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Universidad de los Andes

Ciencias sociales

Departamento de psicología

ALCANCES DE LOS EFECTOS DEL ESTRÉS AGUDO SOBRE LA INFLAMACIÓN

DEPENDIENTE DE LA MICROGLÍA EN ESTRUCTURA HIPOCAMPALES Y SU

RELACIÓN CON LA CONSOLIDACIÓN DE LA MEMORIA EMOCIONAL Y

ESPACIAL EN UN BIOMODELO DE ANSIEDAD

Trabajo de grado para optar al título de

PSICÓLOGA

Maria Alejandra Tangarife Cabrera

Bajo la dirección de Fernando Cárdenas P. (Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia)

Bajo la asesoría de J. Landeira-Fernández (Pontifícia Uuniversidade Católica de Rio de Janeiro,

Brasil - PUC)

Bogotá, D.C., enero de 2018.

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A Gumball, del Increíble Mundo de Gumball.

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Agradecimientos

Considero que no me alcanzan las palabras para expresar lo profundamente agradecida que estoy

con todas las personas que me apoyaron durante la realización de mi tesis, pero procederé con los

puntos que considero más importantes. En primer lugar, quisiera agradecerle al profesor J.

Landeira-Fernández, director del departamento de psicología y del laboratorio de Neurociencia

de la PUC en Rio de Janeiro y a todo el equipo de su laboratorio (Silvia, Flavia y a todos sus

estudiantes) por haberme apoyado en el 100% del financiamiento del presente trabajo y por haber

sido tan amables conmigo durante mi estadía en Brasil. En segundo lugar, quiero agradecer al

equipo del laboratorio de Neurociencia y Comportamiento de la Universidad de los Andes, pues

la culminación del trabajo no hubiera podido ser posible sin ellos. Así pues, quiero agradecerle al

profe Fernando por su admirable paciencia, dedicación, liderazgo y por supuesto, muchas

correcciones. Junto a él, Karencita, Diana y Martita (de manera paralela) resolvimos preguntas y

aclaramos dudas como si fuésemos un equipo; gracias por su apoyo. Por otro lado, quisiera

agradecerles a mis papás por haberme dado mucho amor y obligarme a ir al médico. Finalmente,

quisiera agradecerle a mi amiga Catalina por acompañarme durante noches enteras a mirarme

escribir, a mi amigo Sergio por no hacer nada, pero ser cool, a mi amigo Mateo por ser muy

paciente, nuevamente a Martita por darme muchos ánimos y especialmente a mi novio David por

darme tranquilidad. Muchas gracias, a todos los quiero.

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Índice

Lista de Figuras………………………………………………………………………6

Resumen……………………………………………………………………………...7

Introducción………………………………………………………………………….8

Aproximaciones a la microglía.………………………………………...…………...10

Aproximaciones al hipocampo……………………………………………………...14

Aproximaciones al estrés…………………………………………………………....24

Aproximaciones a los efectos del estrés sobre el hipocampo……………………….33

Aproximaciones a los efectos del estrés sobre la microglía…………………...……43

Aportes a la inhibición de la microglía de fenotipo M1……………….…...……….53

Introducción a las cepas Carioca High Freezing y Carioca Low Freezing…………57

Método………………………………………………………….…………….…….64

Resultados…………………………………………………….………………….…71

Discusión……………………………………………………………………............95

Referencias……………………………………………………………………..….107

6

Lista de figuras

Figura 1. División de grupos experimentales……………………………………65

Figura 2. Ilustración de una caja de condicionamiento aversivo…………....…..67

Figura 3. Esquema general de Xplorat………………………………………..…67

Figura 4. Test de reconocimiento de objetos……………………………………69

Figura 5. Morfología de la microglía……………..………………………….….71

Figura 6. Media del tiempo de congelamiento durante el protocolo de miedo

condicionado…………………………………………………………….………73

Figura 7. Motricidad por el campo abierto……… ………………………….….76

Figura 8. Promedios del tiempo de congelamiento y frecuencia del congelamiento en los grupos

experimentales……………………………………………………….….… …..80

Figura 9. Promedios de tiempo y frecuencia de acicalamiento………..…..….. 82

Figura 10. Promedios de tiempo y frecuencia de estar parado en las patas

traseras………………………………………………………………………….84

Figura 11. Porcentaje de exploración de los objetos durante la fase de

familiarización………………………………………………………………….86

Figura 12. Porcentajes de exploración en el objeto familiar y novedoso………87

Figura 13. Microglía activada en el giro dentado…………………………..…..89

Figura 14. Microglía activada en el área CA3 del hipocampo estresado…….....91

Figura 15. Microglía activada en el área CA3 de los animales Nv……………..92

Figura 16. Microglía activada en el área CA1 de los grupos

experimentales…………………………………………………………………..94

Figura 17. Microglía activada en el CPU de los grupos

experimentales………………………………………………………………......96

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Resumen

La microglía, principal célula reguladora de los procesos inmunes en el ambiente cerebral (Streit

et al., 2004), se destaca durante el estrés por su colaboración en procesos de proinflamación y

fagocitosis (Sugama et al., 2007). Se encuentra en grandes concentraciones en el hipocampo

(Lawson et al., 1990) y se ha observado que en condiciones de estrés fuertes puede responder de

manera poco adaptativa, al favorecer procesos de muerte neuronal e impedir la correcta

consolidación de memorias espaciales, en contraposición con emocionales (Milior et al., 2016;

Tanaka et al., 2006). El presente experimento evaluó los efectos de la respuesta inmune,

dependiendo del grado de vulnerabilidad ante el estrés usando un biomodelo de ansiedad

desarrollado en el laboratorio de neurociencia de la PUC-Rio (de Castro Gómes et al., 2011). El

modelo, compuesto por las cepas CHF (más congelamiento, “vulnerable”) y CLF (menos

congelamiento, “no vulnerable”) fue dividido en dos grupos (Si Estrés vs. No estrés); la mitad

recibió un estímulo aversivo (choque 0.7mA). Posteriormente, fue evaluado en protocolos

comportamentales relacionados con la consolidación de la memoria emocional y espacial, y

finalmente se midieron los niveles de inflamación del hipocampo y el CPU. Se identificó que el

estrés afectó los patrones de pro-inflamación el hipocampo de CHF, quien se caracterizó por

consolidar y mantener las respuestas relacionadas con el estímulo aversivo. En CLF, por el

contrario se observó que la pro-inflamación estuvo presente en los animales estresados y no

estresados sin diferencia. En cuanto al comportamiento, se observaron impedimentos en la

consolidación de las memorias, además del aumento de la motricidad, lo que permite sugerir

problemas cognitivos. Se cree que los patrones de inflamación pueden tener bases genéticas

derivadas del proceso de fenotipaje, pero no se considera que la información sea concluyente; se

recomiendan posteriores estudios para aclarar los interrogantes del experimento.

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Introducción

El uso de modelos animales para la investigación en neurociencia del comportamiento ha

facilitado el entendimiento sobre los principios anatómicos y fisiológicos de la conducta humana

en la actualidad (Bovenkerk & Kaldewaij, 2015; Heeger, 2011; Panksepp, 2011).

Uno de los temas relacionados con el comportamiento que se ha pretendido explorar a

través del tiempo es el estrés y sus consecuencias cuando no es regulado correctamente por el

sistema. El estrés es una condición que ha cobrado una relevancia representativa en la sociedad,

pues es reconocido como un “gatillo” para el desarrollo de otras condiciones, tales como el

aumento de la propensión a los trastornos psicológicos y enfermedades como la depresión, la

ansiedad, la demencia, el cáncer, la diabetes, (Barnay, 2016; McEwen, 2000; Waugh, Hamilton,

Chen, Joormann, & Gotlib, 2012); y otros problemas cognitivos como la pérdida de la

concentración, la dificultad frente a la toma de decisiones y la pérdida de la memoria a corto

plazo (McEwen & Sapolsky, 1995).

Esencialmente, el estrés es una característica compartida a través de las especies, pues

permite al organismo movilizar sus recursos energéticos para adaptarse al ambiente (McEwen &

Gianaros, 2010) y regresar a un estado de homeostasis (Juster, McEwen, & Lupien, 2010). En

otras palabras, se reconoce como una reacción de supervivencia potencialmente adaptativa ante

condiciones normales y de cambio medioambiental (McEwen, 2007; de, V & Landeira-

Fernandez, 2008a; de Castro Gómes, Barroso Silva, & Landeira-Fernandez, 2011). Sin embargo,

los efectos sobre el sistema se encuentran en un dialogo constante con la intensidad, la duración,

la frecuencia y el grado de controlabilidad del estímulo (McEwen, 2000; Lucassen et al., 2014).

Se sabe que su mala regulación puede conducir al desarrollo de enfermedades (Rosch, 1979) y es

por esta razón existe la necesidad de explorar sus características biológicas y fisiológicas en

diferentes contextos experimentales y de vulnerabilidad.

El estrés es una condición que tiene una complicada fisiología que ha ser explorada con

determinación. Hoy en día se considera como un problema representativo que prevalece en

nuestra sociedad, hasta el punto de ser considerado uno de los principales causantes de

enfermedad en la población trabajadora (Chrousos, 2009). Su incidencia se ha reportado a través

del incremento de los costos de mantenimiento de las pensiones y los subsidios para ciudadanos

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inhabilitados por causas de enfermedades relacionadas. Por ejemplo, en EEUU se ha superado

una suma media de 225,8 billones de dólares anuales para el tratamiento de enfermedades

(Stewart, Ricci, Chee, & Morganstein, 2003). De este dinero, aquel que sólo es dedicado al

tratamiento de la depresión o la ansiedad relacionadas al estrés laboral es de aproximadamente

42, 3 billones de dólares, de los cuales tan sólo para 1990, trataron a una tercera parte de los

diagnosticados (Lepine, 2002). En Europa se han reportado gastos que pueden oscilar entre 500€

y 1600€ anuales por persona (Andlin-Sobocki & Wittchen, 2005). Al mismo tiempo, su

prevalencia y la de otros trastornos relacionados aumenta alrededor del mundo tanto en las zonas

urbanas como en las zonas rurales (Bandelow & Michaelis, 2015; Kessler & Bromet, 2013).

En respuesta a esta situación, los gobiernos de EEUU y Europa, por ejemplo, han sugerido

nuevos programas de intervención que promueven la sostenibilidad laboral y el aumento del

bienestar de los trabajadores, por medio del mejoramiento del ambiente de trabajo, la adaptación

al trabajo y la prevención de accidentes y enfermedades (Barnay, 2016). Estos programas

proponen estrategias de relajación, asistencia psicológica e intervenciones relacionadas con los

individuos y las organizaciones (van der Klink, Blonk, Schene, & van Dijk, 2001; Murphy,

1996), pues la mejoría del trabajador consecuentemente generaría efectos positivos sobre la

eficiencia de las empresas (Royer Ghiglione, 2011). No obstante, los resultados no son los

mismos para todos los intervenidos, dado que las diferencias individuales establecen otras

estrategias de afrontamiento que cambian de persona a persona. Por lo tanto, es necesario seguir

explorando este problema desde otras perspectivas y campos de conocimiento, pues de esta

manera se podrían ofrecer soluciones efectivas, duraderas y por supuesto baratas. Desde la

neurociencia, se planea realizar un acercamiento a los efectos del estrés y sus relaciones con la

inflamación y los posteriores problemas cognitivos partiendo de un biomodelo de ansiedad. Todo

esto con el propósito de agregar nueva información que pueda ser utilizada en el futuro para

estudios o tratamientos relacionados.

A continuación, en los siguientes capítulos se realizará una aclaración general de los conceptos

más importantes que se deben tener en cuenta para entender los propósitos y objetivos de la presente

investigación. Si se tiene alguna duda sobre la organización de estos, por favor remítase al índice y escoja

el título que más le interese. Sin embargo, se recomienda fuertemente que se haga una revisión de todos

los capítulos para hacer más enriquecedor el aprendizaje después de la lectura.

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Aproximaciones a la microglía

El cerebro es un órgano que va cambiando de acuerdo a las contingencias del ambiente

por medio de un mecanismo de reorganización, muerte y eventual nacimiento de células

nerviosas que modulan su balance inhibitorio y excitatorio (Pascual, Achour, Rostaing, Triller, &

Bessis, 2012). Estos cambios ayudan a modificar, en condiciones normales, la función de los

organismos, al abarcar el trabajo, tanto de funciones fisiológicas como de mecanismos de

aprendizaje y comportamiento a lo largo de la vida (Tay, Savage, Hui, Bisht, & Tremblay, 2016).

Durante la trasmisión sináptica, más de un grupo de células nerviosas se encuentra participando,

mediando los procesos de plasticidad; se ha observado que las células de la glía, como los

astrocitos y la microglía, medían la actividad de las neuronas (Pascual et al., 2012). En

circunstancias particulares como es el caso de proteger al cerebro de un peligro potencial (Cherry,

Olschowka, & O'Banion, 2014), los cambios estructurales y de funcionamiento se ven afectados

por los efectos inflamatorios, neurotóxicos y neuroprotectores de la microglía (Streit, Mrak, &

Griffin, 2004).

La microglía es, por excelencia, la célula inmune del sistema nervioso central (SNC) y es

una de las mediadoras principales de los efectos proinflamatorios y antiinflamatorios (Streit et al.,

2004). Esta célula, de origen hematopoyético, comparte su nacimiento en el saco vitelino con el

sistema de células llamadas fagocitos mononucleares (Hanisch & Kettenmann, 2007) sin

embargo, antes de la vascularización se diferencia y migra al SNC (Kissa & Herbomel, 2010;

Arnold & Betsholtz, 2013). Este tipo de células se diferencian de los otros macrófagos, pues

poseen una expresión de genes que sólo se encuentran dentro del SNC (Geissmann et al., 2010;

Gautier et al., 2012; Wolf, Yona, Kim, & Jung, 2013). Se ha evidenciado que se encuentra

ubicada en la sustancia gris, correspondiendo a un 5-20% de la población glial del cerebro

(Dalmau, Finsen, Zimmer, Gonzalez, & Castellano, 1998; Kim, Son, & Mook-Jung, 2013) y se

divide en fenotipos con funciones diferentes, de los cuales se han encontrado en mayor

concentración, en el hipocampo (Dalmau et al., 1998), en el cuerpo calloso y en la substancia

nigra (Kierdorf & Prinz, 2013). Dos fenotipos allí encontrados son el ameboideo y el ramificado

(Dalmau et al., 1998), los cuales median su activación de acuerdo a cambios ambientales, dentro

y fuera del cerebro (Meireles et al., 2016), como por ejemplo con las respuestas de estrés (Milior

et al., 2016). También se pueden identificar otros estados de que se encargan de establecer

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funciones diferentes y restringidas de acuerdo a la naturaleza de la situación (Boche, Perry, &

Nicoll, 2013). De ahí se estimulan cambios en la morfología, la expresión de los genes y la

composición de las proteínas (Pascual, Ben, Rostaing, Triller, & Bessis, 2012; Boche et al.,

2013).

La microglía, como macrófago, se encarga de mantener la homeostasis del sistema por

medio de la comunicación con las neuronas (Wolf et al., 2013). Todo esto es desencadenado por

medio de señales endógenas y exógenas de cambio (Doens & Fernandez, 2014), detectadas

gracias al efecto de las moléculas liberadas por las células nerviosas sobre varios tipos de

receptores que se encuentran en la membrana de la célula microglial (Kierdorf & Prinz, 2013).

Entre estos, Kierdorf y Pritz (2013) han reportado los siguientes: los receptores CD200,

los cuales al estar activados ayudan a mantener el estado de reposo de la microglía; los receptores

inhibitorios CD47, cuyos ligandos transmiten el mensaje a la microglía de no fagocitar; la

glicoproteína TREM-2, que es asociada con la proteína DAP12 y estimula la fagocitosis y la

reparación del tejido en la microglía; el factor de estimulación de colonias 1 (Csfr1), activado por

la Interleucina 34 (IL-34); el factor estimulador de colonias (Csf1), que es recibido como una

señal de sobrevivencia para la célula; y el receptor de quimosina (CX3C), que también es

encontrado en otro tipo de células inmunes en el cuerpo. Este se encarga de ejercer una respuesta

inhibitoria que ayuda a mantener el fenotipo de reposo de la microglía y ha sido estudiado in

vitro, puesto que la deficiencia de su eje (CX3CL1-CX3CR1) es asociada con el aumento de la

neuroinflamación y el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas (Cho et al., 2011; Sellner

et al., 2016). No obstante, estudios en organismos vivientes demuestran la presencia de receptores

purinérgicos como el receptor P2X7, los cuales se encuentran expresados en presencia de ATP

extracelular liberado por células heridas. También hace parte del tejido excitable de la microglía,

en el que su canal de iones ligandodependientes estimula la liberación de citosinas

proinflamatorias como la famosa IL-1β (Vonend et al., 2004) y otros receptores purinérgicos

ionotrópicos como P2X, o metabotrópicos como P2Y1, P2Y2/4 y P2Y6, los cuales responden de

maneras diferentes ante la presencia de distintas concentraciones de ATP en el espacio

extracelular (Boucsein et al., 2003).

Ahora bien, se han registrado cuatro estados morfológicos principales en la microglía, que

son mediados gracias a sus mecanismos de comunicación autocrinos y paracrinos (Cherry et al.,

12

2014). Todos estos se encargan de cumplir cuatro funciones principales: la de vigilancia, la de

fagocitosis, la de citotoxicidad y la de neuroprotección (Maysinger & Zhang, 2016), que han sido

definidas gracias a la observación del efecto de las sustancias liberadas por cada una (Martinez &

Gordon, 2014).

El primer estado morfológico se conoce como inflamatorio, M1, en estado activo o en

forma de ameba, pero también se ha observado un fenotipo hiperramificado que también se

considera como “activo” (Mantovani et al., 2004; Reus et al., 2015). Dicho estado se interpreta

como una respuesta inmune impulsada debido a un posible daño en el tejido del SNC o a causa

de la presencia de microbios (Aloisi, 2001; Cherry et al., 2014). El “estado activo” puede ser

precipitado por la inducción del compuesto lipopolisacarido (LPS), el ATP extracelular

(Boucsein et al., 2003; Kierdorf & Prinz, 2013), por células de tipo th1, activadas por el

interferón-y (Gordon & Martinez, 2010; Cherry et al., 2014; Lisi, Stigliano, Lauriola, Navarra, &

Dello, 2014), por la respuesta de receptores de tipo Toll (Gurley et al., 2008), receptores tipo nod

(NLR) (Martinon, Burns, & Tschopp, 2002) etc.

A grandes rasgos, la respuesta ante los patógenos o el daño del tejido, es mediada a través

de los también llamados receptores reconocedores de patrones (PRR) (receptores tipo toll, NRL),

cuya labor principal es reconocer los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) y a

daños (DAMPs), para luego establecer la respuesta inmune e inflamatoria (Walker, Kavelaars,

Heijnen, & Dantzer, 2014; Kigerl, de Rivero Vaccari, Dietrich, Popovich, & Keane, 2014). En

consecuencia libera TNF-α, IL1-β, IL-6, iNOS (Mantovani, Sozzani, Locati, Allavena, & Sica,

2002; Meireles et al., 2016), IL-17, IL-23 (Kawanokuchi et al., 2008), IL-12 (Aloisi, Penna,

Cerase, Menendez, & Adorini, 1997; Gurley et al., 2008), IL-8 (Fernandez, Britton, & Rao, 2013;

Doens & Fernandez, 2014), respuestas desde los marcadores superficiales de las células, CD86,

CD68, CD40 (Sun et al., 2008; Kobayashi et al., 2013; Yang et al., 2016) y otras quimiocinas

(Fernandez et al., 2013) que ejercen un efecto citotóxico, inflamatorio y fagocítico sobre las

neuronas (Mantovani et al., 2004; Doens & Fernandez, 2014). Estando en este estado, la célula

tiende a liberar citocinas pro-inflamatorias, especies reactivas de oxígeno y especies reactivas a

nitrógeno para combatir con el peligro que afecta al tejido. Posteriormente, se activa el factor

nuclear κB (NF-κB) y las MAPks, cuya activación favorece la transcripción de genes, entre los

cuales se destacan aquellos asociados al inflamasoma (Martinon et al., 2002; Walker et al., 2014),

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que quiere decir el complejo de proteínas responsable de la activación de la capatasa 1,

promotora de la posterior liberación de citosinas proinflamatorias (Petrilli, Papin, & Tschopp,

2005; Franchi, Eigenbrod, Munoz-Planillo, & Nunez, 2009).

La respuesta de neuroinflamación del estado M1 de la microglía no solo se ha observado

ante la presencia de agentes patógenos o lesiones, sino también durante la exposición a

situaciones de potencial peligro, en donde se aumenta la activación y cantidad de su fenotipo

proinflamatorio M1 (Reus et al., 2015). Aunque el proceso de neuroinflamación sea considerado

como adaptativo para sistema inmune en el cerebro (Streit et al., 2004), cuando se presenta de

manera crónica o muy fuerte, la inflamación puede causar problemas que se han visto

relacionados con el padecimiento de trastornos psiquiátricos, neurodegenerativos y del desarrollo

(Streit et al., 2004; Reus et al., 2015), que aumentan su riesgo con la edad (Cho et al., 2011;

Vukovic, Colditz, Blackmore, Ruitenberg, & Bartlett, 2012).

Ahora bien, el fenotipo M2, en forma ramificada, o en “estado de alternativo” (Kitamura,

Tsuchihashi, & Fujita, 1978; Morris, Clark, Zinn, & Vissel, 2013; Cherry et al., 2014), se encarga

de producir IL-10 para disminuir la inflamación y reproducir matrices de proteínas protectoras

extracelulares YM1, que son poliaminas para la reparación de las heridas y activación de

receptores asociados con la inhibición de la fagocitosis (Cherry et al., 2014; Yang et al., 2016).

Este fenotipo se divide en tres fenotipos complementarios llamados M2a, M2b y M2c, los

cuales actúan de manera agregada a las funciones del fenotipo principal (Meireles et al., 2016).

La respuesta de la microglía M2a, se caracteriza por ser activada después de la liberación de la

citosina anti-inflamatoria IL-4, la elevación de AMPc (Ghosh, Xu, & Pearse, 2016; Meireles et

al., 2016) y la IL-13, secretadas por las células de tipo Th2 (Doyle et al., 1994; Cherry et al.,

2014). Tanto la IL-4 como la IL-13 son los inductores prototípicos del estado alternativo de la

microglía (M2) (Gordon & Martinez, 2010). Después, se encuentra el M2b, que es el fenotipo

inmunoregulatorio, en el que se evidencia el incremento de la concentración de IL-10 y factor de

crecimiento tumoral beta (TGF-β) (Lisi et al., 2014). El estado morfológico el M2c es activado

por IL-10, cuyo fenotipo es impulsado por complejos inmunes, para desactivar la microglía

“activada” (Boche et al., 2013; Meireles et al., 2016). Con la activación de M2c se ha observado

la liberación de otras moléculas que también ejercen un rol neuroprotector sobre las neuronas y

estos son arignasa-1 (arg-1), CD206 y SOCS3 (Chhor et al., 2013; Kobayashi et al., 2013).

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Se ha observado que el fenotipo M2 se encarga de cicatrizar y reparar el tejido, después

de desactivar la respuesta inmune e inflamatoria (Cherry et al., 2014), no obstante a lo largo del

desarrollo también se ha encargado de otros procesos esenciales para el mantenimiento del

sistema nervioso, como lo son la poda neuronal, la plasticidad sináptica (Kim et al., 2013;

Meireles et al., 2016) y la neurogénesis (Vukovic et al., 2012; Kierdorf & Prinz, 2013; Sellner et

al., 2016). Durante el desarrollo, el mantener el estado ramificado de la microglía es esencial para

promover la plasticidad sináptica y estructural, pues por medio de la liberación de las citosinas

anti-inflamatorias y los factores de crecimiento (Vukovic et al., 2012) se define el soporte los

procesos cognitivos, como lo son el aprendizaje y la memoria (Morris et al., 2013).

En el siguiente capítulo se va a exponer una introducción sobre el hipocampo y su

funcionamiento. Tener un conocimiento sobre esta estructura permite entender de manera más

profunda la función y los efectos de la microglía sobre esta estructura.

Aproximaciones al hipocampo

El hipocampo es una estructura que juega un papel importante en una gran variedad de

funciones heterogéneas alrededor del SNC (Fanselow & Dong, 2010); entre estas, se puede

observar aquellas que involucran particularmente, la codificación y el procesamiento de las

memorias episódicas a corto plazo (Squire, 1992; Spiers, Maguire, & Burgess, 2001) que son

dependientes de la potenciación a largo plazo (LTP) (Squire, 1992; Izquierdo et al., 2008; Kim,

Mahmoud, & Grover, 2005), el reconocimiento y representación espacial y contextual (Fanselow,

2000; Pothuizen, Zhang, Jongen-Relo, Feldon, & Yee, 2004; Solstad, Yousif, & Sejnowski,

2014), la neurogénesis (Alvarez-Buylla & Lim, 2004; Ehninger & Kempermann, 2006), la

plasticidad neuronal (Zhao, Deng, & Gage, 2008; Perederiy & Westbrook, 2013), algunos

procesos cognitivos (Eichenbaum, Yonelinas, & Ranganath, 2007), la regulación de la activación

fisiológica durante respuestas de estrés (Jacobson & Sapolsky, 1991; Dedovic, Duchesne,

Andrews, Engert, & Pruessner, 2009), el control emocional (Blanchard & Blanchard, 1972), entre

otros.

A continuación, se va a elaborar un viaje por el hipocampo, sus estructuras y sus

funciones más importantes.

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Como se dijo anteriormente las funciones del hipocampo han sido ampliamente

estudiadas en cuanto a su papel en la respuesta de aprendizaje contextual, el condicionamiento

aversivo y el control emocional. Varios estudios han observado estas funciones por medio de

lesiones en dicha estructura. De esta manera, lesiones en el hipocampo reducen el tiempo de

congelamiento frente a estímulos potencialmente peligrosos en ratas, como por ejemplo el olor de

los gatos o la presencia de estos mismos; no obstante también se aumentan los comportamientos

de evitación y la disminución del congelamiento, dependiendo de la región (Blanchard &

Blanchard, 1972). Otros estudios corroboran estas observaciones por medio de aumentos en la

agresividad y la evitación después de lesiones en el hipocampo en las pruebas de evitación activa

y pasiva (Blanchard, Blanchard, & Fial, 1970). Todo esto permitiría sugerir una disminución en

el control emocional.

Ahora bien, el estudio de esta región se ha abarcado de maneras cada vez más específicas

a lo largo del tiempo. De esta forma, al hipocampo se le ha dividido en dos estructuras que

funcionan de manera diferencial; estas son el hipocampo dorsal (HD) (hipocampo posterior en

primates (Fanselow & Dong, 2010)), que mantiene conexiones con el neo-córtexy el hipocampo

ventral (HV) (hipocampo anterior en primates (Fanselow & Dong, 2010)), que mantiene

conexiones con la amígdala y el hipotálamo (Fanselow & Dong, 2010; Dorey, Pierard, Chauveau,

David, & Beracochea, 2012). Se tiene conocimiento de que el HD regula las funciones

cognitivas, mientras que el HV se asocia con el control emocional y la inhibición del

comportamiento (Segal, Richter-Levin, & Maggio, 2010; Kouvaros & Papatheodoropoulos,

2016).

Estudios previos han identificado mecanismos divergentes de ambas estructuras por

medio de lesiones selectivas. Si la lesión es en HD, se provoca un deterioro de la formación de la

memoria espacial, la flexibilidad cognitiva y provoca alteraciones en la motivación y problemas

en la extinción de comportamientos aprendidos; pero una mejoría en el aprendizaje instrumental

(Moser, Moser, Forrest, Andersen, & Morris, 1995; Pothuizen et al., 2004; Segal et al., 2010;

Busse & Schwarting, 2016). Otros estudios identifican que HV regula y procesa información

sobre el estado motivacional y homeostático, asociado con el aprendizaje emocional y el

comportamiento defensivo (Pentkowski, Blanchard, Lever, Litvin, & Blanchard, 2006; Fanselow

& Dong, 2010; Segal et al., 2010).

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En la literatura se han aclarado los roles de estas dos estructuras. En primer lugar, se ha

demostrado que las lesiones del HV y HD en el contexto del aprendizaje aversivo, después de una

estimulación en la sustancia gris periacueductal dorsal (SGP), en un test de miedo condicionado

por medio de un choque en las patas, disminuye el tiempo de congelamiento, el cual, en HD es

interrumpido después de 24 horas desde el entrenamiento; y en HV inmediatamente después del

entrenamiento (Ballesteros, de Oliveira, Maisonette, & Landeira-Fernandez, 2014). Otros

estudios corroboran dicho hallazgo, como por ejemplo, (Kjelstrup et al., 2002), quienes

observaron que las lesiones en el HV no causaban deterioros sustanciales en el desempeño en el

laberinto acuático de Morris (pues sugerían que este aprendizaje era más dependiente de HD),

pero aumentaban significativamente el tiempo en los brazos abiertos de un laberinto en cruz

elevado. Lo anterior, permite sugerir que las manipulaciones en HV disminuyen las respuestas el

miedo, la ansiedad en las ratas y esto se debe gracias a sus conexiones funcionales (Fanselow &

Dong, 2010).

De la misma manera, se han se han reportado estudios en los que las lesiones de HV

hacen de los animales experimentales un blanco para los efectos nocivos del estrés y se ha

observado por medio del agravamiento de las úlceras gástricas en un test de restricción y frío

(Henke, 1990). Por otro lado, las lesiones selectivas de HD con NMDA en ésta área (Maren,

Aharonov, & Fanselow, 1997), provocan déficits en la memoria anterógrada y aumentan

sustancialmente el tiempo de entrenamiento para la expresión de miedo condicionado, muestran

impedimentos en el congelamiento después de la presentación de un tono, muestran

impedimentos en el reconocimiento de los contextos, muestran aumentos en la actividad

locomotora y disminuyen el comportamiento exploratorio en comparación con un grupo control

(Maren et al., 1997). A partir de la evidencia, puede quedar claro que el HD se encarga de

procesos cognitivos asociados con la locomoción, la exploración y la navegación y HV se

encarga de funciones emocionales y motivacionales (Fanselow & Dong, 2010).

Una serie de estructuras funcionales que conforman el hipocampo también han sido

ampliamente estudiadas por su conectividad y sus funciones. Así, dicha conectividad categoriza

al hipocampo desde las áreas corticales que lo rodean, que son la corteza perirrinal, la corteza

postrinal y las dos subdivisiones de la corteza entorrinal (lateral y medial) (Burwell & Amaral,

1998). Estas estructuras se encargan de recibir aferencias, con intensidades desiguales, desde

17

distintas áreas corticales, especialmente de las modalidades sensoriales y otras áreas como la

corteza visual y el neo-cortex (Burwell & Amaral, 1998; Kesner, Lee, & Gilbert, 2004; Dolorfo

& Amaral, 1998; Dong, Swanson, Chen, Fanselow, & Toga, 2009; Fanselow & Dong, 2010). De

manera recíproca, proyectan hacia distintas áreas corticales y desde la corteza entorrinal hacia

estructuras hipocampales (Agster & Burwell, 2009). La evidencia ha demostrado el rol de estas

estructuras en varios aspectos del aprendizaje y la memoria. Se ha sugerido que la corteza

entorrinal contribuye a procesos de representación espacial (Fyhn, Molden, Witter, Moser, &

Moser, 2004; Lipton, White, & Eichenbaum, 2007) y de memoria de trabajo (Fransen,

Tahvildari, Egorov, Hasselmo, & Alonso, 2006); que la corteza perirrinal contribuye a los

procesos de percepción (Bussey, Saksida, & Murray, 2003), de reconocimiento de objetos, en

compañía del fornix (Ennaceur & Aggleton, 1997; Bussey, Dias, Amin, Muir, & Aggleton, 2001)

y (junto con las otras cortezas) al aprendizaje y al reconocimiento contextual (Bucci, Phillips, &

Burwell, 2000; Burwell, Saddoris, Bucci, & Wiig, 2004); y la corteza postrrinal contribuye al

aprendizaje contextual y el reconocimiento de objetos (Burwell et al., 2004; Eacott & Gaffan,

2005).

El camino de comunicación del hipocampo comienza con la corteza entorrinal, que juega

un papel importante en la interconexión entre este y las estructuras corticales de asociación

(Dong et al., 2009). Esta corteza recibe la información cortical y desde las otras cortezas

parahipocampales y envía proyecciones hacia el hipocampo desde sus diferentes capas (Ino,

Kaneko, & Mizuno, 1998). De ahí se han observado inervaciones excitatorias unidireccionales

desde su capa II, por medio de la trayectoria perforante hacia la capa molecular de GD, (Spiller &

Racine, 1994; Amaral, Scharfman, & Lavenex, 2007) y en menos abundancia, a otras estructuras

como CA1, CA3 y el complejo subicular (Guzowski, Knierim, & Moser, 2004; Ino et al., 1998).

Desde la corteza entorrinal se promueve la excitación de GD, el cual por medio de la

estimulación de las fibras musgosas dirige sus inputs excitatorios hacia las neuronas piramidales

del área dorsal de CA3 (Wenzel, Buckmaster, Anderson, Wenzel, & Schwartzkroin, 1997;

Kesner et al., 2004; Henze & Buzsaki, 2007; Jonas & Lisman, 2014). En esta región se observan

respuestas de la actividad de la estructura al responder a cambios sensoriales y motivacionales

(Fyhn, Hafting, Treves, Moser, & Moser, 2007). Finalmente la proyección de CA3 hacia CA1

por medio de las colaterales de shaffer (Huang & Kandel, 2005) se promueve a través de las

18

neuronas piramidales dependientes de NMDA. Su excitación prolongada puede inducir la

potenciación a largo plazo (LTP) (de la cual se va a hablar posteriormente) (Stepan et al., 2012).

Después de haber sido procesada la información, CA1 envía proyecciones hacia el

subículo (Cenquizca & Swanson, 2007), el cual proyecta sus porciones septales hacia las áreas

más caudales y laterales de la corteza entorrinal y sus porciones temporales hacia las áreas

rostrales y mediales de esta misma (Ino, Kaneko, & Mizuno, 2001). El área CA1 se encarga de

extender sus axones por diferentes vías de asociación alrededor del cerebro. En primer lugar,

envía proyecciones de realimentación hacia las áreas más rostrales de la corteza entorrinal, hasta

las capas II y III (Ino et al., 2001). No obstante, también se han reportado outputs hacia

hipotálamo, el tálamo y otras regiones corticales, como el área perirrinal, postrrinal y la corteza

cingulada, además de las áreas visuales, auditivas, somatosensoriales, gustativas, viscerales, e

inclusive, la amígdala basolateral, la zona agranular de la ínsula y las áreas orbitales (Kesner et

al., 2004; Cenquizca & Swanson, 2007; Stepan et al., 2012). Se ha observado la actividad de

estas conexiones, especialmente por parte de CA1, excitada por CA3y es importante para los

procesos de consolidación de la memoria episódica en la corteza (Malerba, Krishnan, Fellous, &

Bazhenov, 2016).

Ahora bien, es pertinente para los propósitos de este trabajo anotar algunos respetos de

otras estructuras hipocampales. En primer lugar, se ha considerado al GD una región importante

debido a su participación en la neurogénesis (Zhao et al., 2008; Mongiat & Schinder, 2011). La

neurogénesis se ha observado en las células granulares de la zona subgranular y subventricular,

siendo la zona subventricular, la que se dedica a la proliferación de células que viajan al bulbo

olfatorio y la zona subgranular, la que se dedica a la proliferación de neuronas que permanecen

en el hipocampo (Zhao et al., 2008; Jessberger & Gage, 2014; Chesnokova, Pechnick, &

Wawrowsky, 2016). Se ha reportado que estas células inmaduras carecen de sinapsis funcional y

poseen una alta resistencia a inputs de otras células (Ambrogini et al., 2004). También se ha

observado que pueden durar varias semanas antes de poder ejecutar contactos sinápticos

correctamente, no obstante son altamente receptivas a los inputs GABAérgicos que facilitan su

despolarización y su diferenciación (Ambrogini et al., 2004; Tozuka, Fukuda, Namba, Seki, &

Hisatsune, 2005; Zhao et al., 2008; Mongiat & Schinder, 2011; Sibbe & Kulik, 2016). Con el

paso del tiempo, estas células pueden responder a pequeños contactos sinápticos glutamatérgicos

19

de la corteza entorrinal (Mongiat, Esposito, Lombardi, & Schinder, 2009). Otro de sus

reguladores principales es el BDNF, un factor de crecimiento que ayuda a modular la

neurogénesis y la sinaptogénesis (Lee & Son, 2009).

Una vez las neuronas han madurado lo suficiente, ofrecen un aumento de la plasticidad y

la capacidad de generar LTP (Ge, Yang, Hsu, Ming, & Song, 2007), además de proyecciones

hacia CA3. La proliferación y las posteriores conexiones de estas células es relevante para

perdurar los procesos de memoria y aprendizaje espacial y contextual a lo largo del tiempo (Zhao

et al., 2008; Vivar & van, 2013; Jessberger & Gage, 2014).

Teniendo en cuenta que las células inmaduras son vulnerables a los cambios ambientales

que facilitan o interrumpen los procesos de maduración y sobrevivencia (Ehninger &

Kempermann, 2006), se ha registrado que su funcionamiento es dependiente de mecanismos de

aprendizaje, como por ejemplo el aprendizaje espacial (Dupret et al., 2007). En experimentos que

involucran el aprendizaje y la neurogénesis, se ha observado que la sobrevivencia de las neuronas

que maduran, perdura en el tiempo, mientras que la sobrevivencia de las más jóvenes no, pues

aún no han generado conexiones efectivas (Dupret et al., 2007). Otros estudios han demostrado

los mismos resultados (Dobrossy et al., 2003). Sin embargo, a largo plazo, las actividades que

fomentan el aprendizaje tienden a aumentar la sobrevivencia de estas neuronas (Sisti, Glass, &

Shors, 2007).

Siguiendo esta misma línea, la neurogénesis en el área granular del GD es mayor en

roedores expuestos a ambientes enriquecidos, de los cuales se ha observado una mejora en

diversas pruebas aprendizaje, como el test de reconocimiento de objetos (Kempermann, Brandon,

& Gage, 1998; Bruel-Jungerman, Laroche, & Rampon, 2005). No obstante, otro tipo de estímulos

ambientales, como lo son el estrés físico y psicológico regulan el nacimiento de neuronas y

promueven el retraimiento de las conexiones sinápticas (Ehninger & Kempermann, 2006). En

estudios preliminares se ha evidenciado que una sola exposición a estímulos de estrés agudo

promueve la reducción de la proliferación de la neurogénesis en el GD del hipocampo adulto

(Gould, Tanapat, McEwen, Flugge, & Fuchs, 1998). Por el contrario, se considera que

actividades como el ejercicio voluntario es un factor protector e inductor de neurogénesis y

plasticidad en presencia de estrés (Lee et al., 2013; Lee, Yau, Lee, Lau, & So, 2016).

20

Se ha concretado en párrafos anteriores que el GD es proyectado hacia el área dorsal de

CA3 por medio de las fibras musgosas. Estudios anteriores han documentado que estas fibras

producen transmisiones GABAérgicas y glutamatérgicas, pero su sinapsis GABAérgica sólo se

presenta durante periodos de hiperexitabilidad, estimulación repetida o epilepsia (Gutierrez et al.,

2003). La importancia de este sistema de comunicación es esencial para los procesos de memoria

y aprendizaje contextual, puesto que GD procesa y releva sus señales, por medio de estas fibras,

hacia CA3, influenciando la cantidad de disparos excitatorios en CA1 (Urban, Henze, &

Barrionuevo, 2001; Henze, Wittner, & Buzsaki, 2002; Gruart, Munoz, & Delgado-Garcia, 2006).

Se ha sugerido que la modulación de la sinapsis de CA3-CA1 podría verse impedida con el daño

de GD u otra estructura que haga parte del sistema hipocampal; y estudios que corroboran esta

observación, demuestran que el daño de GD impide la consolidación de la memoria contextual en

tareas de adicción a la cocaína y en procesos de condicionamiento, después de la exposición a un

estímulo aversivo (Hernandez-Rabaza et al., 2008). Al mismo tiempo, la lesión de esta estructura

puede impedir la consolidación de memorias y bloquear el aprendizaje que depende de la

plasticidad neuronal (Madronal et al., 2016).

Otras características sobre la funcionalidad de GD se evidencian en tareas de modalidad

espacial y contextual al funcionar de la mano de CA1 y CA3. Durante la adquisición y

consolidación de las memorias, GD prima codificando aquellas de tipo contextual; de este modo

sus lesiones impedirían una consolidación correcta, además de problemas en otros procesos de

aprendizaje que funcionan de la mano de CA3 y CA1 (Solstad et al., 2014; Lana, Iovino, Nosi,

Wenk, & Giovannini, 2016; Madronal et al., 2016). Al mismo tiempo, las neuronas de GD y CA3

son receptivas a características espaciales en donde se observan disparos relacionados con

cambios específicos en el ambiente. Es por eso que (Leutgeb & Moser, 2007) identificaron que el

número de células activas en GD son más sensitivas a los cambios pequeños de las características

del ambiente, mientras que CA3 y CA1 no asemejan dichos cambios (Hasselmo, 2005a), pero si

establecen re-mapeos. (Leutgeb et al., 2005) mostraron que estos re-mapeos se encargan de

cambiar las intensidades de los disparos postsinápticos dependiendo de modificaciones en la

ubicación espacial, o cambios en la frecuencia de los disparos sobre una misma locación, en la

que se han alterado características del entorno. También son observados cuando en un mismo

ambiente las tareas del animal se ven alteradas (Guzowski et al., 2004). De ahí definieron que

21

CA3 mudaba sus patrones de disparo cuando las distribuciones de los objetos se ubicaban de

manera diferente en un mismo espacio. El rol de CA1 en esta misma situación demuestra que,

con la colaboración de la corteza entorrinal, procesa detalles selectivos de localizaciones para

codificar representaciones específicas de la memoria espacial (Lipton et al., 2007).

Ahora bien, en cuanto a CA3, se ha establecido que posee una red celular que se encarga

de representar y reorganizar el espacio y la distribución del ambiente en el que el animal se

encuentra, puesto que genera representaciones de dichos espacios en mapas espaciales y

contextuales (Leutgeb et al., 2005; Johnson & Redish, 2007; Kesner, 2007). Al mismo tiempo,

también es posible identificar un aumento en la actividad de sus células en pruebas de toma de

decisiones, como el laberinto en T, en donde se observa que son capaces de representar

posiciones de otros espacios y otras temporalidades (Johnson & Redish, 2007). Los procesos de

toma de decisiones de índole espacial pueden ser representados por medio de los cambios

dinámicos en la representación del animal en un espacio futuro (Johnson & Redish, 2007). De

manera interesante, en otros estudios se ha observado que esta área codifica información que

asocia los objetos con el espacio y también con sus olores (Ji & Maren, 2008; Solstad et al.,

2014). Así es como la lesión de esta área impediría la codificación de las memorias espaciales,

además del reconocimiento del espacio en el contexto (Ji & Maren, 2008).

Hasselmo (2009), comentando los modelos propuestos por Lee, Hunsaker y Kesner

(2005), quienes han trabajado la memoria espacial de ratas experimentales en un test de

reconocimiento de objetos después de lesiones en CA1 y CA3, ilustró la labor de estos autores, al

destacar sus resultados. Ellos observaron que el tiempo de exploración de los objetos novedosos

disminuía en un mismo espacio con lesiones en CA1, pero el efecto era aún mayor desde CA3.

Al mismo tiempo, explicó que el tiempo de habituación a los espacios puede disminuir con

lesiones en esta estructura, por lo cual esto impide que los animales evoquen una recuperación de

memorias contextuales incluso en el espacio de experimentación.

Las consideraciones sobre el área CA1 se enfocan en que posee funciones diferenciales

que dependen del agrupamiento y las conexiones que establecen sus neuronas piramidales

glutamatérgicas (Cenquizca & Swanson, 2006; Dong et al., 2009). Dividida esta estructura en

varias regiones, se le ha dado importancia a la porción dorsal (CA1d) y ventral (CA1v). Se ha

22

definido que las conexiones desde CA1v, como las que se ubican de manera bidireccional con la

amígdala (von Bohlen und & Albrecht, 2002) y otras subcorticales, están asociadas con procesos

autónomos, neuroendocrinos, emocionales y afectivos, además de proyectar hacia las regiones

ventrales y laterales del núcleo septal, la stria terminalis, las regiones preópticas, el tálamo, varios

núcleos del hipotálamoy áreas mamilares y premamilares incluyendo el paraventricular (NPV) y

el lateral (Cenquizca & Swanson, 2006; Dong et al., 2009; Dong et al., 2009). Al mismo tiempo,

CA1d mantiene relaciones con las estructuras corticales, por medio de la corteza entrorrinal y el

subículo (Cenquizca & Swanson, 2007). Lo anterior ha sugerido su papel en la modulación de los

ritmos theta y la navegación espacial, pues concentra neuronas de lugar que están envueltas en

procesos cognitivos que se encargan del procesamiento de la información visual (Dong et al.,

2009). Todo esto permite sugerir que las conexiones de CA1 soportan de manera independiente

respuestas emocionales y cognitivas relacionadas con el procesamiento la memoria dependiente

del contexto (Ji & Maren, 2008).

Finalmente pasando de la funcionalidad celular a los procesos moleculares, la

potenciación a largo plazo (LTP), es uno de los mecanismos más importantes que representa el

aprendizaje y la memoria en el hipocampo, puesto que altera los procesos de plasticidad

sináptica, aumenta la liberación de neurotransmisores de la neurona presináptica y magnifica las

respuestas de la postsináptica, para el establecimiento de nuevas conexiones (Barria, Muller,

Derkach, Griffith, & Soderling, 1997; Bernabeu et al., 1997; Martin & Morris, 2002). El LTP es

presentado como una estimulación neuronal que manifiesta respuestas postsinápticas excitatorias

que se encargan de extender la liberación de glutamato por varias horas, días e incluso meses

(Martin & Morris, 2002; Izquierdo et al., 2008). Al mismo tiempo, la expresión de LTP juega un

papel en el incremento de la sensibilidad de la neurona postsináptica (Manabe & Nicoll, 1994).

Los mecanismos de memoria y aprendizaje en el hipocampo dependientes de LTP, han sido

ampliamente estudiados en las aferencias desde CA3, por medio de los colaterales de Shaffer

hasta CA1 3(Izquierdo et al., 2008; Stepan et al., 2012).

Un resumen sobre los estudios de las dinámicas moleculares del LTP en el hipocampo

puede ser observado de la siguiente manera. El LTP requiere de la estimulación de los receptores

glutamatérgicos ionotrópicos AMPA (Dingledine, Borges, Bowie, & Traynelis, 1999), los cuales

ejercen una acción de despolarización de la célula postsináptica y colaboran con la

23

sensibilización de los receptores de NMDA (Dingledine et al., 1999). El influjo de Ca2+ cambia la

polaridad dentro de la célula y promueve la liberación del Mg+2 dependiente de voltaje que

bloquea la entrada de NMDA (Dingledine et al., 1999; Bloodgood, Giessel, & Sabatini, 2009;

Luscher & Malenka, 2012). Dentro de la célula, dicho influjo de Ca2+ también promueve la

estimulación de cascadas enzimáticas, entre las que se observa la autofosforilación de la

calcio/calmodulina-dependiente de proteína kinasa II (CaMKII) (Lisman, Schulman, & Cline,

2002). La CaMKII, a su vez, promueve la fosforilación de los receptores AMPA (Hayashi et al.,

1997). En estudios previos, se ha evidenciado que el bloqueo de CaMKII no afecta la transmisión

sináptica, pero si detiene la expresión de LTP y la fosforilación de AMPA (Barria et al., 1997).

En cierto modo los componentes rápidos de la entrada de Ca2+ son afectados por la modulación

de los receptores AMPA que igualmente son sensibilizados por medio del aumento de la

transmisión sináptica y la activación de CaMKII (Bloodgood et al., 2009; Luscher & Malenka,

2012).

Más adelante este efecto lento de la apertura de NMDA también permite la entrada de

Ca2+ a la neurona (Hayashi, Zviman, Brand, Teeter, & Restrepo, 1996) y coopera como inductor

de LTP y plasticidad (Bloodgood et al., 2009; Luscher & Malenka, 2012). Con el incremento de

la concentración Ca2+, se disminuye el potencial de membrana y aumenta el chance, tanto de una

despolarización, como de la entrada de más Ca2+ en la neurona postsináptica (Hayashi et al.,

1996). Esto mismo promueve la expresión de la proteína quinasa C (PKC), la cual por medio de

su autofosforilación promueve otras cascadas enzimáticas como la fosforilación de su substrato

GAP43 (proteína B50), que se expresa durante inducción de LTP (Gianotti, Nunzi, Gispen, &

Corradetti, 1992) y ayuda a promover la la transmisión glutamatérgica (Gianotti et al., 1992;

Roberson, English, & Sweatt, 1996; Izquierdo et al., 2008). De igual manera, se activan las

proteínas quinasas activadas por mitogeno (MAPKs) y la kinasa extracelular relacionada con la

señal (ERK) que juegan un papel importante en la regulación de la plasticidad dependiente de la

inducción de LTP (English & Sweatt, 1996; Vanhoutte et al., 1999). Las cascadas enzimáticas de

MAPK (p44 y p42) y ERK se translocan al núcleo para promover la fosforilación de los factores

de transcripción ELK-1, CREB y la aparición de la proteína fos (Vanhoutte et al., 1999). La

señalización de cascadas enzimáticas provocadas por MAPK juega un rol importante en la

regulación de los genes controlados por CRE, vía la fosforlación de CREB (Davis, Vanhoutte,

24

Pages, Caboche, & Laroche, 2000; Kanterewicz et al., 2000). Se ha sugerido de CREB es

necesario para la inducción de LTP, la formación de nuevas memorias y el mantenimiento de la

plasticidad (Bernabeu et al., 1997; Martin & Morris, 2002; Izquierdo et al., 2008).

Paralelamente, la estimulación de NMDA de la cual devienen cascadas enzimáticas y la

inducción de factores de crecimiento (English & Sweatt, 1996), también promueve la actividad

de la adenilil ciclasa, que impulsa al segundo mensajero, adenosín monofosfato cíclico (AMPc),

para aumentar el influjo de Ca2+ hacia la célula (Chetkovich, Gray, Johnston, & Sweatt, 1991).

AMPc promueve la activación de la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA), requerida

para la inducción de LTP y la formación de memorias (Bernabeu et al., 1997; Yang et al., 2004).

Inmediatamente después de que los niveles de AMPc aumentan, en la fase tardía del LTP, la

actividad de PKA empieza a ser evidente (Bernabeu et al., 1997), no obstante existen estudios

que argumentan que PKA también hace parte de la fase inicial (Yang et al., 2004). PKA se

encarga de mantener la autofosforilación de CaMKII por medio de la inhibición del inhibidor de

fosforilación 1 (I-1) (Yang et al., 2004), pero también se ha observado fosforilando otros

compuestos como el receptor AMPA y CREB, el cual se encargará de sintetizar las proteínas

requeridas para el mantenimiento y la plasticidad estructural que sigue después de la inducción de

LTP (Luscher & Malenka, 2012).

Para los propósitos de este estudio, es fundamental entender al estrés y los efectos que

este produce sobre el organismo y el hipocampo, pues esta es una estructura que influencia y se

ve influenciada por este proceso.

Aproximaciones al estrés

Todos los organismos vivos invierten sus recursos energéticos para adaptarse a las

circunstancias ambientales que aseguran su sobrevivencia (Habib, Gold, & Chrousos, 2001).

Cuando los recursos ambientales son menos óptimos, las respuestas de autorregulación

adaptativas comprometen mayores cantidades de energía para regresar a la línea de base, ya sea

en una situación verdadera o percibida (Morilak et al., 2005; Dijkstra & Homan, 2016). Todos

estos procesos se ubican bajo los conceptos que muchos autores, entre ellos McEwen (McEwen

& Wingfield, 2003) llaman homeostasis, alostasis, carga alostática y sobrecarga alostática, de las

cuales el estrés es inherente. En primer lugar, la homeostasis es definida como los procesos de

25

balance interno de un organismo para mantener la vida (McEwen & Wingfield, 2003; McEwen,

2007). En segundo lugar, el mantenimiento de esta homeostasis por medio de la generación de

respuestas adaptativas a cambios medioambientales, es denominado alostasis (Goymann &

Wingfield, 2004; McEwen & Wingfield, 2003; McEwen, 2007). El concepto incluye los procesos

que se llevan a cabo para alcanzar la estabilidad (McEwen & Wingfield, 2003). Otras

definiciones refieren a la alostasis como los niveles de actividad requeridos para que se mantenga

la estabilidad durante situaciones de cambio (Goldstein & McEwen, 2002). De la alostasis,

también se deriva el concepto de carga alostática, el cual se refiere a los ajustes fisiológicos y

morfológicos y la inversión de energía del cuerpo para adaptarse a cambios transitorios del

ambiente como las estaciones, el estatus social, las migraciones, los ciclos circadianos, la

búsqueda de comida, etc. (Juster et al., 2010). En otras palabras, la carga alostática se refiere a los

efectos prolongados de manera continua, o la intermitente activación de la alostasis (Goldstein &

McEwen, 2002).

En situaciones de cambios medioambientales, la percepción y la evaluación del entorno

sirven como punto de partida para que se pongan en marcha ciertos mecanismos de

autoregulación que movilizan la energía con el fin de regresar al estado de homeostasis (Juster et

al., 2010). Durante el incremento de la carga alostática, se han observado dos mecanismos

importantes, cuya función es servir como mediadores de estos procesos. De ahí se derivan el eje

simpático-adrenal-medular (SAM), que se encarga de liberar catecolaminas y el eje hipotálamo-

pituitario-adrenal (HPA), cuya labor principal es la liberación de glucocorticoides (Nicolaides,

Charmandari, Chrousos, & Kino, 2014; Goymann & Wingfield, 2004). De estos se va a hablar en

párrafos posteriores.

En condiciones en las que la carga alostática aumenta de manera impredecible y las

demandas de energía exceden los suplementos disponibles para regresar a la homeostasis, se

produce un estado de emergencia, cuyo propósito es producir cambios comportamentales y

fisiológicos rápidos en respuesta a la perturbación; a este se le denomina sobrecarga alostática

tipo I (Goymann & Wingfield, 2004; Goldstein & McEwen, 2002; McEwen & Wingfield, 2003).

Una vez la emergencia ha terminado, los niveles de energía disminuyen nuevamente a la línea de

base o incluso menos, aumentando la probabilidad de consecuencias dañinas o patológicas para el

sistema (Goymann & Wingfield, 2004). En general, la sobrecarga alostática tipo I ayuda al

26

organismo a sobrellevar las situaciones con el fin de obtener, nuevamente, los recursos necesarios

para la sobrevivencia (McEwen & Wingfield, 2003). Por el contario, otro tipo de sobrecarga

alostática, la tipo II, se encuentra situada en un contexto en el que los suplementos de energía se

mantienen constantes, pero las situaciones percibidas, que pueden ser derivadas, por ejemplo, de

una disfunción social, no desencadenan una respuesta adaptativa de lucha o huida, sino que

requieren de otros mecanismos de aprendizaje para que el organismo se adapte a la naturaleza de

la situación (McEwen & Wingfield, 2003).

Ahora bien, el concepto de estrés ha sido formulado desde diferentes disciplinas y

contextos (Selye, 1976). En primer lugar (McEwen & Wingfield, 2003) lo han definido como una

situación de amenaza real o implícita a la homeostasis, en la que un evento o sucesión de eventos

causan respuestas comportamentales y fisiológicas específicas para mediar dicha situación. No

obstante, en otros contextos no se ha precisado como una situación, sino como la respuesta hacia

una situación (McEwen & Wingfield, 2003). También se ha ubicado como un proceso que ayuda

al organismo a ajustarse a los cambios medioambientales diarios por medio de modificaciones en

el metabolismo (McEwen & Wingfield, 2003), funciones fisiológicas y funciones

neuroendocrinas (Nicolaides et al., 2014). De igual forma se ha explicado como la percepción de

un organismo hacia una interrupción o discrepancia en la homeostasis, cuyo trabajo es conducir

una acción fisiológica de regulación y una realimentación negativa (Goldstein & McEwen, 2002).

Normalmente, los mecanismos después del estrés, permiten que el cuerpo retome sus funciones

biológicas normales, sin embargo cuando este es severo o crónico, los costos biológicos de las

respuestas interrumpen estas funciones (Carstens & Moberg, 2000).

Por la misma línea (Selye, 1976) expuso una de las definiciones del estrés con el nombre

de Síndrome de Adaptación General (GAS), el cual era precisado como una respuesta no

específica del cuerpo ante una demanda apetitiva o aversiva. De ahí, al estrés positivo, lo

denominó eustrés y al negativo lo denominó distrés. En todo caso, todas las respuestas de estrés,

ya sean apetitivas o aversivas exhiben cuatro mecanismos biológicos de defensa, denominados

como comportamentales, autónomos, neuroendocrinos e inmunes (Carstens & Moberg, 2000). El

distrés, al contrario del eustrés involucra la percepción o el reconocimiento, consciente o

inconsciente, de que una situación es peligrosa para el mantenimiento de la homeostasis

(Carstens & Moberg, 2000). En animales de laboratorio, los indicadores del distrés usualmente se

27

encuentran en la presencia de patologías, automutilación o muerte. Es más, el distrés suele

acontecer cuando los costos biológicos que se derivan del estrés son negativos para las funciones

del cuerpo (Carstens & Moberg, 2000), o cuando se evocan respuestas con base a experiencias

aversivas, en las que la alostasis no es suficiente para mantener o restaurar la homeostasis

(Goldstein & McEwen, 2002).

Todas estas definiciones del concepto de estrés van ser abarcadas en este texto con el

mismo nombre, estrés.

Ahora bien, se va explicar la manera en la que estos cambios homeostáticos producen

respuestas a estímulos internos y externos, amenazantes e impredecibles, cuyas funciones van de

la mano de cambios fisiológicos, afectivos y cognitivos (Gagnon & Wagner, 2016). Cuando un

organismo se ve expuesto a una situación que provoca estrés, se puede asegurar la identificación

de ciertas reacciones fisiológicas que van a comprometer las respuestas del eje SAM y la función

del eje HPA (McEwen & Wingfield, 2003; Carstens & Moberg, 2000). La primera reacción

(SAM) ha sido considerada como una respuesta “rápida”, mientras que la segunda (HPA), es más

“lenta” (Sutanto & de Kloet, 1994) y predominante cuando el estímulo estresor se mantiene en el

tiempo (Zárate, Cárdenas, Acevedo-Triana, Sarmiento-Bolaños, & Leon, 2014).

El estrés de respuesta "rápida" o SAM, se destaca por la activación del sistema nervioso

simpático, en el que se observa una liberación de catecolaminas como epinefrina (Epi)

norepinefrina (NE) y por otra parte, acetilcolina (ACh) (Schwabe, Joels, Roozendaal, Wolf, &

Oitzl, 2012). Su respuesta “rápida” se encarga de movilizar los recursos metabólicos, es decir la

presión arterial, la respiración y el envío de sangre hacia las extremidades para que se produzca

una respuesta aguda de "lucha o huida" (Cacioppo et al., 1998; Lucassen et al., 2014). Bien es

sabido que muchas de estas reacciones son adaptativas para la sobrevivencia de las especies, no

obstante, es necesario tener en cuenta que estas situaciones ya no hacen parte del contexto en el

que se desarrolla el estilo de vida de las poblaciones humanas. Por esto, es interesante revisar las

reacciones fisiológicas que normalmente se dan durante situaciones potencialmente peligrosas,

pues ciertamente se expresan a través de los eventos que vivimos en la actualidad, pero no

solemos interpretamos de manera correcta (Cacioppo et al., 1998).

28

Ahora bien, al iniciar la respuesta de estrés, Epi es liberada desde la medula adrenal y el

tallo cerebral y comunica la información sensorial con el sistema nervioso central (SNC) por

medio de la estimulación de los β-adrenoreceptores del nervio vago (Wong et al., 2012). Una de

las labores principales de Epi, abarca la modulación de la energía durante la respuesta de estrés,

puesto que actúa en el hígado para liberar glucógeno e incrementar los niveles de glucosa en la

sangre (Osborne, Pearson-Leary, & McNay, 2015; Gold, 2014). Desde la periferia, Epi no sólo

modula la energía del cuerpo sino que también establece relaciones con los circuitos que

cooperan con el procesamiento de la memoria y aprendizaje en el hipocampo (Gold, 2014). De

manera paralela, habiendo sido estimulado por Epi, el nervio vago excita al núcleo del tracto

solitario (NTS) el cual dirige sus proyecciones al locus coeruleus (LC) (Roosevelt, Smith,

Clough, Jensen, & Browning, 2006; Wong et al., 2012) y de ahí, ambos desplazan sus

conexiones a estructuras tales como la amígdala (McGaugh & Roozendaal, 2002), en particular

al núcleo basolateral (BLA), que se encarga de ejercer una actividad excitatoria sobre el

hipotálamo, el neocortex, el hipocampo, el núcleo caudado y otras regiones que ayudan a

modular, por ejemplo, la consolidación de las memorias (McGaugh & Roozendaal, 2002;

Wong et al., 2012; Gagnon & Wagner, 2016); a la amígdala medial (MeA) (Morilak et al.,

2005); a la amígdala central (Cea) (Cecchi, Khoshbouei, & Morilak, 2002); a LC (McGaugh &

Roozendaal, 2002); al núcleo paraventricular del hipotálamo (NPV) en donde se estimula la

producción de CRF (Francis, Caldji, Champagne, Plotsky, & Meaney, 1999; Nicolaides et al.,

2014; Charmandari, Tsigos, & Chrousos, 2005); al hipocampo, SGP y a otras áreas en la corteza

(Belujon & Grace, 2015) que van a permitir la modulación de las respuestas adaptativas de lucha

o huida (McEwen & Wingfield, 2003; Gagnon & Wagner, 2016).

Es importante resaltar el papel de LC durante la respuesta simpática del estrés, pues sus

funciones son imperantes para las posteriores respuestas de activación. Esta estructura también es

activada por medio del factor liberador de corticotropina (CRF) que es un péptido que, por una

parte, se encarga de iniciar la respuesta neuroendocrina del estrés y por la otra, funciona como un

neurotransmisor excitatorio que activa las respuestas noradrenérgicas (Van Bockstaele, Colago,

& Valentino, 1996; Curtis, Leiser, Snyder, & Valentino, 2012; Snyder, Wang, Han, McFadden,

& Valentino, 2012; Sun, Hunt, & Sah, 2015). Estudios recientes demuestran que los

comportamientos de ansiedad y aversión inducidos a través del estrés por restricción son

29

producto de la liberación de CRF en LC desde el núcleo central de la amígdala (CeA) (Sah,

Faber, Lopez De, & Power, 2003a; McCall et al., 2015). El incremento de la actividad de las vías

noradrenérgicas de LC, por medio de la activación de sus β-adrenoreceptores y sus α-

adrenoreceptores, aumentan los comportamientos de ansiedad y de aversión respectivamente

(McCall et al., 2015). Otros estudios han identificado que la administración

intracerebroventricular de CRF aumenta las concentraciones norepinefrina (NE) y dopamina

(DA) en el hipotálamo medial y la corteza prefrontal (CPF) (Lavicky & Dunn, 1993). Por otro

lado, si LC llega a ser inhibido, llevaría consigo, como consecuencia, una disminución

significativa de la hormona corticotrópica (ACTH) y CRF en NPV y provocarían una

desregulación en la respuesta de estrés (Francis et al., 1999).

Está claro que los principales impactos emocionales que se efectúan a raíz de estímulos

estresantes, son producto de las estructuras amigdalinas como CeA, pues de esta región se envían

eferencias de CRF hacia LC y al núcleo del tracto solitario (NTS) (Sah, Faber, Lopez De, &

Power, 2003b). El 34% de las proyecciones de CeA hacia LC son de neuronas que contienen

CRF, no obstante, esta estructura también dirige sus inputs excitatorios hacia otras regiones del

cerebro (Kravets, Reyes, Unterwald, & Van Bockstaele, 2015; Sah et al., 2003b). Esta estructura

juega un papel importante en el procesamiento de los estímulos emocionales derivados del

estrés y es la responsable de mediar las respuestas autónomas y endocrinas con estímulos

emocionales salientes (Kravets et al., 2015). Desde LC, NE también ejerce acciones sobre BLA,

que envía sus proyecciones hacia el hipocampo y la corteza perirrinal (CPeri) y sus neuronas

glutamatérgicas también cooperan con la regulación de la respuesta de estrés al cooperar en la

consolidación las memorias emocionalmente significativas (McGaugh, 2000; Roozendaal,

Brunson, Holloway, McGaugh, & Baram, 2002; Sah et al., 2003a).

La liberación de NE es adaptativa, por ejemplo, en situaciones como el estar ante la

presencia de un depredador, eso quiere decir todas aquellas condiciones que representen un

peligro potencial para la sobrevivencia de un individuo (Curtis et al., 2012; Snyder et al., 2012).

Ciertamente estudios han indicado que, frente a una exposición a estrés agudo por restricción en

ratas, la liberación de NE es aumentada en el espacio extracelular y este es captado por la

amígdala, que ejecuta una acción activadora en el eje HPA (Morilak et al., 2005).

30

Relacionada con estresores psicológicos agudos o muy fuertes, también se evidencia la

proliferación de respuestas inmunes. Los detalles de estos efectos van a ser detallados más

adelante en el capítulo sobre los efectos inmunes durante las respuestas de estrés (para más

información vea capítulo de acercamientos a los efectos del estrés sobre la microglía).

Aunque NE es una de las sustancias más características del eje SAM ante las situaciones

de estrés agudo (Belujon & Grace, 2015), en los párrafos anteriores se mencionó que el eje HPA

también se encarga de mediar las respuestas estresoras por medio de otra sustancia. Los

protagonistas de este proceso son los glucocorticoides (o corticosteroides) (GC) (Cecchi et al.,

2002).

A partir de este punto, se describe la respuesta “lenta” del estrés, que es mediada por el

eje HPA (Lucassen et al., 2014). Este mismo desencadena una secreción de hormonas en el

sistema y por un mecanismo de realimentación negativa, regula su actividad (Herman &

Cullinan, 1997; Nicolaides et al., 2014). Ante la percepción de un estresor, se ha identificado que

NPV se encarga de regular la acción del eje (Herman, Cullinan, Ziegler, & Tasker, 2002). Las

neuronas de NPV se responsabilizan por excretar y transmitir CRF (Heinrichs, Menzaghi, Merlo,

Britton, & Koob, 1995; Herman & Cullinan, 1997) y vasopresina arginina (VPA) (Scott & Dinan,

1998) para estimular la liberación y el aumento significativo de la concentración de ACTH desde

la glándula pituitaria anterior (Ono, Bedran de Castro, & McCann, 1985; Herman & Cullinan,

1997; Gallo-Payet, 2016). La liberación de ACTH compromete la generación del estímulo más

potente para la corteza adrenal (Gallo-Payet, 2016), puesto que viaja por la sangre hasta la zona

Fasiculata (ZF) de las glándulas adrenales, en donde promueve la liberación de GC (Szalay, De,

Stark, & Folly, 1985; Payne et al., 2007).

De manera interesante, en condiciones normales la liberación de GC, circadiana y

ultradiana (liberación aproximadamente cada hora) es esencial para mantener la homeostasis del

sistema (Sarabdjitsingh et al., 2010). Los GC viajan por el torrente sanguíneo, organizando la

movilización y el metabolismo de sustancias importantes, como la glucosa en la sangre, además

de controlar los ritmos energéticos por todo el cuerpo (Herman et al., 2003; Myers, McKlveen, &

Herman, 2014; Oster et al., 2016). La glucosa es la principal fuente de energía para el buen

funcionamiento del sistema y ésta sólo puede ser modulada a través de la insulina (Kuo,

McQueen, Chen, & Wang, 2015). En ese caso los GC estimulan la glucogénesis a través del

31

antagonismo de la producción de insulina en el páncreas (Kuo et al., 2015). Los GC actúan de

manera genómica como reguladores de la transcripción de los genes que responden a ellos

mismos (Lucassen et al., 2014).

No obstante, ante una respuesta urgente o de estrés, los GC viajan por el torrente

sanguíneo hasta traspasar la barrera hematoencefálica y ejercen un efecto de realimentación

negativa (de Kloet, 2013) en el hipotálamo, la corteza prefrontal medial (CPFm), la hipófisis y el

hipocampo (de Kloet, Joels, & Holsboer, 2005; de Kloet, 2013). La realimentación negativa

ocurre por medio de la adhesión de GC a los receptores de glucocorticoides (GR), de poca

afinidad y de mineralocorticoides (MR), de alta afinidad, en los núcleos de las células de estas

áreas (Zhu et al., 2014; de Kloet et al., 2005). No obstante, ha y que tener en cuenta que los GC

no sólo tienen un efecto inhibidor de la actividad, sino que esto depende de la estructura a la que

se adhieren, por ejemplo, si estimulan la conexión amígdala-CRF-NE, llevarán a un aumento de

la actividad, que induce ansiedad (de Kloet, 2013).

En condiciones estresantes MR se encarga de responder a las estimulaciones iniciales y de

manera prolongada GR permite la finalización de la realimentación negativa (Oster et al., 2016).

Es de resaltar que los receptores MR se encuentran situados especialmente en las áreas límbicas,

particularmente el hipocampo, mientras que los receptores para GR se ubican por todo el cerebro,

incluyendose, en menos concentración, en las áreas límbicas (Herman, Patel, Akil, & Watson,

1989; Sutanto & de Kloet, 1994; Zhe, Fang, & Yuxiu, 2008; Oster et al., 2016). En el hipocampo

se ha considerado que la actividad de los MR ayuda a mantener la excitabilidad de las neuronas,

pero GR envuelve la supresión o la normalización de esta actividad (Liu, Wang, Ni, & Sun,

2007). En condiciones normales existe mayor afinidad hacia los receptores GR, que sólo se

activan a partir de grandes concentraciones de GC, como las observadas durante los picos de

liberación circadianos y ultradianos (Sarabdjitsingh et al., 2010; de Kloet, 2013).

En cuanto a las acciones no genómicas al nivel de la membrana, las cuales son evidentes

en presencia de estrés, se ha evidenciado que los MR promueven una neurotransmisión

excitatoria al aumentar la liberación presináptica de glutamato y que los GR promueven una

transmisión inhibitoria al influenciar la neurotransmisión GABAérgica y de endocanabinoides

(de Kloet, 2013). De esta manera, el rol de MR estaría modulando la adquisición y el

procesamiento de la información y la respuesta comportamental ante el estresor, mientras que GR

32

suprimiría la actividad hasta llegar a la condición de base, además de permitir la consolidación de

las experiencias traumáticas y eliminar las memorias de poca importancia en ese momento (de

Kloet, 2013).

La funcionalidad de la relación entre estos receptores es de importancia para la regulación

de muchos estados que se encargan de organizar los cambios homeostáticos del sistema; es por

eso ha sido interesante estudiar la interrupción de esta dinámica. Por ejemplo, estudios han

indicado que la desregulación de la función de los receptores MR y GR, durante la respuesta del

eje HPA tiene varias consecuencias en cuanto a los comportamientos poco adaptativos después

de la exposición a un estímulo estresor (Feldman & Weidenfeld, 1999). Harris, Holmes, de Kloet,

Chapman y Seckl (2013) observaron impactos en la memoria y la actividad cognitiva debido al

aumento de la expresión de MR y la disminución de expresión de GR después de la exposición

de ratas a un modelo de estrés por restricción. Ellos observaron que el aumento de la expresión de

MR facilitaba la consolidación de las memorias, pero disminuía la flexibilidad cognitiva,

mientras que la disminución de GR incrementaba los comportamientos depresivos y también

disminuía la flexibilidad cognitiva. Todo esto impediría una realimentación negativa efectiva.

Durante la realimentación negativa, una de las estructuras principales es NPV. Aunque los

inputs sinápticos de NPV dependen de transmisiones de glutamato, la realimentación negativa de

las respuestas del eje HPA consiste en la liberación de GABA desde sus neuronas GABAérgicas

(Herman et al., 2002). Se ha demostrado que la regulación del eje HPA en NPV se efectúa por

medio del aumento de la concentración de glucocorticoides en el área, los cuales también

promueven la síntesis de anandamida, 2-araquidonilglicerol (2-AG) (endocanabinoides) y la

activación de los receptores CB1 (cannabinoides), que se encuentran en las neuronas

presinápticas (Di, Malcher-Lopes, Marcheselli, Bazan, & Tasker, 2005). En efecto, CB1 se

encarga de disminuir la secreción de neurotransmisores hacia el espacio sináptico, por lo tanto,

inhibe el flujo de glutamato de las neuronas glutamatérgicas en NPV y disminuye su actividad

(Evanson, Tasker, Hill, Hillard, & Herman, 2010), pero a su vez facilita la liberación de GABA

(Di et al., 2005). Se ha observado que la liberación de GABA es bloqueada si se inhibe de manera

selectiva CB1, no obstante, los agonistas de endocanabinoides no aumentan la actividad (Di et

al., 2005). Es así como NPV, por medio del receptor CB1, facilita una rápida realimentación

33

negativa por medio de la inhibición del eje HPA durante la exposición a estrés (Evanson et al.,

2010).

Ahora bien, para los propósitos de esta investigación, es interesante tener en cuenta las

respuestas de un organismo cuando se ve expuesto a una situación de estrés severa, puesto que

esta condición lleva consigo una serie de respuestas que no son adaptativas para el sistema. Este

tipo de situaciones se caracteriza por la desregulación en el eje HPA y provocan un aumento en la

velocidad de la realimentación negativa desde los GC (Belda et al., 2008; Perrine et al., 2016).

Todo esto es debido a una disminución en los niveles basales de GC, una baja respuesta

adrenocortical (Kanter et al., 2001), una modesta supresión de ACTH, el cual no es suprimido de

manera correcta por causa de la falta de GC en los linfocitos (Kanter et al., 2001; Belda et al.,

2008) y un aumento de la concentración de GR, específicamente en el hipocampo (Belda et al.,

2008). Esto mismo trae como consecuencia una hiperresponsividad de ACTH a la inducción de

estresores no severos, como la exposición a ambientes novedosos (Belda et al., 2008; Yehuda,

Lowy, Southwick, Shaffer, & Giller, Jr., 1991).

A continuación, se van a explicar los efectos del estrés sobre el hipocampo y la microglía.

Aproximaciones a los efectos del estrés sobre el hipocampo

Se han estudiado los efectos del estrés sobre las actividades del hipocampo (Feldman &

Weidenfeld, 1999; Kim, Song, & Kosten, 2006) y se ha identificado que este mismo provoca

cambios adaptativos y no adaptativos en el sistema dependiendo de la intensidad del estímulo, su

anticipación y la percepción sobre su controlabilidad (McEwen, 2000; Lucassen et al., 2014).

Existe evidencia de que el hipocampo es una estructura dependiente de la actividad de los GC y

es indispensable para la regulación de la realimentación negativa (Joels, Sarabdjitsingh, & Karst,

2012). Las acciones del estrés sobre el hipocampo son muy fuertes, a tal punto que promueven

cambios morfológicos en las neuronas del área CA3, en GD y en CA1 (no muy fuertemente)

(Joels, 2008; Alfarez et al., 2009). En estado de desarrollo también se ha observado la reducción

de la complejidad dendrítica en las neuronas piramidales de CA1 y una disminución en las

conexiones con CA3 (Alfarez et al., 2009). Otros ejemplos sobre dichos efectos se han observado

por medio de algunos modelos animales que se encargan de estudiar acciones las acciones del

estrés sobre la plasticidad sináptica (LTP/LTD), con la cual depende el aprendizaje y la memoria

34

(Kim & Yoon, 1998; Ryan, Vollmayr, Klyubin, Gass, & Rowan, 2010; Tse, Bagot, Hutter,

Wong, & Wong, 2011); la neurogénesis en GD (Bain, Dwyer, & Rusak, 2004); la consolidación

de memorias emocionalmente significativas (McEwen & Gianaros, 2010; Okuda, Roozendaal, &

McGaugh, 2004); los procesos cognitivos; los procesos afectivos (Sapolsky, 1985) y otros

cambios morfológicos y funcionales en la región (Fuchs & Flugge, 1998).

En efecto, el estrés afecta las funciones básicas que comprometen la actividad del

hipocampo no obstante, esta estructura también ejecuta una acción importante en el proceso de

realimentación negativa de GC, que es mediado a través de su gran concentración de MR y GR

(Kim & Yoon, 1998; Feldman & Weidenfeld, 1999; Sapolsky, Krey, & McEwen, 1984). Existen

resultados que soportan la hipótesis de que el hipocampo juega un rol importante en la inhibición

del eje HPA (Sapolsky et al., 1984) y se ha puesto en evidencia a través del daño en esta

estructura. Daños en el hipocampo producen el aumento de la expresión del ARNm que codifica

ACTH en la pituitaria; del ARNm que codifica AVP en la subdivisión medial del NPV; del

ARNm que codifica CRF en NPV; además de un aumento de la concentración de GC (Herman et

al., 1989). También pueden resultar en una hipersecresión de GC, epecialmente en cerebros de

mayor edad (Lucassen et al., 2014; Sapolsky et al., 1984; Sapolsky, 1985). Todo esto se debe a

una disminución en los receptores GR y MR en las neuronas piramidales del hipocampo; no

obstante, estos efectos son reversibles (Sapolsky et al., 1984). También se ha investigado que el

impedimento de la secreción de GC durante el estrés está relacionado con la pérdida de neuronas

hipocampales. Estudios demuestran que la muerte de células granulares del hipocampo después

de una adrenalectomía corroboran la desaparición de receptores GR en la capa granular del

hipocampo junto con la posterior muerte de células granulares (Hu et al., 1997). Sapolsky y

colegas (1984), demostraron que la ablación completa del hipocampo provoca efectos similares al

síndrome de hipersecreción de corticosteroides, pues al ser asociados con la disminución de

receptores GR y MR, se aumenta la concentración de GC en la zona y se disminuye el chance de

realizar una realimentación negativa efectiva. Así mismo, mostraron que el impedimento de la

terminación de la respuesta del eje HPA prolonga la percepción del estresor en el tiempo.

Finalmente, los autores comentan sobre un aumento en la concentración de CRF después de las

lesiones del hipocampo, que también desinhiben la supresión de la realimentación negativa.

35

Los GR y MR en NPV son regulados por la liberación de GC y sin la acción inhibitoria

del hipocampo sobre esta estructura, el eje HPA no funcionaría correctamente (Feldman &

Weidenfeld, 1999). Aunque es necesario tener presente que los efectos inhibitorios del eje HPA

no sólo dependen de la actividad del hipocampo, sino también de la glándula pituitaria, el

hipotálamo, la corteza prefrontal y las proyecciones indirectas desde la amígdala (Sapolsky et al.,

1984). Como ya se ha dicho, daños en la función inhibitoria del hipocampo y la disminución de

su actividad pueden resultar en una hipersecreción del eje HPA (Herman et al., 1989; Kim &

Yoon, 1998) y evidencia suficiente corrobora esta observación (Feldman & Weidenfeld, 1999;

Herman et al., 1989).

En cuanto a los mecanismos de los GC que han sido examinados durante situaciones

estresantes, también se identifica que los cambios de su concentración en el hipocampo pueden

provocar la muerte de las neuronas de la región, pero la adrenalectomía atenúa estos daños

(Sapolsky, 1985). Al mismo tiempo, lesiones con neurotoxinas son exacerbadas por medio del

aumento de la concentración de GC, los cuales reducen el número de neuronas hipocampales

(Sapolsky, 1985). Se ha documentado que los GC son importantes en los cambios metabólicos de

las células y su incremento está asociado con un efecto catabólico en el tejido al que se adhiere

(May, Bailey, Mitch, Masud, & England, 1996). Por consiguiente, participarían en la degradación

de las células hipocampales, las cuales van a tender a oxidarse y a degradar sus proteínas y

aminoácidos más velozmente (Sapolsky, 1985; May et al., 1996; McEwen & Sapolsky, 1995).

Ahora bien, se sabe que el estrés facilita la formación de memorias cuando el estresor se

encuentra directamente relacionado con el contexto de aprendizaje, no obstante la consolidación

de otras memorias (de valencia emocional neutra) se ve impedida (Wiegert, Joels, & Krugers,

2006; Payne et al., 2007). El aumento de la concentración de GC incrementa la potenciación

sináptica en el área CA1 cuando los niveles altos de la hormona coinciden con la frecuencia de

estimulación (Wiegert et al., 2006). En otros estudios se ha observado que un estímulo estresor

después de una habituación a un ambiente disminuye la tendencia de recuperar memorias no

relacionadas con el estresor, que ya han sido consolidadas con anterioridad (Okuda et al., 2004).

Por otro lado, si el estímulo estresor se encuentra presente durante la presentación de un ambiente

novedoso, la consolidación en ese ambiente se va a ver aumentada, pero una reconsolidación a

nuevos estímulos no (Okuda et al., 2004). Las diferencias que compelen la consolidación y

36

reconsolidación de la memoria de los animales no habituados también depende de la actividad de

BLA, mediada por sus receptores adrenérgicos (Okuda et al., 2004).

El estrés afecta todos los procesos que convienen a la consolidación, recuperación,

reconsolidación y extinción de las memorias en un ambiente dado (Schwabe et al., 2012). De

hecho, la fuerza de la consolidación de este tipo de memorias no solo es trabajo del hipocampo,

sino también de BLA, la cual influencia la consolidación de las memorias a largo plazo después

de estímulos estresantes o emocionalmente significativos (McGaugh, 2000; Roozendaal et al.,

2002). Un aumento en la consolidación de las memorias estresantes se ve mediada por esta

estructura cuando es inducida por hormonas del estrés, glucosa y neurotransmisores como NE

(Lee, Graham, & Gold, 1988; Roozendaal et al., 2002; McGaugh, 2000). Varios estudios han

indicado que la relación entre los efectos del estrés sobre la consolidación de las memorias toma

rumbos diferentes sobre dicha consolidación. Por un lado, las memorias dependientes de la

liberación de NE, se observan mediante sus efectos sobre BLA (Roozendaal et al., 2002) la cual

recibe inputs de NE para incrementar la señalización de endocanabinoides desde receptor CB1 y

finalmente fomentar la consolidación de la memoria (Roozendaal et al., 2009; Roozendaal,

McEwen, & Chattarji, 2009). En específico, la activación de los receptores α y β-adrenérgicos de

BLA estan directamente relacionados con la consolidación de las memorias en el hipocampo

(Roozendaal & McGaugh, 1996; McGaugh & Roozendaal, 2002; Roozendaal et al., 2002). Así

pues, la actividad de la amígdala se enfoca en la consolidación de la memoria emocionalmente

significativa a través de sus conexiones con el hipocampo y se encarga de aparear rápidamente

estímulos neutros con eventos aversivos para que estos se reconozcan con propiedades aversivas

(Phelps, 2004).

Por esta misma línea, se ha reportado que los GC también se adhieren a los receptores GR

de la BLA y nuevamente aumentan la consolidación de las memorias de valencia emocional

(Roozendaal et al., 2009). Por ejemplo, si en la estructura son administradas infusiones de

antagonistas de CRF, su función se inhibe antes de la exposición a estresores fuertes, lo que

conyeva a que no se pueda consolidar la memoria estresante, pero si otras memorias que se

encuentren en el ambiente a través de la actividad del hipocampo (Roozendaal et al., 2002). Otro

ejemplo se observa cuando después de un entrenamiento aversivo, las infusiones de NE en la

amígdala aumentan significativamente la consolidación de las memorias y el LTP en

37

comparación con los grupos control (McGaugh & Roozendaal, 2002; Kim et al., 2005), pero sus

lesiones inhiben dichos impedimentos (Kim et al., 2005).

Todo esto nos hace reflexionar sobre el papel de la amígdala como una de las estructuras

implicadas en los comportamientos y la consolidación de la memoria estresante gracias a sus

influencias excitatorias en el hipocampo (Eagle et al., 2013; Walker & Davis, 2002). Así pues, al

observar que estas estructuras se encuentran directamente relacionadas, sus conexiones

anatómicas permiten identificar la influencia de la una sobre la otra (Canning & Leung, 1997;

Henke, 1990; Pelletier & Pare, 2004), en otras palabras, la amígdala envía proyecciones directas

(desde las neuronas parvocelulares y magnocelulares del BLA hacia CA1 y el súbiculo) e

indirectas (hacia la corteza entorrinal) hacia el hipocampo (Canning & Leung, 1997).

Ahora bien, como se ha expuesto en la sección anterior, la respuesta de estrés SAM tiene

como predominio la liberación de Epi y NE en el sistema y sus efectos regulan de manera

indirecta la función del hipocampo. Comenzando por el nervio vago, se ha demostrado que su

estimulación afecta los caminos noradrenérgicos de NTS y LC, los cuales aumentan la

concentración de NE la corteza y el hipocampo (Morilak et al., 2005; Habib et al., 2001). Los

efectos específicos de NE también se han constatado por medio de sus acciones sobre la

neurogénesis, en las que se ha demostrado, por medio de la activación de los receptores β3-

adrenérgicos de la ZSG del GD, que aumentan la posibilidad de sobrevivencia de las nuevas

neuronas, pero su inhibición impide por completo los efectos de NE sobre esa región (Jhaveri et

al., 2010).

Paralelamente, la liberación de Epi también participa en las influencias sobre la

consolidación de la memoria, tanto de estímulos emocionalmente significativos como de

estímulos neutros, gracias al funcionamiento de los receptores β-adrenérgicos de las estructuras

que estimula y su posterior acción sobre el hipocampo (Dornelles et al., 2007). Como ya se sabe,

los receptores β-adrenérgicos NTS se proyectan hacia la amígdala, la cual dirige sus proyecciones

hacia LC (Nordby, Torras-Garcia, Portell-Cortes, & Costa-Miserachs, 2006; Dornelles et al.,

2007). La administración de Epi poco tiempo después del entrenamiento aumenta aún más la

consolidación durante eventos emocionalmente significativos (Dornelles et al., 2007; Nordby et

al., 2006). Nordby y colegas (2006) argumentaron que es común observar que consolidación de

38

las memorias es mayor en situaciones en las que el cuerpo requiere una gran demanda de energía

para sobrevivir. Este es el caso de la liberación de Epi permite que se mantenga el rendimiento

por más tiempo y se acelere el proceso de adquisición de las memorias emocionales por más

tiempo.

Por otro lado, el papel de la glucosa en el hipocampo también es importante y esta ha sido

evaluada por medio del aumento de la consolidación después de un condicionamiento apetitivo y

un condicionamiento aversivo (Lee et al., 1988; Bueno, de Paiva, Correa, Tiba, & Fornari, 2017;

Dickinson, 2012). Como ya se ha dicho, Epi no puede cruzar la barrera hematoencefálica, pero

sus efectos sobre la memoria dependen de los mecanismos periféricos de respuesta a su

incremento en el plasma (McGaugh, 2000). En este caso, inyecciones de glucosa después de un

entrenamiento aversivo aumentan de manera significativa la consolidación de la memoria (Lee et

al., 1988) y estas repuestas son consistentes con otros resultados que indican que el aumento de la

concentración de Epi en la sangre aumenta los niveles de glucosa y la posterior consolidación de

la memoria (Lee et al., 1988; McGaugh, 2000; Wiegert et al., 2006).

A continuación, se van a abordar los efectos directos del estrés sobre el hipocampo. En

primer lugar, el estrés influencia las funciones neuronales (Keralapurath, Clark, Hammond, &

Wagner, 2014) que conceden la posibilidad de aumentar o disminuir los procesos de aprendizaje,

memoria y mediar la regulación emocional y la posterior adaptación comportamental en un

contexto dado (McEwen & Sapolsky, 1995; de Kloet, Oitzl, & Joels, 1999). Precisamente, la

regulación comportamental depende de la función de GC sobre MR y GRy se ha observado que

su activación es indispensable para la consolidación de las memorias (de Kloet et al., 1999; Oitzl

& de Kloet, 1992). En ratas, el bloqueo selectivo de MR y GR puede interferir con el aprendizaje

espacial. Particularmente el bloqueo de MR altera las estrategias de escape en el laberinto

acuático de Morris, mientras que el bloqueo de GR interrumpe la consolidación de información

espacialy la adrenalectomía provoca los mismos efectos (Oitzl & de Kloet, 1992). En cuanto al

aprendizaje emocional (Zhou et al., 2010) han detallado que, durante situaciones estresantes, GR

se bloquea durante y después de la adquisición de la tarea de estrés, lo que conlleva

impedimentos en la memoria contextual, pero después de unas horas, el rendimiento aumenta.

Dicho aumento del rendimiento, según los autores, es debido a que la liberación de GC,

predominante para la activación de MR, aumenta la formación de memoria espacial y emocional.

39

Por otra parte, examinaron que el bloqueo de MR no tiene efectos inmediatos en la memoria

contextual, pero si disminuye el rendimiento en una tarea de estrés. Esto permite sugerir que las

respuestas de adaptación ante situaciones estresantes se ejercen por medio de GR y MR que

facilitan la formación de memorias emocionales de corto y largo plazo.

Partiendo de lo anterior, no se puede dejar de lado la noción que el estrés afecta esta

estructura en cuanto a todas funciones. Si se examinan los efectos del estrés sobre LTP, es

interesante analizar como un único estímulo de estrés agudo puede provocar cambios en el LTP

que son diferenciados en HD (disminución de LTP) y en HV (aumento de LTP), incluso 2

semanas después de la exposición. En condiciones normales, el LTP de HV es de menor

magnitud que HD, pero se observa un incremento significativo de este después de la exposición a

un estímulo estresante (Maggio & Segal, 2007; Keralapurath et al., 2014). Con esto, desde otras

perspectivas, los efectos comportamentales del estrés, como por ejemplo la consolidación de las

memorias emocionales se hace más claro, en tanto que los circuitos límbicos dependientes de HV

son fortificados, pero los de HD que se encargan de la consolidación de memorias que no son

emocionales, como la navegación espacial se ven disminuidos (Pothuizen et al., 2004;

Keralapurath et al., 2014). Cabe resaltar que específicamente en HV, el aumento del LTP es

mediado por medio de la activación de MR, pero la supresión del LTP es mediada por la

activación de GR (Maggio & Segal, 2007). Desde HV se envían eferencias hacia NPV para

inhibir la respuesta de estrés (Maggio & Segal, 2007). Todo esto compromete cambios en el

rendimiento cognitivo y los comportamientos relacionados con el estrés (McEwen & Sapolsky,

1995; Maggio & Segal, 2007; Keralapurath et al., 2014).

Nuevamente, durante el estrés, GR y MR van a impedir y facilitar LTP en el hipocampo

de manera respectiva. Específicamente la activación de MR facilita el LTP y la de GR lo inhibe

(Korz & Frey, 2003; Maggio & Segal, 2007). Estudios antecedentes han exhibido que una prueba

de nado bloquea GR y mantiene el proceso del LTP, pero la inactivación de MR obstaculiza este

último (Korz & Frey, 2003). Todo esto permite sugerir el papel que juegan estos receptores sobre

la modulación de LTP durante la respuesta de estrés y la regulación de los comportamientos

ocasionados a partir de estas reacciones. En cambio, si el estímulo estresor es muy fuerte, la

plasticidad en el hipocampo se tornará más difícil, sin importar el receptor por lo tanto, se alterará

el aprendizaje (Ryan et al., 2010).

40

Diferentes tipos de estrés agudo pueden alterar los procesos LTP por algunos minutos e

incluso varias semanas y de manera más específica sus efectos se observarán en las corrientes

sinápticas sobre los canales de calcio dependientes de voltaje (VDCC) y los receptores NMDA

(Ryan et al., 2010). En todo caso el estrés, desde moderado hasta incontrolable, causa una

modulación en la plasticidad sináptica del hipocampo, la cual es relacionada con la inducción de

comportamientos de depresión o ansiedad (Joels, 2008; Lucassen et al., 2014) o la falta de

rendimiento durante tareas cognitivas (Cho et al., 2011; Korz & Frey, 2003; McEwen &

Sapolsky, 1995).

En cuanto a los efectos sobre la regulación de los receptores glutamatérgicos NMDA, se

ha observado que la liberación de GC inhibe su actividad en el hipocampo (Hardingham, 2009;

Ryan et al., 2010; Feldman & Weidenfeld, 1999). Estas acciones inhibitorias de los GC afectan

las corrientes de NMDA y protegen las neuronas que están expuestas al incremento de su

concentración durante el estrés (Liu et al., 2007). Por otro lado, la concentración de GC puede

modular de manera aguda la inhibición de NMDA por medio de sus efectos sobre el aumento de

la concentración de Ca2+ intracelular (Liu et al., 2007).

Otros estudios que corroboran esta observación sugieren que la potenciación de NMDA

se ve inhibida después de la administración de GC en el área CA1 (Krugers et al., 2005). Se debe

aclarar que la potenciación por medio de NMDA es diferente a la que se efectúa en VDCC, pues

la inducción de GC efectivamente aumenta la potenciación de VDCC, más no precisamente de

NMDA (Krugers et al., 2005). La activación de los receptores MR y GR cooperan con la

modulación de los niveles de Ca2+ intracelular, al aumentar sus corrientes de entrada, pero en

estos casos NMDA se ve inhibida, pues el aumento de la concentración de glucocorticoides vía

GR aumenta fuertemente la inducción de Ca2+ intracelular y suprime su función (Krugers et al.,

2005). Grandes concentraciones de Ca2+, atribuye a una mayor inhibición de las corrientes de

NMDA inducidas por inhibidores de PKA (Liu et al., 2007).

Por otro lado, también se ha reportado que la actividad de NMDA después de la

exposición un estímulo estresor incrementa su función sináptica por medio de la actividad de sus

subunidades, GluN2A y GluN2B, incluso una hora después de la exposición inicial (Tse et al.,

2011). Se ha observado que los antagonistas de dichas subunidades inhiben de manera selectiva

el proceso de LTP o LTD respectivamente, haciendo de estos factores importantes para

41

determinar la polaridad y plasticidad sináptica (Liu et al., 2004). Adicionalmente, los efectos de

PKA en la actividad funcional de NMDA incluso depende de estas subunidades (Krugers et al.,

2005).

Es preciso entender que los efectos del estrés agudo y el estrés crónico divergen en las

diferentes estructuras hipocampales y se han evidenciado diferencias significativas en el

desarrollo y actividad de las neuronas en las áreas de GD y CA3. Observaciones sobre los

cambios en la proliferación y la sobrevivencia de las neuronas en ratas experimentales que fueron

sometidas a una sola sesión de estrés agudo y a sesiones repetidas de estrés crónico por tres

semanas, permiten argumentar que muchos factores que regulan la neurogénesis en el hipocampo

participan en la inducción de plasticidad estructural (Pham, Nacher, Hof, & McEwen, 2003),

como la remodelación dendrítica de las neuronas piramidales de CA3, que con el exceso de

glucocorticoides o bajo el efecto de los mecanismos excitatorios de NMDA promueve cambios

(Kole, Czeh, & Fuchs, 2004; Pham et al., 2003). Otros estudios han indicado que los efectos del

estrés agudo sobre la neurogénesis de GD evidencian una disminución de la sobrevivencia y

proliferación de las nuevas neuronas (Schoenfeld & Gould, 2012).

Ahora bien, es importante recalcar la importancia de la sensación de controlabilidad que

se tiene sobre la situación estresante. (Kavushansky, Vouimba, Cohen, & Richter-Levin, 2006),

demostraron en humanos que los efectos del estrés incontrolable efectuaron una supresión en la

plasticidad CA1 y disminuyeron LTP, pero aumentaron la plasticidad en GD. Además,

observaron que los niveles de corticoides en el plasma eran mayores que el grupo control. En

estos casos, el aumento de la reactividad de la amígdala media los efectos de LTP en el

hipocampo. Es posible que bajo estas condiciones la memoria dependa más de GD que de CA1.

Pero el estrés crónico, provoca efectos diferentes, este se caracteriza por liberar una

cantidad sustanciosa de GC en el cerebro y vía la estimulación de GR, inhibe la actividad de las

células (Lau et al., 2016). Dichos efectos generan, a largo plazo, déficits cognitivos y problemas

en la memoria (Magarinos, Verdugo, & McEwen, 1997). En CA3, después de la exposición a

estrés crónico, se observa que la resistencia de la membrana disminuye, se incrementa la

amplitud del estado de hiperpolarización, se disminuye el tamaño de las espinas dendríticas, se

aumenta la amplitud de la hiperpolarización, se aumenta la respuesta a la liberación de GC

dependiente la actividad a través de MR y GR, se interrumpe el proceso de LTP y se aumenta la

42

actividad del eje HPA (Kole et al., 2004), no obstante la excitabilidad somática se mantiene y no

se observan cambios sustanciales en las propiedades de la membrana, incluyendo el patrón de

despolarización, los voltajes de los picos y los voltajes del estado de base en las neuronas del

hipocampo (Kole et al., 2004).

Por otro lado, para los propósitos de esta investigación es importante tener claros los

efectos del estrés muy fuerte y prolongado sobre el hipocampo, debido a que a través de

estímulos estresores muy fuertes, promoverían la disminución del volumen del hipocampo

(Bonne et al., 2008). Estos efectos se pueden vincular con las consecuencias derivadas del

trastorno de estrés postraumático (PTSD). De ahí, (Zhe et al., 2008), observaron que la

disminución de la realimentación negativa que se encuentra aumentada en pacientes con PTSD y

una pérdida en el volumen del hipocampo, se deben a una disminución en los niveles de

glucocorticodes. Con esto, argumentaron que una sola exposición prolongada a un estímulo

estresante induce una disminución de la concentración de MR en el hipocampo (particularmente

en CA1) y un cambio de distribución de GR, los cuales se observan no solo en el núcleo, sino

también en el citoplasma. Lo anterior sugiere que la realimentación negativa ofrecida por el

hipocampo puede aumentar su velocidad en este tipo de situaciones y estos datos se relacionaron

con el aumento de los comportamientos de ansiedad y miedo. Los receptores de MR son aquellos

que controlan el eje HPA, por lo que su pérdida figuraría en una menor responsividad durante el

control de la realimentación negativa de dicho eje. También se ha observado que los receptores

GR ejercen un rol neuroprotector sobre el tejido hipocampal y su desregulación también

provocaría efectos nocivos en la estructura (Hu et al., 1997).

A diferencia de la observación anterior, otros estudios han demostrado que estímulos de

estrés muy fuerte aumentan la expresión de GR, que es regulado a través de un aumento en la

fosforilación de proteina quinasa B (PKB) (Eagle et al., 2013), una serina/taurina proteína kinasa

que se encuentra expresada en los circuitos emocionales y su fosforilación es observada durante

eventos como el estrés y en la regulación de las proteínas celulares involucradas en el

metabolismo, la sobrevivencia/apoptosis, la diferenciación y la proliferación (Fayard, Tintignac,

Baudry, & Hemmings, 2005). A lo largo del estímulo de estrés agudo, el aumento de la

concentración de estos dos contribuye al robustecimiento de comportamientos relacionados con

43

ansiedad después del estímulo estresor en el hipocampo, más no en la amígdala (Eagle et al.,

2013).

Por otro lado, también el mRNA de GR y MR en esta estructura también han sido objeto

de estudio durante el estrés (Liberzon, Lopez, Flagel, Vazquez, & Young, 1999). Existe evidencia

sobre los efectos en GR y MR después de la exposición prolongada a un estresor. Se reportó que

después de una semana de la exposición al estresor, se evidenció un aumento en el mRNA de GR,

pero una disminución del mRNA de MR. Esto permite sugerir que la estructura se torna más

sensible a responder a la realimentación negativa de los GC. Después de dos semanas, se observó

un aumento de GR específicamente en CA1 y GD y una disminución de MR en CA2 y GD

(Liberzon et al., 1999).

Finalmente, las hormonas del estrés, también actúan en conjunto con respuestas inmunes que

también responden de manera adaptativa a la interrupción en la homeostasis (Hass & Barnstable,

2016). En el siguiente capítulo se van a tratar los efectos de la respuesta inmune, específicamente

de la microglía sobre el estrés y sus efectos en el hipocampo.

Aproximaciones a los efectos del estrés sobre la microglía

En capítulos anteriores se hizo un breve comentario acerca de los mecanismos inmunes

que se encuentran involucrados en la regulación de las respuestas de estrés. Siendo cada vez

más aceptada la idea de que el estrés viene acompañado de una respuesta inmune, se ha

considerado que esta actividad también funciona como una mediadora de la regulación

homeostática en el sistema (McEwen & Wingfield, 2003). En el cerebro, el protagonismo de la

respuesta inmune en cuanto al estrés recae en la microglía y sus acciones proinflamatorias y

antiinflamatorias. No obstante, hace más de una década, estas no eran consideradas como

actores sustanciales debido a que la evidencia vinculaba a GC como los principales agentes

antiinflamatorios del sistema y resultaba ser una inconsistencia pensar que iban a permitir

efectos de inflamación (Johnson, O'Connor, Watkins, & Maier, 2004; Smoak & Cidlowski,

2004). Hoy en día, estas consideraciones han sido reevaluadas y van a ser expuestas en el

presente capítulo, cuyo tema principal aborda los efectos del estrés sobre las acciones de la

microglía.

44

Las células de la glía están comprometidas en la interacción con las neuronas y el

mantenimiento de la homeostasis neuronal por medio de la modulación de los electrolitos, los

neurotransmisores, las citosinas y los factores neurotróficos (Maletic et al., 2007). Durante el

estrés, la hiperactividad del eje HPA en conjunción con el eje SAM promueven el aumento en el

tono simpatético del sistema y posteriormente la liberación de citosinas proinflamatorias

asociadas con la pérdida de insulina y la sensibilidad de los MR y GR (Maletic et al., 2007;

Payne et al., 2007).

Se ha observado que, dependiendo de la naturaleza y la intensidad del estresor, se

aumentará o se disminuirá la acción inmune en el cuerpo. Estudios previos han resaltado que el

estrés psicológico aumenta la proliferación de citosinas proinfalamatorias e inmunoregulatorias

(Maes et al., 1998) como IL-6 (Maes et al., 1999), IL-1β (Spivak et al., 1997), TNF-α, INF-γ, e

inmunoregulatorias como IL-4 e IL-10 (Maes et al., 1998), además de las catecolaminas y

neurohormonas usualmente encontradas durante las respuestas de estrés.

La evidencia de que la regulación del eje HPA es mediada por medio de la liberación de

citocinas proinflamatorias (Besedovsky et al., 1991), se ha observado a través de las

consecuencias específicas sobre los niveles de IL-1y en menor intensidad IL-6 y TNF-α en el

cerebro, pues su estimulación induce una regulación positiva de CRF y ACTH que conllevan la

posterior liberación de glucocorticoides desde las glándulas adrenales (Besedovsky et al.,

1991; Spivak et al., 1997; Sweep, Rijnkels, & Hermus, 1991; Smoak & Cidlowski, 2004). Se

ha observado el interesante efecto indirecto del polipéptido activador de adenil-ciclasa de la

pituitaria (PACAP)-el cual se encarga de incrementar los niveles del ARNm productor de CRF

en la región parvocelular del núcleo paraventricular del hipotálamo (Kageyama & Suda, 2009)-

en la producción de IL-6 (Nezi, Mastorakos, & Mouslech, 2000).

Se parte de que GC es una neurohormona que causa un efecto de inmunosupresión en el

sistema. En efecto, estas sustancias se han considerado como los immunosupresores más

importantes del cuerpo y sus mecanismos han sido descritos por medio de sus acciones

genómicas en las que, vía GR, inhiben la síntesis de genes proinflamatorios como el factor

nuclear-κB (NF-κB) o la proteína activadora-1 (AP-1) cuyas acciones también se encuentran

presentes en la microglía (Smoak & Cidlowski, 2004; Rhen & Cidlowski, 2005). Los primeros

estudios que mostraron el interés en este tema comenzaron a presentar modestas aproximaciones

45

hacia los efectos inmunes que podrían estar implicados en el estrés, pero con bastante precaución

por causa de la inconsistencia que representaba el rol antiinflamatorio de GC ante las respuestas

proinflamatorias del estrés.

Así pues, en estudios precedentes se observa que la administración de IL-1 aumenta la

respuesta de ACTH y GC por varias semanas y provoca efectos directos en el aumento de la

secreción de AVP y CRF en NPV (Schmidt et al., 2001). Estos planteamientos demuestran su rol

en la sensibilización del eje HPA.

Otras líneas de estudio han dirigido sus investigaciones hacia la observación de los

efectos del aumento de la proliferación de ciertas citosinas proinflamatorias después de la

inducción a un estímulo de estrés agudo y la administración de LPS. En la mayoría se ha

observado que, por ejemplo un choque eléctrico inescapable aumenta la concentración de IL-1β,

la cual es exacerbada con la administración de LPS o una adrenalectomía (Nguyen et al., 1998).

Pero, nuevamente, estas observaciones fueron discutidas por causa de las ya presentes

inconsistencias con los efectos antiinflamatorios de GC.

En relación con el apartado anterior, es importante recalcar que el estrés efectivamente

promueve respuestas proinflamatorias y sin la necesidad de administrar LPS. Por ejemplo,

después de un estímulo de estrés severo, como choque eléctrico inescapable, se ha evidenciado

un incremento del mARN de IL-1β en las regiones del hipotálamo, el hipocampo, la glándula

pituitaria y el esplenio hasta por 8 horas después del estímulo; pero no aumenta

significativamente la expresión del ARNm de TNF-α e IL-6 en Cortex parietal frontal en la

glándula pituitaria y en el hígado (O'Connor et al., 2003). Por otro lado, otros estudios si han

observado el incremento de la concentración en el plasma de IL-6 la cual, incluso al lado de la

acción de los GC (Zhou, Kusnecov, Shurin, DePaoli, & Rabin, 1993). En todo caso, se ha

considerado que IL-1β es una citosina que medía las consecuencias comportamentales y

fisiológicas de los estímulos de estrés agudo. No obstante, también se debe tener en cuenta que

las moléculas clásicas que reaccionan frente al estrés, GC y NE, también regulan dicha expresión,

por medio de otros mecanismos que alteran la glía (O'Connor et al., 2003).

Ciertamente los resultados no se alejaban de esta tendencia, pero sus aportes eran valiosos

para el entendimiento del papel de la inflamación en el estrés. Observaciones como el aumento de

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la concentración de citosinas proinflamatorias (IL-1β y TNF-α o IL-6) posteriores a estímulos de

estrés incontrolable (como el choque eléctrico en la cola inescapable), el interesante aporte sobre

el aumento en el plasma de estas sustancias (Johnson et al., 2002) e incluso estudios con la

administración de antagonistas de IL-1β, que provocan un bloqueo completo en la liberación de

otras citosinas proinflamatoiras después de la exposición a un estímulo de choque eléctrico

inescapable en la cola (Johnson et al., 2004), demuestran cambios en la investigación sobre el

estrés junto al rol de las citosinas proinflamatorias, pero sin considerar la microglía como un

actor importante.

Ahora bien, los primeros estudios que tuvieron en cuenta el papel de la microglía

propendieron por observar los efectos de su bloqueo en el sistema. Antes de ser indagada con

profundidad se tenía conocimiento de que este tipo de células inducían la proliferación de

metabolitos de NO, de IL-1β y de P38 MAPK cuando era estimulada con glutamato o kainatoy

que su acción proinflamatoria era inhibida a través de la administración de la tetraciclina

antiinflamatoria, minocicina (Tikka, Fiebich, Goldsteins, Keinanen, & Koistinaho, 2001).

El papel de la microglía como la principal fuente de IL-1β también ha sido observada a

través de la modulación de NE (Blandino, Jr., Barnum, & Deak, 2006). El tratamiento con

antagonistas de receptores β-adrenergicos, como el propanolol, bloquea completamente la

liberación de IL-1β, por otro lado el bloqueo de la recaptación de NE (con dispramina)

incrementa las concentraciones de IL-1β (Blandino, Jr. et al., 2006). En efecto, se ha observado

que la producción de citosinas proinflamatorias durante el estrés es aumentada por medio de la

estimulación de los receptores β-adrenérgicos. (Johnson, Zimomra, & Stewart, 2013), observaron

las maneras en las que la microglía podía incrementar la liberación de estas citosinas después de

la estimulación de receptores β-adrenérgicos antes a una administración de LPS en el hipocampo.

Estas mismas conclusiones se han comprobado después de examinar la estimulación y la

inhibición de la microglía después de la inducción de agonistas y antagonistas de receptores β-

adrenérgicos y α1-adrenérgicos (Wang et al., 2010). Los resultados concluyeron que el

antagonismo de los receptores α1-adrenérgicos no causaron efectos significativos en la acción de

la microglía, pero los agonistas de los receptores β-adrenérgicos, incluso en ausencia de una

estimulación proinflamatoria incrementaron el ARNm de IL-1β, TNF-α e IL-6 en un cultivo de

microglía (Wang et al., 2010). La expresión de citosinas proinflamatorias durante un trauma

47

cerebral aumenta después de la administración de agonistas β-adrenérgicos, pero se atenúan por

antagonistas de estos mismos. La estimulación de la microglía por medio de los agonistas de

receptores β-adrenérgicos también aumenta la concentración de ERK y p38 MAPK (Wang et al.,

2010). Ciertamente, todo esto demuestra que los receptores β-adrenérgicos medían la función

proinflamatoria de la microglía.

Estos efectos de la microglía se ven expresados en comportamientos de ansiedad

inducidos por estrés social. Nuevamente es observado un aumento en la expresión de citosinas

proinflamatorias liberadas desde la microglía M1 en el cerebro, que es dependiente de la

actividad de las vías noradrenérgicas (Wohleb et al., 2011). Un estudio sobre estrés social

evidenció que la estimulación repetida del estresor incrementaba la concentración de microglía de

fenotipo M1 en la amígdala, la CPF y el hipocampo, además de mostrar un aumento del mARN

de IL-1β y una disminución en genes que responden a GC (Wohleb et al., 2011).

Por consiguiente, la microglía ejerce un papel activo durante las respuestas de estrés, por

ejemplo, estímulos de estrés agudo pueden provocar un aumento robusto en su fenotipo M1 tanto

en el tálamo, como en el hipotálamo, el hipocampo, la substancia nigra y la sustancia gris central,

aunque no precisamente se ha observado acompañado por marcadores de inflamación, es decir

IL-1β, IL-6 e iNOS (Sugama, Fujita, Hashimoto, & Conti, 2007). De manera adicional, es

importante tener en cuenta que durante dicha respuesta no se deben ignorar las otras funciones de

la microglía, pues más allá de la liberación de citosinas proinflamatorias, también se ejecuta su

acción de fagocitar otras células afectadas por la excitotoxicidad producida por el estrés (Sugama

et al., 2007). Entre las funciones de la microglía, el fenotipo proinflamatorio también se encarga

de fagocitar las células que han muerto y esto mismo se observa por medio del marcador CD68

(Croisier, Moran, Dexter, Pearce, & Graeber, 2005). La microglía que expresa la presencia de

este marcador regularmente se encuentra alrededor de neuronas necróticas o que han pasado por

un curso de enfermedad (Croisier et al., 2005) ejerciendo efectos de limpieza sobre el tejido

celular.

Por otro lado, el hipocampo es una estructura vulnerable, no solo ante los efectos del

estrés, sino también ante la actividad de la microglía, pues es en esta región donde se encuentra

en grandes concentraciones (Lawson, Perry, Dri, & Gordon, 1990). En el hipocampo, la

microglía se distribuye principalmente en las áreas CA1 y CA3 (Dalmau et al., 1998) y se ha

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reportado una fuerte proliferación en las neuronas granulares del giro dentado, Stratum

Pyramidale (SP), Stratum Lucidum (SL) and Stratum Radiatum (SR) (Vukovic et al., 2012; Lana

et al., 2016). Siendo considerada la microglía como un substrato de las respuestas de estrés, no

cabe duda de que las funciones hipocampales se van a ver afectadas de manera significativa. Por

ejemplo, hay estudios que tratan los efectos del estrés en la expresión de la microglía y

demuestran que un solo choque incontrolable promueve en las regiones CA3 y GD, más no muy

fuertemente en CA1, la activación microglial (MHC II, CD11b, Iba-1y GFAP) y la disminución

de sus marcadores regulatorios (CD200) (Frank, Baratta, Sprunger, Watkins, & Maier, 2007).

Las acciones del LPS sobre la activación de la microglía en el hipocampo cuando es

inyectado en el área CA1, demuestran aumentos en la expresión de IL-1 y TNF-α, incluso 6 horas

después de la inducción (Tanaka et al., 2006). Ciertamente la proliferación de la microglía M1 es

observada a la par con el incremento de especies reactivas a oxígeno, pero también se observa el

aumento del gen de oxigenasa-1 (HO-1), un marcador del estrés oxidativo (Block, Zecca, &

Hong, 2007). Es importante tener en cuenta que HO-1 no se encarga precisamente de efectuar

acciones proinflamatorias, sino que juega un rol en los efectos de neuroprotección durante

actividades que promueven daños oxidativos y exitotóxicos (Satoh et al., 2003).

El estrés, a largo plazo, provoca la activación prolongada de la microglía M1 y puede

resultar en una desregulación de la transmisión glutamatérgica en el hipocampo, promoviendo

problemas de memoria y aprendizaje (Tanaka et al., 2006). De manera interesante, la morfología

dinámica y la motilidad de estas células también son reguladas a través de la actividad excitatoria

glutamatérgica e inhibitoria GABAérgica (Fontainhas et al., 2011). De hecho, la microglía

expresa receptores de glutamato (GluR) con los cuales se puede aumentar su actividad

proinflamatoria y neurotóxica (Murugan, Ling, & Kaur, 2013). Por ejemplo, se ha observado que

después de una inducción de isquemia en el área CA1 del hipocampo, la expresión de GluR desde

las células microgliales reactivas (M1) incrementa en las áreas afectadas por el daño isquémico

(Gottlieb & Matute, 1997).

Otros estudios han evaluado los efectos proinflamatorios de la microglía en el proceso de

neurogénesis. Así pues, estudios que evalúan los efectos del estrés agudo sobre calitrícidos

adultos, evidencian una disminución en la proliferación de neuronas subgranulares de GD y

cambios en la morfología de células inmunes agrupadas alrededor de la estructura (Gould et al.,

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1998). Conforme a este tipo de estudios, se ha evidenciado que la microglía ejerce un rol

importante en la neurogénesis del hipocampo adulto (Sierra et al., 2010).

En cuanto al LTP, se debe tener presente que los procesos de comunicación entre las

neuronas del hipocampo y la microglía han destacado el rol del receptor (CX3CR1) y su respetivo

ligando (CX3CL1), también conocidos por fractalkina (Meireles et al., 2016). Se ha reportado que

la señalización por medio del eje CX3CR1-CX3CL1 resulta ser neuroprotectora y tiene efectos

moduladores positivos en la neurogénesis y el LTP del hipocampo (Vukovic et al., 2012).

(Vukovic et al., 2012) observaron que el aumento de CX3CL1 es el responsable de mediar la

activación de los precursores de células (NCP) de la microglía en ratones después de 14 días de

ejercicio, especialmente en el giro dentado. La deficiencia de CX3CR1 impide la función de la

microglía, provocando la liberación de citosinas proinflamatorias. Otros estudios han reportado

que la deficiencia de este receptor impide la neurogénesis y el LTP en el hipocampo adulto,

cuando se elevan los niveles de citosinas proinflamatorias como IL-1β (Kierdorf & Prinz, 2013).

Retomando la idea anterior, este eje se encarga de mediar los cambios morfológicos de la

microglía y en presencia de estrés crónico y se ha observado que reduce la plasticidad en el

hipocampo (Milior et al., 2016). Su deficiencia previene que la microglía pueda ejercer una

respuesta morfológica ante el estrés, pues no permite su mantenimiento en estado de reposo

después de que dicho estrés ha terminado (Milior et al., 2016). En efecto, la exposición a

estímulos de estrés disminuye las arborizaciones microgliales y mantienen la morfología

ameboidea por más tiempo (Milior et al., 2016). A largo plazo se han observado problemas

cognitivos que son dependientes de las acciones neurotóxicas de la microglía cuando no se tiene

regulada la actividad de este receptor (Milior et al., 2016).

En cuanto al estrés crónico, también se ha distinguido que este provoca el aumento

dramático de la proliferación de microglía M1, que trae como consecuencia la pérdida de

conexiones sinápticas, el retraimiento de los axones, la sobreexpresión de citosinas

proinflamatorias IL-1 y TNF-α, la sobreexpresión de especies reactivas a oxígeno y la pérdida de

neuronas piramidales (Espinosa-Oliva et al., 2011). Ciertamente, cuando la inflamación es

crónica se inhibe la neurogénesis en el hipocampo (Monje, Toda, & Palmer, 2003). Ya se ha

mencionado que grandes concentraciones de microglía se encuentran ubicadas alrededor de las

zonas subgranular y granular de GD, en la proximidad de la zona de nacimiento de las neuronas

50

nuevas (Ekdahl, Claasen, Bonde, Kokaia, & Lindvall, 2003). Si a esta estructura se le administra

una dosis de LPS, muy posiblemente aumentará la proliferación de microglía de fenotipo M1,

seguida de la disminución de hasta un 85% de la neurogenesis (Ekdahl et al., 2003). No hay que

ignorar que estos efectos también son evidentes en otros cambios de la sinaptogénesis en

neuroblastos (Ekdahl et al., 2003; Chugh, Nilsson, Afjei, Bakochi, & Ekdahl, 2013). Impactos de

estos procesos, se pueden observar sobre la sinapsis GABAérgica e incrementos en las espinas

dendríticas de las nuevas neuronas, cuyos cambios pueden afectar de manera significativa la

transmisión sináptica en GD (Chugh et al., 2013).

Es cierto que la inflamación crónica previene el desarrollo los mecanismos en los que se

desencadena la neurogénesis y fomenta el progreso de deficiencias cognitivas, emocionales y de

memoria (Chesnokova et al., 2016). Asociado con la neuroinflamación crónica, una serie de

desórdenes cognitivos y problemas en la memoria y el aprendizaje, también son producto de

problemas inmediatos en la plasticidad, los cuales han sido relacionados con el gen Arc (proteína

regulada y asociada con la actividad del citoesqueleto) (Rosi et al., 2009; Belarbi, Arellano,

Ferguson, Jopson, & Rosi, 2012). Su actividad es asociada con la exploración espacial y los

procesos de plasticidad necesarios para la consolidación y el mantenimiento de la memoria

dependientes del contexto (Vazdarjanova, McNaughton, Barnes, Worley, & Guzowski, 2002). La

integración funcional de las nuevas neuronas de GD durante los procesos de inflamación, suelen

provocar cambios en la plasticidad y el procesamiento contextual y espacial, especialmente en

CA1, CA3 y GD (Rosi et al., 2009; Belarbi et al., 2012).

En párrafos anteriores se expuesto que la proliferación de microglía es producto de la

liberación de glutamato en el espacio sináptico al estimular NMDA. El estrés agudo que induce la

actividad de NMDA provoca un aumento del influjo de Ca2+ en las neuronas y un posterior

aumento en la exitotoxicidad, además de la disfunción en la mitocondria (Hardingham, 2009).

Como el NMDA funciona bajo una curva de toxicidad, muy poca actividad o mucha actividad

puede promover la muerte neuronal (Hardingham, 2009). Se sugeriría que este efecto induce la

posterior sobreactividad de la microglía. Otros estudios demuestran que la neuroinflamación

crónica afecta la expresión de la plasticidad en CA3 y GD, a través de un incremento

pronunciado de la actividad de la microglía, no obstante la memantina, un agonista NMDA,

51

reduce la neuroinflamación y retorna la expresión de Arc y sus posteriores actividades sobre la

cognición y la memoria (Rosi et al., 2009).

Al mismo tiempo, esta actividad inmune se asocia con la desregulación de varios aspectos

del eje HPA después de estímulos de estrés muy fuertes, como por ejemplo los causantes del

PTSD (Gill, Vythilingam, & Page, 2008). Investigaciones en humanos con dicho trastorno

también han demostrado que el aumento de la sensibilidad de los GC en los tejidos inmunes

(Rohleder, Joksimovic, Wolf, & Kirschbaum, 2004) revelan bajos niveles de IL-4, los cuales son

asociados con comportamientos de ansiedad excesiva; con una mayor circulación de IL-1β (von

et al., 2007); un aumento en la concentración de IL-6; de TNF-α y una disminución significativa

de la concentración de GC (von et al., 2007; Gill et al., 2008). Partiendo de esto, la

realimentación negativa es más veloz, por lo tanto, la supresión del eje HPA es reemplazada por

el incremento de la sensibilidad de las citosinas proinflamatorias (Rohleder et al., 2004). La

afinidad de los GC se encuentra distribuida alrededor de todo el cuerpo, no obstante, su supresión

conlleva un mecanismo de sobre reactividad en el sistema inmune (Rohleder et al., 2004). En

efecto el PTSD en el hipocampo aumenta la exacerbación de células microgliales M1 y provocan

degeneración celular y reducción en la neurogénesis de GD (Acosta et al., 2013).

De manera consistente con estas observaciones, los estímulos de estrés agudo en ratas

adrenalectomizadas y no adrenalectomizadas demuestran que hay incrementos en la liberación de

IL-1β y otras citosinas proinflamatorias, cuando el GC no se encuentra presente o se libera en

pocas intensidades (Nguyen et al., 2000; Rohleder et al., 2004). La posterior administración de

GC atenúa este efecto de manera significativa (Nguyen et al., 2000).

Hoy en día son cada vez son más estudiados los procesos de inflamación de la microglía

M1 durante situaciones estresantes, en las cuales también se observa el aumento de GC. (Nair &

Bonneau, 2006) hicieron parte de las primeras investigaciones que pretendían determinar la

interacción entre la microglía y los GC después de un protocolo de restricción de movimientos en

ratones, por 15 horas al día, durante 6 días y sin la posibilidad de recibir comida o beber agua. De

este protocolo se registró un aumento en la proliferación de microglía M1, GCy la función de los

receptores de NMDA. Entre los días 1 y 4, los niveles de microglía aumentaron de manera

dramática en el hipocampo, pero después del cuarto día el pico comenzó a disminuir. Los

resultados evidenciaron que efectivamente, durante una situación estresante los GC si

52

estimulaban la proliferación de microglía in vivo, es más también se ha registrado que la

actividad de GC sobre la microglía es directa, sin la necesidad de ningún intermediario, debido a

que posee GR y MR en su membrana (Tanaka et al., 2006; Barrientos et al., 2015; Sierra,

Gottfried-Blackmore, Milner, McEwen, & Bulloch, 2008; Tanaka et al., 1997). A partir de este

punto, los cuestionamientos que giraban en torno a las inconsistencias entre las actividades

antiinflamatorias de GC y la presencia de microglía M1 durante situaciones estresantes se pueden

responder si se tienen en cuenta los efectos de estos receptores en esta célula.

Así pues, se ha evidenciado que GR y MR se encuentran presentes en la microglía, más

no en el núcleo, sino en la membrana y el citosol (Sierra et al., 2008; Tanaka et al., 1997). Las

funciones específicas de GR en la microglía han sido estudiadas en ratones que carecen de GR en

los macrófagos. Con una dosis de LPS, se activa el receptor de tipo toll 4 (TLR4) que promueve

lesiones en las células y daños en los axones. La inhibición global de GR demuestra que,

específicamente en la microglía, se previene la degeneración neuronal por todo el cerebro y otras

células (Carrillo-de Sauvage et al., 2013). In vivo e in vitro GR tiene funciones en cuanto a la

diferenciación microglial, su proliferación y su motilidad. Se ha observado que después de

lesiones isquémicas, los MR y GR que se encuentran en la microglía inician su actividad

inmunoreactiva en el área afectada, aumentando la muerte neuronal incluso 7 días después de la

lesión. Precisamente en el experimento de (Carrillo-de Sauvage et al., 2013), los resultados

indicaron que la degeneración neuronal en las ratas después de una inyección de LPS es dañina

para las neuronas después de un estímulo estresante, pero GR disminuyó los efectos provocados

por la inducción de LPS y controló la proliferación de radicales de oxígeno, es decir que se

encargó de detener la acción de la microglía M1. Por el contrario, se ha sugerido que MR ejecuta

efectos proinflamatorios cuando la microglía se encuentra en estado de activación M1 (Tanaka et

al., 1997).

De manera más específica, MR se encarga de promover la acción inmune de la microglía

M1, en respuesta a daños en el cerebro. Por ejemplo, (Frieler et al., 2011) revisaron la activación

de la microglía, vía MR durante situaciones de accidente cerebrovascular y comprobaron que este

receptor permite el incremento del daño vascular y la isquemia. Partiendo de esta observación,

sugirieron que MR funciona como un regulador de la polarización de los macrófagos, pero en

algunas ocasiones también promueve la actividad de la microglía M2. Los autores, identificaron

53

que la eliminación de MR disminuía de manera significativa el volumen de daño del accidente

cerebrovascular. Partiendo de lo anterior, se puede apreciar que los GC están implicados en la

regulación de la función de MR y su liberación durante situaciones potencialmente peligrosas

incrementa el daño de la zona afectada (Frieler et al., 2011). En efecto la señalización de GC

representa un equilibrio entre la actividad inmune y la actividad neuroendocrina, en tanto que

posibilita el control de los efectos proinflamatorios y antiinflamatorios de la microglía (Sorrells,

Caso, Munhoz, & Sapolsky, 2009).

Como se ha observado a lo largo de este capítulo, la actividad de la microglía afecta de

manera significativa todas las funciones del hipocampo. En situaciones de estrés, tanto agudo

como crónico, el fenotipo proinflamatorio de la microglía puede afectar de manera significativa

la sobrevivencia de las células hipocampales. En el siguiente capítulo, se va a abordar el tema de

las futuras aproximaciones desde las cuales se puede llegar a inhibir la microglía M1 por medio

de la administración del fármaco Rosiglitazona.

Aportes a la inhibición de la microglía de fenotipo M1.

Una de las moléculas que se encuentran expresadas durante el estado activado de la

microglía proinflamatoria es CD40 (Sun et al., 2016; Sun et al., 2008; Fernandez et al., 2013). El

CD40 es un miembro de la superfamilia de los factores de necrosis tumoral, cuya expresión se

ubica en las células presentadoras de antígeno, las células dendríticas, los monocitos y otras

células no inmunes como las epiteliales, las endoteliales, las mesenquimales y en las plaquetas y

tumores (Kawabe, Matsushima, Hashimoto, Imaizumi, & Hasegawa, 2011). Estas moléculas

actúan como un transductor de las señales de la membrana celular, puesto que, una vez activadas

permiten la estimulación de quinasas y factores de transcripción encargados de iniciar las

actividades humorales e inmunes de las células (Kawabe et al., 2011). En el SNC, la interacción

entre este compuesto y su respectivo ligando (CD40-CD40L) ejerce un papel importante en las

respuestas de inflamación, pues dirige a la microglía hacia el aumento de la secreción de TNF-α,

IL-6, IL-1β. Posteriormente, esto provocaría un aumento de las heridas celulares (Sun et al.,

2008; Fernandez et al., 2013).

En contraposición, los efectos antiinflamatorios y neuroprotectores de la microglía son

mediados a través del aumento de la expresión de la enzima arginasa-1 (arg-1), considerada como

54

un sello de respuesta a la IL-4 (Pourcet & Pineda-Torra, 2013). Recientemente se ha definido que

la arg-1 es expresada mediante la actividad de otro compuesto: el receptor proliferador-activado

de peroxisoma gamma (PPAR-γ), que también se considera como un regulador de la polarización

de la microglía M2 (Song et al., 2016).

El PPAR-γ es un factor de transcripción nuclear activado por ligando, asociado con un

tipo de receptores nucleares en las células (Wang et al., 2014). Entre sus funciones principales, se

ha observado la regulación de la transcripción de genes proinflamatorios y lípidos microgliales

(GlaxoSmithKline, 2007), o en la utilización y transporte de glucosa por medio de la facilitación

de los genes que responden a la insulina y el metabolismo de los ácidos grasos

(GlaxoSmithKline, 2007). Últimamente se ha observado que su actividad inhibe la producción de

citosinas proinflamatorias en de la micoglía M1 (Wang et al., 2015). Es por eso, que se ha

afirmado que ejerce efectos neuroprotectores sobre el SNC (Luo, He, Kuang, Jiang, & Yang,

2014). No obstante también se encuentran presentes en los tejidos adiposos, los músculos

esqueléticos, el hígado y otros macrófagos.

Retomando a la arg-1, esta es una enzima producto del mismo substrato con que se

sintetizan los iNOS1, esta es la L-arginina. Las dos sustancias (arg-1 e iNOS), son los marcadores

más representativos de los fenotipos M2 y M1 respectivamente (Cherry et al., 2014). La

regulación de la liberación y transcripción de la arg-1 no se podría realizar si no fuese por la

activación del PPAR-γ (Gallardo-Soler et al., 2008) en el núcleo de la célula, o por la actividad

que ejerce la IL-4, puesto que activan el gen de unión (3kb) que le permite comenzar con la

transcripción y proliferación de la enzima (Pourcet & Pineda-Torra, 2013). Se ha observado que

la una (IL-4) activa a la otra (PPAR-γ) en el contexto de la inflamación. En estudios previos, se

ha reportado que la actividad de la IL-4 sobre la arg-1 potencia los efectos antiinflamatorios que

se observan durante el aumento de la expresión de arg-1 después de la administración de un

agonista de PPAR-γ (Gallardo-Soler et al., 2008).

Recientemente se ha observado que la administración de agonistas de PPAR-γ ejercen un

efecto antiinflamatoro y neuroprotector en modelos animales de Parkinson, daño cerebral

1 Es interesante destacar que arg-1 es un poderoso inhibidor de iNOs (Cherry et al., 2014).

55

isquémico e inflamación relacionada con la edad (Pisanu et al., 2014; Song et al., 2016), así como

efectos antiarerogénicos en modelos murinos de arteroesclerosis (Gallardo-Soler et al., 2008).

Uno de los fármacos que funciona como agonista selectivo de PPAR-γ es la Rosiglitazona

Maleate, un fármaco miembro de la familia de las tiazolidinelionas, que se caracterizan por ser

agentes antidiabéticos para el tratamiento de la diabetes tipo II (Park, Kim, Kang, Kim, & Shin,

2004; GlaxoSmithKline, 2007). En un estudio sobre los efectos neuroprotectores de la

Rosiglitazona en la enfermedad de epilepsia, se observó que el incremento de la exitotoxicidad

durante los episodios epilépticos intensificaba la muerte neuronal en el giro dentado y las

regiones CA1 y CA3 pero la Rosiglitazona atenuaba dicho efecto (Sun et al., 2008).

Al mismo tiempo, los efectos más importantes de la Rosiglitazona se observan en la

inhibición significativa de CD40 en el área CA1 del hipocampo y la inhibición de la expresión de

TNFα, 24h después de la inducción de epilepsia con inyecciones de hidrocloruro de policarpina

administradas intraperitonialmente (Sun et al., 2008). Lo anterior permite que la Rosiglitazona

sea considerada como un potente neuroprotector, pues demostró una disminución significativa de

la muerte neuronal después de los ataques epilépticos (Sun et al., 2008). Se considera a este

fármaco (al igual que otros agonistas de PPARγ) como un protector efectivo de las enfermedades

del SNC (Luo et al., 2014). No obstante, aún no se tienen bien definidos sus efectos después de la

neuroinflamación inducida por estrés agudo.

Ahora bien, se ha relacionado la activación de GR con la actividad de PPAR-γ, en tanto

que este receptor ejecuta una activación parcial sobre el primero, pero no al contrario

(Yamamoto, Kakuta, & Sugimoto, 2014). Tanto la Pioglitazona como la Rosiglitazona efectúan

una acción antiinflamatoria al inducir una traslocación nuclear de GR hacia el núcleo de otras

células, es más se han observado actividades antiinflamatorias desde los agonistas de PPAR-γ al

reversar las acciones de los antagonistas de GR (RU486) (Ialenti et al., 2005). Partiendo de esta

observación, se puede evidenciar sus posibles efectos sobre la regulación del eje HPA, que

también depende de la correcta actividad de GR.

Siguiendo esta misma línea, otros efectos de la Rosiglitazona han sido revisados para

tartar la diabetes y se cree que sus mecanismos de acción también pueden afectar la actividad del

eje HPA. Torres, Magalhaes, Martinsy Carvalho (2016) observaron que en ratas diabéticas el

tratamiento con este fármaco inhibe la hipertrofia adrenal debido a la enfermedad. También

56

definieron que la Rosiglitazona bloquea los efectos de la diabetes al aumentar la presencia de los

receptores de ACTH, los receptores de melanocortina-2 (MC2R) en la corteza adrenal (Roy et al.,

2012), disminuir la expresión de los péptidos derivados de la pro-opiomelanocortina (POMC) en

la pituitaria, que se relacionan con la ingesta de comida y la utilización de la energía por todo el

sistema y homeostasis de la energía (Mountjoy, 2010; Mountjoy, 2015) y todo esto asociado con

el aumento de la concentración de PI3K, un regulador del crecimiento y supervivencia celular

(Pinzón, Serrano, & Sanabria, 2017). Pero el tratamiento no tuvo efectos significativos sobre la

disminución de GR y MR. Sus resultados indican que la activación de PPAR-γ con Rosiglitazona

normaliza el eje HPA de las ratas diabéticas, al regular la producción de ACTH y GC en la

glándula pituitaria y las adrenales, no obstante, no se observó que las ratas pudieran realizar una

realimentación negativa correctamente.

Las anteriores observaciones fueron evaluadas de manera más específica por Luo, He,

Quang, Jiang y Yang de la universidad de Chongquing, en China (Luo et al., 2014). Estos

investigadores observaron que la Rosiglitazona juega un papel protector en el daño hipocampal

después de un daño de isquemia cerebral, puesto que inhiben la respuesta de estrés oxidativo y la

inflamación. En su experimento, administraron diferentes volúmenes de Rosiglitazona y

observaron que 7.2mg/kg de Rosiglitazona significaban una dosis efectiva para la inhibición de la

microglía proinflamatoria después de la inducción de isquemia.

Con la información procedente de los estudios anteriores, el observar los efectos de este

fármaco como un antiinflamatorio que actúa de manera específica sobre la actividad de la

microglía activada M1, sería interesante para proceder a futuros estudios que caractericen sus

acciones neuroprotectoras durante o después de las respuestas de estrés. Se creería que por medio

de su efecto agonista sobre los receptores PPAR-γ, podría cambiar la polarización de la microglía

desde el fenotipo citotóxico y proinflamatorio M1, hacia el fenotipo antiinflamatorio y

neuroprotector M2 (Pisanu et al., 2014; Song et al., 2016). Por el lado de la regulación del eje

HPA, se ha observado que los agonistas de PPAR-γ ejercen una activación parcial de los

receptores GR y se encargan de aumentar la presencia de ACTH y la actividad de MC2R (Roy et

al., 2012; Yamamoto et al., 2014). Lo anterior permite sugerir que la administración sistémica de

Rosiglitazona ejecutará una respuesta moduladora de la realimentación negativa del eje HPA y

57

durante la inducción robusta del estrés, todos estos mecanismos que se ven desregulados van a

ser atenuados.

Se sabe que esta estructura es fuertemente afectada por los efectos proinflamatorios de la

microglía M1 (Lana et al., 2016) durante el estrés agudo y puede afectar la funciones cognitivas e

impedir la neurogénesis (Ekdahl et al., 2003; Monje et al., 2003). Es por eso que para identificar

los efectos neuroprotectores de esta sustancia, va a ser importante observar su acción en durante

la consolidación de memorias afectivas y espaciales. En estudios previos se ha evidenciado que la

consolidación de las memorias espaciales y de objetos novedosos se ve impedida después de

lesiones en el GD y en CA3, mas no en CA1, la cual se ve más involucrada en la retención de las

memorias de tipo temporal (Kesner et al., 2004; Hasselmo, 2005b). La evaluación de estas áreas

en el laberinto acuático de Morris puede facilitar la evaluación de los efectos de la Rosiglitazona,

después del protocolo de estrés agudo. En cuanto a las memorias episódicas de corte emocional,

se esperaría que después de la administración intraperitonial de Rosiglitazona no afecte

significativamente la consolidación de memorias emocionales.

Se ha reportado que una sola exposición a estímulos de estrés agudo puede provocar

cambios a nivel cognitivo, comportamental, además de alteraciones en la respuesta del eje HPA

que duran por un plazo de tiempo más largo, por lo menos 28 días (Sutanto & de Kloet, 1994), no

obstante otros estudios consideran que después de la inducción a estrés agudo, una recuperación

de 7 días puede ser suficiente para que el animal vuelva a su estado basal (Yohe, Suzuki, &

Lucas, 2012). Se esperaría que, en experimentos futuros, se revisen los efectos que podría generar

el fármaco en animales experimentales que han recibido estrés, con el fin de observar si es

posible proteger los patrones de consolidación de la memoria espacial.

Introducción a las cepas Carioca High Freezing y Carioca Low Freezing

El estudio de la bioquímica de las reacciones comportamentales hace necesario que se

exploren y evalúen las diferencias entre las condiciones que definen las características innatas y

adquiridas de los sistemas vivientes (Lerner, 1978). Se ha observado que las discrepancias adaptativas de

los seres vivos ante condiciones estresantes pueden dirigir al sistema hacia arreglos funcionales que lo

protegen del estrés, o por el contrario, que facilitan el desarrollo de patologías o comportamientos

derivados del estímulo (Macri, Zoratto, & Laviola, 2011; McEwen, 2000; Lucassen et al., 2014). Lo

58

anterior es posible gracias un dialogo constante entre la intensidad del estímulo y su grado de

controlabilidad (Lucassen et al., 2014), los cuales vía elementos epigenéticos (Ebner & Singewald, 2017)

y gracias a diferencias innatas en la expresión de las moléculas relacionadas con el funcionamiento del

eje HPA, desencadenan procesos adaptativos o no adaptativos después de la percepción del cambio

medioambiental (Scharf & Schmidt, 2012; Ebner & Singewald, 2017; Kabbaj, Devine, Savage, & Akil,

2000).

Algunas aproximaciones que evalúan el desarrollo del comportamiento de las especies

desde perspectivas evolucionistas, han demostrado que la activación neuronal en diferentes

contextos es similar en humanos y otros mamíferos (de Castro Gómes et al., 2011). Entre los

comportamientos, está el estrés (ver capítulo de introducción al estrés), una característica

compartida a través de las especies que se destaca por ser una reacción de supervivencia que

genera conductas potencialmente adaptativas ante situaciones peligrosas (McEwen, 2007). La

expresión de los genes reactivos al estrés dependen, por un lado de los niveles de plasticidad neuronaly

por el otro, de los tipos de estímulos y de la favorabilidad del contexto (Belsky & Pluess, 2009).

Adicionalmente, los factores genéticos dependientes de los cambios producidos por esta condición

pueden ser heredados (Sullivan, Neale, & Kendler, 2000), aumentando la probabilidad de que se

produzca una predisposición a cambios en el sistema en generaciones futuras (Sullivan et al., 2000).

Aproximaciones acerca del estudio de las conductas ansiosas y otras patologías del

comportamiento, suelen usar como base el modelo de diátesis estrés (Belsky & Pluess, 2009),

conocido como la vulnerabilidad genética de algunos individuos a verse mayormente afectados por un

estresor ambiental (Belsky & Pluess, 2009). Por medio de esta teoría y otros conocimientos sobre la

bioquímica vinculada con las diferencias individuales en las reacciones comportamentales del estrés y la

ansiedad (Sweis, Veverka, Dhillon, Urban, & Lucas, 2013), se han elaborado diseños experimentales,

desde los cuales se ha podido responder a la necesidad de entender ciertas condiciones vividas en las

poblaciones humanas (Bovenkerk & Kaldewaij, 2015; Ramos, 2008).

Entre las herramientas de análisis para estos propósitos, los modelos animales con roedores han

realizado aproximaciones a la explicación y el entendimiento del comportamiento normal y

patológico desde una perspectiva que antes no se había podido estudiar con detalle en humanos

(Bovenkerk & Kaldewaij, 2015). La rata, como modelo animal, ha resultado ser efectivo para el

estudio del estrés (Ramos, 2008), pues ha aportado información valiosa sobre sus características

59

comportamentales y fisiológicas en diferentes contextos experimentales (ver Introducción al

estrés). Así mismo, sirven como punto de partida para explorar otros mecanismos del estrés, los

cuales aún no han sido suficientemente estudiados, podrían ser gatillos para conducir a los

sistemas a una mala regulación y posteriormente al desarrollo de enfermedades (Rosch, 1979).

Un modelo animal que ha pretendido realizar un acercamiento a estos temas, se ha desarrollado

en el departamento de psicología la Pontificia Universidad Católica de Rio de Janeiro (PUC), en

Brasil. Dos linajes de ratas que difieren en características asociadas a los comportamientos de

miedo y de ansiedad, Carioca Hight Freezing (CHF) y Carioca Low Freezing (CLF), fueron

desarrolladas desde el 2006 a través de la separación de ciertos rasgos fenotípicos en las ratas

Wistar, hasta tener comportamientos de miedo definidos. Las cepas, fueron desarrolladas con

base a la selección de distintivos emocionales descritos en la literatura y la evaluación del

congelamiento condicionado. El congelamiento2 determinó la separación de los individuos

durante el proceso de fenotipaje. Las ratas que contenían mayor cantidad y menor cantidad de

congelamiento fueron cruzadas por varias generaciones hasta desarrollar los fenotipos de miedo y

de ansiedad (de Castro Gómes et al., 2011).

Se ha afirmado que las cepas Carioca High Freezing y Carioca Low Freezing representan

un modelo novedoso para el estudio de ciertas afecciones vinculadas con la ansiedad, el pánico,

el miedo, etc. Debido a que sus características comportamentales, en estado natural, se mantienen

con comportamientos relacionados con la presencia o ausencia de congelamiento, un predictor

de ansiedad (de Castro Gómes et al., 2011; de Oliveira Galvão, de Castro Gómes, Masionette, &

Landeira-Fernandez, 2011). En estudios que se han realizado a través de sus generaciones, se

observa de manera consistente que el tiempo de congelamiento en las pruebas de miedo

condicionado es más prolongado para CHF que para CLF, cuya actividad locomotora se

encuentra presente con mayor intensidad que CHF antes y después de los protocolos

experimentales (de Castro Gómes et al., 2011). Estos comportamientos se han relacionado con la

capacidad de desarrollar, o bien conductas de pánico y respuestas de miedo exageradas y

2 Definido como un comportamiento defensivo en respuesta a un peligro caracterizado por la ausencia de

movimiento del animal con excepción de la respiración (Fanselow, 1984).

60

espontaneas, o bien ningún tipo de respuesta después de la inducción de los estímulos estresantes

(de Oliveira Galvão et al., 2011).

Se considera que a través del estudio de las cepas, se podrían entender las razones por las cuales

los sistemas biológicos reaccionan de maneras diferentes ante estímulos aversivos. De la literatura, se ha

destacado la necesidad por explorar su etología a través de pruebas comportamentales (Dias,

Bevilaqua, Silveira, Landeira-Fernandez, & Gardino, 2009). No obstante, los resultados aún

dejan cuestiones abiertas sobre su desarrollo, incluso en estado natural.

Así pues, se resaltan algunos detalles en que las diferencian las cepas de las ratas Wistar

comunes. Por ejemplo, se ha observado que la interacción social con animales desconocidos es

significativamente menor en CHF que en un grupo control. O también que los comportamientos

relacionados con la depresión no difieren en las características de la patología entre CHF y el

grupo control. En cuanto a la cognición espacial durante el reconocimiento de objetos, tampoco

han evidenciado diferencias significativas durante la exploración, a pesar de que CHF si mantiene

una menor exploración que la contraparte de control durante la fase de familiarización (Dias et

al., 2009). De ahí, se concluiría que la etología del modelo animal sólo cuenta con diferencias

significativas en variables emocionales, más no cognitivas. Sin embargo, la información

recolectada no se ha adentrado en el estudio de CLF o de todas las cepas después de protocolos

relacionados al estrés.

Es interesante resaltar que en otros estudios se han aclarado algunas diferencias

funcionales en el cerebro de estas ratas que refuerzan las observaciones preliminares del

comportamiento relacionado con el miedo y la defensa. Se destaca una diferencia de función y

conectividad en SGP (de Oliveira Galvão et al., 2011), los núcleos de la amígdala como Cea y BLA

(de, V & Landeira-Fernandez, 2008b) y los niveles de algunas especies reactivas a oxígeno y la

corticosteriona plasmática (Hassan, Gomes, Pinton, Batista Teixeira da, & Landeira-Fernandez, 2013).

Nuevas aproximaciones hacia las raíces del comportamiento de las cepas han resultado

interesantes para la presente investigación, puesto que, al aprovechar las ventajas

comportamentales, se podrían evaluar nuevos efectos sobre las interacciones entre la genética y el

ambiente cuando hay un estímulo de estrés de por medio. Teniendo en cuenta que la inflamación

juega un papel importante en estos procesos, se pretende evaluar la relación del estrés y la

61

expresión de la microglía activada, dado el estado de vulnerabilidad de los animales

experimentales, sobre la consolidación de la memoria espacial y emocional en las ratas CHF y

CLF.

Ahora bien, en el presente experimento se espera ver diferencias en cuanto a las

características comportamentales y neuroquímicas relacionadas con el estrés y la consolidación

de las memorias emocionales y espaciales, pues se conoce que este representa un impedimento para

la consolidación dichas memorias, en comparación con aquellas que si son emocionales (Bodnoff et al.,

1995). Además de esto, también se espera realizar acercamientos a las características

neurofisiológicas referentes a la expresión de microglía activada, pues en el hipocampo estresado

provoca efectos en detrimento de la consolidación de las memorias neutras y el LTP (ver capítulo

de microglía y estrés). Aunque en las cepas no ha sido suficientemente estudiado, el presente

estudio pretende agregar más información a su caracterización, explorando las respuestas

comportamentales y su relación con los niveles de inflamación en el hipocampo de los animales

estresados y no estresados.

Del presente estudio, se tiene presente que la información es limitada en cuanto a la

alteración o deterioro del aprendizaje después de la inducción de estrés tanto en CHF como en

CLF. También se tiene en cuenta que no se han establecido relaciones específicas de acuerdo con

los niveles de inflamación observados en cada cepa. Lo anterior, podría ser una limitación para la

explicación de su biología y sus comportamientos, hasta que no se hagan más estudios

relacionados al tema en cuestión. Es por eso que se tiene la intención de aclarar algunos vacíos de

conocimiento relacionados con las cepas por medio de la realización de un estudio con propósitos

exploratorios.

Se postula una hipótesis que va a guiar los objetivos del presente estudio. Esta es, la

inducción de estrés agudo estimula los efectos proinflamatorios y citotóxicos de la microglía M1

en el hipocampo de la cepa vulnerable (CHF) y actúa en detrimento de la consolidación de la

memoria espacial, en contraposición con el robustecimiento de la emocional, gracias a la muerte

neuronal por excitotoxicidad en las regiones GD, CA3 y CA1. Lo anterior también se va a ver

expresado en el aumento de los comportamientos ansiosos y la disminución de la locomoción.

62

Para evaluar estas condiciones se realizará un protocolo de estrés agudo en la mitad de los

sujetos experimentales de cada grupo CHF, CLF y control (CON) en una caja de

condicionamiento aversivo. Posteriormente, todos los animales serán pasados por diferentes

protocolos de aprendizaje para medir la consolidación de la memoria emocional. La memoria

espacial, va a ser evaluada en un protocolo de reconocimiento de objetos. Y los niveles de

ansiedad y de locomoción en un test de campo abierto. Finalmente, los animales serán

perfundidos y su tejido cerebral se va a analizar para contabilizar el número de microglía activada

por cada 0.1mm en varias regiones del hipocampo (y el cuerpo estriado). Todos los estudios

fueron avalados por el organismo ético de la universidad Pontifica Universidad Católica de Rio

de Janeiro (PUC) en Brasil.

De los resultados, se esperan observar diferencias entre todos los grupos en los

protocolos. En primer lugar, de manera consistente a la literatura (de Castro Gómes et al., 2011),

se espera un aumento significativo en el congelamiento de las ratas CHF, pero no en las CLF

después del condicionamiento aversivo. Luego, durante la evaluación de la consolidación la

memoria a largo plazo, se espera que CHF y el grupo control (CON) evoquen el recuerdo, pero

CLF no.

En el campo abierto, se espera observar que el aumento del congelamiento después del

condicionamiento aversivo disminuirá tanto los niveles de exploración como de locomoción a

través de los cuadrantes en CHF en comparación con los grupos CLF y CON estresados. Esto

mismo podría compararse con los resultados del congelamiento y la exploración en las CHF no

estresadas las cuales, al no haber sido expuestas a una situación de estrés significativo, no van a

exponer el miedo condicionado.

En comparación a CHF, se cree que CLF va a contar con un nivel de exploración intenso

en el campo abiertoy que este resultado no se va a diferenciar de manera significativa en

comparación con su contraparte no estresada. De CLF se puede destacar que no responde de

manera consistente al miedo condicionado como los animales de los otros grupos, pues

disminuye su tiempo de congelamiento cuando es reexpuesto al contexto después del

condicionamiento (de Castro Gómes et al., 2011; de Oliveira Galvão et al., 2011). Es por esa

razón que se sugieren dos posibles explicaciones que se van a tener en cuenta durante la

63

realización del experimento, la primera, sugiere que CLF puede tener problemas para consolidar

las memorias aversivas, por lo que se espera observar inflamación en estructuras hipocampales

ventrales, sin embargo, debido al comportamiento de locomoción incrementado que se observa

durante el condicionamiento aversivo y otras pruebas, cuyos resultados también afirman el

aumento de la locomoción en protocolos de catatonía en modelos de Parkinson (estudio en

proceso), también se podría considerar que el comportamiento de la cepa se relacione con

problemas alteraciones en los circuitos relacionados con la automatización de los movimientos

(Cromwell & Berridge, 1996).

Posteriormente, en la prueba de memoria declarativa, no se espera que los grupos

estresados generen una buena evocación del recuerdo de los objetos, aun habiéndolos explorado

durante la fase de familiarización. Este detalle se debería a los efectos que tiene el estrés en

detrimento de la consolidación de las memorias neutras (diríjase al capítulo de efectos del estrés

sobre el hipocampo). Sin embargo, no se considera que el déficit de aprendizaje en CLF se derivé

directamente del estrés, sino más bien, de otros elementos cognitivos que pueden estar jugando

un papel importante en sus procesos de consolidación. Esto se podría concluir debido a que el

déficit de aprendizaje que tiene CLF, por ejemplo, a la hora de evocar recuerdo aversivo durante

el condicionamiento podría extrapolarse a otros contextos de diferentes naturalezas. Es por eso

que tampoco se espera identificar diferencias con las ratas de su mismo grupo que no han sido

estresadas, cuyo déficit de aprendizaje, puede ser el mismo.

Es también de interés observar los efectos que puede ejercer la microglía, principal célula

nerviosa encargada de las respuestas inmunes y el establecimiento de la homeostasis durante

cambios en el microambiente (Hanisch & Kettenmann, 2007) después del estrés en la región

hipocampal. Finalmente, se esperan observar cambios en la concentración de la microglía

activada por región, dependiendo de la naturaleza comportamental de cada cepa.

En este caso, se espera identificar distintas concentraciones de microglía dependiendo, por

un lado de la cepa (CHF, CLF y CON) y por el otro, del tratamiento (Estrés vs. No estrés). Se

aclara que la principal estructura para analizar en el experimento es el hipocampo, por lo que se

esperó hacer el conteo de microglía activada en porciones hipocampales, anteriores, mediales en

los animales de los grupos experimentales.

64

Se esperan observar las siguientes características: primero, que los hipocampos de los

animales estresados tengan una mayor cantidad de células activadas por área que en los animales

no estresados. En los estresados, se cree que las porciones dorsales del hipocampo posterior se

van a ver más inflamadas que las ventrales. Todo esto se deduciría, debido a que el aumento de la

exitotoxicidad sobre el hipocampo, el aumento de la excitabilidad de la amígdala basolateral

sobre consolidación de memorias de valencia neutra y la activación de la respuesta inmune en

CA3, CA1 y GD impedirían directamente la consolidación de las memorias de valencia neutra

correctamente.

en segundo lugar, en los animales estresados, se cree que en CHF se va a observar una

mayor cantidad de microglía activada en las estructuras dependientes de la consolidación de los

recuerdos espaciales, en comparación con CLF. En este caso, se espera observar microglía

activada en el giro dentado, CA3y en el hipocampo dorsal posterior. En cuanto a CLF, aunque se

cree que sus niveles de inflamación son menores que CHF, se considera que dados los problemas

de aprendizaje demostrados en las pruebas emocionales y dependiendo del aprendizaje en la

prueba de reconocimiento de objetos, tenga microglía activada por todo el hipocampo, pero en

menor concentración. Es interesante explorar sus niveles de inflamación, puesto que la cepa, aún

no ha sido completamente caracterizada como para llegar a especulaciones sobre su cognición y

aprendizaje emocional y espacial. Por último, no se esperan diferencias en cuanto a los niveles de

inflamación de los hipocampos de los grupos no estresados.

A continuación, se va a exponer el método y los resultados obtenidos la presente

investigación.

Método

Animales

Se utilizaron 60 ratas macho adultas, de edades entre 2 y 3 meses y pesos oscilando entre

250 y 350 gramos, del bioterio del laboratorio de Neurociencia de la Pontificia Universidad

Católica de Rio de Janeiro, Brasil. Los animales experimentales fueron divididos en 3 grupos,

que a su vez fueron subdivididos en otros dos (ver figura 1). Cada grupo fue sometido a los

mismos procedimientos experimentales para evaluar la consolidación de la memoria emocional y

65

espacial, sin embargo de cada grupo, una mitad fue sometida a un protocolo de estrés en una caja

de condicionamiento aversivo (de Oliveira Galvão et al., 2011). El número de animales

seleccionado por grupo corresponde al n óptimo requerido para el cumplimiento de los objetivos

(Leon et al., 2013; Hassan et al., 2013). Los sujetos serán alojados bajo condiciones controladas

de temperatura (22±2°C) y humedad (57%), mantenidas en un ciclo de luz de 12:12 h, con inicio

de luz a las 5:00am.

Figura 1. División de grupos experimentales

Procedimiento

El trabajo constó de varias fases experimentales que se enfocaron en evaluaciones

comportamentales y procedimientos de análisis histológicos en el hipocampo. Las fases

exploraron el efecto del estrés agudo en una tarea de consolidación de la memoria emocional, la

memoria espacial y finalmente se realizaron análisis en el tejido que permitieron explorar sus

efectos sobre las células hipocampales (explicados más abajo). En cada uno de los experimentos,

los animales fueron divididos en dos grupos de los cuales uno fue expuesto a un protocolo de

estrés en una caja de condicionamiento aversivo (de Oliveira Galvão et al., 2011). 24 horas

después, fueron puestos en las tareas de memoria. Finalizado el último día de tarea, se revisó de

nuevo el tiempo de congelamiento en el contexto aversivo, para luego ser perfundidos. Las

perfusiones fueron realizadas o inmediatamente después de la exposición al contexto aversivo o

24 horas después de este mismo, pues se pretendía hacer comparaciones que tuviesen.

66

Antes de los registros, las ratas fueron manipuladas por 5 minutos después de realizar la

toma de peso todos los días para que se acostumbraran a las manos del experimentador. Al

mismo tiempo, se procuró que los animales se aclimataran a la sala experimental, por lo que

fueron sacados del bioterio y colocados en las salas durante 1 hora antes de los registros. Todos

los procedimientos fueron avalados por el comité de ética de la universidad.

Inducción del estrés y evaluación de la memoria emocional

Ambos, la inducción del estrés y el condicionamiento aversivo fueron evaluados por

medio de un protocolo de miedo condicionado. Este procedimiento es generalmente utilizado

para medir los recuerdos asociados al miedo a un contexto. Dihco miedo fue medido a través de

la cantidad de tiempo de congelamiento de la rata después de la inducción de un choque eléctrico

(0.7-0.8mA) que causó estrés.

Ahora bien, el procedimiento consistió en ubicar a los animales experimentales en una

caja de 30x 25x 30 con un piso electrificable de 15 tubos de metal de 4mm de diámetro,

separados a 1,5 el uno del otro (ver figura 2). Los tubos estaban conectados a un generador de

choques eléctricos y a un computador. La caja se encontraba ubicada entre otras cajas

atenuadoras de ruido para eliminar estímulos ambientales no relacionados al contexto. Cada

animal fue colocado en las cajas, uno por uno por un tiempo de 8 minutos. Después del quinto

minuto, se indujeron 3 choques eléctricos de 1 segundo de duración, con intervalos de 20

segundos por un minuto y se midió el tiempo de congelamiento después del último choque

durante los siguientes tres minutos. Posteriormente, cada rata fue colocada en su caja de

alojamiento permanente y se limpió el espacio.

Figura 2. Ilustración de una caja de condicionamiento aversivo.

67

24 horas después, se colocó a los animales en el contexto por los 8 minutos y se midió el

tiempo de congelamiento, esta vez sin inducción de choque. Tres días después, las ratas fueron

puestas en el contexto para evaluar el reconocimiento al contexto a largo plazo.

Es importante agregar que todos los procesos fueron realizados a la misma hora del día

durante la mañana.

Campo abierto

Los resultados comportamentales fueron medidos a través de distintos métodos ajustados

para cada prueba. Para la prueba de reconocimiento de objetos, se consideró necesario realizar

una medición tanto de la ansiedad como de la motricidad durante la fase de habituación al

contexto, por lo que se ejecutó un protocolo de campo abierto. Específicamente, se evaluó la

distancia recorrida en el campo y los comportamientos de congelamiento, acicalamiento y estar

parado en las patas traseras, pues brindaron información adicional sobre los niveles de ansiedad

de cada animal durante el experimento (Seibenhener & Wooten, 2015). Para esta, se hizo uso del

programa XploRat 3.3.0, creado por el profesor Fernando Cárdenas de la Universidad de los

Andes. Este consistió en dividir el campo en 9 cuadrantes que me permitieron medir el tiempo de

permanencia total en cada cuadrante, en el centro, la periferia y contar los cruces de la rata a

través de estos (ver figura 3).

Figura 3. Esquema general de X-plo-rat (versión 2.2).

68

Test de reconocimiento de objetos

Para evaluar la memoria espacial se van a someter a los animales experimentales a un

protocolo modificado de reconocimiento de objetos. Las modificaciones consistieron en utilizar

un test de campo abierto para evaluar el reconocimiento dependiente de la porción dorsal

hipocampo (Moser et al., 1995), cuya activación está relacionada a factores de reconocimiento

espacial (Broadbent, Gaskin, Squire, & Clark, 2010; Murray & Mishkin, 1986). Este proceso se

realizó para evitar que la consolidación dependiera de las regiones parahipocampales, las cuales

son usualmente activadas durante el reconocimiento de los detalles de los objetos dentro del

contexto (Winters, Saksida, & Bussey, 2008; Meunier, Hadfield, Bachevalier, & Murray, 1996).

Por esa razón, se utilizó una caja de campo abierto, cuyas dimensiones son suficientes para

reconocer el desplazamiento de los objetos en el espacio (Winters et al., 2008) y uno de los

objetos, además de ser cambiado por otro novedoso, también fue desplazado a 90° de la posición

inicial.

Para evaluar la efectividad de la prueba, se realizó una serie de estudios piloto que

consistieron en cambiar la posición de los objetos, moverlos por diferentes cuadrantes y aumentar

el tiempo de habituación al campo, con el propósito de asegurarse de que el aprendizaje, o su

ausencia, se debiera a la inducción de estrés y no a la falta de reconocimiento del contexto.

Al finalizar la prueba piloto, el experimento consistió en evaluar la memoria espacial en

tres fases. En primera, o fase de habituación, se colocó a las ratas, una por una, en el campo

abierto para que exploraran el espacio por cinco minutos. Durante el procedimiento, se evaluaron

los comportamientos relacionados con la ansiedad y la motricidad. Inmediatamente después, se

colocó a las ratas en sus cajas de alojamiento permanente. La efectividad del procedimiento

estuvo sujeta a la variable de habituación, por lo que se repitió el procedimiento veces antes

comenzar con la familiarización a los objetos- una en el primer día de condicionamiento aversivo,

la otra en el segundo día y la tercera y la cuarta 12 y 24 horas después respectivamente-. 24 horas

después se realizó la fase de familiarización. En esta, se volvió a ubicar a cada rata en el campo

abierto, solo que esta vez en la caja se situaron dos objetos de manera paralela en dos cuadrantes

exteriores. Se dejó a las ratas explorar los objetos durante 5 minutos. Una vez terminado el

tiempo, se limpió el contexto y fueron de nuevo colocadas en las cajas de alojamiento

permanente. 24 horas después, se realizó la fase de prueba, que consistió en cambiar uno de los

69

objetos y moverlo a 90° de la posición original (ver figura 4). Durante los 5 minutos se observó el

tiempo de exploración en el objeto familiar y el objeto novedoso. Finalmente se acomodó cada

rata en las cajas de alojamiento permanente.

Figura 4. Test de reconocimiento de objetos.

Histología

Después de finalizados los procedimientos experimentales, los animales fueron anestesiados con

una dosis letal de ketamina y Xilazine (5mg/kg y 20mg/kg respectivamente) para luego ser

perfundidos transcardialmente con 250ml de solución PBS (0,1M) seguida de 250ml de

paraformaldehido (4%), de acuerdo con protocolo operativo utilizado en el Laboratorio de

Neurociencia y Aprendizaje de la Universidad de los Andes. Los cerebros fueron entonces

extraídos y almacenados en una solución de sacarosa (30%) de una a dos noches para asegurar la

crioprotección y la consistencia de los tejidos durante el proceso de congelamiento y la

realización de los cortes en el criostato (Bondonna, Jacquet, & Wolf, 1977). Posteriormente

fueron ubicados en paraformaldehído (4%) cuatro días.

Para el congelamiento, unos por uno fueron los cerebros colocados en isopentano con hielo

seco y fueron ubicados en una nevera a -80°C por una semana. Luego, fueron cortados con un

criostato a -25°C en tajadas de 16µm. Se buscaron cortes que incluyeran CA1, CA3 y giro

dentado. A cada treinta cortes se tomó uno para realizar una coloración de Nissl, necesaria para la

localización estructural. Los demás cortes fueron almacenados en tubos eppendorf en solución

anticongelante, para su almacenamiento a -20°C.

70

Para la inmunohistoquímica, los cortes fueron procesados en baños de diferentes reactivos,

seguidos de PBS 0,1M por 5 minutos para limpiar residuos. Se realizó un pretratamiento del

tejido por medio de la incubación los cortes en una solución de H2O2 al 0,01% diluido al 30% en

PBS 0,1M de 5 a 7 minutos, seguida de 3 baños de PBS 0,1M. Posteriormente, los cortes fueron

colocados en suero de bloqueo UltraCruz® Blocking Reagent (sc-516214) por una hora e

inmediatamente después, se incubaron en el anticuerpo Iba1 (sc-32725; 200µg/ml; 1:100 en

UltraCruz® Blocking Reagent (sc-516214)) por una noche a temperatura ambiente. Al día

siguiente se bañaron de nuevo en PBS 0.1M y se incubaron en el anticuerpo secundario, la

proteína de unión a IgG kappa de ratón (m-IgGκ BP) conjugada a Horseradish Peroxidasa (HRP)

(sc-516102); 200µg/0,5ml; 1:36 en UltraCruz® Blocking Reagent (sc-516214)) por 120 minutos.

Al finalizar el tiempo fueron nuevamente bañados en PBS 0,1M. 15 minutos antes de acabar la

incubación en el anticuerpo secundario, se preparó la solución ABC, avidina y horseradish

peroxidasa biotinilado (ImmunoCruz® ABC Kit (sc-516216)) en PBS, por media hora a

temperatura ambiente. Se incubaron los cortes en la solución por media hora. Luego del

procedimiento y repetitivos lavados en PBS 0,1M se inició el proceso de visualización, en el que

se incubaron los cortes en solución de X1 de DAB (DAB, 50X (CAS 7411-49-6)) y peróxido de

hidrógeno al 0,3% en 100mM de Tris-HCl (pH 7.6) por 15 minutos. Finalmente, se hicieron

nuevos lavados con PBS 0,1M, se montaron los cortes en láminas y cuando estuvieron secas

fueron deshidratadas en baños de alcoholes a diferentes concentraciones (50%, 70% y 90%) por 1

minunto. Finalmente, los cortes se bañaron dos veces por 10 segundos en xilol.

El análisis morfológico y la cuantificación de la microglía se realizaron por medio de la

utilización de microscopía óptica con objetivo de 40X. Las imágenes se digitalizaron en formato

.tif. para observaciones posteriores. Para el conteo de las células inmunopositivas con Iba1, se

utilizó el software Image J.

Para el conteo de la microglía, se usó un marco de conteo de 220 x 220 µm (Diz-Chaves,

Astiz, Bellini, Garcia-Segura, 2013) (ilustración de la morfología de la microglía se encuentra en

la figura 5).

71

Figura 5. Morfología de la microglía.

Análisis estadístico

Los datos de comportamiento, fueron analizados por medio del uso de ANOVAs de uno y

dos factores que evaluaron los resultados (condicionamiento aversivo, campo abierto y

reconocimiento de objetos) dependiendo del grupo experimental (CHF, CLF y CON) y la

condición (estrés vs no estrés). En caso de ser necesario, usando la prueba t de Student Newman-

Keuls. En todos los casos, el alfa establecido fue de 0.05. Se destaca que algunas pruebas,

específicamente aquellas relacionadas con el condicionamiento aversivo, no presentaron

normalidad (Shapiro-Wilk <0,05), por lo que se procedió a realizar análisis estadísticos no

paramétricos, pruebas de Kruskal-Wallis y de Mann-Whitney.

Para el análisis de la cantidad de células inmunopositivas para Iba-1, se realizaron

ANOVAS con medidas repetidas comparando el número de células activadas de acuerdo con la

condición de estrés (estrés vs no estrés) en los respectivos grupos en distintas áreas

hipocampales. Finalmente, se hicieron regresiones lineales simples para observar el efecto del

estrés sobre la activación de la microglía y la consolidación de las memorias espaciales y

emocionales.

Resultados

Miedo condicionado

En la figura 6 se encuentran los promedios y las desviaciones estándar del tiempo de

congelamiento en cada uno de los grupos experimentales inmediatamente después de la

inducción del choque, 24 horas y 6 días después. Esta sección del diseño experimental posee más

72

de una variable independiente a tener en cuenta para los resultados sobre el tiempo de

congelamiento en los grupos experimentales.

Se observó que las distribuciones de los datos correspondientes a las mediciones del

congelamiento tanto en los momentos post, como 24 horas y a 6 días y tanto para los grupos

naïve como para los estresados, no presentaron normalidad (Shapiro-Wilk <0,05), razón por la

cual se optó por realizar análisis estadísticos no paramétricos. Para el caso de los animales naïve,

sólo fue posible realizar la comparación de los animales control con los animales CLF, pues no se

tuvieron datos de los animales CHF.

Sujetos estresados

El análisis Kruskal-Wallis para el congelamiento en la condición pre mostró que hubo

diferencias significativas entre los grupos (H[2]=26,40; p<0,001). La comparación post-hoc (test

de Dunn) mostró que los animales del grupo CLF presentaron un tiempo de congelamiento

significativamente inferior a los animales del grupo control (P<0,05).

En la condición post se hallaron diferencias significativas entre los grupos (H[2]=19,43;

p<0,001). La comparación post-hoc mostró que los animales del grupo CLF presentaron un

tiempo de congelamiento significativamente inferior a los animales del grupo control (P<0,05).

Para la condición 24 horas, fueron halladas diferencias significativas entre los grupos

(H[2]=23,38; p<0,001). La comparación post-hoc mostró que los animales del grupo CLF

presentaron un tiempo de congelamiento significativamente inferior a los animales del grupo

control (P<0,05).

En la condición 6 días, se encontraron diferencias significativas entre los grupos

(H[2]=22,24; p<0,001). La comparación post-hoc mostró que los animales del grupo CLF

presentaron un tiempo de congelamiento significativamente inferior a los animales del grupo

control (P<0,05).

Finalmente se compararon las condiciones 24 horas y 6 días. ANOVAs con medidas

repetidas determinaron diferencias significativas en el tiempo de congelamiento a lo largo del

tiempo (F[4,25]=40.313, p<0.001). Posteriores análisis de post-hoc revelaron que solamente los

animales del grupo CLF tuvieron la tendencia de disminuir su tiempo de congelamiento (p<0.05).

73

Sujetos Nv

El análisis Mann-Whitney para el congelamiento mostró que las diferencias encontradas

entre los grupos no fueron significativas en ninguna de las condiciones (post U[18]=47,5; P=0,881;

post U[18]=49,0; P=1,0; 24h U[18]=42,0; P=0,574; 6d U[18]=49,0; P=0,935).

Figura 6. Media del tiempo de congelamiento durante el protocolo de miedo condicionado. Los asteriscos (*)

destacan los tiempos de congelamiento cuyos resultados expusieron diferencias estadísticamente significativas

(p<0.05). Solamente se destacaron los puntajes de congelamiento que mantuvieron diferencias estadísticamente

significativas con los grupos. Se aclara que la condición Post tuvo una duración de tres minutos. Las cruces, indican

diferencias entre los grupos no estresado con sus contrapartes estresadas. Una cruz (+) representa un p<0.05 y dos

(++) un p<0.001. Los triángulos representan diferencias estadísticamente significativas entre los resultados de un

mismo grupo con respecto al tratamiento.

Motricidad

Debido al interés en comparar los efectos de la exposición al estrés sobre el

comportamiento característico de cada cepa, se optó por realizar un ANOVA de dos vías, siendo

uno de los factores la condición de estrés (SI x NO) y el otro la cepa (CON x CHF x CLF). En

algunas de las mediciones obtenidas no hubo una distribución normal de los datos, pero debido a

que no existe un test no paramétrico que pueda reemplazar al ANOVA de dos vías, se optó por

realizar el ANOVA, asumiendo que era posible no encontrar significancia estadística en las

mediciones, pero que, en caso de hallarlas, correspondería a un efecto muy marcado en la

++

++++

++

++++

++

++**

++**

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

POST 24h 6 días

Po

rte

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nto

CTR Nv CAC Nv CBC Nv CTR St CAC St CBC St

74

población. En este caso, las diferencias halladas han de ser tomadas con cautela, pero debe

recordarse que, posiblemente, si se tuvieran grupos de mayor tamaño y con igual número de

sujetos, con gran probabilidad el análisis paramétrico acusaría las mismas significancias.

Motricidad en el campo abierto

Primera exposición

El ANOVA de dos vías mostró que no hubo diferencias significativas entre las medias

obtenidas entre el factor de cepa y la condición de estrés (F[2,54]=1.824; P=0.171) para la distancia

recorrida en el campo abierto. Sin embargo, para los dos factores por separado, las diferencias

halladas si alcanzaron el valor de significancia. Para el factor cepa (F[2,54]=14.721, P<0.001), se

identificaron diferencias significativas entre los grupos experimentales. La comparación post-hoc

(test de Student Newman-Keuls) mostró que el grupo CLF recorrió una distancia

significativamente mayor que los demás grupos experimentales (CHF p<0.001; CON p=0.005).

CHF se destacó por haber recorrido la menor distancia en comparación con su respectivo control

(p=0.019).

En cuanto a la condición de estrés (F[1, 54]=4.075, p<0.05), las diferencias entre los grupos

también sugirieron un efecto del tratamiento en la distancia recorrida por el campo. La

comparación post-hoc mostró que los animales pertenecientes al grupo Nv recorrieron una

distancia significativamente mayor a los del grupo estresado.

Vale la pena destacar las interacciones obtenidas entre los factores. En grupos sometidos a

estrés, el análisis de post-hoc mostró diferencias estadísticamente significativas que constataron

que los animales de CLF recorrieron distancias mayores en el campo abierto en comparación con

sus respectivos CHF (p<0.001) y sus respectivos controles (P=0.004); y que los animales de CHF

recorrieron distancias significativamente menores que sus respectivos controles (p=0.036). En el

caso de los animales Nv, no se identificaron diferencias estadísticamente significativas entre los

grupos (figura 7). Posteriores análisis para los efectos del estrés entre los grupos con sus

contrapartes estresadas mostraron que CHF Nv recorrió una distancia significativamente mayor

que su CLF (p<0.05). En los otros grupos, no hubo diferencias que permitiesen afirmar un efecto

del estrés sobre la locomoción de los animales durante su tiempo en el campo (figura 7).

75

Segunda exposición

El ANOVA de dos vías para la segunda exposición al campo abierto tampoco mostró

diferencias estadísticamente significativas para el factor de condición de estrés entre las cepas

(F[2,54]=1.047, p=0.358). Por el contrario, para el factor cepa y condición de estrés por separado,

las diferencias si alcanzaron un valor de significancia. Para el factor cepa (F[2, 54]=14.754,

P<0.001), se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos

experimentales. La comparación post-hoc (test de Student Newman-Keuls) destacó que,

nuevamente, CLF recorrió una distancia significativamente mayor que CHF (p<0.001) y su

respectivo control (p=0.042). Se agrega que CLF fue el grupo cuya distancia recorrida fue la

menor en comparación con el grupo control (p=0.002).

En cuanto a la condición de estrés, (F[1, 54]=4.435, p<0.05), se resalta que los grupos Nv

recorrieron distancias significativamente mayores por el campo que los sujetos estresados.

Las interacciones entre los resultados obtenidos destacan que, para los animales sometidos

a estrés hubo diferencias estadísticamente significativas, las cuales destacaron que los animales

de CHF recorrieron distancias menores en el campo en comparación con CLF (p<0.001) y sus

respectivos controles (p=0.039). Se rescata que el grupo CLF obtuvo la mayor distancia recorrida

en el campo en comparación con su control (p=0.042). En los animales Nv, el grupo CHF Nv

recorrió distancias menores en el campo que CLF Nv (p=0.019) y su respectivo control

(p=0.017). Finalmente, los análisis sobre las diferencias entre los grupos Nv con sus contrapartes

estresadas no mostraron diferencias estadísticamente significativas (figura 7).

Tercera exposición

El ANOVA de dos vías para la tercera exposición al campo mostró que no hubo

diferencias estadísticamente significativas para el factor de condición de estrés entre las cepas

(F[2,54]=1.905, p=0.159) durante esta sesión. Sin embargo, al igual que en las exposiciones

pasadas, para el factor cepa y condición de estrés por separado, las diferencias si alcanzaron el

factor de significancia. Así pues, para el factor cepa (F[2, 54]=18.417, P<0.001), se observaron

diferencias estadísticamente significativas que destacaron que CLF recorrió distancias mayores

en comparación con las demás cepas experimentales (CHF p<0.001; CON P=0.001). El grupo

CHF obtuvo la menor distancia recorrida en comparación con su respectivo control (p=0.014).

76

Para las comparaciones referentes al factor de condición de estrés mostraron diferencias

estadísticamente significativas (F[1, 54]=7.844, p=0.007). La comparación post-hoc rescató que las

cepas que no recibieron inducción de estrés recorrieron distancias significativamente mayores a

sus contrapartes estresadas.

Las interacciones referentes a los resultados obtenidos ofrecieron información adicional

que permitió afirmar un efecto del tratamiento sobre la distancia recorrida por el campo.

Comparaciones de post-hoc aclararon que, en los animales sometidos a estrés, CHF recorrió

distancias significativamente menores que CLF (p=0.002) y sus respectivos controles (p=0.009)

(figura 7). En los animales del grupo CHF Nv también se mostró que las distancias recorridas

fueron menores que CLF Nv (p<0.001) y el grupo control (p<0.001). De manera interesante,

comparaciones entre los grupos y sus respectivas contrapartes estresadas solamente rescató

diferencias estadísticamente significativas en el grupo control, puesto que los animales estresados

recorrieron una distancia significativamente menor que su contraparte no estresada (p=0.003)

(figura 7).

Figura 7. Motricidad por el campo abierto. Los asteriscos representan diferencias estadísticamente significativas

entre los grupos de la misma naturaleza (Estrés vs. Estrés y No Estrés vs. No estrés). Un asterisco (*) representa un

p<0.05 y dos (**) representan un p<0.001. Las cruces, indican diferencias entre los grupos no estresado con sus

contrapartes estresadas. Una cruz (+) representa un p<0.05 y dos (++) un p<0.001.

Habituación al campo

**

+

+

+ ++

**

****

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

Primera Exposición Segunda Exposición Tercera Exposición

Dis

tan

cia

reco

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a (m

s*0

.2) CON

NvCHF nV

CLF Nv

CON St

CHF St

CLF St

77

Con el fin de identificar las diferencias en cuanto a la distancia recorrida en la primera,

segunda y tercera sesión de habituación al campo, se realizaron análisis de varianza de una vía.

En primer lugar, en el grupo CHF estresado no se identificaron diferencias entre la

distancia recorrida en el campo durante las tres sesiones experimentales (F[2, 33]=0.416, p=0.633).

Para el grupo CLF estresado tampoco se identificaron diferencias en cuanto a la distancia

recorrida en ninguna de las sesiones (F[2, 36]=1.107, p=0.342). Para el grupo control, se

identificaron resultados similares (F[2, 21]=0.870, p=0.433). Por lo tanto, se concluye que los

animales experimentales pertenecientes a los grupos sometidos a estrés mantuvieron tendencias

de exploración similares durante las tres exposiciones al campo abierto.

En cuanto a los animales no estresados, tampoco se identificaron diferencias entre las

distancias recorridas en los grupos durante las tres exposiciones al campo abierto. Los grupos

también mostraron tendencias similares de exploración por el campo (CHFNv F[2, 18]=0.325,

p=0.727; CLFNv, F[2, 24]=0.270, p=0.766; CONNv, F[2, 30]=0.0264, p=0.974).

Comportamientos observados en el campo abierto

Se evaluaron los comportamientos correspondientes al congelamiento, el acicalamiento y

levantarse en las patas posteriores durante la primera exposición al protocolo del campo abierto.

Los promedios de tiempo de los comportamientos y sus respectivas frecuencias durante la sesión

experimental se encuentran ordenados de la siguiente manera: en la figura 8, los promedios del

tiempo de congelamiento y la frecuencia de ese comportamiento durante la sesión experimental;

en la figura 9, los promedios del tiempo de acicalamiento y la frecuencia de ese comportamiento

durante la sesión experimental; y en la figura 10, el promedio y las desviaciones estándar del

tiempo de estar de pie y la frecuencia de ese comportamiento durante la sesión experimental.

Debido al interés en comparar los efectos de la exposición al estrés sobre el

comportamiento característico de cada cepa, se optó por realizar un ANOVA de dos vías, siendo

uno de los factores la condición de estrés (SI x NO) y el otro la cepa (CON x CHF x CLF). En

algunas de las mediciones obtenidas, no hubo una distribución normal de los datos, pero debido a

que no existe un test no paramétrico que pueda reemplazar al ANOVA de dos vías, se optó por

realizar el ANOVA, asumiendo que era posible no encontrar significancia estadística en las

mediciones, pero que, en caso de hallarlas, correspondería a un efecto muy marcado en la

78

población. En este caso, las diferencias halladas han de ser tomadas con cautela, pero debe

recordarse que, posiblemente, si se tuvieran grupos de mayor tamaño y con igual número de

sujetos, con gran probabilidad el análisis paramétrico acusaría las mismas significancias.

Congelamiento

El ANOVA de dos vías para el tiempo de congelamiento mostró que hubo diferencias

estadísticamente significativa para los factores de condición de estrés y cepa (F[2, 54]=8.470,

p<0.001). Tanto en el factor cepa (F[2,54]=35.174, p<0.001) como condición de estrés (F[1,

54]=30.082, p<0.001) se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos

experimentales. El análisis post-hoc (test de Student Newman-Keuls) mostró los siguientes

resultados: En cuanto al factor cepa, la comparación mostró diferencias estadísticamente

significativas en todos los grupos. Para este caso, CHF mantuvo un tiempo de congelamiento

significativamente mayor que CLF (p<0.001) y el grupo control (p<0.001). CLF, por el contrario,

obtuvo un tiempo de congelamiento menor que su respectivo control (p=0.001). En segundo

lugar, para la condición de estrés, las diferencias resaltaron que los animales estresados

congelaron más que aquellos que no recibieron el estímulo de estrés (p<0.001).

Las comparaciones entre los factores exhibieron que las medias de tiempo de

congelamiento entre los grupos estresados destacaron a CHF por congelar por un tiempo

significativamente mayor que CLF (p<0.001) y su respectivo grupo control (p<0.001). Se aclara

que el grupo CLF congeló por un tiempo significativamente menor que los demás animales

experimentales (p<0.001). Con respecto a los animales Nv, nuevamente el grupo CHF obtuvo un

tiempo de congelamiento significativamente mayor que CLF (p<0.05) y su respectivo control

(p<0.05). Los efectos del tratamiento entre las cepas experimentales con sus contrapartes

estresadas mostraron que los grupos que fueron sometidos a estrés, con excepción de CLF

(p=0.888), tuvieron tiempos de congelamiento significativamente mayores (p<0.01 para CHF;

p=0.01 para CON).

Ahora bien, el análisis de la frecuencia del comportamiento, mostró que hubo diferencias

estadísticamente significativas para el factor de condición de estrés entre las cepas

experimentales (F[2,54]=4.711, p<0.05). Asimismo, las comparaciones de cada factor mostraron

grados de significancia. Se identificaron diferencias estadísticamente significativas para el factor

79

cepa (F[2, 54]= 260.547, p<0.001). La comparación post-hoc destacó que los animales de CHF

repitieron el comportamiento con mayor frecuencia que los animales de CLF (p<0.001) y el

grupo control (p<0.001). Nuevamente, se reporta que el grupo CLF congeló con menos

frecuencia que su respectivo control (p<0.001). En segundo lugar, las diferencias entre la

condición de estrés o no estrés para los animales experimentales fueron estadísticamente

significativas (F[1, 54]=26.300, p<0.001). La comparación de post-hoc mostró que los animales

estresados repitieron el comportamiento con una frecuencia significativamente mayor que los no

estresados.

Las interacciones entre los grupos mostraron que, para los animales sometidos a estrés, el

grupo CLF obtuvo una frecuencia de congelamiento significativamente menor que CHF

(p<0.001) y su respectivo control (p<0.001). En el caso de los animales Nv, se identificó que los

sujetos de CHF obtuvieron una frecuencia de congelamiento significativamente mayor que CLF

(p<0.001) y su respectivo control (p<0.01). Los efectos del tratamiento entre las cepas

experimentales mostraron un efecto de la inducción de estrés sobre la frecuencia de

congelamiento en CHF y CON con sus contrapartes Nv (p=0.003 para CHF; p<0.001 para CON),

más no en CLF (p=0.459) (figura 8).

**+

**+

**0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

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mie

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D.

80

Figura 8. Promedios del tiempo de congelamiento y frecuencia del congelamiento en los grupos experimentales.

Los asteriscos representan diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Los dos asteriscos (**) hacen

referencia a aquel que obtuvo un valor p<0.001 en comparación con los otros grupos y un asterisco (*) hace

referencia a un p<0.05. Las cruces (+) representan diferencias estadísticamente significativas entre los grupos con

sus respectivas contrapartes no estresadas (nv) A. Promedio del tiempo de congelamiento en los grupos estresados y

Nv. En este se pueden identificar diferencias significativas en todos los grupos. Entre estos se destaca a CLF por

tener el menor tiempo de congelamiento durante toda la sesión y a CHF por tener el mayor tiempo de congelamiento

B. Promedio del tiempo de congelamiento de los grupos no estresados. En este se destaca que el tiempo de

congelamiento de CHF fue el mayor. C. Frecuencia de los episodios, de congelamiento en los grupos estresados. En

este se destaca que CLF tuvo la menor frecuencia en comparación con CHF y CON, cuya frecuencia fue similar

durante el protocolo experimental. D. Frecuencia de los episodios de congelamiento en los grupos no estresados. De

estos, nuevamente se destaca que CHF tuvo una frecuencia mayor que los otros dos grupos durante el protocolo

experimental.

Acicalamiento

Un ANOVA de dos vías para el tiempo de acicalamiento mostró que no hubo diferencias

estadísticamente significativas entre el factor de condición de estrés y las cepas experimentales

(F[2,54]=0.108, p=0.897). Sin embargo para cada factor, las diferencias si alcanzaron el grado de

significancia (cepa, F[2,54]=15.179, p<0.001;condición de estrés, F[1,54]=4.882, p<0.05). La

comparación post-hoc (test de Student Newman-Keuls) para el factor cepa, mostró que el grupo

CLF, en general, se acicaló por un tiempo significativamente mayor que los demás grupos

experimentales (CHF p<0.001; CON p<0.001). En cuanto a la condición de estrés, se rescató que

los animales Nv también se acicalaron por un tiempo significativamente mayor que los

estresados (p=0.032).

Procediendo a las interacciones entre los factores, se rescata lo siguiente. Entre los

animales sometidos a estrés, el grupo CLF tuvo un tiempo de acicalamiento significativamente

mayor que CHF (p<0.001) y su respectivo control (p<0.01). Para el caso de los Nv, se identificó

que los sujetos de CLF también obtuvieron un tiempo de acicalamiento significativamente mayor

que CHF (p<0.01) y su respectivo control (p<0.01). Los efectos del tratamiento entre las cepas

experimentales no mostraron diferencias significativas que permitiesen afirmar un efecto de la

inducción del estrés sobre el tiempo de acicalamiento en los grupos (CHF, p=138; CLF, p=0.157;

CON, p=0.375) (figura 9).

81

En cuanto a la frecuencia del comportamiento, el ANOVA de dos vías mostró que

tampoco hubo diferencias estadísticamente significativas entre el factor de condición de estrés y

las cepas experimentales (F[2,54]=0.196, p=0.823). Sin embargo, en cada factor, estas si

alcanzaron el grado de significancia (cepa, F[2,54]=16.092, p<0.001; condición de estrés,

F[2,54]=5.532, p<0.05). Así pues, la comparación post-hoc (test de Student Newman-Keuls) para

el factor cepa, destacó que los animales de CLF tuvieron la tendencia de repetir el

comportamiento con mayor frecuencia que los demás grupos durante el protocolo experimental

(CHF p<0.001; CON p<0.001). En cuanto al factor de condición de estrés, se observó que los

animales no estresados tuvieron una tendencia de repetir el comportamiento con mayor

frecuencia que sus contrapartes estresadas (p=0.022).

Posteriores comparaciones mostraron resultados similares. Se destacó que, entre los

animales sometidos a estrés, el grupo CLF tuvo un tiempo de acicalamiento significativamente

mayor que CHF (p<0.001) y su respectivo control (p<0.01). Para los animales Nv, se identificó

que los sujetos de CLF también obtuvieron un tiempo de acicalamiento mayor que CHF (p<0.01)

y el grupo control (p<0.01). Los efectos del tratamiento entre las respectivas cepas

experimentales no mostraron diferencias significativas sobre la frecuencia de acicalamiento en

los grupos (CHF, p=0.082; CLF, p=0.310; CON, p=0.219) (figura 9).

**

0,00

5,00

10,00

15,00

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CON Nv CHF Nv CLF Nv

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nto

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B.

82

Figura 9. Promedios de tiempo y frecuencia de acicalamiento. Los asteriscos hacen referencia a diferencias

estadísticamente significativas que vale la pena resaltar entre los grupos. Un asterisco (*) representa un p<0.05 y dos

(**) un p<0.001. Las cruces (+) representan diferencias estadísticamente significativas entre los grupos con sus

respectivas contrapartes no estresadas (Nv) A. Medias del tiempo de acicalamiento en las ratas estresadas. Se

destacan al grupo CLF haber presentado el comportamiento por un periodo de tiempo más prolongado que los

demás. B. Medias de tiempo de acicalamiento de los grupos no estresados. No se observaron diferencias entre las

medias de tiempo del comportamiento entre los grupos. Se destaca que CLFNv obtuvo un tiempo de acicalamiento

significativamente mayor que CHF y su respectivo control C. Frecuencia del comportamiento de acicalamiento de

los grupos estresados durante el protocolo experimental. Se destaca que CLF repitió el comportamiento con más

frecuencia de los otros grupos. D. Frecuencia del acicalamiento en los grupos no estresados durante la sesión

experimental. Para este caso, se rescata a CLF pues la frecuencia repitió el comportamiento con más frecuencia que

los otros grupos.

Levantarse en las patas traseras

Un ANOVA de dos vías para el tiempo de estar parado en las patas traseras mostró que no

hubo diferencias estadísticamente significativas entre el factor de condición de estrés y las cepas

experimentales (F[2,54]=0.00469, p=0.995). Por el contrario, cuando se evaluaron los factores por

separado, las diferencias si alcanzaron el grado de significancia (cepa, F[2,54]=28.565, p<0.001;

condición de estrés, F[1,54]=5.717, p<0.05). La comparación post-hoc (test de Student Newman-

Keuls) mostró que en el factor cepa si hubo diferencias estadísticamente significativas entre los

grupos experimentales. En este caso, se aclara que los animales del grupo CLF se pararon en las

patas traseras por un tiempo significativamente mayor que los demás grupos durante el protocolo

experimental (CHF p<0.001; CON, p<0.001). Por el contrario, los animales de CHF

permanecieron parados en las patas traseras por un tiempo significativamente menor que el grupo

control (p=0.002). En cuanto al factor de condición de estrés, se rescata que los animales

**

0,00

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14,00

CON Nv CHF Nv CLF Nv

Frec

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de

acic

alam

ien

to

D.

83

estresados mantuvieron este comportamiento por tiempo significativamente menor que los no

estresados (p=0.020).

Posteriores comparaciones entre los factores mostraron que, para los animales sometidos a

estrés hubo diferencias estadísticamente significativas en las medias de todos los grupos. Se

observó que el grupo CLF tuvo un tiempo de acicalamiento mayor que CHF (p<0.001) y su

respectivo control (p<0.01). En contraposición, el grupo CHF obtuvo el menor tiempo de estar

levantado en las patas durante la fase experimental. De manera interesante, en los animales Nv

también se identificaron diferencias estadísticamente significativas en el tiempo de estar parado

en las patas traseras. Nuevamente, los sujetos de CLF obtuvieron un tiempo de acicalamiento

significativamente mayor que CHF (p<0.01) y su respectivo control (p<0.01). Se agrega que CHF

Nv obtuvo el menor tiempo de estar de pie (figura 11). Los efectos del tratamiento entre las

respectivas cepas experimentales no mostraron diferencias significativas que permitiesen afirmar

un efecto de la inducción del estrés sobre la frecuencia de pararse en los grupos (CHF, p=0.188;

CLF, p=0.132; CON=0.201).

En cuanto a la frecuencia del comportamiento, el ANOVA de dos vías tampoco destacó

diferencias estadísticamente significativas entre la condición de estrés y las cepas experimentales

(F[2, 54]=0.855, p<0.431), pero cada factor alcanzó un nivel de significancia. El factor cepa

demostró diferencias estadísticamente significativas (F[2,54]=13.043, p<0.001). Este demostró,

durante la comparación post-hoc, que los animales del grupo CLF repitieron el comportamiento

con más frecuencia que las demás cepas experimentales (CHF p<0.001; CON p=0.010). CHF y

control no se diferenciaron. Ahora bien, para el factor de condición de estrés (F[1,54]=0.533,

p=0.469), no se identificaron diferencias que permitiesen afirmar que el estrés causó un efecto

sobre el tiempo de estar parado en las patas traseras entre los grupos (CHF, p>0.05; CLF, p>0.05;

CON>0.05).

Finalmente, las comparaciones entre los factores (test de Student Newman-Keuls)

mostraron que los animales del grupo CLF sometido a estrés obtuvieron una frecuencia del

comportamiento estadísticamente mayor que CHF (p<0.001) y su contraparte control (p<0.01).

En cuanto a los animales Nv, solamente se identificó que CLF repitió el comportamiento con

mayor frecuencia que los animales del grupo CHF (p<0.05). Los efectos del tratamiento entre las

respectivas cepas experimentales no mostraron diferencias significativas que permitiesen afirmar

84

un efecto de la inducción del estrés sobre la frecuencia de pararse en los grupos (CHF, p=0.469;

CLF, p=0.527; CON=0.461) (figura 10).

Figura 10. Promedios de tiempo y frecuencia de estar parado en las patas traseras. Los asteriscos hacen referencia a

diferencias estadísticamente significativas entre los grupos experimentales. Un asterisco (*) representó un p<0.05 y

dos asteriscos (**) un p<0.001. Se resaltaron con los asteriscos los puntajes más altos o más bajos que tuvieron

diferencias estadísticamente significativas con todos los grupos A. Tiempo mantenerse de pie en los animales

estresados. Se rescatan diferencias estadísticamente significativas entre los grupos CLF con CHF y CON. El grupo

obtuvo el mayor tiempo de estar de pie en comparación con los otros dos grupos. CLF, aunque no obtuvo diferencias

estadísticamente significativas con el grupo control, se destaca por tener el tiempo más alto. B. Tiempo de

mantenerse de pie en los animales de los grupos Nv. Se destacó a CHF como el menor puntaje y a CLF como el

mayor. C. Frecuencia de estar de pie en los animales estresados. Se destaca a CLF por tener un puntaje mayor al

resto de los grupos. D. Promedio del puntaje de frecuencia de estar de pie en los animales Nv. Se identificaron

diferencias estadísticamente significativas en la frecuencia del comportamiento entre CLF y los demás grupos. CLF

obtuvo una frecuencia significativamente mayor que CHF y su respectivo control.

Reconocimiento de objetos

Con el propósito de establecer en qué medida los animales experimentales tuvieron la

capacidad de reconocer un objeto novedoso dentro de un contexto familiar (el campo abierto), se

*

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

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CON St CHF St CLF St

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C.

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10,00

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s)

A.

85

analizaron distintas variables que permitieron establecer que tanto exploraron los objetos en la

fase de familiarización y exploraron el objeto novedoso en la fase de prueba.

Familiarización

Se realizaron comparaciones sobre las medias de porcentaje de exploración de los objetos

durante la fase de familiarización. Se realizó este proceso con el propósito identificar si hubo

exploración de los objetos por parte de los grupos experimentales. Para esto, se realizaron

ANOVAs con medidas repetidas, las cuales compararon las medias de los tiempos de exploración

de los objetos en los grupos experimentales estresados y no estresados. En la figura 11 se

encuentran las medias y desviaciones estándar del tiempo de exploración durante la sesión

experimental.

Sujetos estresados

Aunque se puede evidenciar que los animales exploraron los objetos, se observaron

diferencias significativas en cuanto a los tiempos de exploración (F[12, 5]=5.796, p<0.001).

Posteriores comparaciones de post-hoc mostraron que los animales del grupo CHF exploraron los

objetos significativamente menos que los otros grupos, tanto para el objeto P (p<0.05) como para

el objeto B (p<0.05).

Sujetos no estresados

En cuanto a los grupos no estresados, el análisis para la exploración de los objetos

muestra que no hubo diferencias estadísticamente significativas en los grupos (F[10, 5]=2.724,

p=0.488).

86

Figura 11. Porcentaje de exploración de los objetos durante la fase de familiarización. No se identificaron

diferencias estadísticamente significativas en las medias de exploración en los grupos Nv. En los grupos estresados

se puede evidenciar un tiempo de exploración de los objetos significativamente menor en CHF.

Fase de prueba

Una ANOVA de dos vías que comparó las medias de tiempo de exploración del objeto

novedoso entre los grupos experimentales, mostró que las distribuciones de los datos

correspondientes no obtuvo diferencias estadísticamente significativas (F[2, 54]=0.264, p=0.769).

Las diferencias no alcanzaron el grado de significancia, ni para el factor cepa (F[2,54]=3.000,

p=0.058), ni para el factor de condición de estrés (F[1, 54]=0.512, p=0.769). A partir de este punto,

se procede a afirmar que no hubo un efecto del estrés sobre el tiempo de exploración del objeto

novedoso entre las cepas.

Se procedió a realizar un ANOVA de dos vías para identificar las diferencias entre las

medias de tiempo de exploración del objeto familiar, sin embargo estas no se observaron entre el

factor cepa y condición de estrés (F[2, 54]=1.958, p=0.151). Cuando se evaluaron los factores por

separado, las diferencias sólo alcanzaron el grado de significancia para el factor cepa

(F[2,54]=5.015, p<0.01), más no para el factor de condición de estrés (F[1, 54]=0.0926, p=0.762). La

comparación post-hoc para este primer factor (test de Student Newman-Keuls) mostró que los

animales sometidos a estrés CLF tuvieron un tiempo de exploración del objeto familiar

significativamente mayor que CHF (p=0.004) y su respectivo control (p=0.012). En el caso de los

grupos Nv, no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos

**

0,00

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20,00

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(s)

objeto B Objeto P

87

experimentales. Comparaciones múltiples entre las cepas con sus respectivas contrapartes no

estresadas tampoco mostraron diferencias estadísticamente significativas (figura 12).

Comparaciones intra-grupo

se procedió a analizar los porcentajes de las medias de tiempo de exploración entre el

objeto familiar y el objeto novedoso intra-grupo por medio del uso de pruebas t pareadas.

En primer lugar, la prueba t pareada para el tiempo de exploración del objeto familiar y el

objeto novedoso en CHF estresado mostró que las diferencias entre las medias de exploración

fueron estadísticamente significativas en el grupo (t([1]=-2.830, p=0.016). Se identificó que los

animales tuvieron la tendencia de explorar el objeto novedoso en comparación con el familiar. En

cuanto al grupo Nv, el análisis mostró que las diferencias entre los tiempos de exploración del

objeto familiar y novedoso no fueron estadísticamente significativas (t[6]=-2.242, p=0.066).

Para CLF estresado, las diferencias entre el tiempo de exploración tampoco destacaron

diferencias estadísticamente significativas entre el objeto familiar y el objeto novedoso

(t[12]=1.582, p=0.234). En CLF Nv tampoco se identificaron diferencias entre las medias de

tiempo de exploración de los objetos familiar y novedoso (t[8]=-0.154, p=0.882).

Finalmente, las diferencias entre las medias de tiempo de exploración de los objetos en el

grupo control sometido a estrés fueron estadísticamente significativas (t[7]=-4.049, p<0.05),

permitiendo afirmar que se discriminó el objeto familiar del novedoso. De la misma manera, el

análisis rescató que para control Nv también hubo diferencias estadísticamente significativas

entre la exploración de los objetos (t[10]=3.125, p<0.01).

88

Figura 12. Porcentajes de exploración en el objeto familiar y novedoso. Los asteriscos representan diferencias

estadísticamente significativas entre las medias del grupo señalado con las de los demás grupos. Un asterisco

representa un p<0.05 Nota: Se identificaron diferencias estadísticamente significativas entre CLF St y sus respectivas

contrapartes no estresadas. En cuento a los análisis intra-grupo, se observan diferencias estadísticamente

significativas entre los grupos experimentales entre el tiempo de exploración entre la exploración del objeto familiar

y novedoso, las cuales destacan una discriminación entre estos dos. No se observaron diferencias entre los tiempos

de exploración en los animales del grupo CLF Nv y CLF St.

Histología

Ahora bien, se procedió a efectuar el análisis de las muestras de tejido cerebral en los

grupos experimentales. Debido al interés en comparar los efectos de la exposición al estrés sobre

la proliferación de microglía activada por área (0.1mm) en cada cepa, se optó por realizar un

ANOVA de dos vías, siendo uno de los factores la condición de estrés (SI x NO) y el otro la cepa

(CTR x CAC x CBC). En algunas de las mediciones obtenidas, no hubo una distribución normal

de los datos, pero debido a que no existe un test no paramétrico que pueda reemplazar al

ANOVA de dos vías, se optó por realizar el ANOVA, asumiendo que era posible no encontrar

significancia estadística en las mediciones, pero que, en caso de hallarlas, correspondería a un

efecto muy marcado en la población. En este caso, las diferencias halladas han de ser tomadas

con cautela, pero debe recordarse que, posiblemente, si se tuvieran grupos de mayor tamaño y

con igual número de sujetos, con gran probabilidad el análisis paramétrico acusaría las mismas

significancias.

Hipocampo

*

*

**

*

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

CON Nv CHF Nv CLF Nv CON St CHF St CLF St

Tie

mp

o d

e e

xplo

raci

ón

ob

jeto

s p

rue

ba

(s)

Objeto familiar

Objeto novedoso

89

Giro dentado

Un ANOVA de dos vías para el tiempo de pararse en las patas traseras mostró que hubo

interacciones estadísticamente significativas entre el factor de condición de estrés y la

proliferación de microglía activada en las cepas experimentales (F[2,50]=4.590, p=0.015). La

comparación post-hoc (test de Student Newman-Keuls) mostró que, entre los animales sometidos

a estrés, no se mostraron diferencias estadísticamente significativas en las medias de microglía de

fenotipo M1. En cuanto a los animales Nv, si se identificaron diferencias estadísticamente

significativas en la proliferación de microglía activada. Los sujetos de CLF Nv obtuvieron una

cantidad de microglía M1 significativamente mayor que acicalamiento significativamente mayor

que CHF Nv (p<0.04) y su respectivo control (p<0.01).

En cuando a los análisis entre los grupos con sus respectivas contrapartes estresadas, se

observaron diferencias estadísticamente significativas entre CHF sometido a estrés y su

contraparte no estresada (p=0.009). CHF St obtuvo una cantidad de microglía M1

significativamente mayor que CHF Nv. No se observaron diferencias estadísticamente

significativas entre CLF y CON. (figura 13).

*

*

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

CHF St CLF St CON St CHF Nv CLF Nv CON Nv

Mic

rogl

ía a

ctiv

ada

po

r ár

ea

(x0.

1mm

)

D.

A.

C.

B.

90

Figura 13. Microglía activada en el giro dentado. Se muestran las imágenes para aquellos grupos que obtuvieron

diferencias estadísticamente significativas durante el análisis. A. Microglía activada en una porción del giro dentado

ventral de CHF estresado. B. microglía activada de una porción de un giro dentado de un animal de CHF Nv. C.

Microglía activada para una porción de un giro dentado de un animal del grupo CLF Nv. D. Promedio de microglía

activada por área en los grupos experimentales. Se identificaron diferencias estadísticamente significativas entre los

grupos CHF estresado y Nv y el grupo CLF Nv con CHF Nv. Nota: el asterisco (*) hace referencia a un p<0.05.

Todas las imágenes fueron tomadas y procesadas en el Laboratorio de Neurociencia de la Universidad de los Andes.

CA3

En vista de que en CHF Nv no se contaron células de microglía M1, no fue posible el

ANOVA de dos vías, razón por la cual se optó por realizar análisis estadísticos por separado.

Para el caso de los animales naïve, sólo fue posible realizar la comparación de los animales

control con los animales CLF, pues no se tuvieron datos de los animales CHF.

Sujetos estresados

Ahora bien, una ANOVA de una vía comparó las cantidades de microglía por área en la

región anterior de CA3 en los animales estresados. Se identificaron diferencias estadísticamente

significativas entre los grupos experimentales (F[2, 12]=9.006, p<0.01). Las comparaciones de

post-hoc mostraron que el grupo CON inflamó significativamente menos que los otros dos

grupos (ver figura 14).

91

Figura 14. Microglía activada en el área CA3 del hipocampo. Solamente se mostraron las imágenes para aquellos

grupos que obtuvieron diferencias estadísticamente significativas durante el análisis. A. Microglía activada para una

porción del área CA3 de CLF St. B. Microglía activada para una porción del área CA3 de un animal de CHF St. C.

Microglía activada para una porción del área CA3 de un animal del grupo CON St. D. Promedio de microglía

activada por área en el área CA3 para los grupos estresados. Se identificó que el grupo CON obtuvo una cantidad

promedio de microglía proinflamatoria significativamente menor que los otros grupos experimentales. Nota: el

asterisco (*) hace referencia a un p<0.05. Todas las imágenes fueron tomadas y procesadas en el Laboratorio de

Neurociencia de la Universidad de los Andes.

Sujetos Nv

Para los animales no estresado, es importante aclarar que no hubo suficientes muestras

para realizar el análisis en las porciones de CHF. Por esta razón, sólo se realizó el análisis entre

CLF y CON. Una prueba t para muestras independientes mostró que las diferencias entre la

cantidad de células activadas para los grupos fueron estadísticamente significativas (t[7]=4.396,

p<0.003). Posteriores análisis muestran que el CLF obtuvo una cantidad de microglía activada

significativamente mayor que el grupo control (ver figura 15).

A. B.

C.

*

0

2

4

6

8

10

12

CHF St CLF St CON St

Mic

rogl

ía a

ctiv

ada

(x0

.1m

m)

D.

92

Figura 15. Microglía activada en el área CA3 de los animales Nv. Solamente se mostraron las imágenes para

aquellos grupos que obtuvieron diferencias estadísticamente significativas durante el análisis A. Microglía activada

en una porción del área CA3 de un animal perteneciente a CLF Nv. B. Microglía activada en una porción del área

CA3 de un animal perteneciente a CON Nv. C. Gráfico de promedio de microglía activada por área en el área CA3

para los grupos no estresados. Se identificó que el grupo CLF obtuvo una cantidad promedio de microglía

proinflamatoria significativamente mayor que el grupo control. Nota: el asterisco (*) hace referencia a un p<0.05.

Todas las imágenes fueron tomadas y procesadas en el Laboratorio de Neurociencia de la Universidad de los Andes.

Efectos del estrés sobre la inflamación

En cuanto a CHF, no se procedió a comparar los resultados entre el grupo estresado y no

estresado, pues el Nv no obtuvo un n suficiente de muestras para ser comparado con su

contraparte estresada.

En los grupos no estresados, la prueba t para muestras independientes mostró que las

medias de los grupos experimentales no fueron lo suficientemente diferentes como para afirmar

un efecto del estrés sobre la cantidad de microglía activada en esta área (t[4]=-0.198, p=0.853).

B.

*

0

2

4

6

8

10

12

14

CLF Nv CON Nv

Mic

rogl

ía a

ctiv

ada

(x0

.01

mm

)C.

A.

93

Finalmente, para el grupo control, una prueba t para muestras independientes mostró que

las diferencias entre la cantidad de microglía activada entre los grupos no fue estadísticamente

significativa (t[8]=0.081, p=0.311). Por lo tanto, no se puede afirmar un efecto del estrés sobre la

cantidad de microglía activada en esta área.

CA1

Al igual que en CA3, en CHF Nv no se contaron células de microglía activada, no fue posible el

ANOVA de dos vías, razón por la cual se optó por realizar análisis estadísticos por separado.

Para el caso de los animales naïve, sólo fue posible realizar la comparación de los animales

control con los animales CLF, pues no se tuvieron datos de los animales CHF.

Sujetos estresados

Para comparar la cantidad de microglía activada en el área CA1 del hipocampo de los

animales experimentales, se realizó una ANOVA de una vía. Los resultados indicaron que no

existen diferencias estadísticamente significativas entre los grupos experimentales (F[2, 5]=3.759,

p=0.101) (ver figura 18).

Sujetos Nv

Como no se contaron células de microglía activada en el grupo CHF Nv, se procedió a

hacer la comparación entre los grupos CLF y CON. Se compararon las medias de los grupos por

medio de una prueba t para muestras independientes. Del análisis se rescataron diferencias

estadísticamente significativas entre los grupos (t(5)=5.393, p<0.01). Comparaciones de post-hoc

mostraron que CLF obtuvo niveles de inflamación significativamente mayores que el grupo

control (ver figura 16).

Efectos del estrés sobre la inflamación

Al igual que CA3, no se realizó un análisis entre CHF estresada con su contraparte no

estresada, pues CHF Nv no contó con el n de muestras suficiente.

100µm

94

Para CLF, no se identificaron diferencias estadísticamente significativas que permitiesen

sugerir un efecto del estrés sobre la cantidad de microglía activada en el área (t[4]=-0.842,

p=0.447).

En el grupo control, el análisis no resaltó diferencias estadísticamente significativas en

cuanto a la cantidad de microglía activada en esta área (t[3]=-3.090, p=0.054). Por lo tanto, no se

puede afirmar un efecto del estrés sobre la inflamación en esta área.

Figura 16. Microglía activada en el área CA1 de los grupos experimentales. Solamente se mostraron las imágenes

para aquellos grupos que obtuvieron diferencias estadísticamente significativas durante el análisis A. Microglía

activada en una porción del área CA1 de un animal perteneciente a CLF Nv. B. Microglía activada en una porción

del área CA1 de un animal perteneciente a CON Nv. C. Gráfico de promedio de microglía activada por área en el

área CA1 para los grupos experimentales. Se identificó que el grupo CLF no estresado obtuvo una cantidad

promedio de microglía proinflamatoria significativamente mayor que el grupo control no estresado. Nota: el asterisco

(*) hace referencia a un p<0.05. Todas las imágenes fueron tomadas y procesadas en el Laboratorio de Neurociencia

de la Universidad de los Andes.

*

0

2

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6

8

10

12

14

16

CHF St CLF St CON St CLF Nv CONNv

Mic

rogl

ía a

ctiv

ada

(x0

.1m

m)

A. B.

C.

95

CPU

Para los propósitos del experimento, fue de interés observar los niveles de inflamación de

algunos núcleos motores. En este caso, se destacó el cuerpo estriado.

Sujetos estresados

Se realizó una prueba de una vía que evaluó los niveles de inflamación en los grupos

estresados para esta estructura. Los resultados destacaron diferencias estadísticamente

significativas entre los grupos experimentales (F[2, 18]=3.721, p<0.05). Comparaciones de post-

hoc mostraron que el grupo CLF tuvo un nivel de inflamación significativamente mayor que CHF

(p<0.05) (ver figura 17).

Sujetos Nv

En los animales no estresados, no se observaron diferencias estadísticamente

significativas para las medias de inflamación en esta estructura (F[2, 8]=0.267, p=0.772).

Efectos del estrés sobre la inflamación

Para identificar las diferencias entre la inflamación de CHF estresado con su contraparte

no estresada, se realizó una prueba t para muestras independientes. De los resultados no se

rescataron diferencias estadísticamente significativas entre los niveles de inflamación entre los

grupos experimentales (t(8)=-0.975, p=0.354).

En CLF estresado y no estresado, tampoco se identificaron diferencias estadísticamente

significativas que destacaran efectos de la inducción del estrés sobre los niveles de inflamación

en esta área (t(14)=1.220, p=0.243).

Por último, en el grupo control no se observaron diferencias estadísticamente

significativas en cuanto a las medias de cantidad de microglía activada por área (t(4)=0.351,

p=0.743). Por lo tanto, no se puede afirmar que el estrés ejerza un efecto sobre la inflamación en

esta región.

96

Figura 17. Microglía activada en el CPU de los grupos experimentales. Solamente se mostraron las imágenes para

aquellos grupos que obtuvieron diferencias estadísticamente significativas durante el análisis A. Microglía activada

en una porción del CPU de un animal perteneciente a CHF St. B. Microglía activada en una porción del CPU de un

animal perteneciente a CLF St C. Promedio de microglía activada por área en el CPU para los grupos

experimentales. Se identificó que el grupo CLF estresado obtuvo una cantidad promedio de microglía

proinflamatoria significativamente mayor que el grupo CHF estresado. Nota: el asterisco (*) hace referencia a un

p<0.05. Todas las imágenes fueron tomadas y procesadas en el Laboratorio de Neurociencia de la Universidad de los

Andes.

Discusión

Parte de los propósitos de las investigaciones en neurociencia del comportamiento, han

buscado entender las diferencias individuales relacionadas con el moldeamiento del fenotipo de

los sistemas vivientes, dadas ciertas características genéticas durante el desarrollo y su relación

con el ambiente (Koolhaas, de Boer, Coppens, & Buwalda, 2010; Diorio & Meaney, 2007). El

estrés, es una condición destacada en diversos estudios, pues ha sido útil para indagar aspectos

relacionados con los estados de vulnerabilidad y resiliencia ante la presencia de cambios

*

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

CHF St CLF St CON St CHF Nv CLF Nv CONNv

Mic

rogl

ía a

ctiv

ada

(x0

.1m

m)

A. B.

C.

97

medioambientales (Uchida et al., 2011; Campos, Fogaca, Aguiar, & Guimaraes, 2013). Hoy en

día, el uso de modelos animales ha tratado de refinar los procedimientos experimentales, con el

fin de ofrecer protocolos con mayor validez ecológica y facilitar el estudio de las conductas de

interés (Whitaker, Gilpin, & Edwards, 2014; Koolhaas, de Boer, Buwalda, & van, 2007).

Existen modelos animales que facilitan el entendimiento de la neurobiología del estrés.

Por ejemplo, estudios acerca del comportamiento de los ratones C57BL/J, los cuales incrementan

sus niveles de ansiedad y disminuyen su tiempo exploración después de la inducción de estrés

social cuando son vulnerables al estímulo (Krishnan et al., 2007); u otras investigaciones que han

aclarado diferencias individuales relacionadas con los estilos de afrontamiento en ratas durante la

adolescencia3 (Vidal, Buwalda, & Koolhaas, 2011); e incluso algunas delegan la caracterización

de ciertos rasgos entre linajes de ratas, sobre las diferencias en la exploración, el comportamiento

de escape y la desesperanza aprendida (Padilla, Barrett, Shumake & Gonzalez-Lima, 2009); o

que exploran las diferencias en cuanto al comportamiento ansioso en ratas (Rex, Voigt, Gustedt,

Beckett, & Fink, 2004), etc. Sirven como buenos puntos de partida para proponer nuevas

aproximaciones que aporten al conocimiento de temas relacionados.

Del linaje Wistar, fueron desarrolladas las cepas CHF y CLF (de Castro Gómes, Barroso

Silva, & Landeira-Fernandez, 2011), las cuales se caracterizan por poseer fenotipos distintos

relacionados con la respuesta de congelamiento. A lo largo de varias generaciones de cruzamiento,

demostraron diferencias de conectividad e integración de la información aversiva en el cerebro (de

Oliveira Galvão, de Castro Gómes, Masionette, & Landeira-Fernandez, 2011; de Castro Gómes et al.,

2011). En el presente estudio, se tuvo el propósito de determinar, de manera exploratoria, el

posible efecto de la inducción de estrés agudo sobre la inflamación y la generación de

comportamientos relacionados con la consolidación de las memorias emocionales y neutras y la

generación de otras conductas ansiosas que diferenciaron una cepa de la otra. Las suposiciones

sobre la posible relación entre la inflamación y la predisposición a comportamientos ansiosos en

los animales experimentales, fue evaluada a través de diversos protocolos experimentales, con los

3 Que han afirmado al final, menos estrategias por parte de las ratas Wistar en comparación con salvajes en tareas de

estrés social (Vidal, Buwalda, & Koolhaas, 2011).

98

cuales se relacionaron los patrones inflamatorios en el hipocampo con los comportamientos

subyacentes en los animales estresados y no estresados.

Se destacaron varias observaciones que vale la pena considerar; estas serán expuestas en

las secciones siguientes.

Consideraciones generales del experimento

Durante el protocolo de miedo condicionado, se observó que los comportamientos

provocados por el choque, efectivamente afectaron de manera desigual la habilidad de los

animales para establecer mecanismos de afrontamiento ante la situación estresora (Campos et al.,

2013). En concordancia con estudios pasados (de, V & Landeira-Fernandez, 2008a; Hassan,

Gomes, Pinton, Batista Teixeira da, & Landeira-Fernandez, 2013; Leon et al., 2013; de Oliveira

Galvão et al., 2011), se observó que los animales de CHF mantuvieron el congelamiento con la

misma intensidad durante todas las sesiones de la prueba (post, 24 horas y 6 días), permitiendo

sugerir que el recuerdo aversivo se consolidó fuertemente y se retuvo con la misma intensidad

cada vez que los animales fueron reexpuestos a la caja de condicionamiento. Por otro lado, el

grupo CLF tuvo la tendencia de disminuir su congelamiento durante las sesiones experimentales,

demostrando una dificultad en, o bien consolidar, o bien evocar (Genzel, Rossato, Jacobse,

Grieves, Spooner, Battaglia, Férnandez, & Morris, 2017) el recuerdo aversivo a mediano y largo

plazo.

El congelamiento es una respuesta de defensa producida por el animal una vez percibe

que no le es posible escapar de una amenaza subyacente (Steimer, 2002; Fanselow, 2000). No

obstante, cuando es evocado de manera exagerada, resulta poco adaptativo para la sobrevivencia

del sistema a largo plazo (McEwen & Gianaros, 2010). Después del protocolo, el congelamiento

fue el comportamiento más prevalente en CHF, hasta el punto de presentarse, incluso, en otros

contextos como el campo abierto. Cuando se compararon los resultados con los animales que no

recibieron el choque, se reafirmó su capacidad para evocar el recuerdo aversivo. En cuanto a

CLF, aunque también se observaron diferencias con su contraparte no estresada, se recalca que el

comportamiento fue disminuyendo de manera significativa después de la reexposición al

contexto.

99

Ahora bien, el campo abierto es un buen predictor de respuestas emocionales relacionadas

con la ansiedad y el estrés y también es utilizado para explorar los efectos de agentes ansiolíticos

y ansiogénicos (Prut & Belzung, 2003). Dentro del campo, usualmente se evalúan los niveles de

exploración de los animales dentro de un contexto abierto y desconocido, del cual no pueden

escapar (Choleris, Thomas, Kavaliers, & Prato, 2001; Seibenhener & Wooten, 2015).

En el experimento, se valoraron los niveles de deambulación y el tiempo y frecuencia de

los comportamientos de congelamiento, acicalamiento y estar parado en las patas traseras. Se

considera que estas conductas agregaron información importante sobre los niveles de ansiedad de

en los animales experimentales en el campo (Walsh & Cummins, 1976). Al finalizar la prueba, se

observaron resultados consistentes con aquellos reportados en el condicionamiento aversivo,

estos van a ser expuestos a continuación.

En resultados no reportados en el presente experimento, se observó que los animales

tuvieron una tendencia de deambular por los cuadrantes exteriores del campo abierto. El anterior

comportamiento, puede servir como un indicio de ansiedady también se puede considerar como

una conducta de supervivencia de la especie ante depredadores naturales (Choleris et al., 2001;

Seibenhener & Wooten, 2015). Aun así, dentro de las periferias, los animales se movilizaron de

manera diferentey los niveles de exploración revelaron diferencias estadísticamente significativas

en cuanto a la locomoción por el campo.

En primer lugar, CHF estresado exploró menos en comparación con el resto de los grupos

experimentales. Partiendo de este punto, se procede a considerar que después del estrés, los

animales del grupo no contaron con las habilidades para discriminar de manera adaptativa los

contextos parecidos a aquel del miedo condicionado (McEwen, 2007; Lissek, Rabin, McDowell,

Dvir, Bradford, Geraci, Pine & Grillon, 2009; Lissek et al., 2014)4 y por lo tanto se mantuvieron

congelados.

4 Se afirmó que también tuvieron una tendencia a sobregeneralizar el contexto condicionado a otros después del

entrenamiento. La generalización, es alcanzada cuando una respuesta de miedo adquirida a un estímulo particular es

transferida a otros estímulos (McLaren & Mackintosh, 2002). También se relaciona con la incapacidad para

discriminar el contexto peligroso del que no lo es después del aprendizaje (Lissek et al., 2009).

100

Por el contrario, los animales del grupo CLF no congelaron, pero evocaron otros

comportamientos, además de mostrar un aumento significativo en la locomoción por el campo. A

partir de este punto, se consideró que de acuerdo con lo observado tanto en la duración, como en

la frecuencia del acicalamiento y el pararse en dos patas, los animales de la cepa pudieron haber

tenido una tendencia al aumento de la ansiedad durante su tiempo en el campo. Sin embargo,

dicha ansiedad no se relacionaría con la inducción del choque, pues de los resultados no se

revelaron diferencias con su contraparte no estresada. Probablemente otros mecanismos de

afrontamiento diferentes del congelamiento característico de CHF, exactamente durante la

presencia de situaciones potencialmente amenazantes, podrían estar jugando un papel importante

en la conducta de la cepa (Wood & Bhatnagar, 2015). En párrafos posteriores se va a tratar el

tema con más detalle.

Durante la última fase del experimento, se tuvo la intención de evaluar la consolidación

de la memoria contextual y comparar los efectos del estrés entre los niveles de aprendizaje de los

grupos experimentales, haciendo uso de un protocolo de reconocimiento de objetos. Al finalizar

el análisis se observó que, para la familiarización, el grupo CHF estresado y no estresado obtuvo

el menor tiempo de exploración, en comparación con sus respectivos controles, para ambos

objetos. En CLF, por el contrario, se reportó un tiempo de exploración significativamente mayor,

el cual, nuevamente, no se diferenció del de su contraparte no estresada.

En cuanto a la fase de prueba, es importante resaltar que los animales estresados y no

estresados del grupo CHF presentaron una discriminación de los objetos en el campo, a pesar del

bajo tiempo de exploración. Es relevante destacar que en los animales de CLF (estresado y su

contraparte no estresada) se observó una incapacidad para consolidar el recuerdo, pues los

animales demostraron una tendencia por explorar los objetos familiar y novedoso de manera

indiscriminada. Por eso, se afirma que la incapacidad para consolidar de manera el recuerdo

relacionado con el objeto novedoso no depende de la inducción de estrés.

A continuación, se van a exponer las consideraciones complementarias sobre las dos

cepas, CHF y CLFy los posibles acercamientos desde la biología para la explicación del

comportamiento observado durante el experimento.

Consideraciones sobre CHF

101

De acuerdo con las últimas observaciones de la cepa, se procede a sugerir que las

alteraciones vinculadas con los comportamientos de congelamiento y el aumento de la

consolidación de la memoria emocional podrían verse mayormente evocados después de la inducción

del choque. Se propone que la cepa, a pesar de mostrar estados de vulnerabilidad frente al estímulo

estresor, podría no expresar patologías relacionas durante su vida si se encuentra en presencia de

ambientes no hostiles. Sin embargo, después de verse afectadas, se comienzan a destacar

comportamientos ansiosos, los cuales son evidentes en las sesiones del experimento. De los

resultados, se concluye que los animales comienzan a padecer estados relacionados con una

desregulación en la respuesta del eje HPA (Belda et al., 2008), un robustecimiento del

funcionamiento del circuito hipotálamo-amígdala-SGP para la iniciación de la respuesta de miedo

(de, V & Landeira-Fernandez, 2008a; Shvil, Rusch, Sullivan, & Neira, 2013; Patel, Spreng, Shin, &

Girard, 2012; McGaugh, 2000; Kim et al., 2013) y una sobreactividad de los núcleos hipocampales que

también la consolidación del recuerdo aversivo (Ballesteros, de Oliveira, Maisonette, & Landeira-

Fernandez, 2014; Fanselow & Dong, 2010; Belda et al., 2008), más no contextualy una consecuente

proinflamación derivada de la actividad de la microglía M1- la cual va a ser tratada en párrafos

posteriores-.

En primer lugar, se afirma que la respuesta de congelamiento y la reactividad frente al estrés en la

cepa, se relaciona con una estimulación paralela de SGP, una estructura relacionada con la integración de

la información aversiva para evocar respuestas inmediatas de miedo (congelamiento) y defensa (escape)

(Kincheski, Mota-Ortiz, Pavesi, Canteras, & Carobrez, 2012; Benarroch, 2012). SGP posee proyecciones

bidireccionales con el hipotálamo, la corteza y la amígdala desde su porción dorsal (Fendt & Fanselow,

1999; Graeff et al., 1993; Vianna & Brandao, 2003); y con el hipocampo en su porción ventral, que se

encarga de establecer un aprendizaje aversivo (Kim, Rison & Fanselow, 1993; Vianna, Graeff, Landeira-

Fernandez, & Brandao, 2001). Se ha reportado que la estimulación de SGPd, efectivamente aumenta el

tiempo de congelamiento, junto con otros comportamientos anticipatorios de ansiedad en CHF, mas no

en CLF (de Oliveira Galvão et al., 2011).

La propensión al miedo observada en el experimento ha sido corroborada a través de otras

evaluaciones en tareas de condicionamiento aversivo. Cuando esta región es estimulada eléctrica

o químicamente, se afirma que el aprendizaje asociativo se adquiere rápidamente y no es sencillo

102

realizar un proceso de extinción (Kincheski et al., 2012; Motta et al., 2017; Di, Mana, Jacobs, &

Phillips, 1987). Al mismo tiempo, se han registrado comportamientos relacionados con la

propensión al estrés, el aumento del aprendizaje emocional (Motta et al., 2017; Kincheski et al.,

2012), la disminución de la actividad locomotora (de Oliveira Galvão et al., 2011) y otros, como

el aumento de las presión arterial, la disnea, la piloerección, la hiperreactividad y la presencia de

un comportamiento de alerta (de Oliveira Galvão et al., 2011; Vianna et al., 2001). Las lesiones,

por el contrario, tienden a disminuir el congelamiento (Vianna et al., 2001), provocando problemas de

aprendizaje asociativo relacionado con el miedo, el cual fue un comportamiento recurrente en las ratas

CLF.

Desde SGP, también se destaca la liberación de sustancia P (SP)5 (Berton et al., 2007),

reconocida por ser uno de los precursores de procesos fisiológicos y patofisiológicos involucrados en la

regulación y el incremento del estrés y la ansiedad (Ebner & Singewald, 2006). Otros estudios afirman

que la estimulación de SGP puede iniciar de un proceso de inflamación neurogénica después de liberar

SP en el sistema (Corrigan, Vink, & Turner, 2016). La inmunoreactividad de esta sustancia se observa de

5 horas hasta incluso 7 días después accidentes cerebrovasculares inducidos (Corrigan et al., 2016). Este

proceso podría verse sobrelapado con la presencia de la microglía activada (ver capítulo de microglía),

pues en previos estudios se ha corroborado que la expresión del ARNm que codifica para el receptor

NK-1 (receptor de SP) en células microgliales (Rasley, Bost, Olson, Miller, & Marriott, 2002) tiende a

aumentar después del incremento de IL-4 e IFN-γ (Marriott & Bost, 2000). Otros, han observado que la

inducción del péptido (SP) es capaz promover los efectos proinflamatorios y citotóxicos de la microglía

M1 (explicada en el capítulo de introducción a la microglía), hasta por 24 horas después de su inducción

in vitro (Zhu, Qu, Lu, & Zhang, 2014).

Ahora bien, con relación a la respuesta de estrés, nuevamente se afirma que hubo una reactividad

más fuerte de los animales experimentales frente al estímulo, en comparación con sus respectivos

controles. En estudios antecedentes se ha reportado que la concentración corticosterona plasmática basal

y post choque son más altas en CHF que en CLF (Leon et al., 2013). El aumento de la corticosterona

suele afectar la respuesta del sistema frente al estrés, pues dicho aumento ha demostrado causar efectos

5 Un péptido de orígenes neuronales, cuyo receptor se encuentra de manera abundante en todo el sistema ya que es secretado tanto

por neuronas como de células gliales (O'Connor et al., 2004; Marriott & Bost, 2001).

103

de saturación sobre los receptores de glucocorticoides- y posteriormente una disminución de estos

mismos (Sapolsky et al., 1984)-, que los incapacita para realizar una realimentación negativa efectiva del

eje HPA (Kanter et al., 2001; Belda et al., 2008; Harris et al., 2013). Por lo tanto, se observa un

consecuente incremento significativo de liberación glutamatérgica derivada de la estimulación,

que causa impedimentos en el LTP dependiente de GD y CA36 (Alfarez, Joels & Krugers, 2003;

McEwen & Sapolsky, 1995), muerte por excitotoxicidad (Hu et al., 1997; Rosso, Crowley, Silveri,

Rauch & Jensen, 2017), reducción de la neurogénesis (Brummelte & Gales, 2010; Cameron &

Gould, 1994; Schoenfeld & Gould, 2012) -relacionada con el aumento de la ansiedad (Bergami,

Berninger & Canossa, 2009; Revest, Dupret, Koehl, Funk-Reiter, Grosjean & Abrous, 2009)- y

disminución en plasticidad sináptica de GD, CA3 y sus conexiones funcionales con CA1 (Alfarez et al.,

2009; Joels, 2008). Otros estudios sobre la administración con agonistas de esta sustancia, como la

dexametasona, igualmente han demostrado una mejora del recuerdo aversivo después del

condicionamiento de miedo (Roozendaal & McGaugh, 1996).

Directamente relacionado al tema anterior, se ha observado que la inducción de estrés

muy fuerte o crónico, también produce un incremento de la microglía proinflamatoria y

citotóxica, la cual comienza a acumularse sobre las áreas de concentración de glucocorticoides y

actúa en detrimento de la función normal del cerebro (Monje, Toda, & Palmer, 2003; Ekdahl,

Claasen, Bonde, Kokaia, & Lindvall, 2003). Aunque no se esperaba encontrar niveles mayores de

proinflamación en CLF, en CHF se identificó un número incrementado de microglía de fenotipo

M1 en el hipocampo que difirió significativamente con su contraparte no estresada y su

respectivo control. De acuerdo a la hipótesis propuesta, se observó una consistencia entre los resultados

reportados y la literatura correspondiente a los efectos del aumento de la inflamación hipocampal

después de la inducción de estrés (Jinno, Fleischer, Eckel, Schmidt, & Kosaka, 2007; Munhoz,

García-Bueno, Madrigal, Lepsh, Scavone & Leza, 2008).

6 dos estructuras altamente plásticas, cruciales para la adquisición y consolidación de la memoria relacionada con el

espacio y el contexto (Fellini, Florian, Courtney & Roullet, 2009; Florian & Roullet, 2004) y para la diferenciación de patrones

y detección de novedad (Kesner et al., 2004).

104

Se considera que la microglía, efectivamente fue estimulada a través del aumento de la

liberación glutamatérgica, noradrenérgica, de corticosterona y de otros factores derivados del

aumento de la degradación de proteínas y aminoácidos en las células de estructura (Hardingham, 2009;

Hassan et al., 2013; (Sapolsky, 1985; May et al., 1996; McEwen & Sapolsky, 1995; Murugan et

al., 2013; Tanaka et al., 2006; Wohleb et al., 2011), para ejercer sus efectos proinflamatorios y

citotóxicos. La anterior información se relaciona con los resultados obtenidos de otros experimentos,

que sugieren que los animales de CHF mantienen una mayor concentración de especies reactivas a

oxigeno (catalaza y glutaiona peroxidasa), indicadoras de aumento de radicales libres, en la corteza, el

hipocampo y el cerebelo (Hassan et al., 2013). El aumento de estas sustancias ha demostrado ser un

producto del mecanismo de defensa efectuado por la microglía en contra de patrones de muerte neuronal

o aparición de microorganismos potencialmente amenazantes (Hu, Sheng, Peterson & Chao, 1995;

Rock, Gekker, Hu, Sheng, Cheeran, Lokesgard & Peterson, 2004). En general, se afirma que la

reactividad frente al estrés causó en el hipocampo un ciclo de proinflamación derivado del mismo

estímulo, que aumentó las interferencias en los procesos de consolidación del recuerdo aversivo y

contextual (Marchand, Barbelivien, Seillier, Herbeaux, Sarrieau & Majchrzak, 2007).

Este problema ha sido de interés, debido a las aproximaciones que se han reportado acerca

de la presencia de neuroinflamación y aumento de radicales libres durante y después de estímulos

emocionalmente significativos (para más información vaya a capítulo de efectos del estrés sobre

la microglía); además de sus efectos sobre el desarrollo de patologías relacionadas, como la

depresión (Walker, Kavelaars, Heijnen, & Dantzer, 2014; Shibata & Suzuki, 2017; Hashioka et

al., 2007), la bipolaridad (Jakobsson et al., 2015; Knijff et al., 2007), la esquizofrenia (Monji,

Kato, & Kanba, 2009; Monji et al., 2013), los trastornos de ansiedad (Shigemori, Sakai, Takumi,

Itoh, & Suzuki, 2015), el trastorno de estrés posttraumático (PSTD) (Acosta et al., 2013; Sun et

al., 2016), las enfermedades neurodegenerativas (Cunningham, 2013; von, Eugenin-von, &

Eugenin, 2015; Gleichgerrcht, Ibanez, Roca, Torralva, & Manes, 2010), entre otros.

Consideraciones sobre CLF

La interesante ausencia del efecto del choque y la similaridad de los resultados con y sin

inducción de estrés en CLF, sugieren que el comportamiento podría estar relacionado con

impedimentos funcionales de otra naturaleza. Partiendo de lo anterior, se procede a sugerir que

las dificultades en el aprendizaje emocional y contextual durante el experimento se derivan de un

105

incremento en los niveles de neuroinflamación y se cree que la desregulación de los procesos

inflamatorios presentes en la cepa (Mantovani et al., 2002; Hoogman, Aarts, Zwiers, Slaats-

Willemse, Onnik, Cools, Kan, Buitelaar & Franke, 2011), son probables indicativos de otros

tipos de vulnerabilidad, los cuales, en concordancia con el proceso de fenotipaje, podrían ser de

naturaleza genética (Vazdarjanova et al., 2002; Rosi et al., 2009; Belarbi et al., 2012). Sin

embargo, este tema no ha sido suficientemente estudiado y se recomienda explorarlo en estudios

futuros. Aun así, se va a realizar un breve un acercamiento a los posibles procesos que podrían

estar jugando un papel en el desarrollo de estos animales.

Motricidad

Ahora bien, resulta conveniente comenzar por abordar el tema relacionado con el aumento

de la motricidad en la cepa. Como se observó en el presente experimento, los animales se

caracterizaron por mantenerse en constante movimiento a lo largo de las pruebas

comportamentales. Se identificó un incremento significativamente mayor que su respectivo

control en el acicalamiento, en el pararse en las patas traseras y en la distancia recorrida por el

campo abierto. Cuando se relacionó este patrón comportamental con los resultados obtenidos en

el condicionamiento aversivo y la prueba de reconocimiento de objetos, se consideraron dos

puntos: primero, que el aumento de la motricidad si puede ser considerado como un indicio de

aumento de ansiedad; y en segundo lugar, que el comportamiento ansioso es de corto plazo y solo

se expresa en presencia o poco después del estrés.

Entre los comportamientos que se evaluaron, se encuentra en primer lugar, el pararse en

las patas traseras, o mejor conocido como “rearing”. Este es un comportamiento exploratorio

natural de la especie, inducido en contextos novedosos (Lever, Burton, & O'Keefe, 2006). Su

aparición, juega un rol importante en el aprendizaje contextual dependiente del hipocampo (Lever

et al., 2006), sin embargo en contextos experimentales afirma que o bien, el aumento de su

tiempo y frecuencia es indicio de estrés (Borta & Schwarting, 2005), o bien su disminución

significativa es indicio de estrés (Costall, Jones, Kelly, Naylor, & Tomkins, 1989). Aunque aún

no es muy consistente su caracterización en contextos relacionados en la literatura (Seibenhener

& Wooten, 2015), en el presente experimento se sugiere que es consecuencia de un aumento

106

general de la actividad del sistema cuando el animal se encuentra en presencia contextos

potencialmente peligrosos.

Lo anterior se afirma en concordancia con el aumento significativo del acicalamiento.

Aunque en condiciones normales se encuentra involucrado en el mantenimiento de la higiene y

otros procesos que incluyen la termorregulación, la interacción social y también estados de

activación fisiológica, se ha reportado que, en condiciones estresantes, puede llegar a ser

patológico (Kalueff, Stewart, Song, Berridge, Graybiel & Fentress , 2016). En estudios previos,

se ha observado que la inducción de estrés, muestra incrementos en su frecuencia y duración,

además de evidenciar patrones erráticos de limpieza (Pires, Tufik, & Andersen, 2013). En CLF,

el acicalamiento se destacó, tanto en duración como en frecuencia durante toda la sesión

experimental. Por lo tanto, nuevamente se procede a relacionar su intensidad con un aumento en

la activación del sistema.

Relacionado con el tema anterior, en la literatura se ha destacado que las estructuras

pertenecientes a los núcleos que medían el control motor y su secuenciación7, mantienen

conexiones funcionales con algunas regiones encargadas del procesamiento emocional, como la

amígdala y el hipotálamo (Kalueff et al., 2016). De la amígdala, se ha reportado que la

estimulación glutamatérgica en MeA promueve el acicalamiento repetitivo, mientras que la

GABAérgica impide lo anterior (Hong et al., 2014). Resultados similares se han observado

durante estimulación de CeA con agonistas orexinérgicos (ORX-A), agonistas de NMDA y

antagonistas del receptor GABAa (Alo, Avolio, Mele, Di, & Canonaco, 2015).

Se sabe que la amígdala mantiene conexiones excitatorias con el hipotálamo, en especial

el NPV, uno de los núcleos encargados de la producción de CRF (Heinrichs, Menzaghi, Merlo,

Britton, & Koob, 1995; Herman & Cullinan, 1997). Se ha observado que ambas estructuras se

encuentran en estado de activación durante la secuenciación locomotora- junto con el cuerpo

estriado y los ganglios basales- en momentos de activación emocional (Kalueff et al., 2016).

Existe la posibilidad de que el aumento del funcionamiento de estas estructuras esté modulando

7 su circuito incorpora el funcionamiento los ganglios basales, el cuerpo estriado, los globos pálidos, la substancia nigra, el núcleo

acumbes y el núcleo subtalámico (Kalueff et al., 2016; Hong, Kim, & Anderson, 2014).

107

los patrones aumentados de motricidad en la cepa. Por lo que es recomendable explorar los

mecanismos relacionados a estos circuitos en contextos relacionados.

Consolidación de la memoria

En relación a los comportamientos observados en la cepa durante el condicionamiento

aversivo, se quiso destacar el papel de la amígdala, pues se considera que la de pérdida

progresiva del recuerdo condicionado por parte de la cepa, podría derivarse de que esta estructura

no está estableciendo conexiones efectivas sobre el hipocampo (McGaugh & Roozendaal, 2002;

Kim et al., 2005). En cuanto al reconocimiento de objetos, se considera que la inflamación

también actúa en detrimento del funcionamiento de la estructura.

En estudios antecedentes sobre el funcionamiento de la amígdala en CHF y CLF, se reportó

que las lesiones en los núcleos central (CeA) y basolateral (BLA) disminuyeron el congelamiento de

manera diferenciada en cada grupo. Si bien CHF tuvo la tendencia de reducir significativamente este

comportamiento después del condicionamiento, CLF no reveló una disminución significativa en el grupo

lesionado en comparación con el no lesionado (de, V & Landeira-Fernandez, 2008a). Podría resultar

interesante establecer que la disminución del congelamiento de CLF en comparación con CHF se

relaciona con el aumento en los niveles de proinflamación en la estructura, pues la microglía ejerce

acciones inhibitorias sobre el establecimiento del LTP y la plasticidad (Kelly, Lynch, Vereker,

Nolan, Queenlan, Whittaker, O’Neil & Lynch, 2001; Vereker, O’Donnell & Lynch, 2000). De

todos modos, se espera que a futuro se resuelvan los cuestionamientos relacionados con este

punto.

Adicionalmente, los altos niveles de inflamación también podrían estar afectando la

consolidación del recuerdo durante el sueño, pues el input excitatorio de la amígdala hacia las

cortezas hipocampales después del estrés (McGaugh, 2000), no facilitaría la producción de LTP y

la consolidación del recuerdo emocionales en las zonas ventrales de la estructura (hipocampo)

(McGaugh, 2000; Sapolsky, Krey, & McEwen, 1984). El robustecimiento de los recuerdos

aversivos se han observado durante el sueño por medio del incremento de las oscilaciones theta

desde BLA durante la activación emocional (Pelletier & Pare, 2004), que, al sincronizarse con el

hipocampo y la región infralímbica de corteza prefrontal durante el sueño REM (Hutchison &

Rathore, 2015)- a la vez que disminuyen el tiempo total de ondas de sueño lento (SOL) (Datta &

108

O'Malley, 2013)-. Información adicional muestra que, incluso 24 horas después de un

condicionamiento aversivo en ratas Wistar, existe un mejoramiento en la sincronía de frecuencias

theta entre dichas estructuras, especialmente entre BLA y el hipocampo (Narayanan et al., 2007), pero

una menor entre BLA y la corteza prefrontal medial (CPFm) (Lesting et al., 2011; Popa, Duvarci,

Popescu, Lena, & Pare, 2010).

De igual importancia, en vista de que la microglía se encuentra distribuida por todo el

hipocampo, incluso sin la necesidad de la presencia de estrés - con una mayor concentración en el

borde subgranular y granular del giro dentado (GD), CA1 y la porción dorsal de CA3- (Jinno,

Fleischer, Eckel, Schmidt, & Kosaka, 2007) y que los procesos de inflamación agudos tienden a

disminuir los procesos de plasticidad y LTP (Rodriguez, Davies, Errington, Verkhrasky, Bliss &

Stewart, 2007; Vazdarjanova, McNaughton, Barnes, Worley, & Guzowski, 2002), se sugiere que

las ratas de la cepa CLF tienen deficiencias cognitivas que afectan su desempeño a largo plazo

(Chesnokova et al., 2016; Pearson-Leary et al., 2017).

Acercamientos a la epigenética

Aunque se expresa que los resultados obtenidos en CLF aún no son conclusivos y

tampoco son suficientes para explicar la biología y la caracterización de los efectos observados

en el presente experimento, pues ni las variables comportamentales ni la inflamación pudieron

establecer un acercamiento preciso a la naturaleza de su comportamiento, se procede a establecer

otras observaciones, desde la evidencia, sobre los posibles mecanismos que podrían verse

involucrados en el aumento de la proinflamación a lo largo de las generaciones.

En primer lugar, se parte de que las secuencias genéticas relacionadas con el

funcionamiento de los sistemas pueden permanecer inalteradas durante toda la vida, sin embargo,

es muy probable que varios patrones de cambio regulen su expresión para adaptarse los cambios

del ambiente (McGowan, Sasaki, D’Alessio, Dymov, Labonté, Szyf, Turecki & Meaney, 2009;

Roth, Lubin, Funk, Sweatt, 2009). Los genes son modificados por medio de varios procesos,

conocidos como metilación de la citocina, modificación de las histonas, remodelación de la

cromatina y otros mecanismos relacionados con el funcionamiento del ARN (Jaenisch & Bird,

2003).

109

La adición del grupo metil a la citosina por medio de la ADN-metiltransferaza (Houvert,

Vallette & Cartron, 2009), facilita los procesos de inhibición del reconocimiento del ADN por

algunas proteínas, o facilitación de las conexiones entre estos (Prokhortchouk & Defossez, 2008).

Se ha observado que varias regiones de los dinucleotidos CpG (citosina-unión de fosfodiester-

guanina) a lo largo del genoma de los mamíferos son metilados (Lister et al., 2009), sin embargo,

se ha destacado que las células cerebrales también tienen otros complementos de citosinas

metiladas observadas en su contexto (Ladd-Acosta, Pevsner, Sabunciyan, Yolken, Webster,

Dinkins, Callinan, Fan Potash & Feinberg, 2007).

Específicamente en el cerebro, los mecanismos de metilación y modificación de histonas

se encuentran ligados con la expresión y regulación dinámica de los genes dependientes de

cambios medioambientales (Tsnakova, Renthal, Kumar & Nestler, 2007). Estos procesos, están

sujetos a cambios funcionales que, consecuentemente pueden formar cambios adaptativos,

necesarios para la sobrevivencia, incluso por generaciones (Lim & Brunet, 2013; Uchida et al.,

2011). Estudios que observan cambios en la conducta alimentaria y el metabolismo de los

alimentos (Wu, Suzuki, 2006; Dunn & Bale, 2009), la acción frente a la presencia de virus

(Rechavi, Minevich & Hobert, 2011) y la presencia de estrés ambiental (Franklin, Russig, Weiss,

Graff, Linder, Michalon, Vizi & Mansuy, 2010; Weiss, Franklin & Mansuy, 2011), corroboran

esta observación.

Específicamente en la microglía, es interesante observar que algunos tipos de ARN no

codificante, ARNmi (microARN), han sido identificados como promotores de procesos

proinflamatorios y antiinflamatorios a largo plazo (Garden, 2013). En estudios se ha destacado

que, por ejemplo, el aumento de los patrones de expresión de miARN-155 -conocido por su papel

en la estimulación de la secreción de IL-12 en las células CD, para la expresión de IFN- γ en

células NK durante la respuesta inmune y otros procesos de apoptosis (Lu, Huang, Zhang,

Roensch, Cao, Nakayama, Blazar, Zeng & Zhou, 2012)-, por medio de la estimulación de los

recetores de tipo toll 4 o mediante la administración con LPS, suprimen en la microglía al

supresor de la proteína supresora de IL-1 (SOCS-1) y aumenta los niveles de iNOs (Cardoso,

110

Guerdes, Pereira de Almeida & Pedroso de Lima, 2012)8. Otros estudios también han relacionado

la regulación de la expresión de iNOS, con la acción de miARN-155 después de la

administración de LPS (Wang et al., 2009).

Otros ejemplos relacionados han revelado que cambios en el ambiente celular pueden

afectar la expresión de genes antiinflamatorios (Garden, 2013). Se ha destacado que cuando las

células microgliales son expuestas a deprivación de oxígeno y glucosa, existen mayores niveles

de concentración de IL-1, iNOS y en especial TNF-α, en contraposición con la disminución de la

expresión de miR-181c en el hipocampo (Zhang, Dong, Li, Hong & Wei, 2012). También se ha

destacado que la sobreexpresión de el miR-424 que se encarga de detener la respuesta

proinflamatoria y citotóxica en áreas afectadas por isquemia cerebral, tiende a suprimir del Iba-1

y la disminución de la producción de TNF- α (Zhao et al., 2013).

La regulación molecular de los patrones de neuroinflamación es dependiente de

mecanismos epigenéticos afectan el desarrollo funcional y anatómico a largo plazo (Garden,

2013) y los cambios de dichos patrones han sugerido influencias hereditables de los sistemas

afectados (Kendler, Gardner & Presscott, 2006; Smith et al., 2011). Lo anterior se ha relacionado

con el proceso de selección artificial de las cepas efectuado en el Laboratorio de Neurociencia de

la PUC-Rio. De manera efectiva, se ha encargado de caracterizar y conservar a lo largo del

tiempo los fenotipos comportamentales característicos de CHF y CLF, sin embargo, aún existen

vacíos en el conocimiento sobre la naturaleza de estos animales y sus aportes a la ciencia. Para

los animales de CHF, se concluye que efectivamente representa un modelo comportamental

valido para el estudio de patologías relacionadas con la ansiedad el pánico y el estrés, ya que se

considera evidente su fenotipo vulnerable. En CLF, por el contrario, se observó que las ratas,

además de tener problemas cognitivos relacionados con la consolidación de la memoria, también

demostraron tener un aumento significativo de los niveles de inflamación, los cuales también

fueron relacionados con la ausencia de consolidación. Aunque se cree que las diferencias

8 Las iNOS son conocidas como mediadoras del control intrínseco de la excitabilidad neuronal y la plasticidad

(Steinert, Chernova & Forsythe, 2010; Steinert, Robinson, Tong, Haustein, Kopp-Scheinpflug & Forsythe, 2011). Se

ha reportado que en bajas concentraciones puede ejercer papeles neuroprotectores por medio de la mediación de la

señalización fisiológica (Brew & Forsythe, 1995) sin embargo, en altas medía otras acciones inflamatorias y

neurotóxicas durante la respuesta inmune (Wang et al., 2009).

111

obtenidas a partir del proceso de fenotipaje son un producto “funcional” de los cambios en la

expresión de algunos genes relacionados a los defectos desde las primeras generaciones, la

información no es suficiente para como afirmar de manera fehaciente las conjeturas relacionadas

durante el experimento con relación a CLF. Se espera que en el futuro se aclaren muchos de los

cuestionamientos obtenidos a partir del fenotipo tan particular de estos animales.

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