IVD-MKT-11-0769-A

Применение методов масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС) в современной клинической лаборатории – обзор

приложений, преимущества использования, современные подходы и возможности автоматизации.

Александр Кирилюк PhD

Москва, ул Краснопролетарская, 7. т. 499-973-92-80

м. 895-803-60-90

2 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Triple Quad

− Количественный анализ

− ID - MRM

− Количественный анализ

− ID - MRM

− ID - MS/MS

QTRAP®

− Количественный анализ

− ID – точность определения массы

− ID - MS/MS и библиотечный поиск

− Ретроспективный анализ

qTOF

Основные типы тандемных масс-анализаторов

Скорости анализа, селективность и чувствительность широкий диапазон

Высокое разрешение Низкое разрешение

Гибрид Тройного квадруполя/Линей

ной ионной ловушки

3 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Компактность и производительность

5 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Роботизация и автоматизированные системы

подготовки образцов

DPX-LC/MS/MS

Load Clean Analyze

8 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Сравнение ГХ/MС и ВЭЖХ/МС/МС

• ГХ/MС часто требует обширной, трудоемкой

пробоподготовки в том числе дериватизацию.

• ГХ/MС протоколы подготовки проб часто являются

специфическими для класса соединений, ограничивая

скрининг аналитов по нескольким классам соединений

• У ГХ/MС меньшая чувствительность и динамический

диапазон

• Трудоемкое обслуживание

10 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Тандемная масс-спектрометрия как замена иммунохимических методов?

Основные проблемы

применения

Применение ИФА Применение масс-

спектрометрии

Проблемы специфичности Хорошо описанные проблемы

кросс-реакций и наложений.

Детекция методом селекции

масс позволяет добиться более

надежных и достоверных

результатов

Низкие пределы

количественного анализа

ИФА тесты достигли своих

пределов количественного

определения

Селективность масс-спектрометра

позволяет снизить пределы

обнаружения и количественного

анализа

Высокие издержки Обычно высокая стоимость,

особенно в случае применения

индивидуальных тестов

Низкие эксплуатационные

расходы и мультиплексный

анализ позволяет снизить

издержки

Дефицит антител

(сложности с созданием новых тест-систем

плюс длинный цикл разработки)

Долгое время разработки новых

тестов

Не требует антител для

разработки новых тестов

* IA costs are higher for a subset of the IA market. For many routine assays, IA offer lower cost per result than LC/MS.

11 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Q0 Q1 Q2 Q3

A

А

C

Y

W

U

Q2 collision

cell

Q3

Analyzer

Q1

Analyzer

Основы Метода тандемной жидкостной хромато-масс-спектрометрии

(ВЭЖХ-МС-МС), с квадрупольным масс-спектрометром

Multiple Reaction Monitoring (MRM)

Лучшая селективность – низкий предел обнаружения и количественного анализа

Одновременный Количественный анализ множества аналитов

A-Y : Количественный анализ

А-W : Подтверждение

C-U : Внутренний стандарт

12 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Применение ВЭЖХ/МС/МС в Клинической Лаборатории

Иммунодепрессанты

Обезболивающие

препараты

Антиретровирусные

препараты

Противосудорожные

препараты

Нейролептики

Антираковые агенты

и многие другие

Более 40 заболеваний

Обмен Жирных кислот

Оксидативные нарушения

Аминокислоты

Ацилкарнитины

Формы гемоглобинов

и многие другие

Стероиды

Витамин D и

метаболиты

T3/T4

Гомоцистеин

Катехоламины

Оротовая кислота

Длинноцепочечные

жирные кислоты

Желчная кислоты

Раковые маркеры

(Пептиды и белки)

Пурины и

пиримидины

и многие другие

Полный скрининг

лекарств

Наркотики

Каннабиоиды

Опиаты

Амфетамины

Бензодиазепины

Обезболивающие

препараты

Барбитураты

и многие другие

Биомаркеры Токсикологическе

исследования

Исследования

врожденных

пороков

метаболизма

Терапевтический

мониторинг

лекарств

13 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Стероиды

14 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Стероидная панель

16 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Витамины D

17 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Анализ витамина D

Дефицит витамина D связывают с различными

заболеваниями такими, как рак, нарушения иммунной

системы, болезни сердца, диабет и другими проблемами со

здоровьем. За последние пару лет это привело к

значительному росту количества исследований связанных с

изучением витамина D.

• ВЭЖХ/МС/МС спектрометрия быстро приобрела статус

референтного метода количественного анализа витамина D

в биологических образцах

18 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

XIC of +MRM (3 pairs): 383.4/211.1 amu from Sample 1 (~ 10 ng/mL) of Robustness-serum 2.wiff (Heated Nebulizer) Max. 8560.0 cps.

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.874 146 219 292 364 437 510 582 655 728 801 873 946 1019

Time, min

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

7500

8000

8500

Inte

ns

ity

, c

ps

2.13

2.64

2.29

2.37 2.54

XIC of +MRM (3 pairs): 383.4/211.1 amu from Sample 1 (~ 10 ng/mL) of Robustness-serum 2.wiff (Heated Nebulizer) Max. 8560.0 cps.

2.00 2.02 2.04 2.06 2.08 2.10 2.12 2.14 2.16 2.18 2.20 2.22 2.24 2.26 2.28 2.30 2.32 2.34 2.36728 735 742 750 757 764 771 779 786 793 801 808 815 822 830 837 844 851 859

Time, min

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

7500

8000

8500

Inte

ns

ity

, c

ps

2.13

2.29

2.26 2.332.24 2.362.22

25-OH-Vit D3

25-OH-Vit D2

ISTD

LOQ 25-OH Vit D2, D3, 1-2 ng/ml on API 4000 LC/MS/MS System

Пример хроматограммы образца OH-витамина-D3 и OH-витамина-D2 выполненных на системе QTRAP

IVD-MKT-11-0769-A

Мониторинг препаратов с узким терапевтическим диапазоном

20 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Иммунодепрессанты

Tacrolimus

(aka FK-506)

MW 822.0

Sirolimus

(aka Rapamycin)

MW 914.2

Cyclosporin A

MW 1202.6

Everolimus

MW 958.2

IVD-MKT-11-0769-A

Скрининг

23 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Анализ образца мочи на 697 лекарств

24 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Caffeine Cetirizine

Verapamil

Venlafaxine

Trimipramine

Oxazepam

Imipramine Codeine

Lamotrigine

D5-Diazepam

Sulpiride

Paracetamol Lisinopril

D3-Doxepin

Пациент страдающий от хронической депрессии и

эпилепсии.

В анамнезе- множественные попытки самоубийства.

Urine diluted 1:10

25 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

XIC of +MRM (508 pairs): Exp 1, 300.100/152.100 amu Expected RT: 2.4 ID: Codeine_1 from Sample 6 (std 5) of 4000 4500 comparison ... Max. 5.0e5 cps.

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0Time, min

0.0

2.0e5

4.0e5

6.0e5

8.0e5

1.0e6

1.2e6

1.4e6

1.6e6

1.8e6

2.0e6

2.2e6

2.4e6

2.6e6

2.8e6

Inte

ns

ity

, c

ps

2.41

Codeine

Fentanyl

Hydromorphone

Meperidine

Methadone

Morphine

Oxycodone

Oxymorphone

Tramadol

+EPI (286.20) Charge (+0) CE (35) CES (15) FT (6.91412): Exp 2, 2.021 min from Sample 6 (std 5) of 4000 4500 comparison 508 TRAN... Max. 2.2e7 cps.

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480m/z, Da

0.0

1.0e6

2.0e6

3.0e6

4.0e6

5.0e6

6.0e6

7.0e6

8.0e6

9.0e6

1.0e7

1.1e7

1.2e7

1.3e7

1.4e7

1.5e7

1.6e7

1.7e7

1.8e7

1.9e7

2.0e7

2.1e7

2.2e7

Inte

ns

ity

, c

ps

286.0

185.3

157.1

153.1199.2 227.2181.2128.2 243.2

155.2 211.2173.0 268.3187.2 287.9141.5

EPI Hydromorphone

+EPI (248.20) Charge (+0) CE (35) CES (15) FT (250): Exp 2, 3.666 min from Sample 6 (std 5) of 4000 4500 comparison 508 TRAN epi.... Max. 5.0e5 cps.

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320m/z, Da

0.0

2.0e4

4.0e4

6.0e4

8.0e4

1.0e5

1.2e5

1.4e5

1.6e5

1.8e5

2.0e5

2.2e5

2.4e5

2.6e5

2.8e5

3.0e5

3.2e5

3.4e5

3.6e5

3.8e5

4.0e5

4.2e5

4.4e5

4.6e5

4.8e5

5.0e5

Inte

ns

ity

, c

ps

247.9

220.2

174.2

131.2176.2

129.2249.5

202.2184.491.1 172.1103.0 145.1 158.3 246.1

EPI Meperidine

+EPI (337.20) Charge (+0) CE (35) CES (15) FT (13.6662): Exp 2, 4.384 min from Sample 6 (std 5) of 4000 4500 comparison 508 TRAN... Max. 6.3e6 cps.

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480m/z, Da

0.0

5.0e5

1.0e6

1.5e6

2.0e6

2.5e6

3.0e6

3.5e6

4.0e6

4.5e6

5.0e6

5.5e6

6.0e6

6.3e6

Inte

ns

ity

, c

ps

337.2

188.3

216.1134.2105.0 146.4

EPI Fentanyl

Simple “dilute and shoot”

sample preparation

•508 transitions monitored

•2 transitions per compound

•sMRM-IDA-EPI

•10 µL injection

Спектральное подтверждение на QTRAP® Системе

• Phenomenex Kinetex C18

IVD-MKT-11-0769-A

Наследственные болезни обмена веществ

28 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Снижение активности фермента

А В С

А1,А2

фермент 1 фермент 2 ген1

Снижение количества продуктов реакции

Мутации в гене

Увеличение

количества субстрата

Увеличение содержания производных субстрата

в биологических жидкостях или тканях

29 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Аутосомно-рецессивный тип наследования

Фенилкетонурия 1:8 000

Болезнь Тея-Сакса 1:120 000

(среди евреев-ашкенази) 1:3 000

Болезнь Гоше 1:40 000

Болезнь Краббе 1:100 000

Х-сцепленный рецессивный тип наследования

Х-сцепленная адренолейкодистрофия 1:40 000

Мукополисахаридоз тип II 1:70 000

Наследственные нарушения метаболизма – редкие аболевания.

Частота встречаемости: Заболевания Частота

30 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Зачем выявлять НБО?

НБО – обширный класс редких моногенных

болезней, но суммарная частота встречаемости их

достаточно высока (около1:5000 новорожденных).

Многие из НБО поддаются лечению. Для некоторых

возможно полная клиническая коррекция.

31 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Массовый скрининг новорожденных

• Во всех странах проводится массовое обследование

новорожденных на некоторые из НБО (фенилкетонурия)

• Современные технологии позволяют проводить скрининг на

многие из НБО. Но для их диагностики необходимо

уникальные и дорогостоящие биохимические тесты, а

частота их в популяции не велика, что не позволяет

включать их в программу массового скрининга на НБО.

32 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Тандемная масс спектрометрия- современная технология диагностики НБО

В некоторых странах скрининг включает 30-40 форм НБО

Позволяет анализировать большое число метаболитов, а

значит выявлять большое число наследственных нарушений

обмена веществ

Время анализа одного образца- несколько минут

Требуется небольшое количество биологического материала

В мировой практике здравоохранения этот метод используют для

проведения массового скрининга новорожденных на

наследственные болезни обмена веществ (НБО). В пятне

высушенной крови возможно определение аминокислот (в том

числе и фенилаланина) и ацилкарнитинов. Количественное

определение этих веществ позволяет исключать несколько

десятков наследственных заболеваний, относящихся к

различным классам НБО (нарушения метаболизма аминокислот,

органических кислот и дефектов митохондриального b-окисления

жирных кислот).

33 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Анализ аминокислот и ацилкарнитинов в сухих пятнах крови

• Реагенты и стандарты

• Данные для диагностики около 40

заболеваний, связанных с

наследственными нарушениями обмена

веществ полученные в результате анализа

сухого пятна крови

• Простая конфигурация оборудования – не

требуется хроматографическое разделение

34 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

• 3 пятна

• Индикатор влажности

• Индикатор температуры

35 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Альтернативные Системы Автоматической Экстракции

36 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

+NL (102.20): Exp 2, 0.279 to 1.423 min from Sample 13 (Low 2 derv) of 2... Max. 2.8e5 cps.

140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270m/z, Da

0.0

5.0e4

1.0e5

1.5e5

2.0e5

2.5e5

2.8e5

Inte

ns

ity

, c

ps

191.4

172.3

227.3188.3

249.3150.4

146.3260.3

222.3

242.4

209.3

238.3186.3

193.3 246.3182.4174.3212.2

190.2 206.2185.2 192.3162.3 217.3 241.4228.3 261.3178.4 250.3231.2160.3 187.4149.5 210.2203.4147.4 163.3 194.4

Alanine

Valine Methionine

Glutamic acid

Aspartic acid Phenylalanine

Tyrosine

Leucine/Isoleucine

Анализ Аминокислот

37 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Пример данных для аланина

+NL (102.20): Exp 2, 0.279 to 1.359 min from Sample 12 (Low 1 derv) of 2... Max. 2.6e5 cps.

140 142 144 146 148 150 152 154 156m/z, Da

0.00

1.00e4

2.00e4

3.00e4

4.00e4

5.00e4

6.00e4

7.00e4

8.00e4

9.00e4

1.00e5

1.10e5

1.20e5

Inte

ns

ity

, c

ps

150.4

146.3

149.5147.4 151.3

Alanine Alanine-d4

Identification of

target analytes

38 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Фенилкетонурия: (1 на 10000)

Phenylalanine Tyrosine

PAH

>240mmol/L Phenylalanine hydroxylase

39 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Пример выявления фенилкетонурии (PKU)

IVD-MKT-11-0769-A

Врожденная Гиперплазия Коры Надпочечников (ВГКН)

41 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Расширение протокола скрининга НБО

Включение в анализ определенных стероидов связанных с ВГКН,

используя упрощенную подготовку образцов в сочетании с

полностью автоматизированным рабочим процессом.

IVD-MKT-11-0769-A

Спасибо

akirilyuk@khimexpert.ru

IVD-MKT-11-0769-A

Количественный анализ высоко-молекулярных соединений

44 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Трипторелин

Противоопухолевый препарат, синтетический аналог

гонадотропин-рилизинг гормона (входит в список Жизненно

Необходимых и Важнейших Лекарственных Препаратов)

Подавляет секрецию ЛГ, ФСГ и соответственно функцию

яичек и яичников. Вследствие этого происходит

ингибирование секреции эстрогенов яичниками до состояния

менопаузы, а также снижение секреции тестостерона.

Применение: Эндометриоз, миома матки, программа ЭКО,

раннее половое созревание, гипогонадотропная аменорея.

Симптоматическое лечение прогрессирующего

гормонозависимого рака предстательной железы

(альтернатива хирургической кастрации).

45 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Количественный анализ высоко-молекулярных соединений

• Трипторелин это декапептид. GnRH агонист

• Подобно другим GnRH агонистам, Трипторелин может

использоваться во вспомогательной репродукции и при

лечении гормонально зависимых раков

C64H82N18O13

Molecular Mass: 1311.5 g/mol

Вызов → Требуется очень низкий предел обнаружения

46 © 2014 AB SCIEX IVD-MKT-11-0769-A

Signal at LLOQ – Matrix Curve QTRAP® 5500 System

• QTRAP 5500 system signal at

LLOQ (40 pg/mL) ‒ 6 replicates were performed

‒ 305 amol on column:

‒ Area %CV- 9.7

‒ Accuracy – 102.8 %