MUERTE CELULAR APOPTÓTICA IN VITRO DURANTE LA DIFERENCIACIÓN ERITROIDE Zamai et al. Apoptosis...
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MUERTE CELULAR APOPTÓTICA
IN VITRO DURANTE LA
DIFERENCIACIÓN ERITROIDE
Zamai et al. Apoptosis 9:235-246, 2004
ERITROPOYESIS
Stem cells células eritroides tempranas y
tardías eritrocitos
Diferenciación eritroide: - sensibilidad a EPO
- Glicoforina A
- CD45
- cambios nucleares
- pérdida organelas
- síntesis Hb
ANTECEDENTES
Médula ósea normal eritroblastos apoptóticos
Eritroblastos inmaduros receptores de muerte
(Fas, TRAIL-R1 y TRAIL-R2)
Eritroblastos maduros, macrófagos y células NK inmaduras ligandos FasL y TRAIL
Homeostasis balance EPO vs. TRAIL y FasL
OBJETIVO
Caracterizar la muerte de células eritroides que ocurre in vitro
MÉTODOS
Sangre células mononucleares CD34+ cultivo en medio sin suero (+ SCF + EPO + IL-3)
Diferenciación unilinaje población homogénea de células
CITOMETRIA DE FLUJO
- Ag de membrana (CD34, CD45, Glicoforina A)
- Ag intracelulares (HbA y HbF)
- Características apoptóticas / Ciclo celular:
Anexina-V
Coloración supravital con IP
FSC – SSC
EtOH permeabilización + IP
Microscopía electrónica de transmisión (TEM) características ultraestructurales
Electroforesis de ADN (ladder) fragmentación del ADN
Microscopía de fluorescencia TUNEL marcación de 0H 3’ (dUTP-FITC)
CITOMETRIA DE FLUJO: (seguimiento de la diferenciación)
(tamaño)
(complejidad)
Gli+ (low-int)
% Gli+ (intenso) FSC SSC
% Gli+ (intenso)
FSC SSC
Tinción con bencidina
Citometría de flujo: detección de HbF y
HbA
20-25%
80%
Microscopía electrónica de transmisión de células eritroides
Citometría de flujo: expresión de CD45
Tinción con May-Grünwald-GiensaR1 = eritroide
R2 = mieloide temprana + blastos
R3 = mieloide tardía + neutrófilos
R4 = monocitos
R5 = células muertas
CITOMETRIA DE FLUJO: Glicoforina A vs. Anexina-V-FITC
Gli débil/Anx-V+
Gli neg / Anx-V+
Gli débil/Anx-V+ Gli débil/Anx-V+
Microscopía electrónica de transmisión de células apoptóticas
Citometría de flujo: ciclo celular
Ladder de ADN
Microscopía de fluorescencia:Reacción TUNEL
DISCUSIÓN
• Diferenciación asociada con apoptosis
• Células eritroides tienen particular tendencia a apoptosis (característica intrínseca?)
• Progenitores eritroides con distinta sensitividad a EPO
DIFERENCIACIÓN ERITROIDE Glicoforina A Hemoglobina adultaTamaño ComplejidadMaterial granular Hemoglobina
APOPTOSISAnx-V+Alteraciones nuclearesPico subdiploideFragmentación ADN
Hipótesis: apoptosis se induce en el estadio del eritroblasto basófilo
CONCLUSIÓN
El incremento paralelo de células apoptóticas y células eritroides maduras, sugiere que la interacción entre eritroblastos inmaduros y maduros (donde los últimos pueden ejercer una actividad citotóxica sobre los primeros) contribuye a inducir apoptosis durante la diferenciación eritroide in vitro.
Este proceso podría representar una reproducción del feedback regulatorio negativo observado en las islas eritroblásticas de la médula ósea.