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Revista Internacional de Contaminacin Ambiental Universidad Nacional Autnoma de [email protected] ISSN (Versin impresa): 0188-4999MXICO

2002 Luz Elena Vera vila / Edgar Arturo Czares Ibez / Rosario Covarrubias Herrera /

Evangelina Camacho FrasMETODOLOGA EN LNEA PARA LA DETERMINACIN DE HIDROCARBUROS

AROMTICOS POLINUCLEARES EN AGUA AL NIVEL DE ULTRATRAZAS Revista Internacional de Contaminacin Ambiental, ao/vol. 18, nmero 001

Universidad Nacional Autnoma de Mxico Distrito Federal, Mxico

pp. 5-16

METODOLOGA EN LNEA PARA LA DETERMINACIN DE HIDROCARBUROS AROMTICOSPOLINUCLEARES EN AGUA AL NIVEL DE ULTRATRAZAS

Luz Elena VERA-VILA, Edgar Arturo CZARES-IBEZ,Rosario COVARRUBIAS-HERRERA y Evangelina CAMACHO-FRAS

Departamento de Qumica Analtica, Facultad de Qumica, Universidad Nacional Autnoma de Mxico, Ciudad Univer-sitaria, Coyoacn 04510 D.F., Mxico

(Recibido agosto 2001, aceptado diciembre 2001)

Palabras clave: hidrocarburos aromticos polinucleares, anlisis de agua, preconcentracin en lnea

RESUMEN

Se desarroll un mtodo analtico para la determinacin de los 16 hidrocarburos aromticospolinucleares (HAP) de la lista de contaminantes prioritarios de la EPA a niveles de concentra-cin inferiores a las partes por billn (ppb) en agua. Los compuestos fueron extrados ypreconcentrados en una pequea precolumna empacada con un adsorbente de fase reversa.Posteriormente, la precolumna se acopl en lnea con una columna analtica de fase polimricaC18 para la separacin cromatogrfica de los HAP por elucin en gradiente y su deteccin dualpor UV (262 nm) y fluorescencia (excitacin: 305-395 nm, emisin: 430-470 nm). Para un anlisiscompleto se requirieron dos muestras de 75 ml de la misma agua a las cuales se aadi 5% 25%(v/v) de acetonitrilo antes de la etapa de extraccin. Ambas muestras fueron posteriormenteprocesadas de manera idntica, cuantificando los HAP ms ligeros en la de menor contenido dedisolvente orgnico y los HAP ms pesados en la muestra complementaria. En el intervalo deconcentraciones estudiado las recuperaciones obtenidas fueron 88% con coeficientes devariacin 15%. Los lmites de deteccin en muestras de agua grado reactivo fortificadasestuvieron entre 1.5 y 75 partes por trilln (ppt), dependiendo del analito considerado. El anlisisde una muestra de agua de ro permiti detectar la presencia de antraceno y fluoranteno aconcentraciones de 29 y 26 ppt, respectivamente.

Key words: polynuclear aromatic hydrocarbons, water analysis, on-line trace enrichment

ABSTRACT

An analytical method was developed for the determination of the 16 EPA priority pollutantpolynuclear aromatic hydrocarbons (PAH) at sub-ppb concentration levels in water. The com-pounds were extracted and preconcentrated in a small precolumn packed with a reversed phaseadsorbent. Then, the precolumn was on-line coupled to a polymeric C18 analytical column forthe chromatographic PAH separation by gradient-elution and their dual UV (262 nm) and fluo-rescence detection (excitation: 305-395 nm, emission: 430-470 nm). A complete analysis wasperformed with two 75-ml samples of the same water, which were identically extracted andprocessed after the addition of 5% or 25% (v/v) of acetonitrile. The lightest PAH were quanti-tated in the sample with lowest organic solvent content and the heaviest ones in the comple-mentary sample. Recoveries 88% with variation coefficients 15% were obtained for all PAHwith this method. The detection limits of the method in spiked reagent water samples werecomprised between 1.5 and 75 parts per trillion (ppt), depending on the solute. The analysis ofa river water sample indicated the presence of anthracene and fluoranthene at concentrations of29 and 26 ppt, respectively.

Rev. Int. Contam. Ambient. 18 (1) 5-16, 2002

L.E. Vera-vila et al.6

INTRODUCCINLos hidrocarburos aromticos polinucleares (HAP)

son contaminantes que se encuentran dispersos en el am-biente y provienen tanto de fuentes naturales como dediversas actividades humanas, en particular aquellas queinvolucran procesos de combustin incompletos dondelas temperaturas sobrepasan los 700 C. Algunas fuen-tes de contaminacin tpicas son las centrales trmicas,los humos de combustin de los automviles, los proce-sos de refinado del aluminio y los derrames de combusti-bles fsiles. Los HAP pueden clasificarse en dos gruposcon propiedades y efectos diferentes: los de bajo pesomolecular, con dos y tres anillos aromticos, son menoshidrofbicos (log Kow, coeficiente de reparto octanol-agua, entre 3 y 5) y presentan una alta toxicidad; los dealto peso molecular son fuertemente hidrofbicos (logKow > 5.5) y potencialmente mutagnicos y carcino-gnicos. A pesar de la baja solubilidad en agua de losHAP, su presencia en este medio est fuertemente regu-lada en la mayora de los pases debido a los riesgos po-tenciales para la salud humana. Por ejemplo, en la UninEuropea se ha establecido como norma que la sumade la concentracin de 6 HAP [fluoranteno,benzo(b)fluoranteno, benzo(k)fluoranteno, benzo(a)pireno,benzo(ghi)perileno e indeno (cd)pireno] en agua pota-ble debe ser inferior a 0.2 ppb (g/l), con una concentra-cin lmite de 20 ppt (ng/l) para benzo(a)pireno. En elcaso de aguas superficiales usadas como fuente de abas-tecimiento para agua potable, el lmite establecido parala suma de los 6 HAP es de 1 ppb. Estos lmites se en-cuentran muy por debajo de las capacidades de detec-cin de la instrumentacin actual, por lo que el desarrollode mtodos de tratamiento de la muestra que permitanobtener un concentrado analizable es uno de los cam-pos de investigacin ms activos de la qumica analti-ca.

Los mtodos tradicionales para la determinacin enagua de los 16 HAP incluidos en la lista de contaminan-tes prioritarios de la EPA (Agencia de Proteccin Am-biental de EUA), son variaciones del Mtodo 610(USEPA 1984). Todos ellos se basan en la extraccinlquido-lquido (ELL) de la muestra acuosa, seguida porevaporacin del extracto orgnico, reconstitucin y an-lisis por cromatografa de gases (CG) con detector deionizacin de flama o espectrmetro de masas, o bienpor cromatografa de lquidos (CL) con detector UV ode fluorescencia. Estos mtodos son muy largos, minu-ciosos e implican una continua manipulacin de la mues-tra, lo que se traduce en altos riesgos de prdida deanalitos durante el procedimiento. Adems, presentan ladesventaja de requerir volmenes relativamente grandesde disolventes orgnicos txicos, particularmentedisolventes clorados, con el consiguiente problema degeneracin de desechos.

Actualmente, la extraccin en fase slida (EFS) ensus diversas modalidades se ha convertido en la alterna-tiva de eleccin para la preparacin de muestras am-bientales. La EFS fuera de lnea se ha empleado paraaislar y concentrar los HAP de diversas matrices acuo-sas, utilizando adsorbentes de fase reversa C18 deposi-tados en discos o en membranas (Hodgeson 1990, Michoret al. 1996, Carrera et al. 1998) o en cartuchosdesechables (Fladung 1995, Messer y Taylor 1995, Kisset al. 1996). Aunque esta tcnica representa un avancecon respecto a la ELL, an tiene el inconveniente derequerir volmenes de muestra relativamente grandes(superiores a 250 ml) y pasos de evaporacin del disol-vente de elucin, para obtener un extracto suficiente-mente concentrado que permita determinar los HAP alos niveles que exigen las normas de calidad del agua.Esto implica que los tiempos de preparacin de muestrason todava largos (> 100 min) y persisten los riesgos deprdida de analitos durante las etapas de elucin y eva-poracin. Tambin se han publicado varios mtodos paraHAP basados en la EFS en lnea (Brouwer et al. 1994,Vera-vila y Covarrubias 1994, Lai y White 1995). Eneste caso, una pequea precolumna empacada con eladsorbente es cargada con la muestra y luego se eluyeen lnea con la columna analtica de un sistema de CL.De esta manera, las etapas de preparacin de muestra yanlisis se acoplan, conduciendo a resultados ms exac-tos y precisos y a muy altas sensibilidades con volme-nes de muestra ms pequeos. Recientemente, se hadescrito el uso de los inmunoadsorbentes para la EFS deHAP, en lnea o fuera de lnea (Cichna et al. 1997,Bouzige et al. 1999). Estos adsorbentes estn constitui-dos por anticuerpos especficos contra algn HAP,inmovilizados en un soporte slido. Su principal ventajaes la altsima selectividad que presentan respecto al com-puesto que les dio origen; sin embargo, estos materialestodava se encuentran en fase experimental y no han sidomuy comercializados. Otra modalidad de la EFS que hasido empleada en la determinacin de HAP es lamicroextraccin en fase slida (MEFS) (Liu et al. 1997,Negrao y Alpendurada 1998, Doong et al. 2000), en lacual los analitos se adsorben sobre una microfibra querecubre la punta de la aguja de una jeringa, sumergida enla muestra acuosa o colocada en el vapor sobrenadantede sta. El anlisis se realiza por CG CL introduciendola jeringa en el inyector, donde los HAP son desorbidosde la fibra por la temperatura o la fase mvil, respectiva-mente, y son enviados a la columna para su separacin yanlisis. Esta tcnica de preparacin de muestra es su-mamente sencilla pero la sensibilidad obtenida es menorque en las otras modalidades de EFS y presenta mayorinexactitud en la cuantificacin de los analitos.

Independientemente del adsorbente o la modalidad deEFS usada para concentrar los HAP de la muestra, elprincipal problema que presentan estos compuestos es

DETERMINACIN DE HAP EN AGUA 7

su fuerte tendencia a adsorberse sobre la superficie decualquier material que se encuentre en contacto con susdisoluciones acuosas. Esta tendencia es tanto ms inten-sa cuanto ms hidrofbico es el compuesto, por ello lasprdidas mayores por adsorcin en filtros y recipientesse presentan en los HAP ms pesados. Para atenuareste problema, en varios trabajos se ha buscado aumen-tar la solubilidad de los HAP en el agua por adicin de undisolvente orgnico o de un surfactante no inico a con-centracin superior a su concentracin micelar crtica.Sin embargo, el modificador orgnico afecta el procesosubsecuente de EFS, por lo que se requiere una cuidado-sa optimizacin y control de su concentracin en la mues-tra a extraer para obtener recuperaciones aceptables detodos los analitos, independientemente de su hidrofobi-cidad. En general, estos problemas han llevado a mayo-res complicaciones de los procedimientos y del montajeexperimental utilizado en el mtodo.

En un trabajo previo (Vera-vila y Covarrubias1994) se ha propuesto un sistema de EFS en lnea endos etapas, para la determinacin de 10 HAP en agua,logrando buenas recuperaciones para todos ellos. Elobjetivo del presente estudio fue optimizar el sistemaantes propuesto para obtener un mtodo exacto, preci-so y robusto que permitiera determinar los 16 HAP dela lista de contaminantes prioritarios en concentracio-nes inferiores a la ppb y mostrar su aplicabilidad endiversas muestras de agua.

MATERIALES Y MTODOSEquipo

La figura 1 muestra el diagrama del arreglo experi-mental utilizado, que est compuesto por dos seccionesunidas mediante una vlvula de conmutacin Rheodyne7000 (Vc, en la Fig. 1). La seccin de anlisis estconstituida por un sistema de bombeo Varian Modelo5000 (P1) con capacidad para gradiente de elucinbinario, un inyector manual Rheodyne 7125 (i) con unrizo de 24.7 l calibrado in situ (Vera-vila yCovarrubias 1994), una columna analtica (C) y dosdetectores en serie: un UV de longitud de onda variablede Thermo Separations Modelo 3200 (UV) operado a262 nm y un detector de fluorescencia de filtros GilsonModelo 121 (F) con filtro de excitacin de 305-395 nmy filtro de emisin de 430-470 nm; cada detector estconectado a un integrador/graficador Hewlett-Packard3396 Serie II (I/G). La seccin de preparacin de mues-tra, intercalada entre el inyector y la columna analtica,consta de una bomba isocrtica Beckman 210 A (P2),una vlvula de purga (Vp) y la precolumna de extrac-cin y concentracin (Pc) colocada en la posicin co-rrespondiente al rizo de la vlvula de conmutacin. Conel fin de eliminar posibles prdidas de HAP por adsorcin

en las tuberas de la bomba P2, sta fue modificadareemplazando el tubo de entrada de Teflon por un tubode acero inoxidable (1/8 D.E.).

Columnas y fases mvilesLa precolumna de acero inoxidable (20 x 2 mm D.I.)

de Upchurch Scientific fue empacada en el laboratorio a210 bar, con una suspensin de la fase reversa SpherisorbODS-2 de 5 m (Phase Separations) en una mezclatetracloruro de carbono etanol 50:50 (v/v), utilizandoun sistema para empacado de columnas Haskel Modelo29426. La columna analtica (125 x 3.2 mm D.I.)Envirosep-pp de Phenomenex, empacada con una fasereversa polimrica C18 de 5 m, fue adquirida comer-cialmente. La separacin cromatogrfica de los analitosse realiz a un flujo de 0.5 ml/min mediante un gradientede elucin binario. Las fases mviles dbil (fase A) yfuerte (fase B) fueron acetonitriloagua 10:90 (v/v) yacetonitrilo puro, respectivamente. El programa degradiente empleado fue: fase B, 0 min = 25 %, 8 min =25 %, 10 min = 50 %, 14 min = 50 %, 28 min = 100 % y50 min = 100 %.

Disolventes, reactivos y disolucionesEl acetonitrilo fue grado HPLC de Prolabo. El agua

empleada para la preparacin de fases mviles y de mues-tras sintticas fortificadas fue grado reactivo, tipo I, ob-tenida de un desionizador Nanopure de BarnsteadThermolyne. Los 16 HAP, cuyos nombres y abreviatu-ras se muestran en la tabla I, fueron adquiridos de Chem

Vp P2

Pc Vc

i

P1

IG

I G

F

C

UV

Fig. 1. Diagrama del montaje experimental. P1: cromatgrafo paragradiente binario, P2: bomba isocrtica, Vc: vlvula deconmutacin, Vp: vlvula de purga, i: inyector, Pc: precolumna,C: columna analtica, I/G: integrador-graficador, UV: detectorultravioleta-visible, F: detector de fluorescencia


Service con una pureza certificada mnima de 97 %, ex-cepto el acenaftileno (especificacin del proveedor: 89 %Acenaftileno y 11 % acenafteno). Se prepararon disolu-ciones patrn individuales a concentracin entre 100 y200 partes por milln (ppm, mg/l) para cada HAP, pesan-do la cantidad adecuada y disolvindola en acetonitrilo.Las mezclas estndar de trabajo se prepararon tambinen acetonitrilo a partir de las disoluciones patrn. Estasmezclas se utilizaron para fortificar las muestras de aguay tambin en inyeccin directa, como referencia paracalcular la recuperacin de los solutos en las muestrasanalizadas.

Mediante pruebas preliminares, con disoluciones indi-viduales de los HAP inyectadas en el cromatgrafo, sedetermin el orden de elucin de los compuestos y elmodo de deteccin a utilizar para cada uno de ellos (Ta-bla I). Los HAP detectados con alta sensibilidad porfluorescencia (ANT, FLT, B(a)P, B(b)F, B(k)F, DBA,B(ghi)P e I(cd)P) tambin dieron respuesta en el UV a262 nm, pero con mucho menor intensidad. Por el con-trario, el conjunto constituido por NAF, ACE, ACI, FLU,FEN y CRI no dio ninguna seal en el detector de fluo-rescencia con los filtros de excitacin y emisin usa-dos. El PIR y el B(a)A dieron respuestas parecidas enambos detectores; sin embargo, para B(a)A se opt porla deteccin en fluorescencia debido a que eluye muycercano al CRI, el cual no interfiere en este modo dedeteccin, en cambio para PIR se eligi la deteccinUV por la menor interferencia del pico vecino, FLT,cuya seal en UV fue muy pequea. Por otra parte, enestos ensayos se observ que las diferencias de res-puesta para una misma concentracin, entre los HAPdetectados por fluorescencia y los detectados por UV,fueron en general muy grandes e incluso dentro del gru-

po de compuestos reconocidos por un mismo detector,las respuestas fueron considerablemente diferentes. Paraevitar problemas de saturacin de los detectores, las mez-clas estndar de trabajo fueron preparadas ajustandoapropiadamente la concentracin de cada HAP de acuer-do con su modo de deteccin y su respuesta relativa enese detector.

Operaciones fuera de lneaEl mtodo propuesto fue diseado considerando que

las muestras se colectan en frascos de vidrio mbar concapacidad de 75 ml, los cuales se llenan hasta el inicio dela rosca con el agua a analizar. Esto significa que el volu-men de muestra podra variar entre 73 y 77 ml, aproxi-madamente; sin embargo, el protocolo desarrollado pue-de aceptar estas variaciones sin requerir de ninguna mo-dificacin. No obstante, para la cuantificacin de losanalitos se necesita conocer el volumen exacto de mues-tra por lo que deber marcarse el nivel del lquido en elfrasco para determinar posteriormente dicho volumen.

Para un anlisis completo se requieren dos frascoscon la misma muestra. En efecto, debido a la gran dife-rencia de hidrofobicidad entre los 16 HAP, stos se divi-dieron para su anlisis en dos grupos, el de los HAP lige-ros y el de los HAP pesados (tal como se indica en laTabla I), y se disearon condiciones diferentes para eltratamiento de cada grupo. El procedimiento optimizadopara la preparacin previa de la muestra (fuera de lnea)es el siguiente:1. En un sistema de filtracin (Millipore, Modelo OM027)

con una membrana de Nylon 66 de poro 0.4 m, filtrarla muestra ayudndose de una varilla de vidrio y usan-do un vaco suave. Recibir el filtrado en un matrazKitazato de vidrio de 125 ml. Antes de usarse, la mem-

Orden* Compuesto Abreviatura Clasificacin Deteccin**

1 Naftaleno NAF HAP ligero UV2 Acenafteno ACE HAP ligero UV3 Acenaftileno ACI HAP ligero UV4 Fluoreno FLU HAP ligero UV5 Fenantreno FEN HAP ligero*** UV6 Antraceno ANT HAP ligero*** F7 Fluoranteno FLT HAP ligero*** F8 Pireno PIR HAP ligero*** UV9 Benzo(a)antraceno B(a)A HAP pesado F

10 Criseno CRI HAP pesado UV11 Benzo(a)pireno B(a)P HAP pesado F12 Benzo(b)fluoranteno B(b)F HAP pesado F13 Benzo(k)fluoranteno B(k)F HAP pesado F14 Dibenzo(ah)antraceno DBA HAP pesado F15 Benzo(ghi)perileno B(ghi)P HAP pesado F16 Indeno(cd)pireno I(cd)P HAP pesado F

TABLA I. CLASIFICACIN Y DETECCIN DE LOS HAP

*Orden de elucin en el cromatograma. ** UV a 262 nm; F=fluorescencia, excitacin: 305-395 nm, emi-sin: 430-470 nm. ***Compuestos frontera


brana de nylon debe ser acondicionada para lo cual sesumerge por 1 a 2 horas en acetonitrilo, luego se colo-ca en el embudo de filtracin y se lava con acetonitrilofresco y agua grado reactivo, desechando estosdisolventes.

2. Para los HAP ligeros, una vez filtrada la muestra agre-gar 5 ml de acetonitrilo al frasco de muestreo, tapar yagitar vigorosamente. Pasar este disolvente por la mis-ma membrana de nylon y recogerlo en el mismo ma-traz que la muestra. Repetir esta operacin con 20 mlde agua grado reactivo. El volumen final de lquido enel matraz Kitazato ser de 100 ml (volumen inicial demuestra + 25 ml).

3. Para los HAP pesados, agregar 5 x 5 ml de acetonitriloal frasco de muestreo, tapar y agitar vigorosamente acada vez. Pasar cada porcin por la misma membra-na y recogerla en el mismo matraz que la muestra. Elvolumen final en el matraz ser de 100 ml.

4. Retirar el matraz del sistema de filtracin, taparlo conpapel aluminio y agitar suavemente para homogenei-zar la mezcla. El matraz con la muestra filtrada y el olos disolventes aadidos se emplea directamente comoreservorio de la bomba P2 en los pasos 5 y 6 de lasoperaciones en lnea descritas posteriormente.

Operaciones en lneaUna vez preparada la disolucin de carga, se procede

a realizar en lnea la extraccin, preconcentracin y an-lisis de los HAP utilizando el arreglo experimental de lafigura 1. Las soluciones empleadas en la bomba P2 du-rante el procedimiento son:a. disolvente de regeneracin: acetonitrilo.b. disolucin de acondicionamiento: mezcla acetonitrilo

agua 5:95 (v/v) en el ensayo de HAP ligeros o 25:75

(v/v) en el de HAP pesados.c. disolucin de carga: la muestra filtrada y preparada

para HAP ligeros o para HAP pesados.d. disolvente de enjuague: agua grado reactivo.

En la bomba P1 slo se utilizan las fases mviles A yB. La fase mvil inicial, empleada para equilibrar el sis-tema, est constituida por fase A 75 % y fase B 25 % (v/v); el programa del gradiente de elucin para la separa-cin de los HAP fue descrito anteriormente. La tabla IImuestra los tiempos y condiciones experimentales usa-dos en cada paso de las operaciones en lnea descritas acontinuacin. 1. Mediante la bomba P1, enviar la fase mvil inicial

hacia la columna analtica para equilibrarla. Simult-neamente, llenar las lneas de la bomba P2 con eldisolvente de regeneracin.

2. Regenerar la precolumna. 3. Llenar las lneas de la bomba P2 con el disolvente de

acondicionamiento. 4. Acondicionar la precolumna. 5. Llenar las lneas de la bomba P2 con la disolucin de

carga. 6. Cargar la precolumna con 25 ml exactos de esta di-

solucin. 7. Llenar las lneas de la bomba P2 con la disolucin de

enjuague. 8. Enjuagar la precolumna. 9. Rotar la vlvula de conmutacin y correr el progra-

ma de gradiente en la bomba P1 para analizar la mues-tra.

10. Con la bomba P1, enviar la fase mvil inicial paraequilibrar la precolumna y la columna analtica aco-pladas en lnea. Cargar el rizo del inyector con lamezcla estndar de HAP que se utilizar como refe-

Tiempo Paso Vlvulas P1 P2Flujo Flujo

(min) Vp Vc i (ml/min) fase mvil (ml/min) disolucin

0.0 1 A L L/I 0.5 inicial 5.0 a1.0 2 C L L/I 0.5 inicial 2.0 a6.0 3 A L L/I 0.5 inicial 5.0 b7.0 4 C L L/I 0.5 inicial 2.0 b

17.0 5 A L L/I 0.5 inicial 5.0 c19.0 6 C L L/I 0.5 inicial 2.0 c31.5 7 A L L/I 0.5 inicial 5.0 d32.5 8 C L L/I 0.5 inicial 0.5 d33.5 9 A/C I L/I 0.5 gradiente 0.0 -83.5 10 A/C I L 0.5 inicial 0.0 -

113.5 11 A/C I I 0.5 gradiente 0.0 -163.5 Repetir pasos 1-9 para el anlisis de la carga complementaria247.0 Fin o nuevo ciclo para anlisis de otra muestra

TABLA II. TIEMPOS Y CONDICIONES DEL PROCEDIMIENTO EN LNEA

P1: bomba binaria, P2: bomba isocrtica, Vp: vlvula de purga, Vc: vlvula de conmutacin, i: inyector,A: abierta, C: cerrada, L: posicin de carga, I: posicin de inyeccin, a: disolvente de regeneracin, b:disolucin de acondicionamiento, c: disolucin de carga, d: disolvente de enjuague


rencia para la cuantificacin.11. Rotar la vlvula de inyeccin y correr el programa

de gradiente en la bomba P1 para analizar el estndar.Repetir los pasos 1-9, usando en los pasos 5 y 6 la

muestra complementaria; es decir, si inicialmente se car-g la muestra preparada para HAP ligeros, cargar ahorala muestra para HAP pesados o viceversa.

En los pasos 3, 5 y 7, la bomba P2 debe pararse mo-mentneamente para transferir el tubo de entrada a lasiguiente disolucin a emplear; posteriormente, se abrela vlvula de purga y se arranca la bomba P2 para llenarlas tuberas con la nueva disolucin a un flujo rpido. Elestndar inyectado y analizado en los pasos 10 y 11 sirvecomo referencia tanto para el anlisis de la muestra pre-parada para HAP ligeros como para la de HAP pesados.

Segn se observa en la tabla II, el tiempo total paraun anlisis completo (HAP ligeros, HAP pesados yestndar inyectado) es de aproximadamente 4 horas. Sinembargo, la EFS de las dos muestras HAP ligeros y HAPpesados, slo requiere 67 min en total y este proceso serealiza mientras se equilibra la columna analtica a lascondiciones iniciales para la siguiente corridacromatogrfica (entre el paso 1 y 8). As, en este proce-dimiento en lnea, el tiempo de anlisis est determinadoexclusivamente por las corridas cromatogrficas y surespectivo equilibrio de columna. Es interesante mencio-nar que todo el conjunto de operaciones en lnea puedeser automatizado para anlisis de rutina; en este caso, latabla II permite programar las diferentes actividades enel sistema electrnico de comando. En el comercio exis-ten diversos sistemas para la automatizacin de la EFS.

El protocolo presentado lleva incluido un paso de re-generacin de la precolumna antes de cada anlisis. Asmismo, la columna analtica es regenerada en cada corri-da por la fase mvil fuerte que circula a travs de ella alfinal del gradiente. De esta manera se eliminan prctica-mente todos los riesgos de contaminacin cruzada enanlisis secuenciales de muestras.

RESULTADOS Y DISCUSINOptimizacin de las condiciones experimentales

Los 16 HAP en estudio son un grupo de compuestosdifciles de separar tanto por cromatografa de gases comopor cromatografa de lquidos, aunque se considera queesta ltima tcnica es una mejor opcin (Bouzige et al.1999). La columna Envirosep-pp, utilizada en este traba-jo, est especialmente diseada para la separacin deHAP y con el gradiente propuesto permite lograr unaresolucin adecuada de los 16 compuestos, como semuestra en la figura 2. El cromatograma fue obtenidopor inyeccin de una mezcla estndar a concentracionesrelativamente elevadas de los HAP, condicin en la cuallos 16 compuestos se alcanzan a detectar por UV a 262

nm. Sin embargo, combinando la deteccin por UV y porfluorescencia es posible alcanzar lmites de deteccin eninyeccin directa muy bajos para todos los solutos (entre1 y 50 ppb, dependiendo del soluto considerado).

Uno de los principales problemas cuando se trabaja

con compuestos muy hidrofbicos como los HAP, es sufuerte tendencia a escapar de la disolucin acuosa,adsorbindose sobre la superficie de cualquier materialque est en contacto con ella. Para recuperar los analitosadsorbidos, es necesario incluir en el protocolo operacio-nes de enjuagado del frasco de muestreo y de la mem-brana de filtracin con un disolvente orgnico, el cual seagrega posteriormente a la muestra a analizar. El volu-men de este disolvente debe ser lo ms pequeo posiblepara no afectar significativamente las operacionessubsecuentes de extraccin y anlisis, ya que la reten-cin de los analitos en las precolumnas de fase reversautilizadas para la EFS disminuye a medida que aumentael contenido de disolvente orgnico en la muestra acuo-sa. En el caso de los HAP estudiados el problema radica

Fig. 2. Cromatograma UV obtenido de la inyeccin de una mezclaestndar de HAP . Solutos-concentracin: (1) NAF-1609 ppb,(2) ACE-950 ppb, (3) ACI-1826 ppb, (4) FLU-341 ppb, (5)FEN-555 ppb, (6) ANT-186 ppb, (7) FLT-149 ppb, (8)PIR-182 ppb, (9) B(a)A-333 ppb, (10) CRI-421 ppb, (11)B(a)P-86.4 ppb, (12) B(b)F-107 ppb, (13) B(k)F-83.2 ppb,(14) DBA-1049 ppb, (15) B(ghi)P-86.4 ppb y (16) In(cd)P-86.4 ppb


en que, si se utiliza un cantidad muy pequea de disol-vente orgnico para enjuagar el material, los compuestosms voluminosos no alcanzan a desorberse completa-mente, comprometiendo la exactitud y precisin del m-todo; por el contrario, si la muestra contiene una mayorproporcin de disolvente orgnico, entonces es necesa-rio reducir drsticamente el volumen de carga en laprecolumna para evitar la fuga de los analitos ms lige-ros, lo que compromete la sensibilidad del mtodo. Anteesta disyuntiva, se opt por dividir a los 16 HAP en dosgrupos: el de los HAP ligeros, que pudieron recuperarseconvenientemente usando slo 5 ml de acetonitrilo parael enjuague, y el de los HAP pesados, que requirieronhasta 25 ml de este disolvente para desorberse de losrecipientes y filtros y permanecer en la fase lquida.

Algunos compuestos como FEN, ANT, FLT y PIR,que fueron clasificados y tratados como HAP ligeros, dehecho son compuestos frontera pues se comprob quetambin se recuperan aceptablemente si se tratan segnel procedimiento para HAP pesados.

Para optimizar las condiciones de EFS se prepararonmuestras de agua grado reactivo con un contenido de5% o 25% de acetonitrilo y se fortificaron con una mez-cla estndar de HAP. Usando el montaje de la figura 1 yel procedimiento descrito en la parte experimental paralas operaciones en lnea, se cargaron en la precolumnavolmenes crecientes de las muestras (10, 25 y 50 ml) ypara cada volumen se determin la recuperacin de losanalitos. Las concentraciones de HAP en las muestrasfortificadas fueron ajustadas de modo que, para los dife-rentes volmenes ensayados, la cantidad tericamentecargada de cada soluto en la precolumna fuera constan-te. Las ecuaciones utilizadas para calcular el porcentaje

de recuperacin (% R) fueron:

Qm = (Am x Qs) / As (1)

% R = (Qm x 100) / Qt (2)

donde para cada HAP, Am es el rea del pico del soluto

en el cromatograma de la muestra analizada, As es el

rea del pico del mismo soluto en el cromatograma delestndar inyectado, Qm es la cantidad recuperada de solutoen la muestra analizada, Qt es la cantidad de soluto te-ricamente cargada en la precolumna (concentracin delsoluto en la disolucin de carga x volumen cargado) y Qses la cantidad de soluto inyectada (concentracin delsoluto en el estndar x volumen del rizo del inyector). Enlos experimentos con 10 y 25 ml de muestra cargados, serecuperaron totalmente los HAP ligeros (en la muestracon 5 % de acetonitrilo) y los HAP pesados (en la mues-tra con 25 % de acetonitrilo). Por el contrario, con 50 mlde carga, la recuperacin de los solutos, en particular losprimeros de cada grupo, disminuy drsticamente. As,en la muestra con 5 % de acetonitrilo, la recuperacin deNAF fue de 63 % y en la muestra con 25 % del mismodisolvente, la recuperacin de B(a)A fue de 60 %. Por lotanto, se concluy que un volumen de carga de 25 ml erael ms apropiado para una recuperacin ptima y unabuena sensibilidad del mtodo.

Certificacin del mtodo analticoLos resultados de la evaluacin del mtodo desarro-

llado se resumen en las tablas III, IV y V. El estudio delinealidad y exactitud multinivel del mtodo se realiz conmuestras de agua grado reactivo fortificadas con los 16

Compuesto n Ordenada (ng) Pendiente Intervalo (ppb)

AF 5 0.8 1.8 0.92 0.07 0.161 - 2.412ACE 5 -1.3 3.7 1.08 0.09 0.190 - 4.744ACI 5 -1.5 5.8 1.09 0.14 0.183 - 4.565FLU 5 -0.2 0.8 1.04 0.10 0.034 - 0.853FEN 5 0.0 0.6 1.00 0.05 0.056 - 1.387ANT 5 -0.1 0.2 0.99 0.02 0.019 - 0.928FLT 5 -0.2 0.5 1.05 0.07 0.015 - 0.747PIR 5 -0.4 2.6 1.05 0.16 0.054 - 1.813B(a)A 8 -0.2 0.3 1.06 0.02 0.033 - 1.664CRI 8 -0.1 0.5 1.02 0.03 0.042 - 2.107B(a)P 8 -0.1 0.2 1.01 0.04 0.009 - 0.432B(b)F 8 -0.1 0.1 1.00 0.03 0.011 - 0.533B(k)F 8 -0.1 0.1 1.02 0.04 0.008 - 0.416DBA 8 -0.5 3.2 0.93 0.07 0.105 - 5.248B(ghi)P 8 -0.2 0.2 0.94 0.04 0.009 - 0.864I(cd)P 8 -0.4 0.7 0.88 0.04 0.041 - 2.048

TABLA III. LINEALIDAD Y EXACTITUD MULTINIVEL DEL MTODO(CANTIDAD RECUPERADA VS CANTIDAD ANALIZADATERICAMENTE)*

* Coeficientes de correlacin (r) superiores a 0.995; intervalos de confianza de laordenada al origen y la pendiente para un nivel de significin =0.05


HAP a varios niveles de concentracin; para cada nivelse determin la cantidad recuperada de los solutos y serelacion con la cantidad tericamente analizada. En latabla III se reportan las ordenadas al origen y las pen-dientes de las rectas de regresin obtenidas por el mto-do de mnimos cuadrados, junto con sus intervalos deconfianza respectivos; tambin se indican los intervalosde concentracin estudiados para cada soluto, los cualesse encuentran comprendidos entre las partes por trilln ylas partes por billn. Dado que los coeficientes de corre-lacin (r) calculados fueron superiores a 0.995 para to-

dos los HAP y las ordenadas al origen de las rectas deregresin fueron estadsticamente iguales a cero, se puedeconsiderar que el mtodo no presenta errores sistemti-cos y es lineal en el intervalo estudiado de concentracio-nes. Por otra parte, las pendientes, que representan lafraccin de soluto recuperado, se situaron entre 0.88 y1.09, mostrando que la exactitud del mtodo es muy sa-tisfactoria dados los bajos niveles de concentracin delos HAP en las muestras analizadas. Con el fin de cono-cer las capacidades de este mtodo en condiciones lmi-te, se realiz un estudio adicional de precisin y exactitudcon muestras fortificadas a concentraciones cercanas alos lmites de deteccin. La tabla IV muestra que, a es-tos niveles de ultratrazas, la precisin del mtodo medidapor el coeficiente de variacin es 19 % mientras que laexactitud, evaluada por el porcentaje de recuperacin,se encuentra entre 72 % y 129 %. Es interesante men-cionar que la NPS (National Pesticide Survey de EUA)y la EPA establecen como valor aceptable una recupe-racin entre 70 % y 130 %, con un coeficiente de varia-cin mximo de 30 %, para muestras ambientales fortifi-cadas a niveles de ppb (Barcel 1993). En este trabajose obtuvo esa recuperacin para concentraciones a ni-veles de ppt, es decir mil veces menores.

Los lmites de deteccin del mtodo (LDM) se esti-maron a partir de los resultados reportados en la tablaIV, utilizando la siguiente ecuacin:

LDM = t(n-1, =0.99) x DE (3)

donde, DE es la desviacin estndar de las determina-ciones expresada en unidades de concentracin y t(n-1,

=0.99) es el valor de la t de Student para un nivel deconfianza del 99 % y (n-1) grados de libertad, siendo n elnmero de rplicas. El lmite de cuantificacin del mto-do (LCM) se defini como la concentracin correspon-diente a diez veces la desviacin estndar. En la tabla Vse reportan los valores de LDM y LCM para los 16 HAPy se comparan con los lmites de deteccin reportadosen el mtodo 610 de la EPA (USEPA 1984). Como pue-de observarse, el mtodo propuesto en este trabajo per-mite alcanzar lmites de deteccin para los HAP ligerosconsiderablemente menores que los del mtodo oficial.Para los HAP pesados se obtienen tambin lmites dedeteccin menores que los del mtodo EPA, con excep-cin del B(a)A y el DBA, aunque en este caso las dife-rencias entre los valores dados por ambos mtodos sonmenos notorias. Otra caracterstica interesante de com-parar es el volumen de muestra requerido para el anlisisde los 16 HAP; el mtodo EPA est diseado para tra-bajar con un litro de muestra mientras que en el mtodopropuesto slo se necesitan 150 ml (2 frascos con 75 mlde la muestra cada uno). Lo anterior se traduce en me-nores costos y mayor facilidad para el transporte demuestras, lo que representa una gran ventaja cuando las

Compuesto Concentracin R* CV* (ppt) (%) (%)

AF 161 129 3ACE 190 101 5ACI 183 94 10FLU 34.1 99 6FEN 55.5 100 5ANT 37.1 94 10FLT 14.9 85 3PIR 36.3 77 3B(a)A 33.3 100 19CRI 42.1 92 19B(a)P 8.64 107 4B(b)F 10.7 84 6B(k)F 8.32 77 7DBA 105 72 10B(ghi) 8.64 94 9I(cd)P 41.1 82 12

TABLA IV. PRECISIN Y EXACTITUD DEL MTODO (n=4)A CONCENTRACIONES DE HAP CERCANAS ALOS LMITES DE DETECCIN

* R = recuperacin promedio, CV = coeficiente de variacin

Compuesto LCM LDM LDM (EPA 610)(ppt) (ppt) (ppt)

AF 65 29 1800ACE 103 47 1800ACI 165 75 2300FLU 22 10 210FEN 26 12 640ANT 35 16 660FLT 3 2 210PIR 11 5 270B(a)A 62 28 13CRI 73 33 150B(a)P 3 2 23B(b)F 5 2 18B(k)F 5 2 17DBA 74 34 30B(ghi)P 7 3 76I(cd)P 41 18 43

TABLA V. LIMITES DE CUANTIFICACION (LCM) Y DE DE-TECCION DEL METODO (LDM) PARA CADA HAP.COMPARACION CON LOS LDM DEL METODOEPA 610


muestras son colectadas en sitios remotos o de difcilacceso.

Aplicacin del mtodoEl mtodo se aplic para un estudio de estabilidad de

los HAP en medio acuoso y para la determinacin deHAP en una muestra de agua de ro.

La estabilidad de los HAP en solucin se determinen dos medios diferentes, agua grado reactivo y aguapotable. Dos muestras de 75 ml de cada tipo de agua sefortificaron con una mezcla estndar de HAP a las con-centraciones indicadas en la tabla VI, luego se filtrarony prepararon de acuerdo con el procedimiento indicadoen la parte experimental (operaciones fuera de lnea).Las muestras con el acetonitrilo aadido se dejaron ex-puestas a la luz y a la temperatura ambiente por 24 ho-ras. Transcurrido este tiempo se continu con el procedi-miento de extraccin y anlisis en lnea para evaluar ycomparar la estabilidad de los compuestos en los dos ti-pos de agua. Los resultados obtenidos, descritos en latabla VI, muestran que la mayora de los HAP perma-necieron estables por 24 horas en el agua grado reactivo,a la que se haba adicionado acetonitrilo (prctica comnpara la preservacin de muestras) en las proporcionesestablecidas en el mtodo; nicamente se observaron al-gunas prdidas estadsticamente significativas para ANT,B(k)F, B(ghi)P e I(cd)P. Por el contrario, en el agua po-table todos los HAP, con excepcin de FLU (HAP ligero

analizado en la muestra con 5 % de acetonitrilo) y B(a)P(HAP pesado analizado en la muestra con 25 % deacetonitrilo), se degradaron notablemente e incluso algu-nos de ellos desaparecieron totalmente. Es evidente queen este caso el cloro residual presente en el medio con-trarrest en buena medida el efecto protector delacetonitrilo. Por lo tanto, se podra esperar que en au-sencia de disolvente orgnico todos los HAP, con la posi-ble excepcin del fluoreno, seran completamente degra-dados por el cloro. De aqu se concluye que la potabilizacindel agua por cloracin es un mtodo eficaz para eliminarlos HAP de este medio, an a niveles de concentracindel orden de las ppt.

El mtodo desarrollado se aplic tambin para el an-lisis de una muestra de agua superficial proveniente deuna zona expuesta a la contaminacin por HAP. La mues-tra fue colectada en el Ro Seco, al nivel de la ciudad deParaso en la zona petrolera de Tabasco, y conservadade acuerdo con las normas establecidas para este tipo demuestras (USEPA 1984). Los cromatogramas obtenidosdel anlisis de la muestra blanco y la misma muestrafortificada con una mezcla estndar de HAP a las con-centraciones usadas en el estudio precedente (ver TablaVI) se presentan en las figuras 3 a 6. Las figuras 3 y 4corresponden a los cromatogramas UV de la muestrapreparada para HAP ligeros y HAP pesados, respecti-vamente. Aunque los cromatogramas de la muestra blancopresentan algunos pequeos picos que sobresalen delruido de fondo y que eluyen en la misma zona que losHAP, la comparacin cuidadosa con los cromatogramasde la muestra fortificada en las dos figuras lleva a laconclusin de que ninguno de los HAP que dan respues-ta en UV est inequvocamente presente en la muestracolectada del agua de ro. En todo caso, si estuvieranpresentes, sus concentraciones seran muy inferiores alas indicadas en la tabla VI para estos HAP. Cabe men-cionar que en la muestra fortificada preparada para HAPligeros se alcanzan a distinguir los HAP pesados B(a)Ay CRI, los cuales slo se recuperan parcialmente en esteanlisis. De la misma manera, en la muestra fortificadapreparada para HAP pesados se alcanza a distinguir elpico de FLU, HAP ligero que slo se recupera parcial-mente en este anlisis, y los picos de los solutos fronteraFEN y PIR, cuya recuperacin es satisfactoria por cual-quiera de los dos mtodos de preparacin de la muestra.Las figuras 5 y 6 corresponden a los cromatogramas defluorescencia de la muestra preparada para HAP ligerosy HAP pesados, respectivamente. Es importante indicarque ninguno de los HAP que dan seal en fluorescenciaeluye antes de los 25 min; por lo tanto, en loscromatogramas de la muestra blanco los nicos picos deinters son los dos que se observan al final del conjuntode seales ya que sus tiempos de retencin concuerdanexactamente con los del antraceno y el fluoranteno. Es-tos dos HAP son compuestos frontera y el hecho de que

Compuesto Concentracin** Agua reactivo Agua potable(ppt) R (%) R (%)

AF 322 95 62ACE 379 106 n.d.***ACI 365 102 n.d.FLU 68.2 114 102FEN 111 94 55ANT 74.2 73 21FLT 59.7 107 55PIR 72.5 91 n.d.B(a)A 133 115 31CRI 168 - -B(a)P 34.6 99 109B(b)F 42.6 94 74B(k)F 33.3 82 n.d.DBA 420 96 68B(ghi)P 34.6 66 26I(cd)P 164 60 45

TABLA VI. ESTABILIDAD DE HAP EN AGUA GRADOREACTIVO Y AGUA POTABLE FORTIFICADAS*.RECUPERACIN DESPUS DE 24 h A TEMPERA-TURA AMBIENTE

* Muestras con acetonitrilo al 5 % v/v (HAP ligeros: de NAF a PIR) al 25 % v/v (HAP pesados: de B(a)A a I(cd)P)

** Concentracin a la que fueron fortificadas las muestras*** n.d.= no detectado (degradacin total). CRI no fue determinado

en este estudio


sus picos estn claramente presentes en la muestra blancopreparada para HAP ligeros y en la de HAP pesadoscomprueba su identidad. Adems, ANT y FLT prctica-mente no dan seal en UV a 262 nm, por lo tanto, el queno se observen picos en la zona donde eluyen estos com-puestos (entre FEN y PIR) en los cromatogramas deUV (Figs. 3 y 4) es una confirmacin adicional de suidentidad. Por otra parte, las figuras 5 y 6 tambin com-prueban que ninguno de los otros HAP que dan respues-ta en fluorescencia est presente en la muestra colecta-da del agua de ro.

La determinacin de ANT y FLT en la muestra de

agua de ro se realiz por el mtodo de adiciones patrnpara evitar errores por efecto de matriz. Utilizando losreportes de reas de pico de los cromatogramas de lafigura 5 se efectu el clculo por medio de la siguienteecuacin:

Cbi = [Abi x Qadi x (Vb + 25) ] / [ (Afi Abi) x(Vf + 25) x Vb] (4)

donde, Cbi es la concentracin del soluto de inters (ANTo FLT) en la muestra blanco (agua de ro), Abi es el rea

Fig. 3. Cromatogramas UV obtenidos del anlisis de una muestra deagua de Ro Seco, Tab., tratada por el procedimiento paraHAP ligeros. (A) muestra blanco y (B) muestra fortificadacon los HAP a las concentraciones mencionadas en la tablaVI. Identidad de picos en la muestra fortificada como en lafigura 2

Fig. 4. Cromatogramas UV obtenidos del anlisis de una muestra de agua deRo Seco, Tab., tratada por el procedimiento para HAP pesados. (A)muestra blanco y (B) muestra fortificada con los HAP a las concentra-ciones mencionadas en la tabla VI. Identidad de picos en la muestrafortificada como en la figura 2


del pico del soluto en la muestra blanco, Afi es el rea delpico del soluto en la muestra fortificada, Qadi es la canti-dad de soluto que se adicion en la muestra fortificada(concentracin del soluto en el estndar x alcuota adicio-nada), Vb es el volumen de la muestra blanco (75 ml), Vfes el volumen de la muestra fortificada (75 ml) y el nme-ro 25 corresponde a los ml de agua+acetonitrilo que seaadieron a la muestra durante su preparacin.

El contenido de los HAP presentes en la muestra deagua de Ro Seco fue el siguiente (valor promedio de dosdeterminaciones en la misma muestra):

Antraceno 29 ppt

Fluoranteno 26 pptEstos valores son mucho ms bajos que los que esta-

blecen las normas europeas (mencionadas en la Intro-duccin) para aguas superficiales. As, mediante este ejem-plo, se demuestra que el mtodo desarrollado permitedeterminar concentraciones de HAP notablemente infe-riores a los lmites mximos establecidos en las msestrictas normas reguladoras de calidad del agua. Porello, se propone este mtodo como una herramienta til yconfiable para el monitoreo ambiental.

Fig. 6. Cromatogramas de fluorescencia obtenidos del anlisis de unamuestra de agua de Ro Seco, Tab., tratada por el procedi-miento para HAP pesados. (A) muestra blanco y (B) muestrafortificada con los HAP a las concentraciones reportadas en latabla VI. Los picos con (*) en el blanco fueron identificadoscomo ANT y FLT. Identidad de picos en la muestra fortifica-da como en la figura 2

Fig. 5. Cromatogramas de fluorescencia obtenidos del anlisis de unamuestra de agua de Ro Seco, Tab., tratada por el procedi-miento para HAP ligeros. (A) muestra blanco y (B) muestrafortificada con los HAP a las concentraciones reportadas en latabla VI. Los picos con (*) en el blanco fueron identificadoscomo ANT y FLT. Identidad de picos en la muestra fortifica-da como en la figura 2

Tiempo (min)

Tiempo (min)


CONCLUSIONES

Se desarroll y certific un mtodo analtico para de-terminar con buena precisin y exactitud los 16 HAP dela lista de contaminantes prioritarios de la EPA a muybajos niveles de concentracin en muestras de agua. Elmtodo est basado en el acoplamiento en lnea de la EFScon la cromatografa de lquidos, lo que permite simplificarla preparacin de muestra reduciendo al mnimo su mani-pulacin. Con respecto a los mtodos oficiales basados enla extraccin lquido-lquido, el mtodo propuesto presentavarias ventajas: se requiere un menor volumen de muestrapara el anlisis, se reduce el consumo de disolventes org-nicos durante la etapa de preparacin de muestra, es unproceso ms limpio, seguro y econmico y, adems, esautomatizable. Comparado con mtodos similares (basa-dos en la EFS en lnea) previamente reportados, el presen-te mtodo provee los procedimientos necesarios para evi-tar prdidas de analitos desde las primeras etapas del pro-ceso de preparacin de muestra, con menos problemasoperativos y un montaje experimental muy simple, por loque resulta ms sencillo y robusto y conduce a resultadosms confiables. La efectividad del mtodo se demostrmediante su aplicacin al seguimiento y determinacin deestos contaminantes en aguas superficiales y tratadas.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo financiero otorgadoa este trabajo por el Consejo Nacional de Ciencia y Tec-nologa de Mxico (CONACyT) a travs del proyecto28355-U.

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