New Breeding Techniques (NBTs) – Una nueva era en el mejoramiento de

plantas.

Humberto PrietoBioquímico, Dr. en Bioquímica

Estación Experimental La Platinahprieto@inia.cl

2010:NBTs

EVOLUCIÓN DEL MEJORAMIENTO GENÉTICO VEGETAL

Cruzamientos Mutagénesis Selecciónasistida pormarcadores

(MAS)

Transformacióngenética

NBTs

• Cisgenia (e intragenia)

• Tecnología de nucleasas zinc-finger

• Mutagénesis dirigida por oligonucleótidos

• Metilación de DNA dependiente de RNA

• Agro-infiltración

• Injertación de variedades no-GM sobreportainjertos GM

• Mejoramiento Reverso

• Genómica sintética

Principales requerimientos para abordar el Mejoramiento de Precisón

(Precision Breeding)

• Técnicas de cultivo in vitro

• Transformación genética

• Conocimiento de los genomas a trabajar

• El mejorador trabaja de forma directa y específica con variaciones moleculares que estánvinculadas a (o que generan) fenotipos de interés agronómico.

• Información Clave: Los genomas.

Mutagénesis poroligonucleótidos

Mutagénesis Mutagénesis dirigida por óligos

Cisgenia

Plasmidio Ti

Agrobacterium tumefaciens

Cromosoma

Célula vegetal

Genoma

Gen 1

Gen 2

Gen 3

Promotor Secuencia Terminadorcodificante

Promotor Secuencia TerminadorGen 1 codificante Gen 1

Gen 1

Promotor Secuencia TerminadorGen 2 codificante Gen 3

Gen 1

Transgenia

Cisgenia

Intragenia

RB LBDRTerminador

MybA1 CDS ULAnk-Prom

All-Grape

AT-Rich

Plant derived Transfer DNAs

CDS

WT N. benthamiana

TG N. benthamiana + ALL-G

V4 V6V5 V7

RNA interferente y técnicas asociadas

RNA interferente (RNAi): control de la expresión de un gen

AGO1

siRNAs (plants)

Nucleus

RDR6 or RDR1 // RNA pol II

DCL2 or DCL4

(A)nCAP

CAP (A)n

mRNA levels decreased

Cytoplasm

HEN1

AGO1 RISC

21- or 22-nt

miRNAs

Nucleus

Pol II

DCL1

DCL1

CAP (A)n

mRNA levels decreased

Cytoplasm

HASTY

HEN1

RISC MaturemiRNA

(A)nCAP

Vástago no GM

PortainjertoGM

Injerto

Injertación

Silenciamiento a larga distanciadependiente de RNA

Virus

Metilación

Metilación dependiente de RNA

Edición de genomaspor nucleasas

Edición de Genomas porNucleasas

Site Directed Nuclease type 1SDN1

Site Directed Nuclease type 2SDN2

Site Directed Nuclease type 3SDN3

Nucleasas de dedos de Zinc (ZFNs)

TALEN: transcription activator-likeefector nucleases (nucleasas efectoras

tipo activador de transcripción)

+

cas protospacer

lider repeat

CRISPR/casclustered regularly interspaced short palindromic repeats

Un sistema

(immune)

adaptativo enbacterias

por ejemplo: Streptococcus

pyogenes

ATCTCCATCTTCTTCTCCTGTCTTTTCTCTTTCACGGTCTGTTTTTCGTTCTTGTTTTGAAAATGACTGGAGCAGACACGGCTCGGACTGTGATTGGTATTATTGGTATGTTCTTTATTTTGAGCCTTTTGCGTTTTGGACGGTATGCTTTTCTCGTTTGGTTAGGAAGAAAATTAGGTGGGAAAAGAAAACTCAAGATCTTCTGGTGAAGTTCTTGCTGTGAAGTTTTTCTTCT

TTCTCATTAATGTTGAGATCATAACTAACCTTTTTTTTTTTCTCTCGGTACAGGGAATGTCATCTCCTTCGCACTATTCGCCTCTCCGTCGTACGTCTTTGATCACTATAACGAGGGG

CTAACTTTTTCTTGCTATCCAAACAAGATTAGTTAACTGCTCGGAAGAGAAGATTTGGATTTTTTTTTTCCTTTTTTATTTTGTTTTGTTAATAATTAAATTGAAGCGATTGTATGTG

TTTATGGTTGCAGTCCAACATTTTGGAGAATATGGAAGAAGAGATCAGTGGAGGAGTTCAGTCCAGATCCGTACCTAGCCACAGTGATGAACTGCATGTTTTGGATCTTCTATGGACT

ACCAGTAGTCCATCCAAACAGTACTCTGGTGGTGACCATCAACAGCATTGGGCTTGCAGTCGAGTTGATTTACCTCACCATCTATTTCGTATTTGCTCCCAACAAAGGCCGGGTATGC

GTCAAATCATTTCATTCTTCTCTTTAACTTACTTCCCATCTGAACCGAATGAATATGAATACGAATCACAGGTTGTTAGGTTGTTGAAAATTGAAATCCAATATGGGTTATGGGTAAC

GTCATGAATCATGATTGGATATATGATTACGTCATGAATCATGATTGAATTTTAAATTTTAGAGTTCGTTTGATAGTGATTTAATTTGAGTTGTTTGATATAATAATGTTTGTTATCT

ACATTGATTTGAATATGACTATGGCTTTTACAATATTTTTTTATTAATTATATTTCATATATTTTTTTTGGGCAAAGATGTATTATCTTTGATGATTTTATATACTATATATTTGATC

GGTGAATATATGAAATTTAAATTATTTTTAAAGGATTCTTATTTATACTTTTCTTGAGAACAAGTAGTAGTGATATCAAACATAATCCCTTTTGATTAGGATAAAGATATGAGTAAAG

AGAGTTTCATGTTGAATTTGGATTTTTTTGGGCTCGATTAATTATTATTAATAGAAAAGAAATCATGATATACCATATCAAAGACAATCCCCTTTGATTAAAATAAAGATACGAGTAT

GAAGGGTTTCACTTTGAATTTGGATTTTTTTGGACTCTTGCTATTAATTGTTAGAAAAGAAATCATGATATACCATTTTAGATACTATCTTTGATCAATGAATATATGAAATTTAAAT

TATTTTTAGGAATTCAGAGGATTCCTATTTTATATGGAAACTTTTTTTTTTTGGATTTATAGTACTGATATCAAACAAAATCCCCTTTGATTAAAATAAAAATACGGGTATGGAAGGT

TTTTTGGATTTTTTTGGACTCTTGCAATTGATTGTTATTAATAGAAAAGAAATCTCACTGTTATCCTTTTAATCTTCATGGCTGTAAATCGATATCAGATAGAGTCCAGGAAGGTTTT

ATTTATAGTAAATAAATCATATTGTTATTGTTTGAATCTTCATGGGATACGGCTTGGTTGGTATGCAGTTGAAGGTAATAGGTGTGCTTTGCCTGGAATTG

VvSweet4

VvSweet4 Editado

G16 TCACGGTCTGTTTTTCGTTCTTGTTTTGAAAATGACTGGAGCAGACACGGGAAGGTTTTATTTATAGTAAATAAATCATATTGTTATTGTTTGAATCTTCATGGGATACGGCTTGGTTGG

G14, G15 TCACGGTCTGTTTTTCGTTCTTGTTTTGAAAATGACTGGAGCAGACACGGGAAGGTTTTATTTATAGTAAATAAATCATATTGTTATTGTTTGAATCTTCATGGGATACGGCTTGGTTGG

G18, G19, G21, G22, G23 TCACGGTCTGTTTTTCGTTCTTGTTTTGAAAATGACTGGAGCAGACACGGGAAGGTTTTATTTATAGTAAATAAATCATATTGTTATTGTTTGAATCTTCATGGGATACGGCTTGGTTGG

G25 TCACGGTCTGTTTTTCGTTCTTGTTTTGAAAATGACTGGAGCAGACACGAGGAAGGTTTTATTTATAGTAAATAAATCATATTGTTATTGTTTGAATCTTCATGGGATACGGCTTGGTTGG

G2, G7, G9 TCACGGTCTGTTTTTCGTTCTTGTTTTGAAAATGACTGGAGCAGACACGGGAAGGTTTTATTTATAGTAAATAAATCATATTGTTATTGTTTGAATCTTCATGGGATACGGCTTGGTTGG

Guía 1 – sitio de corte

Guía 2 – sitio de corte

Partidor Sentido

Partidor Antisentido

Estudio zona de edición gen SWEET vides

El entorno

Terapéutica

Agricultura

La perspectiva(CRISPR)

Se establece el términoCRISPR y se determina

Cas9 (Jansen et al.)

Se demuestra que CRISPR Cas funcionan

como sistema bacterianoantifagos (Barrangou y

Horvath)

CRISPR-Cas se usa comoSistema de edición

(Doucha y Carpentier)

US llama a moratoria para uso en embriones

humanos

Se encuentra Cpf1, unanuclease más precisaque Cas (Zhang et al.)

Se aprueba el uso de CRISPR para cambios

permanentes enembriones humanos

(UK)

US-NIH aprueba primer ensayo clínico CRISPR-

Cas contra cáncerCRISPR/Cas: Una tecnología de impacto mayor en salud

Se encuentransecuencias repetidas

interespaceadasagrupadas en genomasde bacteria (Mojica et

al.)

Descubrimiento Aplicación Uso en humanos / optimización

Se establecefuncionamiento de

gRNAs y Cas (Deltchevaet al.)

CRISPR-Cas se usa enratón y células humanas

(Zhang et al.)

Octubre 2017…

Cas 9 modificada para cambiar residuos AT a

GC (Oct 4) // Tecnología“Base Editing”

Cas 13: edición de RNA por reemplazo de

residuos A por I (Oct 25) //

Tecnología “REPAIR”;

Cas 13 modificada para edición de RNA (Oct 25)

Regulaciones

Inserción de DNA exógeno

Cambio discreto en

DNA

Sin cambioen DNA

Alc

ance

de

l cam

bio

gen

étic

o

SDN1

SDN2

ODM

SDN3Cisgenia

Intragenia

Agroinfiltración

Injertación

RNAi

Transgenia

Nueva combinación de material genético

No OGM OGM

Regulación NBTs

Categoría 1: Introducción transitoria del ADNdurante un paso intermedio del desarrollodel producto final.

El producto final es similar y no se distinguede los productos desarrollados pormejoramiento convencional.

Categoría 2: Introducción estable del ADN durante un paso intermedio del desarrollo del

producto final.

El producto final es similar y no se distingue de los productos desarrollados por mejoramiento

convencional.

Categoría 3: Integración estable del ADN

El producto final es similar a un transgénico, salvo el caso del uso de genes de la misma

especie (cisgenia)

Regulación NBTs(enfoque Chile)

Foco en:

Muchas gracias!