ELECTROFORESIS

Electroforesis: migración de

una partícula cargada

sometida a un campo

eléctrico

-

+

Cátodo

Ánodo

+ -

ELECTROFORESIS

qVelocidad = E

f

E: gradiente de potencial. E=V/d

q: carga eléctrica de la partícula (depende de pH)

f: coeficiente de fricción tamañoforma

-

+

Cátodo

Ánodo

+ -

Criterios de separación electroforética

q (carga)Velocidad = E

f (tamaño, forma)

1. Separación por tamaño

2. Separación por carga

3. Separación por tamaño y carga

-

+

Cátodo

Ánodo

+ -

ELECTROFORESIS

q (carga)Velocidad = E

f (tamaño, forma)

1. Muestra

2. Tampón: mantenimiento de pH y conductividad

3. Soporte

4. Equipo electroforético:• Fuente de alimentación• Cubeta de electoforesis

-

+

Cátodo

Ánodo

+ -

SOPORTES ELECTROFORÉTICOS

1. Electroforesis libre (Arne Tiselius, 1937)

En solución. Difusión, convección.

2. Electroforesis de zona

• Soportes no restrictivos• Papel, acetato de celulosa• Almidón, agar, agarosa

• Soportes restrictivos• Agarosa (ácidos nucleicos)• Poliacrilamida

-

+

Cátodo

Ánodo

+ -

EQUIPOS ELECTROFORÉTICOS

--

++

CátodoCátodo

ÁnodoÁnodo

++ --

Carga eléctrica de la biomoléculas

1. Ácidos nucleicos

2. Proteínas

8

Lehninger. Principios de Bioquímica

Enlace fosfodiéster

Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa

RNADNA genómicoDNA viral

Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa

Lab-on-a-Chip: electroforesis miniaturizada y automatizada

ELECTROFORESIS MICROCAPILAR(Bioanalyzer(R))

ELECTROFORESIS MICROCAPILAR(Bioanalyzer(R))

RNADNA genómicoDNA viral

Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa

Criterios de separación electroforética

q (carga)Velocidad = E

f (tamaño, forma)

1. Separación por tamaño

2. Separación por carga

3. Separación por tamaño y carga

-

+

Cátodo

Ánodo

+ -

1. DNA hebra doble: condiciones no desnaturalizantes• Tampón: Tris/Borato/EDTA (TBE) o Tris/Acetato/EDTA (TAE)

• Muestra: TBE o TAE, Glicerol, Azul de bromofenol

2. RNA, DNA hebra simple: condiciones desnaturalizantes• Tampón: MOPS + formaldehído

• Muestra: Formamida, Azul de bromofenol

Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa

Se aisló el DNA circular del virus SV40 y se analizó por electroforesis en gel de agarosa. El resultado se muestra en la calle 1.

a) ¿Por qué se separa el DNA en una electroforesis en gel de agarosa? ¿En qué se diferencia el DNA de cada banda?

b) A continuación se incubó el DNA con topoisomerasa I durante 5 min y se analizó por electroforesis (calle 2). ¿A que tipos de DNA corresponde cada banda?

c) Otra muestra se incubó durante 30 min con topoisomerasa I. ¿Qué significa el hecho de encontrar más DNA de las formas de movilidad reducida?

Topología del DNA

Electroforesis de DNA en geles de agarosa

SSCP: single-strand conformation polymorphism

ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE

(PFGE): separación de moléculas de DNA de gran tamaño

pulsed field gel electrophoresis

• FIGE: field inversion gel electrophoresis

• TAFE: transverse alternating field electrophoresis

• RGE: rotating gel electrophoresis

• CHEF: Contour-clamped homogeneous electric field

Rotating gel electrophoresis (RGE) separation of 3000 to 6000 kb DNA

Schizosaccharomyces pombe chromosomes. Run conditions: 50 V, 1.4 V/cm, 100 hrs, 100 angle, concatamated

multiple runs: 2500 sec./50hrs, 3000 sec./50hrs, 0.5X TBE, 0.8% megarose

(Clontech), 10 C.

ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE

(PFGE)

Rotating gel electrophoresis (RGE) separation Saccharomyces cercevisiae

chromosomes (245-2190 kb). Run conditions: 180 V, 5.1 V/cm, 34 hrs., 120 angle, 60-120 sec. pulse ramp, 0.5X TBE,

1.2% GTG agarose, 10 C. Two combs were used on the same gel to load 32

samples, a maximum of 72 are possible

ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE

(PFGE)

gel Nitrocelulosa

Hibridación de ácidos nucleicos: Southern blot

Hibridación de ácidos nucleicos: Southern blot

Electroforesis DNA

Autoradiografía

1.Transferencia a nitrocelulosa o nylon

2. Hibridación con sonda específica radiactiva

3. Lavado y autoradiografía

Southern blot: RFLP Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de

Restricción

Electroforesis DNA genómico Autoradiografía

EcoRI

EcoRI

EcoRI

EcoRI

EcoRISONDA

(A)

(B)

(A)(B)

Hibridación de ácidos nucleicos: Northern blot

Electroforesis RNA

Autoradiografía

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS DEL SUERO EN ACETATO DE CELULOSA

Soporte no restictivo: Separación por carga

ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA EN ACETATO DE CELULOSA

Anemia falciforme:

Mutación en hemoglobina A

• Mutación GAG -> GTG

• Glu -> Val

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON SDS (SDS-

PAGE)

Soporte restrictivo: Separación por tamaño

Gel de empaquetamiento (3% PA)

Gel de separación (8-20% PA)

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON SDS (SDS-

PAGE)• Concentración de poliacrilamida

• Homogénea

• Gradiente

• Tampón de muestra

• Reductor (2-mercaptoetanol)

• No reductor

• Detección de las proteínas separadas

• Tinción (Azul Coomassie, sales de plata)

• Fluorescencia

• Inmunodetección

ISOELECTROENFOQUE

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

ELECTROFORESIS CAPILAR

Electroforesis capilar de alta resolución (HPCE)

• Soporte: capilar 7-100 cm, 20-200 micras de diámetro

• Voltaje: >500 V/cm

• Automatizada, gran resolución

• Detector: Espectrofotómdetro, fluorímetro, espectrómetro de masas …

ELECTROFORESIS CAPILAR• CZE: de zona. Medio líquido, homogéneo,

capilares con carga uniforme

• CGE: en gel. Poliacrilamida, PA lineal, metilcelulosa.

• CIEF: Isoelectroenfoque capilar.

• Isotachophoresis (ITP).

• Electrokinetic Chromatography (EKC).

• Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MECC OR MEKC.

• Micro Emulsion Electrokinetic Chromatography (MEEKC).

• Non-Aqueous Capillary Electrophoresis (NACE).

• Capillary Electrochromatography (CEC.

39

Secuenciación de DNAMétodo de Sanger automatizado

Molde: 3´--G A A T T C G C T A A T G C ---5´Oligo: 5´--C T T A A

- DNA polimerasa- Nucleótidos

dATP, dCTP, dGTP, dTTP-Terminadores fluorescentes

ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP

5´--C T T A A G C G A T T A C G -3´5´--C T T A A G C G A T T A C -3´

5´--C T T A A G C G A T T A -3´

5´--C T T A A G C G A T T -3´

5´--C T T A A G C G A T -3´

5´--C T T A A G C G A -3´

5´--C T T A A G C G -3´

5´--C T T A A G C -3´

5´--C T T A A G -3´

Detector de fluorescencialáser

Separación de los

fragmentos de DNA

marcados, mediante

electroforesis

capilar

-

+

G C G A T T A C G . . .

¿A qué fuerza centrífuga relativa equivalen, en un rotor de 10 cm de radio, las siguientes velocidades de giro?

•1.000 rpm•10.000 rpm•30.000 rpm

•100.000 rpm

CENTRIFUGACIÓN, CÁLCULO DE FUERZA CENTRÍGA RELATIVA