Unidad 4. Genética microbiana

ObjetivosConocer

-Los mecanismos de la herencia

-La relación entre la estructura y función del gen

-Las diferentes aplicaciones de la microbiología

-Los fundamentos de la regulación genética

AsimilarLa información genética se transmite con gran fidelidad, y las mutaciones

tienen un gran significado evolutivo

Comprender y discutirLas ventajas e inconvenientes del desarrollo de la Biotecnología

UNIDAD IV.- Genética microbianaTema 9.-.Principios generales (8h): Introducción. Estructura del ADN y el ARN. Replicación. Estructura de gen. Transcripción. Traducción. Regulación. Recombinación. Transferencia horizontal. Plásmidos. Transposones. Conjugación. Transformación. Transducción. Estructura de los genomas. Genomica, transcriptómica y proteómica. Mutaciones. Reparación

Términos y conceptos• genética: estudio de la herencia• gen: segmento de ADN que

codifica un producto funcional• genoma: la suma de todo el

material genético de un organismo o virus o viriones

• haploide – un serie de genes

• diploide – dos series de genes

• clon: población de células que son genéticamente idénticas

• genotipo: serie específica de genes que posee un organismo o virus

• fenotipo: serie de características observables

El ADN como material genético• se estableció a través de varios

experimentos críticos– Fred Griffith (1928)– Oswald T. Avery, C. M.

MacLeod, and M. J. McCarty (1944)

– Alfred D. Hershey and Martha Chase (1952)

Experimento de transformación de Griffith con neumococos Introducción

Estructura del ácido nucleíco

El experimento de Alfred D. Hershey y Martha Chase (1952)Introducción

El Dogma central

El ADN como material genético (continuación)

nucleósido = base nitrogenada + azucar pentosa

Enlace fosfodiester

Estructura del ADN

• base nitrogenada– A, T, G, C

• azúcar pentosa– desoxirribosa

• normalmente una doble hélice compuesta de dos hebras complementarias

– reglas de emparejamiento • A con T• G con C

las dos cadenas de polinucleótidos son antiparalelas

Estructura del ADN y el ARN

Estructura del RNA• bases nitrogenadas

– A, G, C, U (en lugar de T)

• azúcar pentosa– ribosa

• en general se compone de una sola hebra– puede enrollarse alrededor de si mismo

• forman estructuras con forma de horquilla (hair-shaped structures) con apareamiento de bases complementarias y organización helicoidal

• reglas de apareamiento– A con U

– G con C

Tipos de RNA• Cuatro tipos

– RNA ribosómico (rRNA)

– RNA transferente (tRNA)– RNA mensajero (mRNA)– RNA reguladores: Pequeños RNA (snRNA)

-pequeñas moléculas encontradas en el núcleo eucariota-, aRNA (antisense RNA) y RNAi (RnA interferente)

• difieren por su estructura y función

Organización del ADN en la célula

círculo cerrado en su forma extendida

forma superenrrollada

• en eucariotas– moléculas lineales– asociadas con

histonas– enrolladas en

unidades repetidas denominadas nucleosomas

• difiere entre eucariotas y procariotas• en procariotas

– círculo cerrado en forma superenrrollada asociado con proteínas básica

Estructura del ADN y el ARN

Replicación DNA• proceso complejo que implica a numerosas enzimas y proteínas• en general, el proceso es similar en todos los organismos• semiconservativa

– cada hebra parental es conservada– las dos hebras parentales se separan y sirven de molde para la síntesis de una

nueva

•en procariotas-bidireccional desde un único origen de replicación -replicón

porción del genoma que contiene un origen y se replica como una unidad

• en eucariotas

– bidireccional

– múltiples orígenes de replicación

Horquilla de replicación

las dos horquillas de replicación se mueven en sentido contrario

Replicación

Mecanismo del círculo rodante

Replicación DNA (continuación)

• mecanismo del círculo rodante– se observa durante la replicación de pequeños

genomas circulares

– ej.: la conjungación de algunos plásmidos y la replicación de algunos virus y viriodes

Replicación

Mecanismo de la replicación del ADN

-la mejor conocida es la de Escherichia coli-se cree que la de eucariotas es similar-la ADN polimerasa III sintetiza el ADN

Helicasas: desenrollan las hebras; Girasas: liberan la tensión del desenrollamiento

Sintetizado por la primasa (primosoma) SSB

SSB: proteínas de unión al ADN monocatenario. Mantienen separadas las dos hebras desenrolladas

Cadena conductora: Síntesis continua. La hebra se extiende 5’-> 3’ desde su extremo

Cadena rezagada: Síntesis discontinua.

ADN ligasa: Une los fragmentos de ADN

Movimiento de la horquilla

Replicación

Mecanismos de la ADN polimerasa III Mecanismos de la ADN ligasa

Replicación

Modelo hipotético de la actividad en la horquilla de replicación: el modelo se recoge en cinco etapas.

1. Las DNA girasa, las helicasas y las proteínas de unión (SSB) desenrollan el DNA para producir segmentos monocatenarios

2. El primosoma sintetiza un cebador de RNA

3. El replisoma tiene dos complejos de DNA polimerasa III. Una polimerasa copia de forma continua la cadena conductora. La cadena rezagada forma un lazo a través de la otra polimerasa para que ambas cadenas puedan replicarse simultáneamente. Cuando la DNA polimerasa III se encuentra con un fragmento de Okazaki completo libera la cadena rezagada

4. La DNA polimerasa I elimina el cebador de RNA y rellena los huecos con DNA complementario

5. La DNA ligasa sella los huecos y une los dos fragmentos

1

2

3

4

5

Replicación

Algunos datos curiosos sobre la replicación∀ ≥ 30 proteínas se requieren para replicar el cromosoma de E. coli• se realiza con gran precisión

– frecuencia de error = 10-9 o 10-10 por base replicada– gracias a la actividad de comprobación y corrección de la ADN polimerasa I y III

• es muy rápida– en procariotas de 750 a 1,000 pares de bases/s– en eucariotas de 50-100 pares de bases/s

Replicación

Estructura del Gen• gen

– secuencia lineal de nucleótidos con unos puntos determinados de inicio (el tsp) y de terminación (el terminador)

– codifica un polipéptido, un tRNA, un rRNA o snRNA o algún otro tipo• cistrón – gen que codifica un polipeptido

• Marco de lectura (ORF)– organización de codones tal que pueden ser leídos de forma que dan lugar a un

producto genético

5’

5’

3’

3’

N-terminal C-terminal

Transcripción

Traducción

Estructura del gen

Promotor: secuencia de nucleótidos que sirve de reconocimiento y unión a la RNA polimerasa

Sentido de la RNA polimerasa

Región codificante: región que especifica la secuencia de aminoácidos en un polipéptido

Hebra molde: hebra que contiene la información codificante y dirige la síntesis de RNA

Estructura del gen

Estructura de un promotor

tsp

Estructura del gen

transcripción

Región líder: secuencia 5’ que es transcrita pero no es traducida

Secuencia Shine-Dalgarno o secuencia de unión a los ribosomas: sitio de reconocimiento del ribosoma

Región remolque: secuencia 3’ que es transcrita pero no es traducida

Terminador: señal de la terminación de la transcripciónEstructura del gen

Estructura del gen

La transcripción de DNA produce 4 tipos de RNA tRNA, rRNA, mRNA y RNA reguladores

frecuentemente da como resultado mRNA poligénico (policistrónico)

Catalizado por un única RNA polimerasa compuesta por el núcleo del enzima (α2ββ′) y un factor sigma que dirige el núcleo central al promotor.

Los terminadores procariotas son de dos tipos:•dependientes del factor rho (no tienen poli U y a menudo no forman hairpin•hairpin + 6 uridinas

Transcripción en procariotas:

Diferentes factores sigma permiten a la RNA polimerasa reconocer diferentes promotores

Transcripción

exón intrón

Maduración del RNA “RNA splicing”

monogénico

RNA nuclear heterogéneo

5′ cap of eucaryotic mRNA

Transcripción en eucariotas• Tiene varias RNA polimerasas• mRNA monogénico• Los promotores contienen tres elementos comunes

– la caja TATA~ 30 bases antes del inicio de la transcripción– la caja CAAT~ 75 bases antes del inicio de la transcripción– la caja GC ~ 90 bases antes del inicio de la transcripción

Transcripción

La maduración del Pre-RNA se produce en un complejo de gran tamaño que se denomina partícula procesadora (spliceosome) que contiene el pre-RNA, snRNAs y proteínas

Algunas moléculas de rRNA sufren un proceso de automaduración y constituyen lo que se denomina Ribozimas: Moléculas de RNA con actividad catalítica.

Transcripción

El Código genético

• Forma en la que se almacenan en el genoma las instrucciones genéticas para las síntesis de polipéptidos

• colinearidad:– la secuencia de pares de bases de ADN corresponde a secuencias de

aminoácidos en el polipéptido codificado• los codones codifican para aminoácidos específicos (en general 20

aminoácidos salvo algunos casos en los que emplean seleniocisteina, seleniometionina o pirrolisina –en algunas arqueas)

• se emplea un código de 3 bases combinando las 4 que componen el RNA (A, U, G, C)

• 64 combinaciones posibles (43) (61 tripletes con sentido para aminoácidos y 3 sin sentido o codones de terminación)

• los aminoácidos son codificados por más de un codón

Traducción

biotecnología ya que cuando se transfiere un gen de un organismo a otro el gen solo será interpretado si el organismo receptor posee los codones necesarios

•el código genético está degenerado es decir existen hasta 6 codones diferentes para un determinado aminoácido•el código genético es casi universal

•el de la tabla se aplica a casi todos los procariotas (bacterias y arqueas)•en los genes mitocondriales de plantas y microorganismos UGA codifica triptófano en lugar de terminación. Este mismo codón puede codificar seleniocisteina•en algunas arqueas UAG codifica pirrolisina•algunos ciliados (como Paramecium) y la bacteria Mycoplasma tienen códigos ligeramente diferentes

•todos los organismos no emplean los mismos codones es decir no tienen los 61 tRNAs necesarios para interpretar el código completo•La diferencia en el uso de codones de un organismo a otro es muy importante en

• a veces la secuencia de nucleótidos del mRNA puede ser alterada en lo que se denomina RNA editing (en plantas el codón nuclear CGG es convertido en UGG)

Traducción

Balanceo (Wobble)Se denomina a la flexibilidad en las reglas de apareamiento

• perdida del apareamiento entre bases– la tercera posición del codón es menos importante que la primera o segunda

posición• evita que las células tengan que sintetizar tantos tRNA diferentes

• minimiza el efecto de las mutaciones

• La inosina (I) es un nucleósido que puede aparearse con la adenosina, la citosina y el uracilo

• La inosina se obtiene mediante la desaminación de la adenina (otra forma de edición del tRNA)

Traducción

El ribosoma

• procariotas– 70S ribosomas = subunidades 30S + 50S

• eucariotas– 80S ribosomas = subunidades 40S + 60S– los ribosomas mitocondriales y cloroplásticos se asemejan a los ribosomas

procariotas

El ribosoma 70S

permite alinear el ribosoma con el mRNA uniéndose a la RBS

otros rRNAs – pueden tener un papel catalítico

20 nm

Traducción

Los genes que codifican los genes del tRNA tienen región promotora, líder, codificante, espaciadora y remolque

La región líder, espaciadora y remolque se eliminan durante la maduración

Los genes que codifican los genes del rRNA también tienen región promotora, líder, codificante, espaciadora y remolque

las regiones espaciadoras y de remolque pueden codificar moléculas de tRNA

Genes que codifican tRNA y rRNA

Precursor tRNA

Traducción

Síntesis de proteínas (iniciación, elongación y terminación)• traducción

– la secuencia de nucleótidos del mRNA se traduce en una secuencia polipeptídica

• el sentido de la síntesis es N terminal → C-terminal• el sitio de traducción es el ribosoma que puede formar complejos polirribosómicos:

mRNA y varios ribosomas

tRNA y activación de los aminoácidos (AAs)• unión del aminoácido al tRNA• catalizado por las aminoacil tRNA sintetasas

complementario al codón del mRNA

lugar de unión del aminoácido

Los brazos D y Ψ tienen pirimidinas poco frecuentes

– en general hay, como mínimo, uno para cada AA– en algunos casos un mismo aminoacil tRNA sintetasa es

bifuncional

• Ambas cargan inicialmente la forma ácida y luego la aminan

• una misma aminoacil tRNA sintetasa puede activar glutámico y glutamina

• otra aminoacil tRNA sintetasa puede activar tanto aspártico como asparragina

Traducción

↓ resto del tRNA

aminoácido

tRNA y activación de los aminoácidos (AAs) (Continuación)

Glutamil tRNA sintetasa unida al tRNA y al ATP

Traducción

extremo 3’ del tRNA

Iniciación de la síntesis de proteínas• implica a las subunidades ribosomales y a numerosas moléculas adicionales

– aminoacil-tRNA iniciador• N-formilmetionina-tRNA – es el tRNA iniciador bacteriano• eucariotas y arqueas emplean metionina-tRNA

– factores de iniciación (IFs)• Posicionan adecuadamente el ribosoma en el extremo 5’ del mRNA

Traducción

initiationcodon

Codón de iniciación

Elongación de la cadena polipeptídica• Sitios de unión al tRNA en los ribosomas

– sitio P (sitio peptidil o donador): une al tRNA iniciador o al peptidil-tRNA creciente– sitio A (sitio aminoacil): une el aminoacil-tRNA que se incorpora– sitio E (sitio de salida): al que se une brevemente el tRNA saliente

• ciclo de elongación– adición secuencial de aminoácidos a la cadena polipeptidica – tiene tres fases

• unión del aminoacil t-RNA• reacción de transpeptidación• translocación

– implica numerosos factores de elongación (EFs)

Reacción de transpeptidación

Traducción

Transpeptidación: Catalizado por la peptidil transferasa (localizada en la 50S). El péptido crece en un aminoácido y se transfiere al sitio A

Traducción

Translocación

• el peptidil t-RNA se desplaza del sitio A al sitio P

• el ribosoma desplaza un codón a lo largo del mRNA para que un nuevo codón se sitúe en el sitio A

• el tRNA vacío abandona el sitio P con ayuda de una translocasa (EF-G)

Traducción

Terminación de la síntesis de proteínas

• tiene lugar en alguno de los siguientes codones de terminación

– UAA, UAG, and UGA– UAA es el más frecuente

• tres factores de liberación (RFs)– ayudan a reconocer los codones de

terminación

• dominios– regiones del polipéptido estructuralmente

independientes– separadas unas de otras por porciones de

polipéptidos menos estructuradas

• en eucariotas– los dominios se pliegan independientemente y

correctamente después de su síntesis– los chaperones moleculares no son importantes

• en procariotas– el polipéptido no se pliega hasta que se sintetiza el

polipéptido completo– los chaperones moleculares son importantes

Plegamiento de proteínas – eucariotas versus procariotas

Traducción

Plegamiento de la proteína y chaperomes moleculares

• Chaperones moleculares– ayudan al

plegamiento del polipéptido naciente

– protegen a la célula contra el daño térmico

• ej.:.HSP, heat-shock proteins

– ayudan en el transporte de las proteínas a través de la membrana

TraducciónImpiden que el polipéptido se pliegue inadecuadamente durante su síntesis

Permite la liberación de DnaK y DnaJ

Permiten el plegamiento final

Maduración de proteínas

• eliminación de una parte del polipéptido antes del plegamiento – inteinas – porción eliminada– exteinas – porción que permanece en la proteína

Traducción

• Fueron descubiertas en 1990 en el gen de una ATPasa vacuolar de Saccharomyces cerevisiae

• Actualmente se han identificado más de 100 en los 3 dominios de los seres vivos

Regulación

Regulación•Control de los elementos y procesos celulares.

•A corto plazo (segundos) los seres vivos pueden modificar la actividad de numerosos componentes celulares a través de modificación covalente de proteínas (modificación postraduccional). Esto no modifica la cantidad de proteínas sino su actividad.

•Ej: fosforilación de proteínas

•También, a corto plazo, puede alterar la estabilidad de las proteínas aumentando la degradación de proteínas frente a su síntesis

•Ej.: activando la proteolisis

•A largo plazo pueden modificar la expresión de los genes, la estabilidad de los transcritos, y la traducción

•Ej: Regulación genética

Observación: Los genes y operones se escriben en minúscula y cursiva y los productos de su expresión en mayúscula normalEj.:el gen lacZ codifica la proteína LacZ

Tipos de expresión del mRNA:• Constitutiva: No hay control sobre su expresión, los genes (denominados constitutivos) se expresan igual en cualquier circunstancia independientemente de las

condiciones ambientales. Algunos de estos genes codifican enzimas constitutivos • Adaptativa: Se controla su expresión, los genes están regulados. Pueden dar lugar a enzimas inducibles y a enzimas reprimibles

Regulación

• enzimas inducibles– su nivel se eleva en presencia de un inductor

• pequeña molécula, en general un sustrato de una ruta catabólica en la que participa el enzima. De esta forma solo se inducen cuando son necesarios

• enzimas reprimibles– su disminuye en presencia de un co-represor

• en general, es el producto final de una ruta en la que el enzima participa

• Ventajas– regulación de la expresión génica (la síntesis de un determinado mRNA)– permite conservar la energía y materia prima– mantiene el balance entre las diversas proteínas celulares– permite la adaptación, a largo plazo, a los cambios en el entorno

Regulación de la síntesis de mRNA

• Desventajas– requiere el desarrollo y mantenimiento de sistemas reguladores

Tipos de regulación genética• Control del inicio de la transcripción

– Regulación negativa

– Regulación positiva

• Control de la terminación de la transcripción– Atenuación

– Antiterminación

• Control de la traducción• Control de la estabilidad del transcripto• Regulación con factores sigma• Regulación con RNA antisentido• Otros tipos

– Metilación de ADN

– Superenrrollamiento del ADN

Regulación

Control negativo

Un operón

promotor operador

• el objetivo es sintetizar el enzima de una ruta solo cuando el sustrato de la ruta está disponible

en general un sustrato de la ruta. Inactiva al represor

Genes estructurales

Genes estructurales

Control negativo de una ruta catabólica1. Genes transcritos

2. Genes no transcritos

Represor activo

Represor inactivoInductor

• la presencia de una proteína reguladora (el represor) en el lugar de regulación (el operador) disminuye la síntesis de mRNA

• proteínas represoras – existen en forma

activa e inactiva– inductores y

correpresores modifican la actividad del represor

• se ejercen sobre el operador

Regulación (Control del inicio de la trasncripción)

Control negativo(continuación)

en general un producto final de una ruta. Activa al represor

promotor operador

Genes estructurales

Genes no transcritosControl negativo de una ruta biosintética

Un operón

Genes estructurales

Genes transcritos

• el objetivo es sintetizar el enzima de una ruta solo cuando el producto final de la ruta no está disponible

Regulación (Control del inicio de la transcripción)

Control positivo• la presencia de una proteína reguladora (activador)

en la región reguladora promueve la transcripción• ej., operón lactosa

– regulada por la proteína CAP (proteína activadora del catabolismo) y el AMP cíclico (cAMP)

• CAP también se denomina CRP (proteína receptora de cAMP)

CAP: puede funcionar tanto como controlador positivo como negativo

reconoce y se une a la región reguladora del operón lac

Regulación (Control del inicio de la trasncripción)

en nivel de cAMP depende de las condiciones ambientales

Control positivo de una ruta biosintética

• se ejerce sobre el promotor

Regulación (Control del inicio de la trasncripción)

Sistemas globales de regulación• afecta a numerosos genes y rutas simultáneamente• regulón

– colección de genes o operones controlados por una proteína reguladora común. Ej. El regulón CRP

Represión por catabolito• tiene lugar cuando el operón está controlado por

otro catabolito distinto al sustrato inicial de la ruta

• permite el empleo preferente de un nutriente frente a otro cuando ambos están disponibles

– una fuente de carbono frente a otra (glucosa frente a lactosa)

– un fuente de nitrógeno frente a otra (amonio frente a nitrato)

• ej., represión por catabolito de la lactosa y otros operones por glucosa– la glucosa, a través del sistema fosfotransferasa, inhibe una adenilato ciclasa (enzima que

sintetiza cAMP) y disminuye los niveles de cAMP, esto bloquea la unión de la proteína CAP al operón de la lactosa y disminuye las síntesis de mRNA y,en consecuencia la de proteína.

– En ausencia de glucosa el cAMP aumenta y la proteína CAP activa la transcripción de numerosos operones lac, gal ara.

La lactosa no se consume hasta que toda la glucosa ha sido consumida

Crecimiento en el que el organismo cambia de estrategia metabólica

Regulación (Control del inicio de la trasncripción)

Regulación del operón galEl operón gal de E. coli consiste en 3 genes estructurales: GalE, GalT y GalK que son transcritos desde dos promotores solapados PG1 y PG2 . La regulación es compleja ya que GalE (una epimerasa que convierte UDP-glucosa en UDP-galactosa) es necesaria para la formación de UDP-galactosa para biosíntesis de la pared celular incluso cuando no emplea galactosa como fuente de carbono.Igual que el operón lac, el operón gal es controlado por CAP-cAMP. Este regulador se une en la región -35 activado las transcripción desde PG1 e inhibiendo la transcripción desde PG2.

Cuando las células crecen en glucosa (no se forma complejo CAP-cAMP) la transcripción tiene lugar desde PG2.

El represor del operón es GalR, que a gran concentración, forma tetrámeros que se unen a los dos operadores y reprime por completo la transcripción. A baja concentración, GalR forma dímeros que se unen a un solo operador y permiten la actividad del promotor PG2

Regulación (Control del inicio de la trasncripción)

Atenuación• regulación de la transcripción modificando el comportamiento de los ribosomas

– el avance de los ribosomas depende de la presencia de los aminoácidos necesarios en la traducción. Si estos no están presentes la traducción no avanza.

• observado en bacterias en las que la transcripción y la traducción se simultanean (la traducción de un mRNA tiene lugar a medida que éste es sintetizado)

– el avance de la transcripción depende de las estructura del mRNA que se está sintetizando. La formación de una horquilla de terminación provoca la terminación de la transcripción. En presencia de ribosomas la estructura puede ser distinta.

• operón que codifica las enzimas para la ruta biosintética del triptófano• esta regulado por una proteína represora, TrpR, bajo el control del triptófano como correpresor•el objetivo es no iniciar la transcripción si el triptófano ya está disponible

• también está regulado por atenuación• el objetivo es terminar la transcripción si el triptófano ya está disponible

ej.: el operón triptófano en Escherichia coli

Regulación (Control de la terminación de la trasncripción)

ej.: el operón triptófano en Escherichia coli

región líder del operón

Estructura del mRNA en ausencia de ribosomas. Los segmentos 1 y 2 y 3 y 4 se aparean

Región líder entre el operador y el primer gen estructural trpE: contiene un atenuador y la secuencia de un péptido líder

AtenuadorSecuencia del péptido lider

Codones de triptófano (Trp)

• Se basa en la capacidad que tiene el RNA de la región líder de formar tres estructuras secundarias de RNA (los segmentos numerados (1, 2, 3,4) contienen secuencias complementarias):

•la pausa de transcripción •La horquilla formada por los segmentos 1 y 2 arresta momentáneamente la transcripción

•el antiterminador alternativo•La horquilla formada por los segmentos 2 y 3 impide la formación del terminador

•el terminador de transcripción•La horquilla formada por los segmentos 3 y 4 y la secuencia poli-U forman un terminador de transcripción

En presencia de ribosomas y Trp el péptido líder se sintetiza hasta su codón de terminación. Debido a la presencia de ribosomas los segmentos 1 y 2 no se aparean. Los segmentos 3 y 4 si se aparean y forma un terminador de transcripción

Terminador independiente de Rho

Regulación (Control de la terminación de la transcripción)

Se transcribe el operón

No se transcribe el operón

No se transcribe el operón

No se traduce el mRNA

Triptófano disponible para formar trp-tRNA

Ausencia de triptófanoAusencia de triptófano

Un ribosoma sintetiza el péptido líder y se detiene en el codón de terminación

Un ribosoma se detiene en los codones para trp en la región 1 y obliga a la región 2 a unirse con la 3. La región 4 permanece monocatenaria y no se forma el sitio de terminación

Regulación (Control de la terminación de la transcripción)

Regulación (Control de la terminación de la transcripción)

Yanofsky C (2000) Transcription attenuation: once viewed as a novel regulatory strategy. J Bacteriol. 182:1-8.

Transcripción de la región líder del operón trp de E. coli. Las parejas de números 1:2, 2:3, y 3:4 corresponden a las parejas de segmentos de RNA que forman estructuras secundarias (la estructura de pausa inicial de la transcripción (1:2), el antiterminador (2:3), y el terminador (3:4)).

Cuando la RNA polimerasa se une al promotor trp e inicia la transcripción, la polimerasa se detiene en el loop de pausa 1:2. Si un ribosoma no se une rápidamente al mRNA (un indicador de limitaciones en la síntesis de proteínas) entonces se forma un terminador con los segmentos 3:4 y la RNA polimerasa es desprendida léntamenteLa unión de un ribosoma al complejo en pausa también desprende la RNA polimerasa. •Si hay un adecuado suministro de Trp el ribosoma continua hasta el codón de terminación del péptido líder. Esto bloquea la formación del antiterminador 2:3 y se forma el terminador 3:4, parando la transcripción.•Si no hay Trp el ribosoma continua hasta el codón Trp-Trp. Esto impide la formación del loop 1:2, lo que favorece la formación del antiterminador.

Regulación (Control de la terminación de la transcripción)

Control de la traducción

Un ejemplo es el del gen pyrC que codifica la dihidroorotasa, un enzima de la biosíntesis de piridina.

• Los niveles del enzima varían hasta 10 veces en función de la disponibilidad de piridina sin que para ello se modifiquen los niveles de mRNA

• La transcripción puede comenzar en cualquiera de los siguientes 4 nucleótidos: 5’ CCGG 3’

• Cuando las pirimidinas están en exceso se inicia por la citosina 2 y se permite la formación de un bucle que impide la unión de los ribosomas a la RBS

• Cuando las pirimidinas no están en exceso la transcripción comienza por Guanina 4. Entonces no se forma el bucle y los ribosomas se pueden unir

Regulación

Regulación con factores sigma y control de la esporulaciónRegulación

• diferentes factores sigma reconocen diferentes promotores• sustitución de los factores sigma modifican la expresión de los genes

y operonesEj. Bacillus subtilis factores sigma y esporulación• se sintetizan solo cuando la célula cambia de un crecimiento

vegetativo a esporulación• da lugar a la trascripción de genes relacionados con la esporulación

Ciclo de la formación de esporas de Bacillus sp.

Muerte programada de la célula madre en el desarrollo de la esporulación de B. subtilis.

Las señales ambientales e internas son integradas al nivel de Spo0A, que activa la cascada de los factores sigma de esporulación. El factor sigma terminal K controla el final de la esporulación –la formación del cortex, la cubierta y la expresión de las autolisinas CwlC and CwlH-

RNA antisentido y el control de las porinasRegulación

• RNA antisentido (antisense RNA)– tiene secuencias complementarias a algunos componentes del mRNA necesarios

para su expresión (RNA diana)– se une al RNA diana e inhibe su función

Ej.: Porinas (proteínas de la membrana externa)• diferentes porinas son producidas bajo diferentes condiciones

– E. coli sintetiza la proteína OmpC cuando crece en el intestino y la porina OmpF en ambientes diluidos

• El RNA antisentido micF se une al mRNA que se traducirá en OmpF y bloquea su traducción cuando la bacteria está en el intestino

Altuvia, Shoshy and Wagner, E. Gerhart H. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 9824-9826

RegulaciónRegulación de RNAs diana a través de OxyS (recuadro izquierdo) y DsrA (recuadro derecho).Los RNAs diana se muestran en azul y el antisentido en rojo. Las regiones de interacción se muestran en verde (no se guarda proporcionalidad en los tamaños). Los signos positivos y negativos indican activación e inhibición respectivamente. RBS indica la posición aproximada del sitio de unión a los ribosomas. Hfq es el factor Q del huésped. Los pares de círculos anaranjados representan los ribosomas.

Sistema de fosfotransferencia de dos componentes

• Ej.: Esporulación en Bacillus subtilis• Ej.: Quimiotaxis en Escherichia coli

• la transferencia de grupos fosforilo controla la transcripción de genes y la actividad de proteínas

• En el sistema de dos componentes el primer componente percibe una señal en su extremo N-terminal y se autofosforila en su extremo C terminal. El segundo componente regula su respuesta en función del fosfato que le transfiere el primer componente

Regulación

La activación de las quinasas A y B inicia un sistema de fosfotransferencia de dos componentes que activa al regulador de la transcripción Spo0A

• Ej.: Quimiotaxis en E. coli

Sistema de fosfotransferencia de dos componentes (continuación)Regulación

El sistema de quimiotaxis está diseñado para controlar la rotación flagelar en dirección contraria (ccw) o a favor (cw) de las agujas del reloj.

Regulación

Mazurie et al. Genome Biology 2005 6:R35 doi:10.1186/gb-2005-6-4-r35

Representación de las rutas de regulación

• Las relaciones entre elementos se indican con líneas• Si uno regula positivamente (activa) al otro se indica con una flecha

• Si inhibe, la línea termina en una recta

• Las líneas onduladas indican transformación o síntesis

• La regulación no transcripcional se indica con líneas discontinuas

Transferencia genética horizontal

• transferencia de genes de un organismo maduro e independiente (donador) a otro (receptor)

• exogenote– DNA que es transferido

al receptor• endogenote

– genoma del receptor• merozigoto

– célula receptora que es temporalmente diploide como resultado del proceso de transferencia

Transferencia genética horizontal

Tipos principales de transferencia genética horizontal

Transferencia genética vertical

•Es la que ocurre desde los ascendientes a los descendientes mediante replicación

Tipos de plásmidos bacterianos

• pequeñas moléculas de ADN de doble hebra que, en general, son circulares• son replicones

tienen su propio origen de replicación– pueden existir en una sola copia o en múltiples copias

• curado– se denomina a la eliminación de un plásmido– puede ser espontánea o inducida mediante tratamientos que inhiben la replicación de

plásmido pero no la reproducción del huésped

• Episomas: plásmidos que pueden existir tanto integrados en el cromosoma como sin integrar

• Plásmidos conjugativos: tiene genes que codifican los pili y pueden transferir copias de ellos mismos a otras bacterias durante la conjugación

• Plásmidos suicidas: no tienen un replicón que funcione en el huésped final • Plásmidos de expresión de proteínas

• Plásmidos de clonación de fragmentos de ADN

• Plásmidos de resistencia (antibióticos, metales, etc)• Plásmidos Col (codifican colicinas – un tipo de bacteroicinas, proteínas que destruyen otras

bacterias)

• Otros (de virulencia, metabólicos)

Plásmidos bacterianosPlásmidos bacterianos

Recombinación microbiana y plásmidosRecombinación: proceso en el que una o más moléculas de ácidos nucleicos se reorganizan o combinan para producir una nueva secuencia de nucleótidos

•en eucariotas frecuentemente tiene lugar como resultado del entrecruzamiento durante la meiosis

Recombinación

• Recombinación bacteriana: varios tipos de recombinación– recombinación general– recombinación específica de sitio

integración de genomas víricos– recombinación replicativa (por

transposición)

• tipo de recombinación más común• intercambio recíproco entre parejas

de cromosomas homólogos• el resultado de la ruptura y unión de

la hebra de ADN da lugar al entrecruzamiento

Recombinación

Recombinación general: puede ser recíproca o no recíproca

Recombinación general recíproca

Recombinación

• incorporación de una hebra simple de DNA en el cromosoma para formar un heteroduplex

• se ha propuesto que ocurre durante la transformación bacteriana

Recombinación

Recombinación general no recíproca

Elementos transponibles-Transposición: movimiento de fragmentos de ADN en el genoma-Elementos transponibles (transposones): segmentos de ADN que contienen los genes

necesarios para la transposición-muy extendidos en bacterias, arqueas y eucariotas

Tipos de elementos transponibles• secuencias de inserción (elementos IS): contienen solo los

genes que codifican los enzimas necesarios para la transposición (se denominan con la letra IS seguida de un número, ej.. IS5)

• ej., transposasa

Effectos:

• mutaciones en regiones codificantes: ej., deleción de material genético

• modifica la traducción la transcripción

• activación de genes

• generación de nuevos plásmidos. Ej. Plásmidos de resistencia

Elementos transponibles

IR= Secuencias inversamente repetidas

• Transposones compuestos: llevan genes adicionales a los necesarios para la transposición. Se denominan Tn seguido de un número, Ej. Tn524)

– Transposones conjugativos: además de los genes para la transposisción tienen genes para la conjugación

Integronesintegrones

Se diferencian de los transposones en: (i) no tienen secuencias repetidas en los extremos como las secuencias IS y, (ii) los elementos contienen una integrasa específica de sitio como la que se encuentra en los fagos y no tiene numerosas productos genéticos asociados con la transposición. Los integrones son elementos móviles de ADN que pueden capturar genes (generalmente de resistencia a antibióticos con su propio lugar de integración attC). Se componen de un gen integrasa (int) próximo a un lugar de recombinación (attI site) y un promotor (Pant). Según el tipo de integrasa se diferencian 3 clases de integronesLa organización de los integrones de clase I se muestra a continuación. Los genes aadB, oxa2, aadA2 y oxa 2 se van integrando secuencialmente.

Conjugación bacteriana: transferencia de ADN mediante contacto directo entre células

Cruce F+ x F-

• F+ = donador, contiene el factor F (formación de pilus y transferencia de plásmido)• F- = receptor, no contiene el factor F• El factor F se replica mediante el mecanismo del círculo rodante y el duplicado se transfiere al receptor• el recipiente se convierte en F+

• el donador permanece como F+

Conjugación

Conjugación Hfr• Cepa Hfr: donador que contiene el factor F integrado en el cromosoma• tanto los genes plasmídicos como los cromosómicos son transferidos• Debido a que la ruptura antes de la conjugación tiene lugar en el gen F, la cepa

receptora no se convierte en F+ (salvo que se transfiera todo el cromosoma) • Además de para la transferencia de genes, la conjugación permite mapear (determinar la organización) de los genes en el cromosoma

Conjugación

Conjugación bacteriana: transferencia de ADN mediante contacto directo entre células

Transformación• toma de ADN (desnudo) del medio ambiente e

incorporación en un receptor de forma heredable• célula competente

– capaz de tomar ADN• puede ser una forma importante de intercambio genético

en la naturaleza

Transformación artificial• transformación realizada en el laboratorio con especies que

normalmente no son competentes (ej., E. coli)• numerosas técnicas son empleadas para hacer las células

competentes de forma transitoria. Ej.: tratamiento con Cl2Ca, hace las células más permeables al DNA

Transformación

Transducción • transferencia de genes bacterianos con virus• Fagos virulentos

– se reproducen empleando el ciclo de vida lítico• Fagos atemperados

– se reproducen empleando el ciclo lisogénicoCiclos de vida del fago Lambda

forma integrada del genoma viral

bacteria que contiene un profago

Transducción

Transducción generalizada• cualquier parte del genoma bacteriano puede ser transferido• tiene lugar durante el ciclo lítico• durante el ensamblado viral, los fragmentos del ADN del huésped son erróneamente

empaquetados en el fago– partícula de transducción generalizada

Transducción especializada• también denominada restricted transduction• llevada a cabo por fagos atemperados que establecen el ciclo lisogénico• solo una porción específica del genoma bacteriano es transferida• tiene lugar cuando el profago es cortado incorrectamente

Transducción

Organización de los genes en cromosomas

Genes procariotas versus eucariotas• procariotas (y virus)

– la información codificante está generalmente contigua

• eucariotas– la mayoría de los genes tienen secuencias codificantes

interrumpidas por secuencias no codificantes• exones – secuencias codificantes• intrones – secuencias no codificantes

• en la mayor parte de los organismos las pautas de lectura (ORFs ) no se solapan• algunas bacterias y algunos virus tienen genes solapados

Levadura (Saccharomyces cerevisiae)Escherichia coli

Fago X174

Estructura de los genomas

En los procariotas numerosos genes se organizan el operones. Todos los genes de un operon se transcriben desde un promotor en un único mRNA. Se muestra el operón tuf-s10 de Borrelia burgdorferi ( enfermedad de Lyme)

En eucariotas los genes no forman operones y contienen intrones. Ej.: Receptor de la hormona de crecimiento

Estructura de los genomas

Genómica microbiana Genómica• estudio de la organización molecular de los

genomas, su contenido de información, y los productos genéticos que codifica

• dividido en 3 áreas– genómica estructural

• naturaleza física de los genomas– genómica funcional

• como funciona un genoma– genómica comparativa

• compara los genomas de diferentes organismos

• numerosos genomas han sido completados. Actualmente (26.3.2007)

– 748 bacterianos

– 41 de arqueas– 139 de eucariotas

• su examen ha permitido formular numerosas hipótesis sobre los genomas microbianos

Descubrimientos interesantes• el génoma mínimo

– basado en el análisis del genoma de Mycoplasma genitalium• el más pequeño de los genomas procariotas• ~108-121 genes no son necesarios para el crecimiento en el laboratorio• ~265-350 genes necesarios para el crecimiento en el laboratorio

• la mayor parte de los genes identificados tienen función desconocida (proteínas hipotéticas)– ej., Mycoplasma genitalium: 22% tienen función desconocida– e.g., Haemophilus influenzae: > 40% tienen función desconocida– e.g., Methanococcus jannaschii: 66% tienen función desconocida– e.g., E. coli: ~2500 de 4288 genes tienen función desconocida

Genómica

Patrones generales• a pesar de la conservación en las secuencias de proteínas, la organización de los

genomas es muy variable• la transferencia horizontal de genes parece haber sido muy importante en la

evolución de las bacterias y las arqueas

Genómica funcional (determina como funcionan los genomas)

• las 3 aproximaciones más comunes se abordan a través de proyectos OMA y son:

– Genómica: secuenciación y anotación de genoma (identificación de genes y fases codantes)

– Transcriptómica: estudio de la expresión genética al nivel de RNA

– Proteómica: estudio de la expresión genética al nivel de proteínas

Genómica

DNA chips

• Permiten el estudio masivo de la expresión de genes al nivel del RNA (el transcriptoma)

• DNA microarrays (DNA chips)

– soporte sólido (ej. vidrio) que tiene anclado ADN en matrices (puntos) muy ordenadas (las sondas)

• Este ADN consiste en la secuencia parcial y complementaria del RNA o cDNA de un gen con el que puede hibridar

• incubado con mRNA o cDNA (dianas), que hibridan con el ADN anclado al soporte

– Este RNA está marcado con fluorocromos

– Los genes que se expresan se iluminan en el chip

Genómica

Estudio masivo de la expresión de genes, RNA.

 

  

ADN diana (cDNA) con marcadores fluorescentes

Sondas de ADN

Soporte de vidrio

Chip de ADN con el ADN diana hibridado

• proteoma– la colección completa de

proteínas que produce un microorganismo

• Proteómica: estudio del proteoma

• una aproximación frecuente es la electroforesis en dos dimensiones

• Las proteínas pueden identificarse posteriormente mediante espectroscopía de masas (MALDI TOF)

Estudio masivo de la expresión de genes, Proteínas

MALDI-TOF: Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight)

Espectrometría de masas mediante ionización-desorción por láser asistida por matriz acoplada a un analizador de tiempo de vuelo

Genómica

Genómica en el diseño de vacunas• Diferentes aproximaciones al diseño de vacunas,

consecuencia de la introducción continua de una serie de nuevas tecnologías. Los progresos realizados en inmunología molecular y biotecnología en las últimas dos décadas han desplazado las vacunas clásicas basadas en células enteras de patógenos muertos (a) hacia vacunas con subunidades. La aplicación de la tecnología del ADN recombinante ha dado como resultado la producción de vacunas atenuadas vivas (b) mediante la inactivación de los genes responsables de la patogenicidad. La manipulación del ADN ha revolucionado la posibilidad de clonar, purificar, y crear subunidades antigénicas para eliminar los efectos tóxicos al mismo tiempo que se mantiene la inmunogenicidad de la proteína (c). Además, bacterias y virus atenuados o no patógenas pueden ser manipulados para que expresen proteínas de otro organismo (d). La posibilidad de obtener la secuencia completa de un organismo marca el comienzo de la era genómica que abre nuevas perspectivas en el diseño de vacunas. La totalidad de los antígenos potenciales de un organismo puede ser identificada en el genome mediante análisis in silico. Los antígenos potenciales son clonados, purificados y sometidos a un análisis inmunológico. El proceso completo da lugar a la identificación de un número reducido de candidatos de vacunas. (e).

• Trends in Biotechnology (2005) 23 (2):57-108

Genómica

Mutaciones y su base química• mutaciones

– cambio estable y heredable en la secuencia de nucleótidos– puede tener o no algún efecto sobre el fenotipo de un organismo, de hecho la

mayor parte de las mutaciones son neutras en ese sentido

Mutaciones y mutagénesis• las mutaciones pueden clasificarse, de forma no excluyente, según su efecto en el fenotipo

– mutaciones morfológicas• cambia la morfología de la célula o la colonia

– mutaciones letales• matan al organismo

– mutaciones condicionales• se expresan solo bajo ciertas condiciones (ej.. alta temperatura)

– mutaciones bioquímicas• cambio en la capacidad metabólica de un organismo• auxotrofos

– tienen mutaciones en una ruta biosintética– no pueden sintetizar el producto de una ruta

– requiere el producto de esa ruta como nutriente en medios de cultivos mínimos• El término auxotrofo se contrapone al término prototrofo (denominación que se aplica a cepas que pueden crecer en medio mínimo, sin suplementos)

– mutaciones de resistencia • resistencia a patógenos , productos químicos y antibióticos

Mutaciones

Cómo tienen lugar las mutaciones• espontáneamente

– se desarrollan en ausencia de agentes externos– suelen ocurrir al azar

• mutación dirigida (adaptativa)– mutaciones que son el resultado de la hipermutación seguida de selección

• inducida– desarrollada tras la exposición a un mutágeno

Mutaciones espontáneas• Son el resultado de :

– errores en la replicación del ADN– daño del ADN– inserción de transposones

Mutaciones inducidas

• provocada por agentes químicos o físicos que dañan o alteran le química del ADN o que interfieren con los mecanismos de reparación de ADN

Mutaciones

Detección y aislamiento de mutantes• las mutaciones son poco frecuentes (1 de cada 107 a 1011 células)• para encontrar mutantes se necesitan métodos de detección sensibles y/o métodos

que aumentan la frecuencia de mutación

Mutaciones

Tratamiento de células de E. coli con un mutágeno como la nitrosoguanidina Soporte Superficie de

tercio pelo esterilizada

Inoculación de una placa con medio completo e incubación. Tanto las bacterias de tipo salvaje como los supervivientes mutantes formarán colonias

Placa maestra(medio completo)

Réplica(medio completo)

Réplica(medio sin lisina)

Los auxótrofos de lisina no crecen

Todas crecen

Selección de mutantes• empleo de condiciones

ambientales en las que puede crecer el mutante deseado– ej, selección de revertientes

desde auxotrofía a prototrofía

Mutaciones

Tratamiento de auxotrofos de lisina (Lys-) con un mutágeno como la nitrosoguanidina o la radiación UV para producir revertientes

Siembra en un medio mínimo (carente de lisina)

Incubación

Solo crecen los prototrofos capaces de sintetizar lisina

Test de carcinogenicidad

• se basa en la observación de que la mayor parte de los carcinógenos son también mutágenos

• el test de mutagenicidad se emplea para identificar compuestos potencialmente carcinogénicos

– e.g., Test de Ames

• tasa de reversión en presencia de un carcinogeno potencial > tasa de reversión en ausencia de un carcinogeno potencial

•entonces, si el agente es un mutágeno puede ser carcinógeno

Mutaciones

Cultivo de auxótrofos de histidina de Salmonella

Medio completo con una pequeña cantidad de histidina

Medio completo con una pequeña

cantidad de histidina

Medio completo con un agente mutágeno

y una pequeña cantidad de histidina

Medio completo con un agente mutágeno

y una pequeña cantidad de histidina

Revertientes espontáneos

Revertientes inducidos por el mutágeno

Reparación de ADNReparación de ADN

Sobre la cadena de ADN se muestra los principales lugares en los que se daña el ADN. Las depurinaciones (pérdida de las purinas) se indica con flechas rojas. Los sitios que pueden sufrir un ataque hidrolítico se indican con flechas verdes y los que pueden sufrir una oxidación se indican con flechas azules

• Comprobación de la lectura (proofreading)

– corrección de errores en el apareamiento de bases realizado durante la replicación

– los errores son corregidos por la ADN polimerasa

• otros mecanismos reparan apareamientos incorrectos y el ADN dañado, estos son:

Reparación por escisión de una hebra, la otra se usa como molde

Eliminación de lesiones (Fotoreactivación de dímeros de timina)Reparación postreplicativa (la metilación de ADN permite distinguir cadenas nuevas y viejas)Reparación por recombinación:• repara el ADN en ambas hebras• implica la recombinación con una molécula no dañada

– en células que se dividen rápidamente otra copia de cromosoma esta disponible

• La proteían RecA cataliza la recombinación

Reparación SOS• sistema de reparación inducible• se emplea para reparar daños grandes que paran la replicación, dando

lugar a numerosas brechas

– La proteína RecA inicia la reparación mediante recombinación

– La proteína RecA actúa también como una proteasa, destruyendo una proteína represora y así aumentando la proporción de enzimas de reparación por excisión

Reparación de ADN

Proceso de reparación SOS: En ausencia de daños, los genes de reparación se expresan en E. coli a niveles bajos debido a la unión de la proteína represona LexA en sus operadores (O). Cuando la proteína RecA se une a una región dañada, destruye la proteína LexA y los genes de reparación se expresan de forma más activa