MUERTE CELULAR APOPTÓTICA

IN VITRO DURANTE LA

DIFERENCIACIÓN ERITROIDE

Zamai et al. Apoptosis 9:235-246, 2004

ERITROPOYESIS

Stem cells células eritroides tempranas y

tardías eritrocitos

Diferenciación eritroide: - sensibilidad a EPO

- Glicoforina A

- CD45

- cambios nucleares

- pérdida organelas

- síntesis Hb

ANTECEDENTES

Médula ósea normal eritroblastos apoptóticos

Eritroblastos inmaduros receptores de muerte

(Fas, TRAIL-R1 y TRAIL-R2)

Eritroblastos maduros, macrófagos y células NK inmaduras ligandos FasL y TRAIL

Homeostasis balance EPO vs. TRAIL y FasL

OBJETIVO

Caracterizar la muerte de células eritroides que ocurre in vitro

MÉTODOS

Sangre células mononucleares CD34+ cultivo en medio sin suero (+ SCF + EPO + IL-3)

Diferenciación unilinaje población homogénea de células

CITOMETRIA DE FLUJO

- Ag de membrana (CD34, CD45, Glicoforina A)

- Ag intracelulares (HbA y HbF)

- Características apoptóticas / Ciclo celular:

Anexina-V

Coloración supravital con IP

FSC – SSC

EtOH permeabilización + IP

Microscopía electrónica de transmisión (TEM) características ultraestructurales

Electroforesis de ADN (ladder) fragmentación del ADN

Microscopía de fluorescencia TUNEL marcación de 0H 3’ (dUTP-FITC)

CITOMETRIA DE FLUJO: (seguimiento de la diferenciación)

(tamaño)

(complejidad)

Gli+ (low-int)

% Gli+ (intenso) FSC SSC

% Gli+ (intenso)

FSC SSC

Tinción con bencidina

Citometría de flujo: detección de HbF y

HbA

20-25%

80%

Microscopía electrónica de transmisión de células eritroides

Citometría de flujo: expresión de CD45

Tinción con May-Grünwald-GiensaR1 = eritroide

R2 = mieloide temprana + blastos

R3 = mieloide tardía + neutrófilos

R4 = monocitos

R5 = células muertas

CITOMETRIA DE FLUJO: Glicoforina A vs. Anexina-V-FITC

Gli débil/Anx-V+

Gli neg / Anx-V+

Gli débil/Anx-V+ Gli débil/Anx-V+

Microscopía electrónica de transmisión de células apoptóticas

Citometría de flujo: ciclo celular

Ladder de ADN

Microscopía de fluorescencia:Reacción TUNEL

DISCUSIÓN

• Diferenciación asociada con apoptosis

• Células eritroides tienen particular tendencia a apoptosis (característica intrínseca?)

• Progenitores eritroides con distinta sensitividad a EPO

DIFERENCIACIÓN ERITROIDE Glicoforina A Hemoglobina adultaTamaño ComplejidadMaterial granular Hemoglobina

APOPTOSISAnx-V+Alteraciones nuclearesPico subdiploideFragmentación ADN

Hipótesis: apoptosis se induce en el estadio del eritroblasto basófilo

CONCLUSIÓN

El incremento paralelo de células apoptóticas y células eritroides maduras, sugiere que la interacción entre eritroblastos inmaduros y maduros (donde los últimos pueden ejercer una actividad citotóxica sobre los primeros) contribuye a inducir apoptosis durante la diferenciación eritroide in vitro.

Este proceso podría representar una reproducción del feedback regulatorio negativo observado en las islas eritroblásticas de la médula ósea.