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Cromatografía: conceptos fundamentales. Cromatografía de Adsorción y Partición
La Cromatografía es una técnica que permite separar, aislar y purificar y
en ciertas condiciones identificar los componentes de una mezcla de
compuestos químicos. En todo proceso cromatográfico intervienen fuerzas
que permiten una distribución selectiva de los constituyentes de la mezcla
entre dos fases: una fija y una móvil y la distribución de las sustancias
depende de las propiedades de estas fases y de las características
estructurales de las sustancias.
Según el fenómeno físico-químico que ocurra durante el proceso la
cromatografía se clasifica en:
Adsorción
Partición
Intercambio iónico
Filtración por gel
Dentro de las dos primeras hay una clasificación adicional basada en las
propiedades del estado físico de las fases como se muestra a continuación.
Tipo Fase estacionaria Fase móvil Nombre Adsorción Sólida Líquida
Gaseosa c. sólido-liq. c. sólido-gas
Partición Líquida Líquida Gaseosa
c. liq.-liq. c. gas-liq.
En todo proceso cromatográfico hay etapas que se repiten independiente
del tipo de cromatografía y son:
• preparación de las fases, tanto de la móvil como de la
estacionaria.
Cromatografía
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• siembra del material a cromatografiar.
• desarrollo cromatográfico.
• revelado (que consiste en poner de manifiesto las sustancias
separadas por cromatografía.
El proceso mediante el cual una fase móvil provoca el arrastre de los
productos de la mezcla sembrada (muestra) a lo largo de la fase estacionaria
recibe el nombre de elución o desarrollo cromatográfico. El producto
cromatografiado se llama eluato.
Los productos separados pueden querer aislarse o no. Si lo que queremos
es sólo saber cuántos constituyentes hay en una mezcla o tener idea del tipo
de constituyentes que hay en una mezcla, el modo es analítico. Si se
pretende separar y aislar una sustancia empleando cromatografía el modo se
denomina preparativo.
La fase estacionaria puede colocarse sobre una placa plana ó en un tubo
cilíndrico dando lugar a la cromatografía en capa fina y a la cromatografía en
columna respectivamente. Todos los tipos de cromatografía que se describen
a continuación se pueden llevar a cabo en capa fina o en columna.
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
La cromatografía de adsorción es un fenómeno de superficie, en
ningún momento la sustancia ingresa al material de la fase fija (Fig.1).
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La fuerza con la que un compuesto se adsorbe depende de las
propiedades del adsorbente, de las propiedades solvente y de la estructura
de la sustancia a cromatografiar (soluto). La presencia de momento dipolar y
la posibilidad de formar puente H asegura la retención del soluto sobre el
adsorbente y es esto lo que permite que los solutos se separen (Fig. 2).
Figura 2. Separación de una muestra pura y una mezcla que la contiene
Características de la fase fija
• Actividad o poder adsorbente. Depende de la superficie disponible
para realizar los equilibrios adsorción – desorción. Esta superficie se ve
disminuida por la presencia de moléculas de agua pegadas al adsorbente.
Cada molécula de H2O bloquea un sitio activo en donde no se efectuará el
proceso cromatográfico. Los adsorbentes de uso más frecuentes son la
alúmina (Al2 O3 – trióxido de Al) y la sílica gel (Fig. 3) que es el dióxido de Si
(Si O2). La actividad grado I es la que corresponde al adsorbente exento de
H2O. El adsorbente será menos activo cuando tenga más H2O.
Figura 3. Estructura de la Sílica Gel
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• Inercia. El adsorbente no debe reaccionar con los solutos. Sin embargo,
esto no se logra en todos los casos. Se ha publicado que tanto la alúmina
como la sílica gel pueden catalizar reacciones y transformaciones de ciertos
solutos dando lugar a “artefactos” en los procesos de separación. La alúmina
puede catalizar reacciones de condensación aldólica y la sílica puede
catalizar reacciones de aperturas de epóxidos, lactonizaciones, hidrólisis de
ésteres para algunos compuestos sensibles. En algunos procesos se intenta
que la fase haga una retención selectiva de algún tipo de producto y para eso
se procede a “dopar” el adsorbente. A la alúmina se le confieren propiedades
ácidas o básicas. A la sílica gel se la trata con AgNO3 a fin de retener
selectivamente los alquenos y separarlos de los alcanos (se emplea un 8 a
10% de esta sal de plata sobre el adsorbente).
• Forma, tamaño y homogeneidad del gránulo. Hay materiales
amorfos y esféricos. La sílica para capa fina y para columna de mesada es
amorfa y porosa. Para que las separaciones sean eficientes se debe tratar
que los gránulos del adsorbente sean pequeños y parejos en tamaño, ya que
la separación cromatográfica está relacionada con el tamaño y forma de las
partículas. A menor tamaño y mayor uniformidad de los gránulos se hace
más eficiente la separación como se ve en la Fig. 4. La limitación en el
empleo de micro partículas proviene del consecuente aumento de la presión
a menor tamaño. La sílica para CCF emplea gránulos de 10 a 40 micras de
diámetro mientras que la de columna de mesada emplea gránulos que
oscilan entre 60 y 200 micrones. Esto implica una resolución menor en
columna que en capa fina. Si los gránulos no son parejos la resolución se
afecta notablemente. La eficiencia de una separación depende del
empaquetamiento de la fase fija. En (1) los compuestos saldrán mezclados
por la irregularidad de los gránulos, mientras que en (2) las moléculas iguales
saldrán juntas (Fig. 4).
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(1) (2)
Figura 4. Empaquetamiento de la fase fija
• La porosidad es otra propiedad del adsorbente que se debe tener en
cuenta. Para evitar adsorciones irreversibles los poros deben ser mayores de
5 nm.
Tamaño del poro
Sílica gel 60 Å 60 es el tamaño medio del poro
Elección del Adsorbente Elegir el adsorbente adecuado dependerá del tipo de compuestos a
cromatografiar.
Tabla 1. Adsorbentes para cromatografía de adsorción en orden general
de aumento de actividad
Celulosa < Almidón < Azúcar < Silicato de magnesio < Sulfato de calcio <
Ácido silícico < Florisil < óxido de magnesio < Óxido de aluminio < Carbón
activado
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El carbón activado difiere de los otros adsorbentes porque no tiene grupos
polares en su estructura y por lo tanto no participa en la formación de
puentes H como todos los demás. La capacidad de adsorción sobre el C
depende de la polarizabilidad del compuesto. Esta aumenta con el
incremento de dobles ó triples enlaces y grupos aromáticos.
Elución de solutos
Tabla 2. Solutos ordenados por polaridad creciente
Hidrocarburos < Olefinas < Éteres < Compuestos halogenados <
Aromáticos < Cetonas < Aldehídos < Ésteres < Alcoholes, aminas,
mercaptanos < Ácidos y bases débiles
En cuanto a los solutos, uno que forme puente H y que presente polaridad
permanente ó inducida será más retenido que otro que no presente estas
propiedades.
Por ejemplo: entre un ROH y un aldehído relacionados estructuralmente el
ROH será más retenido por ser donor de puente.
En el caso de un alqueno simétrico trans
H3C H2C H C C H CH2 CH3 H H C C H3C H2C CH2 CH3 La presencia de muchos grupos funcionales no garantiza que la retención
aumente linealmente con el aumento de los grupos.
Se anulan
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En el siguiente esquema podemos ver que si el grupo NO2 se ubica en
posición orto se anula el efecto del OH por el puente que se forma con el
NO2.
Adsorbente Adsorbente
Pte H
p-nitrofenol o-nitrofenol
Características del eluyente
• Pureza. Los solventes para Cromatografía deben ser de calidad p.a y se
tiene que conocer las impurezas que contienen y la cantidad de las mismas.
Pequeñas cantidades de un “solvente polar” le modifican notablemente sus
propiedades cromatográficas. Así como trazas de productos básicos ó
ácidos que afectan la resolución y las cromatografías no son reproducibles.
• Inercia. En general los solventes para Cromatografía de adsorción no
reaccionan con los solutos, o sea son inertes.
• Polaridad del solvente. Los solventes tienen distintas polaridades
dependiendo de los grupos funcionales de sus moléculas. Naturalmente los
alcanos son los menos polares, mientras que los ácidos son los más
polares; entre estos están todos los otros solventes como ésteres,
aldehídos, cetonas, etc. (Tabla 3).
O
+O-OO
O N
OO
O+
-
H
N O O O - O +
O
OH
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Tabla 3. Serie eluotrópica con polaridad creciente
Éter de petróleo < Ciclohexano < Tetracloruro de carbono < Benceno <
Cloruro de metileno < Cloroformo < Éter < Acetato de etilo < Piridina <
Acetona < n- propanol < Etanol < Metanol < Agua < Ácido acético
El CHCL3 comercial contiene 1,5 % de etanol como estabilizante para
inhibir la formación de fosgeno (Cl2CO, gas a T ambiente) más HCl por
efecto de la luz. Al tener EtOH, la polaridad del CHCl3 aumenta.
Los solventes muy polares producen arrastres masivos del material a
cromatografiar (soluto), pues arrastran los solutos no polares, medianamente
polares y polares.
(1) (2) (3)
Siembra
En (1) se usó un solvente de baja polaridad. En (3) se usó un solvente muy
polar. En (2) se usó un solvente de mediana polaridad. Es posible hacer
mezclas de solventes para ampliar el rango de polaridades, siempre que la
mezcla sea homogénea (ó sea 1 sola fase) y se puede conocer la polaridad
de esa mezcla aplicando una ecuación que relaciona la proporción de cada
solvente y la polaridad del mismo PM = θ1P1 + θ2P2
ο
ο
ο ο
ο ο
Eluc
ión
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Hay solventes que además de ser polares, forman puente H y este
hecho cambia la selectividad en la separación. Por ejemplo: el acetonitrilo
(CH3CN) y el metanol (MeOH) son dos solventes polares, pero el MeOH
puede formar puente H y el CH3CN no. Entonces, la selectividad de ellos en
la separación es diferente.
CARACTERISTICAS DEL PROCESO CROMATOGRÁFICO
La velocidad del eluyente tiene que ser la adecuada para que se
establezcan los equilibrios de separación. Si la velocidad es muy rápida
estos equilibrios no se logran. Si es muy lenta se favorece la difusión.
En todo proceso cromatográfico se siembra la mezcla y en el momento
que comienza el proceso de elución el o los solventes arrastran los
componentes en una sola dirección si la velocidad es la adecuada. Si la
velocidad es lenta el soluto puede difundir en el líquido en todas direcciones
y los compuestos separados pueden volver a mezclarse.
En cromatografía la difusión puede hacer disminuir la resolución del
proceso.
La temperatura es un aspecto a tener en cuenta en un proceso
cromatográfico. Los distintos tipos de cromatografía (adsorción ó partición),
pueden realizarse a temperatura ambiente o superiores a la misma.
Aplicaciones Cromatografía en Capa Fina y en Columna En función del tipo de distribución para la fase estacionaria, se puede
establecer la siguiente clasificación :
- Cromatografía en capa fina: una capa de adsorbente de espesor
uniforme se deposita sobre una placa de vidrio, aluminio o plástico.
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- Cromatografía en columna: el adsorbente se deposita en el interior
de una columna de vidrio.
Cromatografía en capa fina (CCF) La CCF permite establecer rápidamente si una muestra está constituida
por uno o más componentes y efectuar la selección del adsorbente y del
disolvente adecuado para una futura separación en columna o capa
preparativa.
El adsorbente para CCF contiene un aglutinante para que no se cuartee la
placa, el más usado es el yeso, esto se indica en el nombre con la letra G. La
mayor parte de las placas de cromatografía llevan un indicador fluorescente,
el cual se indica con la letra F, que permite la visualización de los
compuestos activos a la luz ultravioleta (254 nm). En el caso de compuestos
que no absorban luz UV la visualización requiere utilizar un agente revelador
químico.
Los pasos a seguir para realizar una CCF son:
1.- Elegir el adsorbente para preparar la CF
2.- Elegir el solvente en base a la muestra a cromatografiar.
3.- Ambientar la cuba con el solvente elegido para que los vapores del
mismo saturen todo el recipiente
4.- Sembrar la muestra, para esto la muestra debe estar disuelta en un
solvente volátil, éste se evapora y queda depositada en la placa sólo el
material a cromatografiar. La siembra debe ser puntual y puede hacerse en
punto o banda. Para fines analíticos (0,5 mm de espesor) se siembra en
punto y para fines preparativos (2 mm de espesor) en banda. Las alícuotas
se colocan, mediante un capilar, sobre un mismo punto para cada muestra
esperando que se evapore el solvente de la siembra anterior para depositar
la siguiente. Sobre una misma placa se puede cromatografiar varias
muestras, conservando los puntos de la siembra sobre una línea recta
paralela al borde inferior de la placa.
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En CCF analítica la cantidad máxima de siembra es de 0,5 mg. En CCFP
la cantidad máxima de siembra en una placa de 20 x 20 cm es de 50 mg.
5.- Desarrollo o elución. Una vez que el solvente alcanza 1 cm antes del
borde superior de la placa se la saca de la cuba, se la seca al aire y se
procede al revelado.
6.- Revelado. Esto significa poner de manifiesto las sustancias que se han
separado. Se pueden emplear métodos físicos o químicos.
Entre los métodos físicos se usa la luz UV de distintas λ para iluminar la
placa que ha sido preparada con sílica gel GF254. Se ven por ejemplo las
clorofilas de color rojo, los flavonoides de color amarillo. Este revelado es un
método no destructivo, se usa mucho en CCFP. En el caso que las
sustancias no absorban la luz UV se emplean los reveladores químicos,
entre ellos el yodo, ácido sulfúrico en solución concentrada, al I2 se lo usa
dentro de una cámara de sublimación.
El I2 sublima a temperatura ambiente de modo que se combina con las
muestras de la placa que presentan electrones π como ser un doble enlace o
bien con compuestos oxigenados que puedan formar un complejo de
transferencia de carga que generalmente dan color marrón. Existen una
amplia gama de reactivos reveladores específicos para un grupo particular.
7.- Cálculo del Rf. Para informar la situación cromatográfica es necesario
establecer una relación de frentes que se saca con respecto al solvente.
El Rf es la distancia desde la siembra hasta la posición de un determinado
compuesto dividido por la distancia que recorre el solvente. Los valores de Rf
siempre son menores que 1. Una sustancia se considera adecuadamente
cromatografiada cuando su Rf está entre 0,3 y 0,8.
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Cromatografía en columna (CC) Es el método más general para la separación y purificación de compuestos
orgánicos, sólidos o líquidos, a escala preparativa. Esta técnica se emplea
cuando se tienen mezclas en cantidades superiores a los 100 mg.
Para la CC los adsorbentes no tienen aditivos ni indicadores fluorescentes.
La sílica de grano más pequeño para CC es de 270-400 Mesh (Mesh-
malla). Cuando disminuyo el tamaño de una partícula aumenta la superficie
de contacto para una determinada área y si aumento la superficie aumento la
eficiencia de la separación, pero siempre hay límites ya que si se usa en una
CC sílica de más de 400 Mesh, el solvente fluirá con dificultad.
Una vez elegido el adsorbente (dependiendo del grado de dificultad de la
muestra) se elige el solvente o la mezcla de solventes a usar. El adsorbente
más utilizado es la sílica gel. Cuando ésta es incompatible con la mezcla a
cromatografiar se emplea alúmina o florisil (silicato magnésico).
El solvente a elegir será aquel que en el testeo por CCF haya ubicado al
compuesto que queremos separar en un Rf = 0,3-0,8.
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La fase estacionaria (adsorbente) se deposita en el interior de una
columna de vidrio que termina en un estrechamiento con una llave, y se
impregna con la fase móvil (eluyente).
¿Qué columna elijo? Las proporciones de diámetro del tubo con respecto
a la altura adsorbente de la columna es de 1:10 (puede ir de 1:8 a 1:12).
Una vez eluidas las fracciones de la CC deben analizarse por CCF para
comprobar su contenido, su pureza y seguir el curso de la separación. La
cantidad que se recoge en cada fracción depende del volumen de la
columna. La CCF se realiza con un solvente de polaridad ligeramente
superior al utilizado en la columna porque el adsorbente es más pequeño en
la CCF que en la CC. Por ej. Si en la CC se usó CHCl3 en la CCF se usará
CHCl3 – éter (9:1).
Cuando las CC son de mezclas muy complejas se trabaja con un gradiente
de polaridad de los solventes. Se comienza con el solvente menos polar (con
el que se empaqueta la columna) y se va aumentando poco a poco para que
el cambio no afecte la separación.
El proceso cromatográfico se llama isocrático cuando se usa el mismo
solvente y con gradiente cuando se usa una mezcla (se va aumentando la
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polaridad). Si el Rf en la CCF es bajo se puede hacer una recromatografía
con el mismo solvente o con otro diferente.
¿Qué cantidad de adsorbente cargaremos en la columna? Dependerá
de la mezcla a separar. Dependiendo de la dificultad de la separación la
proporción adsorbente – Muestra será de 10:1 a 100:1.
Cuando sea más difícil la muestra se usará la proporción de 100:1 (gr)
porque va a haber más platos teóricos en una separación cuando más
adsorbente haya. La más común será la proporción 30:1 para mezclas de
complejidad intermedia.
¿Cuáles serán los solutos más retenidos? Serán los más polares ya
que trabaja igual que una CCF y los primeros que fluirán serán los menos
polares si el relleno es de Sílica Gel.
CROMATOGRAFIA DE PARTICION
En este tipo de cromatografía los solutos se reparten entre dos fases
líquidas inmiscibles entre ellas, como ocurre en el proceso de extracción y el
proceso de disolución en ambas fases maneja la cromatografía.
Un soluto que sea muy soluble en la fase fija será más retenido que otro
que no sea tan soluble. Los materiales que se emplean como fases
estacionarias son: polvo de celulosa, papel de filtro, almidón, que contienen
en su estructura agua de hidratación, la cual constituye la fase estacionaria
real en la que se pueden disolver los solutos. Los solventes en este caso son
sustancias inmiscibles en la fase estacionaria. A esta Cromatografía en papel
ó celulosa se la llama Cromatografía líquida – líquida por ser las fases fija y
móvil líquidas.
La Cromatografía de partición se ha usado a escala analítica y preparativa
para separar azúcares, glicósidos, aminoácidos, es decir, productos muy
polares, que si se hubiesen intentado cromatografiar por Cromatografía de
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adsorción hubiesen quedados agarrados en la siembra ya que esta técnica
de adsorción no es útil para compuestos tan polares.
De modo que si sembramos glucosa en papel y la eluímos con butanol –
Piridina – H2O lograremos cromatografiarlas.
Ahora sí, si a la sílica gel se le pega H2O en su superficie hasta saturarla,
puede servir para Cromatografía de partición. La fase estacionaria sería el
H2O y la fase móvil un solvente inmiscible en ella.
Como se ve la fase estacionaria líquida es en general agua pero en el
caso de la HPLC en fase reversa, que también se considera una
cromatografía de partición, la fase fija es una larga cadena hidrocarbonada.
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Se lleva a cabo con materiales especiales de estructura porosa insolubles
en H2O. Contienen grupos reactivos asociados a iones lábiles capaces de
ser intercambiados con los del medio que los rodea durante el proceso
cromatográfico.
El intercambio de iones es el único fenómeno que ocurre en el material
durante todo el proceso cromatográfico que en general tiene lugar en medio
acuoso. Se emplea en la separación de sustancias iónicas tanto orgánicas
como inorgánicas, polielectrolitos, proteínas, hormonas, ácidos nucleicos y
otras sustancias biológicamente importantes. Se emplean tres tipos de
materiales: las resinas, los geles y las celulosas de intercambio iónico que
difieren en microestructura y grupos intercambiadores. Las resinas más
usadas son las sintéticas como las de poliestireno que se puede fabricar
con porosidad uniforme polimerizando estireno y uniendo las cadenas con
divinilbenceno. Sobre este polímero se introducen grupos ácidos que actúan
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como intercambiadores catiónicos o básicos que actúan como
intercambiadores aniónicos.
Como la mayoría de los compuestos a separar no son anfóteros pueden
lograrse fácilmente separaciones de aniones entre cationes o compuestos
iónicos de no iónicos. El método bien manejado permite separar
selectivamente diferentes aniones y cationes. Los factores que gobiernan la
selectividad de una resina frente a un ión particular son:
1. Valencia
2. Radio iónico
3. Concentración
4. Naturaleza del intercambiador
5. Solvente
Los iones que difieren en su valencia o tamaño, normalmente se separan
sin dificultad.
Los materiales intercambiadores porosos descriptos (empleados en
cromatografía clásica) tienen poco uso en HPLC porque colapsan a altas
presiones. Se han debido diseñar nuevos materiales para HPLC de
intercambio iónico.
CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN SOBRE GELES
Por filtración sobre geles la separación se realiza según el volumen
molecular. Se introdujo esta técnica con la creación de un gel: Sephadex
que se obtiene a partir de un polisacárido, el “dextrano”, el cual se somete a
entrecruzamientos de sus cadenas moleculares. Debido a su elevado
contenido en grupos oxhidrilos el producto tiene gran afinidad con el H2O.
Cuando al gel se le agrega H2O, se hincha formando un material
semitransparente que puede colocarse en una columna cromatográfica.
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Las sustancias cuyo tamaño ó volumen molecular sea superior al de los
poros (límite de exclusión) del gel hinchado no pueden penetrar en los poros
por lo que pasan a través de la columna arrastrados por el solvente. En
cambio las moléculas más pequeñas pueden penetrar en los poros del gel y
entonces serán retenidas. Esta técnica se usa ampliamente para el
fraccionamiento de macromoléculas como proteínas, polisacáridos, ácidos
nucleicos.
El nivel de entrecruzamiento de un polímero le confiere rigidez y
resistencia al colapso por presión. El advenimiento de fases estacionarias
que pueden someterse a altas presiones y pueden sintetizarse con gran
homogeneidad en cuanto al tamaño del poro y con poros de diferentes
tamaños ha extendido el uso de este tipo de cromatografía a moléculas
pequeñas por ejemplo con pesos moleculares de 100 Daltons y con la
posibilidad de separar dos moléculas que difieren en un 10% de su peso
molecular. Los materiales que se emplean para la llamada GPC (gel
permeation chromatography, con mezclas de solventes orgánicos) son de
tipo estireno divinilbenceno altamente entrecruzado, que se vende como
STYRAGEL ó μSTYRAGEL. Se trata de un gel hidrofóbico. Otros materiales
disponibles son aquellos basados en sílica. Un gel polimérico llamado
Hydrogel se compone de partículas esféricas, porosas altamente
entrecruzado lo que le confiere una gran rigidez. Esta fase se ha empleado
con presiones de hasta 250 atmósferas. Es posible su uso con agua y
algunos solventes lo que permite un rango amplio de solubilidad de
sustancias. Como el gel es polar pueden ocurrir fenómenos de adsorción los
que se minimizan agregando un 0.5 por mil de una sustancia con grupos
funcionales similares a los de mi muestra que compiten por los sitios de
adsorción. Cuando más pequeñas son las partículas de relleno es mayor la
eficiencia de la separación.
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CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA PRESIÓN O DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Llamada comúnmente HPLC (High performance liquid cromatography) es
conceptualmente similar a la cromatografía líquida clásica. La diferencia
radica en que el relleno de columna se hace con partículas de hasta 3 µ lo
que produce un empaquetamiento tan denso que sólo a gran presión el
eluyente puede atravesar la columna (hasta 500 atm). Con estos rellenos la
eficiencia aumenta considerablemente lográndose la separación de solutos
muy semejantes estructuralmente en un proceso que se puede realizar en
escasos minutos. Separaciones de este tipo sólo se lograban en GC pero
nunca con una columna de líquidos por lo que HPLC viene a solucionar los
problemas de separación de sustancias termolábiles, de sustancias muy
polares o de sustancias poco polares de alto peso molecular que no se
separan por GC.
Así es como nacen los cromatógrafos líquidos que necesitan un sistema
de bombeo para impulsar el líquido por el relleno tan finamente pulverizado.
Las modificaciones introducidas son fundamentalmente dos: (1) la
fabricación de relleno de columna con partículas de hasta 3 µ de esta forma
al ser cada vez más pequeñas las partículas, el relleno es más uniforme. (2)
la fabricación de las llamadas fases ligadas. Un cromatógrafo líquido (Fig. 5)
consta de una bomba, inyector, columna, detector y registrador, pero el
corazón del equipo es la columna y es en el relleno de la columna en donde
se lleva a cabo la separación de los componentes de una mezcla en estudio.
En CL las columnas se fabrican con tubos de acero que pueden resistir hasta
500 atm. de presión y en su interior está la fase estacionaria. El diámetro del
tubo debe ser muy preciso y las paredes internas finamente pulidas. Si el PM
de la muestra es menor que 2000 Daltons y se trata de compuestos solubles
en solventes orgánicos, por ejemplo hexano, se utiliza la técnica de
cromatografía denominada Fase Normal.
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Figura 5. Equipo de HPLC
Empaquetamiento de la columna y fase estacionaria para HPLC
Desde el comienzo de la Cromatografía se han usado tres tipos de
partículas microporosas de porosidad, forma y tamaño variables.
Según las características de las partículas del material de
empaquetamiento, se clasifican en: (Fig. 6)
1) – Partículas totalmente porosas.
2) – Partículas de centro sólido o con absorbente pelicular.
3) – Partículas microporosas.
1) 2) 3)
Figura 6. Material de empaquetamiento
La (1) se fabrica con un adsorbente como sílica gel, alúmina y los poros
alcanzan hasta el corazón de la partícula.
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La (2) consta de un centro o corazón que puede ser una esfera de vidrio y
que está recubierta con el material cromatográfico.
En (1) los poros son muy profundos (50 µ) y en ellos se pueden encontrar
fase móvil estancada, por lo que la transferencia de solutos se hace difícil y
se ensancha el pico cromatográfico.
La carga de muestra que puede sostener un empaquetamiento pelicular
es muy chica comparada con la totalmente porosa. La cantidad de muestra
es muy pequeña.
La solución definitiva se logra cuando se inventan las partículas
microporosas (3) con un tamaño de 5 – 10 µ y que ahora ya hay de 3 µ. Con
este tipo de material se logran eficiencias >> que con las otras partículas.
Estas partículas microporosas llegan a tener una superficie específica de 300
– 400 m2 por cada gramo de relleno (hay >> cantidad de platos teóricos).
La 2º modificación que ha ampliado enormemente el rango de sustancias a
ser cromatografiadas por líquidos es la fabricación de las llamadas fases ligadas. Estas se fabrican haciendo reaccionar la sílica gel con diferentes
sustancias obteniéndose como productos, materiales como alcoxisilanos,
alquilamino silanos, etc.
Recordemos que en fase normal, la sílica gel separa por dos razones: por
el µ y por la posibilidad de formación de puente H. Las sustancias muy
polares se agarran irreversiblemente a la sílica de modo que no se la puede
separar y las sustancias no polares salen con el solvente, como ocurre en
una CC.
En la fase ligada de la cual un caso especial es la fase reversa a la sílica
se le tapan los sitios activos (o sea se tapan los OH), de modo que ahora la
elución de los compuestos se harán de forma inversa, es decir saldrán
primero los más polares y al último los menos polares.
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Con estas fases ligadas se logra que el material de relleno de la columna
tenga una selectividad diferente en la retención de las sustancias.
En un principio se pegaron grupos R al O fabricando los alcoxisilanos (1) o
se pegaron grupos R directamente al Si fabricando los alquil silanos (3),
también se puede pegar una amina fabricándose los alquil amino silanos,
pero este material es hidrolizable a pH inferiores o iguales a 5 y apenas por
arriba de pH 7, entonces había una limitación muy seria en su uso.
Luego se mejoró la técnica de fabricación de la fase ligada haciendo
reaccionar la sílica con cloruro de alquil silanos dando lugar a las a fases R
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con las cuales ya se puede trabajar tranquilamente entre pH 8.5 y 2.5. En la
actualidad ya se han fabricado otras fases para los rangos por encima de 8 y
por debajo de 3.
Si al Si se le pega una cadena de 18 átomos de C se anula la posibilidad
de formación de pte H, o sea, se anula la punta hidrofílica para transformarla
en hidrofóbica. Se transforma en fase reversa y es la que se llama ODS (5)
(octadecil silano).
Es posible agregar cadenas alquílicas que tengan grupos polares, y en
este caso, la sílica tiene una cierta polaridad. Este sería el caso por ejemplo
de una columna CN (8), o sea se le ha pegado a la sílica un silano con un
grupo CN (nitrilo o ciano comp.), que tiene una selectividad distinta a la sílica
y sirve para separar polioles.
Otra columna que tiene una cierta polaridad es la amino (9), se pega un
alquilo con un NH2 en la punta. Esta columna sirve para separar azúcares
por excelencia.
Una cromatografía se dice de FN cuando se usa sílica gel, alúmina, sin
ningún agregado, es decir la separación está basada en interacciones dipolo
– dipolo del OH de la sílica con los solutos o en la posibilidad de formar pte
H, o sea el empaquetamiento tiene alta polaridad. En FR el
empaquetamiento es de baja polaridad.
En cuanto a la polaridad de los solventes en FN de media a baja, mientras
que en FR la polaridad es de media a alta.
Un incremento en la polaridad del solvente en FN reduce el tr o elución de
un compuesto, mientras que en FR incrementa el tr o elución.
En FN los compuestos no polares no se retienen y por lo tanto no se
separan, mientras que los muy polares quedan agarrados en la siembra y
tampoco se separan. Estas serían las pautas de polaridad, que se soluciona
con la FR que puede separar compuestos muy polares y poco polares.
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Fase reversa
En cromatografía en fase reversa, la fase estacionaria es generalmente un
hidrocarburo inerte y la única interacción de dicha fase con el soluto es
hidrofóbica, por lo que la selectividad está controlada por el efecto del
solvente. La fase móvil más usada es el agua (altamente polar) en mezclas
con un solvente menos polar y miscible en ella como metanol, acetonitrilo,
THF, etc.
Para evitar confusiones, emplearemos fuerza del solvente tanto en fase
normal como en fase reversa para indicar el poder de elusión que dicha fase
posee. Esto es, a mayor fuerza del solvente, los compuestos eluyen más
rápidamente (menor tiempo de retención), tanto si nos referimos a FN o FR.
En cambio, si hablamos de polaridad del solvente, en el caso de FN, a mayor
polaridad mayor es la fuerza del solvente, menor tiempo de retención y en
FR a mayor polaridad, menor es la fuerza del solvente, mayor el tiempo de
retención.
El agua es el solvente más débil, debido a la baja solubilidad de los
compuestos en la misma, lo que lleva a una mayor interacción del soluto con
la fase estacionaria no polar produciendo en consecuencia mayores tr. Incrementando la concentración del solvente menos polar disminuye el tr por
ser más afín al mismo y sufrir poca interacción con la fase estacionaria.
Ejemplo: la molécula no polar de naftaleno es soluble en la fase
estacionaria no polar y menos soluble en la fase móvil polar MeOH - H2O.
Incrementando el contenido de metanol de la fase móvil, se incrementa la
solubilidad del naftaleno en esta fase y eluye de la columna con mayor
rapidez. Inversamente si la muestra eluye muy rápidamente, debe
incrementarse el contenido de agua con lo que se permite que la muestra se
disuelva preferentemente en la fase estacionaria, permaneciendo mayor
tiempo en la columna.
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BIBLIOGRAFIA
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y Csaky, AG. Editorial Síntesis. 2000.
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Kirkland, JJ; Dolan, JW. John Wiley & Sons. 2010.
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Group, LLC. 2011.
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Sons. 1992.
• Química Orgánica, fundamentos teórico – prácticos para el
laboratorio. GalagovsKy Kurman, Lydia (1995).