Apoptosis En Enfermedades Neurodegenerativas Introducción a La Terapia Génica Curso 2004-2005.

Apoptosis En Enfermedades

NeurodegenerativasIntroducción a La Terapia

GénicaCurso 2004-2005


Neurodegenerativas• Apoptosis neuronal.• Mecanismos de supervivencia.• Enfermedades

neurodegenerativas.• Aplicación: estudio de la apoptosis

neuronal asociada a la enfermedad de scrapie.

La Neurona

• Normalmente sobreviven toda la vida del individuo permitiendo el mantenimiento de los circuitos neuronales.

• En el desarrollo muchas neuronas (50%) sufren apoptosis (Sinaptogénesis).

• Señales de supervivencia neuronal:– Factores Neurotróficos.– Glutamato (neurotransmisor excitatorio).

Inducción De Apoptosis in vitro

• Falta de factores neurotróficos:– Desarrollo.– Enfermedades Neurodegenerativas.

• Toxicidad del péptido -amiloide:– Enfermedad de Alzheimer.

• Excitotoxicidad.• Falta de K.• Estrés oxidativo:

– Infarto.– Envejecimiento.

Falta De Factores Neurotróficos

• Señales de supervivencia.

• Causa de la pérdida masiva de neuronas en el desarrollo.

• Modelo in vitro:– NGF: Ns simpáticas y

células PC12.– BDNF o CNTF: Ns

sensitivas.– Cultivos sin suero.

Toxicidad Del Péptido -amiloide

• Principal compuesto de las placas seniles.

• Péptido de 39 a 42 aa proveniente de la glicolisis de AAP (695-770 aa).

• Apoptosis o necrosis según el tipo celular o el protocolo experimental.

AAP

-amiloide

Apoptosis:Ns corticalesNs hipocampo

c-jun

caspasas

Necrosis:Ns corticalesNeuroblastomasPC12

Excitotixicidad

• Los aminoácidos excitadores son neurotransmisores (Glutamato).

• Implicados en la diferenciación neuronal y en la memorización.

• Receptores:– Ionotrópicos

glutamatérgicos (NMDA).– Metabotrópicos.

• Estímulo excesivo: muerte neuronal.

Apoptosis

Necrosis

Otros Modelos

• Falta de K:– La supervivencia y

diferenciación neuronales in vitro requiere altas [K].

– Privación de K en el medio apoptosis

• Estrés oxidativo:– Agentes oxidantes

en el medio (H2O2, peroxinitrito).

– Inhibición de la síntesis de antioxidantes intracelulares aumento de radicales libres.

Mecanismos Moleculares De La Apoptosis

Mecanismos Moleculares (2)

Pro-apoptóticas

Caspasas Digestión de sustratos específicos.

Bax, Bad Formación de poros en la Mb. Mit. (salida Cyt-c).

Receptores Glutamato Entrada de Ca; activación de quinasas y proteasas.

Fas Iniciación de la cascasda de Casp-8.

Par-4 Disfunción mitocondrial; supresión de señales de supervivencia (NF-B).

P53 Transcripción de genes apoptóticos (Bax).

Anti-apoptóticas

Bcl-2, Bcl-xL Estabiliza la función mitocondrial; supresión stress oxid.

IAPs Inhibición de caspasas.

Factores tróficos/citoquinas

Expresión de enzimas antioxidantes, prots reguladoras de Ca, IAPs, Bcl-2; fosforilación de AKT y otros.

Telomerasa Previene el acortamiento de los telómeros; modular respuestas de daño ADN.

Enzimas antioxidantes Suprimen estrés oxidativo.

Protein Kinasa C Estimula la expresión de (NF-B)

Prots. Unión al Ca Homeostasis del Ca.Mattson, M.P. (2000) Nature reviews 1: 120-9

Receptores De Membrana

http://perso.wanadoo.fr/adna/Apoptose.html

Fas

p75

Apoptosis por falta de factores neurotróficos

Los Proto-oncogenes: c-fos y c-jun

• Modelos in vitro:– Falta de K o suero,

exposición al -amiloide, strés escitotóxico.

• Modelos in vivo:– Axotomía o estrés

excitotóxico.

c-Jun

Factores neurotróficos

JNK

c-Jun

JNK

Genes Del Ciclo Celular

• Ciclinas:– D1: su función en la apoptosis es variable

dependiendo del tipo neuronal y del estímulo.

– D1 y B1: + individualización de cromosomas en la apoptosis inducida por ácido okadaico en neuroblastomas.

• P53:– Participación demostrada in vivo e in vitro.– No participa en el desarrollo cerebral normal.– Convierte a las neuronas más sensibles al

estímulo apoptótico.

La Familia De Bcl-2

• Sobre-expresión de Bcl-2 in vivo e in vitro inhibe la apoptosis.

• Bcl2 : exceso de neuronas en cerebro y médula.

• Bcl2 (-/-): desarrollo normal y degeneración importante post-natal.

• Bcl-x (-/-): muerte neuronal apoptótica masiva en el desarrollo.

• Bax (-/): exceso de neuronas simpáticas y motoneuronas. Resistentes a la privación de NGF in vitro y a la axotomía.

Regulación De La Familia Bcl-2

• Transcripcional:– EGL-1, Bim, Hrk.

• Post-traducción:– Bax, Bad, Bid.

Putcha et al. (2002)

• Las proteínas pro-apoptóticas BAX y BAK no presentan redundancia o expresión compensatoria en niveles fisiólogicos.

• Bim comparte función con Hrk pero no con Bid o Bad.

• Fas-FasL no contribuyen a la apoptosis por TFD.

• El modelo de apoptosis basado en la privación de factores neurotróficos en cultivos neuronales de SCG y CG depende únicamente de la expresión y traslocación de BAX para la salida de Cyt-c y activación de caspasas.

• BIM y HRK están inducidos y requieren de BAX para mediar la muerte celular.

• La subfamilia BH3 puede mediar la traslocación de BAX.



Modelo 1

Modelo 2

Modelo 3

Modelo 4

Citoplasma Mitocondria

BH3 BAX BAX Cyt c

BCL-2BCL-wBCL-XL

BAXBH3BAXBH3

Cyt c

BH3 BAX BAX Cyt cBCL-wBCL-XL

BCL-2BCL-WBCL-XL

BH3

BAX BAX Cyt c


Modelo 1

Modelo 2

Modelo 3

Modelo 4


BH3 BAX BAX Cyt c

BCL-2BCL-wBCL-XL

BAXBH3BAXBH3

Cyt c

BH3 BAX BAX Cyt cBCL-wBCL-XL

BCL-2BCL-WBCL-XL

BH3

BAX BAX Cyt c

BID BAD

BIM



+NGF BAX BAX BAX Cyt c (periférico) (integral)

BCL-2BCL-XL

-NGF BAX BAX BAX Cyt c (periférico) (integral)

BCL-2BCL-XL

multimerización

BIMDp5

Caspasas

• Casp-8 respuesta a la inducción por Fas y el receptor de la neurotrofina p75.

• Casp-3: importante en el desarrollo.

• Casp-1: apoptosis de neuronas post-mitóticas.

• Casp-2: apoptosis por falta de factores neurotróficos.

• Responsabilidad diferente según el tipo neuronal, el grado de madurez y el estímulo apoptótico.

• Activación de caspasas efectoras:– Activación DNasas.

– Poly-ADP-ribosa polimerasa.

– Kinasa ATM.

– Canales de iones (AMPA).

– Proteínas del citoesqueleto.

Otros Factores

• Par-4:– Prostate apoptosis response-4 protein.– Sobre-expresada en células apoptóticas de

tumores de próstata.– Esencial en la apoptosis neuronal (desarrollo

y patológica):• Sobreexpresada en respuesta a estímulos

apoptóticos.• Interacción con la proteinkinasa C y Bcl-2

(dominio Leucine Zipper).

• Telomerasa:– Previene el acortamiento

de los cromosomas en la mitosis.

– Actividad incrementada en la inmortalización y transformación celular y en el desarrollo.

– Acción anti-apoptótica en los estadíos tempranos de la muerte neuronal.

Otros Factores

www.bio.miami.edu/dana/250/telomerase.jpg

Radicales Libres• La apoptosis neuronal producida por

diversos estímulos (privación de factores neurotróficos, excitotoxididad, falta de K, exposición a b-amiloide, isquemia) se acompaña de la producción de radicales libres de O.

• La acción de antioxidantes (SOD) no inhiben la apoptosis por falta de NGF.

• NGF previene la muerte celular cuando los radicales libres ya se han producido.

• Los radicales libres disminuyen la resistencia de las neuronas a la apoptosis.

Inducción De Apoptosis

• Falta de factores neurotróficos:– Desarrollo.– Enfermedades Neurodegenerativas.

• Glutamato (neurotransmisor excitatorio):– Neurodegeneración aguda (infarto).– Enfermedad de Alzheimer.

• Estrés oxidativo:– Infarto.– Envejecimiento.

• Toxinas ambientales.

Mecanismos De Supervivencia

• La complejidad funcional y estructural del SN se basa en la no división celular.

• La supervivencia neuronal permite mantener funciones continuas a larga distancia y la memoria duradera.

Cascadas De Señalización Anti-apoptótica

Factor De Trascripción NF-kB

Actividad protectora in vitro e in vivo:

NF-B APOPTOSISFalta de factores neurotróficosExcitotoxicidadEstrés oxidativoMn SOD

Bcl-2IAP

Promueve apoptosis:

NF-BO-

ExcitotoxinasGlutamato

Acido kainicoN-metil-D-aspartato

APOPTOSISNEURONAL

Señalización Intracelular

Stress

Factores NeurotróficosAutocrina o Paracrina

Heat-shock proteinsChaperona

Bcl-2, Bcl-XlEz antioxidantes

Caspasas

Ca2+

PKB/AKTCa/calmodulin dependent Protein kinase

CREB

Depolimerización actina

Ca2+

NMDACanalesDe Ca2+

cGMP NF-B

Otros Factores Que Modulan La Apoptosis En

E.N.D.E.N.D. Genéticos Ambientale

sAlzheimer APP, mutaciones

de la presenilina, ApoE

Traumatismo, baja educación, aporte calórico

Parkinson A-synuclein, mutaciones parkin

Trauma, toxinas, aporte calórico

Huntington Expansiones de Poly-CAG en Huntingtin

ALS Mutaciones Cu/Zn-SOD

Toxinas, respuesta autoinmune

Infarto Mutaciones cadasil

Fumar, dieta, grasa.

Mattson, M.P. (2000) Nature reviews 1: 120-9

Gene Disease Effect of Mutanton Apoptosis

CaspaseSubstrate?

Effect ofCaspase Cleavage

Androgen receptor Kennedy's Increased Yes Increased apoptosis

Huntingtin Huntington's Increased Yes Increased apoptosis

Spinocerebellaratrophy-2 (ataxin-2)

Spinocerebellaratrophy-2

Increased Yes ?

Dentatorubropallidoluysianatrophy (atrophin-1)

Dentatorubro-pallidoluysian atrophy

Increased Yes Increased apoptosis

Spinocerebellaratrophy-3 (ataxin-3)

Machado-Josephdisease

Increased Yes ?

Presenilin-1 Alzheimer's Increased Yes ?

Presenilin-2 Alzheimer's Increased Yes ?

Beta-amyloid precursor protein

Alzheimer's Increased Yes Increased apoptosis

ApoE Alzheimer's ? ? ?

Superoxide dismutase-1

Familial amyotrophiclateral sclerosis

Increased No for caspase-3

?

Alpha-synuclein Parkinson’s Increased No for caspase-3 ?

Productos génicos asociados con la neurodegeneración

http://www.hosppract.com/issues/2001/09/bred.htm

Enfermedades Neurodegenerativas

• Corteza cerebral:– Enfermedad de Alzheimer (demencia

senil).– Enfermedad de pick (demencia).– Enfermedad de Creutzfeld-Jakob.

• Ganglios Basales:– Enfermedad de Parkinson.– Corea de Huntington.

• Degeneración espino-cerebral:– Ataxia de Fiedreich.– Atrofia olivo-pronto-cerebelar.

• Enfermedades de la motoneurona:– Esclerosis Lateral Amiotrófica.– Atrofia olivo-pronto-cerebelar.

Alzheimer

• Pérdida progresiva del reconocimiento y problemas emocionales.

• Degeneración sináptica y muerte de neuonas en las estructuras límbicas (hipocampo, amígdala y septo) y corteza asociada.

• Agregados hiperfosforilados de proteína Tau.

• Excesiva proteolisis mediada por Ca y estrés oxidativo.

• Acumulación de placas de -amiloide.

Muerte Neuronal• TUNEL:

– Observada en ausencia de degeneración neurofibrilar.

– Se observa también en casos poco severos (poca NDF).

– Células TUNEL+, DNF-, Tau patológicas+.

– Células gliales TUNEL+.– Células TUNEL+, -amiloide+ y

próximas a placas seniles.• Expresión de genes de apoptosis.

Mecanismos Moleculares• Sobre-expresión de Bax:

– En las placas seniles.– No en neuronas Tau-PHF+.

• Bcl-2:– Resultados inmunohistoquímicos

controvertidos.– No cambios en ARNm.

• C-fos, c-jun, p53 y Fas:– En neuronas TUNEL+.– No en neuronas Tau-PHF+.

• Actividad de caspasas:– Fragmentación de la actina.

• Otros: Par-4, represión de NCKAP1.

-amiloide

• Inducción de apoptosis.• Aumenta la vulnerabilidad neuronal al estrés

oxidativo y la reducción energética.– Peroxidación de lípidos de membrana.– Deterioro de ATPasas de membrana y

transportadores de glutamato y clucosa:– Despolarización de membrana.– Depleción de ATP.– Excesivo influjo de Ca.– Disfunción mitocondrial.

• Protección: antioxidantes y estabilizadores de la homeostasis del Ca, neurotróficos y citoquinas.

-amiloide

-amiloide

A

APP

Casp-3

C31Apoptosis

Factores Genéticos

• Mutaciones en APP, presenilinas1 y 2.• Desarrollo temprano y hereditario de la

enfermedad.• Mutaciones en presenilinas:

– Incremento de la digestión g-secretasa.– Pre-1*: neuronas más susceptible a apoptosis.

• Acción Pres-1 anterior a la activación de caspasas. Aumenta la salida de Ca del RE.

Parkinson• Disfunción motoral.• Degeneración de las neuronas

dopaminérgicas in la substancia nigra.• Neuronas: estrés oxidativo

incrememtnado y disfunción mitocondrial.

• Déficit del complejo mitocondrial I.• Factores genéticos y ambientales

sensibilizan a las neuronas al estrés oxidativo y déficit energético.

• Incremento de par-4 y p53 en neuronas dopaminérgicas.

• Inhibidores de la caspasa-1, drogas que suprimen la síntesis de macromoléculas y facotres neurotróficos protegen a las neuronas in vitro.

• Mutaciones en a-synuclein en un pequeño número de casos.

Mecanismos Moleculares

Huntington

• Movimientos incontrolados.• Enfermedad hereditaria: expansiones

de CAG en el gen de hungtintin Incrementos de repeticiones de poliglutamina.

• Transtornos de la función mitocondrial y muerte excitotóxica.

• El efecto de hungtintin* no se limita a las neuronas.

• Redistribución de Casp-8 en una fracción insoluble del tejido del striatum.

• Huntingtin* Caspasa-8.• Caspasas huntingtin agregación y

neurotoxicidad.• Espresión de huntingtin inhibe la apoptosis

antes de la lesión mitocondrial.


Esclerosis Lateral Amiotrófica

• Parálisis progresiva.• Degeneración de las motoneuronas

en la médula espinal.• Formas esporádica y genética

(mutaciones en la cu/Zn SOD).• SOD* no disminuye su actividad

antioxidante pero incrementa su actividad pro-apoptótica.

• SOD* interacciona con H2O2 o O- daño oxidativo en las membranas y alteraciones en las funciones mitocondriales vulnerables a la apotposis excitotóxica.

• Incremento de Bax, no de Bcl-2.• Sobreexpresión de Bcl-2 e inhibidores de

caspasas retrasan la degeneración y muerte.


Infarto Cerebral

• Infarto:– Corazón necrótico.– Penumbra isquémica.

• Daño del ADN y activación de PARP.

• Expresión genes proapoptóticos y salida de cyt-c.

• Hidrólisis de MPL:– ASMasaEsfingomieli

naceramida.


Neurodegenerativas• Apoptosis neuronal. • Mecanismos de supervivencia.• Enfermedades

neurodegenerativas.• Aplicación: estudio de la

apoptosis neuronal asociada a la enfermedad de scrapie.

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