Post on 15-Aug-2015
Alicia GonzálezDepartamento de Genética Molecular
Instituto de Fisiología CelularUniversidad Nacional Autónoma de México
SOCIEDAD MEXICANA DE GENETICA
"Duplicación génica y diversificación funcional en la levadura Saccharomyces cerevisiae"
SIN DUDA Saccharomyces cerevisiae ESEL MEJOR AMIGO DEL HOMBRE
No hay verdades absolutas;todas las verdades son verdades a medias.
El error consiste en tratarlascomo verdades absolutas.
Alfred North WhiteheadDiálogos (1953)
-Degrada glucosa o fructosa a etanol aun en presencia de oxígeno (crabtree effect).
- Tiene alta capacidad fermentativa que le permite crecer en ausencia de oxígeno
- Genera mutantes mitocondriales deficientes en
respiración¨petit¨
Saccharomyces cerevisiae tiene un metabolismo peculiar
¿Cómo se originan los genes?
1. Duplicación de genes preexistentes
2. Transferencia horizontal
3. Material no codificante
72 %
16% descendientes de una duplicación genómica 16 %
4n
Hace ≈ 108 años
2n
Duplicación Genómica
28 % en mas de una copia
72 %
A B C D E F G H
LEVADURA ANCESTRAL- 150 m.a.
Wolfe & Shields (1997) Nature
2n
A B C D E F G H
A B C D E F G HA B C D E F G H
Kluyveromyces lactis(aerobio estricto)
ANCESTRO DE Saccharomyces
-100 m.a.
2n
4n
Saccharomyces cerevisiae(anaerobio facultativo)
ABC DEFGHABC DEFGH
2n
duplicación genómica
Merico, A. et al. (2007) FEBS Journal.
La duplicación genica favoreció el metabolismo facultativo
DUPLICACIÓN GÉNICA La duplicación de genes funcionales representa una fuente de material
genético útil en la generación de funciones nuevas o especializadas.
PÉRDIDA DE LA FUNCIÓN
90%
DUPLICACIÓN
NEO-FUNCIONALIZACIÓN SUB-FUNCIONALIZACIÓN
1% ADHAADH1 ADH2
9%
ORC1
SIR3
CUAL ES EL DESTINO DE LOS GENES DUPLICADOS ?
GDH1
GDH3
La retencion de genes fue selectiva? Representa alguna ventaja?
Diferencia fisiológica entre S. cerevisiae y otras levaduras, su habilidad para fermentar azúcares bajo condiciones aerobias y anaerobias, produciendo etanol.
¿Qué ventajas representó la duplicación?
Aparición de un nuevo nicho ecológico
Retención de vías glucolíticas
Duplicación coincide con el tiempo en que las angiospermas se hicieron más abundantes
Determinante en su adaptación evolutiva al crecimiento anaerobio:
- Varios duplicados, regulados de manera distinta en condiciones aerobias y anaerobias- Otros codifican para transportadores de azúcares.
Genes Enzyme % aa ident. Function Compounds
GDH1, GDH3 1.4.1.4 NADP-glutamate dehydrogenase
87 Glutamate biosynthesis (1st step)
-Ketoglutarate, NH4, Glutamate
ASN1, ASN2 6.3.5.4 asparagine synthetase 88 Asparagine biosynthesis (1st step)
Aspartate, Glutamine Asparagine, Glutamate
LEU4, LEU9 4.1.3.12 isopropylmalate synthase 83 Leucine biosynthesis (1st step)
Acetyl-CoA, -Ketoisovalerate Isopropylmalate, CoA
LYS20, LYS21 4.1.3.21 homocitrate synthase 92 Lysine biosynthesis (1st step)
-Ketoglutarate, Acetyl-CoA Homocitrate, CoA
YDR111, YLR089 2.6.1.2 alanine transaminase (hypothetical)
67 Alanine biosynthesis and/or degradation
Alanine-Ketoglutarate Pyruvate, Glutamate
BAT1, BAT2 2.6.1.42 Leu/Ile/Val transaminase 77 Leu, Ile, Val biosynthesis and/or degradation
Leu/Ile/Val-Ketoglutarate Methyloxopentanoate, Glutamate
SAM1, SAM2 2.5.1.6 S-adenosylmethionine synthase
91 Methionine biosynthesis regulation
Methionine, ATP S-Adenosylmethionine, PPi
AAT1, AAT2 2.6.1.1 aspartate transaminase 46 Aspartate biosynthesis and/or degradation
Aspartate-Ketoglutarate Oxaloacetate, Glutamate
SHM1, SHM2 2.1.2.1 Gly/Ser hydroxymethyl transferases
60 Gly/Ser biosynthesis and/or degradation
Methylenetetrahydrofolate, Glycine Tetrahydrofolate, Serine
Redundancia génica en el metabolismo de aminoácidos
Función respiratoria
a- KG
citrato
a- KG
succinato
citrato
a-cetoglutarato
succinato
citrato
piruvato
GLUCOSA
etanol ETANOL
acetil-CoA
acetil-CoA
a- KG
succinato
citratocitratooxalacetato
oxalacetato
CO2
Utilización de carbono y metabolismo facultativo en S. cerevisiae
glucosa
a-cetoglutarato
piruvato
NADP-GDH
a-ketoglutarate
L-glutamate
L-glutaminecitrateoxalacetatemalate
fumarate
succinateNH4
+
NH4+
NAD-GDH
GS
NH4+ Gdh1 / Gdh3
Gdh2
GOGAT
Glt1Gln1
Metabolismo central del nitrógeno
0 48 96 1440.0
0.1
0.2
CULTURE TIME (h)
NAD
P-G
DH
ACT
IVIT
Y (U
/mg)
GDH1
GDH3
[glucose][ethanol]
GDH1,gdh3-
GDH3,gdh1-a6Gdh1p
a6Gdh3p
pH 5.8
0 1 2 3 4 50
10
20
30
40
50
NAD
P-G
DH
(U m
g)
-1
)
[a-cetoglutarato] (mM)
GDH WTa6Gdh1p
a6Gdh3p
[a-ketoglutarate] (mM)
NA
DP -
GD
H A
CTIV
ITY
(U/m
g)
GDH3
ACT1
G E
Gdh1Vn Gdh3Vc
En cultivos de etanol, los monomeros de Gdh1 y Gdh3 forman hetero-oligomeros………..Esta observacion tiene un
significado fisiologico????????
Gdh1Vn / Gdh3Vc Gdh3Vn / Gdh1Vc
Geovani López Tesis Doctorado en curso
Se esta desarrollando un metodo para purificar la coleccion de isozimas de Gdh1-Gdh3
17
Alt1
Alt2?
LA PAREJA ALT1/ALT2 ¿CODIFICA PARA ALANINO AMINOTRANSFERASAS?GEORGINA PEÑALOSA
Una mutante alt1Dno es auxótrofa de alanina, pero no crece en alanina como única fuente de Npapel catabólico.Una mutante alt2D no afecta el metabolismo de alanina, no tiene fenotipo
Subcellular localization of the paralogous proteins Alt1 and Alt2
DIC ptetO7 Alt2-yECitrine Merge
Mitotracker Alt1-yECitrine Merge
Figure X. Subcellular localization of the paralogous proteins Alt1 yECitrine and ptetO7 Alt2-yECitrine through confocal microscopy. Strains were grown on MM during exponential phase (~0.6 OD) glucose (2%, w/v) was used as a carbon source, and 40 mM ammonium sulfate was used as a nitrogen source. A) Mitochondrial localization of Alt1-yEcitrine, show co-localization with mitotracker. B) Cytoplasmic localization of Alt2-yECitrine with the inducible promoter ptetO7.
A)
B)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0
5
10
15
20
25
WT alt1 alt2 alt1 alt2
WT alt1Δ alt2Δ alt1Δ alt2Δ
μ (h
-1)
0.3 0.6 0.9 2.0
alan
ine
(nm
ol m
g-1)
CURVAS DE CRECIMIENTO
OD600
A
DC
B
0 2 4 6 8 100.01
0.1
1O
D 60
0nm
Time (h)
WTalt1Dalt2Dalt1D alt2D
0 5 10 15 20 250.01
0.1
1
OD
600n
m
Time (h)
WTalt1Dalt2Dalt1D alt2D
CURVAS DE CRECIMIENTO
VELOCIDAD DE CRECIMIENTO
POZAS DE ALANINAPLoS ONE Peñalosa et al 2012
GLUCOSA + AMONIO
ALT2
ALT1
SCR1
0.3 0.6 0.9 1.7 2.4
ALT1
ALT2
SCR1
0.3 0.6 0.9 1.3 2.1
OD 600nm OD 600nm
TAP Ab
Lys20/Lys21 Ab
ALT1-TAP OD 600nmC
0.3 0.6 0.9 1.5 2.2
AL
T1-
TAP
ALT2-TAP OD 600nmF
TAP Ab
Lys20/Lys21 Ab
0.3 0.6 0.9 1.5 2.2
BA
ALT1-TAP OD 600nm
0.3 0.6 0.9 1.5 2.2
E
TAP Ab
Lys20/Lys21 Ab
0.3 0.6 0.9 1.5 2.2
ALT2-TAP OD 600nm
D
TAP Ab
Lys20/Lys21 Ab
GLUCOSA + ALANINA
GLUCOSA + AMONIO
GLUCOSA + ALANINA
PLoS ONE Peñalosa et al 2012
El represor Nrg1 Determina la expresion de ALT1 Y ALT2!!!!!!!!
EL REPRESOR NRG1 SE UNE A LOS PROMOTORES DE ALT1 Y ALT2
PLoS ONE Peñalosa et al 2012
La expresión de ALT1 se induce poralanina – catabólicaLa expresión de ALT2 se reprimeporalanina - biosintética
Alt1 tiene actividad de alanino aminotransferasaAlt2 NO tiene actividad de alanino aminotransferasa
PLoS ONE Peñalosa et al 2012
LA SOBREEXPRESION DE ALT2 AUMENTA TRANSCRITO, Y LA ACTIVIDAD ENZIMATICA?
PLoS ONE Peñalosa et al 2012
PLoS ONE Peñalosa et al 2012
¿PORQUE SE CONSERVO ALT2?POSIBLEMENTE TIENE OTRA ACTIVIDAD
¿COMO SE ORIGINO?
FUNC 1
MUTACIONES
FUNC 1 FUNC 2
FUNC 1
FUNC 2
SubfuncionalizaciónNeofuncionalización
Post-duplicacion
FUNC 1
FUNC 1
F 2F 1F 2F 1
Ancestral GeneAncestral Gene F 1 F 2
POSIBLES ORIGENES DE ALT2
DANKE!
LA DIVERGENCIA FUNCIONAL DE GENES DUPLICADOS
1.- PROPIEDADES FISICOQUIMICAS DE LOS PRODUCTOS2.- LOCALIZACION SUBCELULAR DE LOS PRODUCTOS3.- REGULACION TRANSCRIPCIONAL DE LOS GENES
"BUSCO LA VERDAD; NO LA SUPOSICION NI LA CREENCIA"
EL SÉPTIMO SELLOI. Bergman, 1957
Es Sacharomyces cerevisiae es el mejor amigo del hombre