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Cromatografía: conceptos fundamentales. Cromatografía de Adsorción y Partición

La Cromatografía es una técnica que permite separar, aislar y purificar y

en ciertas condiciones identificar los componentes de una mezcla de

compuestos químicos. En todo proceso cromatográfico intervienen fuerzas

que permiten una distribución selectiva de los constituyentes de la mezcla

entre dos fases: una fija y una móvil y la distribución de las sustancias

depende de las propiedades de estas fases y de las características

estructurales de las sustancias.

Según el fenómeno físico-químico que ocurra durante el proceso la

cromatografía se clasifica en:

Adsorción

Partición

Intercambio iónico

Filtración por gel

Dentro de las dos primeras hay una clasificación adicional basada en las

propiedades del estado físico de las fases como se muestra a continuación.

Tipo Fase estacionaria Fase móvil Nombre Adsorción Sólida Líquida

Gaseosa c. sólido-liq. c. sólido-gas

Partición Líquida Líquida Gaseosa

c. liq.-liq. c. gas-liq.

En todo proceso cromatográfico hay etapas que se repiten independiente

del tipo de cromatografía y son:

• preparación de las fases, tanto de la móvil como de la

estacionaria.

Cromatografía

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• siembra del material a cromatografiar.

• desarrollo cromatográfico.

• revelado (que consiste en poner de manifiesto las sustancias

separadas por cromatografía.

El proceso mediante el cual una fase móvil provoca el arrastre de los

productos de la mezcla sembrada (muestra) a lo largo de la fase estacionaria

recibe el nombre de elución o desarrollo cromatográfico. El producto

cromatografiado se llama eluato.

Los productos separados pueden querer aislarse o no. Si lo que queremos

es sólo saber cuántos constituyentes hay en una mezcla o tener idea del tipo

de constituyentes que hay en una mezcla, el modo es analítico. Si se

pretende separar y aislar una sustancia empleando cromatografía el modo se

denomina preparativo.

La fase estacionaria puede colocarse sobre una placa plana ó en un tubo

cilíndrico dando lugar a la cromatografía en capa fina y a la cromatografía en

columna respectivamente. Todos los tipos de cromatografía que se describen

a continuación se pueden llevar a cabo en capa fina o en columna.

CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

La cromatografía de adsorción es un fenómeno de superficie, en

ningún momento la sustancia ingresa al material de la fase fija (Fig.1).

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La fuerza con la que un compuesto se adsorbe depende de las

propiedades del adsorbente, de las propiedades solvente y de la estructura

de la sustancia a cromatografiar (soluto). La presencia de momento dipolar y

la posibilidad de formar puente H asegura la retención del soluto sobre el

adsorbente y es esto lo que permite que los solutos se separen (Fig. 2).

Figura 2. Separación de una muestra pura y una mezcla que la contiene

Características de la fase fija

• Actividad o poder adsorbente. Depende de la superficie disponible

para realizar los equilibrios adsorción – desorción. Esta superficie se ve

disminuida por la presencia de moléculas de agua pegadas al adsorbente.

Cada molécula de H2O bloquea un sitio activo en donde no se efectuará el

proceso cromatográfico. Los adsorbentes de uso más frecuentes son la

alúmina (Al2 O3 – trióxido de Al) y la sílica gel (Fig. 3) que es el dióxido de Si

(Si O2). La actividad grado I es la que corresponde al adsorbente exento de

H2O. El adsorbente será menos activo cuando tenga más H2O.

Figura 3. Estructura de la Sílica Gel

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• Inercia. El adsorbente no debe reaccionar con los solutos. Sin embargo,

esto no se logra en todos los casos. Se ha publicado que tanto la alúmina

como la sílica gel pueden catalizar reacciones y transformaciones de ciertos

solutos dando lugar a “artefactos” en los procesos de separación. La alúmina

puede catalizar reacciones de condensación aldólica y la sílica puede

catalizar reacciones de aperturas de epóxidos, lactonizaciones, hidrólisis de

ésteres para algunos compuestos sensibles. En algunos procesos se intenta

que la fase haga una retención selectiva de algún tipo de producto y para eso

se procede a “dopar” el adsorbente. A la alúmina se le confieren propiedades

ácidas o básicas. A la sílica gel se la trata con AgNO3 a fin de retener

selectivamente los alquenos y separarlos de los alcanos (se emplea un 8 a

10% de esta sal de plata sobre el adsorbente).

• Forma, tamaño y homogeneidad del gránulo. Hay materiales

amorfos y esféricos. La sílica para capa fina y para columna de mesada es

amorfa y porosa. Para que las separaciones sean eficientes se debe tratar

que los gránulos del adsorbente sean pequeños y parejos en tamaño, ya que

la separación cromatográfica está relacionada con el tamaño y forma de las

partículas. A menor tamaño y mayor uniformidad de los gránulos se hace

más eficiente la separación como se ve en la Fig. 4. La limitación en el

empleo de micro partículas proviene del consecuente aumento de la presión

a menor tamaño. La sílica para CCF emplea gránulos de 10 a 40 micras de

diámetro mientras que la de columna de mesada emplea gránulos que

oscilan entre 60 y 200 micrones. Esto implica una resolución menor en

columna que en capa fina. Si los gránulos no son parejos la resolución se

afecta notablemente. La eficiencia de una separación depende del

empaquetamiento de la fase fija. En (1) los compuestos saldrán mezclados

por la irregularidad de los gránulos, mientras que en (2) las moléculas iguales

saldrán juntas (Fig. 4).

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(1) (2)

Figura 4. Empaquetamiento de la fase fija

• La porosidad es otra propiedad del adsorbente que se debe tener en

cuenta. Para evitar adsorciones irreversibles los poros deben ser mayores de

5 nm.

Tamaño del poro

Sílica gel 60 Å 60 es el tamaño medio del poro

Elección del Adsorbente Elegir el adsorbente adecuado dependerá del tipo de compuestos a

cromatografiar.

Tabla 1. Adsorbentes para cromatografía de adsorción en orden general

de aumento de actividad

Celulosa < Almidón < Azúcar < Silicato de magnesio < Sulfato de calcio <

Ácido silícico < Florisil < óxido de magnesio < Óxido de aluminio < Carbón

activado

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El carbón activado difiere de los otros adsorbentes porque no tiene grupos

polares en su estructura y por lo tanto no participa en la formación de

puentes H como todos los demás. La capacidad de adsorción sobre el C

depende de la polarizabilidad del compuesto. Esta aumenta con el

incremento de dobles ó triples enlaces y grupos aromáticos.

Elución de solutos

Tabla 2. Solutos ordenados por polaridad creciente

Hidrocarburos < Olefinas < Éteres < Compuestos halogenados <

Aromáticos < Cetonas < Aldehídos < Ésteres < Alcoholes, aminas,

mercaptanos < Ácidos y bases débiles

En cuanto a los solutos, uno que forme puente H y que presente polaridad

permanente ó inducida será más retenido que otro que no presente estas

propiedades.

Por ejemplo: entre un ROH y un aldehído relacionados estructuralmente el

ROH será más retenido por ser donor de puente.

En el caso de un alqueno simétrico trans

H3C H2C H C C H CH2 CH3 H H C C H3C H2C CH2 CH3 La presencia de muchos grupos funcionales no garantiza que la retención

aumente linealmente con el aumento de los grupos.

Se anulan

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En el siguiente esquema podemos ver que si el grupo NO2 se ubica en

posición orto se anula el efecto del OH por el puente que se forma con el

NO2.

Adsorbente Adsorbente

Pte H

p-nitrofenol o-nitrofenol

Características del eluyente

• Pureza. Los solventes para Cromatografía deben ser de calidad p.a y se

tiene que conocer las impurezas que contienen y la cantidad de las mismas.

Pequeñas cantidades de un “solvente polar” le modifican notablemente sus

propiedades cromatográficas. Así como trazas de productos básicos ó

ácidos que afectan la resolución y las cromatografías no son reproducibles.

• Inercia. En general los solventes para Cromatografía de adsorción no

reaccionan con los solutos, o sea son inertes.

• Polaridad del solvente. Los solventes tienen distintas polaridades

dependiendo de los grupos funcionales de sus moléculas. Naturalmente los

alcanos son los menos polares, mientras que los ácidos son los más

polares; entre estos están todos los otros solventes como ésteres,

aldehídos, cetonas, etc. (Tabla 3).

O

+O-OO

O N

OO

O+

-

H

N O O O - O +

O

OH

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Tabla 3. Serie eluotrópica con polaridad creciente

Éter de petróleo < Ciclohexano < Tetracloruro de carbono < Benceno <

Cloruro de metileno < Cloroformo < Éter < Acetato de etilo < Piridina <

Acetona < n- propanol < Etanol < Metanol < Agua < Ácido acético

El CHCL3 comercial contiene 1,5 % de etanol como estabilizante para

inhibir la formación de fosgeno (Cl2CO, gas a T ambiente) más HCl por

efecto de la luz. Al tener EtOH, la polaridad del CHCl3 aumenta.

Los solventes muy polares producen arrastres masivos del material a

cromatografiar (soluto), pues arrastran los solutos no polares, medianamente

polares y polares.

(1) (2) (3)

Siembra

En (1) se usó un solvente de baja polaridad. En (3) se usó un solvente muy

polar. En (2) se usó un solvente de mediana polaridad. Es posible hacer

mezclas de solventes para ampliar el rango de polaridades, siempre que la

mezcla sea homogénea (ó sea 1 sola fase) y se puede conocer la polaridad

de esa mezcla aplicando una ecuación que relaciona la proporción de cada

solvente y la polaridad del mismo PM = θ1P1 + θ2P2

ο

ο

ο ο

ο ο

Eluc

ión

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Hay solventes que además de ser polares, forman puente H y este

hecho cambia la selectividad en la separación. Por ejemplo: el acetonitrilo

(CH3CN) y el metanol (MeOH) son dos solventes polares, pero el MeOH

puede formar puente H y el CH3CN no. Entonces, la selectividad de ellos en

la separación es diferente.

CARACTERISTICAS DEL PROCESO CROMATOGRÁFICO

La velocidad del eluyente tiene que ser la adecuada para que se

establezcan los equilibrios de separación. Si la velocidad es muy rápida

estos equilibrios no se logran. Si es muy lenta se favorece la difusión.

En todo proceso cromatográfico se siembra la mezcla y en el momento

que comienza el proceso de elución el o los solventes arrastran los

componentes en una sola dirección si la velocidad es la adecuada. Si la

velocidad es lenta el soluto puede difundir en el líquido en todas direcciones

y los compuestos separados pueden volver a mezclarse.

En cromatografía la difusión puede hacer disminuir la resolución del

proceso.

La temperatura es un aspecto a tener en cuenta en un proceso

cromatográfico. Los distintos tipos de cromatografía (adsorción ó partición),

pueden realizarse a temperatura ambiente o superiores a la misma.

Aplicaciones Cromatografía en Capa Fina y en Columna En función del tipo de distribución para la fase estacionaria, se puede

establecer la siguiente clasificación :

- Cromatografía en capa fina: una capa de adsorbente de espesor

uniforme se deposita sobre una placa de vidrio, aluminio o plástico.

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- Cromatografía en columna: el adsorbente se deposita en el interior

de una columna de vidrio.

Cromatografía en capa fina (CCF) La CCF permite establecer rápidamente si una muestra está constituida

por uno o más componentes y efectuar la selección del adsorbente y del

disolvente adecuado para una futura separación en columna o capa

preparativa.

El adsorbente para CCF contiene un aglutinante para que no se cuartee la

placa, el más usado es el yeso, esto se indica en el nombre con la letra G. La

mayor parte de las placas de cromatografía llevan un indicador fluorescente,

el cual se indica con la letra F, que permite la visualización de los

compuestos activos a la luz ultravioleta (254 nm). En el caso de compuestos

que no absorban luz UV la visualización requiere utilizar un agente revelador

químico.

Los pasos a seguir para realizar una CCF son:

1.- Elegir el adsorbente para preparar la CF

2.- Elegir el solvente en base a la muestra a cromatografiar.

3.- Ambientar la cuba con el solvente elegido para que los vapores del

mismo saturen todo el recipiente

4.- Sembrar la muestra, para esto la muestra debe estar disuelta en un

solvente volátil, éste se evapora y queda depositada en la placa sólo el

material a cromatografiar. La siembra debe ser puntual y puede hacerse en

punto o banda. Para fines analíticos (0,5 mm de espesor) se siembra en

punto y para fines preparativos (2 mm de espesor) en banda. Las alícuotas

se colocan, mediante un capilar, sobre un mismo punto para cada muestra

esperando que se evapore el solvente de la siembra anterior para depositar

la siguiente. Sobre una misma placa se puede cromatografiar varias

muestras, conservando los puntos de la siembra sobre una línea recta

paralela al borde inferior de la placa.

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En CCF analítica la cantidad máxima de siembra es de 0,5 mg. En CCFP

la cantidad máxima de siembra en una placa de 20 x 20 cm es de 50 mg.

5.- Desarrollo o elución. Una vez que el solvente alcanza 1 cm antes del

borde superior de la placa se la saca de la cuba, se la seca al aire y se

procede al revelado.

6.- Revelado. Esto significa poner de manifiesto las sustancias que se han

separado. Se pueden emplear métodos físicos o químicos.

Entre los métodos físicos se usa la luz UV de distintas λ para iluminar la

placa que ha sido preparada con sílica gel GF254. Se ven por ejemplo las

clorofilas de color rojo, los flavonoides de color amarillo. Este revelado es un

método no destructivo, se usa mucho en CCFP. En el caso que las

sustancias no absorban la luz UV se emplean los reveladores químicos,

entre ellos el yodo, ácido sulfúrico en solución concentrada, al I2 se lo usa

dentro de una cámara de sublimación.

El I2 sublima a temperatura ambiente de modo que se combina con las

muestras de la placa que presentan electrones π como ser un doble enlace o

bien con compuestos oxigenados que puedan formar un complejo de

transferencia de carga que generalmente dan color marrón. Existen una

amplia gama de reactivos reveladores específicos para un grupo particular.

7.- Cálculo del Rf. Para informar la situación cromatográfica es necesario

establecer una relación de frentes que se saca con respecto al solvente.

El Rf es la distancia desde la siembra hasta la posición de un determinado

compuesto dividido por la distancia que recorre el solvente. Los valores de Rf

siempre son menores que 1. Una sustancia se considera adecuadamente

cromatografiada cuando su Rf está entre 0,3 y 0,8.

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Cromatografía en columna (CC) Es el método más general para la separación y purificación de compuestos

orgánicos, sólidos o líquidos, a escala preparativa. Esta técnica se emplea

cuando se tienen mezclas en cantidades superiores a los 100 mg.

Para la CC los adsorbentes no tienen aditivos ni indicadores fluorescentes.

La sílica de grano más pequeño para CC es de 270-400 Mesh (Mesh-

malla). Cuando disminuyo el tamaño de una partícula aumenta la superficie

de contacto para una determinada área y si aumento la superficie aumento la

eficiencia de la separación, pero siempre hay límites ya que si se usa en una

CC sílica de más de 400 Mesh, el solvente fluirá con dificultad.

Una vez elegido el adsorbente (dependiendo del grado de dificultad de la

muestra) se elige el solvente o la mezcla de solventes a usar. El adsorbente

más utilizado es la sílica gel. Cuando ésta es incompatible con la mezcla a

cromatografiar se emplea alúmina o florisil (silicato magnésico).

El solvente a elegir será aquel que en el testeo por CCF haya ubicado al

compuesto que queremos separar en un Rf = 0,3-0,8.

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La fase estacionaria (adsorbente) se deposita en el interior de una

columna de vidrio que termina en un estrechamiento con una llave, y se

impregna con la fase móvil (eluyente).

¿Qué columna elijo? Las proporciones de diámetro del tubo con respecto

a la altura adsorbente de la columna es de 1:10 (puede ir de 1:8 a 1:12).

Una vez eluidas las fracciones de la CC deben analizarse por CCF para

comprobar su contenido, su pureza y seguir el curso de la separación. La

cantidad que se recoge en cada fracción depende del volumen de la

columna. La CCF se realiza con un solvente de polaridad ligeramente

superior al utilizado en la columna porque el adsorbente es más pequeño en

la CCF que en la CC. Por ej. Si en la CC se usó CHCl3 en la CCF se usará

CHCl3 – éter (9:1).

Cuando las CC son de mezclas muy complejas se trabaja con un gradiente

de polaridad de los solventes. Se comienza con el solvente menos polar (con

el que se empaqueta la columna) y se va aumentando poco a poco para que

el cambio no afecte la separación.

El proceso cromatográfico se llama isocrático cuando se usa el mismo

solvente y con gradiente cuando se usa una mezcla (se va aumentando la

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polaridad). Si el Rf en la CCF es bajo se puede hacer una recromatografía

con el mismo solvente o con otro diferente.

¿Qué cantidad de adsorbente cargaremos en la columna? Dependerá

de la mezcla a separar. Dependiendo de la dificultad de la separación la

proporción adsorbente – Muestra será de 10:1 a 100:1.

Cuando sea más difícil la muestra se usará la proporción de 100:1 (gr)

porque va a haber más platos teóricos en una separación cuando más

adsorbente haya. La más común será la proporción 30:1 para mezclas de

complejidad intermedia.

¿Cuáles serán los solutos más retenidos? Serán los más polares ya

que trabaja igual que una CCF y los primeros que fluirán serán los menos

polares si el relleno es de Sílica Gel.

CROMATOGRAFIA DE PARTICION

En este tipo de cromatografía los solutos se reparten entre dos fases

líquidas inmiscibles entre ellas, como ocurre en el proceso de extracción y el

proceso de disolución en ambas fases maneja la cromatografía.

Un soluto que sea muy soluble en la fase fija será más retenido que otro

que no sea tan soluble. Los materiales que se emplean como fases

estacionarias son: polvo de celulosa, papel de filtro, almidón, que contienen

en su estructura agua de hidratación, la cual constituye la fase estacionaria

real en la que se pueden disolver los solutos. Los solventes en este caso son

sustancias inmiscibles en la fase estacionaria. A esta Cromatografía en papel

ó celulosa se la llama Cromatografía líquida – líquida por ser las fases fija y

móvil líquidas.

La Cromatografía de partición se ha usado a escala analítica y preparativa

para separar azúcares, glicósidos, aminoácidos, es decir, productos muy

polares, que si se hubiesen intentado cromatografiar por Cromatografía de

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adsorción hubiesen quedados agarrados en la siembra ya que esta técnica

de adsorción no es útil para compuestos tan polares.

De modo que si sembramos glucosa en papel y la eluímos con butanol –

Piridina – H2O lograremos cromatografiarlas.

Ahora sí, si a la sílica gel se le pega H2O en su superficie hasta saturarla,

puede servir para Cromatografía de partición. La fase estacionaria sería el

H2O y la fase móvil un solvente inmiscible en ella.

Como se ve la fase estacionaria líquida es en general agua pero en el

caso de la HPLC en fase reversa, que también se considera una

cromatografía de partición, la fase fija es una larga cadena hidrocarbonada.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

Se lleva a cabo con materiales especiales de estructura porosa insolubles

en H2O. Contienen grupos reactivos asociados a iones lábiles capaces de

ser intercambiados con los del medio que los rodea durante el proceso

cromatográfico.

El intercambio de iones es el único fenómeno que ocurre en el material

durante todo el proceso cromatográfico que en general tiene lugar en medio

acuoso. Se emplea en la separación de sustancias iónicas tanto orgánicas

como inorgánicas, polielectrolitos, proteínas, hormonas, ácidos nucleicos y

otras sustancias biológicamente importantes. Se emplean tres tipos de

materiales: las resinas, los geles y las celulosas de intercambio iónico que

difieren en microestructura y grupos intercambiadores. Las resinas más

usadas son las sintéticas como las de poliestireno que se puede fabricar

con porosidad uniforme polimerizando estireno y uniendo las cadenas con

divinilbenceno. Sobre este polímero se introducen grupos ácidos que actúan

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como intercambiadores catiónicos o básicos que actúan como

intercambiadores aniónicos.

Como la mayoría de los compuestos a separar no son anfóteros pueden

lograrse fácilmente separaciones de aniones entre cationes o compuestos

iónicos de no iónicos. El método bien manejado permite separar

selectivamente diferentes aniones y cationes. Los factores que gobiernan la

selectividad de una resina frente a un ión particular son:

1. Valencia

2. Radio iónico

3. Concentración

4. Naturaleza del intercambiador

5. Solvente

Los iones que difieren en su valencia o tamaño, normalmente se separan

sin dificultad.

Los materiales intercambiadores porosos descriptos (empleados en

cromatografía clásica) tienen poco uso en HPLC porque colapsan a altas

presiones. Se han debido diseñar nuevos materiales para HPLC de

intercambio iónico.

CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN SOBRE GELES

Por filtración sobre geles la separación se realiza según el volumen

molecular. Se introdujo esta técnica con la creación de un gel: Sephadex

que se obtiene a partir de un polisacárido, el “dextrano”, el cual se somete a

entrecruzamientos de sus cadenas moleculares. Debido a su elevado

contenido en grupos oxhidrilos el producto tiene gran afinidad con el H2O.

Cuando al gel se le agrega H2O, se hincha formando un material

semitransparente que puede colocarse en una columna cromatográfica.

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Las sustancias cuyo tamaño ó volumen molecular sea superior al de los

poros (límite de exclusión) del gel hinchado no pueden penetrar en los poros

por lo que pasan a través de la columna arrastrados por el solvente. En

cambio las moléculas más pequeñas pueden penetrar en los poros del gel y

entonces serán retenidas. Esta técnica se usa ampliamente para el

fraccionamiento de macromoléculas como proteínas, polisacáridos, ácidos

nucleicos.

El nivel de entrecruzamiento de un polímero le confiere rigidez y

resistencia al colapso por presión. El advenimiento de fases estacionarias

que pueden someterse a altas presiones y pueden sintetizarse con gran

homogeneidad en cuanto al tamaño del poro y con poros de diferentes

tamaños ha extendido el uso de este tipo de cromatografía a moléculas

pequeñas por ejemplo con pesos moleculares de 100 Daltons y con la

posibilidad de separar dos moléculas que difieren en un 10% de su peso

molecular. Los materiales que se emplean para la llamada GPC (gel

permeation chromatography, con mezclas de solventes orgánicos) son de

tipo estireno divinilbenceno altamente entrecruzado, que se vende como

STYRAGEL ó μSTYRAGEL. Se trata de un gel hidrofóbico. Otros materiales

disponibles son aquellos basados en sílica. Un gel polimérico llamado

Hydrogel se compone de partículas esféricas, porosas altamente

entrecruzado lo que le confiere una gran rigidez. Esta fase se ha empleado

con presiones de hasta 250 atmósferas. Es posible su uso con agua y

algunos solventes lo que permite un rango amplio de solubilidad de

sustancias. Como el gel es polar pueden ocurrir fenómenos de adsorción los

que se minimizan agregando un 0.5 por mil de una sustancia con grupos

funcionales similares a los de mi muestra que compiten por los sitios de

adsorción. Cuando más pequeñas son las partículas de relleno es mayor la

eficiencia de la separación.

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CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA PRESIÓN O DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

Llamada comúnmente HPLC (High performance liquid cromatography) es

conceptualmente similar a la cromatografía líquida clásica. La diferencia

radica en que el relleno de columna se hace con partículas de hasta 3 µ lo

que produce un empaquetamiento tan denso que sólo a gran presión el

eluyente puede atravesar la columna (hasta 500 atm). Con estos rellenos la

eficiencia aumenta considerablemente lográndose la separación de solutos

muy semejantes estructuralmente en un proceso que se puede realizar en

escasos minutos. Separaciones de este tipo sólo se lograban en GC pero

nunca con una columna de líquidos por lo que HPLC viene a solucionar los

problemas de separación de sustancias termolábiles, de sustancias muy

polares o de sustancias poco polares de alto peso molecular que no se

separan por GC.

Así es como nacen los cromatógrafos líquidos que necesitan un sistema

de bombeo para impulsar el líquido por el relleno tan finamente pulverizado.

Las modificaciones introducidas son fundamentalmente dos: (1) la

fabricación de relleno de columna con partículas de hasta 3 µ de esta forma

al ser cada vez más pequeñas las partículas, el relleno es más uniforme. (2)

la fabricación de las llamadas fases ligadas. Un cromatógrafo líquido (Fig. 5)

consta de una bomba, inyector, columna, detector y registrador, pero el

corazón del equipo es la columna y es en el relleno de la columna en donde

se lleva a cabo la separación de los componentes de una mezcla en estudio.

En CL las columnas se fabrican con tubos de acero que pueden resistir hasta

500 atm. de presión y en su interior está la fase estacionaria. El diámetro del

tubo debe ser muy preciso y las paredes internas finamente pulidas. Si el PM

de la muestra es menor que 2000 Daltons y se trata de compuestos solubles

en solventes orgánicos, por ejemplo hexano, se utiliza la técnica de

cromatografía denominada Fase Normal.

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Figura 5. Equipo de HPLC

Empaquetamiento de la columna y fase estacionaria para HPLC

Desde el comienzo de la Cromatografía se han usado tres tipos de

partículas microporosas de porosidad, forma y tamaño variables.

Según las características de las partículas del material de

empaquetamiento, se clasifican en: (Fig. 6)

1) – Partículas totalmente porosas.

2) – Partículas de centro sólido o con absorbente pelicular.

3) – Partículas microporosas.

1) 2) 3)

Figura 6. Material de empaquetamiento

La (1) se fabrica con un adsorbente como sílica gel, alúmina y los poros

alcanzan hasta el corazón de la partícula.

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La (2) consta de un centro o corazón que puede ser una esfera de vidrio y

que está recubierta con el material cromatográfico.

En (1) los poros son muy profundos (50 µ) y en ellos se pueden encontrar

fase móvil estancada, por lo que la transferencia de solutos se hace difícil y

se ensancha el pico cromatográfico.

La carga de muestra que puede sostener un empaquetamiento pelicular

es muy chica comparada con la totalmente porosa. La cantidad de muestra

es muy pequeña.

La solución definitiva se logra cuando se inventan las partículas

microporosas (3) con un tamaño de 5 – 10 µ y que ahora ya hay de 3 µ. Con

este tipo de material se logran eficiencias >> que con las otras partículas.

Estas partículas microporosas llegan a tener una superficie específica de 300

– 400 m2 por cada gramo de relleno (hay >> cantidad de platos teóricos).

La 2º modificación que ha ampliado enormemente el rango de sustancias a

ser cromatografiadas por líquidos es la fabricación de las llamadas fases ligadas. Estas se fabrican haciendo reaccionar la sílica gel con diferentes

sustancias obteniéndose como productos, materiales como alcoxisilanos,

alquilamino silanos, etc.

Recordemos que en fase normal, la sílica gel separa por dos razones: por

el µ y por la posibilidad de formación de puente H. Las sustancias muy

polares se agarran irreversiblemente a la sílica de modo que no se la puede

separar y las sustancias no polares salen con el solvente, como ocurre en

una CC.

En la fase ligada de la cual un caso especial es la fase reversa a la sílica

se le tapan los sitios activos (o sea se tapan los OH), de modo que ahora la

elución de los compuestos se harán de forma inversa, es decir saldrán

primero los más polares y al último los menos polares.

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Con estas fases ligadas se logra que el material de relleno de la columna

tenga una selectividad diferente en la retención de las sustancias.

En un principio se pegaron grupos R al O fabricando los alcoxisilanos (1) o

se pegaron grupos R directamente al Si fabricando los alquil silanos (3),

también se puede pegar una amina fabricándose los alquil amino silanos,

pero este material es hidrolizable a pH inferiores o iguales a 5 y apenas por

arriba de pH 7, entonces había una limitación muy seria en su uso.

Luego se mejoró la técnica de fabricación de la fase ligada haciendo

reaccionar la sílica con cloruro de alquil silanos dando lugar a las a fases R

22

con las cuales ya se puede trabajar tranquilamente entre pH 8.5 y 2.5. En la

actualidad ya se han fabricado otras fases para los rangos por encima de 8 y

por debajo de 3.

Si al Si se le pega una cadena de 18 átomos de C se anula la posibilidad

de formación de pte H, o sea, se anula la punta hidrofílica para transformarla

en hidrofóbica. Se transforma en fase reversa y es la que se llama ODS (5)

(octadecil silano).

Es posible agregar cadenas alquílicas que tengan grupos polares, y en

este caso, la sílica tiene una cierta polaridad. Este sería el caso por ejemplo

de una columna CN (8), o sea se le ha pegado a la sílica un silano con un

grupo CN (nitrilo o ciano comp.), que tiene una selectividad distinta a la sílica

y sirve para separar polioles.

Otra columna que tiene una cierta polaridad es la amino (9), se pega un

alquilo con un NH2 en la punta. Esta columna sirve para separar azúcares

por excelencia.

Una cromatografía se dice de FN cuando se usa sílica gel, alúmina, sin

ningún agregado, es decir la separación está basada en interacciones dipolo

– dipolo del OH de la sílica con los solutos o en la posibilidad de formar pte

H, o sea el empaquetamiento tiene alta polaridad. En FR el

empaquetamiento es de baja polaridad.

En cuanto a la polaridad de los solventes en FN de media a baja, mientras

que en FR la polaridad es de media a alta.

Un incremento en la polaridad del solvente en FN reduce el tr o elución de

un compuesto, mientras que en FR incrementa el tr o elución.

En FN los compuestos no polares no se retienen y por lo tanto no se

separan, mientras que los muy polares quedan agarrados en la siembra y

tampoco se separan. Estas serían las pautas de polaridad, que se soluciona

con la FR que puede separar compuestos muy polares y poco polares.

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Fase reversa

En cromatografía en fase reversa, la fase estacionaria es generalmente un

hidrocarburo inerte y la única interacción de dicha fase con el soluto es

hidrofóbica, por lo que la selectividad está controlada por el efecto del

solvente. La fase móvil más usada es el agua (altamente polar) en mezclas

con un solvente menos polar y miscible en ella como metanol, acetonitrilo,

THF, etc.

Para evitar confusiones, emplearemos fuerza del solvente tanto en fase

normal como en fase reversa para indicar el poder de elusión que dicha fase

posee. Esto es, a mayor fuerza del solvente, los compuestos eluyen más

rápidamente (menor tiempo de retención), tanto si nos referimos a FN o FR.

En cambio, si hablamos de polaridad del solvente, en el caso de FN, a mayor

polaridad mayor es la fuerza del solvente, menor tiempo de retención y en

FR a mayor polaridad, menor es la fuerza del solvente, mayor el tiempo de

retención.

El agua es el solvente más débil, debido a la baja solubilidad de los

compuestos en la misma, lo que lleva a una mayor interacción del soluto con

la fase estacionaria no polar produciendo en consecuencia mayores tr. Incrementando la concentración del solvente menos polar disminuye el tr por

ser más afín al mismo y sufrir poca interacción con la fase estacionaria.

Ejemplo: la molécula no polar de naftaleno es soluble en la fase

estacionaria no polar y menos soluble en la fase móvil polar MeOH - H2O.

Incrementando el contenido de metanol de la fase móvil, se incrementa la

solubilidad del naftaleno en esta fase y eluye de la columna con mayor

rapidez. Inversamente si la muestra eluye muy rápidamente, debe

incrementarse el contenido de agua con lo que se permite que la muestra se

disuelva preferentemente en la fase estacionaria, permaneciendo mayor

tiempo en la columna.

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BIBLIOGRAFIA

• Técnicas Experimentales en Síntesis Orgánica. Martínez Grau, MA

y Csaky, AG. Editorial Síntesis. 2000.

• Introduction to Modern Liquid Chromatography. Snyder, LR;

Kirkland, JJ; Dolan, JW. John Wiley & Sons. 2010.

• HPLC a Practical Guide. Hanai, T. The Royal Society of Chemistry.

1999.

• Handbook of HPLC. Corradini, D and Phillips, TM. Taylor and Francis

Group, LLC. 2011.

• High Performance Liquid cromatography. Lindsay, S. John Wiley &

Sons. 1992.

• Química Orgánica, fundamentos teórico – prácticos para el

laboratorio. GalagovsKy Kurman, Lydia (1995).