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UNIVERSIDAD VERACRUZANA
UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS DE ORIZABA
MAESTRIA EN CIENCIAS EN PROCESOS BIOLOGICOS
Protocolo del trabajo a desarrollar
TÍTULO
EFECTO DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE NS3 DEL VIRUS DENGUE SOBRE LA INDUCCIÓN DE ANERGIA CLONAL EN CÉLULAS
INMUNES
Propuesto por: Q.F.B. Victor Adolfo Romero Cruz S12022661
Director del Trabajo: Dra. Aracely López Monteon FCQ-UV Orizaba
Asesor (es): Dr. Ángel Ramos Ligonio FCQ-UV Orizaba
Dr. Enrique Méndez Bolaina FCQ-UV Orizaba
Dr. Mario Roberto Bernabé Guapillo Vargas FCQ-UV Orizaba
Dr. Manuel Gonzales del Carmen FM-UV Cd. Mendoza
Orizaba, Veracruz Mayo, 2014
ÍNDICE GENERAL1. INTRODUCCIÓN.....................................................................................................................1
2. MARCO TEÓRICO...................................................................................................................2
2.1. Vector y modo de transmisión del Virus Dengue...............................................................2
2.2. Epidemiologia del Virus Dengue........................................................................................2
2.3. Genómica y Factores de virulencia del Virus Dengue........................................................3
2.3.1. Proteínas Estructurales...............................................................................................3
2.3.2. Proteínas No Estructurales..........................................................................................4
2.4. La proteína NS3 como candidato a Vacuna........................................................................4
2.5. Inducción de anergia clonal en células inmunes.................................................................5
3. JUSTIFICACIÓN......................................................................................................................6
4. OBJETIVOS..............................................................................................................................7
4.1. Objetivo General................................................................................................................7
4.2. Objetivos Particulares.........................................................................................................7
5. HIPÓTESIS................................................................................................................................7
6. METODOLOGÍA......................................................................................................................8
6.1. Expresión de la proteína recombinante GST-NS3..............................................................8
6.2. Solubilización de los cuerpos de inclusión y eliminación de la urea por medio de diálisis.8
6.3. Purificación de la proteína recombinante GST-NS3...........................................................9
6.4. Protocolo de inmunización con la proteína recombinante GST-NS3..................................9
6.5. Cultivo celular y estimulación in vitro con la proteína recombinante GST-NS3..............10
6.6. Ensayo de citometría de flujo...........................................................................................10
7. FACTIBILIDAD DEL PROYECTO....................................................................................11
8. CRONOGRAMA DE TRABAJO............................................................................................12
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................................13
1. INTRODUCCIÓN
La fiebre del dengue y la fiebre hemorrágica por dengue son causadas por cualquiera de los
cuatro serotipos del virus pertenecientes al complejo dengue; se trata de cuatro serotipos
antigénicamente relacionados y conocidos como DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4,
pertenecientes a la familia Flaviviridae, del género Flavivirus, que son transmitidos por la
picadura del mosquito hembra de las especies Aedes aegypti y Aedes albopictus.
El virus dengue DEN está compuesto de una cadena sencilla positiva de RNA de
aproximadamente 11 kb. La proteína NS3 forma parte de las proteínas no estructurales del
complejo del virus dengue, esta es una molécula de 67-70 kDa altamente conservada entre
los flavivirus, la cual es capaz de inducir una respuesta inmune humoral
Debido al impacto actual del dengue y su diseminación, el interés en el desarrollo de una
vacuna que sea eficaz, segura y que induzca protección total hacia los cuatro serotipos ha
aumentado. Hoy en día están en curso estudios para producir vacunas contra el VD
mediante tecnologías de ADN recombinante y otras técnicas de biología molecular,
utilizando como antígenos proteínas estructurales y no estructurales.
La proteína recombinante NS3 se puede considerar como un posible candidato a vacuna
debido a que constituye una fuente principal de epítopes que estimula al sistema inmune en
la formación de anticuerpos. Sin embargo, se cree que la proteína recombinante inhibe la
producción de moléculas coestimuladoras necesarias para el desarrollo de la respuesta
inmune humoral ocasionando anergia clonal.
Por lo anterior descrito, en el presente trabajo, se estudiara el efecto de la proteína
recombinante NS3 del virus dengue sobre la inducción de anergia clonal en células
inmunes en el modelo murino.
1
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Vector y modo de transmisión del Virus Dengue La transmisión del virus al humano es a través de la picadura de la hembra hematófaga de
los mosquitos Aedes (aegypti y albopictus). La especie aegypti es la más distribuida en el
mundo. Su distribución geográfica abarca una extensa franja tropical y subtropical, entre
Estados Unidos, toda América hasta Argentina. Se encuentra en cerca de 100 países
tropicales, y cubre la mayor parte de África, Medio Oriente, Sudeste asiático, norte de
Australia, e incluso algunas zonas de Europa. (Acosta-Bas y Gómez-Cordero, 2005).
2.2. Epidemiología del Virus DengueDurante los periodos de alternancia de 3 a 5 años donde la circulación de los serotipos del
dengue cumple dicho patrón de transmisión, la población susceptible, los movimientos
poblacionales, así como de los índices vectoriales, ha sido posible alertar, desde años atrás,
a las entidades con riesgo de brotes de dengue, como es el caso de la región sur y centro del
país de México donde se pronosticó desde el año pasado el potencial incremento de casos
atribuible a DEN2 o DEN3, los cuales solo habían circulado en baja y mediana proporción
en los últimos 10 años ( Figura 1), (Comité Nacional de Vigilancia Epidemiológica, 2012).
2Figura. 1 . Casos y serotipos de dengue en nuestro país, a partir de 1990 hasta 2011. Tomado de: SINAVE/DGE/SS. Sistema de vigilancia epidemiológica de dengue.
2.3. Genómica y Factores de virulencia del Virus Dengue El virión maduro tiene tres proteínas estructurales, la proteína C de la nucleocápside, la
proteína M, asociada a la membrana y la proteína E de la envoltura y otras proteínas no
estructurales: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5. Todas estas proteínas se
forman a partir de una gran poliproteína (5´ C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-
NS4B-NS5 3´), para la cual codifica el genoma del virus (Figura 2). El genoma del virus
está constituido por una molécula de ácido ribonucleico (RNA) de cadena única y
aproximadamente 11 kb y de relativamente alta variabilidad genómica. Tiene un coeficiente
de sedimentación de 42S y un peso molecular de 4.2 kDa. El RNA genómico es de
polaridad positiva y funciona como RNA mensajero al traducirse directamente en los
ribosomas durante el proceso de replicación. (Acosta, C., y Gómez, I., 2005)
2.3.1. Proteínas Estructurales La proteína C es componente básico de la nucleocápside, el primer polipéptido viral
sintetizado durante la traducción, tiene un peso molecular de 13.5 kDa. Es rica en residuos
de lisina y arginina los que le confieren un carácter altamente básico que permite su
interacción con el RNA viral, con el que forma la nucleocápside como componente
estructural.
3
Figura. 2 A Esquema de la
organización del genoma del virus
del dengue. B. Esquema de la
poliproteína sintetizada que muestra
la organización de las proteínas
estructurales (C, prM y E) y las no
estructurales (NS1, NS2A, NS2B,
NS3, NS4A, NS4B, NS5). C.
Topología propuesta de las proteínas
estructurales y no estructurales del
DENV en el retículo endoplásmico.
(Velandia, M., Castellanos, J. 2011)
La proteína M (8 kb) madura, es una proteína de membrana, extracelular o de virus
maduros, resultado de la proteólisis de prM y eliminación de la porción amino terminal, C-
terminal no-glicosilado. Está estrechamente asociada a la envoltura lipídica.
La proteína E, es una glicoproteína con un peso molecular entre 51 y 60 kDa, es la
mayoritaria de la envoltura, glicosilada y la más conservada, la fusión con la célula huésped
es inducida por pH bajo. Está estrechamente asociada a la envoltura lipídica. Es el
componente principal de las proyecciones de la superficie del virión observadas por
microscopía electrónica y contiene los determinantes antigénicos responsables de la
neutralización del virus (Mellado, G., García, J. 2004).
2.3.2. Proteínas No Estructurales La primera proteína no estructural (NS1), es una glicoproteína de 48 kDa se ha planteado
que posee un papel en la replicación temprana. Las proteínas NS2A y NS2B son
necesarias para el adecuado procesamiento de NS1 y el correcto funcionamiento de NS3 el
cual es la segunda proteína en tamaño, con un peso molecular entre 68 y 70 kDa, asociada a
la membrana. Es altamente conservada en los flavivirus y es un componente de la
maquinaria enzimática de la replicación del RNA viral ya que posee la función de proteasa,
de helicasa y de RNA trifosfatasa trifosfato. Las proteínas NS4A es utilizada para modular
las membranas intracelulares y se piensa que la proteína NS4B es un antagonista del
interferón. Finalmente la proteína NS5 es la más grande de 103 a 104 kDa, bifuncional y
una de las más conservadas en los flavivirus. Es una proteína básica y se cree que funciona
como una RNA polimerasa dependiente del RNA, aunque no se ha verificado directamente
(Mellado, G., García, J. 2004).
2.4. La proteína NS3 como candidato a Vacuna Durante una infección por el VD se generan diferentes tipos de respuesta inmune contra las
proteínas virales, los anticuerpos son generados principalmente contra la proteína E y
contra la proteína NS1 (Rothman, 2004, Lázaro-Olán et al., 2008, Hu et al., 2011). La
proteína E puede también inducir anticuerpos no neutralizantes involucrados en el
fenómeno de aumento dependiente de anticuerpos (ADA) en la infección por el VD lo cual
está asociado al incremento en el número de casos de FHD en las infecciones secundarias
(Halstead y O’Rourke, 1977, Balsitis et al., 2010). Alternativamente, algunos reportes
4
sugieren que estos problemas pueden ser eliminados empleando para vacunas las proteínas
no estructurales del virus (Schlesinger et al., 1987, Falgout et al., 1990, Costa et al., 2007).
La proteína NS1 es altamente inmunogénica (Schlesinger et al., 1993), sin embargo, los
anticuerpos contra la proteína NS1 pueden tener reacción cruzada con proteínas de humano,
las cuales pueden estar asociadas con algunos efectos patológicos de la infección por el
virus dengue (Falconar, 2007, Lin et al., 2008, Cheng et al., 2009). Al contrario, existen
muy pocos estudios en donde se evalué el uso de la proteína NS3 como un antígeno
protector contra el virus dengue (Costa et al., 2011). La proteína NS3 del VD se puede
considerar como un posible candidato para el diseño de una vacuna debido a que constituye
la fuente principal de epítopes para células CD4+ y CD8+ (Kurane et al., 1998; Pérez et al.,
2010).
2.5. Inducción de anergia clonal en células inmunes La proteína recombinante NS3 es capaz de inducir excelentes títulos de anticuerpos en el modelo murino, sin embargo, se cree que NS3 induce anergia clonal en células inmunes (T). (Álvarez Rodríguez, L. 2012).
5
Figura 3. Presentación de antígenos en la Respuesta Inmune. La proliferación y diferenciación de linfocitos T está regulada por la co-estimulación con las moléculas de B7 (CD80 y CD87) por parte de la Célula Presentadora de Antígenos y CD28 por parte del linfocito T. La ausencia de cualquiera de estas moléculas ocasiona Anergia Clonal en linfocitos T. Otra causa de Anergia es la interacción de la molécula inhibidora CTLA-4 con B7.
3. JUSTIFICACIÓN
El dengue constituye un importante problema de salud pública en lugares especialmente
con clima trópico y en todo el mundo. Año con año las muertes de infantes a causa del
dengue han incrementado, así como adultos que presentan la sintomatología ocasionado por
dicho virus y/o sus complicaciones como el dengue hemorrágico. Esto es de gran
importancia ya que a la fecha no se posee alguna vacuna profiláctica o que pueda
restablecer la salud al enfermo, es por ello la necesidad de ahondar sobre el virus dengue.
El uso del virus, representa un riesgo potencial para la salud, por el contacto con partículas
virales infecciosas; aunado a las dificultades intrínsecas en la preparación homogénea de
los lisados antigénicos. En consecuencia la utilización de proteínas recombinantes surgen
como una alternativa atractiva para estudiar la inmunogenicidad de las diferentes proteínas
virales en individuos infectados con el virus.
Se ha reportado, que durante una infección por el virus dengue, la mayoría de los
anticuerpos generados están dirigidos contra la proteína E, sin embargo, estos anticuerpos
algunas veces son no neutralizantes por lo que se corre el riesgo que intervengan en el
fenómeno del ADA, todo esto puede ser solventado si se utilizan proteínas no estructurales
como la NS3. Se ha reportado que la proteína recombinante GST-NS3 es capaz de inducir
excelentes títulos de anticuerpos en el modelo murino, sin embargo, aún cuando posee gran
cantidad de epítopes para la célula T, las células esplénicas de ratones inmunizasos no
presentan proliferación, ni la producción de Il-2. Por este motivo, en el presente trabajo se
evaluará el efecto de la proteína recombinante GST-NS3 del virus dengue sobre la
inducción de anergia clonal en células inmunes.
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4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
Evaluar el efecto de la proteína recombinante GST-NS3 del virus dengue sobre la
inducción de anergia clonal en células inmunes
4.2. Objetivos Particulares
Expresar y purificar la proteína recombinante GST-NS3 de los cuatro serotipos.
Inmunizar ratones de la cepa BALB/c con la proteína recombinante GST-NS3
Estimular in vitro las células esplénicas de los ratones inmunizados con la proteína
recombinante GST-NS3
Determinar por citometría de flujo la expresión de moléculas de coestimulación
(CD28,CD80,CD86) y moléculas inhibidoras (CTLA-4) que intervienen en la
inducción de anergia clonal en células inmunes.
5. HIPÓTESIS
La proteína recombinante GST-NS3 induce anergia clonal en células inmunes al inhibir la
expresión de moléculas de coestimulación (CD28, CD80 y CD86) y/o al estimular la
expresión de moléculas inhibitorias (CTLA-4) durante la presentación de antígenos.
7
6. METODOLOGÍA
6.1. Expresión de la proteína recombinante GST-NS3Las células de E.coli de la cepa DH5-α, serán transformadas tanto con el vector parental
(pGEX-5X-1) como con los vectores recombinantes (pGEX-NS3) se inocularan en medio
LB implementada con 100 mg/L de ampicilina (Sigma) y se incubaron a 37° C durante toda
la noche. Al día siguiente se hará diluciones (1:10) de los cultivos con medio fresco y se
incubará a 37° C durante 1 h o hasta alcanzar una densidad óptica de 0.5 a 600 nm. La
producción de la proteína se inducirá por la adición de IPTG (isopropil-tio-α-galactósido) a
una concentración final de 0.1 mM. Después de 2 h de incubación las células se colectarán
por centrifugación a 3,046 × g por 20 min a 4° C. Las células empastilladas serán
resuspendidas en amortiguador de fosfatos (PBS, NaCl 137 mM, KCl 2.7 mM,
Na2HPO4.7H2O 4.3 mM y KH2PO4 1.4 mM, pH 7.4), se adicionará lisozima a una
concentración final de 200 µg/mL y se incubará a 37° C durante 15 min, posteriormente la
suspensión celular se someterá a varios ciclos de sonicación (90% de amplitud) para lisar
las células (ciclos de 1 min con pausas de 2 min sobre hielo). Se adicionará inhibidores de
proteasas (PMSF 1 mM y EDTA 5 mM), así como DNAsa 5 μg/mL y RNAsa 10 μg/mL y
se incubará a 37° C durante 15 min. Posteriormente se incubará sobre hielo durante 10 min.
El lisado se centrifugará a 3,046 × g por 45 min.
6.2. Solubilización de los cuerpos de inclusión y eliminación de la urea por medio de diálisis
Las pastillas que contiene la proteína recombinante en cuerpos de inclusión se lavarán dos
veces con 50 mL de PBS 1X pH 7.4, y se resuspenderán aplicando vortex, posteriormente
se incubarán a 37° C en agitación constante durante 30 min. La muestra se centrifugara a 3,
046 × g durante 10 min. Enseguida la pastilla se lavará tres veces con PBS 1X pH 7.4 el
cual contendrá 2 M de urea, la muestra se agitará vigorosamente por 2 min, en cada ocasión
se incubará a 37° C durante 30 min. Entre cada lavado las muestras se centrifugarán a 3,
046 g por 10 min. Los sobrenadantes que se obtendrán de la solubilización de los cuerpos
de inclusión se dializarán para eliminar la urea. Se emplearán membranas de 6000-8000
8
MWCO (Fisherbrand), las cuales serán previamente hervidas a 80° C en un volumen
adecuado de NaHCO3 10 mM durante 30 min con agitación, posteriormente se transferirán
a una solución de EDTA 10 mM por 30 min. Finalmente, la membrana se almacenará en
etanol al 50% hasta su uso. Los sobrenadantes obtenidos con los lavados de urea serán
dializados contra PBS 1X pH 7.4 durante toda la noche a 4° C y con agitación constante. El
material dializado se interaccionará con la resina glutatión agarosa para la purificación de la
proteína recombinante.
6.3. Purificación de la proteína recombinante GST-NS3La purificación de las proteínas solubles se realizará de acuerdo a lo descrito por Smith y
Johnson en 1988. Posteriormente, el sobrenadante que contiene las proteínas de fusión
solubilizadas se mezclarán con la resina Glutatión-agarosa (Sigma). Después de la
absorción por 30 min, la resina se colectará y se lavará por centrifugación a 1,713 x g
durante 3 min con amortiguador de fosfatos. Tanto la GST como las proteínas de fusión
serán eluídas por competencia con 1 mL de una solución de glutatión libre (Sigma) (15 mM
de glutatión en 50 mM de Tris-HCl pH 8.0). Finalmente los eluídos se analizarán en geles
de poliacrilamida al 10% (SDS-PAGE) en condiciones desnaturalizantes para analizar la
presencia de la proteína recombinante.
6.4. Protocolo de inmunización con la proteína recombinante GST-NS3Ratones hembras de la cepa BALB/c de 3 a 4 semanas de edad (grupos de 4 ratones) se
inmunizarán por vía intraperitoneal (ip). Todos los ratones serán mantenidos de acuerdo a
las recomendaciones del uso y cuidado de animales de la institución. El protocolo de
inmunización fue reportado previamente (López-Monteon et al, 2003), una dosis con 100
μg de antígeno y dos dosis más con 50 μg, utilizando como antígeno la proteína
recombinante (GST-NS3). Las primeras inmunizaciones se realizarán emulsificando al
antígeno en adyuvante completo de Freund (ACF) y las reinmunizaciones serán realizadas
en intervalos de una semana y serán preparadas con adyuvante incompleto de Freund (AIF)
(Gibco, BRL). Este protocolo se utilizará para evaluar anergia clonal inducida por la
proteina recombinante GST-NS3 en células inmunes.
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Se utilizarán siete grupos de tres ratones como se describe en la siguiente tabla:
Grupo Inmunización con Proteína
1 GST
2 GST-NS3-DEN1
3 GST-NS3-DEN2
4 GST-NS3-DEN3
5 GST-NS3-DEN4
6 GST-NS3-DEN 1-4
7 No inmunizados
Al termino del esquema de inmunización los ratones serán sacrificados obteniendo el bazo
el cual será utilizado para el cultivo de células esplénicas.
6.5. Cultivo celular y estimulación in vitro con la proteína recombinante GST-NS3
En una caja Petri con 6 ml de solución de Hank´s se colocara una malla metálica estéril y
sobre ésta colocar el bazo y con la ayuda de del émbolo de una jeringa se macerara hasta
obtener una suspensión celular, con una pipeta Pasteur estéril se transferirá a un tubo
cónico y se centrifugara a 1500 rpm durante 10 min. Posteriormente se retirará el
sobrenadante y la pastilla se resuspenderá en solución de Hank´s se centrifugará
nuevamente. A la pastilla se le añadirá solución ACK, y se incubará con agitaciones suaves
y se completa el volumen hasta 15 ml con solución de Hank´s y se centrifugará a 1200 rpm
durante 10 min. Se retirará el sobrenadante y la pastilla se resuspenderá en medio DMEM.
Se ajustara el número de células a la concentración deseada de 2-8 x 106 linfocitos/ml. la
suspensión de linfocitos deberá contener además 10% de suero fetal bovino. Se colocará
100 µl de la suspensión de linfocitos en cada pozo en una placa de 96 pozos y hacer las
condiciones por triplicado. Se añadirá el antígeno (100 µl) y el mitógeno inespecífico a la
concentracion adecuada para promover la estimulacion. Se incubara a 37 °C en una
atmosfera de CO2 al 5%.
6.6. Ensayo de citometría de flujoLos linfocitos serán incubados con los anticuerpos específicos (Life Technologies) a las
moléculas CD28, CD80, CD86 y CTLA-4 independientemente para poder realizar los
ensayos correspondientes de citometría de Flujo (Attune acoustic focusing cytometer).
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7. FACTIBILIDAD DEL PROYECTO
Técnica
El proyecto se encuentra bajo la dirección de la Dra. Aracely
López Monteon y por la asesoría adicional del Dr. Angel
_Ramos Ligonio y se cuenta con el apoyo de estudiantes de
doctorado para el desarrollo de los experimentos.
Financiera
Monto estimado del proyecto: $80,000
El LADISER de Inmunología y Biología Molecular cuenta con
los recursos necesarios para llevar a cabo el proyecto.
Infraestructura
El proyecto se realizará en el LADISER de Inmunología y
Biología Molecular en la Facultad de Ciencias Químicas en
donde se cuenta con el equipo necesario para la realización del
proyecto. Se cuenta con los insumos necesarios para la
realización del proyecto.
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8. CRONOGRAMA DE TRABAJO CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DEL PROTOCOLO:
EFECTO DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE NS3 DEL VIRUS DENGUE SOBRE LA INDUCCIÓN DE ANERGIA CLONAL EN CÉLULAS INMUNES
Actividades a desarrollar Meses Valor estimado por actividad
%Bimestral Año 2014
1 2 3 4 5 61. Revisión bibliográfica x x x x x x 102. Obtención de Células
competentes DH5-αx x
5
3. Transformación de células DH5-α con plásmido recombinante pGEX-5X-1/NS3
x x5
4. Expresión y purificación de la proteína recombinante GST-NS3-DEN 1 - 4.
x x5
5. SDS-PAGE de la proteína recombinante NS3
x x5
6. Cuantificación de la proteína recombinante NS3
x x5
7. Inmunización de ratones cepa BALB/c con la proteína recombinante.
x5
8. Obtención de suero inmune x x 59. Sacrificio y obtención del bazo x 510. Cultivo de células esplénicas x x 511. Estimulación de células con la
proteína recombinante NS3 x
5
12. Marcaje de CD28, CD80, CD86 y CTLA-4 con anticuerpos.
x10
13. Ensayo de las células inmunes por citometría de flujo.
x5
14. Análisis de los resultados x x x x 1015. Integración de borrador de Tesis x x x x x x 516. Redacción de informe final Tesis x x x 10
Director del proyecto
Dra. Aracely López Monteon Nombre y firma
Fecha
23 de Mayo del 2014
100%
Victor Adolfo Romero CruzNombre y firma del
12
estudiante
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Acosta-Bas, C. y Gómez-Cordero I. (2005). Biología y métodos diagnósticos del dengue. Biología y
métodos diagnósticos del dengue .Rev Biomed. 16:113-137
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