MÉTODO ESPECTROFOTOMETRICO PARA RESIDUOS DE NICOTINA EN CULTIVOS DE HOJAS Y CEROSOS

INTRODUCCIÓN

Es un método estandarizado correspondiente al 964.20 – AOC, el cual fue estandarizado luego de que este método fuera muy útil para ver el origen de un problema de intoxicación que se produjo en Estados Unidos en el estado de Arizona en 1963, Arizona es un estados de mucha producción vegetal en especial la ciudad de Scottsdale, en esos tiempos no había un control a los productos que utilizaban los agricultores para hacer crecer sus cultivos, algunos compraban sus insecticidas y pesticidas a empresas especializadas, sin embargo un grupo aun preparaba sus propios insecticidas y pesticidas, en 1963 un año donde hubo pocas lluvias y por lo tanto carencia de agua, hubo un brote de enfermedades estomacales muy fuertes en la ciudad de Scottsdale, médicos y científicos arribaron a Scottsdale para ver el motivo de esa intoxicación.

Primero analizaron el agua de la zona , no se encontró absolutamente nada; luego analizaron el suelo de los cultivos aledaños, no encontraron nada fuera de lo común; sin embargo cuando analizaron las hojas de la lechuga encontraron la existencia de nicotina, para ese entonces no existía un método adecuado que brindará de manera cuantitativa la concentración de nicotina en muestras. Se probaron diferentes maneras, algunas producían un margen de error moderado pero las cantidades de nicotina se encontraban por debajo de las concentraciones a la que trabajan los métodos gravimétricos y volumétricos para nicotina, entonces se encontró un método instrumental que satisficiera los parámetros dados.

Luego buscaron otro método para aquellos alimentos que no eran a bases de hojas, como mandarinas y manzanas.

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PRINCIPIOS TEORICOS

ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA-VISIBLE

La espectrometría ultravioleta-visible o espectrofotometría UV-Vis implica la espectroscopia de fotones en la región de radiación ultravioleta-visible. Utiliza la luz en los rangos visible y adyacentes (el ultravioleta (UV) cercano y el infrarrojo (IR) cercano.

En esta región del espectro electromagnético, las moléculas se someten a transiciones electrónicas.

Esta técnica es complementaria de la espectrometría de fluorescencia, que trata con transiciones desde el estado excitado al estado basal, mientras que la espectrometría de absorción mide transiciones desde el estado basal al estado excitado.

LEY DE BEER-LAMBERT

La espectrometría UV-Vis se utiliza con mayor frecuencia en forma cuantitativa para determinar las concentraciones de especies absorbentes en solución, usando la Ley de Beer-Lambert:

-

donde A es la absorbancia medida, I0 es la intensidad de la luz incidente a una determinada longitud de onda, I es la intensidad de transmisión, L la longitud de ruta a través de la muestra, y c la concentración de las especies absorbentes. Para cada especie y longitud de onda, ε es una constante conocida como absortividad molar o coeficiente de extinción. Esta constante es una propiedad fundamental molecular en un solvente dado, a una temperatura y presión particular, y tiene como unidades 1/M * cm o, a menudo, U/M * cm.

La absorbancia y extinción ε a veces son definidas en términos de logaritmo natural en lugar de logaritmo de base 10.

La ley de Beer-Lambert es útil para la caracterización de muchos compuestos, pero no sirve como relación universal para la concentración y absorción de todas las sustancias. En moléculas complejas de gran tamaño, como los tintes orgánicos (Xylenol Naranja o Rojo Neutro, por ejemplo), a veces se encuentra una relación polinómica de segundo orden entre la absorción y la concentración.

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ESPECTROFOTÓMETRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE

El instrumento utilizado en la espectrometría ultravioleta-visible se llama espectrofotómetro UV-Vis. Mide la intensidad de luz que pasa a través de una muestra (I), y la compara con la intensidad de luz antes de pasar a través de la muestra (Io). La relación I / Io se llama transmitancia, y se expresa habitualmente como un porcentaje (%T). La absorbancia (A) se basa en la transmisión:

A = - log (%T)

Las partes básicas de un espectrofotómetro son una fuente de luz (a menudo una bombilla incandescente para las longitudes de onda visibles, o una lámpara de arco de deuterio en el ultravioleta), un soporte para la muestra, una rejilla de difracción o monocromador para separar las diferentes longitudes de onda de la luz, y un detector. El detector suele ser un fotodiodo o un CCD. Los fotodiodos se usan con monochomadores, que filtran la luz de modo que una sola longitud de onda alcanza el detector. Las rejillas de difracción se utilizan con CCDs, que recogen la luz de diferentes longitudes de onda en píxeles.

Un espectrofotómetro puede ser único o de doble haz. En un instrumento de un solo haz (como el Spectronic 20), toda la luz pasa a través de la célula muestra. La Io debe medirse retirando la muestra. Este fue el primer diseño, y todavía está en uso en la enseñanza y laboratorios industriales.

En un instrumento de doble haz, la luz se divide en dos haces antes de llegar a la muestra. Un haz se utiliza como referencia, y el otro haz de luz pasa a través de la muestra. Algunos instrumentos de doble haz tienen dos detectores (fotodiodos), y el haz de referencia y el de la muestra se miden al mismo tiempo. En otros instrumentos, los dos haces pasan a través de un bloqueador que impide el paso de un haz. El detector alterna entre la medida del haz de muestra y la del haz de referencia.

Las muestras para espectrofotometría UV-Vis suelen ser líquidas, aunque la absorbancia de los gases e incluso de los sólidos también puede medirse. Las muestras suelen ser colocadas en una célula transparente, conocida como cubeta. Las cubetas suelen ser rectangulares, con una anchura interior de 1 cm. Esta anchura se convierte en la longitud de ruta, L, en la Ley de Beer-Lambert. También se pueden usar tubos de

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ensayo como cubetas en algunos instrumentos. Las mejores cubetas están hechas con cuarzo de alta calidad, aunque son comunes las de vidrio o plástico. El cristal y la mayoría de los plásticos absorben en el UV, lo que limita su utilidad para longitudes de onda visibles.

ESPECTRO ULTRAVIOLETA-VISIBLE

Un espectro ultravioleta-visible es esencialmente un gráfico de absorbancia de luz frente a una longitud de onda en el rango del ultravioleta o la luz visible. Este espectro puede ser producido directamente con los espectrofotómetros más sofisticados, o bien pueden registrarse los datos de una sola longitud de onda con los instrumentos más simples. La longitud de onda se representa con el símbolo λ. Del mismo modo, para una determinada sustancia, puede hacerse un gráfico estándar del coeficiente de extinción (ε) frente a la longitud de onda (λ). Este gráfico estándar sería efectivamente "la concentración corregida" y, por tanto, independiente de la concentración. Para una sustancia determinada, la longitud de onda en la cual se produce el máximo de absorbancia en el espectro se llama λ max, y se pronuncia "lambda-max".

Las reglas de Woodward-Fieser son un conjunto de observaciones empíricas que pueden utilizarse para predecir λ max, la longitud de onda de la absorción UV-Vis, para compuestos orgánicos conjugados como dienos y cetonas.

Las longitudes de onda de los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlace en una determinada molécula, y son valiosos para determinar los grupos funcionales dentro de la molécula. La absorción UV-Vis no es, sin embargo, una prueba específica para ningún compuesto determinado. La naturaleza del disolvente, el pH de la solución, la temperatura, la concentración de electrolitos, y la presencia de sustancias interferentes pueden influir en los espectros de absorción de los compuestos, así como las variaciones en la anchura de la hendidura (ancho de banda efectivo) en el espectrofotómetro.

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NICOTINA

La nicotina es un compuesto orgánico, un alcaloide encontrado principalmente en la planta del tabaco (Nicotiana tabacum), con alta concentración en sus hojas (constituye cerca del 5% del peso de la planta y del 3% del peso del tabaco seco)1 estando también presente en otras plantas de la familia Solanacea aunque de forma marginal (en el rango de 2–7 µg/kg), como en el caso del tomate, la berenjena, el pimiento y la patata.2 En cantidades aún más marginales, ha sido encontrado en otras plantas como la coliflor, la pimienta verde o el té negro.3 La nicotina debe su nombre a Jean Nicot, quien introdujo el tabaco en Francia en 1560. Se sintetiza en las zonas de mayor actividad de las raíces de las plantas del tabaco y es trasportada por la savia a las hojas verdes. El depósito se realiza en forma de sales de ácidos orgánicos.

Es un potente veneno e incluso se usa en múltiples insecticidas (fumigantes para invernaderos). En bajas concentraciones, la sustancia es un estimulante y es uno de los principales factores de adicción al tabaco. Es soluble en agua y polar.

La nicotina permitida en alimentos debe ser menor a 5ppm.

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OBJETIVO DEL MÉTODO

Este proceso tiene como objetivo identificar la cantidad de nicotina que tienen algunos productos agrícolas.

Se analizaran cultivos con hojas y con ceras.

INSTRUMENTO

Se utilizó un Espectrofotómetro Ultravioleta/Visible GENESYS de haz simple, acoplado a una computadora con el software correspondiente para el análisis de los datos obtenidos

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MÉTODO PARA EL CULTIVOS DE HOJAS (LECHUGAS)

REACTIVOS:

1. Ácido clorhídrico diluido, aproximadamente 0.05N; diluir 5ml de HCl en 1L.2. Solución estándar de nicotina, 1mg/mL, diluir 100mg de nicotina ( Eastman

Kodak Co.No 1242 o equivalente ) con 100mL de HCL 0.05N3. Solución intermedia , 0.01mg/mL pipetear 1mL de la solución stock en una fiola

de 100 mL y diluir con HCl 0.05N .4. Solución extractora, diluir 20mL de NH4OH en 2L, que se prepara cuando se

utilice.

PREPARACION DE LA MUESTRA

1. Pesar 500 g de espinaca o lechuga (picada, limpia y al seco).2. Añadir 800 ml de benceno, 200 ml de CHCl3 (cloroformo) y 10 ml de NH4OH

(hidróxido de amonio).3. Agitar aproximadamente 10 minutos y drenar la solución de la forma más

completa posible en un vaso de la 1 L.4. Filtrar a través del plegado de papel 38.5 cm en el frasco y proceder

inmediatamente con la determinación

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DETERMINACIÓN

1. Colocar 400 ml de solución filtrada en un separador de 500 ml2. Añadir aprox. 25 ml de HCl 0.05 N y 2 ml HCl3. Agitar vigorosamente4. Dejar que las fases se separen (aprox. 5 minutos) y drenar la capa inferior en el

separador de 250 ml5. Arremolinar a lo largo del separador (deje reposar aprox. 2 minutos), drenar

cualquier adicional y llevarlo a un separador de 250 ml6. Repetir unas cuantas veces.7. Extraer soluciones de 25, 25, 15 y 10 ml aprox. 0.05 N de HCl8. Repetir remolinada como anteriormente9. Drenar todo el ácido extraído a un separador de 250 ml10. Extraer 2 porciones de 50 ml y 4 de 25 ml de CHCl311. Combinarlo en un separador de 250 ml12. Adherir 2 ml de HCl en el separador y estar seguros de que la solución es ácida

(tornasol)13. Extraer porciones de 25, 25, 20, 10 y 5 ml de HCl 0.05 N (aprox.)14. Combinarlo todo con el pequeño sistema externo en el separador de 125 ml15. Lavar lo externo con 15 ml de éter de petróleo.16. Drenar la fase acuosa en un segundo separador de 125 ml y limpiar éter de

petróleo con 5 ml de HCl 0.05 N (aprox.), la adición de lavado a la solución de ácido combinado

17. Extraer solución con otros 15 ml de éter de petróleo18. Drenar la fase acuosa en un frasco de 100 ml, y lavar éter de petróleo con 5 ml

de HCl 0.05 N (aprox.)19. Drenar ácido en un frasco y diluir a volumen con HCl 0.05 N (aprox).20. Combinar y verter a un vaso de 50 ml y deje reposar 10 a 15 minutos21. Determinar A en 236, 259 y 282 nm con la referencia de HCl 0.05 N22. Confirme presencia de nicotina con lecturas de intervalos de 2 nm23. Determinar A con la solución estándar de nicotina con la referencia del HCl 0.05

N.

CALCULOS:

Tomar la absorbancia de la solución estándar como: A std=A

'259−0.5 (A'236+A '282)

Y la absorbancia de la muestra como: Amuestra=A259−0.5 ( A236+A282 ) Después:

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mg Nicotina=( AmuestraA std )×2.5

RESULTADOS

El espectro fundamental de cada uno de los extractos de nicotina presentó fuerte absorción entre 250 y 265 nm. Un Espectro representativo se muestra en la figura2

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CURVA DE CALIBRADO:

La curva de calibrado se obtuvo con diez diferentes concentraciones de estándar y cada una con diez repeticiones. La gráfica se muestra en la figura 3.

PRECISIÓN:

Los valores de absorbancia corregida promedio y de concentración, con sus respectivas desviaciones estándar y %RSD al igual que % de nicotina según el método propuesto por la A.O.A.C. y los obtenidos utilizando la técnica de espectrofotometría, muestran una concordancia aceptable. Los datos se observan en las tablas 2, 3 y 4.

Tabla 2

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Tabla 3

Tabla 4

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CULTIVOS CEROSOS

REACTIVOS:

A) Ácido clorhídrico diluido : (Aproximadamente 0.05N) Diluir 4.1mL de ácido clorhídrico a 1L.

B) Solución estándar de nicotina:

(1)Solución Stock: 1mg/mL. Diluir 100mg de nicotina (Eastman Kodak Co. No. 1242, o equivalente) a 100mL aproximadamente en un matraz a volumen con HCl 0.05N.

(2)Solución de trabajo: 0.01mg/mL. Pipetear 1mL de solución stock y diluir a 100mL aproximadamente en un matraz a volumen con HCl 0.05N.

C) Solución de extracción: Diluir 20mL de NH4OH a 2L en un matraz a volumen. Preparar en el momento de uso.

PREPARACION DE LA MUESTRA:

1. Pesar 2 a 2.5kg de manzanas en una jarra limpia y seca (3 a 5 galones; 11 a 20L). 2. Añadir 1L de solución de extracción, revolverlas por 10 minutos

aproximadamente.3. Drenar cuidadosamente en un vaso de 1L.4. Filtrar a través de un papel filtro de 38.5cm en el matraz y proceder

inmediatamente con la determinación.

DETERMINACIÓN:

1. Colocar 400mL de la solución de filtrado en un separador de 500mL (1).2. Añadir 50mL de CHCl3, invertir el separador ida y vuelta suavemente por 2

minutos aproximadamente y dejar que las fases se separen. 3. Drenar la porción clara de la extracción y llevar a un separador de 250mL (2).4. Sacar la capa de CHCl3 (1) en un separador de 125mL (3) y luego agitar

vigorosamente. El separador debe estar seco.

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5. Dejar que las fases se separen (3) y drenar la porción clara en el separador de 250mL (2).

6. Añadir 35mL de CHCl3 al separador de 125mL (3), agitar gentilmente, y drenar en el separador de 500mL (1).

7. Extraer como anteriormente y combinar la extracción clara en el separador de 250mL (2).

8. Extraer con 35, 35, y 10mL de CHCl3, combinar las extracciones en el separador de 250mL (2).

9. Añadir un poco más de 1mL de HCl a los extractos hasta que el tornasol indique que el medio es ácido.

10. Extraer con 3 porciones de 15mL de HCl 0.05N aproximadamente, combinar los extractos ácidos en un separador de 125mL (4).

11. Lavar el separador de 250mL (2) con 10mL de HCl 0.05N aprox., después de dicha extracción, y agregar al separador de 125mL en donde se solía romper la emulsión (3).

12. Agitar, pero no tratar de romper ninguna emulsión en este separador. 13. Combinar todos los extractos ácidos en el separador de 125mL (3) y agitar con

15mL de éter de petróleo.14. Dejar reposar por 5 minutos aproximadamente y drenar la fase acuosa en otro

separador de 125mL (5).15. Lavar el éter de petróleo con 5mL de HCl 0.05N aproximadamente (no agitar

vigorosamente), y añadir el lavado al separador.16. Repetir el lavado con 15mL de éter de petróleo, y drenar la fase acuosa en un

matraz de 100mL. 17. Lavar el éter de petróleo como anteriormente, añadir el lavado al matraz, y dejar

reposar de 10 a 15min. 18. Diluir a volumen con HCl 0.05N aproximadamente y determinar las absorbancias

a 236, 259 y 282nm, con HCl 0.05N aproximadamente como referencia.19. Confirmar la presencia de nicotina leyendo en intervalos cada 2nm y plotear la

curva de absorción, usando el espectrofotómetro.20. Determinar la absorbancia se la solución estándar de nicotina, con HCl 0.05N

aproximadamente como referencia.

CALCULOS:

Tomar la absorbancia de la solución estándar como: A std=A

'259−0.5 (A'236+A '282)

Y la absorbancia de la muestra como: Amuestra=A259−0.5 ( A236+A282 ) Después:

mg Nicotina=( AmuestraA std )×2.5GRÁFICA

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