INDICE

San Nicolás de los Garza a 25 de Mayo del 2015

Universidad Autónoma de Nuevo León

Facultad de Ciencias Biológicas

PPA ETAPA III

Informe técnico del aislamiento y diferenciación morfológica de un organismo a partir de un cultivo mixto.

Métodos Básicos en Microbiología

Aislamiento de microorganismo presente en masa para tortillas.

Nombres:

Cristal Alanís Martínez 1588357

Quetzaly Karyan Ávila Alemán 1544515

Héctor Eduardo Dávila Venegas 1546080

Gisela García Alvarez 1578539

Maestro: Francisco Javier Sánchez

Equipo: 1 Grupo: 241

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Introducción _________________________________________ 2

Antecedentes _______________________________________ 3

Objetivo____________________________________________ 4

Materiales__________________________________________ 4

Diagrama de Flujo____________________________________ 6

Resultados__________________________________________ 7

Discusión___________________________________________ 8

Conclusión__________________________________________ 9

Bibliografía _________________________________________ 9

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INTRODUCCIÓN

La tortilla es un producto alimenticio derivado del maíz y es de muy alto consumo para el país. La elaboración de la masa para tortilla está constituida por las siguientes materias primas como es el maíz, agua y óxido de calcio. Otra manera más sencilla para preparar la masa es mediante la mezcla de harinas instantáneas y agua. Este método al rededor del 20% de la población lo utiliza, ya sea en forma personal o en las tortillerías. La harina instantánea se puede producir por cualquier técnica, ya que la masa obtenida es deshidratada, filtrada y mezclada con nutrientes, esta es de un muy alto consumo en México por lo que su duración en los hogares está dada por la flora microbiana que esta pueda contener (Camacho et al. 2009). La flora microbiana puede tener su origen en el suelo, aire, agua, en el medio ambiente del almacén o en la fase de manipulación y elaboración, generalmente los microorganismos presentes en la harina es relativamente escasa, pero una vez que ha sido hidratada se crean condiciones de actividad acuosa favorables para el crecimiento de hongos, levaduras entre otros (Frazier & Westhoff, 1995).

Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal sanitizados (Pierson & Smoot, 2001). Ciertas especies de hongos y levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin embargo también pueden ser causantes de la descomposición de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable (Food and Drug Administration (2003). Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento a la irradiación. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lácteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus derivados, especias, etc (Beuchat & Cousin, 2001).

La importancia de estudio para el aislamiento de microorganismo presente en la masa para tortillas es saber que se encuentra en ella, para evitar efectos negativos hacia la salud así como evitar malos olores, sabores y la decoloración de las superficies de esta misma(Beuchat & Cousin, 2001).

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ANTECEDENTES

1. El maíz (Zea mays L.) es una planta nativa de México que actualmente se destina para la alimentación humana y del ganado, además de su aprovechamiento industrial. El consumo por ingreso de maíz es de aproximadamente 160 g por día en forma de tortillas, principalmente (ASERCA, 2012). En el 2012 se produjeron en México más de 22 millones de toneladas de maíz (SIAP, 2014). Sin embargo, los volúmenes y la calidad de la producción de maíz en nuestro país son limitados debido principalmente a la incidencia de plagas, hongos y enfermedades y por factores abióticos como altas y bajas temperaturas, la salinidad de los suelos, la deficiencia de nutrimentos en los suelos y la sequía (Moreno y González, 2011).

2. Los hongos que comúnmente atacan al maíz tanto en campo como en almacén pertenecen a los géneros Aspergillus, Fusarium y Penicillium; estos organismos son productores potenciales de micotoxinas (Hernández et al., 2007; Montes et al., 2009). El crecimiento de Aspergillus y la contaminación de los productos alimenticios con aflatoxinas son consecuencia de la interacción entre el hongo, el hospedero y el ambiente. La interacción de dichos factores determina la infestación y la colonización del sustrato, así como el tipo y la cantidad de las aflatoxinas producidas (García y Heredia, 2006).

3. Existen evidencias de la asociación existente entre la ingestión de alimentos contaminados con aflatoxinas y el desarrollo de cáncer en humanos, particularmente en regiones cálidas y húmedas de África, la India y algunos otros países asiáticos. La Agencia Internacional para la Investigación en Cáncer consideró, en 1987, que las aflatoxinas son sustancias con alto poder cancerígeno en humanos (Magan y Aldred, 2007)

4. En México, el maíz particularmente el importado por lo general, está contaminado con aflatoxinas, cuyo principal riesgo radica en que su daño es acumulativo, por lo que pueden afectar a los consumidores en diferentes plazos, dependiendo de las cantidades ingeridas (Méndez, et. al., 2004).

5. Los procesos de descontaminación ideales deben ser baratos, sencillos y que no produzcan compuestos secundarios tóxicos o que altere las características nutrimentales y de palatabilidad durante o después de su utilización (Elias et al., 2002). En México se han utilizado principalmente métodos físicos como la nixtamalización, extrusión y eliminación por adsorbentes. De acuerdo con Anguiano et al. (2005) y Guzmán et al. (2007) el proceso de nixtamalización destruye del 95 al 100 % de las aflatoxinas del maíz.

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OBJETIVO

El presente trabajo de investigación tiene como objetivo el aislamiento puro

de un organismo microbiológico de una muestra de un alimento de la

canasta básica “Harina para tortillas”, para el análisis de sus características

macroscópicas y microscópicas.

Determinar tentativamente el género del microorganismo aislado a partir de

las observaciones macroscópicas y microscópicas.

MATERIALES

Materiales

• 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL

• 1 matraz Erlenmeyer de 125 mL

• 3 tubos 13 x 150 mm con rosca

• 4 Pipetas graduadas estériles de 2 mL

• 4 Cajas de Petri (vidrio) estériles

• 1 Asa de platino estéril

• 1 Cuchara envuelta

• Probeta 100 mL

• Mechero de Bunsen

• Portaobjetos

• Cinta transparente

• Bata

• Cofia

• Cubre bocas

• Marcador Sharpie

• Algodón

• Alcohol al 70%

• Encendedor

Equipos

• Microscopio óptico de campo claro.

• Balanza.

• Incubadora.

Soluciones

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• 130 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2.

• 60.0 mL de agar papa dextrosa.

Reactivos e indicadores

• 3 ml de una solución estéril de ácido tartárico al 10.0 %.

• Solución colorante de lactofenol azul de algodón.

• Colorantes para tinción de Gram.

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RESULTADOS

Después del aislamiento se tomó el inoculo de un hongo y se procedió a observar sus características macroscópicas y microscópicas.

En las características macroscópicas su micelio aéreo era de un color negro y su micelio reproductivo era de un color amarillo-verde rodeado de un color blanco.

Para llevar a cabo la observación microscópica se utilizó un pedazo de cinta y se puso por encima del micelio aéreo todo en zona de esterilidad, para ello antes se había tomado un portaobjetos y se puso una gota de azul de lactofenol para obtener un contraste que permitiera observar mejor sus características morfológicas, después de esto se colocó la cinta sobre el portaobjetos y se procedió a observar bajo el microscopio. Se pudo observar del hongo su cuerpo fructífero, esporas y algunas hifas, ya que no estaba en una etapa muy madura.

Características Macroscópicas

Figura: 1.1, vista superior del hongo aislado Figura: 1.2, vista inferior del hongo aislado

Características Microscópicas

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Observaciones.

Solo se logró encontrar la ubicación del hongo, debido a que en la resolución de este objetivo es complicado observar características

Observaciones.

Se logró observar:

Cuerpo fructífero

Esporas Hifas

Tinción: azul de lactofenol.

DISCUSIÓN

Hoy en día el maíz en México constituye un factor principal para la elaboración de tortillas, ya que representa el 6.7% del valor de la industria alimentaria y constituye a la actividad más importante en la agroindustria del maíz y mantiene una relación estrecha con la molienda de nixtamal (Torres et. al., 1996). Sin embargo la calidad y volumen de la producción de maíz en nuestro país son limitados debido principalmente a la incidencia de plagas, hongos y enfermedades, por factores abióticos como altas y bajas temperaturas, la salinidad de los suelos, la deficiencia de nutrimentos en los suelos y la sequía (Moreno y González, 2011). Esto es debido a que la masa con la que se elaboran las tortillas, tiene una alta actividad acuosa que la hace muy sensible al ataque de microrganismos (hongos, levaduras y bacterias), lo que está unido a la reducción de su alcalinidad (pH = 6.5) y la contaminación por las malas condiciones sanitarias bajo las que se elaboran las tortillas, reduciendo la vida de anaquel de este producto (Torres et. al., 1996).

Considerando estos factores hace que la masa de tortilla sea muy susceptible a la contaminación, uno de los problemas más graves y frecuentes es la presencia de aflatoxinas, hongos de diversos tipos que llegan a desarrollarse en el maíz, en la masa, el campo o durante la cosecha y almacenamiento, como consecuencia de las malas condiciones o el exceso de humedad (Torres et. al., 1996).

Los hongos que comúnmente atacan al maíz tanto en campo como en almacén pertenecen a los géneros Aspergillu y Penicillium; estos organismos son productores potenciales de micotoxinas (Hernández et al., 2007; Montes et al., 2009). El crecimiento de Aspergillus y la contaminación de los productos alimenticios con aflatoxinas son consecuencia de la interacción entre el hongo, el hospedero y el ambiente. La interacción de dichos factores determina la infestación y la colonización del sustrato, así como el tipo y la cantidad de las aflatoxinas producidas (García y Heredia, 2006). De acuerdo a Torres et. al., 1996 a las toxinas producidas por estos hongos, según su origen, se les ha denominado micotoxinas y a las intoxicaciones que causan en el hombre y los animales domésticos se les conoce como micotoxicosis. Las micotoxinas más estudiadas han sido las producidas por el género Aspergillus: las aflatoxinas. Torres et al., 2001 nos menciona que los productos que más frecuentemente se encuentran contaminados con aflatoxinas son: el maíz, la semilla del algodonero y el cacahuate.

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Observaciones.

Solo se logró encontrar la ubicación del hongo, debido a que en la resolución de este objetivo es complicado observar características

Observaciones.

Se logró observar:

Cuerpo fructífero

Esporas Hifas

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Estos hongos productores de aflatoxinas pueden crecer en temperaturas de 8 a 55"C, pero de 36-38°C son las temperaturas óptimas para su crecimiento vegetativo; para la producción de toxinas, que requieren de 25 a 35°C (Yin et al., 2008). Por lo anteriormente señalado, se puede inferir la importancia de la temperatura en la producción de las aflatoxinas y el mayor énfasis que se le debe dar al estudio de este factor en la producción de las toxinas, sobre todo bajo condiciones de campo como en el caso de las aflatoxinas en maíz.

Anguiano et. al., (2005) y Guzman et. al., (2007) nos hablan de la forma en que se pueden destruir del 95-100% de las aflatoxinas del maíz; esto a través de métodos físicos como la nixtamalización, extrusión y eliminación por adsorbentes.

Bhatnagar y García (2001) en su trabajo sobre Aspergillus lo describen a este género con un micelio vegetativo compuesto de hifas septadas, ramificadas, incoloras, estructura conidial desarrollada como pedicelos y cabezuelas de origen en células hifales especializadas (células del pie), de paredes gruesas, las cuales producen conidióforos como ramas aproximadamente perpendiculares al eje longitudinal de la célula del pie. También hablan de la clasificación, la cual se hace por las estructuras de reproducción y color de sus colonias. Los miembros de este género tienen una colonia inicialmente plana, blanca que crece haciéndose algodonosa. A medida que envejece y va apareciendo la esporulación, el centro de la colonia se va tornando de color distinto según la especie, puede ser de color amarillo, verde, negro, gris. De acuerdo a los resultados observados (ver sección de resultados) el hongo mantiene características macroscópicas y microscopias similares a las que los autores redactan, por lo que se puede intuir o pensar que el hongo encontrado pertenece al género Aspegillus. Solo mediante pruebas bioquímicas se podría respaldar esta suposición

CONCLUSIÓN

Se puede concluir que se llevó con éxito el aislamiento del microorganismo presente en la masa para las tortillas. Siendo posible la observación de sus características de forma microscópica y macroscópica que presento el hongo cultivado. Debido a que solo las pruebas de identificación fueron por su forma física solo se puede inferir que puede ser perteneciente al género Aspergillus.

BIBLIOGRAFÍA

1.Anguiano RGL, Verver A, Vargas C y Guzmán-De Peña D. 2005. Inactivación de aflatoxina B y aflatoxicol por 1 nixtamalización tradicional

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del maíz y su regeneración por acidificación de la masa. Salud Pública de México 47:369-375.

2.ASERCA, Apoyos y Servicios a la Comercialización Agropecuaria. 2012. Boletín ASERCA Regional Peninsular 2012: La Industrialización del Maíz. 56/12. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación (SAGARPA). Mérida, México. 32 p.

3.Bhatnagar, D. and García, S. (2001) Aspergillus. In: R. G. Labbe and S. García (Eds) Guide to Foodborne Pathogens, pp. 35-50. New York: Jhon Wiley and Sons, Inc.

4.Beuchat L.R. & Cousin M.A. (2001) “Yeasts and Molds”. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 209-215.

5.Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez (2009). Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.

6.Elias OR, Castellanos NA, Gaytan MM, Figueroa CJD, and Loarca PG. 2002. Comparison of nixtamalization and extrusion process for reduction in aflatoxin content. Food Additives & Contaminants 19:878-885

7.Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th ed. Arlington, VA: AOAC.

8.Frazier W. & Westhoff D. (1995) Microbiología de los Alimentos. 4ª. ed. Acribia, España. 23-50.

9.García S and Heredia N. 2006. Mycotoxins in Mexico: Epidemiology, management, and control strategies. Mycophatologia 162:255-264.

10. Guzmán ODA, Trudel L, and Wogan GN. 2007. Corn “nixtamalización” and the fate of radiolabelled aflatoxin B in the tortilla making process. Bulletin of 1 Environmental Contamination and Toxicology 55:85- 864.

11. Hernández DS, Reyes LA, Reyes MCA, García OJG y Mayek PN. 2007. Incidencia de hongos potencialmente toxígenos en maíz (Zea mays L.) almacenado y cultivado en el norte de Tamaulipas, México. Revista Mexicana de Fitopatología 25:127-133.

12. Magan N and Aldred D. 2007. Post-harvest control strategies: minimizing mycotoxins in the food chain. International Journal of Food Microbiology 119:131- 139.

13. Méndez-Albores, A., Arámbula-Villa, G., Loarca-Piña, G., González-Hernández, J., Castaño-Tostado, E., Moreno-Martínez, E. 2004b. “Aflatoxin’s Fate During the Nixtamalization of Contaminated Maize by Two Tortilla- Making Processes”. J. Stored Prod. Res.40: 87-94.

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15. Moreno LS y González SL. 2011. Efecto antifúngico de extractos de gobernadora (Larrea tridentata L.) sobre la inhibición in vitro de Aspergillus flavus y Penicillium sp. Polibotánica 32:193-205.

16. Norma Oficial Mexicana NOM-109-SSA1-1994. Bienes y servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

17. Norma Oficial Mexicana. NOM-111-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.

18. Pierson M. & Smoot L. (2001) Indicator Microorganisms and Microbiological Criteria. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 71-87.

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20.Torres, Felipe; Moreno, Ernesto; Chong, Isabel y Quintanilla, Juan (1996): La industria de la masa y la tortilla. Desarrollo y tecnología. Universidad Nacional Autónoma de México, Dirección General de Publicaciones, Instituto de Investigaciones Económicas, Programa Universitario de Alimentos, Programa Universitario de Energía, Programa Universitario de Estudios sobre la Ciudad, México, D.F. ISBN 968-36-4793-6.

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22.Yin YN, Yan LY, Jiang JH, and Ma ZH. 2008. Biological control of aflatoxin contamination of crops. Journal of Zhejiang University Science B 9:787-792

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