the monomers would be available for bonding; however, this

should not reduce the complexing capacity of PVA in an equivalent

(1−nac)×100% factor, since acetylated monomers can also perform as

nonbonding bridges between bonded monomers. Nevertheless, we studied next

the effect which would have on qsat the extreme situation in which the

complexing capacity of PVA would be reduced in a full (1−nac)×100% factor.

Thus, the correction applied was: qsat,c = qsat/(1−nac). As shown in Fig. VI.20

(empty symbols), full correction for the acetyl percentage essentially confirmed

the conclusions obtained above using uncorrected qsat values concerning both the

decrease of qsat at increasing molecular masses and the noticeable difference

between the H and M+L tacticity groups.

VI.3.1.4. Structure of the complex

When qsat ≈ 4.9, each dye ion could be bonded by a maximum of four and

probably a minimum of two monomers (since CR is a symmetrical structure),

leaving an average of 0.9–2.9 non-bonded monomers per dye ion, respectively.

Similarly, when qsat ≈ 3.5, each dye ion could be bonded by a maximum of three

and a minimum of two monomers, leaving an average of 0.5–1.5 non-bonded

monomers per dye ion, respectively. In both cases, a small number of non-

bonded monomers are available to perform as bridges between adjacent dye ions.

Thus, in all the possible scenarios, the number of non-bonded monomers per dye


248

ion is very low, which suggests a proximity between the dye ions. As depicted in

the temptative structure of Fig. VI.21, stacks of dye ions by pairs, or by groups

constituted by a higher number of dye ions, could be formed. As proposed in this

figure, it seems reasonably to stack the dye ions by alternating the sulfonate and

amino groups, rather than putting together all the sulfonate groups at one side

and all the amino groups at the other side of the stack. Also, from a geometrical

point of view, it seems reasonably to link the PVA monomers with the alternated

sulfonate and amino groups though hydrogen bonds. As indicated in the

literature, the azo groups are also possible sites for hydrogen bonding [Atkin,

2001; Olsen, 1975.]; however, below the saturation point, and owing to the low

stoichiometry, the number of available monomers per dye ion is rather short.

Then, hydrogen bonding of the PVA monomers with both amino and azo groups,

which are located in outer and inner sites of the dye ion, respectively, seems to be

less likely than the structure proposed in Fig. VI.21 However, the probability of

bonding the OH groups with azo groups should increase after the saturation

point, when an excess of monomers are available.

Dye stacking, resulting in a large absorptivity increase and blue shifting of

the absorption maximum, has been described in solutions of plant pigments when

certain ligands and Mg2+ are present [Ellestad, 2006]. Thus, dye stacking could

explain both the low qsat values of Fig. VI.20 and the very large modification of

the absorption spectrum when PVA is added to CR solutions (Fig. VI.17).

Further, the distance between donor–acceptor atoms in adjacent stacked dye ions

should be constricted by the distances between pairs of adjacent OH groups

along the PVA chain, and these later are longer for r than for m diads. Thus, in

PVA samples having a larger proportion of r diads, adjacent dye ions could be

stacked at longer distances from each other than in samples with larger

proportions of m diads. As discussed below, this could also explain the


249

correlations found between other electrophoretic parameters and PVA tacticity as

established by 13C NMR.

N

N

-

NN

N H

H

NHH

S

OO

O

S

O-

OON

N

S

O-O

NN

O

S

O-

OO

NH

H

OH

O H O

H

O H

OH

OH

O

H

OH

NH H

NHH

OH

OH

H HN

S

O-O

O

OH

S

O -

O

O

OH

Fig. VI.21. Temptative structure for two adjacent PVA–CR complex units

(with two stacked dye ions).

The complex is probably compelled to adopt a given structure when an

excess of either dye ions or unbound monomers is present. This could explain the

excellent reproducibility of the electropherograms when q < qsat or q > qsat,

respectively. Therefore, poor reproducibility of the electropherograms when q ≈

qsat could be due to the different ways the dye ions could be arranged within the

complex when the available monomers are either in a small defect or a small

excess with respect to qsat.


250

VI.3.1.5. Influence of molecular mass and tacticity on the electrophoretic

mobility of the complex

Electropherograms obtained with PVA samples of increasing molecular mass,

also corresponding to different tacticities, are shown in Fig. VI.22. These

electropherograms were obtained with a small CR excess with respect to the

saturation point. Thus, traces A and C, which correspond to complexes with qsat

= 4.51 were obtained at q = 4, and the other traces, which correspond to

complexes with qsat = 3.51 were obtained at q = 3. As further commented in

section VI.3.1.6, this was important to distinguish the AD area from that of the

exponential decay contribution, Ae. As observed in Fig. VI.22, the

electropherograms of M+L samples (traces C–E) showed a sharper complex band

than that of the H samples (traces A and B). In addition, within each tacticity

group, the electrophoretic mobility of the complex was reduced at increasing

molecular mass (A–B and C–D pairs). The relationships among electrophoretic

mobility of the complex formed in the presence of an excess dye, molecular mass

and tacticity are better recognized in Fig. VI.23 (full symbols). Within each

tacticity group, the absolute electrophoretic mobility decreased slightly at

increasing log MW values. Therefore, electrophoretic mobilities indicated that

charge density of the complexes decreased at increasing molecular masses. In

addition, absolute mobility increased when the rr /mm ratio decreased between

the H and M sample groups. Therefore, absolute mobility increased when the

average distances between the OH groups of adjacent monomers decreased as a

result of the reduction of the proportion of r diads, probably giving rise to an

increase of complex compactness.

In free solution, the electrophoretic mobility of polyelectrolytes with the

same linear structure but with different molecular masses is very similar [Grosche,

2000; Long, 1998; Cottet, 2000]. This is due to the almost identical charge-to-


251

volume ratio which is achieved when units with a given charge-to-volume ratio

are increasingly added to the polyelectrolyte. This electrophoretic behavior of

polyelectrolytes has been called the free draining regime [Cottet, 2000].

Time (min)

AD

B

AD

C

AD

D

AD

A

APVA-D / 2

0

100

50

150

Ab

sorb

anc

eat 5

00

(mA

U)

0 2 4 6 8 10

200

E

AD

EOF4; 4.5

3; 3.5

4; 4.5

3; 3.5

3; 3.5

Fig. VI.22. Electropherograms of PVA–CR mixtures containing 20 mM

borax, 4 mM CR and the following PVA monomer concentrations: (A, C)

16 mM and (B, D, E) 12 mM. The molecular masses were: (A) 15, (B) 31,

(C) 49, (D) 100 and (E) 205 kDa. Sample tacticities: H (A, B), M (C, D)

and L (E). The numbers on the traces are q and qsat values (in italics). The

expanded parts show how the AD areas were estimated; APVA-D values were

estimated as indicated in trace A. Other conditions as in Fig. VI.18, traces

A–D.


252

25

30

1.0 1.5 2.0Log MW

-µ·1

05(c

m2

V-1

s-1)

-µ[q

sat+

(VD

/ Vm)]

·10

4(c

m2

V-1

s-1 )

40

50

60

Fig. VI.23. Electrophoretic mobility of the PVA–CR complex against log

MW, without (full symbols, dotted lines and axis at the left) and with

correction for the complex stoichiometry (empty symbols, dashed lines and

axis at the right); correction was performed with both VD/Vm = 15 and 10.

Symbols indicating tacticity groups: H (diamonds), M (circles) and L

(triangles). Other conditions as in Fig. VI.22.

As occurs with polyelectrolytes, the mobility of the PVA–CR complexes could

also reach a constant value at increasing molecular masses, not further dependent

on the molecular mass of PVA. However, in the case of the PVA–CR complexes

formed in the presence of an excess CR, to increase the molecular mass of the

polymer is not the only factor to be taken into account for a free draining regime

to be reached. At increasing molecular masses, both the stoichiometry and the

apparent charge density of the saturated complex, qsat, should be also maintained

constant. As discussed above in section VI.3.1.3, stoichiometry of the complex

formed in an excess dye varied with both molecular mass and tacticity; however,

to show if a free draining regime is approached at high molecular masses, a

model taking into account the stoichiometry variations can be constructed. For

this purpose, the concept of average electrophoretic mobility per complex unit,

µunit, can be used. This parameter was defined as the mobility due to a unit

constituted by a single dye ion and the average number of monomers directly


253

attached to that ion, plus the average share of monomers which are necessary to

link the complexed dye ion to the neighboring complex units. The mobility per

complex unit, µuni, should be directly proportional to the charge of a dye ion, 2,

and inversely proportional to the volume of the complex unit:

2unit

D sat m

f

V q Vµ =

+ (E.VI.6)

where f is a coefficient of proportionality, VD is the volume of a dye ion bound to

the polymer chain, and Vm is the average volume of a monomer in the complex.

If both sides of equation E.VI.6 are multiplied by the electrophoretic mobility of

the complex, µ, and the equation is reorganized, we have:

[ ]2( / )sat D

m unit

fq V Vm

V

µ µµ

= + (E.VI.7)

Therefore, if a free draining regime would be reached at large molecular masses,

the product µ[qsat+ (VD/Vm)] would also reach a constant value. Since the VD/Vm

ratio was unknown, two approximations were used: first, VD/Vm was taken as the

ratio of the molecular masses of the dye ion and the monomers, 651/44 ≈ 15, and

second, VD/Vm was taken as the ratio of the total number of C, H, O and N atoms

involved, 68/7 ≈ 10. These two values of VD/Vm are rough approximations;

however, as shown below, the use of any of them led to essentially the same

conclusions. In Fig. VI.23 (empty symbols), product µ[qsat+ (VD/Vm)] was plotted

against log MW. As observed in this figure, the differences among tacticity groups

were enhanced upon correction of the electrophoretic mobility of the complex by

the effects of complex stoichiometry. This correction confirmed the independent

reduction of the absolute mobility at increasing log MW values for the H and

M+L tacticity groups. Therefore, both a higher molecular mass and a higher

rr /mm ratio implied a larger volume of the monomer–dye complex units, that is,

a smaller packing density of the complex. This agreed with the longer distances

between the OH groups in r diads compared to m diads. On the other hand, the


254

corrected mobilities of Fig. VI.23 also indicated that the complex did not reach a

free draining regime at increasing molecular masses. This meant that coefficient f

in equation E.VI.7 was not constant within any molecular mass range, that is,

packing density of the complex decreased at increasing molecular masses for all

the PVA samples used in this work.

VI.3.1.6. Stability and dissociation rate constants of the complex

In Fig. VI.22, it can be also observed that the area of the peak due the free

dye was larger for the H (A and B traces) than for the M+L (C–E traces) tacticity

groups. This indicated either a higher complex stability or a slower dissociation

rate, or both features at a time, for the H group in comparison to the M+L groups.

Thus, next the stability and dissociation rate constants of PVA–CR complexes

were estimated. For this purpose, three areas are needed: (i) APVA-D, due to the

PVA–CR complex; (ii) AD, due to the free dye present in the initial equilibrium

conditions; and (iii) Ae, generated by the dye released by the complex during

migration. In the electropherograms of Fig. VI.18, AD could not be distinguished

from Ae. This was attributed to the use of q values far from the maximal

stoichiometry of the complexes, qsat. Thus, the free dye concentration should be

very low at large values of q, and conversely, at low q values, the large initial

concentration of the free dye made also difficult to distinguish its contribution

from that due to the dye released during complex migration. However, as shown

in the expanded regions of the electropherograms of Fig. VI.22, at q values

slightly lower than qsat, it was possible to distinguish between these two

contributions. Therefore, the maximum of the PVA–CR complex peak was

located, and as indicated in the same figure (trace A), the area of the left half of

the band was taken as APVA-D/2. In this band half, the contribution to the area due

to the dye released during migration was assumed to be negligible (since the free


255

dye migrates towards increasing migration times). Then, the area at the right of

the first depression of the free dye peak (see the expanded parts in Fig. VI.22)

was assigned to AD, and Ae was calculated as the total area minus the

contributions of the complex and initially free dye: Ae = ATotal −(APVA-D + AD).

These assignments probably implied a systematic error in the estimation of AD,

and therefore also in the calculation of the stability constants; however, this made

possible to compare the constants obtained with the different PVA samples. To

estimate stability constants, the equilibrium molar concentration of free dye,

[D]eq, was obtained as:

[ ] Deq

D

AD

bε= (E.VI.8)

where bεD is the optical path multiplied by the molar absorptivity of the dye. The

equilibrium molar concentration of the complex is given by:

[ ] PVA D eeq

PVA D D

A APVA D

b bε ε−

−

− = + (E.VI.9)

where εPVA-D is the molar absorptivity of the complex. Instead of reasoning about

complex formation in terms of qsat monomers per dye ion, calculations are much

simpler if the formation of a 1:1 complex is assumed, being the “ligand” the

complexing units formed by groups of qsat monomers. The stability constant, Ks,

is then given by:

[ ] [ ]0 0

1

(1 (1/ ))s

RK

C R D

+=+ −

(E.VI.10)

where [C]0 and [D]0 are the total analytical molar concentrations of the

complexing polymer units and the dye, respectively, and where R is given by:

[ ][ ]

( / )eq PVA D D PVA D e

Deq

PVA D A AR

D A

ε ε− −− +

= = (E.VI.11)


256

The value of [C]0 can be calculated as:

[ ] [ ]0 0sat

nC PVA

q= (E.VI.12)

where n is the average number of monomers along the polymer chains, and

where [PVA]0 is the total analytical molar concentration of the polymer in mol

L−1. The molar absorptivity ratio εD/εPVA-D = 0.77 was obtained with a

spectrophotometer at 500 nm by measuring several PVA–CR mixtures with q

values sligthly lower than the respective qsat values; in these conditions, the

formation of a predominant complex with a 1:1 stoichiometry, in which the

“ligand” was constituted by qsat monomers, was assumed. In Fig. VI.24, part A,

the resulting values of log Ks for q = 2 and 3 (full and empty symbols,

respectively) were plotted against log MW. Contrary to that observed for other

CZE parameters, log Ks values did not show any significant trend concerning to

either molecular mass or tacticity.

The electropherograms with q = 2 used to obtain log Ks were further

processed to estimate pseudo-first-order rate constants for the dissociation of the

PVA–CR complexes. For this purpose, half-life measurements were made, and

rate constants were estimated as k = ln2/t1/2, where t1/2 is the half-life. The

exponential decay curve within the region close to the peak of the excess dye,

where the contribution of the remaining PVA–CR complex was small, was used.

Five measurements of the half-life were made by selecting 5 different starting

points on the decay curve of each electropherogram of series of triplicated

injections. The starting points were evenly spaced from each other in about 5 s.

Estimations of k were obtained with low uncertainties (ca. 4.3%). In Fig. VI.24,

part B, the average values of k were plotted against log MW. Within each tacticity

group, the dissociation rate constant of the complex was reduced at increasing

molecular masses; in addition, H samples showed differences with respect to the

M+L samples.


257

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

Log MW

2.01.51.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

A

B

Fig. VI.24. Plots of (A) log Ks and (B) k vs. log MW. Data were calculated

from electropherograms obtained with (A) q = 3 and 2 (full and empty

symbols, respectively) and (B) q = 2. Symbols indicating tacticity groups:

H (diamonds), M (circles) and L (triangles). Other conditions as in Fig.

VI.22.

CHAPTER VII

ENZYMES

Chapter VII. Enzymes

261

VII.1. Intact enzymes by CE

VII.1.1. Identification of enzymes for the detergent industry by CZE of the

intact proteins

Today enzymes constitute important components of laundry cleaners,

dishwashers and other cleaning products [Novozymes, 2002]. Since the

introduction of Alcalase, an alkali-tolerant bacterial protease in 1963 [Novozymes,

2002], the role of enzymes in cleaning products has changed from that of a minor

additive to becoming a key ingredient [Olsen, 1998]. Enzymes for cleaning

products constitute the largest segment of the world market for industrial

enzymes [Novozymes, 2002]. Cleaning power enhancement by enzymes leads to a

reduction of washing times and temperatures, with the subsequent savings of

water and energy. Further environmental advantages arise from the lower

consumption of surfactants, hypochlorite and alkalis, with the additional benefit

of a better care of fabrics during washing [Olsen, 1998].

In spite of their interest in the detergent industry, and in environmental

and toxicological studies [www.heraproject.com.], identification and quantification

methods for enzymes in cleaning products have been scarcely investigated.

Enzymes are commonly detected and quantified by monitoring the hydrolysis of

a substrate, or by precipitation with an antiserum [Novozymes, 2002; Olsen, 1998;

Dunn, 1971; Kulkarni, 1999; Lorentz, 2000]. Polyacrylamide gel electrophoresis has

been used to separate proteases in cleaners [Deschreider, 1972]. Protein

characterization and quantification is frequently carried out by hydrolysis

followed by chromatographic determination of the resulting amino acids [Phillips,

1983]. Amino acid profiles can be established by a variety of separation and

detection techniques, including GC previous derivatization with ethyl

chloroformate [Gimeno-Adelantado, 2002; De la Cruz-Cañizares, 2004], or with a


262

silylating reagent [Rampazzi, 2002], and a wide variety of HPLC methods [Molnár-

Perl, 2000; Molnár-Perl, 2001; Tcherkas, 2001-A; Tcherkas, 2001-B; Concha-Herrera,

2007; Hanczkó, 2007; Chernobrovkin, 2007; Pereira, 2008]. The resulting amino acid

profiles have been used to predict the enzyme class [Beneito-Cambra, 2008;

Beneito-Cambra, 2009-B]. However, amino acid analysis using hydrolysis followed

by either GC or HPLC requires long analysis times.

Capillary electroseparation techniques have the advantages of being

simple, fast and highly efficient. The application of these techniques to the

analysis of peptides and proteins has been periodically reviewed [Jmeian, 2009;

Dolník, 2006; Dolník, 2008; Cifuentes, 1997]. MECK has been used to analyze

Savinase (a protease) and various analogues in cultivation broth [Vinther, 1992-B],

and both CZE and MEKC have been applied to the identification of serine

protease analogues [Eriksen, 1996].

The aim of this work was to examine CZE of intact proteins as a means of

classifying and identifying enzymes in industrial raw materials of the detergent

industry. The four main enzyme classes used in cleaners were included in this

study, i.e. proteases, amylases, lipases and cellulases. Charge and structural

changes of proteins are largely dependent on pH; thus, in order to gather more

information for enzyme identification, both a basic and an acid BGEs were used.

An alkaline borate buffer of pH 9, also containing PVA as dynamic coating to

hinder protein adsorption [Ruiz-Ángel, 2002], was selected. On the other hand, an

acidic BGE containing urea, iminodiacetic acid as low conductive isoelectric

buffer [Righetti, 1997; Bossi, 1997; Righetti, 1998; Capelli, 1998; Stoyanov, 1997] and

HEC to inhibit adsorption, was also used. Due to their much reduced

conductivities, large concentrations of isoelectric buffers are compatible with

high voltage gradients, thus further reducing adsorption and favouring high

resolution within short migration times [Righetti, 1997; Bossi, 1997; Righetti, 1998;

Capelli, 1998]. Further, the total amount of protein in the samples was established


263

by the Bradford’s method. This made possible to use total peak areas of the

electropherograms obtained with both BGEs to establish relative sensitivities,

which were also useful for enzyme identification. The enzymes used in this work

are indicated in Table III.2.

VII.1.1.1. CZE with a basic BGE

With the basic BGE, most enzymes gave rise to a single predominant peak

or a group of partially resolved intense peaks, which was frequently followed by

several small peaks (Fig. VII.1, parts A to D).

Time (min)

Sav

Eve

0

400

800

Ab

sorb

an

ce a

t 2

14

nm

(m

AU

)

Alc

Esp

2 4

EOF

A

0

200

400

Ter

Dur

2 4

Sta

EOF

B

0

40

80

120

Lx

Ls

EOF

2 4

C

EOF

0

40

80

End

Car

Cel

2 4

D

Fig. VII.1. Electropherograms of enzyme brands in the basic BGE (pH

9.0): (A) proteases, (B) amylases, (C) lipases and (D) cellulases.

Experimental conditions in text (sections III.3.1.3 and III.3.1.4).

For all proteases (Fig.VII.1, part A), the main peak was located within the

cationic migration region in the vicinity of the electroosmotic flow (EOF) time

(ca. 2.14 min). At pH = 9.0 charge density should be low for proteases (8.4 < pI

< 11), which agrees with the cationic behaviour of the main peak. The other


264

enzymes (Fig.VII.1, parts B to D), with the exception of Sta, gave also an

intense peak or a group of peaks within the anionic migration region. Sta gave

two partially resolved peaks close to the EOF time, but within the cationic

region. An amylase, Ter, and a lipase, Lx, showed two peaks of similar intensity,

with baseline resolution, instead of a single predominant peak (Fig.VII.1, parts

B and C). The presence of a second intense peak close to the EOF time made Ter

to be easily distinguishable from its engineered variant Dur (Fig.VII.1, part B).

Similarly, the sharp intense peak within the cationic region made Lx to be easily

distinguishable from the other lipase, Ls (Fig.VII.1, part C). Also, some

cellulases as Cel and End (Fig.VII.1, part D) showed a division of the main

band into several partially resolved intense peaks. In addition to the main peaks,

the electrophoretic profiles of most enzymes also provided several small peaks

which can be useful as fingerprints for identification.

Intra- and inter-day repeatabilities in this BGE were obtained by injecting

a 0.01% Alc aqueous solution. Five injections per day during three consecutive

days were performed. Intra- and inter-day migration times showed RSDs lower

than 3.5 and 7.5%, respectively. More than 100 injections were performed

without the need of replacing the capillary.

VII.1.1.2. CZE with an acid BGE

In agreement with literature, an excellent current stability was observed in

the acid BGE [Piergiovanni, 2005]. The EOF was also very low in this medium. As

shown in Fig. VII.2, parts A to D, the electropherograms also showed several

distinctive features according to both enzyme class and the nature of the

particular enzyme. Thus, proteases gave a predominant peak together with

several small peaks within the 5.5 – 6.5 migration time region (Fig. VII.2, part

A). Further, Eve and Sav also gave an additional and quite characteristic intense


265

sharp peak at ca. 3.5 min. The presence of two large peaks in these two enzymes

could be due to the occurrence of two predominant protein fractions in the raw

material. It should be noted that Esp and Sav are two closely related proteases

with well known three-dimensional structures, and a high degree of structural

similarity [Georgieva, 2001]. However, in spite of this structural similarity, these

two enzymes can be clearly distinguished by CZE in the acid BGE.

Time (min)

0

100

200

Sav

Eve

Alc

Esp

A

4 6

0

40

80

120

Ter

Dur

StaB

4 6

0

20

40

Lx

Ls

C

4 6

0

20

40

60

End

Car

Cel

D

4 6

Ab

sorb

anc

e at

21

4 n

m (

mA

U)

Fig. VII.2. Electropherograms of enzyme brands in the acid BGE (apparent

pH 3.1): (A) proteases, (B) amylases, (C) lipases and (D) cellulases.

Experimental conditions in text (sections III.3.1.3 and III.3.1.4).

Concerning to amylases (Fig. VII.2, part B), Ter showed a single

predominant peak, rather than the two large peaks which were observed in the

acid BGE (Fig. VII.1, part B). As observed in the basic BGE (Fig. VII.1, part

C), lipases also gave rather characteristic patterns in the acid BGE, with several

partially resolved sharp peaks (Fig. VII.2, part C). Thus, both Lx and Ls were

clearly distinguishable by CZE using either the basic or acid BGEs. Concerning

to cellulases (Fig. VII.2, part D), Car gave two peaks, whereas Cel and End


266

gave a single asymmetric peak. Using Alc, migration time intra- and inter-day

repeatabilities were below 2.7 and 5.3%, respectively. At least 120 injections

were performed without the need of replacing the capillary. Therefore, both in

the basic and acid BGEs, most enzymes gave characteristic patterns which

allowed class identification, and in many cases the electropherograms also

showed enough distinctive details to allow the safe identification of the

individual enzyme within its class.

VII.1.1.3. Relative sensitivities and application to enzyme identification

In order to establish relative sensitivities, the protein contents in the raw

enzymes were previously measured by the Bradford’s method. The protein

concentrations found using BSA as reference are given in Table VII.1.

Table VII.1. Class, commercial name, protein content and relative sensitivities of the enzyme

industrial concentrates used in this work.

Relative sensitivityc)

Class Commercial name Abbreviation Protein content (% BSA)b)

Basic BGE

Acid BGE

Protease

Alcalase 2.5 L Alc 4.03 ± 0.03 1.0 1.0

Savinase 16L, Type EX Sav 1.81 ± 0.07 1.8 1.7

Everlase 16L, Type EX Eve 1.24 ± 0.03 2.8 1.0

Esperase 8.0L Esp 2.45 ± 0.05 1.5 1.4

Amylase

Termamyl Ultra 300L Ter 2.95 ± 0.02 1.9 1.1

Duramyl 300L, Type DX Dur 4.87 ± 0.03 0.8 0.3

Stainzyme 12L Sta 2.69 ± 0.01 1.0 0.9

Lipase Lipolase 100L, Type EX Ls 1.79 ± 0.01 1.2 1.2

Lipex 100L Lx 2.90 ± 0.01 0.8 0.7

Cellulase

Endolase 5000L End 2.56 ± 0.01 1.1 1.0

Carezyme 4500L Car 0.74 ± 0.08 1.5 1.4

Celluzyme 0,7Ta) Cel 1.31 ± 0.06 4.9 0.4

a) Sample supplied as granular solid (the other samples were liquid concentrates) b) Estimated using the Bradford’s assay (calibration curve with 9 points) c) Relative sensitivities for the total area of the electrophoretic peaks (respect to Alcalase 2.5L)


267

Then, for each industrial enzyme a calibration curve was constructed. For this

purpose, industrial enzymes were diluted with water at several concentration

levels within the 0.2-20% v/v range, and aliquots were taken. Precipitation with

acetone, re-dissolution and injection in the capillary using both the basic and acid

BGEs were then performed. The plots of total peak area versus protein

concentration were linear (r > 0.992). From these plots, relative sensitivities were

established as follows:

r x AlcS S S= (E.VII.1)

where Sx and SAlc are the slopes for the assayed enzyme and Alc which was used

as reference, respectively. As shown in Table VII.1, the ranges were 0.8-4.9 and

0.3-1.7 for the basic and acid BGEs, respectively. The differences between

relative sensitivities were small in a number of cases, but several enzymes gave

rather characteristic values. Thus, Eve and Sav gave high sensitivities in the basic

and acid media, respectively, Dur gave low sensitivities in both media, and Cel

exhibited a very high sensitivity in the basic BGE but a very low one in the acid

BGE. As also deduced from Table VII.1, the differences among relative

sensitivities were predominantly due to the nature of the individual enzymes

rather than to their respective classes.

VII.1.1.4. Influence of surfactants commonly used in the formulation of

cleaning products

The influence of some common surfactants, widely used in the

formulation of cleaning products, on the migration times and areas of the

electrophoretic peaks was examined. For this purpose, solutions of surfactants

spiked with Alc were treated as indicated in section III.3.1.4. Using the basic

BGE, the electrophoretic profile of the enzyme (Fig. VII.3, part A) was slightly

modified in the presence of fatty alcohol ethoxylates (Dehydol LT-7) (Fig. VII.3,


268

part B); however, rather different profiles were obtained when the sample

solution contained anionic surfactants (Fig. VII.3, parts C and D). Similar

experiments were performed in the acid BGE. The influence of Dehydol LT-7

gave electropherograms similar to that of Fig. VII.2, part A for Alc; however, in

the presence of anionic surfactants, a significant increase in the retention time of

the enzyme peaks was observed (data not shown). Similar results were obtained

for selected enzymes of the other three classes. Consequently, the proposed

method for enzyme identification can be safely applied in the presence of non-

ionic surfactants, but will fail probably when anionic surfactants would be

present at large concentrations. Work addressed to reduce the interference of

anionic surfactants is in progress.

0

40

80A

20

0 4 8

0

10

D

0 4 8

0

10

20

C

Time (min)

Ab

sorb

ance

at 2

14

nm

(m

AU

)

B

0

40

80

Fig. VII.3. Influence of surfactants on the electrophoretic profile of Alc

(0.01%) in the basic BGE: (A) absence of surfactant, (B) 5% Dehydol LT-

7, (C) 5% LAS and (D) 5% LES. Other conditions as in Fig. VII.1.


269

VII.2. Classification of enzymes by MS

VII.2.1. Rapid classification of enzymes in cleaning products by hydrolysis,

MS and LDA

The first enzyme-containing detergent was commercialized in 1913;

however, enzymes were little used for cleaning purposes until the introduction of

Alcalase, an alkali-tolerant bacterial protease, in 1963 [Novozymes, 2002]. Since

then, the role of enzymes in cleaning products has changed from one of a minor

additive to becoming a key ingredient [Olsen, 1998]. Cleaning power enhancement

by enzymes leads to a reduction of washing times and temperatures, with the

subsequent savings of water and energy. Further environmental advantages arise

from the lower consumption of surfactants, hypochlorite and alkalis, with the

additional benefit of a better care of fabrics during washing [Olsen, 1998].

Mainly proteases, amylases, lypases and cellulases are used in the

formulation of modern cleaning products. Proteases are used to remove protein-

rich soil stains, including blood and grass. Amylases remove starch-containing

stains, and prevent starch from adhering to fabrics and dishes. Lypases help in

removing fat and edible oil stains. Finally, cellulases are used to remove fuzz and

pills (small balls of fabric) from cotton. In spite of the importance of these

enzymes in the detergent industry, and in environmental and toxicological studies

[www.heraproject. com], identification and quantification methods for enzymes in

cleaning products have scarcely been investigated. Enzymes are commonly

detected and quantified by monitoring the hydrolysis of a substrate, or by

precipitation with an antiserum [Novozymes, 2002; Olsen, 1998; Dunn, 1971;

Kulkarni, 1999; Lorentz, 2000].

Enzymes of different classes differ in molecular structure, and they also

have rather dissimilar amino acid profiles, which can be useful for enzyme


270

classification. After hydrolysis, the amino acid profile of the enzyme can be

established by a variety of separation and detection techniques, including GC

following previous derivatization with ethyl chloroformate [Gimeno-Adelantado,

2002; De la Cruz-Cañizares, 2004], or with a silylating reagent [Rampazzi, 2002],

and a variety of HPLC methods [Molnár-Perl, 2000; Molnár-Perl, 2001; Tcherkas,

2001-A; Tcherkas, 2001-B; García Alvarez-Coque, 1989; Concha-Herrera, 2007;

Hanczkó, 2007; Chernobrovkin, 2007; Pereira, 2008].

Useful sample classification methods without previous chromatographic

separation have been described by using MS. For this purpose, the samples have

been directly infused into the mass spectrometer using an ESI [Goodacre, 2002;

Gama-Melão, 2006; Ng, 2004; Peris-Vicente, 2005; Catharino, 2005] or an APPI

[Gómez-Ariza, 2006] ion source. Amino acid profiles obtained by protein

hydrolysis have been used as fingerprints to classify protein-binding media used

in works of art according to their biological sources [Peris-Vicente, 2005; Lletí,

2003], vegetable oils in accordance to their botanical origin [Lerma-García, 2007],

rice cultivars [Wang, 1998], and tea varieties [Alcázar, 2007], as well as to

authenticate high quality beer [Erbe, 2000]. Multivariate algorithms including

principal component analysis [Goodacre, 2002; Poulli, 2005], hierarchical cluster

analysis [Poulli, 2005], LDA [Peris-Vicente, 2005; Gómez-Ariza, 2006; Lerma-García,

2007], partial least-squares [Yang, 2002] and ANN [García-González, 2004], have

been used to treat the spectral data.

The aim of this work was to develop a quick and straightforward method

for enzyme identification and classification in cleaning products. For this

purpose, the enzymes were isolated by precipitation with acetone, hydrolyzed,

and the hydrolysates were directly infused in the ESI ion source of a mass

spectrometer. After normalization, the ion abundances of the amino acids were

used as predictors to construct LDA models for enzyme classification. The


271

procedure was validated by analyzing enzyme industrial concentrates and

laundry products. The enzymes used in this work are indicated in Table III.2.

VII.2.1.1. Mass spectra and normalization of the variables

After protein hydrolysis, the mass spectra of the enzyme industrial

concentrates showed the [M+H]+ ions of the following amino acids: Gly (m/z

76.1), Ala (m/z 90.1), Ser (m/z 106.1), Pro (m/z 116.1), Val (m/z 118.1), Thr (m/z

120.1), Cys (m/z 122.2), Ile/Leu (single common ion at m/z 132.2), Asn (m/z

133.1), Asp (m/z 134.1), Lys (m/z 147.2), Glu (m/z 148.2), Met (m/z 150.2), His

(m/z 156.2), Phe (m/z 166.2), Arg (m/z 175.2), Tyr (m/z 182.2) and Trp (m/z

205.5). A typical mass spectrum obtained from the hydrolysate of a protease is

shown in Fig. VII.4.

Rel

ativ

eab

und

ance

x 1

07

1.2

Va

l

Leu+Ile

Met

Ph

eAsn G

lu

His

Lys ArgAsp

Gly

Ala

Ser

Th

r

Tyr

Trp

Pro

0.4

0.8

0

Cys

80 200

Gly

Ala

Cys

0

Met

Ser0.05

m/z120 160

Fig. VII.4. Typical ESI mass spectrum of the hydrolysate of a protease.

The [M+H]+ ions of the amino acids used as variables in this study are

indicated.


272

In order to reduce the variability associated with the total amount of

protein recovered from the samples, normalized rather than absolute ion

abundances were used. For this purpose, two normalization procedures were

tried. In procedure A, the ion abundance of each amino acid was divided by the

sum of the ion abundances of all the amino acids in the corresponding spectrum.

In procedure B, the ion abundance of each amino acid was divided by each of the

ion abundances of the other amino acids in the corresponding spectrum. In this

way, and taking into account that 18 peaks were measured on each spectrum and

that a pair of peaks should be considered only once, (18×17)/2=153 non-

redundant ion abundance ratios were obtained. The ion abundances of these 18

amino acids were either intermediate or low, but in all cases signal-to-noise ratios

adequate for data analysis were obtained. Significant differences between the

amino acid profiles given by different enzyme classes were observed. After

normalization according to procedures A and B, the significance of several

variables was checked using analysis of variance (ANOVA). Using 3 enzymes of

each class × 3 infusions of each, all the variables checked showed significances

better than 0.05.

VII.2.1.2. Construction of LDA models

Using the normalized variables, LDA models capable of classifying the

samples according to the respective enzyme classes were constructed. Thus,

training data set 1 was used in combination with normalization procedures A and

B to constitute matrices M1A and M1B. Taking into account the 18 and 153

predictors generated by normalization procedures A and B, the dimensions of the

M1A and M1B matrices were 36 × 18 and 36 × 153, respectively. Similarly, data

set 2 was used to constitute matrices,M2A and M2B, whose dimensions were 72 ×

18 and 72 × 153, respectively, and evaluation data set 3 was used to constitute


273

matrices, M3A and M3B, whose dimensions were 42 × 18 and 42 × 153,

respectively.

Using training matrix M1A, an LDA model with 12 variables (selected out

of 18), which showed an excellent resolution between all the possible pairs of

categories, was obtained. Using training matrix M1B, an LDA model with 15

variables (selected out of 153) was obtained. This latter model showed a slightly

better λW value (0.035) than the previous one (0.043). Then, matrices M2A and

M2B, which were obtained by using detergent bases spiked with enzymes, were

used to evaluate the models. With some exceptions, all the objects of matrices

M2A and M2B were erroneously assigned to the protease category. This revealed a

relevant sample matrix effect, which could be due to the modification of the ion

suppression effect in the mass spectrometer. Ion suppression may depend on both

the concentrations of the enzymes, which was much smaller in the spiked

detergent bases than in the enzyme industrial concentrates, and the saline

contents of the infused solutions, which could be higher in those obtained by

enzyme precipitation from spiked detergent bases.

Therefore, to take into account the sample matrix effect in the design of

the training set, matrices M1A and M2A were jointly used. Analogously, matrices

M1B and M2B were also jointly used to construct another LDA model. Both

models yielded excellent resolution between all the pairs of categories; however,

in comparison with the model obtained using normalization procedure A,

procedure B led to a smaller number of predictors (18 instead of 20), and to a

much lower value of λW (0.019 instead of 0.047). Thus, model construction using

normalization by procedure B was selected for further studies.

The effect of requiring an entrance threshold of Fin=0.01 instead of 0.05 in

the stepwise algorithm for variable selection was studied. With Fin=0.01, the four

categories were also very well resolved, λW increased only slightly (from 0.019 to


274

0.022), and the number of predictors selected from the 153 variables initially

established decreased from 18 to 13. The predictors and their standardized

coefficients for the three discriminant functions obtained by using Fin=0.05 and

0.01 are shown in Table VII.2. Using normalization procedure B, the ion

abundance ratios of pairs of amino acids rather than the ion abundances of

individual amino acids are used as predictors.

Table VII.2. Predictors selected and standardized coefficients of the LDA models

constructed by jointly using training matrices M1B (enzyme industrial concentrates)

and M2B (detergent bases spiked with enzyme industrial concentrates) with two

different entrance thresholds.

Fin=0.05 Fin=0.01 Selected variable f1 f2 f3 f1 f2 f3 Val/Met 3.44 6.34 -0.800 – – –

Val/Thr -2.78 0.715 5.71 1.92 0.51 5.82

Leu+Ile/Met -2.12 -0.744 -0.22 0.295 1.70 -0.326

Phe/His 3.24 0.805 0.92 -4.10 0.839 1.04

Phe/Lys -6.78 12.1 3.74 3.02 2.57 3.75

Phe/Arg -6.43 4.47 -2.02 6.41 0.172 -2.72

Phe /Ser 2.06 0.849 0.070 -1.67 -0.247 -0.237

Phe/Trp 3.08 -3.20 -0.261 -3.43 -2.16 -0.572

Phe/Cys -1.63 -4.76 -0.424 – – –

Phe/Pro 1.78 -1.34 -2.07 -0.927 0.698 -1.22

Glu/His -1.07 -1.70 3.69 1.85 0.275 4.21

His/Arg 0.95 -2.95 -0.831 -2.47 -0.545 -0.254

Lys/Arg 10.6 -17.0 -5.19 -5.17 -2.41 -3.99

Lys/Trp -8.26 15.5 2.02 2.42 2.11 0.646

Gly/Trp -1.21 0.846 0.426 – – –

Ser/Thr 0.513 -1.19 0.088 – – –

Thr/Trp 5.75 -4.06 -0.255 – – –

Tyr/Pro -0.158 -3.63 0.022 – – –

Phe/Thr – – – 2.14 0.290 -0.002

This prevented us from assigning any particular relevance to the discriminant

capability of any individual amino acid; however, the coefficients of Table VII.2


275

suggested that Phe was important in distinguishing enzyme classes, and that the

pairs Lys/Arg, Lys/Trp, Phe/Lys and Phe/Arg, among others, were also

particularly important.

200-20-40-60

30

20

10

0

-10

Sec

ond

dis

crim

ina

nt f

unc

tion

First discriminant function

proteases

amylases

lipases

cellulases

A

3020100-10

10

0

-10

-20

Second discriminant function

Thi

rd d

iscr

imin

ant

fun

ctio

n proteases

amylases

lipases

cellulases

B

1030

-40

20

-20

0

010

20

0-10

Firs

t di

scrim

ina

nt f

unct

ion proteases

amylases

lipases

cellulases

C

Fig. VII.5. Score plots on the planes of the first and second (A), and

second and third discriminant functions (B), and on an oblique plane of the

3-D space defined by the three discriminant functions (C). Matrices M1B

(industrial concentrates of enzymes selected for training) and M2B (two

detergent bases spiked with the same industrial concentrates of enzymes)

were jointly used to construct the LDA model. The predictors were

selected using Fin=0.01.


276

As observed in Fig. VII.5, part A, the variance gathered by discriminant

function 1 was mainly associated with the resolution between cellulases and the

other categories, whereas discriminant function 2 was associated with the

resolution between lipases and the rest of the categories. According to Fig. VII.5,

part B, amylases were resolved with respect to the other categories along

discriminant function 3. As illustrated in Fig. VII.5, part C by using a plane

oblique to the three discriminant functions, all the possible pair of categories

were very well resolved from each other.

VII.2.1.3. Evaluation of the prediction capability of the optimal LDA model

The LDA model obtained by jointly using matrices M1B and M2B for

training (with Fin=0.01) was used to predict the enzyme categories of the objects

of the evaluation set (M3B matrix). The enzymes of all the samples (42 objects),

including the two commercial laundry cleaners (6 objects), were correctly

classified, with assignment probabilities higher than 98%.

VII.3. Classification of enzymes by HPLC-UV-Vis

VII.3.1. Enzyme class identification in cleaning products by hydrolysis

followed by derivatization with o-phthaldialdehyde, HPLC and LDA

Today, enzymes are important components ofmost laundry and

dishwasher cleaners, spot removers and other household products [Olsen, 1998]. In

fact, enzymes for cleaning products constitute the largest division of the world

market for industrial enzymes [Novozymes, 2002]. Using enzymes, substantial

reductions of washing times and temperatures, with the subsequent savings of

water and energy are achieved. Further, the concentrations of surfactants and

harsh chemicals as alkalis and strong oxidants are reduced [Olsen, 1998], with the


277

additional benefit of a better care of fabrics duringwashing. Mainly proteases,

amylases, lypases and cellulases are used in the formulations. Proteases are used

to remove protein-rich soil stains (as blood and grass), amylases are addressed to

solubilise starch-containing stains, also preventing starch from adhering to

fabrics and dishes, lypases help in removing fat and edible oil stains, and

cellulases are used to remove fuzz and little balls of fibers from the surface of

cotton fabrics. In spite of their interest in the detergent industry, and in

environmental and toxicological studies [www.heraproject.com], identification and

quantificationmethods for enzymes in cleaning products have been scarcely

investigated. Enzymes are commonly detected and quantified bymonitoring the

hydrolysis of a substrate, or by precipitation with an antiserum [Olsen, 1998;

Novozymes, 2002; Dunn, 1971; Kulkarni, 1999; Lorentz, 2000].

Enzymes of different classes largely differ in molecular structure, also

having rather dissimilar amino acid profiles, which can be useful for enzyme

class identification. After hydrolysis, the amino acid concentration profile of the

enzyme can be established by a variety of analytical techniques, including gas

chromatography previous derivatization with ethyl chloroformate [Gimeno-

Adelantado, 2002; De la Cruz-Cañizares, 2004], or with a silylating reagent

[Rampazzi, 2002], automated ion exchange chromatography previous hydrolysis

[Phillips, 1983], and a variety of HPLC methods [Molnár-Perl, 2000; Molnár-Perl,

2001; Tcherkas, 2001-A; Tcherkas, 2001-B; García-Álvarez-Coque, 1989; Concha-

Herrera, 2007; Hanczkó, 2007; Chernobrovkin, 2007; Pereira, 2008]. Among these,

RP-HPLC with pre-column derivatization using either phenylisothiocyanate or

OPA, in the presence of a reagent containing an –SH group, is most frequently

used [Molnár-Perl, 2000]. Using OPA, isoindoles, which can be detected by either

UV–Vis spectrophotometry [Concha-Herrera, 2007], fluorimetry [Molnár-Perl,

2001; Tcherkas, 2001-B; Pereira, 2008] or electrochemical techniques [Tcherkas,

2001-A], are quickly and easily obtained. Among the SH-group-containing


278

additives, 3-mercaptopropionic acid, NAC [Molnár-Perl, 2001; Concha-Herrera,

2004; Concha-Herrera, 2007] and ethanethiol [Hanczkó, 2007], which yield rather

stable isoindoles, have been recommended. Amino acid concentration profiles of

protein hydrolyzates have been used to classify protein-binding media used in

works of art [Lletí, 2003; Peris-Vicente, 2005], vegetable oils [Lerma-García, 2007],

and rice cultivars [Wang, 1998]. The contents of free amino acids have been also

used to classify tea varieties [Alcázar, 2007] and to authenticate high quality beer

[Erbe, 2000]. Multivariate data treatment techniques, including ANN [Lletí, 2003]

and LDA [Peris-Vicente, 2005; Lerma-García, 2007], have been used to construct

the models for class prediction.

In this work, we describe a method for the identification of the enzyme

class in raw materials of the cleaning industry and household cleaners by HPLC-

UV-Vis detection. The enzymes are first precipitated with acetone and

hydrolyzed with HCl, the resulting amino acids are derivatized with OPA in the

presence of NAC, and their concentration profiles are established by RP-HPLC

with UV–Vis detection. Then, either the normalized peak areas (divided by the

sum of the peak areas of the chromatogram), or ratios of pairs of peak areas, are

used as predictors in the construction of LDA models for enzyme class

prediction. The enzymes used in this work are indicated in Table III.2.

VII.3.1.1. Optimization of OPA–NAC derivatization and chromatographic

conditions

The conditions for OPA–NAC derivatization, initially taken from

literature [Concha-Herrera, 2006], were further optimized using hydrolyzates of

Alc. First, the OPA concentration was increased, while both an OPA/NAC molar

ratio of 1:2 and an OPA–NAC/hydrolyzate ratio (v/v) of 10:1 were maintained at

fixed values. The peak areas increased when the OPA–NAC concentration


279

increased from 2.5×10−4M [Concha-Herrera, 2006] to 1.25×10−2 M. Then,

1.25×10−2 M, close to the OPA solubility in water [www.cas.org/SCIFINDER], was

selected. Owing to the increase of the dilution factor, the peak areas were

reduced to ca. 50% when the OPA–NAC volume was increased from 1 to 2mL,

while maintaining an hydrolyzate volume of 100 µL. The amino acid peak areas

also decreased when the hydrolyzate volume was increased to 0.5 mL, which

could be due to a reduction of the reaction yield at the decreasing pH of the

mixture. Thus, further studies were performed with an OPA–NAC/hydrolyzate

ratio of 10:1 (v/v). Under these conditions, the other enzymes of Table III.2,

section III.3.1.1 also provided satisfactory peak intensities.

To optimize the chromatographic separation of the amino acids, the multi-

segmented gradient of Concha-Herrera et al. [Concha-Herrera, 2006] was initially

used. This consisted of three linear steps where the ACN concentration was

increased as follows: 5–18.5% (30 min), 18.5–22% (40 min) and 22–27.5% (10

min). However, with this gradient a few peaks overlapped at long retention times.

Then, careful trial-and-error optimization of the multi-segmented gradient was

carried out in order to improve resolution between the critical peak pairs. With

the gradient described in Table VII.3, and as illustrated in Fig. VII.6, all the

amino acid peak pairs, except the Phe/Leu pair, were baseline resolved.

Table VII.3. Optimal multi-segmented gradient accomplished by mixing 5% (A)

and 50% (B) ACN/water solutions, both buffered at pH 6.5 with 5mM sodium

citrate/citric acid.

Time (min) A(%) B(%)

0 100 0

28 72.5 27.5

36 70 30

42 44.4 55.6

50 42.4 57.6

55 0 100


280

Abs

orba

nce

at

335

nm (

mA

U)

0

40

80

120

Asp

Glu

His

Thr

Arg

Ala

Tyr

Val

Met

Ile

Phe + Leu

Gly Lys

0 10 20 30 40 50Time (min)

Ser

0

10

20

30

AC

N %

Fig. VII.6. Chromatogram of a hydrolyzate of Alc showing the peaks of

the isoindoles of the amino acids and the optimal multi-segmented gradient

(dashed line and Table VII.3). Other conditions as indicated in section

VII.3.1.1.

Also, the Ser peak, which was well resolved in the chromatogram of Fig.

VII.6,was only partially resolved from an unidentified peak (see Fig. VII.6) in

the chromatograms of a few other enzymes. Thus, to construct LDA models, the

Ser peak was not used, and the Phe/Leu peak pair was jointly measured, 13 peak

areas corresponding to 14 amino acids being then selected.

VII.3.1.2. Data matrices and construction and evaluation of the LDA models

In order to reduce the variability associated to the total amount of protein

recovered from the samples and to their hydrolysis, normalized rather than

absolute values of the peak areas were used. For this purpose, two normalization

procedures were tried. In procedure A, the area of each amino acid peak was

divided by the sum of the areas of all the amino acid peaks of the chromatogram.

In procedure B, the area of each amino acid peak was divided by each one of the


281

areas of the other 12 amino acid peaks; in this way, and taking into account that a

pair of peaks should be considered only once, (13×12)/2=78 non-redundant ratios

of peak areas were obtained.

To construct LDA models for enzyme class prediction, the training set

was first constituted by the enzyme industrial concentrates indicated in Table

III.2, section III.3.1.1. Three enzymes from each one of the four enzyme classes

were selected. As indicated in section III.3.3.4, two aliquots of each enzyme were

hydrolyzed and injected; however, only the average of the peak areas of the two

injections was included in the training matrix. In this way, the internal variance

of the categories was reduced, which was important to also reduce the number of

variables selected by the stepwise algorithm during model construction.

Therefore, the training matrices were initially constituted by 12 objects each (3

enzymes × 4 enzyme classes ×1 average of two hydrolyzates) and either 13 or 78

variables obtained according to normalization procedures A and B, respectively.

The resulting LDA models were used to predict the enzyme class in the

two detergent bases spiked with the four enzymes indicated in Table III.2. Data

obtained from a total of 16 chromatograms were evaluated (4 enzyme industrial

concentrates ×2 detergent bases × 2 hydrolyzed aliquots of each mixture).

However, the two models showed a poor prediction capability (25–30% of

correct assignments for a 95% probability level) which was attributed to the

matrix effect produced by the anionic surfactants and other components present

in large concentrations in the detergent bases. Thus, in order to increase the

prediction capability of the models, data obtained with the spiked detergent

baseswere also included in the training set. Thus, the expanded training matrices

had 20 objects (3 enzyme industrial concentrates plus 2 spiked detergent bases ×

4 enzyme classes × 1 average of two hydrolyzates), and either 13 or 78 predictors

as indicated. Then, the duplicate hydrolyzates of the enzyme industrial


282

concentrates of Table III.2 which were not included in the training set, plus the

duplicated hydrolyzates of the spiked detergent bases and the two commercial

cleaners, were used to construct the evaluation matrices. Thus, the two evaluation

matrices had 58 objects each (19 industrial concentrates of enzymes plus 8

spiked detergent bases and 2 cleaning products × 2 hydrolyzates each).

Using normalization procedure A, an LDA model with 9 variables,

showing an excellent resolution between all the possible pairs of categories (λW =

0.032), was obtained. However, only a 30% of the samples of the evaluation

setwere correctly classified by this model. On the other hand, using

normalization procedure B, an LDA model with 8 variables, showing a slightly

better value of λW (0.019) than the previous model (0.032) was obtained. Further,

all the 58 samples of the evaluation set were correctly classified, with assignment

probabilities higher than 99%. The predictors and respective standardized

coefficients of the three discriminant functions of this model are shown in Table

VII.4. The use of ratios of areas of peak pairs as predictors, rather than individual

peak areas, prevented from reliably assigning any particular relevance to the

discriminant capability of individual amino acids.

Table VII.4. Predictors and their corresponding standardized coefficients of the

optimal LDA model.

Selected variables f1 f2 f3

Asp/Val 0.92 0.56 -0.55

Glu/His 0.63 -0.76 1.76

Glu/Ala 0.07 1.04 0.82

His/Thr 0.20 -3.77 2.29

Thr/(Leu+Phe) 1.09 0.25 1.46

Ala/Tyr -0.45 2.35 -1.70

Ala/(Leu+Phe) -1.26 0.15 0.15

Gly/Ile 0.97 1.47 0.81


283

As observed in Fig. VII.7, part A, the variance gathered by discriminant

function f1 was mainly associated to the resolution between the protease class and

the rest of the classes (amylase+lipase+cellulase), whereas discriminant function

f2 explained variance associated to the resolution of the amylase class with

respect to the rest of the classes (protease+cellulase+lipase).

lipases

cellulases

amylasesproteases

100-10

4

2

0

-2

-4

-6

-8

f2

f3

B

f1

1086420-2-4-6-8

10

0

-10

f2

proteases

amylases

lipases

cellulasesA

amylases

proteases

104 2

0

0

10

-2 0-4 -6

cellulases

lipases

f1f3

f2

C

Fig. VII.7. Score plots on the planes of the first and second (A), and

second and third discriminant functions (B), and on an oblique plane of the

3D space defined by the three discriminant functions (C) of the LDA

model of Table VII.4.


284

Finally, according to Fig. VII.7, part B, the lipase class was resolved with

respect to the other classes (protease+cellulase+amylase) mainly along

discriminant function f3. As illustrated in Fig. VII.7, part C by using a plane

oblique to the three discriminant functions, all the possible pairs of classes were

very well resolved.

Then, the peak areas of the most stable amino acids (Ala, Arg, Asp, Glu,

Gly, His, Leu, Lys and Phe) were exclusively used as predictors to construct an

LDA model. In this case, the following four peak area ratios were selected by the

stepwise algorithm: Glu/His, Glu/Ala, His/Ala, Ala/(Leu+Phe). This model gave

λW = 0.387, and the score plots along the discriminant functions showed well

resolved classes. The resolution between classes was only slightly lower than that

observed in Fig. VII.7 for the model obtained with the eight predictors of Table

VII.4.

VII.4. Tryptic digests of enzymes, columns comparation

VII.4.1. Comparison of microparticulate and monolithic columns for RP-LC

of tryptic digests of industrial enzymes in cleaning products

Today enzymes are commonly used in cleaning product formulations,

particularly in developed countries, with over half of all detergents presently

available containing enzymes [Olsen, 1998]. In fact, the detergent industry is the

largest single market for enzymes, constituting 25 - 30% of total sales in the

enzyme market [Novozymes, 2002]. Enzymes allow a reduction of washing times

and temperatures, jointly with lower consumptions of aggressive chemicals,

which translates into additional environmental benefits and better care of fabrics

during washing [Olsen, 1998; Novozymes, 2002]. An active research area within this

field is the development of enzymes capable of maintaining their activity in


285

extreme temperatures and high pH values, and in the presence of chelate agents

for calcium ions. For this purpose, several techniques (i.e. DNA technology) are

used [Olsen, 1998; Novozymes, 2002].

Enzymes are used in small amounts (0.4 - 0.8% crude enzyme by weight)

in most formulations [Novozymes, 2002], being by far proteases, lipases, amylases

and cellulases the most commonly used enzyme classes. Proteases are used to

remove protein-rich stains (including blood and grass), amylases are addressed to

solubilize starch-containing stains, also preventing starch from adhering to

fabrics and dishes, lipases help in removing fat and edible oil stains, and

cellulases are used to remove fuzz and little balls of fibres from the surface of

cotton fabrics.

Analytical methods for enzyme identification and quantitation in raw

materials and manufactured products are required in industrial quality control.

Further, enzyme producers and their customers are also interested in

investigating the enzyme market trends, which also requires analytical support.

Finally, analytical methods for enzymes are also needed to assess their potential

impact on water treatment plants, as well as to optimize plant operation.

However, in spite of their interest in the detergent industry, and in environmental

and toxicological studies [www.heraproject.com], analytical methods for enzymes

in cleaning products have rarely been investigated. Enzymes are commonly

detected and quantified by monitoring the hydrolysis of a substrate, or by

precipitation with an antiserum [Olsen, 1998; Novozymes, 2002; Dunn, 1971;

Kulkarni, 1999; Lorentz, 2000]. Other methods are based on complete hydrolysis of

the protein into its constitutive amino acids followed by derivatization and

separation/detection by GC [Gimeno-Adelantado, 2002; De la Cruz-Cañizares, 2004;

Rampazzi, 2002] or HPLC [Molnár-Perl, 2000; Molnár-Perl, 2001; Tcherkas, 2001-A;

Tcherkas, 2001-B; García-Álvarez-Coque, 1989; Concha-Herrera, 2007; Hanczkó,

2007; Chernobrovkin, 2007; Pereira, 2008]. The resulting amino acid profiles have


286

been also used to predict the enzyme class [Beneito-Cambra, 2008; Beneito-Cambra,

2009-B]; however, much information about the nature of the protein is lost during

total hydrolysis.

In proteomics, a common approach for protein analysis is the enzymatic

digestion with trypsin. In this way, the resulting peptides, which are much more

specific for protein identification than the amino acid profiles can be studied.

After digestion, profiles are studied by HPLC-MS [Nilsson, 2000; Opiteck, 1997-A;

Opiteck, 1997-B; Opiteck, 1998]. Although this routine is well-established in

proteomics, it has been not applied to industrial enzymes in detergents.

Further, there is a need to develop highly efficient and/or fast analytical

methods to assess the quality of peptides produced by biotechnological

procedures in terms of identity, content and purity. Within this concern, several

analytical strategies related to column technology have been developed in LC,

including the use of monolithic supports [Cabrera, 2004; Guiochon, 2007], packed

columns with fused-core (or core-shell) sub-3 µm particles [Cunliffe, 2007;

Marchetti, 2007-A; Marchetti, 2007-B], or with sub-2 µm particles operating at ultra-

high pressure (UPLC) [Mazzeo, 2005; Guillarme, 2007].

In the present study, several commercial chromatographic supports

(monolithic and particulate columns) are comparatively applied to the LC-UV

analysis of enzymes of the different classes commonly used in the detergent

industry. Using industrial concentrates of the raw enzymes, both the intact

proteins and their tryptic digests were analyzed. A polymeric and a silica

monolithic, and particulate columns, including classical and core-shell particle

technology, were compared. For this purpose, and for each column, peak

capacity, resolution and number of peaks were evaluated. The best column was

also used to analyze tryptic digests of enzymes in spiked detergent bases and

commercial cleaners.


287

VII.4.1.1. Study of intact enzymes and tryptic digests using a ProSwift

polymeric monolithic column

First, a commercial ProSwift RP polymeric monolithic column was

applied to the monitoring of raw industrial concentrates of enzymes using intact

proteins. This column has been employed for the analysis of proteins and

peptides [Rao, 2006; Causon, 2010-B]. The gradient elution conditions for intact

proteins were as follows: an isocratic step with 1% ACN for 2 min followed by a

linear gradient up to 75 % ACN in 18 min.

Time (min)Time (min)

Abs

orb

ance

Abs

orb

ance

A B

C D

0

40

80

120

0

50

100

150

5 10 15 20

0

20

40

5 10 15 20

0

20

40

Fig. VII.8. Chromatograms of intact enzymes using a ProSwift polymeric

monolithic column: (A) protease (Everlase), (B) amylase (Duramyl), (C)

lipase (Lipex) and (D) cellulase (Deterzyme). Elution conditions: isocratic

with 1% ACN for 2 min followed by a linear gradient up to 75 % ACN in

18 min at 1 mL min-1.

As shown in Fig. VII.8, most enzymes gave rise to a single predominant peak;

however, a comparison of enzymes of different classes showed a coelution of the

main peaks for the following enzyme class pairs: proteases and cellulases (main


288

peak within the ca. 11-12 min range), and amylases and lipases (main peak

within the ca. 13-14 min range). No improvement in the resolution between

enzyme classes was achieved by modifying the elution conditions. Then, the

chromatograms of the intact enzymes are useful to assess the quality of the

protein for any enzyme class; however, chromatography of the intact enzymes

did not provide the necessary information to unequivocally identify unknown

enzymes. For this purpose, application of the tryptic digests of the enzymes was

investigated.

5 10 150

40

80

120

10 20 30 40 500

40

80

Abs

orb

ance

Abs

orb

ance

Time (min)

A

B

Fig. VII.9. Chromatograms of a tryptic digest of BSA using a ProSwift

polymeric monolithic column under different elution conditions: (A) as in

Fig. 1, and (B) isocratic step with 1% ACN for 5 min followed by a linear

gradient up to 40 % ACN in 58 min at 1 mL min-1.

In addition to the enzymes, BSA was also used as a reference protein to check

the performance of the tryptic digestion, as well as a probe to optimize the


289

separation of the digests. Fig. VII.9, part A shows a chromatogram of a BSA

digest obtained with the same elution gradient employed in Fig. VII.8 for intact

proteins. A number of peptides, most of them partially resolved, were observed.

Optimization of elution conditions to improve resolution was performed. Fig.

VII.9, part B shows the best conditions achieved, selecting 50 min gradients as

compromise between analysis time and peak resolution.

10 20 30 40 50Time (min)

Abs

orb

ance

A

B

Fig. VII.10. Chromatograms of a tryptic digest of (A) a protease (Alcalase)

and (B) a lipase (Lipolase) using the ProSwift polymeric monolithic

column under elution conditions as in Fig. VII.9, part B.

According to literature, an increase in the column temperature can lead to

an increase in efficiency of separations of tryptic digests [Ruta, 2010; Causon,

2010-A]. Thus, a tryptic digest of BSA was chromatographed at several

temperatures (25, 40 and 60 ºC; chromatograms not shown). At 40 ºC, the


290

resolution between the weakly retained peptides decreased, whereas at 60 ºC a

reduction of peak intensity, which could be due to peptide hydrolysis, was

observed. Then, 25 ºC was selected for further studies. Under these conditions,

tryptic digests of enzymes belonging to different classes were analyzed. The

chromatograms of a protease and a lipase, showing rather different fingerprints

are given in Fig. VII.10. A series of partially resolved peptides at retention times

below 20 min, were observed for the protease, whereas, the lipase provided a

wide range of satisfactorily resolved peptides. Also, acceptable separations were

achieved with amylases and cellulases (chromatograms not shown); however, as

evidenced, low efficiencies were obtained for the tryptic digests of the four

classes of enzymes. Changes in gradient elution conditions did not lead to

significant improvements in efficiency and resolution, then, other stationary

phases were investigated.

VII.4.1.2. Study of tryptic digests of enzymes using microparticulate and silica

monolithic columns

Chromatographic supports with C18 particulate packings and a silica monolithic

bed (see Table III.4) were investigated. Fig. VII.11 shows the chromatograms of

a tryptic digest of a protease obtained with different columns and using the

gradient elution conditions found in the previous section. Since the columns

differed in their cross section, the flow rate was adapted to maintain a constant

value of the average linear flow velocity. As evidenced, a satisfactory separation

of the tryptic digest of the protease was achieved for all these columns, in

contrast with that obtained for the same enzyme by using the ProSwift column

(Fig. VII.10, part A).


291

A

bsor

ban

ceA

bsor

ban

ce

Time (min)

A

0

20

*

C

20 400

0

20*

Time (min)20 400

B*

D*

Fig. VII.11. Chromatograms of a tryptic digest of a protease (Alcalase)

obtained using different columns: (A) Chromolith, (B) Gemini 5 µm, (C)

Gemini 3 µm and (D) Kinetex. The flow rate was 1.12, 1.5, 0.4 and 0.4 mL

min-1, respectively. Other elution conditions as Fig. VII.9, part B. The

asterisk indicates a blank peak i.e. a peak not originating from the enzyme

analyte.

In order to evaluate the chromatographic performance of the columns, the

number of resolved peaks, peak capacity (PC) and global resolution (RG) were

obtained by selecting as representative probes a protease (Fig. VII.11) and a

lipase. The PC was experimentally determined using the well-known equation

[Snyder, 1986.]:

1 ( / )C gP t w= + (E.VII.1)

where w is the average peak width at 4σ (13.4% of peak height) in time units

(experimentally measured) and tg is the gradient time. The global resolution, RG,

was also measured as the geometric mean of the resolution between the


292

consecutive peak pairs. To perform this evaluation unresolved peak pairs or with

RS values 0.5 were excluded.

Fig. VII.12 shows the number of peaks, PC and RG found for a protease

and a lipase using the different columns. As it can be seen for the protease (Fig.

VII.12 part A), the PC values increased in the following order: ProSwift <

Gemini (5 µm) < Chromolith ~ Gemini (3 µm) < Kinetex, and a similar order

was obtained for the lipase, providing in this case the Chromolith column higher

PC values than the Gemini (3 µm) column. A similar trend was observed for the

number of peaks and RG; in both cases, the Kinetex column showed the best

performance.

The differences in number of peaks, PC and RG values among the columns

are a consequence of differences in their morphological features. Comparing

monolithic beds, the results obtained for complex tryptic digests for the ProSwift

column suggest a larger globule/polymer skeleton diameter and/or bed

inhomogeneity than for its silica counterpart (Chromolith Performance RP18),

which translates into lower plate numbers and reduced peak capacities as well as,

along with absence of mesoporous structure, into lower surface area and less

retention of analytes. Silica monoliths show larger porosities than packed beds.

Hence, they exhibit a higher permeability than packed columns. The silica

skeleton in Chromolith is mesoporous and has mean thickness of around 1-3 µm

leading to a mass-transfer kinetics faster than that of packed columns with 5-µm

particles and comparable to those of columns packed with 3–4 µm particles

[Guiochon, 2007], in rough agreement with the results shown in Fig. VII.12.

The Kinetex column, packed with 2.6 µm core-shell particles (porous shell

0.35 µm, fused-core 1.9 µm) showed a better performance than both Gemini

columns, packed with conventional 5- or 3-µm particles and monolithic

supports.This can be explained by the particular characteristics of the Kinetex


293

packing, where the particles are constituted by porous outer layer surrounding a

solid non-porous core [Snyder, 1979].

0

20

40

60

80A

Nu

mbe

r of

pea

ks

0

100

200

300

400 B

Pe

ak

Ca

paci

ty

0

10

20

C

Log

(Glo

bal R

eso

lutio

n)

Fig. VII.12. Evaluation of separation performance of tryptic digests of a

protease (Alcalase, dotted bars) and a lipase (Lipolase, striped bars) using

different columns: (A) number of peaks, (B) peak capacity and (C) log

(global resolution). Elution conditions as indicated in Fig. VII.11.


294

Ab

sorb

ance

Abs

orb

ance

Ab

sorb

ance

Time (min)0 20 40 60

C

0

40

0

40

A*

0

20B*

*

Fig. VII.13. Chromatograms of tryptic digests of (A) an amylase

(Purastar), (B) a lipase (Lipolase) and (C) a cellulase (Puradax) using the

Kinetex column. Other details as in Fig. VII. 11, part D.

In comparison to conventional particle technology, efficiency is gained due to the

faster mass transfer through the shorter diffusion distance provided by the porous

layer. In addition, the PC values obtained for the Kinetex column were similar to

those found in literature for other shell-core columns (Ascentis), and lower than

those reported for columns packed with sub-2 µm particles (Acquity, BEH C18)

operating at much higher pressures (UHPLC technology) [Ruta, 2010]. The

Kinetex column which showed the best chromatographic performance for tryptic

digests, was chosen for further studies. Chromatograms of a protease, an

amylase, a lipase and a cellulase are shown in Figs. VII.11, part D and Figs.

VII.13, parts A to C, respectively.


295

VII.4.1.3. Influence of matrixes commonly used in cleaning product

formulations

In order to evaluate the feasibility of the proposed method to analyze

enzymes in cleaning products, two detergent bases containing surfactants and

other reagents commonly employed in the formulation of cleaning products (see

composition in section III.3.4.4) were used. These solutions, spiked with

different classes of enzymes, were treated as indicated in section III.3.4.4 and

injected into the HPLC system. Fig. VII.14, part A shows a representative

chromatogram of a tryptic digest resulting from detergent base II spiked with a

protease (Alcalase). This profile was closely similar to those obtained for

detergent base I spiked with the same enzyme (chromatogram not shown) and by

directly digesting the raw enzyme (Fig. VII.11, part D). Similarly, detergent

bases (I and II) spiked with other classes of enzymes also gave chromatograms

closely resembling those obtained with the corresponding raw enzymes.

Therefore, interference due to the matrix components used to prepare the

detergent bases was not observed. The method was also tested with several

commercial cleaning products containing mainly proteases, which constitute the

most common enzymes used today by the detergent industry [Watson, 2006.]. Fig.

VII.14, part B shows a chromatogram of a liquid detergent containing a protease

(Everlase, as declared by the manufacturer Químicas Oro, S.A.). Again, a closely

similar profile was obtained for the tryptic digest of the industrial concentrate of

this enzyme (chromatogram not shown). Other commercial household cleaners

containing proteases of unknown origin were analyzed, and matrix interferences

were not evidenced in any case.


296

0 20 40 60Time (min)

B

0

40

*

0

40

AA

bsor

ban

ce*

Abs

orb

anc

e

Fig. VII.14. Chromatograms of tryptic digests of (A) detergent base II

spiked with a protease (Alcalase) and (B) liquid detergent containing

protease (Everlase). Other details as in Fig. VII. 11, part D.

CHAPTER VIII

MONOLITHIC COLUMNS

Chapter VIII. Monolithic Columns

299

VIII.1. Monolithic columns of lauryl methacrylate

VIII.1.1. Photo-polymerized LMA monolithic columns for CEC using LPO

as initiator

Polymer-based monolithic stationary phases have been developed over the

past two decades as an alternative to particle-packed phases for CEC and HPLC.

The advantages of these monolithic supports are very well documented [Svec,

2005; Lämmerhofer, 2003], and include good efficiencies, simplicity of

manufacturing and low back-pressure in HPLC. These phases are usually

prepared by in situ free-radical polymerization of a mixture containing one or

more functional monomers, including a crosslinker, a porogenic solvent and an

initiator. Heat [Peters, 1997; De Vries, 2008; Peters, 1998-A; Yu, 2002; Eeltink, 2005]

and UV irradiation [Peters, 1998-A; Eeltink, 2005; Geiser, 2007; Ngola, 2001] are the

most common ways of initiating polymerization, while other techniques, such as

microwaves [Faure, 2007], γ-radiation [Zhang, 2008; Sáfrány, 2005], electron beam

[Beiler, 2007] and chemical agents [Bandari, 2007; Holdšvendová, 2003; Cantó-

Mirapeix, 2008-A; Cantó-Mirapeix, 2008-B] have been scarcely employed.

Advantages of photo-initiation are speed and easy selection of polymerization

regions by using masks, which is particularly important in relation to the

manufacturing of microfluidic chips.

Acrylate and methacrylate-based materials have been proved to be

excellent as stationary phases, with outstanding chemical stability over a broad

pH-range [Peters, 1997; De Vries, 2008; Peters, 1998-A; Yu, 2002; Eeltink, 2005;

Sáfrány, 2005; Beiler, 2007; Cantó-Mirapeix, 2008-C; Throckmorton, 2002; Delaunay-

Bertoncini, 2004; Augustin, 2006]. Several authors have described the preparation of

monoliths using UV irradiation, mostly in the presence of either AIBN [Peters,

1998-A; Eeltink, 2005; Geiser, 2007; Ngola, 2001; Cantó-Mirapeix, 2008-C;


300

Throckmorton, 2002; Delaunay-Bertoncini, 2004; Augustin, 2006] or 2,2-dimethoxy-

2-phenylacetophenone [Augustin, 2008; Ro, 2004; Lee, 2004; Huo, 2007] as initiators.

LPO, as other diacyl peroxides, constitutes a source of free-radicals, when

decomposed by thermolysis, irradiation or activation by tertiary amines [Gu, 2007;

Redington, 1948; Sanchez, 1996; O’Driscoll, 1960]. This compound has been

employed in the preparation of methyl methacrylate polymers by thermal

initiation [Denisov, 2003; Bevington, 2004], and recently, we have described its use

in the preparation of LMA-based monolithic columns for CEC also by thermal

polymerization [Gao, 2005]. The monoliths obtained with this initiator provided

better permeability and a finer control of the pore size over the studied range of

1,4-butanediol/1-propanol ratio, than columns prepared with AIBN. This

suggested that the combination of LPO and UV irradiation could also be an

attractive way for the fast preparation of LMA-based monoliths.

In this work, the preparation of LMA-based monolithic columns for CEC

by UV irradiation using LPO as an initiator is described. In order to obtain

satisfactory column performances, the composition of polymerization mixture

(i.e. ratios of monomers/porogens and monomer/crosslinker, and the composition

of the porogenic solvent) was optimized. SEM photographs were used to

characterize the morphology of the resulting monoliths, and the CEC

performance of different columns was evaluated by measuring the retention

factors and efficiencies of test mixtures of non-charged solutes. Photo-

polymerized LMA stationary phases were compared with those prepared by

thermal initiation. These columns were also compared with those prepared using

the more common AIBN instead of LPO as an initiator.


301

VIII.1.1.1. Preparation and characterization of columns photo-initiated with

LPO

The conditions to prepare photo-polymerized LMA-based monoliths were

adapted from our previous work, where CEC columns were thermally

polymerized using LPO as initiator [Gao, 2005]. Initially, the selected composition

of the polymerization mixture was 40 wt% monomers (59.8 wt% LMA, 39.9

wt% EDMA and 0.3 wt% META) and 60 wt% porogens (17 wt% 1,4-butanediol

and 83 wt% 1-propanol) in the presence of a 0.3 wt% LPO. However, when a

PAH test mixture was injected in this monolith (column C1), wide peaks of

components with several overlappings (naphthalene/fluorene and

pyrene/benz[a]anthracene peak pairs) were evidenced (Fig. VIII.1). These peaks

showed much lower efficiencies than those reported for a thermally polymerized

LMA column [Gao, 2005].

0

20

40

60

1 2 3 4Time (min)

Ab

sorb

ance

(mA

U)

1

2

34

5+67

Fig. VIII.1. Electrochromatogram of a PAH test mixture obtained with an

LMA-based monolithic column photo-polymerized with LPO (column C1

of Table VIII.1) and SEM photograph of the monolith (inset). CEC

conditions: mobile phase, 80:20 v/v ACN/aqueous 5 mM Tris (pH = 8.0);

applied voltage, 10 kV; UV detection at 254 nm. Peak identification: (1)

thiourea, (2) naphthalene, (3) fluorene, (4) anthracene, (5) pyrene, (6)

benz[a]anthracene and (7) benzo[k]fluoranthene.


302

It was attributed to that the photo-polymerized columns yielded monoliths with

larger pores and globules compared with those initiated thermally, which is

consistent with the literature [Peters, 1998-A; Cantó-Mirapeix, 2008-D]. This was

also corroborated by the SEM pictures, where the photo-polymerized column C1

showed larger flow-through pores and globule sizes (inset of Fig. VIII.1) than a

thermally initiated column obtained with the same polymerization mixture [Gao,

2005].

In order to improve the CEC properties of the photopolymerized LMA

monoliths, the influence of the ratios of monomers/porogens and 1,4-

butanediol/1-propanol on the porosity and performance of the columns was first

studied (Table VIII.1). For this purpose, SEM pictures were obtained, and a

mixture of PAHs was used to measure retention and efficiency values (by giving

the minimum plate height, Hmin obtained from van Deemter plots). The ratio of

monomers/porogens was varied from 30:70 to 60:40 wt/wt at several 1,4-

butanediol percentages. For 17 wt% 1,4-butanediol and a 30:70 wt/wt ratio of

monomers/porogens, the polymerization inside the capillaries was not produced.

Stable monoliths were obtained with 40:60 and 50:50 ratios; however, for a

60:40 ratio and at all the studied 1,4-butanediol percentages, the bed permeability

was significantly reduced, thus, leading to column blockage. At 17 wt% 1,4-

butanediol, when ratio of monomers/porogens was increased from 40:60 (column

C1) to 50:50 (column C2), efficiency improved (see Table VIII.1); however the

pyrene/benz[a]anthracene pair was still not resolved by column C2. As shown in

Table VIII.1, the k-values increased from column C1 to column C2, while the

flow rate (u) remained almost the same. The increase in k-values can be

explained by the smaller globule structure of column C2 when compared with

column C1, and therefore, the column C2 gave higher surface/column volume

ratio.


303

Tab

le V

III.

1. C

ompo

sitio

n of

the

pol

ymer

izat

ion

mix

ture

s us

ed f

or t

he p

repa

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n of

pho

to-p

olym

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ed L

MA

-bas

ed mon

olith

ic

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with

LP

O a

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CE

C p

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ents

. b W

eigh

t pe

rcen

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s.

c Flo

w r

ates

and

ret

entio

n m

easu

red

at 5

kV

. Mob

ile p

hase

, 80:

20 v

/v A

CN

:5 m

M T

ris

(pH

= 8

.0)


304

On the other hand, the similar u-values suggested similar flow-through pore sizes

for columns C1 and C2, which was consistent with their SEM pictures (data not

shown). The similarity of the pore sizes could be due to the excessively large 1,4-

butanediol content employed in the preparation of these two monoliths.

A B

C D

Fig. VIII.2. SEM photographs of LMA monoliths photo-polymerized with

LPO prepared with 10:90 wt/wt 1,4-butanediol/1-propanol, at several ratios

of monomers/porogens (wt/wt): 30:70 (column C3) (A), 40:60 (column

C4) (B) and 50:50 (column C5) (C). Part (D) shows a monolith prepared

with a 40:60 wt/wt ratio of monomers/porogens and a 6:94 wt/wt ratio of

1,4-butanediol/1-propanol (column C7). Other details about the

composition of the columns are given in Table VIII.1.

The influence of the ratio of monomers/porogens on the CEC properties

was also studied at 1,4-butanediol contents lower than 17 wt% (columns C3–C8).

As shown in Table VIII.1, at 10 and 6 wt% 1,4-butanediol in the porogenic

mixture, and when the content of this mixture was reduced (from 30:70 to a

50:50 ratio of monomers/porogens), an increase in k- and a decrease in u-values


305

were observed. This trend was consistent with the SEM pictures of these

monoliths. As a representative example, monoliths photo-polymerized with 10

wt% 1,4-butanediol showed a significant decrease in both flow-through pore and

globule sizes when the ratio of monomers/porogens was increased from 30:70 to

50:50 (columns C3–C5) (Fig. VIII.2, parts A to C).

60

0

20

40

0 0.5 1 1.5u (mm s-1)

Hm

in(µ

m)

B

0

10

20

0 0.5 1 1.5 2

Hm

in(µ

m)

A

Fig. VIII.3. Van Deemter plots of LMA monolithic columns

photopolymerized with LPO and using different polymerization mixtures

(wt/wt ratios): (A) 40:60 monomers/porogens and 10:90 1,4-butanediol/1-

propanol (column C4); (B) 50:50 monomers/porogens and 6:94 1,4-

butanediol/1-propanol (column C8); other details about the composition of

the columns are given in Table VIII.1. Compounds: (◊) naphthalene, (∆)

anthracene, and (□) benzo[k]fluoranthene. CEC conditions: mobile phase,

80:20 v/v ACN: 5 mM Tris (pH=8.0); UV detection at 254 nm; injection, 5

kV for 3 s.


306

Regarding to the efficiency, at 10 and 6 wt% 1,4-butanediol, a 30:70 wt/wt

ratio of monomers/porogens (columns C3 and C6) provided the worst Hmin

values. The best efficiencies for 10 and 6 wt% 1,4-butanediol were achieved at

ratios 40:60 (column C4) and 50:50 (column C8), respectively. Figure VIII.3

shows the van Deemter plots obtained for these columns for naphthalene,

anthracene and benzo[k]-fluoranthene. The column C4 gave Hmin values

comprised 8.9–11.1 µm (at optimum u-values 0.65–0.67 mm/s), whereas for the

column C8, the Hmin values ranged between 18.6–22.7 µm (u-values 0.30–0.33

mm/s) (see Table VIII.1). Additionally, this latter monolith showed higher mass

transfer contributions (C-term) (26.5–47 ms) than those obtained with the column

C4 (6.8–13 ms). The separation of the PAH test mixture on columns prepared

with these two monoliths was examined. In both cases, all the analytes were well

resolved, giving the monolith prepared with a 40:60 ratio (column C4) the

shortest analysis time (see Fig. VIII.4, parts A and B).

Next, the influence of the content of 1,4-butanediol in the porogenic

solvent was studied at a given ratio of monomers/porogens. At 40:60 wt/wt

monomers/porogens, by decreasing the 1,4-butanediol from 17 (column C1) to 6

wt% (column C7), the flow rates did not change significantly, but the k-values

progressively increased. This retention behavior was attributed to the reduction

of the globule size, which was corroborated by the SEM pictures (see inset of

Fig. VIII.1 and Fig. VIII.2, parts B and D for columns C1, C4 and C7,

respectively). A reduction of the globule size produced by a reduction of the

porogenic solvent content was also reported for LMA-based monoliths prepared

by thermal polymerization in the presence of LPO as initiator [Gao, 2005]. The

increase in retention was also observed at 50:50 wt/wt monomers/porogens,

being more pronounced than 40:60 wt/wt monomers/porogens (see columns C2,

C5, C8 compared with columns C1, C4, C7). At 50:50 wt/wt


307

monomers/porogens, with decreasing 1,4-butanediol, u decreased from column

C2 to C5, for later did not change significantly for column C8. This behavior can

be explained as follows. The reduction of 1,4-butanediol in polymerization

mixtures prepared at 50:50 wt/wt monomers/porogens led to monoliths with

small macropore and globule sizes, which translated in a reduction in u and

increase in k-values. However, at 6 wt% 1,4-butanediol percentage (column C8),

no substantial changes in u and an increase in k-values was observed. It can be

explained by considering that this polymerization media produced a decrease in

globule size and non-significant variations in macropore size.

The influence of the 1,4-butanediol percentage in the mixture of porogenic

solvents on the CEC separation performance was also evaluated. When the PAH

test mixture was injected using columns prepared with a 40:60 wt/wt ratio of

monomers/porogens, the decrease of the 1,4-butanediol percentage from 17 wt%

(column C1, Fig. VIII.1) to 10 wt% (column C4, Fig. VIII.4, part A) led to an

improvement of the resolution between all the successive analyte pairs. The

column prepared with 6 wt% 1,4-butanediol (column C7, Fig. VIII.4, part C)

also provided baseline resolution of analytes; however, it showed lower

efficiency than the column C4. Thus, this monolithic bed, which represented the

best compromise between resolution and analysis time, was selected for further

studies.

Changes in the monomer to crosslinker ratio have been proved to have

significant effects on monolith porosity [Svec, 1995-A; Svec, 1995-B; Viklund, 1996;

Okay, 2000]. Thus, the LMA:EDMA ratio was increased from 40:60 to 50:50,

60:40 and 70:30 wt/wt (columns C9, C4 and C10, respectively). When 40:60 was

used the columns exhibited a large flow resistance, which caused column

blockage.


308

0

10

20

30

0 2 4 6 8

Abs

orb

anc

e (

mA

U) 1

2

3

4

5

67

A

1

2

3

4

5 67

B

0

10

20

30

40

0 4 8 12 16

Ab

sorb

anc

e (

mA

U)

0

20

40

60

0 2 4 6 8Time (min)

Ab

sorb

anc

e (

mA

U)

C

1

2

3

4

5 6 7

Fig. VIII.4. Electrochromatograms of a PAH test mixture obtained using

LMA columns photo-polymerized with LPO and using different

polymerization mixtures (wt/wt ratios): (A) 40:60 monomers/porogens and

10:90 1,4-butanediol/1-propanol (column C4); (B) 50:50

monomers/porogens and 6:94 1,4-butanediol/1-propanol (column C8); and

(C) 40:60 monomers/porogens and 6:94 1,4-butanediol/1-propanol

(column C7). Other details about the composition of the columns are given

in Table VIII.1. CEC conditions and peak identification are as in Fig.

VIII.1.


309

When LMA:EDMA ratio was increased from 50:50 (column C9) to 60:40

(column C4), a decrease in retention without any separation improvement was

observed (see Table VIII.1). Finally, with 70:30 (column C10), overlapping of

the naphthalene/fluorene and pyrene/benz[a]anthracene peak pairs was produced.

This was consistent with the SEM pictures of these columns, which showed how

the decrease of the crosslinker concentration from 60 to 30 wt% led to monolithic

beds with larger globules (pictures not shown). This was in agreement with other

studies reported in the literature, where a decrease in the crosslinker percentage

was also accompanied by an increase in the average pore size [Svec, 1995-A; Svec,

1995-B; Okay, 2000]. This behavior can be explained as follows. When the

LMA/EDMA ratio was progressively increased from 50:50 to 70:30 wt/wt, the

hydrophobicity of the monomer mixture was increased, which resulted in an

earlier phase separation. The aggregates preferentially tended to swell with the

LMA monomers than with porogenic solvent. Overall, the globules and voids

formed in this system will be larger. It should translate in a reduction both in k-

values and efficiency along this series. However, similar Hmin values were

observed from column C9 to C4, whereas as expected an increase in Hmin was

observed for column C10. As shown in Table VIII.1, the LMA:EDMA ratio of

60:40 wt/wt (column C4) provided the best Hmin values for all the PAHs of the

test mixture, thus being this ratio selected for the studies that followed. These

efficiencies are comparable with the performance of microparticulate columns

packed with 5 µm silica particles [Vlakh, 2007; Eeltink, 2004].

Using LPO, the photo-polymerized LMA-based monolithic columns were

also compared with those prepared by thermal polymerization. For this purpose,

the 1,4-butanediol and porogenic solvent contents, which were found to be

optimal for each polymerization processes were used. The monoliths of the two

types showed similar efficiencies for naphthalene, i.e. Hmin naphthalene = 11.1 and


310

9.5 µm for photo-polymerized and thermal initiated columns, respectively, but

the former showed much lower k-values than the latter (kpyrene = 1.76 and 4.58,

respectively).

A comparison in terms of efficiency with monolithic columns made with

either LMA or other similar bulk monomers (i.e. LA) was also performed.

Regarding to LMA columns initiated thermally with AIBN, the Hmin values found

were similar to the 9–15 µm for alkyl benzenes (at optimum flow rates 0.5–1.0

mm/s) obtained by Buszewski et al. [Buszewski, 2004]. Our efficiencies were also

comparable with the values of 5–13 µm for PAH compounds (flow rates: 1.0–1.5

mm/s) obtained with photo-initiated LA monoliths with AIBN [Geiser, 2007].

However, the plate heights achieved were slightly higher than those obtained for

LA columns chemically initiated with LPO [Buszewski, 2004], where the Hmin

values for PAH compounds ranged from 2.6 to 5.3 µm (flow rates: 0.5–1.5

mm/s).

Table VIII.2. Reproducibility of CEC properties of LMA-based monolithic

columns photo-polymerized with LPOa

Column-to-column (n=3) Batch-to-Batch (n=3)

Parameter Mean RSD (%) Mean RSD (%)

u (mm/s) 1.25 4.5 1.29 5.4

kanthracene 1.08 2.8 1.00 6.3

Hminb (µm) 11.0 2.1 13.1 6.0

a Polymerization mixtures prepared with 40 wt% monomers (59.8 wt%

LMA, 39.9 wt% EDMA and 0.3 wt% META) and 60 wt% porogens (10

wt% 1,4-butanediol and 90 wt% 1-propanol); LPO, 0.3 wt%. Applied

voltage, 15 kV; other conditions as in Fig. VIII.2.

b Hmin values obtained for naphthalene.

To estimate the reproducibility of photo-polymerized columns initiated

with LPO, three independent batches of three columns each were prepared. As it


311

can be observed in Table VIII.2, satisfactory reproducibilities were achieved for

all the tested parameters, with RSD values comprised between 2.1 and 4.5% for

column-to-column, and between 5.4 and 6.3% for batch-to-batch. These

reproducibilities were similar to those reported for thermally polymerized

monoliths using also LPO as initiator (<5.3%) [Gao, 2005].

VIII.1.1.2. Comparison of LPO and AIBN as initiators for photo-

polymerization

Since AIBN is used as initiator for UV polymerization in most of the

studies reported in the literature, the CEC performance of columns photo-

polymerized using either LPO or AIBN was next compared. The features of

columns prepared by using the same ratios of monomers/porogens (40:60 wt/wt)

and LMA/EDMA (60:40 wt/wt), and the same 1,4-butanediol range in the

porogenic solvent (17–6 wt%), are shown in Tables VIII.1 and VIII.3. Using

PAHs for testing, the columns photo-initiated with AIBN at 17 wt% 1,4-

butanediol in the porogenic solvent showed better efficiencies than the

corresponding columns obtained using LPO (column C1, Table VIII.1). At 6

wt% 1,4-butanediol, the columns polymerized with AIBN gave slightly better

efficiencies (see Table VIII.3 and column C7, Table VIII.1) and comparable

separations were achieved for both initiators (data not shown). As deduced from

Table VIII.3, the optimal efficiency for the monoliths photo-initiated with AIBN

was found at 10 wt% 1,4-butanediol in the porogenic mixture. Figure VIII.5

shows the electrochromatogram obtained with the column that provided the best

Hmin using AIBN. As it can be observed, the solutes of the PAH test mixture were

resolved at 10 kV with similar peak efficiencies as those obtained with the

optimal monolith initiated with LPO (see Fig. VIII.4, part A), but within a

longer analysis time.


312

Table VIII.3. CEC properties of LMA-based monolithic columns prepared from

mixtures with different 1,4-butanediol/1-propanol ratios using AIBN as initiatora)

a) The polymerization mixtures contained 40:60 wt/wt monomers/porogens and 60:40 LMA/EDMA.

b) Weight percentages. c) Flow rates and retention measured at 5 kV. Mobile phase, 80:20 v/v ACN: 5 mM Tris

(pH = 8.0).

0

40

80

2 4 6 8 10Time (min)

Abs

orba

nce

(mA

U)

1

2

3

4

56 7

Fig. VIII.5. Electrochromatogram of a PAH test mixture obtained with an

LMA-based monolithic column photo-polymerized with AIBN, and SEM

photograph of the monolith (inset). Polymerization mixture: 40 wt%

monomers (59.8 wt% LMA, 39.9 wt% EDMA and 0.3 wt% META) and 60

wt% porogens (10 wt% 1,4-butanediol and 90 wt% 1-propanol). CEC

conditions and peak identification are as in Fig. VIII.1.

As shown in Tables VIII.1 and VIII.3 for LPO and AIBN, respectively,

at the optimal ratios of monomers/porogens (40:60 wt/wt) and LMA/EDMA


313

(60:40 wt/wt), when the 1,4-butanediol contents was decreased from 17 to 6

wt%, the u-values did not varied significantly. As also shown in these tables, the

LPO photo-initiated monoliths gave higher u-values than those initiated with

AIBN. Concerning to retention, for 10 and 17 wt% 1,4-butanediol, the monoliths

photo-polymerized with AIBN gave higher k-values than those obtained with

LPO. This could be explained by the presence of a higher number of micropores

in the globule structure of the AIBN columns, and consequently, by a higher

surface area. This was confirmed by the SEM pictures, which showed smaller

globules in beds made with AIBN than in those prepared with LPO (see for

instance inset of Figs. VIII.5 and VIII.2, part B for columns prepared with 10

wt% 1,4-butanediol).

The performance of these monolithic stationary phases as RP packings

was also evaluated using alkyl benzenes and a mixture of basic compounds (Figs.

VIII.6 and VIII.7, respectively). From Fig. VIII.6, it can be seen that the

column initiated with LPO showed a fast baseline separation of alkyl benzenes in

less than 4 min. Similar theoretical plates (7.1–18.3 µm) were achieved with this

monolithic column than the monolithic column initiated with AIBN, which

yielded 8.2–16.4 µm for a separation under 6 min.

The analysis of basic compounds in HPLC commonly undergoes of peak

broadening and tailing due to the interaction of these compounds with residual

silanol groups on RP columns [Cantó-Mirapeix, 2009-B]. Figure VIII.7, part A

shows the separation of five basic compounds in less than 12 min with column

efficiency of up to 20 µm, whereas the column initiated with AIBN (Fig. VIII.7,

part B) as in Fig. VIII.6 showed longer analysis times with theoretical plates ca.

24 µm. Similar efficiencies were achieved for RP columns, in particular XTerra

RP18 and XBridge C18, two columns with low-silanophilic activity [McCalley,

2003], with theoretical height plates ranged between 16–25 µm. In any case, it


314

can be observed that symmetric peaks were obtained in CEC due to suppressed

electrostatic interaction between the neutral solutes and the positively charged

monolithic surface, then; these stationary phases were suitable for the analysis of

basic compounds.

1

2

34

5

6

7

A

0

2

4

Ab

sorb

anc

e (m

AU

)

B

1

23

4

5

6

7

0

1

2

3

0 1 2 3 4 5 6Time (min)

Abs

orb

ance

(m

AU

)

Fig. VIII.6. Electrochromatograms of a mixture of alkylbenzenes obtained

by using LMA monoliths photo-polymerized with LPO (A) and AIBN (B)

as initiator. The composition of the polymerization mixtures is as in Figs.

VIII.4, part A and VIII.5, respectively. CEC conditions: mobile phase,

70:30 v/v ACN: 5mM Tris (pH = 8.0); UV detection at 214 nm; applied

voltage, 25 kV; injection, 5 kV for 3 s. Peak identification: (1) thiourea, (2)

toluene, (3) ethylbenzene, (4) n-propylbenzene, (5) n-butylbenzene, (6) n-

pentylbenzene and (7) n-hexylbenzene.


315

0

2

4

6

0 10 20 30

Abs

orb

anc

e (

mA

U) A

1

2

3

45

6

0

1

2

4

0 10 20 30 40Time (min)

Ab

sorb

anc

e (

mA

U) B

12

34 5

6

Fig. VIII.7. Electrochromatograms of a mixture of basic compounds

obtained by using LMA monoliths photo-polymerized with LPO (A) and

AIBN (B) as initiator. The composition of the polymerization mixtures is

as in Figs. VIII.4, part A and VIII.5, respectively. CEC conditions:

mobile phase, 40:60 v/v ACN: 5mM Tris (pH=8.0); UV detection at 254

nm; applied voltage, 10 kV; injection, 5 kV for 3 s. Peak identification: (1)

thiourea, (2) pyridine, (3) aniline, (4) 4-nitroaniline, (5) 2,4,6-

trimethylaniline, (6) N,N-dimethylaniline.


316

VIII.2. Comparison of photo-initiators for methacrylate monolithic

columns

VIII.2.1. Comparison of photo-initiators for the preparation of methacrylate

monolithic columns for capillary electrochromatography

In the last years, monolithic columns have attracted considerable attention

due to their properties such as the ease of preparation, the good efficiencies, the

speed of chromatographic separations at low back-pressure and non-requirement

of frits, constituting a competitive technology to the conventional particlepacked

phases used in HPLC and CEC [Svec, 2003; Legido-Quigley, 2003]. Organic

polymer-based monoliths are prepared in situ by thermal [Peters, 1997; Peters,

1998-A; Eeltink, 2005; Geiser, 2007], photoinduced [Geiser, 2007; Ngola, 2001;

Delaunay-Bertoncini, 2004; Faure, 2007] or chemical [Cantó-Mirapeix, 2008-A; Cantó-

Mirapeix, 2009-A] polymerization of a mixture that contains one or more

functional monomers, a cross-linking agent, a porogenic solvent and an initiator.

Photo-initiation process is faster than other initiation ways and provides a

spatial and temporal control of the polymerization reaction, since the radiation

can be focused on a location of interest and stopped at a specified time. Thus, UV

irradiation constitutes the most common way of photo-polymerization [Geiser,

2007; Ngola, 2001; Delaunay-Bertoncini, 2004; Faure, 2007; Yu, 2002; Augustin, 2006],

although other sources of electromagnetic radiation (e.g., electron beam, γ-rays

or microwaves [Bandari, 2007; Sáfrány, 2005; Zhang, 2008]) have also been used to

induce the polymerization reaction.

Typically, the morphological properties of polymeric monoliths are

controlled by the type of porogenic solvent selected and the amounts of both

porogen and crosslinker used [Peters, 1997; Peters, 1998-A; Eeltink, 2005; Svec, 1995-

B; Eeltink, 2007]. In contrast, very less attention has been paid to the effects of


317

other variables such as type of free-radical initiator and its concentration, which

both affect the kinetics of the free-radical polymerization. Consequently, these

will affect the morphology of the resulting polymer.

Most literature concerning UV-initiated polymeric-based monoliths has

reported the use of AIBN [Geiser, 2007; Ngola, 2001; Delaunay-Bertoncini, 2004;

Faure, 2007; Yu, 2002; Augustin, 2006; Augustin, 2008; Bernabé-Zafón, 2009] or

DMPA [Ro, 2004; Lee, 2004; Huo, 2007; Gu, 2007] as initiators, whereas others, such

as BPO and LPO [Chen, 2007; Du, 2007; Bevington, 2004; Cantó-Mirapeix, 2008-D]

have been less employed.

In this work, the preparation of LMA-based monoliths for CEC by photo-

polymerization using several free-radical initiators is described. Fig. VIII.8

shows the decomposition schemes for the four initiators investigated (AIBN,

DMPA, BPO and LPO). Using a 1,4-butanediol/1-propanol mixture as porogenic

solvent, the influence of each type of initiator and its content in the

polymerization mixture was comparatively investigated. The morphology of the

resulting columns was characterized by SEM images, whereas their CEC

properties were evaluated by measuring retention factors, efficiencies and

resolution of a test mixture of non-charged solutes. The run-to-run and column-

to-column reproducibilities of CEC columns were also studied.

VIII.2.1.1. Preparation and characterization of LM columns photo-initiated

with AIBN or DMPA

A series of LMA-based monolithic columns photo-initiated with AIBN

was prepared by modifying the percentage of this initiator in the polymerization

mixture. The composition of this mixture was taken from a previous work

[Bernabé-Zafón, 2009]. It contained 40 wt% monomers (59.8 wt% LMA, 39.9

wt% EDMA and 0.3 wt% META) and 60 wt% porogens (10 wt% 1,4-butanediol


318

and 90 wt% 1-propanol). The AIBN percentage was varied from 0.05 to 0.8 wt%

in the polymerization mixture. As it can be seen in Table VIII.4, minor changes

in efficiency (minimum theoretical plate, Hmin obtained from Van Deemter plots)

were observed for the range of AIBN tested. On the other hand, small variations

in u-values were observed with increasing AIBN content, while the k-values

increased from 0.05 to 0.30 wt% AIBN, followed by a decrease at contents

higher than 0.6 wt% (see Table VIII.4).

N NN

N

N

·N2

hν2 +

A

BC C

O OCH3

OCH3

C

O

· C

OCH3

OCH3

·+hν

C

OCH3

OCH3

· C

O

OCH3 CH3·+

CO

O

O

O

O

O

·hν2

D 2hν

CH3(CH2)9CH2O

O CH2(CH2)9CH3

O

O

CH3(CH2)9CH2O

O

·

Fig. VIII.8. Photolytic cleavage schemes of four investigated photo-

initiators: AIBN (A), DMPA (B), BPO (C) and LPO (D).

In order to understand this behaviour, SEM pictures of these monoliths

were taken. Thus, from 0.05 (Fig. VIII.9, part A) to 0.30 wt% AIBN (Fig.

VIII.9, part B), the characteristic dimensions of the globules are decreased,

which produce an increase in surface area, and consequently, larger retention.


319

A B

C D

Fig. VIII.9. SEM photographs of LMA monoliths photo-polymerized with

AIBN at several contents: 0.05 wt% (A), 0.3 wt% (B) and 0.8 wt% (C).

Part (D) shows a monolith photo-polymerized with 0.05 wt% DMPA.

Polymerization conditions: 40 wt% monomers (59.8 wt% LMA, 39.9 wt%

EDMA and 0.3 wt% META) and 60 wt% porogens (10 wt% 1,4-

butanediol and 90 wt% 1-propanol); photo-polymerization at 0.90 J/cm2 for

10 min. The bar lengths stand for 3.0 µm.

However, SEM photograph of monolith photo-initiated with 0.8 wt%

AIBN (Fig. VIII.9, part C) did not show significant changes in globule size

compared to Fig. VIII.9, part B. It would be reasonable to assume that lower

concentrations of initiator (i.e., 0.05 wt%) would lead to lower number of nuclei

and thus polymers with slightly large globules (Fig. VIII.9, part A). Increasing

the initiator concentration increases the polymerization rate, which would

produce the formation of a larger number of free-radicals and growing nuclei,

which would result in smaller globules.


320

Tab

la V

III.

4. E

lect

roch

rom

atog

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rope

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s of

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321

Tab

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III.

4. C

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-to-

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met

rical

mea

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olu

tion

bet

wee

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nse

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e P

AH

pai

rs.


322

It was in agreement with Fig. VIII.9, part B and C, and with the increase in

retention observed from 0.05 to 0.3 wt% AIBN. However, a reduction in k-

values was observed at larger AIBN contents (Table VIII.4). Several possible

explanations could be given for this irregular retention behaviour. The effect of

initiator concentration on the final globule size is likely to be dependent on the

competition between the rates of nucleation and termination. With increasing

AIBN content, an increase in termination step could be favoured, which leads to

the formation of less chains able to grow a sufficient length either to become

nuclei or to stabilize the growing nuclei. It could reduce the available free sites

for interactions within the polymer, and would produce a decrease in retention of

analytes [Paine, 1990; Lai, 1997]. Another potential explanation is taking into

account “the screening effect” of initiator, as has been reported [Lai, 1997; Gruber,

1992; Guthrie, 1986; Hutchison, 1973; Moad, 1995]. At large initiator concentrations,

the distribution of initiating species will become less uniform, being the majority

of these concentrated in a relatively narrow region close to the radiation source.

Thus, this “surface layer” will effectively screen the deeper layer of initiating

species against UV radiation. This non-uniformity will give rise to an overall

reduction in the rate of polymerization, and consequently, monoliths with less

binding capacity.

The possibility of employing DMPA as free-radicals source by photo-

initiation instead of AIBN was also evaluated. Different amounts of DMPA

ranging between 0.02 and 0.2 wt% were tested (Table VIII.4). Concentrations

above 0.15 wt% led to a fast polymerization of mixture at room temperature,

making a proper filling of the capillaries unfeasible. Along the DMPA range,

similar flow rates and Hmin values were obtained, while the k-values decreased

from 0.02 to 0.05 wt% DMPA, remaining practically constant at 0.15 wt%.

However, SEM pictures of these monoliths did not show significant differences

in morphology. A representative example of porous structure of these monoliths

is given in Fig. VIII.9, part D.


323

The retention behaviour could be explained by taking into account the

above considerations. Additionally, one should keep in mind that the initiation

efficiency of generated radicals depends on the type of photo-initiator. In fact,

each initiator will have its own specific decomposition rate, which would depend

on its concentration and the selected experimental conditions [Gruber, 1992].

A comparison of CEC performance of monoliths photo-initiated with

AIBN and DMPA was also accomplished. As it can be seen in Table VIII.4, at

0.05 wt% for each initiator, slightly better efficiency values were achieved for

columns photo-initiated with DMPA. The k-values were also higher in columns

obtained with DMPA. This fact suggests the presence of higher number of

micropores in the globule structure for monoliths photo-polymerized with

DMPA, and consequently, larger retention, which is confirmed by SEM pictures

(see Fig. VIII.9, parts A and D). Rohr et al. [Rohr, 2001] have reported the use

of DMPA as UV initiator for polymerization 2-hydroxyethyl methacrylate

monoliths providing a much faster polymerization rate than those photo-initiated

with AIBN. Faster polymerization rate results in a faster initiation and therefore

the formation of smaller globules.

Additionally, the RG, measured as the geometrical mean of the resolution

between the consecutive PAH pairs, was also evaluated. Monoliths prepared with

DMPA showed slightly better resolution values than those obtained for AIBN

taking into account the studied range for each initiator (Table VIII.4). Fig.

VIII.10, parts A and B shows the electrochromatograms of PAHs obtained with

monoliths photo-initiated at the optimal percentage of AIBN and DMPA,

respectively.


324

0

20

40

60

80

1 2 3 4

Abs

orb

anc

e (m

AU

) A

1

2

3

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40

60

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D

13

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U)

0

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120

160

1 2 3Time (min)

1

2

3

4

5 67

C

1 2 30

20

40

60

80B

1 2

3

4

5 6 7

Fig. VIII.10. Electrochromatograms of a PAH test mixture obtained using

LMA-based monolithic column photo-polymerized with several initiators:

0.3 wt% AIBN (A), 0.05 wt% DMPA (B), 0.05 wt% BPO (C) and 0.3 wt%

LPO (D). Other details about the composition of the columns are given in

Fig. VIII.9. CEC conditions: mobile phase, 80:20% (v/v) ACN/aqueous

5mM Tris (pH 8.0); applied voltage, 25 kV. Peak identification: (1)

thiourea, (2) naphthalene, (3) fluorene, (4) anthracene, (5) pyrene, (6)

benz[a]anthracene and (7) benzo[k]fluoranthene.

VIII.2.1.2. Preparation and characterization of LMA columns photo-initiated

with BPO or LPO

LMA-based monolithic columns were prepared using BPO or LPO as

photo-initiators and the same polymerization mixture described in the previous

section was adopted. The BPO content was varied from 0.02 to 0.8 wt% in the

polymerization mixture, while the content of LPO ranged from 0.05 to 0.8 wt%

(see Table VIII.4). When BPO was increased from 0.02 to 0.30 wt%, a decrease

in the k-values was observed, followed by an increase at 0.6 wt%, and a later


325

decrease at 0.8 wt%. The beds initiated with 0.05 (Fig. VIII.11, part A) and 0.6

wt% (Fig. VIII.11, part C) showed globule sizes smaller than those obtained

with 0.3 wt% (Fig. VIII.11, part B), which would explain its lower retention.

The monolith initiated at 0.8 wt% did not show significant changes in

morphology compared to 0.6 wt%.

A

B C

Fig. VIII.11. SEM photographs of LMA monoliths photo-polymerized

with BPO at several contents: 0.05 wt% (A), 0.3 wt% (B) and 0.6 wt% (C).

Other details about the composition of the columns are given in Fig.

VIII.9.

As we commented in previous section, a possible explanation of this

retention behaviour could be related to the competition between the rates of

coagulation and nucleation along initiator concentration.

LMA-based monolithic columns using LPO as initiating system were also

prepared. At 0.05 wt% LPO (Fig. VIII.12, part A), large globule sizes were

observed, whereas beds initiated with higher LPO contents gave similar


326

monolithic structures (see Fig. VIII.12, part B as representative example). Thus,

these latter monoliths showed small variations in u- and k-values.

A B

Fig. VIII.12. SEM photographs of LMA monoliths photo-polymerized

with LPO at several contents: 0.05 wt% (A) and 0.6 wt% (B). Other details

about the composition of the columns are given in Fig. VIII.9.

A comparison of CEC performance of both diacyl peroxides was also

performed. Taking into account the initiator content employed, for both types of

monoliths, some differences in the studied parameters could be observed. As it

can be seen in Table VIII.4, at low initiator contents (i.e., 0.05 wt%), the k-

values were slightly higher with BPO than those observed for LPO, which was

consistent with SEM pictures of these columns (see Figs. VIII.11, part A and

VIII.12, part A). On the other hand, for initiator contents comprising between

0.05–0.3 wt% BPO and 0.15–0.6 wt% LPO, the k-values obtained with BPO

initiated monoliths were lower than those observed for LPO ones. This result was

consistent with SEM pictures, which showed larger globules in beds made with

BPO than those prepared with LPO (see Figs. VIII.11, part B and VIII.12, part

B). However, for BPO contents above 0.6 wt%, the use of this initiator provided

again monoliths with larger retention. As we commented above, these variations

in retention could be probably ascribed to the yield of radical generation, which

depends on the type and concentration of photo-initiator [Gruber, 1992].


327

As observed for LPO, similar k-values were obtained within the range

0.15–0.8 wt%, in contrast to their BPO counterparts. This fact would allow the

possibility of a fine control of morphological and electrochromatographic

properties of LMA-based monolithic columns prepared using LPO.

In terms of efficiency and resolution, similar values were achieved both

using BPO and LPO over the tested initiator range, except at 0.3 wt% BPO,

where the lowest efficiency and resolution values (Table VIII.4) were achieved,

probably due to its large globule size. Fig. VIII.10, parts C and D shows the

electrochromatograms of PAHs that provided the best chromatographic

performance obtained with the monoliths initiated with BPO and LPO,

respectively.

Finally, a comparison of four investigated photo-initiators was performed

taking into account the optimal initiator concentration found for each one. As

shown in Table VIII.4, the four initiating systems investigated showed in their

optimum conditions similar Hmin and RG values. Fig. VIII.13, parts A to D

shows the Van Deemter plots for several PAHs with the optimal monoliths found

for each photoinitiator. The AIBN and LPO monoliths showed low mass transfer

contributions (C-term): 5.6–12.1 and 6.8–12.5 ms, respectively, followed by

DMPA (8.2–14.3 ms) and BPO (7.8–16.6 ms). At the sight of these values and

Fig. VIII.13, the AIBN monoliths showed the flatter profile, which offered the

possibility of increasing the speed of analysis without a significant loss in

efficiency. Anyway, as shown in Fig. VIII.10, for all tested monoliths, the PAHs

were satisfactorily separated at 25 kV in less than 4 min. The monoliths initiated

with LPO gave the best compromise between separation performance and

analysis time, followed by AIBN, DMPA and BPO.

The repeatability of LMA-based monolithic columns prepared using the

optimal monolithic columns found for each photoinitiator was also examined


328

(see Table VIII.4). Satisfactory run-to-run repeatabilities in the tested

chromatographic parameters were found for each initiator, whereas for column-

to-column repeatability, the beds photo-polymerized with BPO showed the

largest RSD values (see Table VIII.4).

Hm

in(µ

m)

A

0

10

20

30

0 0.4 0.8 1.2 1.6

Hm

in(µ

m)

C

0

10

20

30

0 0.4 0.8 1.2 1.6u (mm s-1)

B

0

10

20

30

0 0.4 0.8 1.2 1.6

D

0

10

20

30

0 0.5 1 1.5 2u (mm s-1)

Fig. VIII.13. Van Deemter plots of LMA monolithic columns photo-

polymerized with 0.3 wt% AIBN (A), 0.05 wt% DMPA (B), 0.05 wt%

BPO and 0.3 wt% LPO (D). Compounds: (◊) naphthalene, (□) anthracene,

and (∆) benzo[k]fluoranthene. Polymerization conditions as in Fig. VIII.9

and CEC conditions as in Fig. VIII.10.

CAPÍTULO IX

CONCLUSIONES GENERALES /

GENERAL CONCLUSIONS

Capítulo IX. Conclusiones generales

331

IX.1. Surfactantes

IX.1.1. APGs

IX.1.1.1. Separación y determinación de APGs por LC con detección ESI-MS

Los espectros de masas de los APGs en el modo PI están constituidos por

picos de iones [M+Na]+. Utilizando una columna de alquilamida, elución

isocrática y detección MS, se consiguió una buena separación de los AMGs, con

resolución entre los epímeros α- y β- y los isómeros de anillo. Los isómeros de

los APGs (alquildiglicósidos y alquiltriglicósidos) también se resolvieron

parcialmente. Alternativamente, los isómeros de anillo pueden resolverse en

menor tiempo utilizando una columna de cianopropilo y elución en gradiente con

la ventaja de que esta columna requiere un tiempo de equilibrado mucho más

corto que la columna de alquilamida. Ambos métodos permiten la identificación

y cuantificación de APGs en mezclas industriales y productos de tocador.

Utilizando ESI-MS como sistema de detección, los factores de respuesta de los

AMG son independientes del contenido de ACN en la fase móvil. Los factores de

respuesta aumentan en más de un orden de magnitud al pasar del C1G1 al

C10G1, y nuevamente disminuyen para cadenas de alquilo más largas; por lo

tanto, para evitar un error sistemático en la determinación de los APGs de mayor

interés industrial (C10G1-C16G1) es necesario utilizar estándares de todos los

oligómeros.

The mass spectra of the APGs in the positive-ion mode were constituted by

the single peaks of the [M+Na]+ ions. Using an alkylamide column, isocratic

elution and MS detection, the alkylmonoglycosides can be separated with

resolution between the α- and β-epimers and ring isomers. The isomers of the


332

alkyldiglucosides and alkyltriglucosides are also partially resolved. The ring

isomers can be also resolved in a shorter time using a cyanopropyl column with

gradient elution. Also in comparison with the alkylamide column, the

cyanopropyl column requires a much shorter equilibration time. The APGs

present in industrial mixtures and products (toiletries) can be quickly identified

and quantified by any of these two methods. Using ESI–MS, the response factors

of alkylmonoglycosides are independent from the acetonitrile contents of the

mobile phase, but increase more than one order of magnitude from C1G1 up to

C10G1, and decrease again for longer alkyl chains; thus, standards of all the

oligomers are required to avoid systematic error in the determination of the

alkylpolyglycosides of most industrial interest (C10G1–C16G1).

Main points:

- The ESI-MS spectra of the APGs in PI mode consist mainly of [M+Na]+

peaks.

- A column of silica-alkylamide allows the separation of the AMGs, with

resolution between epimers and ring isomers, as well as the partial resolution

of the APGs (alkyldiglicosides and alkyltriglicosides). Its main drawback is

the long equilibration time, thus, isocratic elution should be used.

- Using a cyanopropyl column and gradient elution, the AMG ring isomers are

resolved in shorter analysis times than using the alkylamide column.

- The two methods can be applied to the identification and quantification of

APGs in industrial mixtures and toiletries.

- In ESI-MS, the AMG response factors are independent of the content of ACN

in the mobile phase, increase from C1G1 to C10G1, and decrease for longer

alkyl chains.


333

IX.1.1.2. Estudio de fragmentación de la D-glucosa y los AMG en presencia de

iones de sodio en IT-MS

En presencia de iones Na+, los espectros MS en modo PI correspondientes

a la D-glucosa y a los APGs con cadenas alquílicas de hasta 12 átomos de

carbono presentaron, predominantemente, iones [M+Na]+. Los espectros de MS2

obtenidos a partir de los iones progenitores [M+Na]+ mostraron un patrón de

fragmentación común con las siguientes características: (i) un ion a m/z 185, cuya

obtención se debe a una deshidratación en la D-glucosa, o a la pérdida de la

cadena alquílica en forma de alcohol en los APGs; (ii) un ion a m/z 143

producido por una rotura 0,2A en el anillo; (iii) un ion a m/z 413, que no contiene

átomos de carbono, y que se debe probablemente a un cluster o grupo constituido

por Na+, OH- y H2O; (iv) aductos que contienen una molécula de D-glucosa o el

correspondiente APG (se representa como M), con las estructuras [M+413]+,

[M+413-2H2O]+ y [M+413+H2O-NaOH]+; y (v) unos iones adicionales, cuya

estructura depende de la longitud de la cadena de alquilo. Además, la D-glucosa

también mostró un débil ión a m/z 113 producido por una rotura 0,3A en el anillo

(Fig. IV.8), mientras que todos los APGs mostraron un ion a m/z 129 producido

por una rotura transversal 2,5A del anillo.

Debido a la falta de estándares comerciales de AMGf, los patrones de

fragmentación de estos isómeros de anillo se estudiaron mediante HPLC-MS y

HPLC-MS2 de mezclas industriales de APGs. Estas mezclas contienen pequeñas

concentraciones de octil- y decil-MGf. En comparación con los AMGf, el ion a

m/z 413 y los aductos formados a partir de éste con moléculas no fragmentadas

se producen más fácilmente con los AMGp. Por el contrario, el ion a m/z 143 se

produce más fácilmente con los AMGf que con los AMGp, lo que puede deberse

a la menor estabilidad de los anillos de cinco miembros (furanósidos) respecto a

los de seis miembros (piranósidos).


334

In the presence of Na+, the PI MS spectra of D-glucose and the APGs with

alkyl chains up to 12 carbon atoms gave predominantly [M+Na] + ions. The MS2

spectra obtained from the isolated [M+Na]+ parent ions showed a common

fragmentation pattern with the following features: (i) an m/z 185 ion, which is

due to dehydration and to loss of the alkyl chain as an alcohol in the cases of D-

glucose and the AGPs, respectively; (ii) an m/z 143 ion produced by a 0,2A cross-

ring cleavage; (iii) an m/z 413 ion, not containing carbon atoms and probably

containing Na+, OH-, and H2O; (iv) adducts containing a molecule of either D-

glucose or the corresponding AGP, M, with the structures [M+413]+, [M+413–

2H2O]+, and [M+413+H2O–NaOH]+; and (v) a few additional ions, whose

structures depended on the length of the alkyl chain. In addition, D-glucose also

showed a weak m/z 113 ion produced by a 0,3A cross-ring cleavage (Fig. IV.8),

and all the AGPs exhibited an m/z 129 ion produced by a 2,5A cross-ring

cleavage.

Standards of AMGf were not available; however, the fragmentation

patterns of these ring isomers were studied by using HPLC-MS and HPLC-MS2

of industrial mixtures of APGs. These mixtures contain minor concentrations of

octyl- and decyl-MGf. In comparison with the AMGf, the m/z 413 ion and its

adducts with unfragmented molecules were more easily formed by the AMGp. In

contrast, the m/z 143 ion occurred more easily in the AMGf than in the AMGp,

which can be due to the lower stability of the five-membered furanoside rings.

Main points:

- In the presence of Na+, the [M+Na]+ peak also predominates in the ESI-MS

spectrum of D-glucose in PI mode.

- When obtained from [M+Na]+ parent ions, the ESI-MS2 spectra of D-glucose

and the APGs show a common fragmentation pattern.


335

- The spectra of AMGp y AMGf (ring isomers) can be separately studied by

using HPLC-MS y HPLC-MS2. The corresponding spectra show differences

that can be useful to identify the ring isomers.

IX.1.2. Alcoholes

IX.1.2.1. Oxidación de alcoholes no etoxilados y etoxilados con cromo(VI) y

posterior determinación por ESI-MS

Los alcoholes alifáticos no pueden ser detectados por MS empleando ESI

u otras interfaces de ionización a presión atmosférica. Sin embargo, en el

procedimiento propuesto, la oxidación de alcoholes primarios alifáticos con CrO3

(reactivo de Jones), para dar los correspondientes ácidos carboxílicos de forma

rápida y cuantitativa, permite su detección mediante ESI-MS. Una vez oxidados

mediante el método propuesto, los alcoholes primarios presentes en muestras

industriales y ambientales pueden ser identificados y cuantificados por infusión

directa en el espectrómetro de masas. Se infunde una disolución transparente e

incolora constituida por extractos en acetato de etilo/acetona. La sensibilidad en

modo NI se exalta por la simple adición de un 10% de agua alcalinizada a los

extractos. Por otra parte, la sensibilidad de este método es mayor al aumentar la

masa molecular de los alcoholes, de manera que para alcoholes de cadena larga

se consiguen LODs particularmente bajos.

Los rendimientos combinados de las etapas de extracción-oxidación

fueron de prácticamente del 100% para alcoholes no etoxilados disueltos en

acetona, y disminuyeron progresivamente para muestras que presentaban

cantidades crecientes de agua. Por ejemplo, con un 50% de agua se obtuvo un

rendimiento del 75%. Por esta razón, las muestras industriales que contienen

agua en proporciones importantes se diluyeron con acetona antes de añadir el


336

reactivo de Jones. Con ello se reduce considerablemente la concentración final de

los analitos en las muestras, lo que no constituye ningún problema en control de

calidad industrial, donde las concentraciones de analito suelen ser grandes. Sin

embargo, en muestras ambietales, a causa de las bajas concentraciones de analito

normalmente presentes, se necesita una preconcentración de la muestra. La

preconcentración puede hacerse por SPE, lo que permite remplazar el agua por

otro disolvente (como acetona) durante la etapa de elución.

La formación de aductos con H+ permite el análisis por MS de los

alcoholes etoxilados en modo PI, aunque la sensibilidad es baja para oligómeros

con un número pequeño de unidades de EO. Por otra parte, los espectros en

modo PI son más complejos y con una peor relación señal-ruido que los

espectros en modo NI. Por lo tanto, la oxidación de los FAEs a los

correspondientes ácidos etoxicarboxílicos, seguido por MS en el modo NI, tiene

mayor interés. En el procedimiento desarrollado, los FAEs se oxidan con unos

rendimientos del 65 y 60% para los oligómeros con m = 1-2 y m ≥ 2,

respectivamente. La oxidación también puede dar lugar a la pérdida de una

unidad de EO, sin embargo, el rendimiento de esta reacción secundaria es bajo

(4-8%). Por otra parte, al variar el número de átomos de C y de EOs, los

rendimientos en la oxidación de los FAEs fueron bastante constantes. Por otra

parte, las sensibilidades en MS fueron mayores para los ácidos etoxicarboxílicos

que para los ácidos carboxílicos con el mismo número de átomos de carbono

(véase Fig. IV.13).

Los alcoholes no etoxilados y alcoholes con un bajo grado de etoxilación

se suelen determinar por GC-FID. Las ventajas del procedimiento propuesto en

este trabajo son la rapidez y las elevadas sensibilidades obtenidas para los

alcoholes de cadena larga, lo que tiene interés en el análisis de muestras con

matrices complejas. En cosméticos, productos para el cuidado corporal y


337

extractos de muestras medioambientales, la presencia de muchos compuestos

neutros con volatilidades relativamente altas da lugar a cromatogramas muy

complejos en GC. En el procedimiento propuesto, esta complejidad se evita por

la oxidación de los alcoholes a los correspondientes ácidos carboxílicos, y por el

aislamiento de los mismos mediante extracción líquido-líquido. Tras aumentar el

pH, los extractos se infunden directamente en un espectrómetro de masas

trabajando en modo NI. Además, el procedimiento oxidación-extracción

propuesto permite también el análisis de alcoholes por HPLC-MS, CE-MS, y

CEC-MS. Por el contrario, los alcoholes no etoxilados con altas masas

moleculares no se detectan (o bien se observan con una sensibilidad muy baja)

por HPLC-ELSD, mientras que la sensibilidad de alcoholes mono y dietoxilados

es también bajas con esta técnica [Bernabé-Zafón, 2006]. Por esta razón, otra

ventaja del procedimiento propuesto es que permite ampliar el campo de

aplicaciones de los detectores evaporativos, haciendo posible la detección de

alcoholes no etoxilados, y mejorando la respuesta de alcoholes mono y

dietoxilados. Por último, cuando los ácidos carboxílicos correspondientes a la

oxidación de los alcoholes de interés están inicialmente presentes en la muestra,

las señales obtenidas por el método propuesto corresponden a la suma de

alcoholes y ácidos carboxílicos. En estos casos, se puede obtener un espectro o

cromatograma adicional a partir de la muestra sin la adición del reactivo de

Jones, y utilizarlo para restar la contribución de las señales derivadas de los

ácidos carboxílicos inicialmente presentes en la muestra. De este modo, es

posible aislar las contribuciones de los alcoholes respecto a las debidas a los

ácidos carboxílicos. Aunque la sustracción de la señal aumenta el error aleatorio,

la pérdida de precisión es pequeña cuando la concentración de alcohol en las

muestras es bastante mayor que la de los ácidos carboxílicos correspondientes, lo

que es frecuente en muchos casos.


338

Aliphatic alcohols cannot be detected by MS using ESI and other

atmospheric-pressure ionization interfaces. However, in the proposed procedure,

the oxidation of primary aliphatic alcohols with a CrO3 solution in aqueous

sulphuric acid (Jones’ reagent) resulted in their rapid and quantitative

conversion into the corresponding carboxylic acids. Primary alcohols present in

industrial and environmental samples can be identified and quantitated by

infusion of the transparent and uncoloured ethyl acetate-acetone extracts in a

mass spectrometer. Sensitivity in the NI mode is strongly enhanced by the

addition of 10% alkalinized water to the extracts. Moreover, the sensitivity of this

approach further increases as the molecular mass of the alcohols increases, such

that for long-chain alcohols the LODs obtained using the proposed procedure

were particularly low.

Oxidation-extraction yields, which were ca. 100% for nonethoxylated

alcohols dissolved in acetone, decreased moderately in samples containing

increasing amounts of water, e.g., a 75% yield was obtained in the presence of

50% water. For this reason, industrial samples containing large amounts of

water were diluted with acetone before Jones’ reagent was added. While this

greatly reduced the final concentration of the analytes in these samples, this

should not be a problem in industrial quality control, where analyte

concentrations are usually large. However, owing to the low analyte

concentrations typically present in environmental samples, preconcentration of

the sample, with replacement of water by another solvent, is usually required.

The formation of H+ adducts enables MS analysis of ethoxylated alcohols

in PI mode, although the sensitivity is low for oligomers with a small number of

EO units. Furthermore, PI mode spectra are potentially more complex and

noisier than NI mode spectra. Thus, oxidation of ethoxylated alcohols to the

corresponding ethoxycarboxylic acids, followed by NI mode MS, is also of


339

interest. In the procedure developed in this work, ethoxylated alcohols are

oxidized, with ca. 65 and 60% yields for m=1–2 and m ≥ 2 oligomers,

respectively. Oxidation may also result in the loss of an EO unit; however, the

extension of this side reaction is low (4–8%). Furthermore, oxidation yields of

ethoxylated alcohols were fairly constant, and MS sensitivities were larger for

ethoxycarboxylic acids than for carboxylic acids with the same number of carbon

atoms (see Fig. IV.13).Therefore, application of the proposed procedure not only

to nonethoxylated alcohols but also to ethoxylated alcohols is of much interest.

Non-ethoxylated alcohols and alcohols with a low degree of ethoxylation

are usually identified and determined by GC-FID. The advantages of the

procedure proposed in this work are its rapidity and the prominent signals

obtained from long-chain alcohols present within wide concentration ranges in

samples comprising complex matrices. In cosmetics, body-care products, and

extracts from environmental samples, the presence of many neutral compounds

with relatively large volatilities frequently gives rise to complex gas

chromatograms. In the proposed procedure, this is avoided by alcohol oxidation

to carboxylic acids and isolation of the acids by liquid-liquid extraction; after the

pH has been raised, the extracts can be directly infused in the mass spectrometer

working in the NI mode, without the need for further purification. Moreover, the

proposed oxidation-extraction procedure allows alcohol analysis by HPLC-MS,

CE-MS, and CEC-MS as well. By contrast, non-ethoxylated alcohols up to high

molecular masses are either not detected or are observed with low sensitivities

by HPLC-ELSD, while the sensitivities for mono- and diethoxylated alcohols are

likewise poor [Bernabé-Zafón, 2006]. Thus, a further advantage of the proposed

procedure is that it expands the range of applications of evaporative detectors to

include non-ethoxylated alcohols and improves the response of mono- and

diethoxylated alcohols. Finally, signals corresponding to the sum of alcohols and


340

carboxylic acids are obtained when these acids are initially present in the

sample. In this case, an additional spectrum or chromatogram, obtained without

adding Jones’ reagent to the sample, can be used to subtract the signal

contributions arising from the carboxylic acids initially present in the sample

and thus to isolate the contributions of alcohols. Although signal subtraction

increases the random error, the loss of precision is small when the alcohol

concentration in the samples is larger than that of the corresponding carboxylic

acids.

Main points:

- A procedure that combines the oxidation of aliphatic primary alcohols and

the extraction of the resulting carboxylic acids to obtain an extract free of

inorganic salts has been developed. The oxidation-extraction yields are close

to 100%.

- Aliphatic primary alcohols are not detected in MS; however, using this

procedure, the identification and quantification of aliphatic primary alcohols

by ESI-MS is possible.

- In NI mode, sensitivity increases with pH and the molecular mass of the

alcohol, being also higher when alcohol is ethoxylated.

- The oxidation yield decreases with increasing water content in the sample.

- After SPE preconcentration in SPE cartridges, followed by elution with

acetone, the method can be applied to samples of the aquatic environment.

- Owing to the formation of adducts with H+, ethoxylated alcohol can be

analyzed by MS in the PI mode; however, the sensitivity is low for oligomers

with a low EO number. In addition, PI mode spectra are more complex tan Ni

mode spectra. Also, the signal to noise ratio in the PI mode is lower than that

usually found in NI mode spectra.


341

- Oxidation of FAEs to ethoxycarboxylic acids results in loss of one EO unit,

but the yield of this side reaction is small (< 8%).

- Ethoxylated alcohols are oxidized with lower yields (60-65%) than those

obtained with non-ethoxylated alcohols (~ 100%), however, oxidation yields

are independent from the number of carbon atoms and the number of EOs.

- The proposed method allows the use of evaporative detectors and mass

spectrometry detection in the determination of aliphatic primary alcohols.

The method is direct, fast and results in lower LODs with complex samples of

industrial and environmental origin.

IX.1.3. AES

IX.1.3.1. Determinación de FAEs y AESs por separación mediante SAX,

derivatización con un anhídrido cíclico y LC

En trabajos anteriores, se han desarrollado procedimientos para la

caracterización y la determinación de FAEs basados en su derivatización con un

anhídrido cíclico, seguida por separación de los oligómeros mediante RP-HPLC

[Micó-Tormos, 2008-A; Micó-Tormos, 2008-B; Micó-Tormos, 2009; Micó-Tormos, 2010].

Sin embargo, cuando los FAEs se esterifican, los AESs se transesterifican, dando

lugar ambas clases de surfactantes a los mismos derivados. Por lo tanto, en el

caso en que las dos clases de surfactantes estén presentes en una muestra, los

cromatogramas resultantes muestran, en realidad, la suma de FAEs y AESs. Por

lo tanto, en este trabajo se ha desarrollado un procedimiento para la separación

de ambas clases de surfactantes, empleando SPE con un cartucho de SAX. Tras

la separación, los oligómeros se derivatizan independientemente y se determinan

por RP-HPLC-UV. La separación casi cuantitativa de las dos clases de

surfactantes, incluyendo oligómeros hidrofílicos e hidrofóbicos, se logró


342

mediante la elución de las fracciones correspondientes a los FAEs y AESs en tres

y dos pasos, respectivamente. Como ya se demostró previamente para los FAEs,

la derivatización de los AESs también tiene lugar de forma cuantitativa. Para ello

se puede usar anhídrido ftálico o difénico en 1,4-dioxano a 105 ºC. La separación

de los oligómeros derivatizados empleando RP-HPLC y elución en gradiente con

fases de ACN/agua, mostró una buena resolución entre las sucesivas series

hidrocarbonadas, y entre los oligómeros dentro de una misma serie. También se

ha demostrado que los FAEs pueden utilizarse como patrones de calibración para

AESs, lo que supone una ventaja, ya que los estándares de AESs son raros y

caros, mientras que los estándares de alcoholes grasos son ampliamente

disponibles; además, los estándares de AES con m > 0 no se encuentran

comercialmente disponibles. Por otro lado, otras clases de surfactantes aniónicos

de uso general en productos de limpieza, como son el SAS y el LAS, no

interfieren. El método propuesto se aplicó satisfactoriamente a la caracterización

y determinación de FAEs y AESs en detergentes líquidos industriales y en

extractos de agua de mar. El procedimiento propuesto es también útil para el

control de calidad industrial de los AESs, donde los FAEs suelen estar presentes

como impurezas, a causa de que en el proceso de obtención de los AESs la

sulfatación no es cuantitativa.

In previous work, procedures for FAE characterization and determination

based on derivatization with a cyclic anhydride, followed by RP-HPLC with UV

or MS detection, were developed [Micó-Tormos, 2008-A; Micó-Tormos, 2008-B; Micó-

Tormos, 2009; Micó-Tormos, 2010]. However, when FAE are esterified, AES are

also transesterified, leading to the same derivatives as FAE. Thus, if the two

surfactant classes are present in the samples, the resulting chromatograms show

the sum of both FAE and AES oligomers. In this work, a procedure for the SAX


343

separation of both surfactant classes, followed by their independent

derivatization and RP-HPLC-UV, was developed. Quantitative isolation of the

two surfactant classes, including both hydrophilic and hydrophobic oligomers,

was achieved by eluting the FAE and AES fractions in three and two steps,

respectively. As previously shown for FAE, quantitative derivatization of AES

with either phthalic or diphenic anhydrides has been demonstrated. Separation

of the derivatized oligomers, with good resolution between both the hydrocarbon

series and the successive oligomers within the series, was achieved by RP-HPLC

using gradient elution with ACN/ water. It has been also shown that FAE

oligomers can be used as calibration standards for AES, which is an advantage

because standards of alkylsulfates are rare and expensive, whereas standards of

fatty alcohols are widely available; further, standards for AES with m > 0 are

not commercially available. On the other hand, anionic surfactant classes

commonly used in cleaners, including SAS and LAS, did not interfere. The

proposed method was successfully applied to the characterization and

determination of FAE and AES in industrial liquid cleaners and seawater

extracts. The proposed procedure is also useful to control the quality of

industrial AES, where FAE are always present as an impurity, due to the non-

quantitative sulfatation of FAE during AES manufacture.

Main points:

- Reacting with a cyclic anhydride, FAEs are esterified, and AESs are

transesterified, quantitatively giving rise to the same derivatives (hemiesters

of the alcohol residues).

- Using a SAX cartridge, a procedure for the quasi quantitative separation of

FAEs and AESs has been developed.


344

- A method for the characterization and determination of FAEs and AESs in

mixtures has been developed. The method is based on the separation of the

two surfactant classes with a SAX cartridge, followed by derivatization with a

cyclic anhydride and RP-HPLC-UV. A good resolution between consecutive

series (different hydrocarbon chain), and between the oligomers within a

series is obtained.

- The method allows the use of FAEs as calibration standards for AESs.

- The method is useful to characterize and determine FAEs and AESs in

industrial liquid detergents and in seawater. Other classes of anionic

surfactants such as SAS or LAS do not interfere.

IX.2. Polímeros sintéticos

IX.2.1. PVP-NO

IX.2.1.1. Caracterización de PVP-NO por CE y MECK

Los estudios mediante FSCE realizados en este trabajo han mostrado que

el PVP-NO es un polímero aparentemente no iónico, que se comporta como un

polielectrolito con un carácter aniónico bien definido en disolución acuosa. Los

resultados obtenidos por FSCE están de acuerdo con los obtenidos previamente a

través de estudios de viscosidad, conductividad, dispersión de luz y ácido-base

[Okamoto, 1998; Lee, 1996; Yamamoto, 1996]. Los resultados también son

consistentes con la presencia de al menos dos formas del polímero en

disoluciones acuosas, probablemente una de ellas constituida por cadenas libres

(unímeros) y la otra por agregados. Este enfoque estaría de acuerdo con los

estudios realizados por CE para otros polímeros y copolímeros [Cottet, 2001;

Györffy, 1998; Štěpánek, 2001]. Por otro lado, los resultados obtenidos por MEKC


345

indican una fuerte interacción del PVP-NO con las micelas de SDS, y son

coherentes con la formación de micelas mixtas de dos tipos: las constituidas por

polímeros libres y SDS, y las que contienen agregados de polímero y SDS [Arai,

1971; Cabane, 1977]. Esta explicación es consistente con los estudios

espectroscópicos por UV-Vis de Oakes y col. [Oakes, 2003-C]. Por lo tanto, en el

presente estudio se ha demostrado la utilidad de la FSCE y la MEKC en la

investigación del comportamiento de los polímeros sintéticos en disolución.

También se ha demostrado la capacidad del PEA para reducir la adsorción de

polímeros sintéticos sobre la pared interna de los capilares en medio ácido. Por

último, la FSCE puede ser útil en el control de calidad de materias primas y

productos comerciales que contienen PVP-NO, si bien, el procedimiento se

encuentra limitado a productos que no contienen surfactantes aniónicos.

The FSCE studies performed in this work have shown that PVP-NO,

which is a nominally non-ionic polymer, behaves as a polylectrolyte, with a well-

defined anionic character in aqueous solutions. In this concern, the results

obtained by FSCE agreed with those previously reported using viscosity, light

scattering, conductivity and acid-base studies [Okamoto, 1998; Lee, 1996;

Yamamoto, 1996]. The results are also consistent with the presence of at least two

forms of the polymer in aqueous solutions, likely one of them constituted by free

chains (unimers) and the other one by aggregates. This would agree with the CE

studies performed with other polymers and copolymers [Cottet, 2001; Györffy,

1998; Štěpánek, 2001]. On the other hand, the results obtained by MEKC indicated

a strong interaction of PVP-NO with the SDS micelles, and are consistent with

the formation of both free polymer/SDS and aggregated polymer/SDS mixed

micelles [Arai, 1971; Cabane, 1977]. This explanation is consistent with the UV-Vis

spectroscopic studies by Oakes et al. [Oakes, 2003-C]. Thus, the present study


346

further shows the usefulness of both FSCE and MEKC as complementary

techniques in the investigation of the behavior of synthetic polymers in solution.

The capability of PEA to reduce the adsorption of synthetic polymers in weak

acid media has been also demonstrated. Finally, FSCE can be useful in the

quality control of raw materials and commercial products containing PVP-NO,

although the procedure is limited to products not containing anionic surfactants.

Main points:

- Using FSCE, it has been shown that PVP-NO (apparently a non-ionic

polymer) behaves as a polyelectrolyte with anionic character in aqueous

solution, which has been attributed to the deprotonation of water associated

with the NO- group.

- The FSCE experiments are consistent with the presence of two forms of the

polymer in solution, one made up of free chains (unimers) and the other

constituted by aggregates.

- PVP-NO interacts strongly with SDS micelles, giving rise to mixed micelles of

two types: free polymers bound to SDS, and polymer aggregates also bound

to SDS.

- The usefulness of FSCE and MEKC in investigating the behavior of synthetic

polymers in solution has been demonstrated.

- The ability of PEA to reduce adsorption of synthetic polymers on the inner

wall of the capillaries in acid medium has been demonstrated.

- Although limited to samples having no anionic surfactants, FSCE is useful in

the quality control of industrial products containing PVP-NO.


347

IX.2.2. PVP

IX.2.2.1. Caracterización y determinación de PVP por complejación con un

azo-colorante aniónico seguida de NEECEM

En disolución acuosa, los colorantes aniónicos están enlazados al PVP

formando complejos que muestran movilidad aniónica. Durante la separación

electroforética, estos complejos se disocian parcialmente siguiendo una cinética

de primer orden. En este trabajo, la teoría NECEEM, que se desarrolló para

estudiar las interacciones proteína-marcador y proteína-DNA, se aplica por

primera vez al estudio de polímeros sintéticos. Mediante esta teoría se puede

obtener información sobre la estabilidad de los complejos formados entre un

polímero y un colorante. A pesar de la mayor polidispersidad de los polímeros

sintéticos en comparación con las proteínas [Grosche, 2000; Borisch, 2000], el

comportamiento electroforético de las mezclas PVP-colorante ha podido ser muy

bien explicado por la teoría NECEEM. Así, a partir de la inyección de mezclas

con diferentes razones molares monómero/colorante, puede establecerse la

estequiometría máxima de los complejos, y trabajando con razones molares

monómero/colorante cercanas al punto de saturación, puede estimarse también la

constante de estabilidad de los complejos. El método NECEEM es, por lo tanto,

útil para caracterizar polímeros no iónicos, tanto sintéticos como naturales, y

estudiar su interacción con un marcador en disolución. Además, trabajando a

razones molares inferiores al punto de saturación, puede obtenerse la

concentración de monómeros mediante una curva de calibración, y puede

estimarse un promedio de la masa molecular del polímero a partir de relaciones

sencillas basadas en la forma del pico o banda del complejo polímero-marcador.

En este trabajo se estimó la estequiometría de los complejos formados por

el PVP con dos azo-colorantes aniónicos, CR y AB. La saturación de PVP con


348

estos dos colorantes se produjo a una razón molar monómero/colorante próxima

a q = 4. Se estimaron también las constantes de estabilidad de los complejos

PVP-CR. Cuando se trabaja en presencia de un exceso de colorante (q < 4), la

banda de los complejos PVP-CR es útil para predecir la concentración del PVP,

así como su MW promedia, lo que se aplicó a la caracterización de PVP en

productos de limpieza y productos farmacéuticos.

Anionic dyes are bound to PVP in aqueous solutions, forming complexes

that show anionic mobility. During the electrophoretic run, the complexes

partially dissociate following a first-order kinetics. On the basis of the NECEEM

theory, which was formerly developed to study protein–probe and DNA–protein

interactions, information about the stability of polymer–dye complexes can be

obtained. In spite of the much larger polydispersity of synthetic polymers when

compared to proteins [Grosche, 2000; Borisch, 2000], the electrophoretic behaviour

of PVP–dye mixtures is very well explained by the NECEEM theory. Thus, by

injecting mixtures at several monomer/dye molar ratios, the maximal

stoichiometry of the complexes can be established, and by working at

monomer/dye molar ratios close to saturation, the average stability constant of

the complexes can be estimated. The NECEEM method is thus useful to

characterize synthetic and natural nonionic polymers, and to study their

interaction with a probe in solution. In addition, at monomer/dye molar ratios

lower than saturation, the monomer concentration can be obtained by using a

calibration curve, and the average molecular mass of the polymer can be

estimated from a simple relationship provided by the shape of the peak of the

polymer–probe complexes.

In this work the stoichiometry of the complexes formed by PVP with two

anionic azo-dyes, CR and AB, was estimated. Saturation of PVP with these dye


349

ions was produced at a monomer/dye molar ratio close to q = 4. The stability

constants of the PVP–CR complexes were also estimated. Upon addition of an

excess dye to the sample (q < 4), the band of the PVP–CR complexes was useful

to predict both the concentration of PVP and the average molecular mass, Mw,

in cleaning products and pharmaceutical preparations.

Main points:

- Anionic dyes are bound to PVP in aqueous solution, resulting in complexes

with anionic mobility.

- During electrophoretic separation, the PVP-dye complex is partially

dissociated following a first-order kinetics.

- It has been shown that the NECEEM theory, previously developed to

characterize proteins and DNA fragments, is also useful to characterize

synthetic nonionic polymers. Information on the stability of the complexes

and the nature of the polymer (average molecular mass) can be obtained.

- Working at molar ratios below the saturation point, the stoichiometry of the

complexes (number of monomers per dye ion) can be estimated.

- Saturation of the polymer (PVP) with CR or AB occurs at a monomer / dye

molar ratio close to 4.

- Working in an excess dye (q < 4), the band of the PVP-CR complexes

contains information which is useful to predict the PVP concentration and

their average MW.


350

IX.2.3. PVA

IX.2.3.1. Evaluación de la MW y tacticidad del PVA mediante NEECEM de

mezclas polímero-colorante

Cuando una disolución de PVA que contiene borato se mezcla con una

disolución que contiene CR, se forma inmediatamente un complejo PVA-CR. La

formación de este complejo se detecta por el aumento de la absortividad molar y

por el notable desplazamiento batocrómico de la banda principal del espectro de

absorción UV-Vis del CR. Utilizando polaridad positiva, los electroferogramas

de las mezclas PVA-CR en presencia de un exceso de CR mostraron el patrón

predicho por la teoría NECEEM para complejos formados por una

macromolécula sin carga y un marcador aniónico. Cuando la concentración de

PVA aumentó hasta el punto de saturación, el área de la banda del complejo

aumentó también linealmente, y las áreas debidas al exceso de colorante liberado

durante la migración disminuyeron igualmente de forma lineal. Se estimó la

máxima estequiometría del complejo a partir de la variación de áreas a valores

crecientes de la razón molar monómero/colorante (valores de q). Esta razón

osciló entre qsat ~ 4,9 y 3,5 para PVA de MW bajo y alto, respectivamente. Por

otra parte, esta variación se produjo a diferentes valores de log MW dependiendo

de la tacticidad del PVA. A la vista de los valores de la qsat, se discutió la posible

estructura del complejo de PVA-CR. Las correlaciones encontradas entre varios

parámetros electroforéticos obtenidos en las condiciones NECEEM respecto a la

MW y la tacticidad del PVA, pueden explicarse suponiendo que los iones de

colorante se apilan muy próximos unos a otros dentro de la estructura de los

complejos PVA-CR. La corrección de la estequiometría para tener en cuenta el

porcentaje de monómeros acetilados no enlazados (qsat,c) confirmó las diferencias

entre los grupos de muestras de distinta tacticidad. La forma de la banda de los


351

complejos PVA-CR, las áreas relativas de la banda del complejo y del pico del

colorante libre, la movilidad electroforética y la constante de disociación de

pseudo-primer orden del complejo, también resultan estar correlacionadas con la

MW y la tacticidad del PVA. Las muestras más sindiotácticas (tipo H) dieron

complejos con menor movilidad absoluta que las muestras más atácticas (tipos M

y L). Este comportamiento podría deberse a las mayores distancias entre los

grupos OH adyacentes en las muestras tipo H, las cuales presentan una mayor

relación rr /mm que las muestras M y L. El producto µ [qsat + (VD / Vm)]

disminuyó para todas las MW, lo que indica que no llega a alcanzarse el régimen

de drenaje libre (donde la movilidad es constante porque la relación carga/masa

ya no aumenta al seguir creciendo la MW del polímero). La variación de este

producto, también confirmó la dependencia entre la movilidad del complejo

PVA-CR y la tacticidad. Por lo tanto, se puede obtener información útil acerca de

la MW y la tacticidad del PVA a partir de la CZE de mezclas de PVA-CR. Sin

embargo, sería necesario recurrir a la calibración multivariante, incluyendo la

variación ortogonal de las variables MW y el cociente rr /mm, para construir el

correspondiente conjunto de estándares de calibración. Sin una calibración

independiente de estas variables no es posible construir modelos capaces de

hacer predicciones de la MW y la tacticidad con una precisión razonable. El

conjunto de muestras comerciales de PVA recopilado y empleado en este trabajo

fue suficiente para demostrar la dependencia de los parámetros de CZE obtenidos

en condiciones de NECEEM sobre la MW y tacticidad, pero no es lo

suficientemente bueno para hacer una calibración multivariante. Por último,

aunque esto también debe ser estudiado, la NECEEM podría ser útil para evaluar

la MW y la tacticidad de otros polímeros solubles no cargados.


352

A PVA–CR complex is immediately formed when a PVA solution

containing borate and a CR solution are mixed. Complex formation produced a

large increase of the molar absorptivity and a remarkable bathochromic shift of

the main band of the UV–Vis absorption spectrum of CR. Using positive polarity,

electropherograms of PVA–CR mixtures containing a CR excess showed the

pattern predicted by the NECEEM theory for a complex formed by an uncharged

macromolecule and an anionic marker. The area of the complex band increased

linearly, and the areas due to the excess dye and to the dye released by the

complex during migration decreased, when the PVA concentration increased up

to the saturation point. The variation of the areas at increasing monomer/dye

molar ratios (q values) was used to estimate the maximal stoichiometry of the

complex. This ranged from qsat ~ 4.9 to 3.5 for low and high MW PVA,

respectively, this variation being produced at different log Mw values depending

on PVA tacticity. At the sight of the values of qsat, the possible structure of the

PVA–CR complex was discussed. The correlations found along this work among

several electrophoretic parameters obtained in NECEEM conditions with respect

to both molecular mass and tacticity of PVA can be explained by assuming that

the dye ions are stacked in a proximity to each other within the structure of the

PVA–CR complex. Correction of the stoichiometry taking into account the

percentage of unbonding acetylated monomers (qsat,c) confirmed the differences

between tacticity groups. The shape of the PVA–CR complex band, the relative

areas of the complex band and free dye peak, and the electrophoretic mobility

and dissociation pseudo-first-order rate constant of the complex, were also

related to both MW and tacticity of PVA. Thus, the H samples gave complexes

with lower absolute mobilities than the M+ L samples. In comparison to M+ L

samples, these differences could be due to the larger distances between adjacent

OH groups in H samples, which have a higher rr/mm ratio than the M+ L


353

samples. Product µ [qsat + (VD / Vm)] decreased at all MW, thus indicating that a

free draining regime was not reached. The variation of this product also

confirmed the dependence of the mobility per complexed dye ion on tacticity.

Therefore, useful information about both MW and tacticity of PVA can be gained

by CZE of PVA–CR mixtures. However, multivariate calibration, including the

orthogonal variation of the molecular mass and rr/mm ratio values along the set

of standards, would be necessary to construct multivariate models capable of

making predictions of these two responses with reasonable precision. The set of

commercial PVA samples we collected and used in this work was adequate to

demonstrate the dependence of CZE parameters obtained in NECEEM

conditions on molecular mass and tacticity, but it was deficient to support

multivariate calibration. Finally, although this should be also investigated,

NECEEM could be useful to evaluate MW and tacticity of other soluble non-

charged polymers.

Main points:

- The PVA-CR complex is immediately formed upon mixing a solution of PVA

with a solution containing CR (in the presence of borate). Upon complex

formation, an increase in the molar absorptivity of the main UV-absorption

band of CR, and a large bathochromic shift, is produced.

- In the presence of an excess of CR, the electropherograms of PVA show the

pattern predicted by the NECEEM theory.

- Increasing the PVA concentration up to the saturation point, the band area of

the complex increases linearly, while the sum of the areas due to excess dye

and the dye released during migration, also decreases linearly.


354

- The maximum stoichiometry of the complex ranges from qsat ~ 4.9 to 3.5 for

samples of PVA of high and low MW, respectively. This variation occurs at

different values of log MW, depending on the tacticity of PVA.

- The correlations between MW and tacticity of PVA with various

electrophoretic parameters obtained in the NECEEM conditions can be

explained by assuming that in these complexes, dye ions are stacked very

close together within the structure of the PVA-CR complex.

- Correction of the stoichiometry of the complex to take into account the

percentage of unbound acetylated monomers, confirmed the differences

observed between groups of samples of different tacticity.

- The shape of the band of PVA-CR complexes, the relative areas of the band of

the complex and free dye peak, the electrophoretic mobility and the

dissociation constant of the complex, are all correlated with MW and tacticity.

IX.3. Enzimas

IX.3.1. CZE

IX.3.1.1. Identificación de enzimas de la industria de la detergencia por CZE

de enzimas intactas

Se ha demostrado que la separación de proteínas intactas por CZE,

utilizando dos BGEs, uno ácido y otro básico, es potencialmente útil para

identificar las enzimas comúnmente utilizadas en la formulación de productos de

limpieza. En particular, el BGE básico proporciona una línea base habitualmente

plana, lo que permite distinguir una serie de pequeños picos que muestran pautas

características del tipo de enzima. Además del tiempo de migración del pico

principal, la presencia de un segundo pico de mediana intensidad también


355

constituyen un rasgo característico de algunas enzimas utilizadas en la industria

de los detergentes. La cuantificación del contenido proteico por el método de

Bradford, permitió calcular las sensibilidades relativas a partir de las áreas totales

de los picos obtenidos en los electroferogramas en los BGEs básico y ácido.

Estas sensibilidades también pueden ser útiles para clasificar o identificar las

enzimas. La aplicación del procedimiento a muestras reales falla en presencia de

surfactantes aniónicos, si bien, algunas muestras que contienen surfactantes no

iónicos dan resultados aceptables.

It has been shown that CZE of the intact proteins using either basic or

acid BGEs is potentially useful to identify the enzyme brands commonly used in

the formulation of cleaning products. In particular, the basic BGE gives flat

baselines, which makes possible to distinguish a number of small peaks

constituting rather characteristic patterns. In addition to the migration time of

the main peak, the presence of a second large well resolved peak was also a

rather characteristic feature of some raw enzymes. Further, after quantitation by

the Bradford’s method, relative sensitivities calculated from the total peak area

of the electropherograms obtained in the basic and acid BGEs can be also useful

to identify the enzymes. Application of the procedure to real samples is possible

in the presence of non-ionic surfactants, but not in samples containing large

concentrations of anionic surfactants, more research being needed to reduce this

interference.

Main points:

- The separation of intact proteins by CZE is potentially useful to classify or

identify the enzymes used in the formulation of cleaning products.


356

- A basic BGE provides a flat baseline on which some small peaks are

distinguished; the peaks constitute characteristic patterns which can be useful

to classify or identify the enzymes.

- Relative sensitivities in the acid and basic BGEs, calculated after protein

quantification by the Bradford’s method, may also be useful for enzyme

identification.

- The application of the procedure to real samples is limited to samples that do

not contain anionic surfactants, being tolerated the presence of nonionic

surfactants.

IX.3.2. Aminoácidos por infusión directa en MS

IX.3.2.1. Clasificación rápida de enzimas en productos de limpieza por

hidrólisis aminoácidos, MS y LDA

Se ha desarrollado un procedimiento sencillo y rápido, capaz de clasificar

las enzimas presentes en los productos de limpieza de acuerdo con su clase

(proteasa, amilasa, celulasa y lipasa). Para ello, tras la precipitación e hidrólisis

de las enzimas empleadas como materia prima, los hidrolizados fueron disueltos

en etanol y directamente infundidos en la interfaz ESI de un espectrómetro de

masas de trampa iónica. Los datos espectrales fueron utilizados para construir

modelos LDA, obteniéndose unas capacidades de predicción excelentes. Los

efectos de matriz de la muestra, observados al aditivar las bases de detergente

con los concentrados de enzimas industriales, se redujeron en gran medida

mediante la inclusión de muestras aditivadas en el conjunto de entrenamiento. El

modelo de LDA resultante mostró una excelente capacidad de predicción.


357

A simple and quick procedure capable of classifying enzymes in cleaning

products according to their protease, amylase, lypase and cellulase classes has

been developed. For this purpose, after precipitation and hydrolysis, the

hydrolysates were dissolved in ethanol and directly infused into the ESI ion

source of an ion trap mass spectrometer. The spectral data were used to

construct LDA models with excellent prediction capabilities. The sample matrix

effects, which were observed when detergent bases spiked with enzyme industrial

concentrates were used for model evaluation, were ruled out by also including

the spiked samples in the training set. The resulting model showed an excellent

prediction capability.

Main points:

- A simple and rapid procedure for enzyme classification in cleaning products

has been developed; enzymes are classified according to the protease,

amylase, cellulase or lipase classes.

- The spectral data of amino acids obtained by hydrolysis followed by ESI-MS

were used in the construction of LDA models which showed excellent

predictive capabilities.

- Sample matrix effects were reduced by including spiked samples in the LDA

training set.

IX.3.3. Aminoácidos derivatizados con OPA-NAC

IX.3.3.1. Clasificación de enzimas presente en productos de limpieza mediante

hidrólisis, derivatización con OPA-NAC, HPLC y LDA

Se ha desarrollado un método para la clasificación de las enzimas

presentes en productos de limpieza, basado en la hidrólisis seguida de


358

derivatización con OPA- NAC de los aminoácidos resultantes, separación de los

derivados (isoindoles) mediante HPLC-UV-Vis. La clasificación se efectúa en

función de las categorías más comunes: proteasas, amilasas, lipasas y celulasas.

Para la separación se utilizó una columna C18 y elución de los isoindoles con un

gradiente multisegmentado. A partir del perfil de aminoácidos se obtuvo un

modelo de LDA con una excelente capacidad predictora. Se utilizaron los

cocientes de las áreas de pares de picos como variables predictoras para construir

el conjunto de entrenamiento, además de los concentrados industriales de las

enzimas (materias primas), se incluyeron bases de detergentes reforzadas con

enzimas. Todos los objetos del conjunto de evaluación, incluyendo concentrados

industriales de enzimas, bases de detergente aditivadas y productos de limpieza

comerciales, se asignaron correctamente, con una probabilidad del 99%.

An HPLC–UV–Vis method for class identification of the enzymes found in

cleaning products according to the protease, amylase, lypase and cellulase

classes, has been developed. For this purpose, after precipitation and hydrolysis,

the amino acids were derivatized with OPA–NAC and aliquots were

chromatographed. A C18 column and multi-segmented gradient elution with

ACN/water were used to separate the isoindoles of the amino acids. An LDA

model with an excellent prediction capability was obtained by using ratios of the

areas of the peaks taken by pairs as predictors, and by including both enzyme

industrial concentrates and spiked detergent bases in the training set. All the

objects of the evaluation set, including enzyme industrial concentrates, spiked

detergent bases and commercial cleaners, were correctly assigned with a 99%

probability.


359

Main points:

- A method for the classification of enzymes in cleaning products has been

developed. The method is based on the total hydrolysis of the enzymes to

amino acids, followed by derivatization with OPA-NAC, HPLC of the

resulting isoindoles and LDA, using the chromatographic peak areas as

predictors.

- In addition to industrial enzyme concentrates, the inclusion of detergent bases

spiked with enzymes in the training set improves the prediction capability of

the model when applied to real samples.

IX.3.4. Digestos con tripsina

IX.3.4.1. Comparación de columnas microparticuladas y monolíticas para RP-

LC de digestos trípticos de enzimas industriales en productos de

limpieza

Se ha realizado un estudio comparativo de las prestaciones de diversos

soportes cromatográficos comerciales, incluyendo tanto columnas monolíticas

(una polimérica y otra de base sílice) como columnas particuladas (dos basadas

en tecnología convencional de partículas y una conteniendo partículas de núcleo

fundido), para el análisis mediante HPLC-UV de digestos trípticos de las

enzimas más comunes en la industria de los detergentes. Se desarrolló también

un procedimento para el control de calidad de las enzimas intactas en

concentrados industriales, utilizando para ello la columna monolítica polimérica.

Sin embargo, esta columna proporcionó unas bajas eficacias y resolución global

en la separación de los péptidos obtenidos por digestión con tripsina. Para este

fin, la columna Kinetex, empaquetada con partículas de 2,6 µm, con un núcleo

fundido no poroso y una superficie porosa (tecnología de partículas “shell-core”),


360

fue la que mostró las mejores prestaciones. La columna monolítica de sílice

Chromolith, y columnas convencionales empaquetadas con partículas de 5 y 3

µm mostraron prestaciones intermedias. La columna Kinetex en las condiciones

óptimas de elución se utilizó para el análisis de los digestos trípticos de los

concentrados de materias primas industriales, bases de detergente aditivadas y

productos de limpieza comerciales. Los cromatogramas resultantes fueron muy

similares a los obtenidos directamente por la digestión de los concentrados

industriales de enzimas, por lo que no se observaron interferencias ni efecto

matriz.

El método cromatográfico propuesto es útil también para la clasificación

de las enzimas. Actualmente se está trabajando para mejorar este método,

estableciendo los péptidos que llevan a una mejor identificación y clasificación

fiable de las enzimas a partir de datos de LC-MS.

The chromatographic performance of several commercial

chromatographic supports, including monolithic (polymeric and silica-based)

and particulate columns (with conventional and core-shell particle technology),

for the HPLC-UV analysis of tryptic digests of enzymes commonly used in the

detergent industry was comparatively evaluated. In addition, quality control of

industrial enzymes concentrates was shown to be possible by chromatographing

the intact enzymes on the polymeric monolithic column (ProSwift). However, this

column gave a poor efficiency and a low global resolution for the separation of

the peptides obtained by trypsin digestion. The Kinetex column, packed with

superficially porous sub-3 µm particles (shell-core particle technology), showed

the best performance when applied to the separation of tryptic digests of the

enzymes. The Chromolith silica monolithic column, and columns packed with 5

µm or 3 µm conventional particles showed intermediate performances. The


361

Kinetex column in the optimal elution conditions was applied to the analysis of

tryptic digests from both raw industrial concentrates of the enzymes as well as to

enzymes in spiked detergent bases and commercial cleaners. The resulting

chromatograms were quite similar to those obtained by directly digesting the

industrial enzyme concentrates; then matrix interferences were not observed.

Therefore, HPLC of intact enzymes is useful in the quality control of

industrial samples, as well as to discard enzyme classes; however, a more

selective approach is required for a reliable classification and identification of

the enzyme. For this purpose, HPLC of the tryptic digest of the enzyme using a

core-shell particulate column is an excellent option. Further work on this topic,

in order to establish characteristic peptides leading to the reliable identification

of the individual enzymes by coupling LC with MS is in progress.

Main points:

- A polymeric monolithic column (ProSwift) is useful for the separation of

intact enzymes, giving rise to chromatograms which show a predominant

peak. These chromatograms are useful in quality control; however, they do

not provide enough information to reliably classify or identify the enzymes.

- To separate the peptides obtained by enzyme digestion with trypsin, the

polymeric monolithic column provides low efficiencies and poor overall

resolution.

- For the separation of tryptic digests of enzymes, a Kinetex column showed an

excellent performance. Columns packed with conventional 5 or 3 µm

particles, and a silica monolithic column (Chromolith), presented

intermediate performances.


362

- No interference or matrix effects were observed in the separation of tryptic

digests of industrial enzyme concentrates, detergent bases spiked with

enzymes and commercial cleaning products, with the Kinetex column.

IX.4. Columnas monolíticas

IX.4.1. Columnas monolíticas de lauril metacrilato para CEC

IX.4.1.1. Columnas monolíticas de LM para CEC utilizando LPO como

iniciador

Se ha optimizado la preparación de columnas monolíticas de LMA

mediante fotopolimerización UV en presencia de LPO como iniciador. Se ha

investigado la influencia de los cocientes monómeros/disolventes porogénicos,

1,4-butanodiol/1-propanol y LMA/EDMA sobre las propiedades morfológicas y

sobre las prestaciones de las columnas en condiciones de uso en modo CEC.

Utilizando LPO como iniciador, se comparó la polimerización por vía UV con la

polimerización térmica. Ambos métodos proporcionaron columnas con una

eficacia similar, sin embargo, las columnas fotopolimerizadas mostraron menores

tiempos de análisis que las iniciadas térmicamente. Otras ventajas de la

fotoiniciación respecto a columnas obtenidas por polimerización térmica es el

menor tiempo de fabricación de la columna, y la mayor permeabilidad de la

misma.

Por otra parte, se estudió la sustitución del LPO por AIBN como iniciador

en la síntesis de columnas monolíticas obtenidas por fotoionización. Bajo sus

respectivas condiciones óptimas de polimerización, los dos tipos de monolitos

proporcionaron eficacias semejantes. Las columnas obtenidas utilizando LPO

como iniciador dieron lugar a tiempos de análisis eran menores. Asimismo, se


363

evaluó el potencial de las columnas obtenidas con ambos iniciadores para separar

compuestos tanto neutros como básicos. Teniendo en cuenta los resultados

obtenidos, el empleo de LPO y radiación UV es la mejor opción para la

preparación rápida de monolitos de LMA con buenas prestaciones

cromatográficas.

The preparation of photo-polymerized LMA monoliths in the presence of

LPO as initiator has been optimized, and the resulting columns have been

characterized. The influence of ratios of monomers/porogenic solvents, 1,4-

butanediol/1-propanol and LMA/EDMA on the morphological and CEC

properties was investigated. Under their respective optimal conditions, photo-

and thermal-polymerization using LPO gave rise to columns with similar

efficiencies; however, photo-polymerized columns showed shorter analysis times.

Other advantages of photo-initiation are shorter polymerization times and better

permeabilities.

Additionally, the LMA-based monolithic columns photoinitiated with

either LPO or AIBN were compared. Under their respective optimal

polymerization conditions, both types of monoliths provided similar efficiencies,

but those prepared in the presence of LPO gave faster separations than their

AIBN counterparts. The capability of columns obtained with both initiators to

separate neutral and basic compounds has been also demonstrated. Thus, the

employ of LPO and UV irradiation constitutes an attractive way for the fast

preparation of improved LMA-based monoliths.

Main points:

- Using LPO as initiator, photopolymerization gives rise to better columns than

thermal polymerization. Efficiencies were similar, but analysis times were


364

shorter with photoinitiated columns. Also, manufacturing time was shorter,

and the monoliths showed a higher permeability.

- Using photoinitiation in the presence of either LPO or AIBN, similar

efficiencies were obtained; however, LPO led to shorter analysis times than

AIBN.

- Excellent columns are quickly prepared using photoinitiation in the presence

of LPO.

IX.4.1.2. Comparación de fotoiniciadores para la preparación de columnas

monolíticas de metacrilato para CE

Se ha estudiado la preparación y caracterización de columnas monolíticas

de LMA para CEC por fotopolimerización, utilizando varios iniciadores

radicalarios a distintas concentraciones. El tipo y la variación del contenido del

iniciador produce cambios en la estructura monolítica. Así, el tamaño de los

glóbulos puede variar, lo que influye en las propiedades electrocromatográficas

de los monolitos. Por lo tanto, es importante encontrar una concentración óptima

para cada uno de los fotoiniciadores investigados. En las respectivas condiciones

óptimas, se obtuvieron eficacias y resoluciones similares para los cuatro

fotoiniciadores estudiados. Los monolitos polimerizados con AIBN y DMPA

mostraron separaciones ligeramente mejores que aquellos polimerizados con

BPO y LPO; sin embargo, este último iniciador proporcionó menores tiempos de

análisis y la posibilidad de controlar mejor las propiedades cromatográficas del

monolito. Por otro lado, la peor repetibilidad columna-columna se encontró para

los lechos cromatográficos fotoiniciados con BPO.

The preparation and characterization of LMA-based monolithic columns

for CEC by photo-polymerization using several free radical initiators have been


365

described. The influence of each type of initiator and its concentration in the

polymerization mixture was studied. As a result of this study, we have found that

the type and variation of initiator content can produce changes in the monolithic

structure, leading to an increase, a small influence, or a decrease on the final

globule size, and therefore, variations in the electrochromatographic properties

of monoliths. Consequently, it is important to find an optimum concentration for

each photo-initiator investigated. Thus, under their respective optimum

conditions, similar efficiencies and resolutions were obtained for the four

investigated photo-initiators. The monoliths initiated with AIBN and DMPA

showed slightly better separations than BPO and LPO, however, this latter

initiator provided shorter analysis time jointly with a fine control in the retention

properties. Additionally, the highest RSD values found for column-to-column

repeatabilities were obtained for beds photo-initiated with BPO.

Main points:

- The type and concentration of the initiator may cause changes in the

structure of the monoliths obtained by photopolymerization, which implies

variations in the CEC properties.

- Each photoinitiator has its own optimal concentration.

- The four photoinitiators which have been studied show similar efficiencies

and resolutions. The monoliths polymerized with AIBN and DMPA showed

separations slightly better than those polymerized with BPO and LPO;

however, LPO provided the shortest analysis time for the test compounds. On

the contrary, BPO provided the worst column to column reproducibility.

CAPÍTULO X

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399

ABREVIATURAS

A

AB Azul ácido / Acid blue

ABS Alquilbenceno sulfonatos / Alkylbenzenesulfonates

ACN Acetonitrilo / Acetonitrile

AES Alquil éter sulfatos / Alkyl ether sulfates

AIBN α,α’-azobisisobutironitrilo / α,α’-azobisisobutyronitrile

Ala Alanina / Alanine

Alc Alcalase 2.5 L

AMG Alquilmonoglucósido / Alkylmonoglucoside

AMGf Alquilmonoglucofuranósido / Alkylmonoglucofuranoside

AMGp Alquilmonoglucopiranósido / Alkylmonoglycopyranoside

ANN Red neuronal artificial / Artificial neuronal network

ANOVA Análisis de la varianza / Analysis of variance

AOS α-olefina sulfonatos / α-olefin sulfonates

APCI Ionización química a presión atmosférica / Atmospheric pressure chemical ionization

APE Alquilfenol etoxilados / Alkylphenol ethoxylates

APES Alquil fenol éter sulfatos / Alkyl phenol ether sulfates

APG Alquilpoliglucósidos / Alkylpolyglucosides

APPI Fotoionización a presión atmosférica / Atmospheric pressure photoionization

Arg Arginina / Arginine

AS Alquil sulfatos / Alkyl sulfates

Asn Asparagina / Asparagine

400

Asp Ácido aspártico / Aspartic acid

B

BGE Electrolito de fondo / Background electrolyte

BPO Peróxido de dibenzoilo / Dibenzoyl peroxide

BSA Albúmina sérica bovina / Bovine serum albumine

C

Car Carezyme 4500L

CE Electroforesis capilar / Capillary electrophoresis

CEC Electrocromatografía capilar / Capillary electrochromatography

Cel Celluzyme 0,7T

CGE Electroforesis capilar en gel / Capillary gel electrophoresis

CI Ionización química / Chemical ionization

CID Cationización seguida de colisión inducida / Cationization followed by collision-induced

CIEF Isoelectroenfoque capilar / Capillary isoelectric focusing

CMC Concentración micelar crítica / Critical micelar concentration

CR Rojo Congo / Congo red

Cys Cisteína / Cysteine

CZE Electroforesis capilar zonal / Capillary zone electrophoresis

D

DAD Detector de fila de diodos / Diode array detector

DMPA 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona / 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone

401

DMSO Dimetilsulfóxido / Dimethilsulfoxide

DNA Ácido desoxiribonucleico / Deoxyribonucleic acid

DP Longitud de la cadena de poliglucósido / Degree of polymerization

DTI Inhibidor de la transferencia de color / Dye-transfer inhibitor

Dur Duramyl 300L, Type DX

E

EDMA Dimetilacrilato de etileno / Ethylene dimethacrylate

EI Impacto electrónico / Electron impact

EIC Cromatograma de ion extraído / Extracted ion chromatogram

ELSD Detector evaporativo de luz dispersada / Evaporative light scattering detection

End Endolase 5000L

EO Óxido de etileno / Ethylene oxide

EOF Flujo electroosmótico / Electroosmotic flow

ESI Ionización por electronebulización / Electrospray ionization

Esp Esperase 8.0L

EtOH Etanol / Ethanol

Eve Everlase 16L, Type EX

F

FAA Alcanolamidas / Fatty acid amide ethoxylates

FAB Bombardeo con átomos rápidos / Fast atom bombardment

FAE Alcoholes grasos etoxilados / Fatty alcohols ethoxylates

FID Detector de ionización por llama / Flame ionization detector

402

FSCE Electroforesis capilar en disolución libre / Free solution capillary electrophoresis

FT Transformada de Fourier / Fourier transform

G

GC Cromatografía de gases / Gas chromatography

Gf Glucofuranósido / Glucofuranoside

Gln Glutamina / Glutamine

Glu Ácido glutámico / Glutamic acid

Gly Glicina / Glycine

Gp Glucopiranósido / Glucopiranoside

H

HAcO Ácido acético / Acetic acid

HEC Hidroxietilcelulosa / Hydroxyethylcellulose

HILIC Cromatografía de interacción hidrofílica / Hydrophilic interaction chromatography

His Histidina / Histidine

HPLC Cromatografía líquida de alta resolución / High performance liquid cromatography

I

ICP Plasma acoplado por inducción / Inductively coupled plasma

ID Diámetro interno / Internal diameter

IDA Ácido iminodiacético / Iminodiacetic acid

Ile Isoleucina / Isoleucine

IT Trampa iónica / Ion trap

403

L

LAS Alquilbenceno sulfonatos lineales / Linear alkylbenzenesulfonates

LC Cromatografía líquida / Liquid cromatography

LDA Análisis discriminante lineal / Linear discriminant analysis

LES Lauril éter sulfatos / Lauryl ether sulfates

Leu Leucina / Leucine

LMA Lauril metacrilato / Lauryl methacrylate

LOD Límite de detección / Limit of detection

LPO Peróxido de lauroilo / Lauroyl peroxide

Ls Lipolase 100L, Type EX

Lx Lipex 100L

Lys Lisina / Lysine

M

MALDI Desorción-ionización láser asistida por matriz / Matrix-assisted laser desorption/ionization

MEKC Cromatografía micelar electrocinética capilar / Micellar electrokinetic capillary chromatography

MeOH Metanol / Methanol

Met Metionina / Methionine

META Cloruro de [2-(metacriloiloxi)etil] trimetilamonio / [2-(methacryloyloxy)ethyl]trimethyl ammonium chloride

MGf Monoglucofuranósido / Monoglucofuranoside

MGp Monoglucopiranósido / Monoglucopyranoside

MS Espectrometría de masas / Mass spectrometry

MW Peso molecular / Molecular weight

404

N

NaAcO Acetato sódico / Sodium acetate

NAC N-acetil-cisteína / N-acetyl-cysteine

NECEEM Electroforesis capilar en condiciones de no equilibrio de mezclas en equilibrio / Non-equilibrium capillary

electrophoresis of equilibrium mixtures

NH4AcO Acetato amónico / Amonium acetate

NI Ion negativo / Negative ion

NMR Resonancia magnética nuclear / Nuclear magnetic resonance

NP Fase normal / Normal phase

NPE Nonilfenoles etoxilados / Nonylphenol ethoxylates

O

OD Diámetro externo / Outside diameter

OPA o-Ftaldialdehído / o-Phthaldialdehyde

OPE Octifenoles etoxilados / Octylphenol ethoxylates

P

PAH Hidrocarburo poliaromático / Polyaromatic hydrocarbon

PEA o-fosfoetanolamina / o-phosphoethanolamina

PEEK Poli-éter-éter-cetona / Polyether ether ketone

PEG Polietilenglicol / Polyethylenglycol

Phe Fenilalanina / Phenylalanine

PI Ion positivo / Positive ion

Pro Prolina / Proline

PVA Polivinil alcohol / Polyvinyl alcohol

PVAcO Acetato de polivinílo / Polyvinyl acetate

405

PVP Polivinil pirrolidona / Polyvinyl pyrrolidone

PVP-NO Poli(1-óxido-4-vinilpiridina) / Poly(4-vinylpyridine-1-oxide)

PVP-PVI Poli(1-vinilpirrolidona-co-1-vinilimidazol) / Poli(1-vinylpyrrolidona-co-1-vinylimidazole)

Q

QDA Análisis discriminante cuadrático / Quadratic discriminant analysis

QTOF Cuadrupolo-tiempo de vuelo / Quadrupole time-of-flight

R

RG Resolución global / Global resolution

RP Fase reversa o inversa / Reverse phase

RSD Desviación estándar relativa / Relative standard deviation

S

Sav Savinase 16L, Type EX

SAX Intercambio aniónico fuerte / Strong anionic exchange

SDS Dodecil sulfato sódico / Sodium dodecil sulfate

SEC Cromatografía de exclusión por tamaño / Size exclusion chromatography

SEM Microscopía electrónica de barrido / Scanning electron microscope

Ser Serina / Serine

SFC Cromatografía de fluidos supercríticos / Supercritical fluid chromatography

SIM Monitorización de iones seleccionados / Selected ion monitoring

406

SIMS Espectrometría de masas de iones secundarios / Secondary Ion Mass Spectrometry

SPE Extracción en fase sólida / Solid phase extraction

Sta Stainzyme 12L

T

TAG Triacilgliceroles / Triacilgliceride

Ter Termamyl Ultra 300L

TFA Ácido trifluoroacético / Trifluoroacetic acid

Thr Treonina / Threonine

TIC Cromatograma de iones totales / Total ion chromatogram

TLC Cromatografía en capa fina / Thin layer chromatography

TMBA Ácido 3,4,5-trimetoxibenzoico / 3,4,5-trimethoxibenzoic acid

TMS Trimetilsilano / Trimethylsilane

Tris Tris(hidroximetil)aminoetano / Tris(hydroxymethyl)amino ethane

Trp Triptófano / Tryptophan

Tyr Tirosina / Tyrosine

U

UV Ultravioleta / Ultraviolet

V

Val Valina / Valine

Vis Visible / Visible

ANEXO I

A nexo I

A3

M iriam B eneito Cam bra

A4

A nexo I

A5


A6

A nexo I

A7


A8

A nexo I

A9

ANEXO II

A nexo II

A13


A14

A nexo II

A15


A16

A nexo II

A17


A18

A nexo II

A19


A20

A nexo II

A21


A22

A nexo II

A23


A24

A nexo II

A25


A26

A nexo II

A27

ANEXO III

A nexo III

A31


A32

A nexo III

A33


A34

A nexo III

A35


A36

A nexo III

A37


A38

ANEXO IV

A nexo IV

A41


A42

A nexo IV

A43


A44

A nexo IV

A45


A46

A nexo IV

A47


A48

ANEXO V

A nexo V

A51


A52

A nexo V

A53


A54

A nexo V

A55


A56

A nexo V

A57


A58

ANEXO VI

A nexo V I

A61


A62

A nexo V I

A63


A64

A nexo V I

A65


A66

A nexo V I

A67


A68

ANEXO VII

A nexo V II

A71


A72

A nexo V II

A73


A74

A nexo V II

A75


A76

ANEXO VIII

A nexo V III

A79


A80

A nexo V III

A81


A82

A nexo V III

A83

ANEXO IX

A nexo IX

A87


A88

A nexo IX

A89


A90

A nexo IX

A91


A92

A nexo IX

A93


A94

A nexo IX

A95

ANEXO X

A nexo X

A99


A100

A nexo X

A101


A102

A nexo X

A103


A104

A nexo X

A105

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