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INSTITUTO DE AGROQUÍMICA Y TECNOLOGÍA
DE ALIMENTOS (IATA)
DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS BIOQUÍMICOS PARA EL
CONTROL DE CALIDAD EN LA ELABORACIÓN DE JAMÓN
COCIDO Y JAMÓN CURADO
TESIS DOCTORAL
Presentada por:Leticia Mora Soler
Dirigida por:Prof. Dr. Fidel Toldrá Vilardell
Dr. Miguel Ángel Sentandreu Vicente
Valencia, febrero de 2010
INSTITUTO DE AGROQUÍMICA YTECNOLOGÍA DE ALIMENTOS ( IATA )
D. Fidel Toldrá Vilardell, Profesor de Investigación del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) en el Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA), y D. Miguel Ángel Sentandreu Vicente, Científico Titular en el mismo Instituto, hacen constar:
Que la memoria titulada “Determinación de compuestos bioquímicos para el control de calidad en la elaboración de jamón cocido y jamón curado” presentada por Dña. Leticia Mora Soler para optar al grado de Doctor por la Universidad Politécnica de Valencia, ha sido realizada bajo su dirección y supervisión, reuniendo las condiciones necesarias para ser defendida por su autora.
Valencia, febrero 2010
Fdo. Fidel Toldrá Vilardell Fdo. Miguel Ángel Sentandreu Vicente
Resumen Durante la última década se ha puesto de manifiesto la importancia de desarrollar
nuevos métodos rápidos de análisis con el fin de controlar el proceso de elaboración
de los productos cárnicos de una forma segura y eficiente. Debido a este interés,
parte de esta Tesis Doctoral se ha centrado en el desarrollo y la aplicación de nuevos
métodos no destructivos y rápidos para controlar el proceso de producción, tanto del
jamón cocido como del tradicional jamón curado. La participación de compuestos
como la creatina y creatinina en el conjunto de las reacciones químicas y enzimáticas
que tienen lugar en el músculo postmortem los convierten en buenos marcadores
para conocer el tiempo de curado y/o cocción de productos cárnicos. En la presente
Tesis Doctoral se ha desarrollado un nuevo método de análisis por HPLC sencillo y
fiable basado en la cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) para la
determinación simultánea de creatina y creatinina, así como de los dipéptidos
carnosina, anserina y balenina, siendo una alternativa muy interesante a los métodos
ya existentes para el análisis de este tipo de compuestos. Dado que la conversión de
creatina en creatinina se ve influenciada por la temperatura, el tiempo, y por los
cambios de pH, se ha empleado la ratio creatinina/creatina como índice para
determinar el alcance del tratamiento térmico aplicado durante el procesado de
jamón cocido, y también como valor para estimar el tiempo mínimo de curado del
jamón.
Además de los cambios en compuestos relacionados con el metabolismo energético
del músculo, durante el proceso de curado de jamón tienen lugar una serie de
reacciones bioquímicas entre las que destaca la intensa proteólisis de las proteínas
musculares. A pesar de tener la evidencia de la presencia de oligopéptidos al final del
proceso de curado, se sabe muy poco acerca de la secuencia específica de los
mismos. A este respecto, en esta Tesis Doctoral se presenta por primera vez la
identificación de fragmentos peptídicos generados a partir de la hidrólisis de
proteínas miofibrilares como la cadena ligera de miosina I, la titina, y la troponina T, y
sarcoplásmicas como la creatina quinasa, para lo cual se ha recurrido al uso de
modernas técnicas de proteómica basadas en la espectrometría de masas.
Resum Al llarg de l'última dècada s'ha posat de manifest la importància de desenvolupar
nous mètodes ràpids d'anàlisi amb la finalitat de controlar el procés d'elaboració dels
productes càrnics d'una forma segura i eficient. A conseqüència d’aquest interès, part
d'aquesta Tesi Doctoral s'ha centrat al desenvolupament i l'aplicació de nous
mètodes no destructius i ràpids per controlar el procés de producció, tant del pernil
cuit com del tradicional pernil curat. La participació de compostos com la creatina i
creatinina al conjunt de les reaccions químiques i enzimàtiques que tenen lloc al
múscul postmortem els converteixen en bons marcadors per a conèixer el temps de
curat i/o cocció dels productes càrnics. En la present Tesi Doctoral s'ha desenvolupat
un nou mètode d'anàlisi per HPLC senzill i fiable basat en la cromatografía
d'interacció hidrofílica (HILIC) per a la determinació simultània de creatina i
creatinina, així com dels dipèptids carnosina, anserina i balenina, sent una alternativa
molt interessant als mètodes ja existents per a l'anàlisi d'aquest tipus de compostos.
Atès que la conversió de creatina en creatinina es veu influenciada per la
temperatura, el temps, i per els canvis del pH, un dels objectius d'aquest treball ha
estat emprar la ràtio creatinina/creatina com a índex per determinar l'abast del
tractament tèrmic aplicat durant el processat de pernil cuit, i també com a valor per
estimar el temps mínim de curat en pernils.
A més dels canvis que ocorren als compostos relacionats amb el metabolisme
energètic muscular, durant el procés de curat tenen lloc una sèrie de reaccions
bioquímiques entre les quals destaca la intensa proteolisis de les fibres musculars.
En relació a aquesta temàtica cal ressaltar que a pesar de ser evident la presència
d’oligopèptids al final del procés de curat, es sap molt poc de la seqüència específica
d'aquests pèptids. En aquesta Tesi Doctoral es presenta per primera vegada la
identificació de fragments peptídics generats a partir de la hidròlisi de les proteïnes
miofibrilars i sarcoplàsmiques com la cadena lleugera de miosina I, la titina, la
creatina quinasa i la troponina T. Per tal de dur a terme aquest objectiu s'han utilitzat
modernes tècniques de proteòmica basades a l’espectrometría de masses.
Abstract
During the last decade it has been shown the importance of developing new rapid
methods of analysis with the aim to control the elaboration process of meat products
in a safety and efficient way. Due to this interest, part of this Thesis has been focused
on the development and the application of new and fast nondestructive methods to
control the processing of both cooked and dry-cured ham. The role of creatine and
creatinine in the chemical and enzymatic reactions that take place during the
postmortem period of skeletal muscle makes these compounds to be potential good
markers in the cooked and dry-cured ham processes. In the present Thesis, a new,
simple and reliable HPLC method based on hydrophilic interaction chromatography
(HILIC) has been developed for the simultaneous determination of creatine and
creatinine, together with the dipeptides carnosine, anserine and balenine. This
method constitutes an interesting alternative to methods currently in use for the
analysis of this type of compounds. Due to the fact that creatine conversion to
creatinine is influenced by temperature, time, and pH changes, one of the main
objectives of this work has been to use the creatinine/creatine ratio as an indicator to
assess the effectiveness of the heat treatment in cooked ham processes and the
minimum time of ripening of dry-cured hams.
In addition to the changes occurred in compounds related to muscle metabolism,
during the processing of dry-cured ham numerous physico-chemical and biochemical
reactions, such as the intense proteolisis of the muscular proteins, take place. In
relation to this, although there is evidence of the presence of oligopeptides at the end
of dry-curing, the identity of these peptides still remained elusive. The present Thesis
shows the identification for the first time of a large number of fragments generated
from the hydrolysis of myofibrilar proteins like myosin light chain I, titin, and troponin
T, and sarcoplasmic proteins like creatine kinase. Modern mass spectrometry-based
proteomic approaches have been carried out to reach this objective.
Usun Yoon: A mi me gustaría ser una intelectual prestigiosa como usted, ¿me podría dar un consejo?
José Saramago: ¿Intelectual en qué área?, ¿en qué territorio?, ¿quieres ser qué?,…
Usun Yoon: Un poco de todo, en general.
José Saramago: Lo primero es aprender, aprender mucho… pero el consejo que yo daría tiene dos partes: la primera parte es no tener prisa, y la segunda es no perder tiempo.
Entrevista de la presentadora Usun Yoon al Premio Nobel de Literatura José Saramago en ‘EL INTERMEDIO’. Emisión del 2 de noviembre del 2009.
No puedo creer que ya hayan pasado cuatro años. Al final resultará cierto eso de que
el tiempo pasa cada vez más deprisa… Durante estos cuatro años en el IATA puedo
decir que he conseguido tres de las cosas más valorables en cualquier trabajo:
aprender, emocionarme, y disfrutar. Por ello me gustaría agradecer a todas las
personas que han compartido conmigo este tiempo su contribución a que el balance
haya sido, finalmente, tan positivo:
Al Dr. Fidel Toldrá y al Dr. Miguel Ángel Sentandreu por todo el esfuerzo y tiempo
dedicado. Gracias por la ayuda y apoyo que siempre me habéis dado.
Al Ministerio de Educación del Gobierno de España, por la beca FPU que ha hecho
posible mi formación predoctoral, a los proyectos AGL-2004-05064-C02-01 y AGL-
2007-65379-C02-01 del Ministerio de Ciencia e Innovación, así como al proyecto
Agroalimed de la Consellería de Agricultura, Pesca, y Alimentación.
A los Drs. Marga Aristoy, Mónica Flores, y Jose Luís Navarro por estar ahí, siempre
dispuestos a echar una mano.
Al personal técnico del Laboratorio de Carnes, Mª Pilar, Mª Angeles, y Maribel, y a
todos los estudiantes de prácticas o proyectos fin de carrera, por su ayuda y buena
relación durante estos años.
A mis compañeras y amigas Aleida, Eli, Alicia, Susana, Mónica, Aurora, Liliana,
Milagro, y Natalia, por todo lo que he compartido con vosotras y espero continuar
compartiendo.
A los Drs. Peter Bramley y Paul Fraser, por permitirme realizar mis estancias en su
laboratorio de la Royal Holloway University of London (RHUL). Gracias por confiar en
mí.
A Chris Gerrish y a todos mis compañeros, tanto de dentro como de fuera del
laboratorio de la RHUL, por haberme acogido y tratado tan bien durante los ocho
meses que compartimos.
A la Dra. Luz Valero, del Centro de Investigación Príncipe Felipe, por sus valiosos
consejos, y por estar siempre dispuesta a ayudar y colaborar.
A mi familia, mis padres y mi hermana, por enseñarme a valorar lo que es realmente
importante en la vida.
A mis amigos María, David, Sonso, Pablo, Paula, Nacho, Alicia, y Alberto, no solo por
los momentos que hemos vivido, sino por escucharme, comprenderme, y estar
siempre a mi lado.
A Lorena, Álvaro, María, Mari Carmen, Laurita, Juanan, y Quique, por nuestras
quedadas que espero continúen por muchos años.
Y por último, y muy especialmente, a Pau, por su paciencia, cariño, y apoyo en esta
última parte del recorrido. Mil gracias por este año que por poco no cabe en un libro,
y por darme ese amor mochilero que tanto me gusta.
Por todo esto, muchas gracias a todos.
Leticia
ÍNDICE I. Introducción……………………………………………………………..………
1. La carne de cerdo y sus principales productos……………………..………..
1.1. Relevancia socio- económica: Producción y consumo…...……………
1.2. Jamón curado.......................................................................................
1.2.1. Tipos de productos………………………………………………….
1.2.2. Importancia del proceso de elaboración…………….……………
1.2.3. Características de calidad………………………………………….
1.2.3.1. Color…………………………………………………………
1.2.3.2. Textura………………………………………………………
1.2.3.3. Aroma y sabor………………………………………………
1.3. Jamón cocido……………………………………………………………….
1.3.1. Tipos de productos………………………………………………….
1.3.2. Importancia del proceso de elaboración………………………….
1.3.3. Características de calidad………………………………………….
1.3.3.1. Color…………………………………………………………
1.3.3.2. Textura………………………………………………………
1.3.3.3. Aroma y sabor…………………………………………..….
1.4. Principales cambios bioquímicos en los procesos de elaboración del
jamón……………………………………………………………………………..
1.4.1. Proteolisis……………………………………………………………
1.4.1.1. Principales enzimas implicadas………………..…………
1.4.1.2. Proteolisis en la carne de cerdo……………………..……
1.4.1.3. Proteolisis en jamón curado y jamón cocido…..………..
1.4.2. Lipólisis……………………….………………………………………
1.4.3. Glucólisis………………………………………….………………….
1.4.4. Transformación de nucleótidos…………………………...............
1.4.5. Otros cambios debidos a reacciones químicas………………….
3
3
3
6
6
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32
1.4.5.1. Degradación y oxidación de lípidos………………………
1.4.5.2. Reacciones de Maillard……………………………………
1.4.5.3. Reacciones de Strecker……………………………………
2. Compuestos bioquímicos marcadores de calidad en carne y productos
cárnicos…………………………………………………...…………………………
2.1. Nucleótidos y nucleósidos………………………………...………………
2.2. Creatina y creatinina…………………………………………….…………
2.2.1. Participación de la creatina en el metabolismo energético
muscular……………………………………………………………..………
2.2.2. Generación de creatinina por tratamientos de calor………….…
2.3. Dipéptidos naturales de la carne…………………………………………
2.4. Péptidos generados durante la proteolisis e influencia en el aroma y
sabor……………………………………………………………………………...
3. Métodos analíticos para la determinación de compuestos bioquímicos
marcadores de calidad en carne y productos cárnicos…………………..........
3.1. Compuestos derivados del metabolismo muscular………………….…
3.2. Péptidos en carne y productos cárnicos…………………………………
3.2.1. Extracción……………………………………………………………
3.2.2. Separación……………………………………………….................
3.2.2.1. Ultrafiltración…………………………………………..……
3.2.2.2. Cromatografía de exclusión molecular…………………..
3.2.2.3. Electroforesis en gel………………………………………..
3.2.2.4. Electroforesis capilar……………………………………….
3.2.2.5. Cromatografía de fase reversa……………………………
3.2.2.6. Cromatografía de intercambio iónico…………………….
3.2.2.7. Cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC)………..
3.2.3. Identificación y secuenciación……………………………………..
3.2.3.1. Secuenciación por degradación de Edman……………..
3.2.3.2. Identificación por espectrometría de masas…………….
3.2.3.2.1. Espectrometría de masas MALDI-TOF………
32
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3.2.3.2.2. Espectrometría de masas MALDI- TOF/TOF..
3.2.3.2.3. Cromatografía líquida acoplada a
espectrometría de masas………………………………….
4. Bibliografía……………………………………………………………………….
II. Objetivos………………………………………………………………………… III. Resultados……………………………………………………………………... Parte 1.- Determinación de creatina y creatinina como marcadores de
calidad de los procesos de elaboración de jamón cocido y curado…………..
Capítulo 1.- Determinación por cromatografía hidrofílica de carnosina,
anserina, balenina, creatina y creatinina……………………………………
Capítulo 2.- Contenido en creatina, creatinina y carnosina en músculos
de cerdo de distinto tipo metabólico……...…………………………………...
Capítulo 3.- Efecto de las condiciones de cocción sobre la formación de
creatinina en jamón cocido…………………………...……………………......
Capítulo 4.- Evolución de creatina y creatinina durante el procesado de
jamón curado……………………………………………………………..……...
Parte 2.- Identificación de los péptidos generados durante el curado del
jamón……………………………........................................................................
Capítulo 5.- Péptidos pequeños generados de forma natural a partir de
proteínas miofibrilares en jamón Serrano………………………………….…
Capítulo 6.- Oligopéptidos derivados de la degradación de la creatina
quinasa en jamón curado……………………………………………………….
Capítulo 7.- Identificación de péptidos pequeños derivados de la
troponina T en jamón curado……………………….………………………….
IV. Discusión general…………………………………………………………….. V. Conclusiones…………………………………………………………………...
59
61
68
89
93
93
101
121
139
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177
183
205
229
251
263
I. Introducción
Introducción
3
I. Introducción 1. La carne de cerdo y sus principales productos 1.1. Relevancia socio-económica: producción y consumo
La carne y los productos cárnicos constituyen uno de los sectores con mayor
participación en el patrón alimentario de los españoles. La industria cárnica, el cuarto
sector industrial en España, alcanzó en el año 2008 una cifra de negocio de 18830
millones de euros, lo cual equivale a un 21% de todo el sector alimentario. Esta cifra
supone prácticamente el 2% del producto interior bruto (PIB) total español y el 14%
del PIB de la rama industrial (Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino,
MAMR, 2009).
En cuanto al consumo de carne, en 1987 se consumían en torno a 67 kg de carne
por persona, mientras que en 2008 el consumo rondaba los 64 kg (Ministerio de
Medio Ambiente y Medio Rural y Marino, MAMR, 2009). A este respecto, el consumo
de carne de cerdo es el que ha experimentado un mayor incremento en la última
década, mientras que el consumo de pollo se ha reducido durante este periodo. La
Figura 1 muestra la importancia de los distintos tipos de carne, incluyendo las carnes
frescas, congeladas y los elaborados cárnicos.
% Valor (Euros)
19%
16%
8%21%7%
6%
23%
% Volumen (kg)
26%
5%22%
9%
2%
22% 14%
Total vacunoPolloOvino y caprinoCerdoOtras carnes frescasTotal carnes congeladasElaborados cárnicos
% Valor (Euros)
19%
16%
8%21%7%
6%
23%
% Volumen (kg)
26%
5%22%
9%
2%
22% 14%
Total vacunoPolloOvino y caprinoCerdoOtras carnes frescasTotal carnes congeladasElaborados cárnicos
Figura 1. Importancia de la carne fresca, congelada, y de los elaborados cárnicos en el año 2008. Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino. Gobierno de España, 2009.
Por lo que respecta a la Unión Europea (UE), se producen 22,8 millones de
toneladas de carne de porcino al año, siendo el tercer productor de todo el mundo,
por detrás de China y Rusia. Los principales países productores en 2007 fueron:
Introducción
4
Alemania (16,9% de la producción), España (16,3%), Polonia (11%), Francia (9,4%) y
Dinamarca (8,2%). Durante 2008, los precios de la carne de cerdo reflejaron de
forma visible los altos precios de producción debido al aumento en el precio del
pienso; sin embargo, en otoño del 2008 se produjo una notable bajada del precio
influenciada por el impacto de la “crisis económica y financiera” sobre la demanda.
La población de la UE consume cada año unos 35 millones de toneladas de los
diversos tipos de carne, lo que supone una media de aproximadamente 92 kg per
cápita al año. De ellos, la carne de porcino aporta 44 kg, la de vacuno 20 kg y la de
aves de corral 23 kg per cápita (Comisión Europea, Desarrollo Rural y Agricultura,
2009).
El consumo de carne de porcino y de aves de corral se benefició en cierta manera de
la caída en la demanda de carne de vacuno debida a la encefalopatía espongiforme
bovina (EEB) a partir de 1996, pero también ha presentado un incremento continuo
debido a su mayor competitividad con respecto a otras carnes, en parte como
resultado de las reformas de la política agrícola común (PAC), que redujeron en esos
años el precio de los cereales utilizados en los piensos.
Dentro del sector cárnico español, la producción y elaboración de productos curados
ocupa una gran parte de la actividad empresarial, estando especialmente ligada a
aquellas áreas donde cuenta con una gran tradición, que en muchos casos ha dado
lugar a una Denominación de Origen Protegida (DOP) o una Indicación Geográfica
Protegida (IGP). La DOP Guijuelo es la marca de calidad de jamón que tiene unas
mayores cifras de producción y comercialización dentro de los de Ibérico y que,
además, lleva a cabo una amplia campaña de promoción de su producto. Esta marca
de calidad destina el 90% de su producción al mercado nacional, el 7% a países de
la Unión Europea, y el 3% restante a otros mercados (ver Figura 2).
En general, desde el año 2000, la producción de piezas curadas en España ha
estado en constante crecimiento, estancándose en los últimos años. Este crecimiento
fue posible debido al fomento en las exportaciones, cristalizado en la apertura de
nuevos mercados como el de Estados Unidos en 2005, que animaron al sector
productor ante la esperanza de poder llegar con sus productos a nuevos
consumidores. Lamentablemente, con el paso de los años se ha visto que el impulso
Introducción
5
inicial no se ha correspondido con la rápida apertura de estos nuevos mercados.
Finalmente, cabe destacar que cerca del 88% de la producción de jamones en
España está ligada a la producción de jamones y paletas de cerdo blanco, aunque
poco a poco van siendo más las piezas que se producen de jamón Ibérico.
40,48
36,06
26,28
15,28
8,38
2,97
D.O.P. Guijuelo
D.O.P. Jamón de Teruel
D.O.P. Dehesa de Extremadura
I.G.P. Jamón de Trévelez
D.O.P. Jamón de Huelva
D.O.P. Los Pedroches
Figura 2. Valor económico de las marcas de calidad de jamones en 2007 (millones de euros). Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino.
El consumo de elaborados cárnicos, como el jamón curado o cocido, se ha visto
especialmente incrementado en España durante los últimos años debido a cambios
en la actitud de los consumidores, los cuales dan prioridad a factores como la
calidad, salud, e imagen. De hecho, el consumo de Ibéricos en 2008 alcanzó los 38
millones de kilos, siendo el consumo en el último trimestre del año el triple con
respecto a los meses precedentes. Como puede observarse en la Figura 3, cinco de
cada diez kilos consumidos de productos cárnicos Ibéricos corresponden a jamón
curado.
La carne lleva mucho tiempo formando parte importante de la dieta europea y
constituye una fuente de proteínas de alta calidad para satisfacer las necesidades de
los consumidores europeos. Además de las características nutricionales, las
apetecibles y únicas características de aroma y sabor especialmente en el caso de
los productos cárnicos curados o cocidos, constituyen un valor añadido importante
para su consumo. Tanto los péptidos y aminoácidos libres de la carne como aquellos
que se generan durante el procesado de los productos cárnicos, están directamente
relacionados con la generación del aroma y sabor de estos alimentos; sobre este
Introducción
6
tema se ha realizado una labor de investigación muy intensa durante las últimas
décadas (Toldrá, 2002; Sentandreu et al., 2003).
% Valor (Euros)
59%15%
13%
13%
% Volumen (kg)
51%
15%
11%
23%Jamón IbéricoPaleta IbéricaLomo emb. IbéricoChorizo Ibérico
Figura 3. Importancia de los productos Ibéricos en el año 2008. (Ministerio de Medio Ambiente y Medio Rural y Marino. Gobierno de España, 2009).
1.2. Jamón curado
1.2.1. Tipos de productos
Existen numerosas variedades de jamón curado, dependiendo de la genética, el tipo
de alimentación, las condiciones de la cría, el tipo de procesado, y la región o país de
origen. En el mundo se producen muchos tipos diferentes de jamón curado,
pudiéndolos agrupar en cuatro grandes regiones: el área mediterránea, el norte de
Europa, América y China.
Jamones curados del área mediterránea: Estos jamones se caracterizan
principalmente por periodos de curado muy largos y por la ausencia del ahumado y la
cocción en su proceso de elaboración. Es importante destacar cuatro
Denominaciones de Origen principales de jamón Ibérico: Dehesa de Extremadura,
Guijuelo, los Pedroches, y Jabugo. El Real Decreto 1469/2007, del 2 de noviembre
del 2007, por el que se aprueba la Norma de calidad para la carne, el jamón, la
paleta y la caña de lomo Ibéricos (BOE, 2007), establece tres designaciones
obligatorias: el tipo de producto, la designación racial (Ibérico puro e Ibérico), y el tipo
de alimentación (de bellota, de recebo, de cebo de campo, y de cebo, ver Tabla 1).
El jamón Serrano, por el contrario, se produce en toda España bajo control de la
Fundación Jamón Serrano, existiendo tres tipos principales dependiendo del tiempo
de curado: reserva, gran reserva, y bodega. También existe una Denominación de
Origen (Teruel) y una Especialidad Tradicional Garantizada (Trévelez) para el jamón
Introducción
7
blanco. En Francia destaca el jamón de Corsica y el de Bayonne, aunque su
producción es muy escasa. Los jamones de Parma se producen en el noroeste de
Italia, mientras que los San Danielle son característicos del noreste de Italia. En
ambos casos el tiempo de curado mínimo es de doce meses.
Tabla 1. Designaciones en relación al tipo de alimentación de los productos objeto de Real Decreto 1469/2007, del 2 de noviembre del 2007, por el que se aprueba la Norma de calidad para la carne, el jamón, la paleta y la caña de lomo Ibéricos (BOE, 2007).
Bellota Recebo Cebo de campo Cebo
AlimentaciónBellotas, hierba, y
recursos naturales de la dehesa
Mínimo peso en montanera y cebo
con pienso
Pienso y estancia mínima de 60 días en
campoPienso
Peso medioentrada montaneraEntrada montanera 01 - Oct. / 15 - Dic. 01 - Oct. / 15 - Dic. — —Reposición en Mínimo 46 kg Mínimo 29 kgmontanera Mínimo 60 días Mínimo 60 díasSacrificio 15 - Dic. / 15 - Abril 15 - Dic. / 15 - Mayo — —Edad sacrificio 14 meses 14 meses 12 meses 10 mesesPeso sacrificio
Carga ganadera 2 cerdos / hectárea 2 cerdos / hectárea 15 cerdos / hectárea —
117 kg peso medio108 kg peso mínimo individual
Tipo de alimentación
92 - 115 kg 92 - 115 kg 92 - 115 kg —
— —
Jamones del norte de Europa: Los tiempos de procesado de estos jamones son
mucho más cortos que los del área mediterránea, siendo ahumados y cocidos antes
de su consumo. Algunos ejemplos son el jamón Fenalâr y el Spekeskinke de
Noruega y los alemanes Westphalian y Katenschinken.
Jamones de América: Estos jamones pasan por un salado, postsalado durante un
mes, y ahumado en su proceso de elaboración. Normalmente se consumen tras
cocinarlos (fritos, en el horno, etc.). Los más conocidos, tipo Country-style, se
producen en Kentucky y Virginia.
Jamones de China: La producción de jamones en China ha aumentado
considerablemente en los últimos años. Buenos ejemplos son los jamones Yinghua,
tradicionales del distrito de Jinhua, una región muy montañosa; los jamones
Xuanwei, de la provincia de Yunnan, característica por su altitud; y los jamones
Rugao, de la provincia de Jiangsu.
Introducción
8
1.2.2. Importancia del proceso de elaboración
La elaboración de jamón curado ha constituido desde tiempos inmemoriales una
forma de conservación de los jamones mediante el salado y posterior secado.
Actualmente, se busca obtener un producto con un alto valor añadido, seguro, sin
defectos y apreciado por sus características sensoriales típicas. El producto que se
obtiene al final del proceso viene condicionado por la materia prima utilizada y por el
proceso tecnológico aplicado. Existen distintas tecnologías de fabricación de jamón
curado pero básicamente todas ellas pretenden, por una parte, estabilizar el producto
para que pueda mantenerse a temperatura ambiente sin peligro para la salud ni
riesgo de alteración y, por otra, facilitar el desarrollo de sus características
sensoriales.
El proceso de elaboración del jamón curado se resume en la Figura 4. El efecto de la
materia prima sobre la calidad del producto final es muy importante, influyendo
factores como la edad de los cerdos en el momento del sacrificio, el pH, la cantidad
de grasa, y el peso del jamón. La edad de los cerdos puede afectar a la actividad
enzimática, al color, a la cantidad de grasa, y a la resistencia de los músculos a las
tensiones del secado (Whipple y Koohmaraie, 1992; Huff-Lonergan et al., 1995). El
pH de la carne constituye otro parámetro importante que afecta a la maduración del
jamón (Watanabe y Devine, 1996; Beltrán et al., 1997), recomendándose evitar
aquellos jamones con pH > 6,2 por razones de seguridad microbiológica, con el fin
de mejorar la salazón y evitar problemas de aspecto y de textura blanda. La
eliminación de la sangre residual de las venas y arterias es recomendable para
disminuir posibles problemas microbiológicos y de aspecto al corte. Así pues, para
facilitar la penetración de las sales de curado y eliminar los residuos de sangre
todavía presente en venas y arterias se efectúa un masaje con una mezcla que suele
contener sal, nitrato y nitrito. La sal contribuye a la disminución de la actividad de
agua, a la solubilización parcial de las proteínas miofibrilares, y al sabor
característico de este tipo de productos. El nitrato está presente a niveles muy bajos
de forma natural en carne y ha sido un agente nitrificante muy utilizado en productos
de larga maduración, ya que se va transformando en nitrito por acción bacteriana. El
Introducción
9
nitrito actúa como agente conservante y contribuye a la formación y estabilización del
característico color rojo del jamón gracias a la formación de la nitrosomioglobina.
Figura 4. Diagrama de flujo de la elaboración del jamón curado con las condiciones
ambientales óptimas de cada etapa del proceso.
El recubrimiento con sal debe realizarse tan pronto como la temperatura alcance un
valor entre 1 y 3 ºC, ya que con ello se logra inhibir el crecimiento de bacterias
indeseables. En los países mediterráneos se utiliza el salado por vía seca, mientras
que en el norte de Europa es común también el salado en salmuera. El salado por
vía seca se puede realizar utilizando dos metodologías distintas: salando los jamones
por recubrimiento de sal, lo que se hace durante un tiempo aproximado de 1,1 día/kg
para los jamones refrigerados y de algunos días menos para los congelados, y el
salado mediante una cantidad de sal proporcional al peso de jamón, donde
permanece horizontalmente durante un periodo de 3 - 4 semanas, favoreciéndose la
penetración de la sal y la salida de agua del interior.
La finalidad de la etapa de postsalado es conseguir un reparto homogéneo de la sal
por todo el jamón al tiempo que se logra una ligera deshidratación. Para obtener un
secado regular, la cantidad de agua que se evapora debe estar compensada por la
difusión de agua del interior al exterior del jamón. Las condiciones óptimas de
Introducción
10
temperatura y humedad para cada etapa se encuentran descritas en la Figura 4.
Durante el proceso de elaboración del jamón curado, las etapas de secado y
maduración tienen gran importancia. En esta fase del proceso se intenta conseguir la
total estabilización del jamón mediante la exposición progresiva a temperaturas más
elevadas y humedades relativas más bajas. Durante esta etapa el jamón sigue
deshidratándose y, además, con la elevación de la temperatura se pretende
favorecer las reacciones de formación de compuestos responsables del sabor y
aroma típico del jamón como son la proteolisis e hidrólisis en general y la
autooxidación de lípidos, de las que se hablará más adelante.
1.2.3. Características de calidad
1.2.3.1. Color
El característico color rojo brillante del jamón curado es debido a la formación de
nitrosomioglobina, que se genera tras la reacción del óxido nítrico con la mioglobina.
La intensidad del color rojo aumenta tanto con la concentración de mioglobina, la
cual es mayor en músculos de metabolismo oxidativo (Aristoy y Toldrá, 1998), como
con la edad del animal (Rosell y Toldrá, 1996). Sin embargo, durante la última
década, numeroos estudios se han centrado en desvelar el mecanismo por el que los
jamones de Parma desarrollaban su característico color rojo sin haber añadido otra
cosa que sal (Parolari, 1996). El pigmento rojo Zn-protoporfirina IX parece ser el
responsable, ya que se trata del pigmento mayoritario encontrado en este tipo de
jamones y actúa reemplazando el hierro por zinc en la molécula de hemoglobina
(Parolari et al., 2009).
1.2.3.2. Textura
La textura en el jamón curado depende del grado de secado (la pérdida de humedad
que haya sufrido), el alcance de la proteolisis (grado de hidrólisis de las proteínas
miofibrilares), y del contenido en tejido conectivo (Tabilo et al., 1999). De hecho, se
ha observado que las principales proteínas estructurales (titina, nebulina o troponina
T) se degradan totalmente durante el curado, mientras que la cadena pesada de
miosina y la α-actinina son hidrolizadas en menor grado (Toldrá y Etherington, 1988;
Introducción
11
Monin et al., 1997). El contenido en grasa intramuscular también influye
positivamente en la textura y apariencia del jamón (Fernández et al., 2000).
1.2.3.3. Aroma y sabor
El sabor en el jamón curado se asocia principalmente con los compuestos no
volátiles como los aminoácidos libres y los péptidos pequeños que se acumulan al
final del proceso de curado, mientras que el aroma se asocia con la generación de
compuestos volátiles.
La hidrólisis de las proteínas y de los lípidos, conocida como proteolisis y lipólisis
respectivamente, representan dos de los más importantes fenómenos enzimáticos
que ocurren durante el curado, siendo responsables de la generación de compuestos
que influyen directamente sobre el sabor y aroma del producto final (Flores et al.,
1998a; Toldrá y Flores, 2007). La influencia de ambas reacciones sobre las
características finales del jamón curado se describe más adelante.
1.3. Jamón cocido
1.3.1. Tipos de productos
El jamón cocido se produce a partir del despiece total o parcial de los miembros
posteriores de los cerdos, separados de la semicanal en un punto no anterior al
externo del hueso de la cadera, excluyéndose expresamente la carne triturada o
picada, y con un tratamiento térmico suficiente para lograr la coagulación de las
proteínas cárnicas y asegurar que se mantenga inalterado en condiciones de
almacenamiento y conservación.
Se trata de uno de los pocos productos cárnicos que goza de Norma Específica de
Calidad, a pesar de lo cual existe en el mercado una gran diversidad de productos
con calidades y precios muy dispares.
Los jamones cocidos pueden ser clasificados en función de la carne utilizada para su
procesado, la composición de la salmuera (uso de fosfatos, almidones, o
carragenatos), el rendimiento tecnológico (desde el 85% al 110%), y su forma de
presentación (con hueso, sin hueso, a piezas, entero, etc.). Por otro lado, según la
Orden del 29 de junio de 1983, por la que se aprueban las Normas de calidad para el
Introducción
12
jamón cocido, los jamones cocidos pueden clasificarse en distintas categorías en
función de sus características de composición y de calidad: jamón cocido extra,
jamón cocido I, o fiambre de jamón II. La Tabla 2 muestra una comparativa entre la
categoría extra, primera y segunda en jamón cocido.
Tabla 2. Categorización comercial de los productos objeto de la Norma de calidad para jamón cocido y fiambre de jamón (BOE, 1983).
Categoría extra Categoría primera Categoría segundaParámetros analíticos Jamón cocido extra Jamón cocido I Fiambre de jamón II
Mínimo 14%(15% con proteína añadida)
Relación humedad/proteína 4.13 4.68 —Azúcares (expresados como glucosa)Proteínas añadidas Ausencia Ausencia máximo 1%Agar-agar, alginatos y carragenatos Máximo 0,2% Máximo 0,5% Según lista positiva de aditivosReacción del almidón Negativa Negativa Máximo 2,5%Fosfatos totales Máximo 7500 ppm Máximo 7500 ppm Máximo 7500 ppm
Máximo 1,5% Máximo 2% Máximo 3%
Tipo de producto
— —Proteína cárnica sobre la total
1.3.2. Importancia del proceso de elaboración
En los últimos cuarenta años la tecnología de producción del jamón cocido ha estado
sometida a numerosas investigaciones que han dado lugar a notables modificaciones
en los procesos de producción. Para conseguir productos de calidad se hace
necesario que las mejoras en las instalaciones y equipos vayan acompañadas de
una adecuación de los métodos de elaboración y control de calidad.
En la elaboración de jamón cocido, la adecuada elección de la materia prima es
fundamental para la obtención de un producto óptimo. En este sentido hay dos
factores a tener en cuenta: las características microbiológicas de la materia prima, y
la aptitud tecnológica de la carne para el tratamiento al que va a ser sometida. El
valor de pH resulta de esencial importancia en la evaluación de esta aptitud, ya que
este dato permite predecir la capacidad de retención de agua de la carne (CRA), de
la que dependerán las pérdidas por cocción y la jugosidad final del jamón. Así pues,
para la elaboración de productos cocidos sólo deben seleccionarse piezas con pH
entre 5,8 y 6,2. Los jamones con estos valores de pH cuentan con una buena CRA,
proporcionando una textura blanda y jugosa y un buen rendimiento en la fabricación.
Introducción
13
El diagrama de flujo del proceso de elaboración de jamón cocido se muestra en la
Figura 5. Durante el recorte, además de dar forma al jamón cocido, se corta el tejido
conjuntivo que se encuentra alrededor de los distintos músculos, facilitando la salida
al exterior de las proteínas con el fin de proporcionar una mejor adherencia de las
porciones. Los componentes de la salmuera que se van a introducir en las piezas de
jamón variarán en función del tipo de jamón que vayamos a realizar y del peso y las
características de éste (según la Norma de calidad para el jamón cocido, ver Tabla 2).
Figura 5. Diagrama de flujo de la elaboración de jamón cocido.
La sal, que puede ir acompañada de azúcares como la glucosa o sacarosa, es el
principal ingrediente de la salmuera, siendo la cantidad a añadir en torno al 2%. El
nitrito es añadido como principal agente conservante. La generación de óxido nítrico
a partir del nitrito, además de asegurar la conservación, contribuye a la formación del
típico color rosado de estos productos a través de la formación del
nitrosohemocromo (Chasco et al., 1996; Arneth, 1998). El ascorbato sódico puede
ser añadido con el fin de asegurar la desaparición rápida de los nitritos y así evitar la
Introducción
14
generación de nitrosaminas. Finalmente, también pueden añadirse fosfatos,
polifosfatos o pirofosfatos con el objetivo de aumentar la CRA, aunque las cantidades
de estos compuestos están reguladas y controladas. Los fosfatos aumentan el pH del
jamón y su fuerza iónica, aumentando también la capacidad captadora y fijadora de
agua, influenciando favorablemente en el rendimiento y jugosidad de las piezas (Sun,
2009). La salmuera puede ser inyectada en la pieza de carne mediante diversos
métodos (inmersión en salmuera, inyección, etc.), siendo el más empleado el de
inyección, que consiste en inyectar la salmuera directamente mediante un sistema de
agujas huecas. La etapa de malaxado/amasado permite aumentar la blandura,
jugosidad y cohesión del jamón cocido, así como el rendimiento del producto, ya que
tanto el amasado como el malaxado inducen la extracción de las proteínas solubles
en sales (actina y miosina), que coagulan durante el calentamiento e influyen
positivamente sobre la consistencia. En el proceso de elaboración de jamón cocido,
la etapa de cocción es fundamental y tiene como finalidad alcanzar cuatro grandes
objetivos (Toldrá et al., 2010):
- la coagulación de las proteínas, para lo que es necesaria una temperatura de
calentamiento en el centro del producto de al menos 72 ºC,
- la inactivación de enzimas, que tiene lugar generalmente entre 60 y 75 ºC,
- el desarrollo de las características organolépticas deseadas,
- la reducción del número de microorganismos.
Todo esto hace indispensable un adecuado control de calidad en esta fase del
proceso de manera que se pueda asegurar la calidad tanto sensorial como
microbiológica del producto. La importancia del desarrollo de métodos rápidos,
eficientes y no destructivos de control de calidad en las etapas clave del procesado
de jamones, tanto curados como cocidos, es trascendental para poder asegurar la
calidad final del producto.
1.3.3. Características de calidad
1.3.3.1. Color
Al igual que ocurre con el jamón curado, el jamón cocido destaca por tener un color
rosáceo como consecuencia de la adición de nitritos. El nitrito es reducido a óxido
Introducción
15
nítrico, el cual reacciona con la mioglobina formando nitrosomioglobina, que es la
que da el color rojizo. Este color cambia de rojo a rosa durante el proceso de
cocción, especialmente a temperaturas superiores a 65 ºC, debido a la formación de
nitrosohemocromo, que da una coloración rosa claro (Chasco et al., 1996; Arneth,
1998).
1.3.3.2. Textura
La textura de los jamones cocidos depende de factores como el contenido en
humedad, la presencia de tejido conectivo, el tratamiento térmico y el grado de
hidrólisis al que hayan llegado las proteínas miofibrilares. Por otro lado, algunos
factores del proceso como la etapa de enfriamiento, pueden afectar a la jugosidad, la
textura global, la aceptabilidad y el color (Desmond et al., 2000). Finalmente, también
se ha estudiado la influencia del genotipo del cerdo sobre la calidad final del jamón
cocido, obteniéndose jamones mucho más secos, duros y correosos a partir de
cerdos nn que los producidos a partir de cerdos NN o Nn (Fernández et al., 2002).
1.3.3.3. Aroma y sabor
El jamón cocido experimenta numerosos cambios bioquímicos durante su
elaboración como consecuencia de reacciones enzimáticas como la proteolisis y la
lipólisis aunque, en este tipo de productos, las enzimas responsables tienen un
tiempo de acción muy corto.
La elevada actividad de agua y el bajo contenido en sales del jamón cocido hace que
las condiciones sean muy favorables para la proteolisis, aunque también es cierto
que las enzimas musculares son sensibles a temperaturas mayores de 50 ºC, lo que
provoca su rápida inactivación durante la cocción (Toldrá et al., 1992a). La lipólisis
también se ve favorecida por las condiciones existentes en este producto antes de la
etapa de cocción, especialmente por la proximidad desu valor de pH a la neutralidad.
Un mayor tiempo de reposo permite una acción enzimática más prolongada,
liberándose una mayor cantidad de aminoácidos y ácidos grasos, los cuales actuarán
como sustratos de reacciones químicas como las reacciones de Strecker, de las que
se hablará más adelante en el apartado 1.4.5.3. Como ocurre en el caso de las
Introducción
16
peptidasas, las lipasas también se inactivan durante la etapa de cocción. Otras
reacciones químicas, como las reacciones de Maillard, más detalladas en el apartado
1.4.5.2., se ven aceleradas durante la cocción, y también contribuyen a la generación
de compuestos volátiles aromáticos. En este sentido, el alcance y las características
del aroma y sabor generados dependerán del tiempo y la intensidad del
calentamiento (Toldrá y Flores, 2007).
1.4. Principales cambios bioquímicos en los procesos de elaboración del jamón
Las principales reacciones bioquímicas que tienen lugar en el jamón durante su
procesado son fundamentalmente de tipo enzimático, destacando la hidrólisis de las
proteínas musculares (conocida como “proteolisis”), la hidrólisis de triglicéridos y
fosfolípidos (conocida como “lipólisis”), y, en menor medida, la hidrólisis de glúcidos
(“glucólisis”) y la transformación de nucleótidos. También tienen lugar reacciones
químicas como son las reacciones de Maillard, las degradaciones de Strecker o las
oxidaciones. Estos tipos de reacciones contribuyen al desarrollo del sabor y aroma
del producto final y ocurren de forma simultánea y con mayor o menor intensidad
dependiendo de las características del proceso (Flores et al., 1998b).
1.4.1. Proteolisis
1.4.1.1. Principales enzimas implicadas
La proteolisis es un proceso en el que están implicadas fundamentalmente las
propias enzimas musculares, afectando tanto a las proteínas sarcoplásmicas como
miofibrilares. El músculo esquelético contiene una gran variedad de enzimas que son
responsables de la mayoría de los cambios bioquímicos observados durante el
procesado de la carne y de los productos cárnicos. Algunas de las principales
enzimas musculares se asocian con la hidrólisis de las proteínas (endopeptidasas) y
con la generación de péptidos pequeños y aminoácidos libres (exopeptidasas)
(Toldrá y Aristoy, 2010).
Las enzimas proteolíticas más estudiadas en relación con la hidrólisis de proteínas
son la μ-calpaína (EC 3.4.22.52) y m-calpaína, (EC 3.4.22.53), las catepsinas B (EC
Introducción
17
3.4.22.1), H (EC 3.4.22.16), L (EC 3.4.22.15) y D (EC 3.4.23.5), el proteasoma (EC
3.4.99.46), y, más recientemente, las caspasas.
Las catepsinas B, H, y L son cisteín peptidasas, mientras que la catepsina D es una
aspartil peptidasa. Estas enzimas son de pequeño tamaño, en el intervalo de 20 a 40
kDa, de manera que una vez liberadas penetran fácilmente en la estructura
miofibrilar. Son activas a pH ácido (pH 3 – 5 para la catepsina D), ligeramente ácido
(alrededor de 6 para las catepsinas B y L), e incluso neutro (6.8 para la catepsina H)
a 30 – 40 ºC (Rico et al., 1991a y 1991b; Matsuishi et al., 2003; Godiksen et al.,
2009). La presencia de estas enzimas en el músculo esquelético se ha demostrado
mediante técnicas citoquímicas, inmunocitoquímicas, o por inmunofluorescencia
(Okitani et al., 1981; Okitani et al., 1988; Al-Jassabi, 2000; Matsuishi et al., 2003).
Las cisteín peptidasas necesitan un ambiente reductor para expresar su máximo de
actividad. La glicólisis anaeróbica en el músculo postmortem sería, por tanto, un
ambiente adecuado para la actividad de las catepsinas (O'Halloran et al., 1997).
Las calpaínas son un grupo de cisteín endopeptidasas que se encuentran en el
citosol y, muy especialmente, en la región del disco Z. La μ-calpaína y la m-calpaína
requieren 50 – 70 μM de Ca2+ y 1 – 5 mM de Ca2+ respectivamente para su
activación, y muestran su activiad máxima a pH neutro (alrededor de 7,5), mientras
que son inefectivas a pH 5,5 – 6,0 (Etherington, 1984). La existencia de calpastatina,
un inhibidor específico de estas enzimas, regula la actividad de las calpaínas en el
músculo postmortem. Comparado con otras especies, el músculo de cerdo es el que
presenta los niveles más bajos de calpastatina (Ouali y Talmant, 1990). Este
inhibidor se inactiva por autolisis a los pocos días tras el sacrificio (Koohmaraie et al.,
1987)
El proteasoma (EC 3.4.99.46) es un complejo enzimático de numerosas
subunidades, con una masa molecular en torno a los 700 kDa. Se trata de una
proteína muy abundante que puede llegar a representar hasta el 1% de la proteína
soluble en la célula (Rivett y Sweeney, 1991). Tiene un intervalo de pH óptimo entre
7 y 9, dependiendo de la reacción que catalice (Djaballah y Rivett, 1992). Su función
en el músculo está relacionada con la regulación del recambio de las proteínas
Introducción
18
musculares, aunque ciertos resultados indican que el proteasoma no degrada
miofibrillas intactas (Goll et al., 1991).
Las caspasas son un grupo de enzimas perteneciente al grupo de las cisteín-
peptidasas con una especificidad de sustrato limitada a la hidrólisis de aquellos
enlaces peptídicos que contienen un ácido aspártico en posición P1. La familia de las
caspasas está compuesta por catorce proteínas de las que once se han encontrado
en la especie humana. Esta familia de petidasas está involucrada en el desarrollo de
la apoptosis o muerte celular, y en la activación de citoquinas proinflamatorias
(Earnshaw et al., 1999). El interés por el estudio de este grupo de enzimas ha
surgido a partir de un nuevo modelo propuesto recientemente donde se postula la
acción de estas enzimas durante la proteolisis postmortem, contribuyendo su acción
enzimática al desarrollo de la ternura de la carne (Ouali et al., 2006).
Los péptidos resultantes de la acción de las endopeptidasas anteriormente descritas
son degradados posteriormente por la acción de las exopeptidasas, que hidrolizan
las cadenas peptídicas a partir de sus extremos. En la Tabla 3 se recogen las
principales exopeptidasas.
De entre los principales grupos de exopeptidasas se distinguen:
- Las peptidasas (EC 3.4.14), responsables de la generación de di y tripéptidos
según se trate de dipeptidilpeptidasas (DPP) o de tripeptidilpeptidasas (TPP),
respectivamente. En ambos casos actúan a partir del extremo amino terminal de
proteínas y polipéptidos, habiéndose descrito su acción durante el proceso de
curado del jamón. Las enzimas TPP I, DPP I y DPP II se encuentran localizadas
en el lisosoma y presentan su actividad óptima a pH ácidos (Sentandreu y
Toldrá, 2000 y 2001a). Las TPP II y DPP III se encuentran en el citosol (Smyth y
O'Cuinn, 1994; Sentandreu y Toldrá, 1998), y la DPP IV está unida a membrana
(Sentandreu y Toldrá, 2001b). Estas enzimas presentan un pH de actuación
óptimo cerca de la neutralidad y son muy estables, manteniendo su actividad
incluso tras 15 meses de procesado, con excepción de la DPP II cuya actividad
cesa después de los 8 meses (Sentandreu y Toldrá, 2001c).
- Las aminopeptidasas (EC 3.4.11) degradan la cadena peptídica a partir del
extremo amino terminal liberando un aminoácido. Las arginil (RAP), leucil (LAP),
Introducción
19
alanil (AAP), metionil (MAP) y piroglutamil (PGAP) aminopeptidasas se
encuentran en el citosol y actúan a pH neutros (RAP y AAP) o básicos (LAP y
PGAP), tal y como se muestra en la Tabla 4 (Toldrá et al., 1992b; Toldrá et al.,
1993a; Flores et al., 1996a; Flores et al., 1997a).
Tabla 3. Clasificación de las exopeptidasas en función de la reacción que catalizan. Las barras rojas indican el enlace peptídico susceptible de hidrólisis en cada caso. Los círculos azules indican los residuos que se liberan debido a la acción enzimática.
- Las carboxipeptidasas (EC 3.4.16-18) se encuentran localizadas en el lisosoma y
presentan su actividad óptima a pH ácidos (ver Tabla 4) (Bodwell y Meyer,
1981). Estas enzimas actúan a partir del extremo carboxi terminal, siendo
también responsables de la generación de aminoácidos libres, aunque han sido
menos estudiadas en carne y productos cárnicos.
- Otras enzimas comunes pero menos estudiadas en carne y productos cárnicos
son las peptidildipeptidasas (EC 3.4.15), que hidrolizan dipéptidos a partir del
extremo carboxi terminal de polipéptidos, las dipeptidasas (EC 3.4.13), que
actúan hidrolizando dipéptidos, y las tripeptidasas (EC 3.4.11), que lo hacen
sobre el extremo amino o carboxi terminal de tripéptidos (Toldrá et al., 1997).
Introducción
20
Tabla 4. Principales características de las amino y carboxipeptidasas en músculo de cerdo.
Enzima Número EC Clasificación pH Temperatura (ºC)Alanil aminopeptidasa 3.4.11.14 Cisteín/Metalo 6,5 37Arginil aminopeptidasa 3.4.11.6 Cisteín/Metalo 6,5 37Metionil aminopetidasa 3.4.11.18 Cisteín 7,5 40Leucil aminopeptidasa 3.4.11.1 Metalo 9,0 45Piroglutamil aminopeptidasa 3.4.19.3 Cisteín 8,5 37Carboxipeptidasa A 3.4.16.1 Serín 5,2 - 5,5 37Carboxipeptidasa B 3.4.18.1 Cisteín 5,0 37
1.4.1.2. Proteolisis en la carne de cerdo
Después del sacrificio, el músculo es objeto de numerosos cambios bioquímicos
debido, entre otras razones, a que los sistemas enzimáticos continúan siendo
activos. Estos cambios postmortem de las proteínas musculares se han estudiado
principalmente durante el periodo de maduración de la carne con el fin de mejorar su
calidad (Huff-Lonergan et al., 1995; Hwang et al., 2005; Koohmaraie y Geesink,
2006), ya que durante esta etapa las principales proteínas estructurales del músculo
como la titina, nebulina, actina, y miosina, sufren una importante degradación, dando
lugar a un aumento en la terneza de la carne (Lametsch et al., 2003). Este aumento
en la terneza es el resultado de la pérdida de tensión y la rotura de las miofibrillas
principalmente a nivel del disco Z (Taylor et al., 1995).
La maduración de la carne es un proceso muy variable que dependerá de factores
biológicos tales como la edad, el sexo, o el tipo de músculo, y de las condiciones de
procesado. De hecho, el manejo del animal antes del sacrificio y de la canal después
del mismo, puede tener un efecto muy importante en la actividad de las enzimas
musculares.
La acción de las catepsinas sobre el ablandamiento postmortem ha sido
ampliamente estudiada, sugiriéndose que las catepsinas B, D, H y L podrían estar
involucradas en la proteolisis del músculo. El lisosoma cuenta con una membrana
lipoproteica que se mantiene intacta a los niveles de pH in vivo pero que se rompe al
descender el pH durante el período postmortem o cuando el tejido sufre una lesión
grave, quedando liberadas las enzimas. Las actividades de las catepsinas B y L
Introducción
21
durante las primeras 8 horas postmortem se han relacionado positivamente con el
ablandamiento de la carne de bovino (O'Halloran et al., 1997). La catepsina L
hidroliza numerosas proteínas miofibrilares, incluyendo la troponina T, I y C, la
nebulina, la titina y la tropomiosina, las cuales son degradadas durante el periodo de
acondicionamiento postmortem junto con la miosina y actina en carne de conejo,
pollo y vaca (Mikami et al., 1987).
Actualmente existen muchas evidencias que relacionan la actividad de las calpaínas
con el ablandamiento de la carne de vaca, cordero y cerdo (Cena et al., 1992).
Estudios de correlación en diferentes especies indican que las diferentes velocidades
de ablandamiento de la carne (vaca < cordero < cerdo) están inversamente
relacionadas con la ratio calpastatina/calpaína (vaca > cordero > cerdo) (Koohmaraie
et al., 1991). Estudios in vitro en los que se han incubado proteínas miofibrilares con
calpaínas, muestran patrones de degradación similares a los observados en músculo
postmortem para las proteínas nebulina, titina, troponina T y desmina (Huff-Lonergan
et al., 1996). La m-calpaína se activa en las primeras etapas postmortem (dentro de
los primeros 3 días tras el sacrificio), momento en el que se produce la rotura de las
proteínas miofibrilares clave (Taylor et al., 1995). La m-calpaína persiste durante más
tiempo, ya que es más estable que la μ-calpaína en el músculo de todas las especies
estudiadas (Sensky et al., 1996). Recientemente, la importancia de la μ-calpaína en
la proteolisis postmortem ha sido puesta en evidencia a partir de observaciones en
ratones knock-out, sugiriéndose que la μ-calpaína es la enzima más importante del
sistema calpaína que participa en la proteolisis postmortem y el ablandamiento de la
carne (Geesink et al., 2006). Hay suficientes evidencias experimentales que sugieren
por un lado que las calpaínas son las principales responsables de la proteolisis
postmortem que da lugar al ablandamiento de la carne, y por otro que el calcio
provoca el debilitamiento de la línea Z al activar las calpaínas, ya que el aumento de
la concentración de calcio produce una aceleración de la proteolisis (Koohmaraie,
1990).
Las caspasas pueden activarse inmediatamente después del sacrificio en
condiciones de hipoxia e isquemia. Por ello, en los últimos años se ha planteado la
hipótesis de que tras el sacrificio y desangrado del animal se podría iniciar la
Introducción
22
activación de las caspasas y que, por tanto, estas enzimas podrían contribuir a la
proteolisis postmortem y al consecuente ablandamiento de la carne (Ouali et al.,
2006). En este sentido, se ha comprobado que las caspasas se expresan y
permanecen activas en el músculo esquelético del cerdo vivo (Kemp et al., 2006a) y
postmortem (Kemp et al., 2006b), pudiendo influir en la calidad de la carne como
consecuencia de la hidrólisis de la calpastatina. Esto provocaría una mayor actividad
de las calpaínas, lo que influiría en la tenderización disminuyendo la dureza de la
carne. Por otro lado, también existen evidencias recientes de la hidrólisis de las
proteínas musculares por acción directa de las caspasas (Huang et al., 2009).
1.4.1.3. Proteolisis en jamón curado y jamón cocido
La proteolisis constituye uno de los grupos de reacciones bioquímicas más
importantes en la generación del aroma y sabor durante el procesado del jamón
curado. La proteolisis tiene un gran impacto sobre la calidad del jamón curado ya que
influye directamente sobre la textura por ser responsable de la hidrólisis de las
proteínas miofibrilares y, además, contribuye en la generación de péptidos y
aminoácidos libres que influyen directamente en el aroma y sabor del producto final,
actuando también como sustratos en reacciones posteriores (Toldrá y Flores, 1998;
Toldrá et al., 2000).
La evolución de la proteolisis depende del tipo de producto, la cantidad de enzimas
musculares endógenas y las condiciones específicas del proceso. La primera etapa
de la proteolisis consiste en la hidrólisis de las proteinas miofibrilares y
sarcoplásmicas por la acción de las endopeptidasas musculares (catepsinas,
calpaínas, proteasoma y caspasas) para generar grandes polipéptidos, los cuales
son porteriomente degradados en péptidos más pequeños y aminoácidos libres por
la acción de exopeptidasas como las dipeptidasas, aminopeptidasas, y
carboxipeptidasas (Toldrá y Aristoy, 2010), (Ver Figura 6).
En los productos cárnicos curados, el tiempo de maduración y procesado es mucho
más largo que el de maduración de la carne, llegando hasta los 12 meses e incluso
hasta los 24 meses en algunos casos. Esto hace que la rotura de la estructura
miofibrilar sea mucho más intensa y completa, produciéndose cambios estructurales
Introducción
23
muy importantes como la degradación de las cadenas pesadas y ligeras de la
miosina, las troponinas C e I, etc., dando lugar a la aparición de una gran cantidad de
aminoácidos libres y péptidos pequeños, menores de 1200 Da, que se relacionan
con el aroma y sabor típicos de estos productos (Aristoy y Toldrá, 1995).
Figura 6. Esquema general de las principales etapas de la proteolisis con las enzimas más importantes que participan en el proceso de curado de jamón.
Las calpaínas tienen un pH de actuación próximo a la neutralidad. Durante el
procesado del jamón sólo se detecta actividad de calpaínas en el jamón fresco y, en
menor medida, durante la etapa de postsalado (Toldrá et al., 1993b). Estas enzimas
son muy inestables, perdiendo su actividad a los 10 -14 días de postsalado (Rosell y
Toldrá, 1996). Como se ha comentado en el apartado anterior, las calpaínas son
capaces de hidrolizar la titina, la nebulina, las troponinas T e I, la tropomiosina y la
desmina (Koohmaraie, 1994). Sin embargo, no son capaces de degradar la miosina,
la actina, la troponina C ni la α-actinina (Goll et al., 1992).
Las catepsinas son enzimas lisosomales con un pH óptimo de actuación ácido (pH
de 5,0 a 6,0). Están localizadas en el lisosoma y son de tamaño pequeño (20 – 50
kDa) (Sentandreu et al., 2002). Algunas catepsinas son particularmente relevantes
Introducción
24
en el músculo esquelético, presentando especificidades de sustrato marcadamente
diferentes entre ellas. En estudios realizados en jamón curado se ha observado que
las catepsinas B, H y L permanecen activas durante todo el proceso de curado,
mostrando una buena estabilidad incluso después de 15 meses de procesado,
momento en el que todavía se detecta una actividad residual del 5 - 10% de la
actividad inicial (Toldrá y Etherington, 1988). La catepsina D se inhibe en gran
medida por el NaCl durante la maduración, aunque permanece activa hasta los 6
meses de procesado (Rico et al., 1990); sin embargo la actividad de las catepsinas B
y L se afecta menos por la presencia de sal, obteniendo actividades del 70 - 80% de
la actividad inicial a concentraciones del 4 - 5% de cloruro sódico (Rico et al., 1991b).
Como se ha comentado más extensamente en el apartado anterior, ensayos in vitro
han demostrado la habilidad de las catepsinas D y L para degradar proteínas
miofibrilares como la titina, la cadena pesada de miosina, la actina, la tropomiosina, y
las troponinas T e I, así como la degradación de la miosina y la actina por acción de
la catepsina B (Goll et al., 1992). El proteasoma actúa a pH ligeramente alcalino,
desconociéndose su estabilidad durante el procesado del jamón.
La acción combinada de calpaínas y catepsinas sobre las principales proteínas
integrantes de la estructura del músculo, resulta en la rotura de las proteínas, lo que
provoca un aumento de la terneza de la carne y la generación de grandes
polipéptidos (Sentandreu et al., 2002; Lametsch et al., 2003; Nagaraj et al., 2005), tal
y como se ha comentado en el aparatado anterior.
La mayor parte de los aminoácidos libres que se generan durante el procesado del
jamón curado son resultado de la acción de las aminopeptidasas (Toldrá et al.,
1997). Se ha observado que la actividad de las aminopeptidasas musculares,
incluyendo la alanil, arginil, leucil, tirosil y piroglutamil aminopeptidasas, presenta una
estabilidad muy buena durante los primeros 8 meses de curado, aunque ésta se
reduce considerablemente al final del proceso debido al efecto inhibidor de la sal, la
desecación, y la propia actividad proteolítica (Toldrá et al., 1992b). También se ha
observado que la actividad de las aminopeptidasas se ve inhibida por la presencia de
aminoácidos libres (Flores et al., 1998a), lo que explicaría las diferencias obtenidas
en la concentración de aminoácidos libres dependiendo del tipo de proceso y de
Introducción
25
producto. La alanil aminopeptidasa (EC 3.4.11.14) es responsable de más del 80%
de la actividad total de las aminopeptidasas y actúa de forma específica sobre una
amplia variedad de sustratos con enlaces aromáticos, alifáticos, y aminoacil básicos
(Flores et al., 1996b). Se puede considerar que esta aminopeptidasa es la que
desempeña el papel más relevante en la generación de aminoácidos libres durante el
procesado del jamón curado. La metionil aminopeptidasa (EC 3.4.11.18) muestra
también un amplia especificidad de sustrato, mientras que la arginil aminopeptidasa
(EC 3.4.11.6) hidroliza principalmente aminoácidos básicos (Flores et al., 1996b).
Otras aminopeptidasas presentes en el músculo esquelético de cerdo son la LAP
(EC 3.4.11.1) y la PGAP (EC 3.4.19.3). La LAP cataliza la liberación de los
aminoácidos leucina y metionina, así como otros aminoácidos hidrofóbicos, mientras
que la PGAP muestra una elevada especificidad por el ácido piroglutámico en
posición N-terminal (Toldrá et al., 1992a y 1992b; Toldrá et al., 2000).
Respecto a la generación de aminoácidos libres durante el procesado del jamón, los
mayores incrementos se observan en los ácidos glutámico y aspártico, la alanina, la
valina, la leucina, la arginina, y la lisina. La AAP podría ser la responsable de estos
incrementos debido a su amplia especificidad de sustrato aunque la RAP contribuiría
en la liberación de los aminoácidos básicos. La contribución de la leucil y la
piroglutamil aminopeptidasa, a pesar de ser enzimas muy estables durante el
proceso de curado, quedaría bastante restringida debido a que están presentes en el
músculo de cerdo a niveles muy bajos y a que su pH básico de actuación queda
alejado de los valores de pH del músculo postmortem (Toldrá et al., 2000). Las
mayores concentraciones de aminoácidos libres se han detectado en jamones
Ibéricos debido a sus largos tiempos de curado (más de 24 meses), mientras que las
concentraciones más bajas se encuentran en jamones con tiempos de curado cortos
(Toldrá y Flores, 1998).
Como se ha comentado anteriormente, en el jamón cocido la proteolisis no tiene
tanta influencia sobre el sabor y aroma del producto final como en el caso del jamón
curado. Durante el proceso de producción del jamón cocido se produce un
importante aumento en el contenido de aminoácidos libres en general, aunque
algunos de ellos se degradan durante el proceso (Toldrá et al., 2010). En este
Introducción
26
sentido, la cocción puede afectar significativamente a las concentraciones de lisina,
metionina, y, especialmente, el triptófano, que desaparece totalmente al final de la
cocción. La glutamina también desaparece pero solo parcialmente. Tanto la alanil
aminopeptidasa como la arginil aminopetidasa pueden ser muy activas durante el
tratamiento térmico, participando en la generación de aminoácidos libres, aunque la
actividad de la alanil aminopeptidasa al final del proceso de cocción es muy baja, y la
del resto de las aminopeptidasas es prácticamente indetectable (Toldrá et al., 1995).
Los aminoácidos libres y péptidos pequeños generados durante esta intensa
proteolisis son responsables en gran medida, junto a otros compuestos, del
característico aroma y sabor tanto del jamón curado como del jamón cocido.
Además, los aminoácidos constituyen el sustrato de nuevas reacciones químicas
como las reacciones de Maillard y/o la degradación de Strecker (Flores et al., 1998b),
que se describirán más adelante.
1.4.2. Lipólisis
La fracción lipídica muscular está constituida fundamentalmente por triglicéridos y
fosfolípidos. La lipólisis consiste en la hidrólisis enzimática de los lípidos musculares
o del tejido adiposo y se traduce en la generación de ácidos grasos libres. Estos
ácidos grasos liberados van a servir de sustratos para una sucesión de reacciones
oxidativas que en último lugar darán origen a una serie de compuestos aromáticos de
gran importancia para el desarrollo del aroma y sabor característico del jamón
curado. Pueden distinguirse dos tipos de lipólisis según los lípidos estén presentes
en el interior del músculo o se encuentren en el tejido adiposo o capa externa de
grasa visible. Los lípidos intramusculares constan esencialmente de triglicéridos y
fosfolípidos. Ambos grupos de compuestos son los sustratos naturales de las lipasas
(ácida lisosomal y neutra) y fosfolipasas musculares (A1, A2, C y D) (Motilva et al.,
1993a), que van a ejercer su efecto hidrolítico liberando los ácidos grasos de las
moléculas de triglicéridos y de fosfolípidos, respectivamente (ver Figuras 7 y 8).
El resultado final de la acción de ambos grupos de enzimas es la generación de
numerosos ácidos grasos libres, tanto saturados como monoinsaturados y
poliinsaturados (Motilva et al., 1993a), que en una segunda etapa generarán
Introducción
27
compuestos volátiles como resultado de la oxidación química y/o enzimática,
contribuyendo al aroma del producto. Las lipasas musculares muestran una gran
estabilidad durante el curado, manteniendo su actividad incluso a los 15 meses de
proceso, aunque la liberación de ácidos grasos se produce especialmente durante
los primeros seis meses de proceso (Motilva y Toldrá, 1993).
Figura 7. Mecanismo de actuación de las lipasas musculares.
Figura 8. Mecanismo de actuación de las fosfolipasas musculares A1, A2, C y D.
Respecto de la lipólisis en el tejido adiposo, la lipasa sensible a hormona es la
principal enzima responsable. Los lípidos que constituyen este tejido son en un 99%,
triglicéridos y, derivado de la acción de esta enzima, se generan mono y diglicéridos
y una gran cantidad de ácidos grasos libres. La principal actividad de estas enzimas
Introducción
28
tiene lugar durante los primeros 8 - 10 meses de curado, coincidiendo con la máxima
liberación de ácidos grasos como el esteárico y el oleico (Motilva et al., 1993b).
1.4.3. Glucólisis
La glucólisis es la secuencia de reacciones que transforman la glucosa en piruvato.
Esta vía metabólica se encarga de oxidar o fermentar la glucosa para obtener
energía de la célula. Además, la glucólisis también tiene su papel en la función
anabólica formando precursores (moléculas de tres átomos de carbono) para la
síntesis de ácidos grasos y aminoácidos. El piruvato formado en la glucólisis puede
seguir varias rutas catabólicas distintas (ver Figura 10) (Lehninger, 2000).
Figura 10. Los tres posibles destinos catabólicos del piruvato producido en la glucólisis. Adaptación del libro Lehninger Principles of Biochemistry (Lehninger, 2000).
En los organismos aeróbicos, la glucólisis sirve de preámbulo al ciclo del ácido cítrico
y a la cadena de transporte electrónico, obteniendo la mayor parte de la energía de la
glucosa. En estas condiciones, el piruvato es oxidado hasta CO2 y H2O mediante
reacciones acopladas, generando 36 moléculas de ATP por cada molécula de
glucosa (Greaser, 1986).
Durante el periodo postmortem y en ausencia de oxígeno, la glucólisis anaeróbica es
la única fuente de energía de las células del músculo para mantener la homeostasis
(Gutiérrez, 1991). En estas condiciones de hipoxia, el NADH no puede ser reoxidado
a NAD+, siendo este último el aceptor de electrones imprescindible para la oxidación
Introducción
29
del piruvato. En esta situación, el piruvato se reduce a lactato, aceptando los
electrones del NADH y regenerando así el NAD+ necesario para la continuación de la
glucólisis. En esta vía se generan 2 moléculas de ATP por cada molécula de glucosa.
Por último, el piruvato puede convertirse en etanol y CO2 por medio de la
fermentación alcohólica (ver Figura 10) (Lehninger, 2000).
La glucólisis consiste en 11 pasos bien diferenciados descritos en la Figura 11. Las
enzimas que participan en la glucólisis están presentes en el sarcoplasma, el cual
contiene gránulos de glucógeno (se trata del almacén de glucosa en músculo)
localizados cerca de la banda I. La liberación de glucosa a partir del glucógeno
depende de la enzima glucógeno fosforilasa específica, la cual es activada por Ca2+,
adrenalina y AMP. Una vez liberada la glucosa, las siguientes fases del metabolismo
glucolítico son comunes independientemente del estado redox del tejido. Sin
embargo, como ya hemos adelantado, prevalecen las reacciones anaeróbicas en la
última vía, en la que el piruvato es reducido a lactato por el NADH por medio de la
enzima lactato dehidrogenasa mientras que en condiciones aeróbicas el piruvato es
descarboxilado a acetil-Co-A en las mitocondrias y luego oxidado hasta CO2 en el
ciclo del ácido cítrico. Los iones H+ generados son capturados y participan en la
cadena de fosforilación oxidativa (Greaser, 1986).
El ácido láctico generado al final del ciclo de la glucólisis en condiciones anaerobias
es el principal responsable de la bajada de pH de la carne postmortem. Cabe
destacar que el perfil de dicha bajada está íntimamente relacionado con la incidencia
de carnes pálidas, blandas y exudativas (PSE, del inglés ‘palid, soft and exudative’) y
oscuras, firmes y secas (DFD, del inglés ‘dark, firm and dry’). Así, una rápida
acidificación causada por un metabolismo muscular acelerado en cerdos
susceptibles a estrés, daría lugar a carnes PSE, mientras que una ausencia de
azúcares/glucógeno mantendría el pH cercano a la neutralidad, dando lugar a
carnes DFD (Batlle et al., 2000; Scheffler y Gerrard, 2007).
1.4.4. Transformación de nucleótidos
El adenosín trifosfato (ATP) es la principal fuente de energía del músculo empleada
en las reacciones bioquímicas. Inmediatamente después del sacrificio del animal, hay
Introducción
30
un periodo de aparente estabilidad del ATP debido a su regeneración a partir de la
fosfocreatina y de la glucólisis anaeróbica (Greaser, 1986).
Figura 11. Principales pasos de la glucólisis y enzimas glucohidrolasas envueltas en la degradación de la glucosa. El paso 11 del esquema representa la fermentación a lactato del piruvato, propia de músculos con contracción vigorosa, eritrocitos y algunas células y microorganismos. Adaptación del libro Lehninger Principles of Biochemistry (Lehninger, 2000).
Una vez se agotan las reservas de fosfocreatina y glucógeno, o se inactivan las
enzimas responsables de la formación del ATP, la concentración de ATP se reduce
en pocas horas, pasando a formarse, mediante hidrólisis enzimática, adenosín
difosfato (ADP) y adenosín monofosfato (AMP). A su vez, el AMP es desaminado
enzimáticamente a inosín monofosfato (IMP), el cual se descompone de forma lenta
en inosina (Ino) y, finalmente, en la base hipoxantina (Hx). También se forman por
acción enzimática aunque en menor cantidad guanosín monofosfato (GMP), que
Introducción
31
puede degradarse en guanosina y guanina. La xantina (X) es un producto final
común de estas reacciones que puede ser posteriormente oxidada a ácido úrico
(AU), lo que normalmente se asocia a la presencia de flora microbiana (Aristoy et al.,
2009). La Figura 12 muestra las enzimas responsables de la degradación del ATP.
Figura 12. Esquema de la participación de las nucleasas en la degradación del ATP. Adaptación
del libro Handbook of Seafood and Seafood Products Analysis (Aristoy et al., 2009).
La velocidad de estas reacciones dependerá del estado del animal antes del
sacrificio y de las condiciones postmortem, especialmente el pH y la temperatura de
la carne.
Introducción
32
1.4.5. Otros cambios debidos a reacciones químicas
De forma simultánea a las reacciones enzimáticas, en el músculo postmortem se dan
un conjunto de reacciones químicas tanto primarias (formación de más precursores
y/o componentes del aroma y sabor como los peróxidos lipídicos), como secundarias
(formación de compuestos volátiles aromáticos). Reacciones químicas como la
pirólisis de los péptidos y aminoácidos, la caramelización de los carbohidratos o la
degradación térmica de la tiamina ocurren en la carne al calentar a temperaturas muy
altas y por ello no son transcendentes en el procesado del jamón curado o cocido.
Sin embargo, la degradación y oxidación de los lípidos, las reacciones de Maillard y
las reacciones de degradación de Strecker sí que son las reacciones químicas
fundamentales en el procesado del jamón.
1.4.5.1. Degradación y oxidación de lípidos
Las reacciones oxidativas de los lípidos se inician en la fracción de fosfolípidos
debido a su elevado contenido en ácidos grasos poliinsaturados y a su localización
en las membranas. Estas reacciones van a generar una serie de compuestos
capaces de modificar el aroma de los productos en los que se desarrollan (Toldrá y
Aristoy, 2010).
La degradación de los lípidos presenta una etapa inicial consistente en la hidrólisis
enzimática descrita en el apartado anterior en la que se generan ácidos grasos libres.
Estos ácidos grasos libres son susceptibles de oxidación, la cual consta de tres fases
características (Estévez et al., 2009):
- Iniciación de la oxidación en la que se forman radicales libres, bien por acción de
catalizadores como la luz, iones metálicos o calor, o de enzimas como la
cicloxigenasa o la lipoxigenasa.
- Propagación, en la que se forman los hidroperóxidos, muy inestables y reactivos.
Este tipo de compuestos carecen de olor por lo que su repercusión sobre el
aroma de los alimentos no es apreciable, pero van a ser el origen de los
productos secundarios de oxidación.
- Terminación, en la que los hidroperóxidos se rompen en moléculas volátiles de
bajo peso molecular de los cuales los más característicos e importantes son los
Introducción
33
aldehídos, aunque también se forman cetonas, alcoholes, hidrocarburos y
ácidos. Los hidroperóxidos también pueden reaccionar con proteínas, péptidos o
aminoácidos y polimerizarse (Buscailhon et al., 1993). Estos compuestos tienen
una repercusión muy importante sobre el aroma del producto final en los
elaborados cárnicos.
1.4.5.2. Reacciones de Maillard
Se trata de una de las principales rutas de generación de compuestos responsables
del aroma de la carne y productos cárnicos. Esta reacción se produce entre
aminoácidos y grupos reductores como los de los azúcares y otros compuestos
carbonílicos. Las reacciones de Maillard, también reconocidas como de
pardeamiento no enzimático, requieren cierto aporte de calor o almacenamientos
prolongados a temperatura ambiente. Las condiciones ambientales durante las fases
finales de la maduración del jamón curado son favorables para la formación de este
tipo de compuestos según disminuye la actividad de agua del jamón (Ventanas et al.,
1992).
El conjunto de reacciones de oxidación y de Maillard generan un gran número de
compuestos volátiles que se pueden agrupar en carbonilos (aldehídos y cetonas),
furanos, ácidos grasos, pirazinas y compuestos azufrados (sulfuros, tiazoles, tioles y
tiofenos) y contribuyen a la formación de compuestos del aroma y sabor en muchos
alimentos (Shahidi et al., 1986). La importancia de estas reacciones durante el
curado dependerá de las condiciones del proceso, existiendo una correlación entre el
aumento en los productos derivados de las reacciones de Maillard y la temperatura y
el tiempo de almacenamiento (Ventanas et al., 1992).
En el jamón cocido, la generación de los productos derivados de las reacciones de
Maillard dependerán también del pH y de la disponibilidad de oxígeno (Leroy et al.,
2009).
1.4.5.3. Reacciones de Strecker
La degradación de Strecker es una de las vías de las reacciones de Maillard (Cremer
y Eichner, 2000) consistente en la desaminación oxidativa y posterior
descarboxilación de un aminoácido en presencia de determinados compuestos como
Introducción
34
pueden ser azúcares reductores o productos de oxidación lipídica (Arnoldi et al.,
1987). Los compuestos generados a partir de la degradación de Strecker poseen
características aromáticas intensas y pueden contribuir al desarrollo del aroma final
característico del jamón curado. Se trata de una ruta de formación de compuestos
volátiles tales como el 2-metil propanal, 2-metil butanal y 3-metil butanal procedentes
de los aminoácidos valina, isoleucina y leucina, respectivamente. También se forman
compuestos volátiles azufrados a partir de aminoácidos ricos en azufre como la
metionina, cisteína y cistina.
Algunos autores han establecido que los aldehídos con grupo metilo como el 3-metil
butanal también pueden generarse a partir del metabolismo secundario de
microorganismos, y ponen en duda que las reacciones de Maillard o Strecker puedan
tener lugar a las bajas temperaturas del proceso del jamón curado (Hinrichsen y
Andersen, 1994). Sin embargo, la detección de compuestos volátiles derivados de la
degradación de Strecker en estudios con sistemas modelo apoya el hecho de que
estas reacciones puedan ocurrir bajo condiciones similares a las del proceso de
jamón curado (Pripis-Nicolau et al., 2000; Hidalgo y Zamora, 2004; Ventanas et al.,
2007). 2. Compuestos bioquímicos marcadores de calidad en carne y productos cárnicos 2.1. Nucleótidos y nucleósidos
La alta incidencia de carnes tipo PSE se traduce en una menor calidad del producto
final, altas pérdidas por exudado, y la contracción de las carnes durante el
almacenamiento, resultando todo esto en carnes muy poco atractivas para los
consumidores (Flores et al., 1999). La disponibilidad de métodos rápidos de análisis
para la detección de este tipo de carnes durante los primeros momentos postmortem
es muy importante para la industria cárnica, ya que evitaría las consecuentes
pérdidas económicas que conlleva la disminución de la calidad sensorial de la carne.
El agotamiento del ATP es la principal causa del inicio del rigor mortis (Greaser,
1986). Tras el sacrificio, el ATP se degrada rápidamente a ADP y, seguidamente, a
AMP y IMP, el cual pasa a inosina e hipoxantina. La caída en la concentración de
Introducción
35
ATP y la formación de IMP e inosina ocurre más rápidamente en músculos PSE y
mucho más lenta en DFD que en músculos normales. Esto implica que las carnes
PSE contienen niveles muy bajos de ATP y niveles altos de IMP tras las primeras
horas postmortem, mientras que las carnes normales contienen concentraciones
relativamente altas de ATP y concentraciones bajas de IMP (Tsai et al., 1972;
Lundström et al., 1989). Esta observación ha constituido la base del desarrollo de
distintos métodos para la detección postmortem de carnes PSE y DFD. En este
sentido, la medida del valor R, que es la ratio de absorción a 250 y 260 nm, solo
necesita entre 3 y 4 minutos para su determinación por lo que puede ser muy
interesante para el control de calidad en matadero (Honikel y Fischer, 1977). Por otro
lado, el valor R’ es una variación del valor R, consistente en la ratio de los
compuestos derivados de la inosina y los derivados de la adenosina. También está
basado en la ratio de las absorbancias a 250 y 260 nm y se utilizó para distinguir
entre carnes PSE, normales y DFD a los 45 minutos postmortem. Este valor ha
demostrado ser útil para discriminar entre tipos de carnes también a las 2 horas
postmortem e incluso a las 8 horas, pero deja de ser útil tras las 24 horas del
sacrificio (Batlle et al., 2000). Otra medida sencilla de determinar es la ratio IMP/ATP,
que también se ha usado para la detección de carnes exudativas. Este índice es útil
en la discriminación entre carnes con un periodo postmortem de hasta 2 horas, pero
deja de serlo en carnes de mayor tiempo debido a la alta desviación estándar que
presentan (Batlle et al., 2000; Batlle et al., 2001).
El valor K0, ((Ino+Hx+X)/(ATP+ADP+AMP+IMP+adenosina+Ino+Hx+X))*100, se ha
utilizado como indicador de frescura en pescado (Saito et al., 1959), y también en
carne de cerdo, pollo (Fujita et al., 1988), conejo y vaca (Nakatani et al., 1986). Este
valor puede simplificarse debido a que el ATP, ADP, y AMP se degradan
rápidamente en las primeras horas postmortem. Sin embargo, este indicador no sería
válido para la detección rápida de carnes exudativas, por lo que se sugirió el valor K,
eliminando de la ecuación la xantina ya que su velocidad de formación durante el
tiempo postmortem es muy lenta (Okuma y Abe, 1992). Por otro lado, el ATP, ADP y
AMP desaparecen generalmente tras un día de almacenamiento en hielo (Jones et
al., 1964; Jones, 1969) afectando a este valor, por ello el valor K se simplificó a K’,
Introducción
36
que se define como la ratio entre Ino y Hx frente a la suma de IMP, Ino y Hx
expresada como porcentaje (Karube et al., 1984). Los nucleótidos y nucleósidos
también se han relacionado con atributos sensoriales de la carne. A este respecto,
un elevado contenido en hipoxantina se relaciona con el sabor amargo del pescado
estropeado, mientras que el IMP recuerda al sabor de carne fresca (Veciana-Nogués
et al., 1997; Kuda et al., 2007). El conocido sabor umami es el resultado de la
presencia de los compuestos IMP y GMP, los cuales también resultan ser
importantes potenciadores del sabor. Así pues, el contenido en nucleótidos se ha
estudiado en diferentes carnes para evaluar su contribución al aroma y sabor
(Calkins et al., 1982; Fish, 1991; Aliani y Farmer, 2005; Liu et al., 2007).
2.2. Creatina y creatinina
La creatina (Cr) es un ácido orgánico nitrogenado que se sintetiza de forma natural
en el hígado, el páncreas y los riñones a partir de aminoácidos como la arginina, la
glicina y la metionina a razón de un gramo de creatina por día (ver Figura 13),
aunque también puede obtenerse a través de complementos dietéticos o de
alimentos como la carne o el pescado.
2.2.1. Participación de la creatina en el metabolismo energético muscular
En mamíferos, la Cr se encuentra principalmente presente en el músculo esquelético
y es un componente fundamental en el metabolismo energético del músculo. La Cr
proporciona al músculo la energía necesaria para su mecanismo de contracción-
relajación y se ha demostrado que mejora el rendimiento en ejercicios de alta
intensidad (Wyss y Kaddurah-Daouk, 2000). En el músculo esquelético, la Cr
coexiste en equilibrio con la fosfocreatina; la conversión de creatina en fosfocreatina
es catalizada por la enzima creatina quinasa y consiste en la transferencia del grupo
γ-fosfato de la adenosina trifosfato (ATP) al grupo guanidino de la Cr (ver Figura 14).
La reacción inversa, por tanto, proporciona un camino alternativo a la glucólisis para
la regeneración del ATP. La existencia de este almacén de reserva mantiene los
niveles de ATP/ADP lo suficientemente altos para actuar en caso de demanda de
energía muscular anaeróbica urgente.
Introducción
37
NH2
NH
NH
NH2
O
OH
O
OH
NH
NH
NH2
N NH2
NH
OH
O
NH2
O
OH
NH2
NH2
O
OH
NH2
HS
O OH
O
OHOH
ONN
NH2
NN
P O
OH
NH2S
OOH
O
OHOH
ONN
NH2
NN
P O
OH
Arginina
Guanidoacetato
Creatina
Glicina Ornicina
s-adenosil-metionina
En riñones
s-adenosil-homocisteína
En hígado
Figura 13. Reacciones de síntesis de creatina en riñones e hígado a partir de aminoácidos. Adaptación de una figura contenida en el artículo Creatine and creatinine metabolism (Wyss y Kaddurah-Daouk, 2000).
La Cr aumenta la capacidad anaeróbica, la recuperación aeróbica, y la síntesis de
proteínas. Por esta razón, se ha usado terapéuticamente para el tratamiento de la
atrofia ocular (disfunción ocular que provoca la pérdida progresiva de visión)
(Heinanen et al., 1999) y la distrofia muscular (Pearlman y Fielding, 2006; Kley et al.,
2007). Estudios en animales también muestran a la Cr como prometedora en el
Ornitina
Introducción
38
tratamiento del daño cerebral traumático (Sullivan et al., 2000; Hergenroeder et al.,
2008) y la esclerosis lateral amiotrófica, conocida especialmente por ser la
enfermedad padecida por el físico Stephen Hawking (Zhang et al., 2003). Por otro
lado, aunque existen estudios enfrentados sobre el beneficio de los suplementos de
Cr en el rendimiento muscular, son numerosos los atletas que la consumen con este
fin, principalmente en forma de creatina monofosfato (Balsom et al., 1994; Casey et
al., 1996; Vandenberghe et al., 1997; Mc Kenna et al., 1999; Kreider, 2003). Hasta el
momento, no está prohibida por el Comité Olímpico Internacional. De hecho,
prestigiosos velocistas y vallistas ingleses admitieron haberla consumido a principios
de los noventa (Williams y Branch, 1998).
Figura 14. Reacción de la enzima creatina quinasa.
Aunque la mayor parte de las investigaciones se han realizado en humanos, también
existen algunos estudios sobre el efecto de los suplementos de creatina monohidrato
en el rendimiento del crecimiento de los cerdos y las características y calidad final de
su carne. Los cerdos alimentados con estos suplementos inmediatamente antes del
sacrificio, presentan una bajada de pH postmortem mucho más suave, ya que se ve
aumentada la cantidad de energía disponible para la producción de ATP, pasando a
segundo plano el metabolismo glucolítico y la consecuente producción de ácido
láctico. Esto hace disminuir la incidencia de carnes pálidas, blandas y exudativas
(PSE), aumentando la capacidad de retención de agua como consecuencia de la
presencia de fosfatos intramusculares unidos a la Cr dentro de la célula muscular
(James et al., 2002; Maddock et al., 2002; Rosenvold et al., 2007).
Una gran parte de la creatina generada por el organismo es transportada a través de
la sangre hacia los diferentes tejidos tales como cerebro, hígado, testículos, riñones
Introducción
39
y, muy especialmente, hacia la masa muscular, que suele absorber y almacenar
entre un 95% y un 98% del total de la creatina en dos tipos de compuestos: creatina
libre (es aproximadamente un 40% del total de la Cr muscular) y fosfocreatina (cerca
de un 60%). Las fibras musculares de contracción rápida (fibras Tipo II) son las que
más cantidad de Cr absorben (Kraemer y Volek, 1999; Persky y Brazeau, 2001).
2.2.2. Generación de creatinina por tratamientos de calor
La creatinina (Cn) es un compuesto orgánico generado a partir de la degradación de
la creatina. Se ha estudiado que la formación de creatinina a partir de creatina o
fosfocreatina ocurre por vía no enzimática (Figura 15), influyendo sólo factores
físicos como son el pH, la temperatura, el tiempo, y la concentración inicial de los
precusores (Fuller y Elia, 1988; Mora et al., 2008).
Figura 15. Reacción de conversión de la creatina en creatinina. Se trata de una reacción no enzimática.
La creatinina es un producto de desecho del metabolismo normal de los músculos
que normalmente se produce en una tasa muy constante (dependiendo de la masa
muscular). La creatinina es filtrada por los riñones y, si el filtrado del riñón es
deficiente, los niveles en sangre se elevan; por ello su medida en suero se usa como
indicador de la función renal. Por otro lado, la velocidad de excreción de creatinina
también ha sido utilizada para calcular la masa muscular en humanos (Gábor et al.,
1984) y como índice del estado nutricional (Bistrian et al., 1975), basándose en el
hecho de que la velocidad de producción de creatinina diaria es constante por la
presencia constante de una reserva de los precursores creatina y fosfocreatina en el
músculo esquelético.
Introducción
40
2.3. Dipéptidos naturales de la carne
Los péptidos en los alimentos se pueden encontrar de forma natural o pueden
generarse tras el acondicionamiento o procesado de los alimentos debido a la acción
de enzimas proteolíticas presentes en los propios alimentos o bien adicionadas a
éstos. Los procesos que van a ser causa de una mayor generación de péptidos son
los procesos de fermentación y/o maduración tal como ocurre en el queso, el vino y
los elaborados cárnicos. El estudio de los péptidos que se generan durante estos
procesos es una vía para conocer los cambios físicos y bioquímicos que ocurren
durante la elaboración.
Entre los péptidos que se encuentran de forma natural y cuyo origen no es proteico
destacan la carnosina (β-alanil-L-histidina), la anserina (β-alanil-L-1-metil-histidina) y
la balenina (β-alanil-3-metil-histidina), que se encuentran en el músculo esquelético
de la mayoría de los animales vertebrados. Estos péptidos poseen propiedades
tamponantes (Abe et al., 1985) y antioxidantes (Zhou y Decker, 1999; Djenane et al.,
2004). Además, se han utilizado para identificar las especies animales utilizadas
como ingredientes en la elaboración de productos cárnicos, ya que los cocientes
entre ellos son específicos de cada tipo de carne (Huang y Kuo, 2000; Aristoy y
Toldrá, 2004; Aristoy et al., 2004). El contenido de estos péptidos es especialmente
elevado en músculos con metabolismo glucolítico, aunque éste también va a
depender de la especie animal, la edad y la dieta (Aristoy y Toldrá, 1998; Cornet y
Bousset, 1998; Aristoy et al., 2004). Las carnes de vaca y de cerdo contienen niveles
elevados de carnosina y bajos de anserina, la de cordero presenta cantidades
similares de ambos compuestos, mientras que las carnes de caballo y pollo se
caracterizan por ser muy ricas en anserina. El dipéptido balenina, uno de los
abundantes en ballena, se encuentra presente en cantidades similares a las de
anserina en carne de cerdo (Aristoy y Toldrá, 2004).
2.4. Péptidos generados durante la proteolisis e influencia en el aroma y sabor.
El interés en el estudio de los péptidos de la carne se relaciona generalmente con la
proteolisis postmortem por ser la responsable del desarrollo de la terneza y de las
Introducción
41
características organolépticas propias del producto y, por tanto, de la calidad final del
mismo.
Durante los últimos años numerosos péptidos se han relacionado con la terneza y la
maduración de la carne. A este respecto cabe destacar la aparición de un péptido de
30 kDa proveniente de la acción de las calpaínas sobre la troponina T (Olson et al.,
1977) y, más recientemente, la de otro péptido de 32 kDa proveniente de la misma
proteína (Okumura et al., 2003). Ambos péptidos aparecen durante el
almacenamiento postmortem y están relacionados con el aumento de la terneza en la
carne de bovino (Mc Bride y Parrish, 1977; Negishi et al., 1996; Stoeva et al., 2000) y
de cerdo (Okumura et al., 2003). También se ha identificado un fragmento de 110
kDa procedente de la degradación de la proteína C (Mc Bride y Parrish, 1977; Stoeva
et al., 2000), así como péptidos mucho más pequeños como tres fragmentos de 1,2,
1,7 y 5,7 kDa, provenientes de las proteínas gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
(Stoeva et al., 2000; Okumura et al., 2003), troponina T y creatina quinasa (Stoeva et
al., 2000) respectivamente, todos ellos relacionados con el acondicionamiento de la
carne. La secuencia APPPPAEVPEVHEEV, también proveniente de la troponina T,
fue identificada en carne de bovino tras 10 días de almacenaje a 4 ºC (Nakai et al.,
1995).
En los productos cárnicos se produce una hidrólisis muy intensa de las proteínas
miofibrilares y sarcoplásmicas durante su procesado. Sin embargo, a pesar de
haberse documentado la presencia de fragmentos generados durante todo el
proceso de elaboración (Rodríguez-Nuñez et al., 1995; Hansen-Möller et al., 1997;
Martín et al., 2001; Sentandreu et al., 2003), se sabe muy poco sobre la identidad de
los péptidos generados. A este respecto, varios péptidos provenientes de la
degradación de proteínas miofibrilares en salchichón fueron secuenciados en parte
por su extremo N-terminal mediante degradación de Edman (Hughes et al., 2002).
Como se ha mencionado anteriormente, la intensa proteolisis que se produce
durante el curado del jamón se traduce en la generación de una gran cantidad de
péptidos de pequeño tamaño, especialmente entre 2,7 y 4,5 kDa, e incluso por
debajo de 2,7 kDa. En el jamón de Parma se ha purificado un péptido de 2,6 kDa
proveniente del extremo N-terminal de la enzima piruvato quinasa porcina, que
Introducción
42
mostró una correlación positiva con el grado de proteolisis (p < 0,01), asociándolo a
la actividad endopeptidásica (Sforza et al., 2003). Secuencias completas de
oligopéptidos procedentes de proteínas miofibrilares como la actina (Sentandreu et
al., 2007) han sido recientemente identificadas en el jamón Serrano.
Durante la proteolisis se generan muchos péptidos relacionados con el aroma y
sabor, tanto en la carne de cerdo como en el jamón curado. En este sentido, tras
separar por cromatografía de filtración en gel extractos de estos productos, se
obtuvieron fracciones que contenían péptidos de pequeño tamaño (< 3000 Da), los
cuales se correlacionaban claramente con algunos atributos de aroma y sabor
característicos de la carne y el jamón curado. Las primeras fracciones, con una masa
molecular de unos 1800 Da, tenían un sabor amargo, mientras que en las fracciones
de menos de 1000 Da se detectó un sabor ligeramente ácido. Los rangos
moleculares de 1500 a 1700 Da, se relacionaron con sabores agradables en el caso
de los extractos de jamón curado y con el atributo umami en el caso de la carne
fresca (Aristoy y Toldrá, 1995). El análisis sensorial en muestras de jamón con
periodos de curado de 7 y 12 meses, resultó en la detección de diferencias
significativas en los atributos de olor sexual, fermentado, agrio y salado, siendo éstos
mucho mayores en el proceso de curado largo, posiblemente debido a que la
intensidad de la proteolisis es mucho mayor (Flores et al., 1997b).
Por otro lado, di y tripéptidos generados por acción de las dipeptidil y
tripeptidilpeptidasas han sido aislados del jamón curado y secuenciados (Sentandreu
et al., 2003). Algunos de estos péptidos contribuyen al aroma y sabor característico
del jamón, dependiendo de su composición en aminoácidos. La generación de
aminoácidos libres como productos finales de la proteolisis debido a la acción de las
aminopeptidasas es muy intensa, pudiendo llegar a varios cientos de miligramos por
100 g de jamón (Toldrá et al., 1997; Toldrá et al., 2000). Estos aminoácidos libres
pueden contribuir al sabor final cuando se encuentran en concentraciones superiores
al valor umbral de detección (Nishimura et al., 1988). A este respecto, los ácidos
glutámico y aspártico se generan en grandes cantidades y podrían ser responsables
en parte del sabor ácido, aunque sus sales sódicas contribuyen a la mejora del
sabor. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina también se generan en grandes
Introducción
43
cantidades durante el curado y pueden contribuir a la formación de sabores amargos
si no se controlan. Por otro lado, aminoácidos como la alanina, serina, prolina, glicina
e hidroxiprolina pueden compensar el sabor aportando dulzor. El sabor final del
jamón curado va a depender de las cantidades y proporciones en que esté presente
cada aminoácido. El sabor a viejo, característico del jamón de Parma, se ha
correlacionado con el contenido en los aminoácidos lisina y tirosina (Careri et al.,
1993), mientras que en jamones de tipo francés apenas se ha observado efecto
alguno (Buscailhon et al., 1994). La concentración de los dipéptidos carnosina y
anserina también aumenta a lo largo del proceso de curado. La acción tamponante
de estos dipéptidos a pH < 6,0, hace que su contribución en el desarrollo del sabor
sea muy importante, ya que el efecto sobre el sabor de los componentes iónicos de
los alimentos en general, son fuertemente dependientes del pH (Nishimura et al.,
1988). Una excesiva proteolisis puede dar lugar a la generación de componentes
indeseables con sabores amargos o con un trasfondo metálico (Careri et al., 1993;
Parolari et al., 1994). Finalmente, algunos aminoácidos libres pueden convertirse en
una fuente de compuestos volátiles durante el curado o el calentamiento de
productos cárnicos (Mc Cain et al., 1968). La metionina y la cisteína pueden dar lugar
a compuestos volátiles azufrados, mientras que la leucina, valina e isoleucina
podrían generar aldehídos por medio de la degradación de Strecker (Toldrá et al.,
2000).
Parte de la importancia de la identificación de los péptidos generados durante el
curado del jamón radica en su potencial uso como marcadores de calidad de este
producto. Además de aportar información sobre el procesado del producto y de
contribuir a aumentar el conocimiento del conjunto de reacciones bioquímicas que
ocurren durante el curado, estudios más profundos permitirían elucidar las
propiedades funcionales de estos péptidos y su influencia sobre nuestro organismo.
Introducción
44
3. Métodos analíticos para la determinación de compuestos bioquímicos marcadores de calidad en carne y productos cárnicos 3.1. Compuestos derivados del metabolismo muscular
Para el correcto análisis de los compuestos derivados del ATP debe tenerse en
cuenta que el músculo en sus primeros momentos postmortem es muy sensible a la
temperatura. La degradación de la cadena de ATP ocurre de forma muy rápida
incluso a temperaturas de refrigeración. Por ello, es importante detener esta
degradación en el momento de la toma de muestra, para lo cual se congela el
músculo mediante inmersión en nitrógeno líquido.
En el procedimiento de extracción del ATP y los compuestos relacionados se utiliza
principalmente como agente de extracción el ácido perclórico, el cual es
posteriormente neutralizado añadiendo carbonato potásico. El ácido tricloroacético,
que posteriormente se neutraliza con hidróxido sódico, también da muy buenos
resultados en la extracción este tipo de compuestos.
Como ya se ha adelantado en el párrafo anterior, para el análisis de nucleótidos se
han utilizado una gran variedad de métodos. Entre ellos podemos destacar la
espectroscopía por resonancia magnética nuclear (Van den Thillart et al., 1990), la
electroforesis capilar de alta resolución (Nguyen et al., 1990; Luong et al., 1992),
radioinmunoensayos (Roberts et al., 1991), cromatografía de capa fina (Dingle et al.,
1968), HPLC en fase reversa (RP-HPLC) con o sin par iónico (Meynial et al., 1995;
Veciana-Nogués et al., 1997; Kuda et al., 2007), HPLC de intercambio iónico
(Borgese et al., 1978) y ensayos enzimáticos con la enzima en solución (Fujita et al.,
1988) o inmovilizada, constituyendo en este último caso los llamados biosensores
(Luong y Male, 1992; Yano et al., 1995; Volpe y Mascini, 1996). Aunque la técnica
más empleada en el análisis de nucleótidos y nucleósidos haya sido con diferencia la
RP-HPLC, estudios recientes sitúan a la cromatografía de interacción hidrofílica
(HILIC) en un nivel similar en lo que a linealidad, repetibilidad, reproducibilidad y
recuperación se refiere para este tipo de compuestos.
En lo que respecta a la determinación de la creatina y creatinina, la temperatura es
también un parámetro importante a controlar debido a la influencia de la misma en la
velocidad de conversión de la creatina en creatinina. Por ello, desde la toma de
Introducción
45
muestra e incluyendo el proceso de extracción, todo el tratamiento se hace en
condiciones de refrigeración (5 ºC). La creatina y creatinina se determinan
comúnmente utilizando el método de Folin, que está basado en la reacción de Jaffé,
base de los métodos oficiales. La reacción de la creatina con el 1-naftol y el biacetilo,
siempre a través de metodologías de inyección en flujo, se ha utilizado para la
determinación simultánea de creatina y creatinina en carne y productos cárnicos
(Dvorak, 1988; del Campo et al., 1995). Otras técnicas incluyen la cromatografía en
fase reversa con par iónico (Dunnett et al., 1991; Tranberg et al., 2005), un método
isotacoforético capilar (Kvasnicka y Voldrich, 2000), y ensayos espectrofotométricos
utilizando sistemas enzimáticos (Purchas et al., 2004).
3.2. Péptidos en carne y productos cárnicos
3.2.1. Extracción
Para el análisis de péptidos presentes en carne y productos cárnicos la extracción es
una etapa fundamental. Tras eliminar la grasa y el tejido conectivo del tejido
muscular, se tritura la muestra por métodos mecánicos y se toma una muestra
representativa para el análisis, la cual se homogeneiza con el tampón de extracción.
Los agentes más empleados suelen ser el agua bidestilada, soluciones salinas
diluidas, soluciones acuosas ácidas (acético, clorhídrico o perclórico), tampón fosfato
neutro e incluso mezclas de agua con disolventes orgánicos. Sin embargo, en carne
y productos derivados se suelen emplear soluciones ácidas como el ácido clorhídrico
0,01N (Rodríguez-Nuñez et al., 1995; Mora et al., 2008). Tras la extracción, el
sobrenadante se recoge y desproteiniza añadiendo 3 volúmenes de acetonitrilo,
metanol o etanol. En ocasiones, la extracción y la desproteinización se realizan en un
solo paso extrayendo la muestra con un solvente desproteinizante como el ácido
perclórico 0,6 N (Dunnett y Harris, 1997; Martín et al., 2001; Liu et al., 2007) o el
ácido tricloroacético (Hughes et al., 2002).
3.2.2. Separación
En la mayoría de los casos el análisis de péptidos requiere un fraccionamiento previo
con el fin de simplificar la muestra y eliminar las sustancias interferentes presentes
Introducción
46
en la solución. Los métodos de separación pueden basarse en diferentes principios
como el fraccionamiento por tamaño (ultrafiltración, cromatografía de exclusión
molecular), la carga (electroforesis o cromatografía de intercambio iónico) o la
polaridad (electroforesis micelar o cromatografía de fase reversa).
3.2.2.1. Ultrafiltración
Se trata de una técnica preparativa. Con esta técnica es posible aislar la fracción
peptídica de interés según su tamaño molecular, aunque también se puede usar
como medio para concentrar extractos de péptidos. Existe una gran variedad de
filtros con numerosos tamaños de corte molecular.
3.2.2.2. Cromatografía de exclusión molecular
También se la denomina cromatografía de filtración en gel y se utiliza para separar
proteínas, péptidos u otras macromoléculas biológicas en función de su tamaño
molecular. En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria es un gel donde las
moléculas más pequeñas penetran en los poros del relleno mientras que las que
tienen un mayor tamaño que el diámetro del poro son excluidas y eluyen más
rápidamente. Como puede verse en la Figura 16, el resultado es una separación en
la cual los péptidos eluyen ordenados de mayor a menor tamaño molecular.
El intervalo de tamaños a fraccionar va a depender del tamaño del poro del gel. Por
ejemplo, un gel Sephadex G-25 (GE Healthcare) es adecuado para separar péptidos
de un tamaño entre 500 y 5000 Da (Spanier et al., 1988; Rodríguez-Nuñez et al.,
1995; Hughes et al., 2002; Mora et al., 2009), mientras que un gel Sephadex G-10
sería adecuado para separar péptidos menores de 700 Da (Cambero et al., 1992;
Hughes et al., 2002).
La elución normalmente se lleva a cabo con ácido clorhídrico 0.01N o tampones
fosfato diluidos a velocidades de flujo muy bajas (por ejemplo, 15 mL/h). El eluyente
se monitoriza por absorción ultravioleta a 214, 254 o 280 nm con el fin de controlar la
elución de los compuestos de interés.
Introducción
47
Un cromatograma típico de un extracto de jamón curado se muestra en la Figura 17.
Tras la elusión, se pueden recoger las fracciones con el fin de utilizarlas en
posteriores etapas de análisis.
Figura 16. Esquema básico del funcionamiento de la cromatografía de filtración en gel. Los compuestos de menor tamaño quedan retenidos en las partículas del gel mientras que los más grandes eluyen más rápido.
3.2.2.3. Electroforesis en gel
La tecnología más utilizada para la separación de proteínas y péptidos es la
electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE), tanto de una dimensión, donde la
separación se realiza en función de la masa molecular en presencia de dodecil
sulfato sódico (SDS), como bidimensional, que está basada en una primera
separación en función del punto isoeléctrico utilizando un gradiente de pH, seguida
de una segunda separación en función de la masa molecular (ver Figura 18).
Esta técnica se ha utilizado mucho en el estudio de los cambios postmortem del
músculo esquelético, lo que ha contribuido a conocer mejor los mecanismos
bioquímicos que tienen lugar durante este periodo. Así pues, la electroforesis
Introducción
48
bidimensional se ha utilizado para estudiar los cambios postmortem ocurridos
durante el periodo de almacenamiento de la carne de cerdo (Lametsch y Bendixen,
2001), oveja (Jia et al., 2006a), ródalo (Verrez-Bagnis et al., 2001) y bacalao
(Kjaersgard y Jessen, 2003). Otros autores también han empleado la electroforesis
bidimensional para relacionar los cambios postmortem que se producen en el
proteoma con la terneza de la carne de cerdo (Lametsch et al., 2003; Hwang et al.,
2005) y también con cambios en el color de la misma (Sayd et al., 2006).
0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.5
0 20 40 60 80Volumen de elución (mL)
Abso
rban
cia
214 nm
254 nm
280 nm
Figura 17. Cromatografía de filtración en gel con una columna Sephadex G-25 de un extracto de jamón curado desproteinizado.
Aunque el uso más común de la electroforesis en geles de poliacrilamida ha sido
para la separación de proteínas, también se ha utilizado para la separación de
péptidos entre 1 - 30 kDa presentes en carne. Para ello es necesario tener en cuenta
una serie de medidas, entre las que se incluye la tricina como componente
fundamental del tampón (Schägger, 2006). La separación ocurre según los valores
de pK de los grupos funcionales de la tricina, que definen la movilidad electroforética
de los péptidos. Este sistema es también útil para la separación de péptidos
extremadamente hidrofóbicos que posteriormente van a ser identificados por
espectrometría de masas.
Introducción
49
La electroforesis de flujo libre es una alternativa a la separación por electroforesis
bidimensional. Se trata de una metodología basada en la separación en medio
líquido y sin límites de pH o de tamaño molecular. Se desarrolló para la separación
en contínuo de compuestos moleculares, desde péptidos y proteínas a partículas
subcelulares y células, y está basado en la separación por electromigración de los
compuestos cargados gracias al flujo hidrodinámico contínuo de una corriente de
electrones que se aplica perpendicularmente a la dirección del flujo de la muestra
(Weber y Bocek, 1998). La ausencia de matriz permite recuperaciones de muestra de
más del 95% y velocidades de fraccionamiento de menos de 20 minutos.
Figura 18. Esquema de funcionamiento de la electroforesis bidimensional. El extracto se separa en un primer gel según su punto isoeléctrico (IEF) y, posteriormente, a partir de ese mismo gel, se realiza una sep8aración por SDS-PAGE según la masa molecular.
Recientemente se ha desarrollado un fraccionador basado en esta metodología. El
tradicional gel de acrilamida ha sido sustituido por una fase líquida, la cual permite la
recogida de las distintas fracciones para posteriores análisis sin necesidad de la
tediosa fase de extracción en gel que era necesaria en la electroforesis SDS-PAGE.
Introducción
50
Esta electroforesis denominada Offgel permite la separación de proteínas y péptidos
según su punto isoeléctrico (Hörth et al., 2006; Fraterman et al., 2007).
3.2.2.4. Electroforesis capilar
Esta técnica consiste en la separación por electroósmosis, cuyo principio se basa en
colocar un capilar de sílice fundida relleno de una solución tampón entre dos
electrodos, aplicándose una diferencia de potencial que produce una corriente que
atraviesa el capilar y hace que la solución fluya en su interior en dirección al cátodo.
De este modo, la introducción de una disolución de péptidos por el ánodo hace que
éstos migren al cátodo en función de su carga y tamaño, eluyendo primero los de
menor electronegatividad y tamaño. Los analitos en su camino al cátodo son
detectados cuando el capilar pasa a través de un detector ultravioleta o de
fluorescencia, resultando un electroferograma equivalente a un cromatograma. Esta
técnica se ha aplicado a la caracterización de proteínas por medio de mapas
peptídicos (Saz y Marina, 2007). Estos mapas peptídicos constituyen la huella
peptídica de una determinada proteína, que es el conjunto de péptidos generados
mediante la digestión con una peptidasa específica. Más adelante se comentará
cómo, mediante técnicas de espectrometría de masas y comparación de las masas
experimentales generadas con masas peptídicas teóricas presentes en bases de
datos, es posible la caracterización de la proteína de interés.
La aplicación de esta técnica al análisis de péptidos presentes en extractos de carne
o productos cárnicos resulta complicada en parte debido a la complejidad de estas
matrices, la presencia de sustancias interferentes como aminoácidos y nucleótidos, y
la dificultad del fraccionamiento, lo que complica la posterior purificación y
caracterización de los péptidos por separado.
3.2.2.5. Cromatografía de fase reversa
La cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) es la técnica
más utilizada para analizar extractos peptídicos, ya que permite separarlos en base a
diferencias de hidrofobicidad, lo que está directamente relacionado con la
composición en aminoácidos de los péptidos. En este tipo de cromatografía, la fase
Introducción
51
estacionaria es apolar mientras que la fase móvil es polar. Existen muchos tipos de
columnas de fase reversa; las más utilizadas consisten en un soporte de sílice con
cadenas n-alquil octadecil (C18) y octil (C8) enlazadas. En el interior de la columna
se produce un reparto de los péptidos entre la fase móvil y la estacionaria. Las
típicas fases móviles que se emplean en este tipo de separaciones son el acetonitrilo
como fase orgánica y una fase acuosa compuesta generalmente de un 0.1% de
ácido trifluoroacético o ácido fórmico en agua (Sforza et al., 2006). Para conseguir
una separación óptima de los péptidos se suele realizar una elución en gradiente.
Los péptidos más polares eluyen en primer lugar mientras que los hidrofóbicos
quedan retenidos en la columna y tardan más tiempo en eluir. La detección de los
péptidos puede realizarse a diferentes longitudes de onda, 214, 254 o 280 nm,
aunque si el sistema cuenta con un detector de diodos es posible obtener el espectro
completo de absorción para cada péptido.
La gran eficacia de esta técnica permite la obtención de los denominados mapas
peptídicos (Colilla et al., 1991) a partir de digestiones proteicas o de extractos de
péptidos en general. Así mismo, se puede hacer un seguimiento de los procesos en
los que existe proteolisis tal como ocurre en el caso del jamón curado o el queso
(Rodríguez-Nuñez et al., 1995; Michaelidou et al., 2003). Además, lospéptidos
separados se pueden aislar para su estudio o identificación posterior (Recio et al.,
2000; Fogaça et al., 2004).
3.2.2.6. Cromatografía de intercambio iónico
Este tipo de cromatografía también permite una buena separación de péptidos,
siendo complementaria de la anteriormente descrita. En la cromatografía de
intercambio iónico, la fase estacionaria muestra en la superficie grupos funcionales
iónicos que interactúan con iones de carga opuesta del analito. La cromatografía de
intercambio catiónico retiene cationes debido a que la fase estacionaria posee
grupos funcionales cargados negativamente como el ácido sulfónico o carboxílico,
mientras que la cromatografía de intercambio de aniones retiene aniones usando
grupos funcionales cargados positivamente, como un catión de amonio cuaternario.
Así pues, los péptidos de carácter ácido se separan mejor en columnas de
Introducción
52
intercambio aniónico (Pizzano et al., 1998), mientras que para el análisis de péptidos
con carácter básico se suelen emplear columnas de intercambio catiónico (Recio et
al., 2000; Sentandreu et al., 2003).
Los mejores resultados se suelen obtener utilizando sales no volátiles como el
cloruro sódico, lo que presenta un gran inconveniente cuando se requieren
posteriores identificaciones por espectrometría de masas. Para superar este
problema, la separación de intercambio iónico suele ir seguida de una cromatografía
en fase reversa o de interacción hidrofílica con el fin de eliminar la sal de los péptidos
de interés.
La naturaleza catiónica de los dipéptidos naturales de la carne (carnosina, anserina y
balenina), permite su análisis por cromatografía de intercambio catiónico.
Normalmente, es suficiente su detección por ultravioleta a 214 nm, pero cuando se
precisa una mayor sensibilidad, es posible aumentar el límite de detección en
muestras complejas mediante la derivatización postcolumna con o-ftalaldehído (OPA)
(Aristoy y Toldrá, 2004; Aristoy et al., 2004). En estos casos la detección suele
hacerse por fluorescencia.
3.2.2.7. Cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC)
Como se ha comentado anteriormente, tanto la cromatografía líquida de alta
resolución en fase reversa como de intercambio iónico han sido durante décadas los
métodos elegidos para el análisis de péptidos. Sin embargo, la cromatografía de fase
reversa presenta algunas limitaciones en el análisis de compuestos polares debido a
la baja retención de los mismos. En este sentido, la cromatografía de interacción
hidrofílica constituye una alternativa interesante a estos tipos de cromatografía por
muchas razones. Esta técnica utiliza fases móviles similares a las empleadas en fase
reversa, con la consecuente ventaja sobre la solubilidad del analito, sin embargo, no
precisa del uso de agentes derivatizantes o pares iónicos para aumentar la retención,
generalmente necesarios en RP-HPLC. Por otro lado, se trata de una cromatografía
líquida perfectamente compatible con espectrometría de masas, eliminando el paso
de desalado que es necesario cuando se utiliza la cromatografía líquida de
intercambio iónico.
Introducción
53
La cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) es complementaria a la
cromatografía de fase reversa. Compuestos que presentan poca o ninguna retención
en fase reversa suelen presentar una fuerte retención en columnas HILIC, las cuales
requieren fases móviles con un alto contenido en componente orgánico con el fin de
promover las interacciones hidrofílicas entre el analito y la fase estacionaria. El
tiempo de retención en este tipo de cromatografía aumenta con la polaridad del
péptido, la polaridad de la fase estacionaria, y con la concentración en disolvente
orgánico de la fase móvil utilizada para la elución, al contrario de lo que ocurre en
fase reversa.
Aunque sí se han descrito estudios sobre el uso de este tipo de cromatografía en la
separación de péptidos (Alpert, 1990; Yoshida et al., 1995; Dunnett y Harris, 1997;
Yoshida, 2004), no existen prácticamente registros sobre su aplicación en el análisis
de alimentos.
3.2.3. Identificación y secuenciación
Tradicionalmente para la identificación de proteínas se han desarrollado dos
estrategias claramente diferenciadas, la identificación mediante huella peptídica y la
identificación mediante fragmentación de péptidos obteniendo la secuencia total o
parcial de los aminoácidos. La huella peptídica de una determinada proteína es un
conjunto de péptidos generados mediante digestión de la proteína con una enzima
conocida como es la tripsina. Las masas peptídicas experimentales obtenidas son
comparadas con las masas peptídicas teóricas de proteínas presentes en bases de
datos de forma que, para la identificación correcta de la proteína, se requiere que las
masas de un gran número de péptidos coincidan con las masas teóricas de los
péptidos y que cubran parte de la secuencia de la proteína de la base de datos.
Últimamente aparecen trabajos en los que la investigación se centra en la
identificación de péptidos presentes en matrices complejas, los cuales se han
generado a partir de procesos proteolíticos muy poco conocidos. En la identificación
de péptidos endógenos presentes en matrices complejas no es necesario generar
péptidos ya que éstos se encuentran presentes en la muestra de forma natural, como
es el caso de las leches fermentadas o los productos curados (Sentandreu et al.,
Introducción
54
2007; Jauhiainen y Korpela, 2007). Esto plantea un importante inconveniente en la
identificación de la secuencia de estos péptidos al no haber sido generados por
digestión con una enzima conocida (tripsina mayoritariamente), no siendo posible
obtener su huella peptídica ni contrastarla con las masas teóricas presentes en las
bases de datos. En estos casos, los péptidos se deben identificar por elucidación de
su secuencia de aminoácidos mediante espectometría de masas en tándem, técnica
que se explicará más adelante.
3.2.3.1. Secuenciación por degradación de Edman
La degradación de Edman se ha utilizado durante décadas en la secuenciación de
péptidos y consiste en la liberación progresiva de los aminoácidos situados en el
extremo N-terminal del péptido y su posterior identificación, lo que permite conocer la
secuencia de los aminoácidos que componen el péptido (Aldanova et al., 1970). Esta
técnica se basa en la reacción del fenilisotiocianato con el grupo amino libre terminal
del péptido. Tras una hidrólisis suave en medio ácido se libera el derivado
feniltiohidantoína del aminoácido mientras el resto del péptido permanece intacto y el
ciclo vuelve a comenzar (ver Figura 19) (Bermodso et al., 1970).
A pesar de que esta técnica de secuenciación ha sido de gran utilidad durante
décadas, presenta importantes limitaciones como son la necesidad de tener libre el
extremo N-terminal del péptido para permitir la reacción con el fenilisotiocianato, así
como la exigencia de tener un elevado grado de pureza del péptido a secuenciar, ya
que la secuenciación de una mezcla de dos o más péptidos dificulta mucho la tarea y
puede conducir fácilmente a error.
Los equipos de secuenciación basados en este principio se denominan
secuenciadores automáticos y constan de una unidad que realiza la degradación de
Edman de forma continua y automática, la cual está conectada a un cromatógrafo
líquido de fase reversa, donde se realiza la identificación del derivado de
feniltiohidantoína (PTH-aminoácido) (Laursen, 1971; Laursen et al., 1972; Kulbe,
1974).
Introducción
55
Los secuenciadores de proteínas se han utilizado para identificar péptidos en carne
(Stoeva et al., 2000; Okumura et al., 2003) y productos cárnicos (Hughes et al., 2002;
Sentandreu et al., 2003).
Figura 19. Diagrama esquemático de la degradación de Edman.
3.2.3.2. Identificación por espectrometría de masas
Las aplicaciones de la espectrometría de masas experimentaron grandes cambios a
finales de la década de los 80 como consecuencia del desarrollo de los métodos de
producción de iones de moléculas no volátiles o termolábiles, muchas de ellas
estudiadas con frecuencia por bioquímicos y biólogos. Es el caso de los nuevos
métodos de ionización por electrospray (ESI) (Fenn et al., 1989; Fenn, 2003) y por
desorción/ionización por láser asistida por una matriz (MALDI) (Karas et al., 1989;
Tanaka, 2003). Estos métodos de ionización ‘suave’ permiten convertir biomoléculas
grandes, polares y no volátiles (proteínas) en iones en fase gaseosa tras una
Introducción
56
fragmentación mínima. Aunque se han desarrollado diversas combinaciones de
fuentes de ionización y de analizadores de masas, la fuente de ionización MALDI se
suele acoplar a un analizador tipo tiempo de vuelo (TOF) o TOF/TOF mientras que la
ionización ESI normalmente se combina con un cuadrupolo, una trampa iónica o
instrumentos híbridos cuadrupolo-trampa iónica, cuadrupolo-tiempo de vuelo, y triple
cuadrupolo.
Un espectrómetro de masas es un instrumento capaz de separar los iones que
componen una muestra según su relación masa/carga (m/z). Antes de pasar al
espectrómetro de masas, la muestra es vaporizada e ionizada y, una vez allí, se
genera una lista de masas (m/z) de forma que pueden seleccionarse aquellas
correspondientes a péptidos específicos para una posterior fragmentación por
MS/MS. La espectrometría de masas en tándem implica el acoplamiento de un
espectrómetro de masas a otro. En este montaje, el primer espectrómetro sirve para
aislar los iones moleculares de los diferentes componentes de la mezcla. Estos iones
se introducen en un segundo espectrómetro de masas donde son fragmentados para
dar una serie de espectros de masas, uno por cada uno de los iones moleculares
obtenidos en el primer espectrómetro. Como los péptidos se pueden fragmentar por
múltiples sitios se ha creado una nomenclatura para indicar el tipo de fragmentos
generados. Tras la fragmentación a nivel de enlace peptídico se generan
principalmente dos tipos de iones cargados positivamente, los de tipo b y los de tipo
y. Los iones tipo b son aquellos que contienen el extremo amino del péptido,
mientras que el ión tipo y contiene el extremo carboxilo (Roepstorff y Fohlman, 1984).
Los espectros de fragmentación MS/MS proporcionan información de las diferencias
de masas entre dos iones consecutivos del mismo tipo (por ejemplo iones de la serie
y o b) y que corresponden a la pérdida de un aminoácido en el péptido (ver Figura 20). Estos espectros proporcionan información sobre la identidad y posición de los
aminoácidos en el péptido. Por tanto es posible determinar la secuencia completa del
péptido si éste genera una fragmentación de buena calidad. Otras veces sólo se
obtiene una secuenciación parcial del péptido. La información sobre la secuencia
parcial y la masa del péptido, puede permitir la identificación de la proteína mediante
las bases de datos (Henzel et al., 1993; Mann et al., 1993).
Introducción
57
Figura 20. Ejemplo de un péptido fraccionado por distintos enlaces (marcados con distintas letras).
En un experimento típico, un espectrómetro de masas sencillo puede general cientos
de espectros por hora y su interpretación de forma manual no sería una opción
viable, por ello se han desarrollado un gran número de aproximaciones y
herramientas bioinformáticas que permiten la interpretación de estos espectros de
MS/MS. Podemos clasificar estas metodologías de trabajo en tres categorías:
- En la primera aproximación se obtienen las secuencias de los péptidos
directamente a partir de la información del espectro de fragmentación sin recurrir
a las bases de datos (aproximación por secuenciación de novo). Esta
metodología presenta la ventaja de que permite la identificación de péptidos cuya
secuencia exacta no está disponible en las bases de datos.
- La siguiente aproximación sería por búsqueda en bases de datos, en la que la
identificación de los péptidos se lleva a cabo correlacionando los espectros de
fragmentación (MS/MS) experimentales con los teóricos contenidos en las bases
de datos (Pappin et al., 1993; James et al., 1993; Yates et al., 1993).
- Finalmente, existe una aproximación híbrida basada en la identificación de un
fragmento corto de la secuencia, entre tres y cinco residuos, seguido de una
búsqueda en bases de datos.
Existen diversas herramientas bioinformáticas que pueden utilizarse para la
interpretación de los espectros de fragmentación de un péptido: SEQUEST,
MASCOT, PARAGON, etc., las cuales trabajan con distintas bases de datos como
son la SwissProt o el NCBInr.
Introducción
58
3.2.3.2.1. Espectrometría de masas MALDI-TOF
MALDI-TOF es una técnica de ionización suave utilizada en espectrometría de
masas. En esta técnica, la mezcla de péptidos se coloca sobre una placa metálica a
la que se le añade una matriz, normalmente un ácido aromático de bajo peso
molecular como el ácido α-ciano-hidroxicinámico o el ácido 2,5-dihidroxibenzoico,
que absorbe la radiación del láser de nitrógeno, ayudando en la ionización sin que se
produzca la rotura del péptido. Una de las principales ventajas de esta técnica es que
el proceso de ionización genera principalmente iones con una sola carga (M + H)+
(ver Figura 21).
Figura 21. Esquema de la ionización por MALDI.
A la salida de la fuente de ionización los iones son acelerados en un campo eléctrico
(103 a 104 V) y conducidos a una zona libre de campos. Este voltaje de aceleración
proporciona a todos los iones la misma energía cinética y, por lo tanto, distintas
velocidades en función de sus relaciones masa/carga. Los iones más ligeros viajarán
a mayor velocidad y llegarán antes al detector, el cual registra los “tiempos de vuelo”
de los distintos iones.
A partir de los tiempos de vuelo pueden derivarse las relaciones masa/carga de los
iones (ver Figura 22). El resultado es un espectro de masas en el que quedan
representadas las masas moleculares (m/z) de los péptidos presentes en la muestra.
Introducción
59
Durante la última década se han llevado a cabo varios estudios sobre los cambios
postmortem que se dan en el músculo porcino utilizando esta técnica. De este modo,
se han podido observar cambios en la abundancia de algunas enzimas del
metabolismo energético muscular (Lametsch et al., 2004), y,por otro lado, se han
detectado proteínas que pueden ser sustratos de la μ-calpaína (Lametsch et al.,
2002). Esta técnica también ha servido para la identificación de una nueva forma de
actina en el jamón curado (Di Luccia et al., 2005).
Figura 22. Esquema de funcionamiento del analizador de tiempo de vuelo. Tras la ionización, los iones se aceleran en función de su relación masa/carga y llegan al detector.
3.2.3.2.2. Espectrometría de masas MALDI- TOF/TOF
Los analizadores TOF/TOF proporcionan un mejor enfoque de los iones y, por tanto,
mayor resolución y precisión másicas. Este tipo de analizadores consisten
principalmente de tres secciones: un TOF lineal (TOF 1), una región de colisión que
sirve como fuente de iones, y un TOF reflector (TOF 2) (ver Figura 23). Los iones
precursores se generan en el TOF 1, donde son acelerados y dirigidos al centro de
un dispositivo selector de iones (TIS). Con el ajuste adecuado de los voltajes a unos
tiempos predeterminados, el TIS evita la entrada en la celda de colisión de todos los
valores de m/z que son menores y mayores que el valor m/z del ion precursor. Los
iones seleccionados son decelerados antes de su entrada en la celda de colisión.
Tras su fragmentación en la celda de colisión, los iones son reacelerados en la
región TOF 2 (Yergey et al., 2002).
Introducción
60
Este diseño se ha modificado recientemente para incorporar un reflectrón de campo
curvilíneo como TOF 2. Con esta modificación no hay necesidad de decelerar los
iones antes de la disociación inducida por colisión (CID) ni de reacelerar los
productos de la CID, ya que el reflectrón de campo curvilíneo puede aceptar iones de
amplio rango de energía.
Figura 23. Esquema de un instrumento MALDI-TOF/TOF. Adaptación de una figura contenida en el artículo De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF (Yergey et al., 2002), de la American Society for Mass Spectrometry.
Otro diseño del TOF/TOF en tandem utiliza una celda LIFT para la postaceleración a
mayores energías. Además de la celda de colisión, contiene un sistema TIS que
actúa como barrera selectiva de iones, una celda LIFT para elevar la energía
potencial, y un dispositivo de supresión metaestable para eliminar los precursores no
fragmentados (Suckau et al., 2003). Como se puede ver en la Figura 24, constan de
un solo tubo de tiempo de vuelo con un acelerador de iones intermedio, mientras que
los TOF/TOF tradicionales constan de dos TOF separados por una cámara de
colisión para generar fragmentación por CID. Los TOF/TOF tipo LIFT no generan
fragmentación sino que aprovechan los iones metaestables generados durante la
ionización y aceleración de los iones.
Este tipo de instrumentos también pueden ir acoplados a un sistema de
cromatografía líquida (LC-MALDI-TOF/TOF), de manera que tras la separación, las
sucesivas fracciones peptídicas que eluyen en la columna, se van depositando de
forma automática en la placa MALDI.
Introducción
61
El MALDI-TOF/TOF se ha utilizado en el estudio de los primeros cambios
postmortem en músculo de becerro (Jia et al., 2006b), identificándose un total de
cinco proteínas en los músculos Longissimus dorsi y Semitendinosus.
Figura 24. Esquema de un analizador de tipo MALDI-TOF/TOF con celda LIFT.
3.2.3.2.3. Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas
Una técnica alternativa para separar e identificar péptidos es la cromatografía líquida
de alta resolución acoplada a un espectrómetro de masas (Watson y Sparkman,
2007a). Cuando se emplean técnicas de cromatografía líquida acoplada a
espectrometría de masas, el método de ionización más comúnmente empleado es la
ionización por electrospray (ESI) (Fenn et al., 1990; Dass, 2007a; Watson y
Sparkman, 2007b).
La ionización por electrospray se puede aplicar a una gran variedad de muestras
líquidas y consiste en hacer pasar la muestra a través de una aguja hueca sometida
a un campo eléctrico (5-10 kV/cm), de forma que se forman pequeñas gotas
cargadas eléctricamente. Las gotas son de 1 μm de diámetro y tienen una carga neta
que hace que sean atraídas a un electrodo a través de una corriente de gas inerte.
Las gotas se mueven a contracorriente en el gas, el cual evapora parte del disolvente
en un proceso llamado desolvatación. Como consecuencia de esto, las gotas se
encojen y los iones que se encuentran en la superficie se ven forzados a
aproximarse entre sí hasta que, en cierto momento, la fuerza de repulsión entre ellos
se hace más fuerte que la tensión superficial que los mantenía unidos, provocando
Introducción
62
que las gotas se rompan en otras más pequeñas. Éstas continuarán perdiendo
disolvente hasta que los iones quedan en fase gaseosa y pasan al analizador (ver
Figura 25).
Figura 25. Representación esquemática de la ionización por electrospray.
El último avance de este tipo de ionización ha sido la introducción de microcapilares
de borosilicato recubiertos de oro para la inyección de la muestra en el
espectrómetro. A esta técnica se la ha denominado nanoelectrospray y permite
analizar volúmenes de muestra de 1 - 2 μL consiguiendo una sensibilidad del orden
de fentomoles (Wood et al., 2003).
La principal diferencia entre la ionización por ESI o por MALDI es que la ionización
por ESI suele generar iones con varias cargas (M + nH)n+ a diferencia de los iones
monocargados que se obtienen con la ionización MALDI. El espectro de masas que
se obtiene puede por tanto mostrar varios picos correspondientes a la misma
secuencia peptídica pero con diferentes cargas. Gracias a esto es posible analizar
muestras de alto peso molecular por espectrometría de masas dentro de un estudio
de intervalo de masas moderado.
Como se ha comentado anteriormente, los analizadores de masas más comunes que
suelen combinarse con la fuente de ionización por electrospray son los cuadrupolos,
las trampas iónicas o los instrumentos híbridos cuadrupolo-trampa iónica, los
cuadrupolo-tiempo de vuelo, y los triple cuadrupolo.
Introducción
63
ESPECTRÓMETRO DE MASAS CUADRUPOLO
El espectrómetro de masas cuadrupolar es uno de los analizadores de masas más
utilizados, ya que se trata de un instrumento compacto y robusto y, además, presenta
la ventaja de su elevada velocidad de barrido. Este analizador consta de cuatro
barras cilíndricas paralelas que actúan como electrodos. Las barras opuestas se
conectan eléctricamente, un par al polo positivo y el otro al negativo, y se le aplican
potenciales variables de corriente continua (DC) y de radiofrecuencia (AC) (ver
Figura 26).
Figura 26. Esquema de un analizador de tipo cuadrupolo.
Para obtener un espectro de masas con este dispositivo, los iones se aceleran en el
espacio entre las barras mediante un potencial de 5 a 10 V. Entre tanto, las tensiones
de corriente continua y alterna se incrementan simultáneamente manteniendo
constante su relación. Esto induce un movimiento ondulatorio en los iones
sincronizado en cada momento con el voltaje aplicado. Solo los iones de una
determinada relación m/z que oscilan de una manera moderada serán capaces de
atravesar completamente el canal central del analizador y llegar al detector.
En función de los potenciales DC y AC aplicados, seleccionamos aquellos iones que
nos interesan, por tanto este analizador actúa como un filtro y se puede usar en dos
modos de trabajo: (i) SIM, (single ion monitoring), donde se selecciona tan solo la
m/z del analito de interés, y (ii) barrido de iones, donde se recogen sucesivamente
todos los iones de un determinado rango de m/z (Gross, 2004; Dass, 2007a).
Introducción
64
ESPECTRÓMETRO DE MASAS DE TRAMPA IÓNICA
Una trampa de iones es un dispositivo en el que los cationes o aniones en estado
gaseoso pueden formarse y quedar retenidos durante largos periodos de tiempo por
la acción de campos eléctricos y/o magnéticos (ver Figura 27).
Figura 27. Diagrama esquemático de un analizador del tipo trampa iónica.
Este tipo de analizadores consta de un electrodo anular y un par de electrodos
colectores. Al electrodo anular se le aplica un potencial de AC variable mientras que
los dos electrodos colectores están conectados a tierra. Los iones con un valor de
m/z adecuado circulan en una órbita estable dentro de la cavidad que está rodeada
por el anillo. Cuando se incrementa el potencial de AC, las órbitas de los iones más
pesados llegan a estabilizarse, mientras que las de los más ligeros se desestabilizan
y atraviesan la salida hacia el exterior. Normalmente los iones son expulsados en
orden de m/z creciente mediante cambios graduales en los potenciales (Dass,
2007a).
Este tipo de analizadores se ha aplicado al estudio de los cambios postmortem en
músculo de trucha (Bauchart et al., 2007a), así como en la caracterización e
identificación de péptidos pequeños generados por digestión de pescado y carne
Introducción
65
(Bauchart et al., 2007b). En ambos casos, el uso de la trampa iónica se combinó con
la espectrometría de masas MALDI-TOF.
ESPECTRÓMETRO DE TRANSFORMADA DE FOURIER
La parte esencial de un instrumento de transformada de Fourier es una trampa de
iones en la que éstos circulan en órbitas bien definidas durante largos periodos.
Este analizador está basado en la acción que un campo magnético ejerce sobre una
partícula cargada (ión) que gira en un campo de radiofrecuencia. Por medio del
campo magnético, los iones son dirigidos al interior de una celda donde giran
describiendo una órbita de diámetro reducido y mínima frecuencia. Por aplicación de
una señal de radiofrecuencia, los iones son excitados a describir órbitas espirales de
amplitud creciente. Llega un momento en que la órbita descrita es tal que alcanza el
diámetro igual a la distancia de separación de dos electrodos detectores, momento
en el que los iones son detectados originando una imagen de corriente función
directa de su relación masa/carga. Esta imagen de corriente es integrada mediante
una transformada de Fourier y convertida en una señal proporcional a su intensidad.
La principal ventaja de este tipo de instrumentos está en la altísima precisión en la
medida de masas (> 0.001%) y en su poder de resolución casi ilimitado (superior a
106). Por el contrario, el nivel de vacío es un parámetro crítico y su coste es muy
elevado (Gross, 2004; Dass, 2007a).
ESPECTRÓMETRO DE MASAS ORBITRAP
Recientemente se ha introducido un nuevo tipo de espectrómetro de masas
denominado orbitrap (Hu et al., 2005). Este sistema se basa en una trampa en la que
los iones orbitan alrededor de un electrodo central axial con un campo electroestático
equilibrado con fuerzas centrífugas. La Figura 28, que representa un orbitrap,
muestra el electrodo central axial en forma de huso, situado dentro de un electrodo
exterior coaxial en forma de barril.
Los iones ‘atrapados’ experimentan una rotación alrededor del electrodo central
combinada con oscilaciones a lo largo de dicho eje. La frecuencia de esta oscilación
harmónica depende de la velocidad a la que se mueve el ión y es inversamente
Introducción
66
proporcional a la raíz cuadrada de la ratio masa/carga (m/z). Tanto los modos de
ionización MALDI como ESI se han combinado con el orbitrap en numerosas
aplicaciones. Una incorporación reciente al mundo de los espectrómetros de masas
en tándem es una trampa iónica lineal (LTQ) combinada con un orbitrap (Yates et al.,
2006). La principal característica de este instrumento es una trampa lineal curvilínea
que colecta los iones del LTQ y los inyecta ortogonalmente en el orbitrap.
Figura 28. Esquema básico de un orbitrap. Adaptación de una figura contenida en el artículo
The orbitrap: A new mass spectrometer (Hu et al., 2005).
ESPECTRÓMETRO DE MASAS TRIPLE CUADRUPOLO (QQQ)
Se trata de uno de los espectrómetros de masas en tándem más utilizados. En este
caso, la muestra se introduce en una fuente de ionización blanda y, seguidamente,
los iones son acelerados en la primera etapa, o separados de los iones progenitores
mediante un filtro de cuadrupolo ordinario. Los iones separados más rápidos pasan
entonces a un segundo cuadrupolo, que es una cámara de colisiones donde tiene
lugar la posterior ionización de los iones progenitores producida en el primer
cuadrupolo. El segundo cuadrupolo opera en modo de radiofrecuencia única, esto es,
no se aplica ningún potencial de corriente continua a las barras. Este sistema
proporciona un procedimiento muy eficaz para enfocar los iones dispersados pero no
Introducción
67
actúa como un filtro de masas. Se bombea helio a esa cámara, dando una presión de
10-3 a 10-4 torr. Aquí tiene lugar una posterior ionización como consecuencia de las
colisiones entre los iones progenitores, que se mueven rápidamente, con los átomos
de helio de la cámara. Los iones hijos resultantes, pasan al tercer cuadrupolo, donde
son sometidos a un barrido y registrados de la manera habitual (Dass, 2007b).
ESPECTRÓMETRO DE MASAS CUADRUPOLO Y TRAMPA IÓNICA EN TÁNDEM
Este tipo de espectrómetro de masas se caracteriza porque todos los pasos de
MS/MS se llevan a cabo en el mismo espacio pero siguiendo una secuencia
temporal. Un experimento típico de MS/MS en este tipo de instrumentos implica tres
etapas consecutivas: el aislamiento del ión, la excitación/disociación del ión y el
análisis de las masas de los iones producidos (Gross, 2004; Dass, 2007a). Esta
técnica se ha utilizado en la identificación de péptidos indicadores de adulteración en
carne con proteínas de soja (Leitner et al., 2006).
ESPECTRÓMETRO DE MASAS CUADRUPOLO Y TIEMPO DE VUELO EN
TÁNDEM
La forma más fácil de describir este tipo de instrumentos sería decir que se trata de
un triple cuadrupolo al cual se le ha sustituido la última sección del cuadrupolo por un
analizador de tiempo de vuelo. Muchas veces encontramos un cuadrupolo adicional
(Q0) con el fin de aportar humedad (no representado en la Figura 29) así que este
espectrómetro de masas consiste en tres cuadrupolos, Q0, Q1 y Q2, seguidos de un
analizador tipo TOF con una inyección de iones ortogonal. En el Q1 se consigue
aislar un determinado ión (ión precursor). Este ión se fragmenta en una celda de
colisión (Q2) aplicando una determinada energía por medio del gas de colisión
(normalmente helio) (ver Figura 29).
Los fragmentos generados característicos de nuestro analito se analizan en el
analizador de tiempo de vuelo tal y como se ha descrito anteriormente. En algunos
instrumentos comerciales, los cuadrupolos Q0 y Q2 se reemplazan por hexapolos,
pero su principio de funcionamiento es el mismo (Dass, 2007b).
Introducción
68
Figura 29. Esquema del funcionamiento de un espectrómetro de masas cuadrupolo tiempo de vuelo en tándem.
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II. Objetivos
Objetivos
89
Objetivos
A la vista de todo lo expuesto, en la presente tesis doctoral se plantean dos objetivos
principales:
1. Determinación de creatina y creatinina como marcadores de calidad de los
procesos de elaboración de jamón cocido y curado.
2. Identificación de los péptidos que se generan debido a la proteólisis sufrida por
acción de las peptidasas musculares durante el procesado de curado de jamón.
Para conseguir estos objetivos generales se han planteado los siguientes objetivos
parciales:
Desarrollo de un método cromatográfico para la determinación rápida de creatina
y creatinina, así como de otros compuestos de interés como son la carnosina,
anserina y balenina, como posibles marcadores de calidad de los productos
cárnicos.
Estudio de la distribución de la creatina y creatinina según el tipo de metabolismo
muscular.
Evaluación de la cocción en el proceso de fabricación de jamón cocido mediante
el establecimiento de una correlación entre la ratio creatinina/creatina y la
efectividad del tratamiento térmico.
Evaluación del efecto del procesado de curado de jamón sobre las
concentraciones de creatinina, creatina y su ratio, así como su posible utilidad en
el control de calidad del proceso.
Identificación de la secuencia completa de los péptidos generados en el jamón
curado empleando varias técnicas de proteómica como son la cromatografía
líquida acoplada a un analizador cuadrupolo-tiempo de vuelo en tándem y la
desorción/ionización por láser asistida por una matriz acoplada a un analizador
de tiempo de vuelo en tándem (MALDI-TOF/TOF).
90
III. Resultados
93
Parte 1 Determinación de creatina y creatinina como marcadores de calidad de los
procesos de elaboración de jamón cocido y curado.
La primera parte de esta Tesis doctoral compila los capítulos del 1 al 4, los cuales
describen los resultados obtenidos tras la consecución del primer objetivo, dando
lugar a cuatro publicaciones.
Durante la última década se ha puesto de manifiesto la importancia de desarrollar
nuevos métodos rápidos de análisis con el fin de controlar el proceso de elaboración
de productos cárnicos de una forma segura y eficiente. El desarrollo de nuevos
Capítulos 1, 2, 3 y 4
94
métodos contribuye a obtener resultados con mayor rapidez y, suponiendo en la
mayoría de los casos, además, un ahorro de material y horas de trabajo, lo que
resulta de gran utilidad en el análisis de un gran número de muestras.
La cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa es uno de los métodos
más utilizados para la separación de péptidos; sin embargo, este tipo de
cromatografía presenta limitaciones importantes ya que no es adecuada para la
separación de péptidos polares y de bajo peso molecular, los cuales no se retienen
en ese tipo de columnas. En ese sentido, la cromatografía de interacción hidrofílica
se complementa adecuadamente con la separación en fase reversa.
El método que se describe en el capítulo 1 constituye la primera aplicación de la
cromatografía de interacción hidrofílica en la separación de compuestos presentes en
la carne, permitiendo la separación de carnosina, anserina, balenina, creatina y
creatinina en tiempos muy cortos y con una elevada resolución gracias al pequeño
tamaño de las partículas de sílica que componen la columna. Las columnas
cromatográficas con tamaño de partícula pequeño (3 μm en lugar de las más
utilizadas de 5 μm) permiten una buena separación de estos compuestos en tiempos
cortos de elución. El principal inconveniente de trabajar con este tipo de columnas
radica en que la presión que se requiere para una velocidad lineal óptima aumenta
de forma inversamente proporcional al cubo del diámetro de la partícula; no obstante,
los equipos habituales de HPLC, que soportan presiones de hasta 600 bar, admiten
trabajar con columnas de 2,5 – 3 μm de tamaño de partícula sin tener que recurrir a
los instrumentos de última generación, que soportarían presiones de hasta 900 bar.
Como se ha comentado en la Introducción (página 36), la creatina y creatinina están
íntimamente relacionadas con el metabolismo energético muscular. Además, se sabe
que según el tipo de metabolismo que predomine, el músculo esquelético puede ser
oxidativo o glucolítico. Las interacciones entre el tipo de músculo esquelético, el
metabolismo energético y los distintos factores medioambientales son determinantes
para la transformación postmortem del músculo en carne.
Las propiedades metabólicas y contráctiles del músculo esquelético están
directamente relacionadas con el tipo de metabolismo energético del animal vivo.
Sus características fisiológicas explicarían la variabilidad en la respuesta metabólica
Parte 1
95
del tejido muscular durante el estrés antes del sacrificio, así como la velocidad y el
alcance de la caída postmortem de pH. Así pues, existe una importante relación
entre el metabolismo energético muscular de los animales vivos y su respuesta
metabólica ante el estrés durante el sacrificio, lo que condiciona la calidad final de la
carne.
A la hora de desarrollar un método rápido de control de calidad en la elaboración de
jamón cocido o curado basado en el análisis de compuestos bioquímicos
relacionados con el metabolismo muscular, es importante conocer el comportamiento
metabólico de los distintos tipos de músculo con el fin de determinar la mejor forma
de realizar la toma de muestra.
El capítulo 2 presenta los resultados obtenidos tras estudiar el contenido de estos
compuestos en los distintos músculos del cerdo incluyendo los principales músculos
del jamón. Así, además de conocer las diferencias significativas en cuanto al
contenido en creatina y creatinina en los distintos músculos, también se podrán
determinar las diferencias en cuanto a su naturaleza metabólica. De hecho, estudios
previos a éste habían relacionado el contenido de carnosina con el tipo de
metabolismo energético.
Una vez desarrollado un método cromatográfico sencillo, fiable, y rápido para el
análisis de creatina y creatinina, y tras conocer las concentraciones en estos
compuestos de los músculos del jamón y relacionarlas con el metabolismo
energético, se procedió al estudio del comportamiento de estos compuestos durante
la elaboración de jamón cocido y curado con el fin de utilizarlos como marcadores de
calidad de estos procesos.
En el proceso de elaboración del jamón cocido existen varias etapas críticas donde
se puede ver afectada la calidad y el rendimiento del producto. Uno de los principales
puntos críticos del proceso de elaboración se encuentra en la etapa de cocción, ya
que ésta es en gran parte responsable de los defectos que aparecen en el producto
final relacionados con la textura o la estabilidad del color. Aunque estos defectos son
los más comunes, una cocción insuficiente o incorrecta puede provocar también
alteraciones de sabor y olor, como pueden ser el sabor a viejo o rancio,
putrefacciones, etc. La importancia de estos defectos es notable ya que su presencia
Capítulos 1, 2, 3 y 4
96
conllevaría a la no aceptabilidad del producto por parte de los consumidores. Así
pues, un adecuado control de calidad de la etapa de cocción permitiría obtener un
producto más seguro y de mejor calidad organoléptica.
El objetivo del capítulo 3 ha sido establecer una relación entre la ratio
creatinina/creatina y la intensidad del tratamiento térmico, con el objetivo de emplear
esta ratio como marcador de calidad del proceso de cocción. Este estudio se ha
basado en la reacción no enzimática de conversión de creatina en creatinina, ambos
compuestos participantes en el metabolismo energético muscular. Así, sabiendo que
los músculos mayoritarios que forman parte del jamón presentan un comportamiento
metabólico similar de tipo glucolítico (capítulo 2), es posible dar los primeros pasos
en el desarrollo de un método de control de calidad basado en la toma de muestra en
la superficie del jamón, consiguiendo así evitar el tradicional método destructivo de
toma de muestra en el centro de la pieza.
Existen muchos tipos de jamón curado en el mercado debido a la heterogeneidad de
la industria de producción de jamón. Los procesos de elaboración del jamón varían
según las empresas, tanto por la tecnología empleada, el tiempo de salado o
contenido en sal, como por la temperatura y humedad relativas. Por otro lado, los
jamones curados típicos de cada región, como el jamón de Teruel, de Serón, o de
Trévelez, son productos muy heterogéneos con características particulares.
Hasta hace algunos años, la elaboración del jamón curado resultaba una tarea
sencilla; apenas existían controles y el proceso prácticamente se reducía a salar los
perniles y colgarlos a secar. Siendo baja la producción de jamones curados, no se
requería maquinaria y apenas mano de obra. Actualmente el nivel de producción ha
alcanzado cifras muy elevadas, lo que ha forzado el desarrollo de nuevas formas de
producción con el fin de abastecer esta demanda.
Un sistema óptimo para el control de calidad del jamón debería permitir diferenciar
entre distintas calidades y ser capaz de determinar si el producto final posee los
parámetros de calidad exigidos por el consumidor. Esta evaluación sería útil no sólo
para asegurar al consumidor que el producto se ajusta a los criterios deseados, sino
también para que la propia industria pueda tener un control sobre la calidad de las
piezas que comercializa. Así pues, a medida que el jamón curado ha ido adquiriendo
Parte 1
97
relevancia en el panorama alimentario español, ha surgido la necesidad de controlar
el proceso de curado con el fin de conseguir productos de mayor homogeneidad.
El capítulo 4 describe el estudio de la conversión de creatina en creatinina durante
distintos tiempos del proceso de producción de jamón curado, abriendo una vía para
emplear estos compuestos como marcadores de calidad del jamón y asegurar un
tiempo mínimo de curado de 7 meses.
98
Capítulo 1Determinación por cromatografía hidrofílica de carnosina, anserina, balenina,
creatina y creatinina.
Capítulo 1
101
Hydrophilic chromatographic determination of carnosine, anserine, balenine, creatine, and creatinine
Leticia Mora, Miguel Angel Sentandreu and Fidel Toldrá
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), P.O. Box 73, 46100 Burjassot,
Valencia, Spain
Received for review February 9, 2007. Revised manuscript received March 30, 2007. Accepted April 12, 2007.
Abstract
A new HPLC procedure based on hydrophilic interaction chromatography (HILIC) has been
developed for the simultaneous determination of carnosine, anserine, balenine, creatine, and
creatinine in meat. This is the first time that HILIC has been directly applied to the study of meat
components, having the advantage of not requiring complex clean up and/or sample derivatization
procedures. The chromatographic separation has been developed using a silica column (4.6 x 150
mm, 3 μm), and the proposed methodology is simple, reliable, and fast (< 13 min per sample). The
method has been validated in terms of linearity, repeatability, reproducibility, and recovery and
represents an interesting alternative to methods currently in use for determining the mentioned
compounds and other polar substances. The detection limits are 5.64, 8.23, 3.66, 3.99, and 0.06
μg/mL for carnosine, anserine, balenine, creatine, and creatinine, respectively.
Keywords: Hydrophilic interaction chromatography; HILIC; meat; histidine dipeptides; carnosine;
anserine; balenine; creatine; creatinine; peptides; polar compounds.
J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4664-4669
102
INTRODUCTION
The imidazole dipeptide carnosine (CAR), and its methylated analogues anserine
(ANS) and balenine (BAL) are histidine-containing dipeptides (Figure 1) widely
distributed in vertebrated animal tissues, especially in skeletal muscle, the heart and
the central nervous system (1).
Creatine (Cr) (Figure 1) and its phosphorylated derivative phosphocreatine (PCr) are
key components of the energy delivery process in several tissues, particularly those
characterized by a high and/or fluctuating energy demand (2).
On the other hand, creatine turns into creatinine (Cn) (Figure 1) in muscle due to a
non-enzymatic conversion by the removal of water and the formation of a ring
structure. This non-enzymatic conversion takes place easily under heating conditions
(3).
In view of the growing interest and the biological importance of biochemical
compounds such as carnosine, anserine, balenine, creatine, and creatinine, attention
has been focused on the development of analytical techniques to separate,
characterize, and quantify these compounds.
Techniques such as thin-layer chromatography and colorimetry have been used in
peptide separations for many years, but such procedures require long analysis times
and have poor resolution and low sensitivity. However, the versatility, short analysis
time, and high resolution of high-performance liquid chromatography (HPLC) have
made this technique the method of choice for the analysis of histidine dipeptides. In
fact, several HPLC methods have been described for the analysis of these
compounds in tissues of different mammalian species. These methods include ion-
exchange chromatography (IEC) applied to both underivatized (4) and postcolumn
derivatized peptides (5, 6) with UV, fluorescence, or pulsed amperometric detection.
Reverse-phase liquid chromatography (RP-HPLC) has been also employed for the
analysis of histidine dipeptides (7) in their precolumn derivatizatized forms (8).
Creatine and creatinine are commonly determined by using the Folin method, based
on the Jaffé reaction, which is the basis of some official methods (9). The reaction of
creatine with 1-naphtol and biacetyl (10), both through flow injection methodologies,
Capítulo 1
103
have been used for the simultaneous determination of creatine and creatinine in meat
and meat products (11, 12). Alternative techniques include ion-pairing applied to
reverse-phase chromatography (7, 13), a capillary isotachophoretic method (14) and
a spectrophotometric assay using enzyme-based systems (15).
Carnosine N-β-alanyl-L-histidine
Anserine N-β-alanyl-3-methyl-L-histidine
Balenine N-β-alanyl-1-methyl-L-histidine
Creatine N-(Aminoiminomethyl)-N-methylglycine
Creatinine 2-Amino-1-methyl-2-imidazolin-4-one
Figure 1. Chemical structures of carnosine, its methylated analogues anserine and balenine, creatine, and creatinine, the end product of creatine catabolism.
RP-HPLC has been a very useful technique for the isolation of peptide compounds,
having as its main advantage, apart from its powerful resolving capacity, the use of
volatile mobile phases that avoid the need for sample desalting. Although RP-HPLC
is a powerful separation technique, there is a major limitation consisting of the low
retention of polar molecules. In this case, normal-phase liquid chromatography
(NPLC) has been traditionally used to separate polar compounds with non-aqueous
mobile phases, but an important limitation is the difficulty in dissolving hydrophilic
compounds, such as peptides, in these phases. Moreover, this methodology is not
environmentally friendly. For these reasons, the application of NPLC to biological
samples is limited and, thus, rarely used for separating peptide mixtures (16).
J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4664-4669
104
Hydrophilic interaction chromatography (HILIC) constitutes an interesting alternative
to reverse-phase, ion-exchange, and normal-phase liquid chromatography for the
separation of such polar compounds for many reasons: (i) it implies the use of volatile
buffers, avoiding a desalting step; (ii) it has clear advantages with regard to the
solubility of biological compounds such as peptides; and (iii) there is no need of
compound derivatization. These advantages facilitate an easier sample processing
and compatibility with further mass spectrometry analysis, where a low amount of
volatile salt is allowed.
In HILIC, an initial mobile phase with a high content of an organic solvent is used to
promote hydrophilic interactions between the analyte and the polar hydrophilic
stationary phase. In this context, silica and amino columns with organic solvents
compatible with aqueous mobile phases offer potential use in the HILIC mode (17).
This chromatographic mode is similar to normal-phase chromatography because
polar compounds are retained longer than the non-polar ones and the polar
component of the mobile phase (usually water) is the strong solvent used to elute the
compounds. However, with regard to the solubility of analytes in the mobile phase
and matrix compatibility, HILIC is superior to normal-phase chromatography, as the
nature of the mobile phases that are used is comparable to reverse-phase
separations (16).
The objective of the present study was to develop a new method based on HILIC for
the analysis of small and highly hydrophilic relevant biochemical compounds such as
carnosine, anserine, balenine, creatine, and creatinine present in meat. The results of
this study demonstrate that a novel procedure based on hydrophilic chromatography
directly applied to a meat extract yields a simultaneous isolation and quantification of
the aforementioned compounds.
MATERIALS AND METHODS Chemicals and reagents All chemical and chromatographic reagents used were of HPLC grade. Acetonitrile
(ACN), ammonium acetate, glacial acetic acid and hydrochloric acid 37% were
Capítulo 1
105
purchased from Scharlau (Barcelona, Spain). Formic acid 50%, amonium formate for
mass spectrometry, trifluoroacetic acid and standards of carnosine and L-anserine
were from Sigma (St Louis, MO). Creatine and creatinine were purchased from Fluka
Chemie AG (Buchs, Switzerland).
Materials and instrumentation Pork loin and chicken breast were used to develop the method. These tissues were
chosen because of the differences existing between them for the analyzed
compounds (Figure 2). As has been demonstrated, anserine is predominant in non-
mammalian species such as chicken, whereas pork is one of the species with higher
balenine content (18, 19).
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
1 2
Mea
n (m
g/10
0g)
Carnosine
Anserine
Balenine
Creatine
Creatinine
Pork loin Chicken breast Figure 2. Levels of carnosine, anserine, balenine, creatine, and creatinine in pork loin and chicken breast determined by simultaneous separation using HILIC. Each value represents the mean of eight samples from different meat cuts, and labelled error bars indicate the standard deviation for each mesurement.
Chromatography was performed in a HPLC Agilent 1100 Series system (Agilent
Technologies, Palo Alto, CA) equipped with a quaternary pump (G1311A), an
J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4664-4669
106
autosampler (G1313A) and a vacuum degasser (G1379A). Ultraviolet detection was
made by a G1315B diode array detector, which was used in the range 195-300 nm.
Sample and standards preparation Samples were extracted and deproteinized following the method described by Aristoy
and Toldrá (20). Briefly, 5 g of sample tissue were homogenized with 3 volumes of
0.01 N HCl in a stomacher (Seward Laboratory) for 8 min and further centrifuged in
cold (4 ºC) at 10000 rpm for 20 min. Supernatant was filtered through glass wool, and
250 μL of this solution were deproteinized by adding 3 volumes of ACN, standing at 4
ºC for 20 min. Finally, the sample was centrifuged (10000 rpm) for 10 min at 4 ºC and
the supernatant directly analyzed. The rest of the meat extract was stored under
vacuum at -20 ºC until use.
The calibration ranges for the assayed compounds were established using a
duplicate set of standards. Carnosine, anserine, and creatinine calibration standards
were prepared by diluting a stock solution of 1 mg/mL. As balenine is not
commercially available, pork meat was used as the source of this compound because
of its high content. This standard solution was prepared according to the method of
Aristoy et al. (5) and further quantified, obtaining a mean value of 0.83 mg/mL. A
standard solution of creatine at 0.3 mg/mL was prepared because of the low solubility
of this compound in the injection solution (0.01 N HCl in water/acetonitrile, (25:75,
v/v)). Nevertheless, this concentration limit was enough to determine creatine levels
normally found in muscle tissue. Working standard solutions were prepared over the
appropriate concentration range by dilution of stock solutions. All stock solutions were
stored at -20 ºC until use.
Stability of the compounds under frozen storage The initial quantification was done immediately after extraction and deproteinization.
The remaining pork loin extracts were kept under frozen storage (-20 ºC) and further
analyzed after 2, 3, and 8 days. Each analysis was done in triplicate.
Capítulo 1
107
Statistical method: The ANOVA procedure was used to determine significant
differences between initial and after 2, 3, and 8 days quantifications using the
software Statgraphics Plus (v 5.1). Each statistical analysis was n = 3, and the
normality of the data was tested before application to the ANOVA procedure.
Description of the chromatographic method Carnosine, anserine, balenine, creatine, and creatinine were analyzed by HILIC.
Twenty microliters of each sample were injected into the HPLC system. The
chromatographic separation was developed using an Atlantis HILIC silica column (4.6
x 150 mm, 3 μm) from Waters (Milford, MA) at room temperature. Mobile phases
consisted of solvent A, containing 0.65 mM ammonium acetate, pH 5.5, in
water/acetonitrile (25:75), and solvent B, containing 4.55 mM ammonium acetate, pH
5.5, in water/acetonitrile (70:30). The solvents were filtered through a 0.22 μm
membrane filter and degassed prior to the analytical run. The separation conditions
were a linear gradient from 0% to 100% of solvent B in 13 min at a flow rate of 1.4
mL/min. The separation was monitored using a diode array detector at a wavelength
of 214 nm for creatine, carnosine, anserine, and balenine, whereas a wavelength of
236 nm was used for creatinine detection. Peak areas were correlated to compound
concentration by interpolation in the corresponding calibration curve (Figure 3). The
column was equilibrated for 5 min under the initial conditions before each injection.
RESULTS AND DISCUSSION Development of the chromatographic method To establish optimal conditions for the separation of carnosine, anserine, balenine,
creatine, and creatinine by hydrophilic chromatography, the effect of ion-pairing, pH
and ACN gradient were examined.
Ion-pairing and pH selection
The use of a buffered mobile phase is crucial to achieve an acceptable repeatability in
the chromatographic separation of charged compounds, because electrostatic
J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4664-4669
108
interactions between the analyte and the stationary phase are controlled by the buffer
nature. Therefore, an ion-pairing reagent is necessary because silanol groups,
present with functionalized silica-based materials, can interact with ionic residues of
compounds and then affect recovery and cause peak-tailing. For this reason,
trifluoroacetic acid (TFA), ammonium formate, ammonium acetate, acetic acid, and
formic acid were investigated to determine the appropriate reagent to eliminate ionic
interactions.
Creatininey = 62497x - 19,085
R2 = 0,9999
Carnosiney = 26681x + 145,87
R2 = 0,999
Anseriney = 21263x - 15,516
R2 = 0,9987
Baleniney = 17498x + 8,1626
R2 = 0,9997Creatine
y = 18014x + 63,123R2 = 0,9991
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6Concentration (mg/mL)
Are
a (m
AU
*s)
Carnosine
AnserineBalenineCreatine
Creatinine
Figure 3. Linearity range and regression of carnosine, anserine, balenine, creatine, and creatinine.
TFA has been widely used as an ion-pairing reagent because of its volatility,
transparency at 214 nm, and effectiveness for preventing ionic interactions. This acid
not only acts as an ion-pair agent to improve peak shapes of basic compounds on
silica-based column but also controls the pH of the mobile phases. In fact, a good
separation of standards of carnosine, anserine, balenine, creatine, and creatinine was
achieved using this reagent, but a decrease of the selectivity was observed when
these compounds were separated from a meat extract, possibly due to matrix effects.
Two alternative volatile salts, ammonium formate, and ammonium acetate, were
evaluated in the solvent system. However, both of them are less volatile than TFA
Capítulo 1
109
and both also absorb at 214 nm. In order to minimize absorption effects, lower
concentrations of salt were tested (< 6 mM). In the case of ammonium formate,
variable retention times owing to an insufficient buffering effect of the mobile phase
occurred at these low concentrations. Finally, a mobile phase containing ammonium
acetate was found to provide the best results in selectivity and reproducibility and
thus, this salt was selected for the development of the method. Acetic acid and formic
acid were also tested at a concentration of 0.1%, but this did not improve results
obtained with ammonium acetate (results not shown).
In addition to the type of salt, the effect of salt concentration on the separation profile
was also investigated by varying ammonium acetate concentrations along with the
chromatographic gradient. In this way, HILIC retention was inversely proportional to
the concentration of mobile phase, because increases in salt concentration resulted in
lower hydrophilicity. A final gradient from 0.65 to 4.55 mM ammonium acetate was
selected, providing an optimum analysis time of 13 min.
The pH value of the mobile phase has a significant impact on retention and selectivity
in hydrophilic chromatography by influencing solute ionization. Low-pH conditions
charge only basic and phosphorylated groups of peptides and amino acids. On the
other hand, at higher pH values, both acid and basic residues are charged (21, 22).
Ideal pH conditions in HILIC separation were investigated by changing the pH of the
mobile phase containing ammonium acetate. This pH was adjusted to 4.5, 5.0 and
5.5, using this factor to manipulate selectivity. In all cases, pH 5.0 offered the lowest
retention times for carnosine, anserine and balenine while keeping a good separation
of these compounds. However, a pH of 5.5 was finally selected because it provided
also the best selectivity for creatine and creatinine, which are eluted during the first 5
min of the chromatogram (results not shown).
Optimization of the separation
In HILIC, peptide retention times increase with increasing the polarity of both peptides
and the stationary phase, and with decreasing the aqueous content in the mobile
phase (16). For these reasons, in this study, the effect of ACN concentration on
peptide retention was also examined. The percentage of ACN was varied while
J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4664-4669
110
keeping a gradient of ammonium acetate concentration from 0.065 to 4.5 mM, which
was necessary to accommodate the low solubility of this salt in the high ACN content
of the initial mobile phase.
The injection solvent is also an important parameter in HILIC because, as in reverse-
phase chromatography, the injection solvent can strongly influence the peak shape of
the analytes. The injection solvent should be as close as possible to the initial mobile
phase, which must be adequate for solubilization of the compounds to analyze. In our
case, this was achieved at an initial concentration of 75% acetonitrile/25% water
solution.
Absorption at 214 nm was adequate for the determination of carnosine, anserine,
balenine, and creatine, but meat extracts showed interferences in the detection of
creatinine at this wavelength. To avoid this, creatinine was detected at 236 nm, where
this compound has another maximum of absorption (Figure 4B,C).
The final chromatographic conditions resulted in a good separation of the five
compounds, as can be observed in Figure 4A. Using these conditions, creatine and
creatinine eluted at 4.4 and 3.1 minutes, respectively, whereas carnosine, balenine
and anserine eluted, at 9.9, 10.9 and 11.9 min, respectively.
Method evaluation
(a) Linearity and calibration
Plots and respective regressions of carnosine, anserine, balenine, creatine, and
creatinine are shown in Figure 3. As can be observed, the linearity of the method for
all compounds was as good as results obtained with other methods (5, 8, 23).
However, this method has the advantage that no initial clean up and no derivatization
steps are required for sample processing.
(b) Detection limits (LOD)
The LOD for the different compounds was calculated in two different ways: First, the
LOD was established by analyzing 15 blank solutions without the analyte and
calculating the respective signal-to-noise ratios at the time windows where the
compounds are expected. For each compound, the LOD was set as 3 times the
Capítulo 1
111
signal-to-noise ratio. Second, increasing dilutions of pork loin and chicken breast
extracts were injected, confirming by this way, the detection limits calculated
previously. Finally, a comparison between the two methods was done, and similar
results were obtained. LODs obtained for carnosine, anserine, balenine, creatine, and
creatinine were 5.64, 8.23, 3.66, 3.99 and 0.06 μg/mL (with relative standard
deviations of 17.68, 14.94, 19.98, 19.16 and 14.88, respectively).
(c) Repeatability
A repeatability study of the developed method was done. In this study, six samples
from the same pork loin and six samples from the same chicken breast were
processed to estimate the mean concentration of carnosine, anserine, balenine,
creatine and creatinine, together with standard deviations and coefficients of variation
(Table 1). The different measurements were done by the same analyst on the same
instrument, on the same item, and under the same conditions. The standard deviation
under repeatability conditions is often used as a measure of precision, and good
results have been obtained in comparison to those reported previously using other
techniques (6, 8). Because of the lower mean concentration of anserine in pork loin
and balenine in chicken breast, their coefficients of variation were slightly higher but
always within acceptable values (Table 1).
(d) Reproducibility
Reproducibility of the method was tested by successive analysis of the five
compounds of interest in eight samples from pork loin and eight from chicken breast
within 30 days. Each analysis was taken on identical animal samples but under
different conditions (different operators and apparatus, different times and interday).
Data, shown in Table 2, demonstrated a very good reproducibility from one analysis
to another. Results obtained agree with those reported by many other authors when
quantification of these histidine-containing dipeptides was done using other
techniques (5, 18, 19, 24) and are also comparable for those of creatine and
creatinine (3, 15).
J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4664-4669
112
Table 1. Repeatability (n = 6) for the analysis of carnosine, anserine, balenine, creatine and creatinine in pork loin and chicken breast.
Mean (mg/100g)a SDb CV (%)c
Pork loinCarnosine 462.33 16.86 3.65Anserine 10.76 1.23 11.44Balenine 33.40 1.88 5.62Creatine 427.32 12.66 2.96Creatinine 5.71 0.34 5.87
Chicken breastCarnosine 149.89 6.05 4.04Anserine 677.49 28.61 4.22Balenine 5.41 0.67 12.31Creatine 336.24 12.38 3.68Creatinine 1.78 0.13 7.31a Means expressed as mg/100g of muscle. Each value represents the mean of sixsamples from the same meat cut. b Standard deviation. c Coefficient of variation.
Table 2. Reproducibility (n = 8) obtained for the analysis of carnosine, anserine, balenine, creatine and creatinine in pork loin and chicken breast.
Mean (mg/100g)a SDb CV (%)c
Pork loinCarnosine 398.59 22.77 5.71Anserine 13.54 1.95 14.41Balenine 28.49 2.23 7.83Creatine 393.83 10.00 2.54Creatinine 4.63 0.15 3.18
Chicken breastCarnosine 149.27 7.06 4.73Anserine 675.59 33.32 4.93Balenine 5.50 0.61 11.04Creatine 335.73 14.58 4.34Creatinine 1.76 0.14 7.94a Means expressed as mg/100g of muscle. Each value represents the mean of eightsamples from the same meat cut. b Standard deviation. c Coefficient of variation.
Capítulo 1
113
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Time (min)
Abs
orpt
ion
(mA
U) a
t 214
nm
0
300
600
900
1200
1500
Absorption (m
AU
) at 236 nm
Cn
Cr
A)
CAR
BAL
ANS
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Time (min)
Abs
orpt
ion
(mA
U) a
t 214
nm
0
20
40
60
80
Absorption (m
AU
) at 236 nm
B)
ANS
BAL
CAR
Cr
Cn
0
200
400
600
800
1000
1200
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13Time (min)
Abs
orpt
ion
(mA
U) a
t 214
nm
0
5
10
15
20
25
Absorption (m
AU
) at 236 nm
Cn
C)
Cr
CA
R
BAL
ANS
Figure 4. (A) Chromatogram corresponding to the separation of the standards of the five compounds determined with the HILIC method developed in this work. (B) Chromatogram corresponding to a pork loin sample and (C) Chromatogram corresponding to a chicken breast sample. In all cases carnosine (CAR), anserine (ANS), balenine (BAL) and creatine (Cr) were detected at 214 nm (solid line), whereas creatinine (Cn) was detected at 236 nm (dotted line).
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114
(e) Recovery and matrix effects
Recovery was determined in five sets of pork loin and chicken breast, one set for
each one of the studied compounds. Samples were enriched with standard solutions
of the different compounds in order to yield concentrations equivalent to 0.5, 1, and
1.5 times the main value obtained in reproducibility studies. At each level, analysis
were performed in duplicate, and recoveries were calculated by comparison with a
blank meat sample. The percentage of recovery determined in each case is shown in
Table 3. Table 3. Recovery of carnosine (CAR), anserine (ANS), balenine (BAL), creatine (Cr) and creatinine (Cn) obtained in pork loin and chicken breast.
Pork loin (n = 3) Chicken breast (n = 3)Added* Theoretical Recovered* Recovery (%) Added* Theoretical Recovered* Recovery (%)
value* value*CAR 0.1 0.309 0.308 99.67 0.05 0.162 0.160 98.89
0.2 0.409 0.395 96.71 0.15 0.262 0.252 96.050.35 0.559 0.531 95.13 0.225 0.337 0.339 100.64
ANS 0.05 0.063 0.065 103.71 0.2 0.584 0.577 98.870.10 0.113 0.116 102.42 0.4 0.784 0.803 102.470.20 0.213 0.203 95.49 0.8 1.184 1.165 98.42
BAL 0.0005 0.0261 0.0260 99.63 0.002 0.0066 0.0061 92.540.0010 0.0266 0.0231 86.93 0.00 0.0086 0.0085 98.270.0020 0.0276 0.0276 100.28 0.01 0.0126 0.0118 93.40
Cr 0.10 0.293 0.293 99.96 0.10 0.315 0.318 100.970.26 0.622 0.674 108.40 0.26 0.480 0.432 90.170.53 0.886 0.878 99.15 0.53 0.744 0.751 100.98
Cn 0.0015 0.0066 0.0066 100.21 0.0005 0.0021 0.0022 107.310.0030 0.0081 0.0088 108.71 0.0010 0.0026 0.0028 107.810.0060 0.0111 0.0106 95.42 0.0020 0.0036 0.0038 105.98
* Values expressed as mg of analyte/mL of injection solvent. Each value corresponds to three replicates at each concentration level. In this way, the matrix effect of meat was evaluated on compound recoveries, and it
was concluded that different meat matrices did not affect the quantification of the
analytes, mainly because of the absence of intermediate steps in sample processing,
which is a remarkable advantage with respect to previous existing methods used to
quantify these compounds(8, 25).
Capítulo 1
115
Stability of the analyzed compounds under frozen storage
The stability of the histidine dipeptides, together with creatine and creatinine, in a pork
loin extract was investigated up to 8 days. A comparison between the obtained results
is showed in Figure 5. As can be observed, when meat was stored for 8 days under
freezing conditions, no significant differences (P < 0.05) were observed in the levels
of the five compounds along this storage time.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
1 2 3 8Days
Mea
n (m
g/10
0g)
Carnosine
Anserine
Balenine
Creatine
Creatinine
Figure 5. Stability of a pork loin sample whithin 8 days. Each value represents the mean of three samples from the same meat cut, and labelled error bars indicate the standard deviation for each measurement. No significant differences (P < 0.05) between initial and final conditions were found.
CONCLUSION HILIC constitutes a new and simple methodology for the separation of polar
compounds. It requires minimal sample manipulation, thus avoiding the need for
solid-phase extraction and derivatization steps. The method developed in this work
for the analysis of carnosine, anserine, balenine, creatine, and creatinine is simple,
fast (< 13 min per sample), reliable, and easily applicable for any laboratory having
conventional standard HPLC equipment. Furthermore, this method allows the use of
J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4664-4669
116
low concentrations of salt, which avoids ionization suppression in ESI (26, 27) and
thus makes it suitable for further LC-MS analysis.
This is the first time that a separation using HILIC has been developed for the
simultaneous determination of carnosine, anserine, balenine, creatine, and creatinine
in meat samples. Adequate levels of linearity, recovery, reproducibility, and sensitivity
prove that the proposed method is a good alternative for isolating and quantifying
these compounds in complex matrices such as meat.
ACKNOWLEDGEMENTS Scholarship FPU from Ministerio de Educación y Ciencia (Spain) to L.M. and an I3P-
CSIC contract from the European Social Fund to M.A.S., are fully acknowledged.
Work was supported by Agroalimed grant from Consellería de Agricultura, Pesca y
Alimentación (Generalitat Valenciana, Spain).
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Capítulo 1
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Capítulo 2Contenido de creatina, creatinina y carnosina en músculos de cerdo de
distinto tipo metabólico
Capítulo 2
121
www.elsevier.com/locate/meatsci
Contents of creatine, creatinine and carnosine in porcine
muscles of different metabolic types
Leticia Mora, Miguel Angel Sentandreu and Fidel Toldrá
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), P.O. Box 73, 46100 Burjassot, Valencia, Spain
Received for review May 25, 2007. Revised manuscript received October 31, 2007. Accepted
November 2007.
Abstract
Creatine, creatinine and carnosine have been analyzed by hydrophilic interaction chromatography
(HILIC) in seven different pork muscles of different metabolic type (Semimembranosus, Biceps
femoris, Gluteus maximus, Longissimus dorsi, Gluteus medius, Trapezius and Masseter). As
reported in previous literature, carnosine contents are related with the type of metabolism, being
higher in those muscles with glycolytic metabolism. Creatine and creatinine also showed significantly
higher concentrations in glycolytic muscles such as Semimembranosus, Biceps femoris, Gluteus
maximus and Longissimus dorsi. Masseter, a red oxidative muscle, was characterized by the lowest
contents of creatine, creatinine and carnosine and, finally, Gluteus medius and Trapezius, both
intermediate muscles, had also intermediate contents of these studied compounds. Finally, a
correlation between initial content of creatine and creatinine formation after cooking has been
verified using pure standards and two different metabolic type muscles, Longissimus dorsi and
Masseter, obtaining slightly higher creatinine amounts in Longissimus dorsi, probably due to its
higher initial creatine content and its lower pH.
Keywords: HILIC; Hydrophilic interaction chromatography; Muscle; Metabolic type; Carnosine;
Creatine; Creatinine.
Meat Sc. 2008, 79, 709-715
122
INTRODUCTION
Carnosine is an histidine-containing dipeptide widely distributed in vertebrate animal
tissues, especially skeletal muscle, heart and the central nervous system (Crush,
1970).
Creatine and its phosphorylated derivative phosphocreatine are key components of
the energy delivery process in several tissues, particularly those characterized by the
transfer of high energy phosphate to ADP in muscle cells (Wyss & Kaddurah-Daouk,
2000). These compounds play an important role in the energy metabolism of skeletal
muscle, taking part in the post-mortem biochemical processes occurring immediately
after slaughter (Toldrá, 2006). There is also extensive evidence that, under some
circumstances, creatine supplements can enhance muscle performance (Demant &
Rhodes, 1999).
On the other hand, creatine turns into creatinine in muscle due to a non-enzymatic
conversion by the removal of water and the formation of a ring structure. This
conversion takes place easily under heating conditions such as meat cooking. The
presence of creatine and creatinine in meat has also been associated to negative
aspects because creatine and creatinine can constitute important precursors of
heterocyclic amines (HAs), which can be formed on the surface of meat when cooked
at high temperatures using dry-heat such as in roasting, frying and grilling (Pais,
Salmon, Knize & Felton, 1999).
Skeletal muscles consist of various fibre types, which differ in their contractility, their
metabolism and other properties. Contractile and metabolic properties of skeletal
muscle may strongly affect the pattern of energy metabolism in live animal, as well as
during the post-mortem conversion of muscle to meat. Therefore, the metabolic type
of the muscle is one of the main factors involved in the variability of meat quality
(Valin, Touraille, Vigneron & Ashmore, 1982; Karlsson, Klont & Fernández, 1999).
Several authors have used myoglobin concentration and lactate dehydrogenase
activity as an approximation to the glycolytic or oxidative pattern of the muscle
(Leseigneur-Meynier & Gandemer, 1991; Flores, Alasnier, Aristoy, Navarro,
Gandemer & Toldrá, 1996). The myoglobin content is closely related to the oxidative
Capítulo 2
123
pattern of the muscles whereas lactate dehydrogenase activity is an indicator of its
glycolytic potential (Flores et al., 1996). In this way, porcine Longissimus dorsi,
Semimembranosus and Biceps femoris were classified as glycolytic muscles while
Masseter and Trapezius were assigned to the oxidative metabolism group. On the
other hand, Leseigneur-Meynier and Gandemer (1991) consider three types of
metabolism in pork: (i) glycolytic, with Longissimus dorsi; (ii) oxidative, with Masseter;
and (iii) an intermediate one including Trapezius.
The content of natural dipeptides is significantly lower in oxidative muscles (Aristoy &
Toldrá, 1998). These results agree with those reported by Cornet and Bousset
(1998), who demonstrated that the content of several amino acids in muscle are
closely related to the metabolic type of fibres. Both authors established that the
highest carnosine amounts were found in glycolytic muscles, so that the content of
the natural dipeptide carnosine constitutes a good indicator of muscle glycolytic
activity.
The main objective of the present study was to determine by means of a recently
developed methodology using hydrophilic interaction chromatography (HILIC) the
content of creatine, creatinine and carnosine on seven different pork muscles
(Semimembranosus, Biceps femoris, Gluteus maximus, Longissimus dorsi, Gluteus
medius, Trapezius and Masseter), chosen to represent the three main metabolic
types, in order to evaluate the relation between the total content of these compounds
and the type of muscle metabolism. In addition, pure standards and Longissimus
dorsi and Masseter pork muscles, with glycolytic and oxidative metabolism
respectively, were cooked and analysed in order to establish a relation between initial
amounts of creatine and the formation of creatinine after cooking.
MATERIALS AND METHODS Chemicals and reagents All chemical and chromatographic reagents were of HPLC grade. Acetonitrile,
ammonium acetate and glacial acetic acid were purchased from Scharlau (Barcelona,
Meat Sc. 2008, 79, 709-715
124
Spain). Creatine and creatinine standards were from Fluka Chemie AG (Buchs,
Switzerland).
Materials Seven muscles, Semimembranosus, Biceps femoris, Gluteus maximus, Longissimus
dorsi, Gluteus medius, Trapezius and Masseter, obtained each from four different
porcine carcasses, from 6-month old female pigs, were used to detect significant
differences in creatine, creatinine and carnosine content according to the type of
muscle. These muscles were chosen in order to cover a broad range of metabolic
types according to the description carried out by Leseigneur-Meynier and Gandemer
(1991), Cornet and Bousset (1998) and Karlsson et al., (1999).
Sample and standards preparation Standards preparation
The calibration ranges for the assayed compounds were established using a
duplicate set of standards. Carnosine and creatinine calibration standards were
prepared by diluting a stock solution of 1 mg/mL. A standard solution of creatine at
0.3 mg/mL was prepared because of the low solubility of this compound in the
injection solution (0.01 N HCl in water/acetonitrile, (25:75, v/v)). Working standard
solutions were prepared over the appropriate concentration range by dilution of stock
solutions. All stock solutions were stored at -20 ºC until use.
On the other hand, in order to study the influence of initial creatine amounts in the
formation of creatinine after cooking, standards of creatine were prepared at three
levels, 0.25, 0.5 and 0.75 mg/mL, that correspond to 100, 200 and 300 mg/100g of
muscle, respectively. These concentrations were selected because they covered the
usual range of creatine concentration in pork meat and its derived products (Macy,
Naumann & Bailey, 1970; Del Campo, Gallego, Berregi & Casado, 1998; Kvasnicka &
Voldrich, 2000). The effect of initial creatine amounts on the creatinine formation was
studied at 72 ºC during 10, 16, 30 and 60 min and during 30 min at 60, 65, 72 and 80
ºC. These assays were carried out in 1 mL sealed tubes, introducing the standards in
a water bath (Tectron Bio, Selecta, (Barcelona, Spain)) and holding them at 72 ºC for
Capítulo 2
125
the specified times and during 30 min at the temperatures above mentioned. After the
heating treatment, the standards were cooled to 0 ºC in an ice bath in order to
decrease the temperature as soon as possible to stop the creatine conversion to
creatinine.
Finally, in order to study the effect of cooking in the creatine conversion to creatinine
under controlled conditions of pH, temperature and time, standards of creatine and
creatinine were prepared at similar concentrations to those expected in raw
Longissimus dorsi: 0.875 mg/mL of creatine and 0.02 mg/mL of creatinine. The effect
of cooking on the creatinine formation was established under the same cooking
conditions described in ‘Longissimus dorsi and Masseter pork muscles processing’
section.
Pork muscles preparation for analysis
The muscles Semimembranosus, Biceps femoris, Gluteus maximus, Longissimus
dorsi, Gluteus medius, Trapezius and Masseter, were excised from four pork
carcasses at 24 h post-mortem and immediately processed for further analysis
following the method described by Aristoy and Toldrá (1991) with some minor
changes. Briefly, 5 g of sample tissue were homogenized with 20 mL of 0.01 N HCl in
a Stomacher (Seward Laboratory) for 15 min and further centrifuged in cold (4 ºC) at
10000 rpm for 20 min. Supernatant was filtered through glass wool and 250 μL of this
solution were deproteinized by adding 3 volumes of acetonitrile, standing at 4 ºC for
20 min. Finally, the sample was centrifuged (10000 rpm) for 10 min at 4 ºC and the
supernatant directly analyzed. All the process was done in a cold-storage room at 5
ºC in order to avoid possible influences of higher temperatures at the laboratory.
Longissimus dorsi and Masseter pork muscles processing
Two different metabolic type muscles were chosen in order to study the conversion of
creatine to creatinine under controlled conditions of pH, temperature and time. So,
Longissimus dorsi, a white glycolytic muscle, and Masseter, a red oxidative one, were
cut in 2 mm thick slices and the effect of cooking conditions on the creatinine
formation was established holding the samples at 72 ºC during 0, 3, 7, 12, 16, 30 and
Meat Sc. 2008, 79, 709-715
126
60 min and during 12 min at 24, 60, 72, 80 and 90 ºC, always under controlled pH
conditions. In fact, the pH was determined at each point of the experiment to ensure
that no change in pH had occurred as a result of creatine conversion to creatinine.
These assays were carried out in a water bath (Tectron Bio, Selecta, (Barcelona,
Spain)) under controlled conditions of temperature. The use of thin slices allowed us
to establish an immediate heat transfer between bath water and muscle slices. At the
end of the different incubation periods, the samples were cooled to 0 ºC in an ice bath
in order to decrease the temperature as soon as possible and stop the creatine
conversion to creatinine. Samples were prepared for analysis as previously described
for pork muscle samples.
Description of the chromatographic method Carnosine, creatine and creatinine were analyzed by hydrophilic interaction
chromatography (HILIC) according to Mora, Sentandreu and Toldrá (2007). Briefly, 20
μL of each sample were injected into the HPLC system. The chromatographic
separation was developed using an Atlantis HILIC Silica column (4.6 x 150 mm, 3
μm) together with an Atlantis HILIC Silica guard column (4.6 x 20 mm, 3 μm) both
from Waters (Massachusetts, USA). Mobile phases consisted of solvent A, containing
0.65 mM ammonium acetate, pH 5.5, in water/acetonitrile (25:75), and solvent B,
containing 4.55 mM ammonium acetate, pH 5.5, in water/acetonitrile (70:30). The
separation conditions were a linear gradient from 0% to 100% of solvent B in 13 min
at a flow rate of 1.4 mL/min. The separation was monitored at a wavelength of 214
nm for creatine and carnosine, whereas a wavelength of 236 nm was used for
creatinine detection. Peak areas were correlated to compound concentration by
interpolation in the corresponding calibration curve. The column was equilibrated for
10 min under the initial conditions before each injection.
Chromatography was performed in a HPLC Agilent 1100 Series system (Agilent
Technologies, Palo Alto, CA, USA) equipped with a quaternary pump (G1311A), an
autosampler (G1313A) and a vacuum degasser (G1379A). Ultraviolet detection was
made by a G1315B diode array detector, which was used in the range 195-300 nm.
Capítulo 2
127
Statistical method The ANOVA procedure was used to determine significant differences between type of
muscle and measured compounds using the software Statgraphics Plus (v 5.1). Each
statistical analysis was done using four samples for each muscle type (n = 4) and the
normality of the data was tested before applying the ANOVA procedure.
RESULTS AND DISCUSSION Several pork muscles having different glycolytic/oxidative metabolic patterns have
been analysed for their contents in carnosine, creatine and creatinine. The results are
shown in Table 1, where muscle types Semimembranosus, Biceps femoris, Gluteus
maximus, Longissimus dorsi, Gluteus medius, Trapezius and Masseter have been
arranged according to their content in carnosine.
Table 1. Carnosine, creatine and creatinine content in seven pork musles having different metabolic patterns.
Muscle type Mean SD CV Mean SD CV Mean SD CVSemimembranosus 419.41a 46.06 10.98 373.76a 10.88 2.91 9.06a 0.18 1.98Biceps femoris 367.53b 44.03 11.98 343.03b 16.16 4.71 7.84b 0.39 5.04Gluteus maximus 326.42c 11.16 3.42 344.18b 7.56 2.20 7.46b 0.06 0.79Longissimus dorsi 324.48c 22.88 7.05 351.82b 16.9 4.80 8.37c 0.97 11.56Gluteus medius 259.49d 3.76 1.45 324.93c 0.98 0.30 6.55d 0.15 2.35Trapezius 210.84e 6.84 3.24 298.21d 6.94 2.33 5.46e 0.33 5.97Masseter 13.55f 0.75 5.50 247.45e 4.72 1.91 3.34f 0.28 8.36Different letters within the same column mean significant differences (p < 0.05).Results espressed as means of four muscles of each type (in mg/100 g muscle) with standard deviation(SD) and coefficient of variation (CV, as %).
Carnosine Creatine Creatinine
The results obtained agree with those reported by other authors for the quantification
of this peptide (Carnegie, Hee & Bell, 1982; Aristoy & Toldrá, 1998; Cornet &
Bousset, 1998). Gluteus maximus and Longissimus dorsi present a similar content of
carnosine (326.42 and 324.48, respectively). Reports regarding creatine and
creatinine contents in different pork muscles are scarce in literature although Harris,
Meat Sc. 2008, 79, 709-715
128
Lowe, Warnes and Orme (1997), Purchas, Rutherfurd, Pearce, Vather and Wilkinson
(2004), and Pegg, Amarowicz and Code (2006) had reported creatine and creatinine
contents in other species.
The results of the analysis of variance show that muscle type has a significant effect
on the content of the measured compounds carnosine, creatine and creatinine.
Among these, the analysis revealed substantial differences in the content of
carnosine according to the type of muscle (p < 0.05) as reported in the literature
(Aristoy et al., 1998; Cornet & Bousset, 1998). The highest contents of carnosine
were found in glycolytic muscles such as Semimembranosus, Biceps femoris,
Gluteus maximus and Longissimus dorsi, and the lowest contents of carnosine
appeared in oxidative muscles such as Masseter. Finally, muscles Gluteus medius
and Trapezius, with an intermediate metabolism, also showed an intermediate
content of carnosine. According to Suzuki, Ito, Mukai, Takahashi and Takamatsu
(2002), higher carnosine contents in glycolytic muscles seem to be because the
physicochemical buffering capacity of carnosine is more required for glycolytic
muscles, where its higher dependence on anaerobic metabolism increases the lactic
acid accumulation. In fact, these authors reported that carnosine concentration could
be an important factor in determining the high-intensity exercise performance.
The analysis of variance also revealed significant differences in creatine and
creatinine content depending on the type of muscle (p < 0.05). In this way, the highest
contents of creatine, as also seen with carnosine, were found in glycolytic muscles
Semimembranosus, Longissimus dorsi, Gluteus maximus and Biceps femoris. This
could be due to the highest dependence of glycolytic muscles on anaerobic
metabolism. In fact, the greater values of creatine could come from its phosphorilated
form phosphocreatine, which is involved in the transfer of high energy phosphate to
ADP.
In this study, it has been observed that as long as the amounts of carnosine
increases with the glycolytic activities of the muscle, also creatine and creatinine
contents increase in this type of metabolism. However, this tendency has not been
observed in the case of oxidative muscles like Masseter, which presents the lowest
content of carnosine and, despite this, considerable amounts of creatine. Fig. 1
Capítulo 2
129
shows the ratios of creatinine/creatine in the studied muscles. The purpose to use the
ratio was to eliminate the variations in creatinine amounts that could occur because of
differences in the initial content of protein in the different muscles. As can be
observed, ham muscles (Semimembranosus, Biceps femoris, Gluteus maximus and
Gluteus medius) together with Longissimus dorsi, present the highest ratios mainly
due to their high content of creatinine (see Table 1), whereas Masseter presents the
lowest ratio in accordance to its low creatinine content.
Figure 1. Creatinine/creatine ratios in seven different pork muscles. Each value represents the mean of four muscle samples from different carcasses and labelled error bars indicate the standard deviation for each measurement. Bars without a common letter indicate significant differences (p < 0.05). SM: Semimembranosus, BF: Biceps femoris, GM: Gluteus maximus, LD: Longissimus dorsi, Gm: Gluteus medius, T: Trapezius and M: Masseter.
Many authors (Edgar & Shiver, 1925; Fuller & Elia, 1988; Kvasnicka et al., 2000)
reported the influence of pH, temperature and time in creatine conversion to
creatinine. According to the literature, all authors agree that creatine contents
decrease after cooking, while creatinine contents increase, presumably due to the
heat-induced conversion of creatine to creatinine (Macy et al., 1970; Purchas,
0.000
0.004
0.008
0.012
0.016
0.020
0.024
0.028
SM BF GM LD Gm T M
Rat
io (C
reat
inin
e/C
reat
ine)
a a, b
b, c
a
cd
e
Meat Sc. 2008, 79, 709-715
130
Busboom & Wilkinson, 2006). It has also been reported that the increase in creatinine
concentration with cooking was appreciably greater than the decrease in creatine
(Macy et al., 1970; Pegg et al., 2006; Purchas et al., 2006).
Thus, a study with standards of creatine was done in order to relate initial amounts of
creatine with creatinine formation after cooking. This study has been done under
controlled conditions of temperature, time and pH. Fig. 2A shows the catalysis of this
non-enzimatic reaction at a constant temperature of 72 ºC and increasing times. Fig. 2B shows creatinine formation under a constant time of 30 min and at different
temperatures.As can be observed, a correlation between initial content of creatine
and creatinine formation after cooking has been verified in both conditions, at
constant temperature (Fig. 2A) and at constant time (Fig. 2B). As can be observed in
Fig. 2A, significant differences between time and creatinine concentration has been
obtained. Fig. 2B also shows significant differences between temperature and
creatinine concentration. This indicates that initial creatine amounts, apart from pH,
temperature and time, constitute a decisive factor for the creatinine production. In this
way, muscle samples with the highest contents of initial creatine amounts also should
show the greatest creatinine values after cooking.
In order to verify the correlation between initial creatine amounts and creatinine
formation after cooking, the ratio of creatinine/creatine was studied under controlled
conditions of pH, temperature and time using pure standards and Longissimus dorsi
and Masseter pork muscles.
The effect of time on the ratio of creatinine/creatine was assayed at a constant
temperature of 72 ºC. As can be observed in Fig. 3A, increasing values of creatinine
were obtained with time of cooking and a linear relation between creatinine/creatine
ratio and time could be established in pure standards, Longissimus dorsi and
Masseter.
On the other hand, the effect of temperature on creatinine formation under constant
time conditions was also studied. As can be observed, a non-lineal relation between
creatinine/creatine ratio and temperature was obtained (Fig. 3B). No significant
differences in creatinine formation were observed below 72 ºC, but when this
temperature was reached, an inflexion followed by a high positive slope was
Capítulo 2
131
observed in both pure standards and muscle samples. This clearly shows an increase
in creatinine formation at temperature values higher than 72 ºC.
0
0,0005
0,001
0,0015
0,002
0,0025
0,003
0,0035
0,004
0,0045
0,005
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8Creatine (mg/mL)
Cre
atin
ine
(mg/
mL)
60 minutes30 minutes16 minutes10 minutes
A)
0
0,0005
0,001
0,0015
0,002
0,0025
0,003
0,0035
0,004
0,0045
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8Creatine (mg/mL)
Cre
atin
ine
(mg/
mL)
80ºC72ºC65ºC60ºC
B)
Figure 2. Effect of initial amount of creatine on the formation of creatinine in pure standard solutions of creatine (0.25, 0.50, and 0.75 mg/mL) under controlled conditions of temperature and time. (A) At a constant temperature of 72 ºC along different times of incubation (10, 16, 30 and 60 min) and (B) At several temperatures (60, 65, 72, 80 ºC) during 30 min. The initial creatine solutions contained no creatinine. Labelled error bars indicate the standard deviation for each measurement.
Meat Sc. 2008, 79, 709-715
132
In all the performed experiments (Figs. 3A and 3B), significant differences were
detected between muscle samples and standards.
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Time (minutes)
Rat
io (C
reat
inin
e/C
reat
ine)
Longissimus dorsi
Masseter
Pure standards
A)A)
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temperature (ºC)
Rat
io (C
reat
inin
e/C
reat
ine)
Longissimus dorsiMasseterPure standards
B)B)
Figure 3. Effect of time and temperature on creatinine/creatine ratio in a pure standard solution (0.875 mg/mL of creatine and 0.02 mg/mL of creatinine) and Longissimus dorsi and Masseter pork muscle slices. (A) At a constant temperature of 72 ºC along different incubation times (0, 3, 7, 12, 16, 30 and 60 min) and (B) At several temperatures (24, 60, 72, 80 and 90 ºC) during 12 min. Labelled error bars indicate the standard deviation for each measurement.
Capítulo 2
133
Higher creatinine/creatine ratios were obtained in all the experiments when cooking
pork Longissimus dorsi samples in comparison to pure standards despite the similar
initial creatine and creatinine amounts present in both assays. The differences in
creatine conversion could be due to the pH differences existing between Longissimus
dorsi (5.6) and standards solution (6.3). In fact, many authors establish that acid
media increases the creatine conversion to creatinine. So, according to Edgar and
Shiver (1925), creatine is practically quantitatively converted to creatinine in acid
solution and thus, acid media could be an explanation for the unilateral conversion of
creatine to creatinine (Fuller & Elia, 1988).
On the other hand, although Longissimus dorsi and Masseter present a very similar
behaviour, Figs. 3A and 3B show that the creatine conversion to creatinine is slightly
higher in Longissimus dorsi than in Masseter. According to these figures, significant
differences have been detected between muscle samples in both cases, at a constant
temperature along different times (Fig. 3A) and at different temperatures during a
constant time (Fig. 3B). This difference could be due to the higher initial creatine
content of Longissimus dorsi (351.82 mg/100g against the 247.45 mg/100g found in
Masseter) and the differences in pH between these two muscles (5.6 in Longissimus
dorsi and 5.7 in Masseter). Monin, Mejenesquijano and Talmant (1987) established
that in pork muscles as Gluteus and Adductor, which contain less glycogen than
Longissimus dorsi muscle, the glycolytic potential might play a limiting role in the
extent of the pH fall. This could explain the pH differences found between
Longissimus dorsi, a glycolytic muscle, and Masseter, a muscle with a low content of
glycogen. So, the lower pH of the Longissimus dorsi together with its higher initial
creatine content could be responsible for the greater creatinine formation after
cooking that occurs in this muscle.
CONCLUSION This study clearly demonstrates that muscle type has a significant effect (p < 0.05) on
the contents of carnosine, creatine and creatinine. Semimembranosus, Biceps
femoris, Gluteus maximus and Longissimus dorsi, all of them glycolytic muscles, have
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134
the highest carnosine, creatine and creatinine contents. Gluteus medius and
Trapezius, both muscles having an intermediate metabolism, present also
intermediate amounts of these compounds whereas Masseter, a red oxidative
muscle, has the lowest content of carnosine, creatine and creatinine. So, it has been
concluded that, in the same way as carnosine content increases with the glycolytic
activity of the muscle (Macy et al., 1970; Aristoy et al., 1998), also creatine and
creatinine increase in muscles having this type of metabolism.
Finally, a study dealing with standards and cooked pork muscle samples shows a
correlation between initial content of creatine and the amount of creatinine generated
after cooking. Statistically significant differences were detected between muscle
samples and standards possibly due to the pH differences existing between them.
From this study, it has also been concluded that, apart from pH, temperature and
time, the initial amount of creatine is a decisive factor for creatinine generation.
ACKNOWLEDGMENTS FPU Scholarship from Ministerio de Educación y Ciencia (Spain) to L.M. and an I3P-
CSIC contract from the European Social Fund to M.A.S. are fully acknowledged.
Agroalimed grant from Consellería de Agricultura, Pesca y Alimentación (Generalitat
Valenciana, Spain) is also acknowledged.
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Capítulo 3Efecto de las condiciones de cocción sobre la formación de creatinina en
jamón cocido
Capítulo 3
139
Effect of cooking conditions on creatinine formation in cooked
ham
Leticia Mora, Miguel Angel Sentandreu and Fidel Toldrá
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), P.O. Box 73, 46100 Burjassot, Valencia, Spain
Received for review June 26, 2008. Revised manuscript received September 18, 2008. Accepted
September 23, 2008.
Abstract
The aim of this study was to evaluate the effect of different cooking procedures on the
concentrations of creatine and creatinine and the ratio of creatinine/creatine in cooked ham. Two
cooking methods (constant temperature and increasing temperature, constant T and ΔT,
respectively) were tested on different locations in porcine Longissimus dorsi muscle and ham
(Semimembranosus, Biceps femoris and Gluteus muscles). The results showed larger creatine
conversion into creatinine in the surface layer than in the core as well as higher creatinine/creatine
ratio values when applying the ΔT in comparison to the constant T method. A correlation between
the creatinine/creatine ratio and the heat treatment was established, and 15 samples of commercial
cooked hams were analyzed to support these results. This creatinine/creatine ratio analyzed in the
surface of the ham could be used as a rapid and nondestructive indicator to determine the
effectiveness of the heat treatment in cooked ham processes.
Keywords: Cooked ham; cooking method; creatine; creatinine; quality marker; hydrophilic interaction
chromatography; HILIC.
J.Agric. Food Chem.. 2008, 56, 11279-11284
140
INTRODUCTION
Cooked ham is a well-known meat product with high consumption levels all over the
world. It contains a large number of compounds of interest including creatine and
creatinine. Creatine is an important component of the energy delivery process in
several tissues, particularly those implicated in high energy demand. Creatine exists
in equilibrium with phosphocreatine in skeletal muscle, where the reversible
conversion of creatine into phosphocreatine is catalized by creatine kinase and
involves the transfer of the γ-phosphate group of adenosine triphosphate (ATP) onto
the guanidine group of creatine. Thus, creatine plays an important role in the energy
metabolism of skeletal muscle providing the necessary energy for vigorous muscle
contraction. Creatine is produced in the liver, kidneys, and pancreas but can also be
obtained from dietary supplements and from foods such as meat and fish.
Supplements of creatine have shown to improve muscle performance in high-intensity
exercise (1-3).
Creatine turns into creatinine in muscle due to a nonenzymatic conversion by the
removal of water and the formation of a ring structure. This non-enzymatic conversion
takes place easily under heating conditions such as meat cooking. Some authors
have established a correlation between creatinine content and flavor of cooked meat
(4, 5). On the other hand, the addition of creatine to broths has also been strongly
recommended because of its contribution to the full flavor of meat extracts (6, 7).
The presence of creatine and creatinine in cooked meat has also been associated
with negative aspects, because creatine and creatinine can constitute important
precursors of heterocyclic amines (HAs) formed on the surface of meat when it is
cooked at high temperatures such as roasting, frying, and grilling (8).
It is important to consider the study of the cooking step as a critical part of the cooked
ham process in relation to its safety and quality. Critical (indicator) microorganisms
and acid phosphatase (ACP) activity have been used to assess the extent of heat
treatment in the central area of canned hams and meat products for several decades
(9-12) despite their disadvantages because they are destructive determinations.
Capítulo 3
141
The main objective of the present study was to evaluate the effect of cooking
temperature on creatine and creatinine concentration as well as establish a
correlation between this ratio and the applied heat treatment.
MATERIALS AND METHODS Chemicals and reagents All chemical and chromatographic reagents were of HPLC grade. Acetonitrile,
acetone, ammonium acetate, and glacial acetic acid were purchased from Scharlau
(Barcelona, Spain). Creatine, creatinine, and carnosine standards were from Fluka
Chemie AG (Buchs, Switzerland). Sodium carbonate anhydrous and sodium
hydrogen carbonate used in phosphates analysis were from Panreac (Spain).
Materials In a first set of experiments, Longissimus dorsi muscle, excised from four carcasses
of 6-month-old female pigs at 24 h post-mortem, was used in order to detect
differences in creatine and creatinine amounts by varying time and temperature
conditions according to the cooking technique established. The use of just one type of
muscle such as Longissimus dorsi allowed the evaluation of creatine conversion to
creatinine according to the location and the cooking method in an homogeneous
sample, avoiding the variability in the amounts of these compounds that could exist in
a mixture of muscles (13).
In a second approach, Semimembranosus, Biceps femoris, and Gluteus muscles
were chosen from four carcasses of 4-month-old female pigs at 15 h post-mortem
and immediately prepared and processed to obtain cooked ham. These three
muscles were selected for being the main muscles of the pork leg. Controlled
muscles were needed to analyze the variability in creatine and creatinine amounts in
different cooked ham muscles.
Finally, five different classes of commercial boneless cooked ham from different
brands were purchased from different supermarkets. Two top-quality (‘extra’) cooked
hams, a tinned cooked ham, a ham cooked in its juice, and a cold-cut sandwich
J.Agric. Food Chem.. 2008, 56, 11279-11284
142
shoulder (14) were selected in order to obtain the highest variety of results in creatine
and creatinine contents. Three samples of each quality, each from different batches,
were obtained.
Sample and standards preparation Standards preparation
The calibration ranges for the assayed compounds were established using a
duplicate set of standards. Carnosine and creatinine calibration standards were
prepared by diluting a stock solution of 1mg/mL, whereas creatine standards were
prepared from a stock solution of 0.3 mg/mL. All dilutions were done using 0.01 N
HCl/acetonitrile (25:75, v/v).
Pork loin processing
Four pieces of pork loin, weighing approximately 250 g each, were cooked in a bath
until an internal temperature of 72 ºC. The effect of two cooking methods on creatine
and creatinine amounts was tested. Pork loin pieces were cooked using a constant
one-stage cooking cycle (cooked at 85 ºC to a core temperature of 72 ºC) and a ΔT
cycle (maintaining a constant difference of 35 ºC, between water bath and core
temperatures until the bath reached 85 ºC, whereupon the core was allowed to come
up to 72 ºC). Both assays were done using a digital sensor thermometer in order to
control the core temperature of the pieces. After cooking, traditional water immersion
method (at 0 ºC) was used to cool all samples to 4 ºC at the core. Brine solution was
not injected into L.dorsi muscle in order to avoid its possible influence in creatine
conversion to creatinine.
Cooked ham preparation and processing
A study about how the creatine conversion to creatinine can be influenced by the
cooking method has been carried out as a way to assess the effectiveness of the heat
treatment. Two cooking methods, constant T and ΔT, were selected as representative
of different cooking processes, and their effect on creatinine formation was studied in
pork loin pieces and ham.
Capítulo 3
143
The individual muscles excised from four carcases and weighing approximately 2 kg
(Biceps femoris and Semimembranosus muscles) and 1.5 kg (Gluteus muscle), were
injected manually to reach 120% of their green weight with a brine solution formulated
to give the following concentration of ingredients in the injected meat: 2.34 % of
sodium tripolyphosphate, 11.69% of NaCl, 0.03% of nitrites (NaNO2) and finally,
1.47% of glucose and 0.13% of sodium ascorbate (15). After brine injection, the
samples were tumbled manually for 24 h at 4 ºC at three hours intervals. After
tumbling, the muscles were formed by hand and vacuum packaged in cooking bags.
Hams were cooked using the two cooking methods previously described under ‘Pork
loin processing’. For each cooking treatment, weights of pork loin and cooked ham
before cooking and after cooling were recorded to calculate the weight losses during
the process as follows:
100×=cooking before Weight
cooling after Weight-cooking before Weight(%) losses weightProcess
The weights of hams before brine injection were also recorded to calculate the yield
of the complete process:
100×=injection brine before Weight
cooling after Weight(%) Yield
After cooking, traditional water immersion method (at 0 ºC) was used to cool all
samples to 4 ºC at the core.
Cooking efficiency was calculated as the slope of the heating curve (time versus
temperature in the core of the ham) of the cooking process.
Commercial cooked ham A cut cross slice 15 mm thick from the geometrical middle was cut from each cooked
ham, and three samples from each slice were excised in order to analyze the content
of creatine, creatinine, and carnosine in different random muscles from each type of
cooked ham. The identification of the different muscles was not necessary, having
J.Agric. Food Chem.. 2008, 56, 11279-11284
144
proved that nonsignificant differences in creatinine/creatine ratios exist between the
main ham muscles (Semimembranosus, Biceps femoris and Gluteus).
Creatine, creatinine, and carnosine analysis of Longissimus dorsi muscle and cooked ham The temperature profile in the core of the pieces of loin and cooked ham is a factor
that differs among the various cooking techniques. For this reason, after cooking and
cooling, all pieces were half-cut, and three samples from each piece were taken in
order to analyze differences in creatine and creatinine amounts between the core,
half, and surface. All samples were immediately processed for further analysis
following the method described by Aristoy and Toldrá (16) with some minor changes.
Briefly, 5 g of sample tissue were homogeneized with 20 mL of 0.01 N HCl in a
stomacher (Seward Laboratory) for 15 min and further centrifuged in the cold (4 ºC) at
10000 rpm for 20 min. Supernatant was filtered through glass wool and 250 μL of this
solution was deproteinized by adding 3 volumes of acetonitrile, standing at 4 ºC for 20
min. Finally, the sample was centrifuged (10000 rpm) for 10 min at 4 ºC and the
supernatant directly analyzed.
Chemical analysis Measurements of pH were taken in Semimembranosus, Biceps femoris and Gluteus
muscles before brine injection and after cooling. For this purpose, 5 g of each muscle
were taken, triturated, and homogenised in 10 mL of bidistilled water using a Polytron
PT2100 (Kinematica, Inc.). The pH measurement was taken directly on the
homogenized solution with an electrochemical sensor (238000/09 Hamilton). Moisture
content was determined by oven-drying to constant weight at 100 ºC (ISO R-1442).
Phosphates were analyzed using an ion analyzer with a chemical conductivity
detector (Metrohm). The chromatographic separation was developed in a Metrosep A
Supp 5 column (4.0 x 250 mm, 5 μm) from Metrohm. The mobile phase contained 3.2
mM of sodium carbonate anhydrous and 1 mM of sodium hydrogen carbonate in
water and 30 mL of acetone were added per liter of solution. The chromatographic
separation was isocratic, and it was developed at a flow rate of 0.7 mL/min.
Capítulo 3
145
Description of the chromatographic method Creatine, creatinine and carnosine were analyzed by hydrophilic interaction
chromatography (HILIC) under the conditions described by Mora et al. (17).
Statistical analysis The ANOVA procedure was used to determine significant differences between
Longissimus dorsi muscle and the different cooked ham muscles as well as between
the five classes of commercial cooked ham analyzed using the software Statgraphics
Plus (v 5.1). Each statistical analysis and the normality of the data were tested before
the application of the ANOVA procedure.
RESULTS AND DISCUSSION Cooking stage is a critical part of the cooked ham processing. Differences in cooking
bath temperature and time of immersion influence the creatine conversion to
creatinine as well as the efficiency, water loss, and yield. In this way, the constant T
cooking method, which consists of cooking at 85 ºC, is shorter than the ΔT method,
which increases the water bath temperature in a progressive way. The effect of the
cooking technique on cooking efficiency is shown in Table 1. As can be observed,
constant T cooking shows the highest cooking efficiency (0.54 and 4.90 min/ºC in
Longissimus dorsi and cooked ham, respectively), probably due to the shorter times
needed for this type of cooking.
With regard to water losses in cooked ham samples, the constant T cooking method
produces higher losses (15.7%) compared with the ΔT cooking method (13.6%).
These results fully agree with those reported by other authors, who established that
the ΔT cooking method significantly reduced cooking looses by 2-3% in Biceps
femoris and Semimembranosus pork muscles with respect to constant T cooking
(18). However, process losses obtained in Longissimus dorsi muscle were much
higher in the samples cooked using the ΔT method. This could be due to the lack of
brine solution injection because phosphates clearly influence the muscle absorption
J.Agric. Food Chem.. 2008, 56, 11279-11284
146
of water. On the other hand, some authors also established that cooking losses
should not be extrapolated between muscles cooked under standard conditions (19).
In fact, cooking losses in Biceps femoris were found to be independent of the cooking
technique, whereas, in the case of Longissimus dorsi, differences in cooking losses
were detected when different cooking techniques were used (20). Table 1 also shows
that cooking ham with the ΔT method could obtain the highest yield compared with
the constant T cooking method. The lowest yield values obtained during Longissimus
dorsi cooking could be due to the absence of brine solution injection, which caused
higher losses of water and, thus, a decrease in the percentage of yield.
Table 1. Effect of different cooking methods on cooking efficiency, weight loss, and yield in Longissimus dorsi muscle and cooked ham
Cooking methods Sample Type Cooking efficiency Process losses Yield Cooking time(min/ºC) (%) (%) (min)
Longissimus dorsi a 0.54 19.9 83.43 43Cooked ham 4.90 15.7 101.55 325Longissimus dorsi a 0.83 30.3 76.75 69Cooked ham 6.96 13.6 105.05 455
a Longissimus dorsi muscle was not brine injected.
Constant T
ΔT
The amounts of creatine and creatinine and also the creatinine/creatine ratios in the
two different processes studied are shown in Table 2. As can be observed, cooking
produces a remarkable increase in creatinine amounts, probably due to the
conversion of creatine to creatinine. Creatine contents before and after cooking in
both pork loin and ham are very similar, although a slight decrease is observed after
cooking, especially in the case of ham. A considerable increase in creatinine/creatine
ratio values has been shown in samples after cooking (0.02 and 0.01 in noncooked
Longissimus dorsi and ham samples, respectively, vs 0.13 and 0.39 in the constant T
method, and 0.14 and 0.46 in the ΔT method, all for surface location). Our results
agree with those obtained by other authors, who demonstrated that cooking brought
about a decrease in the amounts of creatine and an increase of creatinine,
presumably due to the heat-induced conversion of creatine to creatinine (4, 21, 22).
As can be observed with creatine and creatinine values obtained after cooking,
Capítulo 3
147
increases in creatinine levels did not fully account for decreases in creatine levels. In
fact, it has been established that as a result of thermal processing, creatine levels in
pork meat preparations decreased by 22%, whereas creatinine levels increased by
390% (23).
Table 2. Levels of creatinine (Cn), creatine (Cr), and creatinine/creatine ratio in fresh and cooked pork Longissimus dorsi muscle and ham, according to the type of cooking and locationa.
RatioCooking methods Location Mean SD Mean SD (Cn/Cr)No cooking 8.78a 0.71 354.56a,b 17.56 0.02a
Core 22.68b 0.55 387.09a 6.58 0.06b
Half 23.06b,c 0.72 354.06a,b 11.91 0.06b,c
Surface 44.57c,d,e 1.59 340.92b 8.87 0.13b,c
Exudate 0.010f 0.0003 0.025c 0.0002 0.40d,e
Core 22.34b,c 0.88 338.13b 13.05 0.07b
Half 23.96b,c 0.87 328.86b 7.60 0.07b,c
Surface 43.81b,c,d 1.48 319.52b 6.46 0.14b,c
Exudate 0.011f 0.0003 0.027c 0.0005 0.41d,e
RatioCooking methods Location Mean SD Mean SD (Cn/Cr)No cooking 4.94g 0.70 351.99a,b 7.24 0.01a
Core 35.12b,c,d 0.47 243.70d,e 13.44 0.14b,c
Half 39.50b,c 2.75 232.44d,e 14.36 0.17b,c
Surface 83.30h 9.58 212.04d,f 4.82 0.39d,e
Exudate 270.27i 16.43 183.98f 47.85 1.53f
Core 56.07d,e 10.82 256.10e 34.79 0.22b,c,d
Half 65.38e,h 4.36 256.93e 27.81 0.25c,d
Surface 107.88j 7.18 234.15d,e 22.54 0.46e
Exudate 230.24k 31.97 99.25g 21.21 2.35g
a Results expressed as means of three samples (in mg/100g of muscle) and standard deviation (SD).Different letters within the same column mean significant differences (p < 0.05). Longissimus dorsimuscle has not been brine injected.
Coo
ked
ham
Creatinine Creatine
Constant T
ΔT
ΔT
Constant T
Creatinine Creatine
Long
issi
mus
dor
si
Creatine conversion takes place more rapidly on the surface than in the core of the
samples, independent of the brine solution and type of muscle as observed from
results shown in Table 2. In fact, creatinine amounts in the surface increase up to
J.Agric. Food Chem.. 2008, 56, 11279-11284
148
about 2 times the core values obtained in both L.dorsi and ham in both methods.
These results agree with those obtained with commercial cooked ham as will be
discussed later.
To determine the extent to which the differences in creatine and creatinine contents
between core and surface were due to losses of these compounds in the exudate
generated after cooking or conversion of creatine to creatinine, the effect of the
cooking technique on exudates was also studied. In this way, creatinine and creatine
amounts analyzed in the exudate of Longissimus dorsi are almost negligible (0.010
and 0.025 mg/100g in the constant T method and 0.011 and 0.027 mg/100g in the ΔT
method for creatinine and creatine, respectively); however, their ratio values are
considerable higher than those obtained in pork loin pieces (0.4 using both methods).
This could be possibly due to differences in solubility of creatine and creatinine
compounds and/or the greater heat transfer suffered by the exudate because of its
direct contact with the hot water. Curiously, despite the higher losses values obtained
in Longissimus dorsi muscle compared to ham (see Table 1), it is interesting to
highlight the higher amounts of creatinine and creatine found in the exudate of ham
samples. These high values could be due to the effect of brine solution and tumbling
on cooked ham muscles, which would allow creatine and creatinine solubilization and,
thus, an easier mobilization of these compounds to the exudate.
Different samples were also taken from the surface of the cooked hams in order to
obtain creatinine and creatine amounts as well as their ratio values in
Semimembranosus, Biceps femoris and Gluteus muscles and to compare these
results with their corresponding values before cooking (Table 3).The lower creatinine
values presented in Table 3 for noncooked Semimembranosus, Biceps femoris and
Gluteus muscles in comparison with those published previously by us (13) could be
due to differences in post-mortem time at the moment of analysis. It has been
observed that during the first hours post-mortem creatinine values increase (results
not shown), important differences appearing in the amounts of this compound in
samples collected between 15 and 24 hours post-mortem. Ratio values presented in
Table 3 for cooked muscles show slightly higher values in muscles corresponding to
Capítulo 3
149
hams cooked with the ΔT method, although all creatinine/creatine ratio values were
above 0.4 at the surface for all muscles.
Table 3. Levels of creatinine (Cn), creatine (Cr), and creatinine/creatine ratio on the surface of the cooked ham main muscles according to the type of cookinga.
RatioCooking methods Muscle Mean SD Mean SD (Cn/Cr)
Semimembranosus 4.32a 0.28 346.77a 29.23 0.012a
Biceps femoris 4.79a 0.48 348.95a 23.04 0.014a
Gluteus 5.70a 0.38 360,27a 19.68 0.016a
Semimembranosus 90.69b 11.54 222.79b 26.44 0.407b
Biceps femoris 82.12b,c 8.95 193.05c 3.88 0.425b,c
Gluteus 103.95d 5.32 217.20b,c 23.33 0.479c
Semimembranosus 95.88c,d 14.61 215.90b,c 20.07 0.444b,c
Biceps femoris 94.61c,d 6.87 220.71b,c 17.65 0.429b,c
Gluteus 125.68e 23.91 233.22b 28.45 0.539d
a Results expressed as means of 3 samples (in mg/100g muscle) an standard deviation (SD). Different letters within the same column mean significant differences (p < 0.05).
Creatinine Creatine
No cooking
Constant T
ΔT
It has been shown that different cooking methods applied to pork meat can influence
the amount of creatine and creatinine present at the end of the treatment, depending
on time, temperature and initial amounts of creatine. To study the conversion of
creatine to creatinine in hams that have been cooked under real industrial cooking
conditions, the analysis of 15 samples from five different qualities of commercial
cooked ham has been performed. Thus, a correlation between creatine amounts and
creatinine formation after cooking has been obtained with the analysis of the cooked
ham samples (13). As can be observed in Figure 1, hams with the highest content of
creatine are also those with the greatest amounts of creatinine generated after the
cooking process. Regression lines corresponding to the three different locations,
core, half and surface, show higher slopes as they move away from the core of the
sample. This higher slope value at the surface compared to the core confirms that the
greatest conversion of creatine to creatinine occurs in this location.
Creatine and creatinine amounts obtained according to the market quality of the
cooked ham and the location of the sample are shown in Table 4. Although very little
J.Agric. Food Chem.. 2008, 56, 11279-11284
150
literature about creatine and creatinine contents in cooked hams has been found, our
results are in the order of those obtained by other authors (24, 25). As can be
observed, creatine, creatinine and ratio values confirm results obtained in Table 3.
Commercial cooked ham samples also showed that the cooking treatment brought
about a reduction in creatine and an increase in creatinine levels, as well as the lower
ratio values obtained in the core in comparison to the surface.
Table 5 reports the average value and the standard deviations of pH, carnosine,
phosphates and moisture, as well as a summary of the creatinine/creatine ratios that
appear in Tables 3 and 4 to facilitate their comparison between cooked hams.
Table 4. Levels of creatinine, creatine, and creatinine/creatine ratio in five different qualities of commercial cooked ham according to sample locationa.
RatioCooked ham classb Location Mean SD Mean SD (Cn/Cr)
Core 75.99a,b 9.14 189.15a,b 13.32 0.40a,b
Half 74.45a,b 7.17 181.09a,b,c 10.58 0.41a,b
Surface 73.61a,b,c 13.77 171.93a,c 21.40 0.43b
Core 56.94d 16.77 237.36d 65.92 0.25c,d,e
Half 55.92d 14.63 204.64b 34.87 0.27d,e,f,g
Surface 54.55d 13.25 177.73a,b,c 33.54 0.30g
Core 66.01c,e 8.86 254.61d 31.63 0.2d,e,f
Half 67.67b,c,e 2.67 240.27d 7.74 0.28e,f,g
Surface 65.46c,e 2.90 229.82d 14.00 0.29f,g
Core 65.99d,e 13.35 170.15c,e 34.81 0.39a
Half 78.11a 10.22 196.14a,b 37.90 0.41a,b
Surface 88.45f 11.42 186.80a,b,c 40.18 0.48h
Core 29.68g 5.24 141.46e,f 15.16 0.21c
Half 31.07g 5.60 134.03e,f 11.65 0.23c,d
Surface 33.22g 3.31 123.02f 8.24 0.27d,e,f,g
a Results expressed as means of three samples (in mg/100g of muscle) and standard deviation (SD).Different letters within the same column mean significant differences (p < 0.05). b I: The mostexpensive top-quality cooked ham, II: the cheapest top-quality cooked ham, III: Tinned cooked ham,IV: Cooked ham cooked in its juice, V: Cold-cut sandwich shoulder.
Creatine
I
II
III
Creatinine
IV
V
According to the literature, opposite results concerning the effect of cooking on
carnosine amounts have been found. Whereas some authors have reported that
Capítulo 3
151
histidine dipeptides, such as carnosine, are unaffected by cooking (26), others obtain
relative small differences in carnosine amounts between uncooked and cooked beef
meat (22). In our case, nonsignificant differences in the amounts of carnosine have
been found between uncooked and cooked hams (results not shown). Carnosine is a
peptide only present in animal tissues. The amount of this compound is much higher
in the skeletal muscle than in other tissues, especially in muscles with glycolytic
metabolism like the main muscles of pork ham. Thus, this characteristic together with
its resistance after cooking makes carnosine very useful in the knowledge of the
amount of animal protein present in cooked ham samples.
Table 5. Mean (n = 3) and standard deviation of pH, carnosine, and phosphates amounts, moisture percentage, and creatinine/creatine ratio in the surface of cooked hamsa.
Cooked hamquality2 Mean SD Mean SD Mean SD Mean SD Mean SD
(mg/100g) (ppm) (%)I 6.20a,b 0.03 165.43a 32.98 4119.92a 16.36 74.99a,b 1.35 0.43a 0.08II 6.44b 0.22 227.53b 8.16 5263.90b 167.28 72.98b,c 1.34 0.30b 0.02III 6.22a,b 0.23 252.48b 12.97 6159.26c 630.61 76.99a 1.59 0.29b 0.01IV 6.23a,b 0.10 143.92a 26.55 6071.11c,d 43.17 71.98c 1.69 0.48c 0.06V 6.26a,b 0.25 94.52c 11.13 3956.28a 452.96 72.42b,c 0.97 0.27b 0.03VI 6.07a 0.05 261.48b 15.68 5474.40b,d 419.67 72.80b,c 2.39 0.46c,3 0.06a Different letters within the same column mean significant differences (p < 0.05). 1Results also shown in Table
4. 2I: The most expensive top-quality cooked ham, II: the cheapest top-quality cooked ham, III: Tinned cookedham, IV: Cooked ham cooked in its juice, V: Cold-cut sandwich shoulder, VI: Cooked hams cooked undercontrolled IV: Cooked ham cooked in its juice, V: Cold cut sandwich shoulder, VI: Cooked hams cooked under
controlled conditions of temperature and time. 3Mean of the ratio values obtained in both cooking conditions inSemimembranosus, Biceps femoris and Gluteus muscles (shown in Table 3).
Ratio (Cn/Cr)1pH Carnosine Phosphates Moisture
It seems that higher creatinine/creatine ratio values could be correlated to the more
intense heat treatments and, for this reason, it is possible to assume that cooked
hams I and IV have experienced the highest temperature and/or longest time
conditions. The lowest carnosine contents present in these hams would be an
indicative of the lower animal protein amounts contained in them, so water retention
would be lower and a longer cooking would be needed to reach 70 ºC in their core. In
J.Agric. Food Chem.. 2008, 56, 11279-11284
152
fact, higher carnosine amounts obtained in cooked ham III also corresponds to high
values of moisture content and was also in coincidence with the lowest ratios
amounts and, therefore, the smoothest heat treatment. The lowest ratio
creatinine/creatine of ham V would be perfectly justified because cold-cut sandwich
shoulder is presented at supermarkets as a rectangular bar with lower distance to the
core and, thus, a minor heat treatment is necessary to reach an adequate
temperature in the core.
0
20
40
60
80
100
120
100 125 150 175 200 225 250 275 300
Creatine (mg/100g)
Cre
atin
ine
(mg/
100g
)
Figure 1. Relationship between creatine and creatinine amounts (mg/100g) in cooked ham samples. Regression lines represent core ( ), half ( ), and surface ( ) according to the sample location on the slice. Open symbols correspond to commercial cooked hams samples ( , and for core, half and surface, respectively) and solid symbols correspond to core ( ), half ( ) and surface ( ) of hams cooked under constant T and ΔT conditions.
On the basis of the obtained results, the creatinine/creatine ratio could be used as an
index of the heating efficiency of cooked ham because it gives a good estimation of
the magnitude of the heat treatment experienced by these products. Thus, according
to the results shown in Table 2, pieces with a weight of 5.5 kg and injected with
Capítulo 3
153
controlled brine solution would need a ratio above 0.4 on the surface to ensure
adequate heat treatment of 70 ºC in the core of the ham. Therefore, these
measurements could be easily assayed in a small sample of the surface of the ham,
minimizing the damage to the pieces as a type of nondestructive assay.
In summary, the tested cooking processes (constant T and ΔT) brought about a
decrease of creatine and an increase of creatinine contents. In this way, slightly
higher creatinine/creatine ratio values were obtained when the ΔT method was
applied in comparison to the constant T method. On the other hand, it has been
observed that creatine conversion takes place more rapidly on the surface than in the
core of the samples, probably due to the longer heating time and the higher heat
transfer values corresponding to this location. Thus, after demonstrating the increase
of the creatinine/creatine ratio with cooking, we can state that this ratio could be used
to determine the extent of the applied heat treatment during the processing of cooked
ham. When ham piece weights, brine solution composition, and cooking method
conditions are taken into account in the determination of the critical ratio, this
procedure would be a rapid and nondestructive technique, requiring only a small
sample of the cooked ham surface to perform the assay.
ACKNOWLEDGMENTS FPU Scholarship from Ministerio de Ciencia y Educación (Spain) to Leticia Mora and
Agroalimed grant from Consellería de Agricultura, Pesca y Alimentación (Generalitat
Valenciana, Spain) are also acknowledged. We give special thanks to Elizabeth
Escudero for her valuable assistance during phosphate analysis and to Aleida Selene
Hernández for helpful advice.
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156
Esta hoja es una prueba
Capítulo 4Evolución de creatina y creatinina durante el procesado de jamón curado
Capítulo 4
159
www.elsevier.com/locate/meatsci
Creatine and creatinine evolution during the processing of
dry-cured ham
Leticia Mora, Aleida S. Hernández-Cázares, Miguel Angel Sentandreu and Fidel Toldrá
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), P.O. Box 73, 46100 Burjassot,
Valencia, Spain
Received for review July 24, 2009. Revised manuscript received September 8, 2009. Accepted September 15, 2009.
Abstract
Dry-curing of ham involves many biochemical reactions that depend on the processing conditions.
The aim of this study was to evaluate the effect of the dry-cured processing on the concentration of
creatine, creatinine and the creatinine/creatine ratio. Dry-cured hams under study were salted using
three different salt mixtures (100% NaCl; NaCl and KCl at 50% each; and 55% NaCl, 25% KCl, 15%
CaCl2 and 5% MgCl2) in order to observe its influence on creatinine formation but no significant
differences were found between them at any time of processing. However, significant differences
between different post-salting times (20, 50 and 80 days) and the ripened hams (7, 9 and 11 months
of ripening) were observed. Results showed that creatine and creatinine remain stable once the
ripening period is reached. These results were confirmed when analysing dry-cured ham samples
submitted to extreme conditions of temperature and time (20, 30, 40 and 70 ºC during 0, 20, 40 and
60 min) as well as commercial dry-cured hams with more than 12 months of processing.
Keywords: Dry-cured ham, creatine, creatinine, HILIC, Hydrophilic interaction chromatography, salt
substitutes.
Meat Sc. 2010, 84, 384-389
160
INTRODUCTION
Spanish dry-cured ham is a high quality, well-known meat product with an enormous
economic importance in its sector. In fact, more than 40 million dry-cured hams are
produced in Spain per year.
Creatine (Cr) is an amino acid derivative normally biosynthesised in the liver, kidneys
and pancreas from arginine, methionine and glycine. Creatine plays a central role in
the energy metabolism of skeletal muscle, providing the necessary energy for
vigorous muscle contraction (Wyss & Kaddurah-Daouk, 2000). Although an important
part of this compound can also be obtained from other sources like food, there are
extensive evidences that creatine supplements can enhance muscle performance in
anaerobic exercises (Balsom, Soderlund & Ekblom, 1994). In pigs, dietary
supplementation with creatine monohydrate prior to slaughter may slow post-mortem
pH decline by providing an immediate energy source, thus delaying glycogen
metabolism and reducing the incidence of pale, soft and exudative (PSE) tissues
(James et al., 2002).
Creatine turns easily into creatinine (Cn) under heating conditions such as meat
cooking through a non-enzymatic conversion (del Campo, Gallego, Berregi &
Casado, 1998). In fact, a correlation between the Cn/Cr ratio and the heat treatment
was established in cooked ham samples concluding that this ratio could be used as a
rapid and non-destructive indicator for the effectiveness of the heat treatment in
cooked ham processes (Mora, Sentandreu & Toldrá, 2008a). Some authors reported
the sensory properties of creatine (Cambero, Pereira-Lima, Ordóñez & de Fernando,
2000) and creatinine (Macy, Naumann & Bailey, 1970; Snider & Baldwin, 1981),
recommending the addition of creatine to broth because of the contribution of this
compound to the full flavour of meat extracts (Schlichtherle-Cerny & Grosch, 1998).
During the processing of dry-cured ham and due to the particular conditions of
humidity, temperature and long times needed, numerous physico-chemical and
biochemical reactions take place (Toldrá, 2006; Estévez, Morcuende, Ventanas &
Ventanas, 2007). This phenomenon is responsible for changes in structure and
functional properties of proteins and contributes to the formation of the typical dry-
Capítulo 4
161
cured ham texture and the development of its final flavour characteristics (Toldrá &
Etherington, 1988; Toldrá & Flores, 1998). Salt content is a parameter that
contributes to the typical salty taste of dry-cured ham (Andrés, Cava, Ventanas,
Thovar & Ruiz, 2004) and influences the development of the intense proteolysis
occurred during its processing (Toldrá, Cervero & Part, 1993). Nowadays, there is a
challenge to reduce sodium intake due to health recommendations to reduce
hypertension (Morgan, Aubert & Brunner, 2001). In this way, many studies have been
done to reduce the global salt content in this type of products by reducing the salting
time, reducing the addition of sodium salt (Andrés, Cava, Ventanas, Muriel & Ruiz,
2004) or substituting total or partially the NaCl by other salting agents (Blesa et al.,
2008).
There is a lack of information regarding the evolution of creatine and creatinine during
the dry-curing. The numerous biochemical changes that are involved in this process,
together with the dependence of the creatine non-enzymatic conversion on time,
temperature, pH and initial creatine amounts (Edgar & Shiver, 1925; Fuller & Elia,
1988; Mora, Sentandreu & Toldrá, 2008b), makes this processing very interesting for
a better understanding of creatine conversion to creatinine. Thus, the main purpose of
the current study was to evaluate the effect of the dry-curing process on creatine and
creatinine concentrations and to establish a possible correlation between the levels of
these compounds and the time of processing, as well as to evaluate the effect of
different salt formulations on creatinine formation and the effect of temperature and
time on the levels of creatine and creatinine in 11 months dry-cured ham samples.
MATERIALS AND METHODS Chemicals and reagents All chemical and chromatographic reagents used were of HPLC grade. Acetonitrile
(ACN), ammonium acetate, glacial acetic acid, perchloric acid and potassium
carbonate were purchased from Scharlau (Barcelona, Spain). Creatine and creatinine
standards were from Fluka Chemie AG (Buchs, Switzerland).
Meat Sc. 2010, 84, 384-389
162
Dry-cured ham preparation Fifty-four fresh hams with an average weight of 10 ± 1 kg from 6-months old pigs
(Landrace x Large White) were selected in a local slaughterhouse, controlling the pH
within the 5.5 - 6.0 range. Hams were frozen in an industrial freezer at -40 ºC and
stored for at least 30 days at -20 ºC. Before starting with the Spanish dry-cured ham
processing, frozen hams were thawed in a cold chamber at 3 ºC for 5 days. Three of
the hams were used to characterise the raw material. The remaining 51 hams were
divided into three groups, one of 15 and two of 18 hams. Each group was salted
using the following formulations: 100% of NaCl salt, formulation I; NaCl and KCl at
50% each, formulation II; and 55% NaCl, 25% KCl, 15% CaCl2 and 5% MgCl2, formulation III.
Hams were pre-salted and placed in salting chambers using the respective
formulations for 11 - 12 days. Nitrites and nitrates were also added as curing agents
(100 ppm of NaNO2 and 200 ppm of KNO3). The salting chambers were set at 4 ºC
and 85-90% relative humidity. After salting, hams were brushed in order to remove
remaining salt from their surfaces and transferred to the post-salting chamber, where
a complete salt homogenisation took place. The temperature was kept below 4 ºC for
50 days in hams salted with formulation I, while it was maintained for 80 days in hams
salted with formulations II and III. The relative humidity in the chambers was
established between 75% and 85%. Hams salted with formulation I (100% NaCl)
were considered as control batch, being 50 days in the post-salting stage, the usual
time employed in industry. The increase of the post-salting time up to 80 days for
formulations II and III was applied because of the necessity of increasing the post-
salting time when replacing sodium by other cations such as potassium, calcium and
magnesium in order to reach same water activity (Blesa et al., 2008). During the last
stage, corresponding to the ripening period, hams were placed in air-conditioning
chambers and subjected to different time, temperature and relative humidity cycles.
Higher temperatures (14 - 20 ºC) and lower relative humidity (until 70%) were set
during ripening in order to accelerate the drying process. The total length of the curing
process was 11 months.
Capítulo 4
163
Five different commercial dry-cured hams with times of processing between 12 and
18 months were purchased from different supermarkets with the aim to analyse Cr
and Cn contents.
Sampling Samples from the Semimembranosus muscle were taken from the middle of the ham
before processing and with 20, 50 and 80 days and 7, 9 and 11 months of
processing. Semimembranosus muscle is an external muscle that is in direct contact
with the salt mixture during the salting step.
Creatine and creatinine extraction and deproteinisation Samples were extracted and deproteinised following the method described by (Burns
& Ke, 1985) with some minor changes. Briefly, 5 g of frozen tissue were minced and
homogenised with 15 mL of cold 0.6 M perchloric acid for 10 min at 4 ºC in a
stomacher (IUL Instrument, Barcelona, Spain). The extract was centrifuged at 24500
g for 20 min in the cold (4 ºC) and the supernatant was filtered through glass wool. An
aliquot of 12 mL of this solution was neutralized (pH 6.5 - 7.0) by adding solid
potassium carbonate, standing in an ice bath for 20 min. An aliquot of 200 μL was
deproteinised by adding three volumes of acetonitrile, standing at 4 ºC for 5 min.
Finally, the sample was centrifuged for 10 min at 4 ºC and the supernatant directly
analysed.
Analytical determinations Measurements of pH were taken in Semimembranosus muscle at 20, 50 and 80 days
of the post-salting step and at 7, 9 and 11 months of the ripening period. For this
purpose, 2 g of each ham were taken, triturated, and homogenised in 5 mL of
bidistilled water using a Polytron PT2100 (Kinematica, Inc., Switzerland). The pH
measurement was taken directly on the homogenised solution with an
electrochemical sensor (238000/09 Hamilton Bonaduz AG, Switzerland).
Moisture content was determined by over-drying to constant weight at 175 ºC using a
moisture halogen analyser (Mettler Toledo AG, Switzerland).
Meat Sc. 2010, 84, 384-389
164
Standards preparation Stock solutions of all standards were prepared employing the solvent sample solution,
which is 0.6 M perchloric acid previously neutralized to pH 6.5 - 7 with potassium
carbonate and acetonitrile (1:3). Working standard solutions were prepared over the
appropriate concentration range by dilution of stock solutions. All stock solutions were
stored at -20 ºC until use.
Processing of Semimembranosus muscle slices Semimembranosus muscle of 11 months dry-cured hams salted with formulation I,
were cut in 4 mm slices in order to study the conversion of creatine into creatinine
under controlled conditions of pH, temperature and time. The aim of this experiment
was to prove that stable and constant values in creatine and creatinine concentrations
were reached during the ripening. The effect of temperature and time on creatinine
formation was established holding the samples at 20, 30, 40 and 70 ºC during 0, 20,
40 and 60 min, always under controlled conditions of both pH and initial amount of
creatine. These assays were carried out in a water bath (Tectron Bio, Selecta,
Barcelona, Spain) under controlled conditions of temperature. The use of thin slices
allowed to establish an immediate heat transfer between water and muscle slices. At
the end of the incubation period, samples were cooled to stop creatine conversion to
creatinine. Samples were prepared for analysis as previously described.
Description of the chromatographic method
The HILIC separation was performed using a ZIC® - pHILIC column (4.6 x 150 mm,
5μm) together with a ZIC® - pHILIC guard column (2.1 x 20 mm, 5μm) both from
SeQuant (Sweden). Ten microliters of each sample were injected into the HPLC
system. Mobile phases consisted of solvent A, containing 1 mM of ammonium
acetate, pH 5.5, in water/acetonitrile (20:80), and solvent B, containing 1 mM of
ammonium acetate, pH 5.5, in water/acetonitrile (70:30). The separation conditions
were a linear gradient from 0% to 100% of solvent B in 30 min at a flow rate of 0.5
mL/min. The column was equilibrated for 15 min under initial conditions before each
injection.
Capítulo 4
165
All samples were filtered through a 0.22 μm nylon membrane filter (Teknokroma,
Barcelona, Spain). Solvents were also degassed prior to each analytical run. The
separation was monitored using a diode array detector at a wavelength of 214 and
236 nm for creatine and creatinine, respectively.
Chromatography was performed in a HPLC Agilent 1100 series system (Agilent
Technologies, Palo Alto, CA) equipped with a quaternary pump (G1311A), an
autosampler (G13131A), a thermostated column compartment (G1316A) and a
vacuum degasser (G1379A). Ultraviolet detection was made by a G1315B diode
array detector, which was used in the range of 195 - 300 nm.
Statistical method The ANOVA procedure was used to determine significant differences in creatine and
creatinine content during the dry-cured processing as well as to determine the
influence of the different formulations of salts on creatine conversion to creatinine.
Nine dry-cured hams per time and three per formulation were analysed. This
statistical procedure was also used to determine significant differences in creatine
and creatinine amounts after keeping dry-cured ham samples under controlled
conditions of temperature and time as well as in the analysis of commercial dry-cured
hams. Each statistical analysis was done using the Statgraphics Plus (v 5.1) software.
The normality of the data was tested before applying the ANOVA procedure.
RESULTS AND DISCUSSION Semimembranosus is a glycolytic muscle that has been reported to present higher
contents of creatine in comparison with muscles like biceps femoris, gluteus,
longissimus dorsi or trapezius, and this fact could come from phosphocreatine, which
is a phosphorilated creatine molecule anaerobically used to regenerate ATP from
ADP. Creatine and creatinine concentrations obtained in this study in raw
semimembranosus muscle (414.37 and 8.21 mg/100g of muscle, respectively) agree
with those reported previously (Mora et al., 2008b).
Meat Sc. 2010, 84, 384-389
166
Creatine and creatinine concentrations were evaluated during dry-cured ham
processing using three different salt formulations (Figs. 1A and B).
0
500
1000
1500
2000
Cre
atin
e (m
g/10
0g o
f DM
)
Formulation IFormulation IIFormulation III
0
50
100
150
200
0 50 100 150 200 250 300 350
Time of dry-cured processing (days)
Cre
atin
ine
(mg/
100g
of D
M)
A)
B)
Figure 1. Creatine (A) and creatinine (B) evolution during dry-cured ham processing using three different salt formulations. Labelled error bars indicate the standard deviation for each measurement.
The dry-cured processing has a significant effect on the content of creatine and
creatinine. Creatine concentration did not show significant changes (p < 0.001) during
the post-salting period for the three formulations. The measurement taken at 80 days
in hams salted with formulations II and III was done with the purpose of preventing
the necessity of longer times to reach the same water activity values than those
obtained in hams salted with formulation I. Finally, also no significant differences (p <
Capítulo 4
167
0.001) in creatine concentration were obtained between the 3 salt formulations and
the ripening times (7, 9 and 11 months) even though they were significant in relation
to the post-salting data. So, the final creatine concentration in such ripened hams was
around 825.25 ± 52.72 mg/100g d.m.
The effect of dry-cured processing on creatinine concentration (Fig. 1B) was
proportional to the creatine disappearance. So, a significant increase (p < 0.001) in
creatinine concentration was observed between post-salting (20, 50 and 80 days) and
the ripening period (7, 9 and 11 months). Creatinine content also remained constant
during ripening with a mean value of 121.72 ± 6.54 mg/100g d.m.
Creatine conversion into creatinine depends on pH, temperature and time. Recently,
it has also been reported the influence of creatine initial concentration on creatine
conversion into creatinine. In this way, (Mora et al., 2008b) established a correlation
between initial content of creatine and creatinine formation after cooking that was
verified at constant temperature and constant time, obtaining significant differences in
Cn formation depending on the initial creatine amounts. Thus, the highest amounts of
creatine present in ham during the first days of curing could be responsible of the
large increase in creatinine amounts occurred during the first 50 days of processing.
The pH is also a very important factor in creatine conversion to creatinine. Its
influence has been widely studied during years and literature contains references to
the conditions under which Cr is practically quantitatively converted to Cn in acid
solution and only partially converted in alkaline solution (Edgar et al., 1925; Fuller et
al., 1988). Post-mortem muscle pH declines as a result of the accumulation of lactic
acid. However, during post-salting and initial ripening periods, an increasing of pH
value from 5.6 - 5.8 to about 6.1 occurs. The pH of the hams was controlled after rigor
mortis and during all processing (see Table 1). Hams pre-salted with formulation III
presented the lowest pH values as well as no significant differences (p < 0.001)
between them at any time of processing. On the other hand, the highest pH values
were obtained in hams salted with formulation II. According to some authors, the
fluctuation of pH is higher in muscles situated near the surface of the ham probably
due to the salting step, the faster and intense drying that occurs, and the migration of
phosphates towards the surface (Arnau, Gou & Comaposada, 2003). According to
Meat Sc. 2010, 84, 384-389
168
creatine and creatinine variations observed during the processing of dry-cured ham,
pH does not appear to be the responsible variable for creatine conversion to
creatinine.
Table 1. Values of dry-cured ham pH at different times of processing.
Time of processing Formulation MeanA SDB CV(%)C
0 days 5.77g 0.092 1.60I 6.16a-g 0.200 3.25
20 days II 6.39ab 0.113 1.76III 5.83efg 0.226 3.88I 6.57a 0.156 2.37
50 days II 6.52ab 0.243 3.72III 5.77g 0.025 0.44II 6.21a-f 0.221 3.57III 5.84efg 0.038 0.65I 6.15b-g 0.072 1.17
7 months II 6.26a-d 0.129 2.05III 5.97c-g 0.086 1.44I 5.92c-g 0.028 0.48
9 months II 5.92d-g 0.096 1.62III 5.83fg 0.150 2.57I 6.24a-e 0.163 2.61
11 months II 6.30abc 0.137 2.18III 5.86d-g 0.075 1.28
A Each value represents the mean of three samples from different dry-cured hams. Different letters within the same column mean significant differences (p < 0.001).B Standard deviation.C Coefficient of variation.
80 days
Temperature during post-salting was kept at 4 ºC, so that the initial amounts of
creatine and the time of processing could be the only responsible for creatine
conversion to creatinine during this period. During ripening, the temperature of
chamber was raised up to 14 - 20 ºC and creatinine formation showed an important
increase but in spite of the long time of the ripening period (11 months) creatine and
creatinine amounts kept constant from 7 months until the end of the ripening.
In agreement with our results, many authors have reported the decrease of creatine
and increase of creatinine contents in muscle during periods of processing like
Capítulo 4
169
cooking (Macy et al., 1970; Purchas, Busboom & Wilkinson, 2006). Chromatograms
showing ceatinine increase during post-salting (0, 20 and 50 days) in hams salted
with formulation I are shown in Fig. 2.
As can be observed, Cr decrease is not as considerable as Cn increase. In this
respect, it has been reported that the increase in Cn concentration with cooking was
sensibly larger than the Cr decrease (Macy et al., 1970; Pegg, Amarowicz & Code,
2006; Purchas et al., 2006). A similar behaviour with respect to correlation between
creatinine amounts and ratio at different processing times has been observed. This
would be logical because although creatine amounts decrease with temperature and
time, its diminution is not comparable to the considerable increase that creatinine
suffers under the same conditions.
Fig. 3 shows the evolution of the creatinine/creatine ratios at different processing
times. The reason of using the ratio was to eliminate the variations in creatine
amounts that could occur in the different hams. By this way, a no significant (p <
0.001) increase in Cn/Cr ratio was observed during the first 20 days post-salting in
hams treated with all formulations.
However, whereas no significant differences were also detected between
formulations at 50 and 80 days post-salting, significant differences in ratios between
20 and 50 days were detected. On the other hand, ratios changes occurred during the
ripening times of 7, 9 and 11 months were non-significant (p < 0.001) for any
formulations. Creatinine/creatine ratio at 7, 9 and 11 months reached the maximum
value of 0.15.
In order to verify the stability of creatine and creatinine values existing after 7 months
of processing (see Figs. 1.A and B), these values and their ratios were studied under
controlled conditions of temperature and time using semimembranosus muscle of an
11 months dry-cured ham salted with formulation I (Table 2).
The effect of time (20, 40 and 60 min) was assayed at different temperatures (20, 30,
40 and 70 ºC). These temperatures were chosen because 20, 30 or 40 ºC may be
used at specific stages of dry-cured processing. An extreme temperature of 70 ºC
was also tested in order to assure the stability of creatine and creatinine.
Meat Sc. 2010, 84, 384-389
170
0
200
400
600
800
1000
1200
Abs
orba
nce
(mA
U)
0
50
100
150
200
250
Absorbance (m
AU
)
210 nm236 nm
Cn
Cr
0
200
400
600
800
1000
1200
Abso
rban
ce (m
AU)
0
50
100
150
200
250
Absorbance (m
AU
)
B)
Cn
Cr
0
200
400
600
800
1000
1200
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20Time (min)
Abso
banc
e (m
AU)
0
50
100
150
200
250
Absorbance (m
AU
)
C)
Cn Cr
A)
Figure 2. Chromatograms corresponding to the separation of creatine and creatinine in semimembranosus muscle before processing (0 days) (A) and 20 days (B) and 50 days (C) post-salting. Creatine (Cr) was detected at 214 nm (solid line and left scale), whereas creatinine (Cn) was detected at 236 nm (dotted line and right scale).
Capítulo 4
171
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0 days 20 days 50 days 80 days 7 months 9 months 11 months
Time of dry-cured processing
Rat
io (C
n/C
r)
Formulation IFormulation IIFormulation III
aa
b,c,d
e
aa
aaa
a
a
b
c,d,e
c,d
c,d,ec,d,ec,d,e
e ed,e
Figure 3. Creatinine/creatine ratios during the processing of dry-cured ham. Each value represents the mean of three semimembranosus muscle samples from different dry-cured hams. Labelled error bars indicate the standard deviation for each measurement. Different bar letters indicate significant differences in a confidence interval of 99.9% (p < 0.001).
Some authors have reported that increasing temperatures throughout the process of
dry-curing leads to enhanced proteolytic activity, producing softer and defective
textures (Rico, Toldrá & Flores, 1990; Arnau, Guerrero & Gou, 1997). No information
about creatine and creatinine changes at different temperatures during dry-cured ham
processing has been reported, whereas important changes in these compounds have
been observed during processing of cooked ham (Mora et al., 2008a). Table 2 shows
no significant differences (p < 0.001) in creatine and creatinine amounts between
different time and temperature conditions in 11 months dry-cured hams, confirming
that no further changes can be expected in dry-curing.
Finally, the analysis of creatine and creatinine contents in commercial dry-cured hams
submitted to times of processing between 12 and 18 months was done in order to
assure that longer processing times do not influence the stability of creatine and
creatinine values. Mean values of 755.99 mg/100 g d.m. ± 95.89 and 127.80 mg/100
g d.m. ± 5.49 for creatine and creatinine, respectively, were obtained. No significant
differences between these values and those observed during the ripening period (7, 9
and 11 months) were obtained.
Meat Sc. 2010, 84, 384-389
172
Table 2. Effect of temperature and time on the levels of creatine, creatinine and creatinine/creatine ratio in 11 months dry-cured ham samples salted with formulation I (100% NaCl).
Temperature Time Ratio(ºC) (min) MeanA SDB MeanA SDB (Cn/Cr)
None None 1028.69ab 24.43 140.91a 1.25 0.14bc
20 957.69ab 27.30 134.16ab 1.47 0.14abc
40 895.76ab 126.02 124.24b 3.79 0.14abc
60 1035.23a 46.39 137.76ab 4.98 0.13c
20 998.44ab 61.88 140.23a 6.18 0.14abc
40 881.11ab 144.13 130.46ab 8.45 0.15ab
60 1014.13ab 61.73 142.25a 6.16 0.14abc
20 1015.42ab 43.45 138.36a 5.21 0.14bc
40 1027.24ab 127.86 140.96a 10.62 0.14abc
60 945.99ab 82.37 130.8ab 5.07 0.14abc
20 878.4ab 61.02 132.64ab 7.65 0.15ab
40 916.24ab 49.32 135.6ab 4.00 0.15abc
60 872.95b 50.75 132.58ab 5.40 0.15a
A Results presented as means of three samples (in mg/100 g of ham d.m.). Different letters within the same column mean significant differences (p<0.001).B Standard deviation.
20
30
40
70
Creatine Creatinine
The fact that under extreme conditions of temperature and time (70 ºC during 1 h) no
changes in creatine and creatinine amounts were observed, together with the non-
variability detected in the amount of these compounds when analysing commercial
dry-cured hams with curing times until 18 months, could suggest the potential use of
these values as a way to estimate the extent of the ripening period.
CONCLUSIONS This study clearly demonstrates that time of dry-cured processing has a significant
effect (p < 0.001) on the contents of creatine, creatinine and their ratio, whereas no
significant differences (p < 0.001) in these compounds were detected among different
salt formulations. The main differences in creatine, creatinine and their ratio were
Capítulo 4
173
observed between post-salting times (20, 50 and 80 days) and the ripening period (7,
9 and 11 months), obtaining a final stable value for these compounds during ripening.
A study carried out under extreme conditions of temperature and time together with
the analysis of commercial hams with longer processing time support these results,
indicating that creatine and creatinine contents reach a plateau at about 7 months of
processing, fact that could be a good estimation of a minimum time of ripening.
ACKNOWLEDGMENTS FPU Scholarship from Ministerio de Ciencia y Educación (Spain) to L.M. and
scholarship from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) and Colegio
de Postgraduados (Mexico) to A.S.H.-C. are fully acknowledged. Grant AGL2007-
65379-C02-01/ALI from Ministry of Education and Science (Madrid, Spain) and
FEDER funds are also acknowledged.
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176
Parte 2 Identificación de los péptidos generados durante el curado del jamón.
La segunda parte de esta Tesis Doctoral compila los capítulos 5, 6, y 7, los cuales
describen los resultados obtenidos tras el desarrollo del segundo objetivo, y se
traducen en tres publicaciones.
Como se ha comentado en la introducción, durante el curado del jamón se producen
numerosos cambios bioquímicos entre los que destaca la intensa proteolisis de las
proteínas musculares. Este proceso es responsable tanto de los cambios en la
Capítulos 5, 6, y 7
178
textura que se dan durante el periodo postmortem como del sabor y aroma
característico desarrollado durante el curado del jamón.
La proteolisis consiste fundamentalmente en la ruptura de los enlaces peptídicos de
las proteínas para dar lugar a grandes polipéptidos y, posteriormente, a péptidos de
menor tamaño y aminoácidos libres. Tanto las proteínas miofibrilares como
sarcoplásmicas son degradadas durante el proceso de curado. A pesar de que se
sabe que las propias enzimas musculares son las responsables de esta proteolisis,
actualmente se dispone de poca información sobre la estructura de los péptidos
generados como consecuencia de esta hidrólisis.
La metodología más común empleada en la actualidad para la identificación de
proteínas y péptidos está basada en la digestión previa con una enzima proteolítica
como la tripsina, que corta de modo específico el péptido o proteína, lo que facilita la
posterior identificación e interrogación en las bases de datos de proteínas. Sin
embargo, para la correcta identificación de la proteína o péptido se requiere que las
masas de un cierto número de fragmentos coincidan con las masas teóricas de los
péptidos y que éstos cubran parte de la secuencia de la proteína existente en las
bases de datos de proteínas (SwissProt, NCBInr,…). La dificultad añadida del trabajo
que se presenta en esta parte de la Tesis Doctoral surge por el hecho de que los
péptidos generados de forma natural durante el curado del jamón son demasiado
pequeños para ser digeridos con tripsina, debiendo ser identificados directamente sin
hidrolizar.
En el capítulo 5 se presenta por primera vez la identificación de fragmentos
peptídicos generados a partir de la hidrólisis de la cadena ligera de miosina I y de la
titina. La miosina es la principal proteína miofibrilar del músculo esquelético, mientras
que la titina, también conocida como conectina, es la tercera proteína más
abundante. La identificación de estos péptidos contribuye sin duda a mejorar el
conocimiento de los mecanismos responsables de la generación de la textura y del
aroma y sabor característico del producto final. Para la identificación de los péptidos
que se presentan se ha recurrido al uso de algunas de las técnicas de
espectrometría de masas descritas en la introducción como son la
desorción/ionización por láser asistida por una matriz acoplada a un analizador de
Parte 2
179
tiempo de vuelo (MALDI-TOF) y la cromatografía líquida con ionización por
nanoelectrospray acoplada a un analizador cuadrupolo-tiempo de vuelo.
Además de las proteínas miofibrilares, las proteínas sarcoplásmicas también se
degradan de forma muy intensa durante el curado del jamón. De hecho, las proteínas
sarcoplásmicas constituyen entre el 30 y el 40% del contenido total en proteínas del
músculo, siendo solubles en soluciones de baja fuerza iónica. Se localizan en el
sarcoplasma y de entre ellas cabe destacar la mioglobina como la proteína más
relevante, así como las enzimas del metabolismo muscular. La hidrólisis de las
proteínas sarcoplásmicas puede desempeñar un papel destacado en el desarrollo de
la textura de la carne y de los productos cárnicos sometidos a tratamiento térmico.
La creatina quinasa (EC 2.7.3.2.) es una de las proteínas sarcoplásmicas más
abundantes del músculo esquelético. Está implicada en el metabolismo energético
del músculo y tiene una estrecha relación con la calidad de la carne. La
desnaturalizalización o insolubilización de la creatina quinasa como consecuencia de
las condiciones de pH y temperatura existentes en el músculo postmortem afecta
negativamente al color de la carne y a su capacidad de retención de agua.
En el capítulo 6 se presenta el aislamiento y la identificación de péptidos generados
en el jamón curado a partir de la degradación de la creatina quinasa mediante el
desarrollo de distintas etapas de fraccionamiento del extracto de jamón y el uso de
técnicas de espectrometría de masas MALDI-TOF y de cromatografía líquida
acoplada a un espectrómetro de masas cuadrupolo-tiempo de vuelo en tándem (LC-
Q/TOF). Los distintos espectros de masas obtenidos fueron analizados empleando
dos motores de búsqueda distintos, MASCOT y PARAGON, a través de los
programas Analyst™ y ProteinPilot™, respectivamente. En ambos casos se utilizó la
base de datos NCBInr para identificar la proteína de origen de los fragmentos.
Debido a que la creatina quinasa es un sustrato de las peptidasas relacionadas con
el proceso de tenderización de la carne, los fragmentos resultantes de la acción de
estas enzimas podrían emplearse como marcadores de la actividad proteolítica,
pudiendo ser útiles como indicadores de calidad de la carne y productos cárnicos.
Así pues, en los capítulos 5 y 6 se describe la identificación de varios fragmentos de
proteínas miofibrilares y sarcoplásmicas generados durante el proceso de curado del
Capítulos 5, 6, y 7
180
jamón. La identificación de estos fragmentos se llevó a cabo mediante cromatografía
líquida acoplada a la espectrometría de masas con un analizador cuadrupolo-tiempo
de vuelo en tándem.
Los analizadores de tiempo de vuelo (TOF) se emplean tanto con la técnica de
ionización por electrospray (ESI) como con la técnica MALDI, ambas comentadas en
la introducción. Como allí se explica, la principal diferencia entre estos dos tipos de
ionizaciones radica en que en los espectros generados mediante ionización ESI el
mismo péptido puede ionizarse con distintas cargas, mientras que mediante la
ionización MALDI la mayoría de los péptidos serán monocargados. Como resultado
de esto, la ionización por electrospray permite la identificación de péptidos
relativamente grandes en espectrómetros de masas con un intervalo de detección de
masas relativamente pequeño.
En el capítulo 7 se presenta la identificación de un total de 27 péptidos generados a
partir de la degradación de la proteína troponina T durante el curado del jamón
haciendo uso de la la técnica MALDI-TOF/TOF. Desde el punto de vista de la
resolución y de la reproducibilidad, los instrumentos que emplean analizadores de
tiempo de vuelo no son tan satisfactorios como aquellos que emplean separadores
cuadrupolares. Sin embargo, algunas ventajas compensan estas limitaciones; entre
ellas están la sencillez de manejo, la robustez, la facilidad de acceso a la fuente de
iones, la precisión de masa, un intervalo de masas virtualmente ilimitado y la rapidez
en la adquisición de datos.
Estudios previos demuestran que la troponina T es una proteína miofibrilar que sufre
una degradación muy intensa durante el periodo postmortem. Aunque muchos
autores han determinado la secuencia N-terminal de algunos de los fragmentos
generados, muy poca información acerca de la secuencia completa de estos
péptidos ha sido publicada hasta la fecha.
Capítulo 5Péptidos pequeños generados de forma natural a partir de proteínas
miofibrilares en jamón Serrano
Capítulo 5
183
Naturally generated small peptides derived from myofibrillar
proteins in Serrano dry-cured ham
Leticia Mora1,2, Miguel Angel Sentandreu1,2, Kaisa M. Koistinen1, Paul D. Fraser1, Fidel Toldrá2 and Peter M. Bramley1
1. School of Biological Sciences, Royal Holloway, University of London, Egham TW20 0EX, U.K.
2. Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), P.O. Box 73, 46100 Burjassot, Valencia, Spain
Received for review November 6, 2008. Revised manuscript received February 12, 2009. Accepted
February 14, 2009.
Abstract
A proteomic approach has been carried out to investigate the extensive proteolysis occurring in the
processing of Serrano ham. In this study, a total of 14 peptide fragments derived from myosin light
chain I and titin have been identified for the first time. Nine of these peptides originated from myosin
light chain I protein, with the loss of dipeptides at N-terminal position observed in some of them. This
suggests that dipeptidyl peptidases are involved in the generation of dipeptides, which contribute to
the generation of the characteristic taste associated with Serrano ham. The other five peptides came
from the PEVK region of the titin protein. This region is believed to confer elasticity to the sarcomere
as well as the ability to bind calpains. The hypothetical action of μ-calpain and calpain 3 enzymes
over this region would make these enzymes potentially responsible for protein breakdown during the
early dry-curing stage.
Keywords: Serrano ham; titin; myosin light chain I; proteomics; peptide sequencing.
J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 3228-3234
184
INTRODUCTION
Dry-cured ham is a high-quality, processed meat product that represents an important
proportion (57%) of the total production of dry-cured products in Spain. Serrano ham
is protected by the European Community as a Traditional Speciality Guaranteed,
controlled by the Foundation Jamón Serrano that defines and regulates specific raw
materials and processing conditions. The processing of dry-cured ham is very
complex and involves numerous biochemical reactions, most of them related to the
muscle structure. In fact, many studies have been carried out to understand the main
biochemical changes that take place during the post-mortem period in relation to the
initial breakdown of myofibrils by muscle endopeptidases. This proteolysis is directly
related to the development of meat tenderness (1, 2). The activity of muscle
exopeptidases has been also studied due to the high increase in free amino acids
and small peptides, which greatly influence the unique flavor characteristics of dry-
cured ham at the end of processing (3, 4).
Despite several studies describing the presence of amino acids and peptides at the
end of the curing process (5-7), the identity of these peptides has remained elusive
(8, 9). The information derived from the knowledge of the protein fragments naturally
generated during dry-curing would be very important for a better understanding of the
texture changes and flavor development mechanisms occurring in this process.
Myosin is the major myofibrillar protein in skeletal muscle, making up more than one-
third of the total protein in muscle. This protein is very large (~500 kDa) and contains
two identical heavy chains, which constitute the head and tail domains, and two sets
of light chains (two per head), which bind the heavy chains in the region between the
head and tail. Myosin plays a key role in muscle contraction, being responsible for
producing the contractile force.
Titin, also known as connectin, is the third most abundant protein of vertebrate
striated muscle, after myosin and actin. The titin molecule is formed by a single
polypeptide chain with a molecular weight of up to ~4 MDa, constituting the largest
protein found so far in nature. The molecule is a flexible filament longer than 1 μm
Capítulo 5
185
(10). Interestingly, several studies have now suggested that titin degradation is
concurrent with the development of meat tenderness (1, 11, 12).
In the present work, we have carried out a proteomic analysis of peptides generated
in dry-cured ham in order to understand better the mechanisms leading to the
development of final texture and flavor characteristics of this product.
MATERIALS AND METHODS Extraction and deproteinization of dry-cured ham The three Serrano dry-cured hams used in this study were produced using raw
material from intensively reared industrial genotype pigs (Landrace x Large White),
which were 6 month old at the moment of the slaughtering. These hams were
processed in a local factory in Castellón (Spain) and were submitted to a ripening
process of 9 months.
A 50 g sample of Serrano dry-cured ham (Biceps femoris) was minced and then
homogenized in 100 mL of 0.01 N HCl using a stomacher apparatus (Seward
Laboratory Systems Inc.) for 8 min. The mixture was centrifuged at 4 ºC and 24500 g
for 20 min. The resulting supernatant was filtered through glass wool; the solution
was deproteinized by adding 3 volumes of ethanol and allowed to stand for 20 min at
4 ºC. Finally, the sample was centrifuged (24500 g) for 10 min at 4 ºC, and the
supernatant was dried in a rotatory evaporator. The residue remaining from the
extract was finally redissolved in 25 mL of 0.01 N HCl. Finally, the sample was filtered
through a 0.45 μm nylon membrane filter (Millipore, Bedford, MA) and stored at -20
ºC until use.
Size-exclusion chromatography To fractionate the deproteinized cured ham extract on the basis of molecular weight,
5 mL of the extract was subjected to size-exclusion chromatography on a Sephadex
G25 column (2.5 x 65 cm, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden), at 5 ºC. The
degassed mobile phase was 0.01 N HCl, filtered through a 0.22 μm membrane filter.
The separation was performed at a flow rate of 15 mL/h, and fractions of 5 mL were
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186
collected using an automatic fraction collector (Model 2110, Bio-Rad Laboratories,
U.K.). These fractions were monitored at 214, 254 and 280 nm with an UV
spectrophotometer (Agilent 8453, Agilent Technologies, Palo Alto, CA). The fractions
corresponding to an elution volume between 125 and 190 mL were pooled, then dried
centrifuging under vacuum, and stored at -20 ºC.
Reversed-phase chromatography The dried sample was redissolved in 5 mL of 0.1% trifluoroacetic acid (TFA, v/v) in
water/acetonitrile (95:5, v/v) and filtered through a 0.22 μm nylon membrane filter.
After filtering, 500 μL of the redissolved sample was injected into a Bio-Cad™
workstation liquid chromatograph (Perseptive Biosystems, Framingham, MA). The
chromatographic separation was developed using a Nucleosil C18 column (250 x 4.6
mm, 5 μm particle size) from Macherey-Nagel (Düren, Germany) at room
temperature. Mobile phases comprised solvent A, containing 0.1% TFA in water (v/v)
and solvent B, containing 0.08% TFA in water/acetonitrile (5:95). The degassed
solvents were filtered through a 0.22 μm filter. The separation conditions consisted of
solvent A isocratically for 10 min, followed by a linear gradient from 0 to 100% of
solvent B over 90 min at a flow rate of 1 mL/min. The separation was monitored using
a diode array detector at a wavelength of 214 nm, and 1 mL fractions were collected.
Two of these fractions, containing myosin light chain I fragments and corresponding
to the maximum level of absorbance, were pooled together, dried under vacuum, and
stored at -20 ºC. Another four fractions were selected and chromatographed again to
improve the isolation of the titin fragments. To carry out this second chromatographic
analysis, the same column and conditions described above were used but with 0.08%
TFA in water/acetonitrile (40:60) as solvent B. Separation was monitored at 214 nm
and fractions corresponding to different maximal absorbances were collected
manually, subsequently dried under vacuum, and stored at -20 ºC.
Molecular mass determination and peptide identification by mass spectrometry Dried fractions were redissolved in 40 μL of 0.1% TFA in water. A sample (1 μL) of
each fraction was spotted onto an AnchorChip plate (Bruker Daltonik GmbH, Bremen,
Capítulo 5
187
Germany) and mixed with 1 μL of 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB, Bruker Daltonik
GmbH) in 0.1% TFA/acetonitrile (2:1, v/v). After air-drying, the plate was introduced in
a Bruker Reflex III matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass
spectrometer (MALDI-TOF MS, Bruker Daltonik GmbH). The instrument was used in
positive-ion reflector mode for mass analysis with an ion acceleration voltage of 20
kV. Spectra were obtained from the average of 300 laser shots. Mass calibration was
performed using a peptide calibration standard in a mass range between 1000 and
3000 Da (code 206195, Bruker Daltonik GmbH). FlexAnalysis 2.4 software (Bruker
Daltonik GmbH) was employed for data analysis.
To identify the peptides by tandem mass spectrometry, they were separated using an
Ultimate/Famos nano LC system (LC Packings, Amsterdam, The Netherlands). The
sample was loaded onto a 0.2 x 5 mm PS-DVB monolithic trap column (Dionex,
Sunnyvale, CA, USA) at a flow rate of 10 μl/min of 0.1% TFA for 30 min. After pre-
concentration, the trap column was automatically switched in-line with a Dionex poly-
(styrene-divinylbenzene) (PS-DVB) monolithic column (0.1 x 50 mm) to elute peptides
with a linear gradient starting from 95% solvent A (0.1% formic acid in water, v/v) to
40% solvent B (0.1% formic acid in CAN, v/v) for 120 min, at a flow rate of 100
nL/min. The column outlet was directly coupled to a nanoeletrospray ion source
(Protana, Odense, Denmark) using a 10 µm PicoTip (New Objective, Woburn, MA).
The positive TOF mass spectra were recorded on a QSTAR Pulsar i hybrid
quadrupole TOF instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA) using information-
dependent acquisition (IDA). TOF MS survey scans were recorded over a mass
range of m/z 400 - 1600, followed by MS/MS scans of the two most intense peaks.
Typical ion spray voltage was in the range of 2.0 - 2.4 kV and nitrogen was used as
collision gas. Other source parameters and spray position were optimized with a
tryptic digest of bovine serum albumin.
Automated spectral processing, peak list generation, and database searches were
performed using Mascot search v1.6b21 script for Analyst QS 1.1 (Applied
Biosystems) in combination with the Mascot interface
(hppt://www.matrixscience.com). Identification of the proteins from which the peptides
were derived was performed by homology blasting using the NCBI nonredundant
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188
protein database. Matches of MS/MS spectra against sequences of the database
were verified manually.
To validate the results, two replicates of the technical analysis were done to confirm
the myosin light chain I and titin sequences.
RESULTS Peptide isolation and purification by reversed-phase HPLC Fractions corresponding to an elution volume between 125 and 190 mL obtained after
Sephadex G-25 size-exclusion chromatography and containing peptides between
1000 and 3000 Da, were pooled together and subjected to preparative reversed-
phase chromatography. Peptides eluting at a concentration of acetonitrile (ACN) from
28% to 30%, were pooled together, dried, and subjected to mass spectrometry for the
identification of myosin light chain I fragments. Additionally, titin peptides were
obtained in four fractions at an ACN concentration of 31% - 35%. A second reversed-
phase chromatographic step was needed for further fractionation to improve the
isolation of titin fragments. Thus, after this step, a main peak eluting at 38% ACN was
collected for further peptide identification.
De novo peptide sequencing using mass spectrometry Myosin light chain I fragments
Fractions selected after the first reversed-phase chromatography were subjected to
MALDI-TOF mass spectrometry to determine peptide molecular masses. Four singly
charged ions (M + H+) were obtained at m/z values 2046.07, 1903.99, 1735.88 and
1567.74 (spectra in ‘Supporting Information’). The same fraction was subjected to
quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry along with a nanoelectrospray
ionisation source liquid chromatography (nanoLC-nESI-QTOF-MS) in order to
elucidate the sequence of the peptides in this fraction. A total of nine peptide
sequences were identified (see Tables 1 and 2). The molecular masses of peptides
1, 2, 4 and 5 were in accordance with the signals obtained from MALDI-TOF MS.
Capítulo 5
189
Figure 1 shows the MS/MS spectrum corresponding to peptide 1 (other spectra are
not shown).
Table 1. Sequence of the nine myosin light chain I fragments identified by LC-MS/MSa.
a Spectra were interpreted both manually and using the online form of the MASCOT program. Superscripts indicate the position of the fragments in the protein.
All the identified myosin light chain I peptides share the common sequence
PAPPKEEK (peptide 9), which corresponds to the C-terminus of the peptides.
However, as can be observed in Table 1, the identified peptides show remarkable
differences at their N-termini. Peptide 1 contains two additional amino acids at the N-
terminus compared with peptide 2, whereas peptide 2 has an additional proline than
peptide 3. Finally, a consecutive loss of the dipeptide Pro-Ala is observed from
peptide 4 to peptide 8. BLAST sequence similarity searches revealed 100%
homology of the nine peptides to porcine myosin light chain I (accession number
ABK55642 in NCBI nonredundant database), as shown in Figure 2.
Titin fragments
The main peak obtained after the second chromatographic step, analyzed by MALDI-
TOF MS, showed the molecular ions in Figure 3. Among the peaks showing the
highest intensities, singly charged ions (M + H+) were obtained at m/z values
2130.97, 2260.02, 2358.10 and 2487.14.
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190
Table 2. Myosin light chain (MLCI) fragments identified in the Biceps femoris muscle of a dry-cured ham by nanoLC-MS/MS.
Peptide Observeda Charged State Calculatedb Scorec Positiond MALDI-TOFe LC-MS/MSe
1 682.74 (3+) 2045.09 83 14-35 X X
2 635.38 (3+) 1903.02 89 16-35 X X
3 603.03 (3+) 1805.97 91 17-35 X
4 579.32 (3+) 1734.93 78 18-35 X X
5 523.28 (3+) 1566.84 69 20-35 X X
6 467.28 (3+) 1398.75 59 22-35 X
7 411.24 (3+) 1230.66 54 24-35 X
8 532.31 (2+) 1062.57 50 26-35 X
9 448.25 (2+) 894.48 27 28-35 XaMolecular ion mass observed in the LC-MS/MS system calculated in daltons. bCalculated relative molecular mass
(Da) of the matched peptide. c Score obtained in Mascot using the NCBI nonredundant protein database. dPosition of
the peptides inside the partial MLCI sequence identified for porcine specie (NCBI accession no. ABK55642).ePeptides marked with an 'X' were observed using the corresponding mass spectrometric technique.
The same fraction was also subjected to nanoLC-MS/MS in order to elucidate the
sequences of the peptides in it. A total of five peptide sequences were identified (see
Tables 3 and 4), their molecular masses being in accordance to the most intense
signals obtained in MALDI-TOF MS (Figure 3). The MS/MS spectra of the tetra-
charged ions 533.57, 565.83, 590.40 and 622.62, matched the peptide sequence
PEIKPAIPLPGPEPKPKPEP for peptide 10, PEIKPAIPLPGPEPKPKPEPE for peptide
11, KVPEIKPAIPLPGPEPKPKPEP for peptide 12 and
KVPEIKPAIPLPGPEPKPKPEPE for peptide 13. A fifth peptide not detected
previously by MALDI-TOF-MS was also identified. The MS/MS spectrum for the
doubly-charged precursor matched the sequence PGPEPKPKPEPE (peptide 14),
which corresponds to the C-terminal side of peptides 11 and 13. Figure 4 shows the
MS/MS spectrum of peptide 14.
As can be observed (Table 3), the identified titin peptides share a common sequence
but showing differences at both N- and C- termini. Thus, peptides 11 and 13 have an
additional glutamic acid at the C-terminus compared to peptides 10 and 12. On the
Capítulo 5
191
other hand, peptides 12 and 13 contain two additional amino acids (Lys-Val) at the N-
terminal position.
Peptide 1 (682.743+ )
Peptide 1 (682.743+ )
b Seq y
1 72.04 A 22
2 143.08 A 1975.06 21
3 240.13 P 1904.03 20
4 311.17 A 1806.97 19
5 408.22 P 1735.94 18
6 479.26 A 1638.88 17
7 576.31 P 1567.85 16
8 647.35 A 1470.79 15
9 744.40 P 1399.76 14
10 815.44 A 1302.71 13
11 912.49 P 1231.67 12
12 983.53 A 1134.62 11
13 1080.58 P 1063.58 10
14 1151.62 A 966.53 9
15 1248.67 P 895.49 8
16 1319.71 A 798.44 7
17 1416.76 P 727.40 6
18 1513.82 P 630.35 5
19 1641.91 K 533.29 4
20 1770.95 E 405.20 3
21 1899.99 E 276.16 2
22 K 147.11 1 Figure 1. MS/MS spectrum of ion 682.743+ (peptide 1). Peptide sequence matching the product ion spectrum is shown in capital letters, together with observed b and y ions. The spectrum is presented with its corresponding table showing the ions matched by MASCOT in bold letters.
BLAST sequence similarity searches revealed 100 % homology of the five peptides to
a partial sequence of porcine muscle titin (entry name AAD00528 in NCBI
nonredundant protein database), shown in Figure 5.
J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 3228-3234
192
DISCUSSION Extensive proteolysis has been reported during the processing of dry-cured ham (13,
14). This implies the degradation of both sarcoplasmic and myofibrillar proteins by
muscle endopeptidases (mainly by cathepsins and calpains) and the further
degradation of the generated polypeptides by the action of certain groups of
exopeptidases such as dipeptidyl peptidases (15).
10 20 30 40 50 60 MAPKKDVKKP AAAAAPAPAP APAPAPAPAP PKEEKIDLSA IKIEFSKEQQ DEFKEAFLLF 70 80 90 100 110 120 DRTGECKITL SQVGDVLRAL GTNPTNAEVK KVLGNPSNEE MNAKKIEFEQ FLPMLQAISN 130 140 150 160 170 180 NKDQGSYEDF VEGLRVFDKE GNGTVMGAEL RHVLATLGEK MKEEEVEALM AGQEDSNGCI 190 NYEAFVKHIM SI Figure 2. Sequence corresponding to porcine myosin light chain I (NCBI nonredundant database accession number ABK55642). The same sequence also corresponds to the entry A1XQT6_PIG in UniProtKB/TrEMBL protein database. Cleavage sites of the peptides identified in the present work are indicated with black arrows.
Possible role of endopeptidases Cathepsins are lysosomal enzymes that play an important role in both the
development of meat tenderness and during dry-cured ham processing (14, 16). They
have been implicated in the breakdown of most myofibrillar proteins and connective
tissue, playing an important role in the development of meat texture (17). Several
studies have related the action of cathepsins with the progressive disappearance of
myosin. For example, incubation of rabbit skeletal muscle myosin with cathepsin B
proved the degradation of myosin heavy chain and one of the myosin light chains, L2,
by this enzyme (18). Etherington also established that both cathepsins B and D were
especially active against myosin. This author tested purified liver cathepsin L against
intact myofibrils and found the enzyme degraded myosin, although to a lesser extent
Capítulo 5
193
than other proteins like titin (19). In contrast, other authors reported that myosin was
not degraded by rabbit skeletal muscle cathepsin B, while cathepsin L, isolated from
rabbit skeletal muscle, was able to hydrolyse myosin at pH 4.1 (20). In this way, a
progressive disappearance of myosin light chains 1 and 2 during the dry-curing
process was suggested (21). According to these authors, the disappearance of
myosin light chains 1 and 2 could be due to cathepsins L and D, despite cathepsin D
activity being notably reduced after 4-6 months of processing, due to its inhibition in
the presence of high levels of NaCl.
Table 3. Sequences of the five titin fragments identified by LC-MS/MS. Spectra were interpreted both manually and using the online form of the MASCOT program. Superscripts indicate the position of the fragments in the protein.
Table 4. Titin fragments identified in the Biceps femoris muscle of a dry-cured ham by nanoLC-MS/MS.
Peptide Observed a Charged State Calculated b Score c Position d MALDI-TOF e LC-MS/MS e
10 533.57 (4+) 2130.21 62 97-116 X X
11 565.83 (4+) 2259.25 47 97-117 X X
12 590.40 (4+) 2357.37 70 95-116 X X
13 622.62 (4+) 2486.41 76 95-117 X X
14 651.35 (2+) 1300.67 43 106-117 Xa Molecular ion mass observed in the LC-MS/MS system calculated in Daltons. bCalculated relative molecular mass
(Da) of the matched peptide.c Score obtained in Mascot using the NCBI non-redundant protein database. dPosition ofthe peptides inside the partial titin sequence identified for porcine specie (NCBI accession number AAD00528).ePeptides marked with an 'X' were observed using the corresponding mass spectrometric technique.
The action of cathepsin D in the degradation of myofibrillar proteins has been widely
studied during meat ageing (21). Cathepsin D has been found to be specially active
against myosin heavy chains, titin, proteins M and C, actin, tropomyosin, troponins I
J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 3228-3234
194
and II and myosin light chains as well as altering the Z disk structure (22). The
degradation of myosin light chains by cathepsin D has also been studied by
incubating purified cathepsin D with myofibrils at pH 5.5 and 37 ºC (23). According to
these authors, myosin light chains were degraded at a much slower rate than myosin
heavy chains. The peptide sequences corresponding to the hydrolysis products were
not identified.
2487.140
2260.019
2808.234
1959.869
2130.969
2358.103
1773.8091520.674
1212.637
2917.2302714.216
2936.2252644.114
2559.903
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000m/z
Peptide 10
Peptide 11
Peptide 12
Peptide 132487.140
2260.019
2808.234
1959.869
2130.969
2358.103
1773.8091520.674
1212.637
2917.2302714.216
2936.2252644.114
2559.903
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
4x10
Inte
ns. [
a.u.
]
1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000m/z
Peptide 10
Peptide 11
Peptide 12
Peptide 13
Figure 3. MALDI-TOF mass spectrum of the titin fraction collected manually after the second reversed-phase chromatography.
Calpains constitute another relevant group of endopeptidases, even though many
authors have established that they do not degrade myosin and actin (24). The
proteolytic activity of calpains has been reported by many authors (12, 25). In fact,
binding assays using two titin regions showed that, in the presence of inhibitors, a titin
fragment external to the N1 line that bears the PEVK/N2 region, tightly bound μ-
calpain enzyme, whereas in their absence, both fragments were cleaved by the
enzyme (26). The titin PEVK region has been suggested to be directly involved in the
Capítulo 5
195
mechanism of elasticity, contributing to passive force development of relaxed skeletal
muscle during stretch (27). In relation to this, it is worth noting that the five titin
fragments identified in our study belong to the last part of the PEVK region, situated in
the extreme C-terminal region of titin (28). This finding would suggest that both μ-
calpain and calpain 3 may be responsible for the protein breakdown at this level, thus
contributing to the intense protein breakdown that occurs during the early steps of
dry-cured processing (29).
Figure 5. Partial sequence of porcine titin (NCBI protein accession number AAD00528). The same sequence also corresponds to the entry O97771 in UniProtKB/TrEMBL protein database. Cleavage sites of the peptides identified in the present work are indicated with black arrows. 10 20 30 40 50 60GSVSCTATLT VTVPGGEKKV RKLLPEPKPE PKEEVVLKSV LRKRPEEEEP KVEPKKLEKI 70 80 90 100 110 120KKPAVPEPPP KAVEEVEAPP AAVPKRERKV PEPTKVPEIK PAIPLPGPEP KPKPEPEVKV 130 140 150 160 170 180IKPPPVEPPP APIAAPVTVP VVGKKAEAKA PKEEAAKPKG PIKGVAKKTP SPIEAERKKL 190 200 210 220 RPGSGGEKPP DEAPFTYQLK AVPLKFVKEI QDIVLTEAES VGSSAIFE
Possible role of exopeptidases
Dipeptidyl peptidases (DPP I, II, III and IV) are enzymes that release different
dipeptides from the N-terminus of peptides. Considering the high stability of dipeptidyl
peptidases during the processing of dry-cured ham (30) and the consecutive loss of
dipeptides observed in the N-terminal side of the peptides identified in this work (see Tables 1 and 2), these enzymes could be the responsible for the loss of N-terminal
dipeptides from myosin light chain I and titin peptides. Table 1 shows the loss of Ala-
Ala in peptide 1 to obtain peptide 2, as well as the consecutive loss of Pro-Ala, giving
rise to peptides 5 - 9. These dipeptides could contribute, together with amino acids
and other nonvolatile compounds, to flavor development in dry-cured ham (7).
J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 3228-3234
196
Peptide 14 (651.352+)
b2b3
b4
b5 b6b8 b10y3
y4
y6
y8
y11
P G P E P K P K P E P E
b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9
y1y2y3y4y5y6y7y8y10y11
y10
y9
b10
y2
y1 y5 y7b7 b9 y9
b2b3
b4
b5 b6b8 b10y3
y4
y6
y8
y11
P G P E P K P K P E P E
b2 b3 b4 b5 b6 b7 b8 b9
y1y2y3y4y5y6y7y8y10y11
y10
y9
b10
y2
y1 y5 y7b7 b9 y9
Peptide 14 (651.352+)
b Seq. y
1 98.06 P 12
2 155.08 G 1204.62 11
3 252.13 P 1147.60 10
4 381.18 E 1050.55 9
5 478.23 P 921.50 8
6 606.32 K 824.45 7
7 703.38 P 696.36 6
8 831.47 K 599.30 5
9 928.52 P 471.21 4
10 1057.57 E 374.16 3
11 1154.62 P 245.11 2
12 E 148.06 1 Figure 4. MS/MS spectrum of ion 651.352+ (peptide 14) of the main peak obtained after the second reversed-phase chromatography. Peptide sequence matching the product ion spectrum is shown in capital letters, together with observed b and y ions. The spectrum is presented with its corresponding table showing the ions matched by MASCOT in bold letters.
Capítulo 5
197
DPP I preferentially hydrolyzes N-terminal peptides with a penultimate basic residue,
even though the synthetic derivative Ala-Ala-pNa was also hydrolyzed by porcine
DPP. On the other hand, those peptides containing a basic amino acid in the N-
terminal position are not hydrolyzed by this enzyme, as well as those containing a
proline residue on either side of the peptide bond (31). Thus, it does not seem likely
that DPP I could be responsible for the sequential loss of the dipeptide Pro-Ala in
peptides 4 - 8, due to the presence of proline in the C-terminus of the scissile bond
and at the P1 position of these peptides. On the other hand, the action of DPP I with
peptide 1 and peptides 12 and 13 also seem unlikely, due to the presence of Pro in
the scissile bond and the presence of Lys in N-terminal position, respectively.
DPP II from porcine skeletal muscle preferentially hydrolyzes the synthetic substrates
of type X-Pro-, followed by those of type X-Ala- in both fluorescent (dipeptidyl 7-
amido-4-methyl-coumarin (AMC)) and colorimetric (dipeptidyl-pNa) derivatives (32).
Some authors have established that basic, neutral and acidic amino acids are
accepted in the N-terminal position of peptides, decreasing their relative activities in
this order (33). Thus, the presence of Ala, Pro and Lys in this position could make
peptides 1, 4 - 8, 12, and 13 potential substrates for this enzyme although these
authors also established that rat brain DPP II activity decreases drastically with
increasing chain length of the peptides.
Arg-Arg-AMC is the most commonly used substrate to determine DPP III activity,
although Ala-Ala-pNa is also hydrolyzed by the enzyme (34). No activity was detected
against peptide sequences containing more than 10 amino acids or a proline residue
on either side of the scissile bond using DPP III purified from guinea-pig brain (35).
Therefore, it seems unlikely that DPP III is involved in the generation of any of the
fragments identified in this study because of their length (more than 10 amino acids in
peptides from 1 to 8 and from 10 to 14) and the presence of a Pro residue in the
scissile bond.
Substrates for DPP IV are those peptides containing a proline residue in the N-
penultimate position and, to a lower degree, those containing alanine in this position
(36). These authors also established that peptides were hydrolyzed by DPP IV even if
they contained a proline residue also in the third position from the N-terminus. Other
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198
authors disagree, observing an inhibition of DPP IV with a number of nonsubstrate
oligopeptides containing an N-terminal X-X-Pro- structure (37). The degree of
inhibition by these peptides depends on their length, with the most potent inhibition
shown by the longest peptides tested (peptides between 13 and 86 amino acids). A
wide number of natural peptides contain this X-X-Pro- structure and thus, according
to these authors, it is conceivable that the DPP IV activity is regulated by such
peptides in vivo.
In summary, any dipeptidyl peptidase with the exceptions of DPP I and DPP III could
be responsible for the loss of the dipeptide Ala-Ala in peptide A. On the other hand,
and due to the lack of literature related to the DPP specificity to the substrates Pro-
Ala- and Lys-Val-, it is difficult to elucidate the enzymes involved in the loss of these
dipeptides, although the action of DPP II and/or DPP IV would be feasible.
In conclusion, the peptides identified in this work provide clear evidence of the
extensive hydrolysis of proteins during dry-cured ham processing. The myosin light
chain I fragments identified could constitute evidence of the contribution of dipeptidyl
peptidases in the generation of dipeptides during dry-cured ham processing. These
dipeptides could contribute, together with other nonvolatile compounds, to flavor
development in dry-cured ham. Some peptide fragments belong to the PEKV region
of titin, a protein that is directly implicated in the elasticity of the sarcomere. The
hypothetical action of μ-calpain and calpain 3 over this region would make these
enzymes potentially responsible for the protein breakdown that occurs during the
early dry-curing stage. Better knowledge about the enzymatic action that takes place
during dry-cured ham processing is needed to provide a thorough understanding of
the main enzymes involved and how their action influences the texture changes and
flavor generation during processing.
ACKNOWLEDGMENTS Food Standards Agency project Q 01R006 (United Kingdom), FPU scholarship from
Ministerio de Educación y Ciencia (Spain) to L.M., Grant AGL2007-65379-C02-01/ALI
from Ministry of Education and Science (Madrid, Spain) and FEDER are fully
Capítulo 5
199
acknowledged. We are grateful to Dr. Ahmed Ouali (INRA, France) for his valuable
assistance in the discussion of the results. Special thanks also to Raj Patel, John
Halket and Chris Gerrish (Royal Holloway) for their helpful advice. LITERATURE CITED 1. Lametsch, R.; Karlsson, A.; Rosenvold, K.; Andersen, H. J.; Roepstorff, P.; Bendixen,
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202
Capítulo 6Oligopéptidos derivados de la degradación de la creatina quinasa en jamón
curado
Capítulo 6
205
Oligopeptides arising from the degradation of creatine kinase in Spanish dry-cured ham
Leticia Mora1,2, Miguel Angel Sentandreu2, Paul D. Fraser1, Fidel Toldrá2 and
Peter M. Bramley1
1. Center for Systems and Synthetic Biology, School of Biological Sciences, Royal Holloway, University of London, Egham TW20 0EX, U.K..
2. Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), P.O. Box 73, 46100 Burjassot, Valencia, Spain
Received for review May 11, 2009. Revised manuscript received July 16, 2009. Accepted July 24,
2009.
Abstract
During the processing of dry-cured ham many biochemical changes occur, including the degradation
of muscle proteins. These changes are due to the intense action of endogenous proteolytic
enzymes. In the present study, the isolation and identification of a large number of peptides derived
from creatine kinase has been achieved for the first time in dry-cured ham. A total of 58 peptides
coming from different regions of the protein have been identified by mass spectrometry. This study
provides evidence for the extensive degradation of creatine kinase during the processing of dry-
cured ham as well as the role played by endo- and exopeptidases in the generation of small peptides
and free amino acids from polypeptides. These peptides are important in the development of
characteristic sensory properties associated with dry-cured ham.
Keywords: Dry-cured ham; creatine kinase; proteolysis; aminopeptidases; proteomics; mass
spectrometry, peptides.
J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 8982-8988
206
INTRODUCTION
Traditional Spanish dry-cured ham is a high-quality product that requires prolonged
processing. During this process many biochemical reactions responsible for the
products final characteristic traits, such as texture and flavor, occur. One of the main
changes arising in skeletal muscle during the dry-curing process is the degradation of
protein (1, 2). Muscle endopeptidases like cathepsins and calpains degrade the
muscle protein structure giving rise to large polypeptides, that are further degraded to
smaller peptides and free amino acids by exopeptidases such as aminopeptidases
and carboxypeptidases. The action of these enzymes during processing is of great
importance because they are directly responsible for changes in postmortem muscle
texture (3-5) and for the flavor development that occurs during the ripening of dry-
cured meat products (2, 6-8).
Creatine kinase (CK; E.C.2.7.3.2.) is a sarcoplasmic protein and, functionally, is an
enzyme involved in energetic metabolism of tissues, such as skeletal muscle, with
high and fluctuating energy demands in vivo. In this way, adenosine triphosphate
(ATP) is continuously regenerated by the action of CK, which catalyzes the
transphosphorylation reaction between phosphocreatine (PCr) and adenosine
diphosphate (ADP). This enzyme is used as an indicator of pre-slaughter physical
stress/muscle damage in animal production by the measurement of its levels in blood
(9, 10). Early postmortem, CK continues to exert important functions related to the
conversion of muscle into meat. Numerous studies have related this enzyme to meat
quality (11), establishing a negative correlation between the solubility of sarcoplasmic
proteins (being CK the major denatured protein) and drip loss (12, 13) or pale colour
(13, 14) in porcine meat. The texture of meat may also be affected somehow by the
denaturation of sarcoplasmic proteins. In this way, the insolubilization of sarcoplasmic
proteins, including CK, during vinegar curing of mackerel meat was hypothesized to
be responsible for the texture changes caused by the curing process (15). Recently,
some authors have established a positive correlation between abundance of the full-
length CK and firmness of fish meat, suggesting that limited proteolysis of CK in firm
fish is possibly related to minimised oxidative conditions (16).
Capítulo 6
207
Many authors have reported the intense proteolysis suffered by sarcoplasmic proteins
during dry-cured ham processing, reporting the degradation of CK occurred along the
ripening period (17, 18). Although there is evidence of the presence of creatine kinase
and other protein fragments at the end of the curing period, little is known about the
identity of specific peptide sequences coming from the degradation of this protein in
dry-cured ham (19, 20). A CK fragment was identified after characterization of
proteolysis during the ripening of semi-dry fermented sausages (21), whereas a total
of three CK fragments were isolated and identified during postmortem aging in bovine
Longissimus dorsi muscle (22).
Information derived from the knowledge of the protein fragments naturally generated
during dry-curing of meat products would be very important to better understand both
proteolysis and flavor development. Thus, the main objective of the present work was
to elucidate some of the changes occurring in the sarcoplasmic fraction of Spanish
dry-cured ham, though the identification of a large number of peptides generated from
CK degradation.
MATERIALS AND METHODS Dry-cured ham preparation Three Spanish dry-cured hams were produced using raw material from 6-months-old
pigs (Landrace x Large White). Selected hams were bled and prepared according to
traditional procedures: (1) Hams were presalted using a mixture of curing ingredients
(salt, nitrate and nitrite) for 30 min to avoid microbiological spoilage. (2) In the salting
stage, hams were placed fat side down, entirely buried in salt, and piled up without
touching each other in salting chambers for 11 - 12 days. During this stage, curing
agents slowly diffuse into the hams. The salting chambers were set at 4 ºC and 85-
90% relative humidity. (3) After salting, hams were brushed to remove remaining salt
from their surfaces and transferred to the postsalting chamber, where a complete salt
equalization takes place. The temperature was kept below 4 ºC for 50 days and the
relative humidity in the chambers was established between 75-85%. (4) During the
last stage, corresponding to the ripening period, hams were placed in air-conditioning
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208
chambers and subjected to different time, temperature and relative humidity cycles.
Higher temperatures (14 - 20 ºC) and lower relative humidity (until 70%) were set
during ripening to accelerate the drying process. The total length of the curing
process was 9 months.
Dry-cured ham extraction and deproteinization A total of 50 g of Biceps femoris muscle coming from the processed dry-cured hams
and previously removed from their extramuscular fat, were minced and homogenized
with 100 mL of 0.01 N HCl in a stomacher (IUL Instrument, Barcelona, Spain) for 8
min. The homogenate was centrifuged in the cold (24500 g for 20 min at 4 ºC), and
after filtering through glass wool, the supernatant was deproteinized by adding 3
volumes of ethanol and maintaining the sample 20 min at 4ºC. After that, the sample
was centrifuged again (24500 g for 20 min at 4ºC), and the supernatant was dried in a
rotatory evaporator. The dried deproteinized extract was redissolved in 25 mL of 0.01
N HCl, filtered through a 0.45 μm nylon membrane filter (Millipore, Bedford, MA) and
stored at -20 ºC until use.
Molecular mass fractionation A 5 mL aliquot of the deproteinized dry-cured ham extract was subjected to size-
exclusion chromatography to fractionate the peptides according to their molecular
mass. For this purpose, a Sephadex G25 column (2.5 x 65 cm) (Amersham
Biosciences, Uppsala, Sweden), previously equilibrated with 0.01 N HCl, was
employed. The separation was performed using an isocratic gradient of 0.01 N HCl at
a flow rate of 15 mL/h. Fractions of 5 mL were collected using an automatic fraction
collector and further monitored by ultraviolet (UV) absorption at 214 nm using an
Agilent 8453 UV spectrophotometer (Agilent Technologies, California, USA).
Fractions corresponding to a molecular weight between 1000 and 4000 Da were
pooled together, dried under vacuum, and redissolved in 5 mL of 0.1% trifluoroacetic
acid in water/acetonitrile (95:5, v/v).
Capítulo 6
209
Reversed-phase chromatography
A 100 μL aliquot of the redissolved mixture of peptides was injected into an HPLC
Agilent 1100 Series system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) equipped with an
autosampler and a diode array detector, which was used in the range 195 - 300 nm.
The separation of peptides was carried out using a 250 x 4.6 mm, 5 μm, Symmetry
C18 column from Waters (Milford, MA) at 25 º C. Mobile phases consisted of solvent
A, containing 0.1% trifluoroacetic acid in water, and solvent B, containing 0.05%
trifluoroacetic acid in water/acetonitrile (5:95). Both mobile phases A and B were
filtered through a 0.45 μm filter and degassed prior to any analytical run. The
chromatographic separation consisted of a 5 min isocratic gradient with solvent A,
followed by a linear gradient from 0 to 40% of solvent B in 70 min at a flow rate of 1
mL/min. The separation was monitored using a diode array detector at a wavelength
of 214 nm and 1 mL fractions were collected and lyophilized separately.
Molecular mass determination by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry The molecular mass of peptides contained in the reversed-phase HPLC fractions was
determined using a Reflex III MALDI-TOF mass spectrometer (MS) (Bruker Daltonik
GmbH, Bremen, Germany). By this way, fractions of interest were redissolved in 30 -
50 μL of 0.1% trifluoroacetic acid according to the concentration of peptides expected
in each fraction. A total of 1 μL of each fraction was spotted onto an AnchorChip
MALDI plate (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany) and mixed with 1 μL of 2,5-
dihydroxybenzoic acid (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany) in 0.1%
trifluoroacetic acid/acetonitrile (2:1, v/v). After air-drying, the plate was introduced in
the MALDI-TOF MS. The instrument was used in positive-ion reflector mode, and ion
acceleration voltage was 20 kV. Spectra were obtained from the average of 300 laser
shots. Mass calibration was performed using a peptide calibration standard with code
206195 (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany) in a mass range between 1000
and 3000 Da. FlexAnalysis 2.4 software (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)
was employed for data analysis.
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210
Peptide identification by tandem mass spectrometry Peptides contained in the fractions obtained after reversed-phase chromatography
were further separated and identified by liquid chromatography coupled to tandem
mass spectrometry (LC-MS/MS) using an Ultimate/Famos nano LC system (LC
Packings, Amsterdam, The Netherlands) and a QSTAR Pulsar i hybrid quadrupole-
TOF instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA) equipped with a nano-
electrospray ion source (Protana, Odense, Denmark).
Fractions previously resuspended for MALDI-TOF analysis, were diluted 4 times
using loading buffer (0.1% of formic acid and 2% of acetonitrile in water). A total of 10
μL of the diluted samples was preconcentrated on a 0.3 x 5 mm, 3 μm, C18 trap
column from LC Packings (Dionex Company, Sunnyvale, CA) at a flow rate of
25 μL/min and using the loading buffer as mobile phase. After preconcentration, the
trap column was automatically switched in-line with a 0.075 x 150 mm, 3 μm, Dionex
C18 PepMap column from LC Packings. Mobile phases consisted of solvent A,
containing 0.1% formic acid in water, and solvent B, containing 0.1% formic acid in
acetonitrile. Chromatographic conditions were a linear gradient from 95% to 60%
solvent A in 70 min at a flow rate of 0.2 μL/min. The column outlet was directly
coupled to a nanoeletrospray ion source (Protana, Odense, Denmark) using a 10 µm
PicoTip EMITTER SilicaTip needle (New Objective, Woburn, MA). The positive TOF
mass spectra were recorded on the QSTAR instrument using information-dependent
acquisition (IDA). A TOF MS survey scan was recorded for mass range m/z 400 -
1600 followed by MS/MS scans of the two most intense peaks. A typical ion spray
voltage was in the range of 1.8 - 2.0 kV, using nitrogen as collision gas. Other source
parameters and spray position were optimized with a tryptic digest of bovine serum
albumin.
Automated spectral processing, peak list generation and database search was
performed using both Mascot search v1.6b21 script for Analyst QS 1.1 (Applied
Biosystems, Foster City, CA) in combination with the Mascot interface (Matrix
Science, Inc., Boston, MA) (hppt://www.matrixscience.com) and the ProteinPilot
2.0.1. software (Applied Biosystems, Foster City, CA) with Paragon algorithm.
Capítulo 6
211
Identification of the protein origin of peptides was done using NCBI nonredundant
protein database. Matches of MS/MS spectra against sequences of the database
were verified manually.
RESULTS AND DISCUSSION Isolation and purification of peptides A deproteinized dry-cured ham extract was submitted to size-exclusion
chromatography to fractionate the peptide mixture according to their molecular mass.
Fractions corresponding to elution volumes between 125 and 190 mL were pooled
together, concentrated, and subjected to reversed-phase chromatography. During this
chromatographic separation (Figure 1), 1mL fractions were collected and analyzed
separately by mass spectrometry.
0
100
200
300
400
500
600
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80Fractions
Abs
orba
nce
(mA
U)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Solvent B (%
)
Figure 1. Reversed-phase chromatographic separation of the selected pooled fractions obtained from size-exclusion chromatography. Dotted lines indicate the fractions where CK fragments have been detected. Bold line indicates the solvent gradient of the chromatographic separation. Peptide sequencing using mass spectrometry Fractions obtained after reversed-phase chromatography were subjected to MALDI-
TOF mass spectrometry to determine peptide molecular masses. By this way, 18
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212
singly charged ions (M + H+) corresponding to CK fragments were obtained. To
elucidate the sequence of the peptides, samples were further analyzed by liquid
chromatography coupled to a quadrupole time-of-flight mass spectrometer equipped
with a nanoelectrospray ionization source (nanoLC-nESI-QTOF MS). The molecular
masses of peptides 4-7, 13, 15, 19, 21, 42, 43, 47-49, 51, 53 and 55 were in
accordance to the signals previously obtained by MALDI-TOF MS (Table 1).
As can be seen in Table 2, a total of 58 peptide sequences have been identified.
Peptides have been arranged according to their position in the sequence of porcine
CK. Thus, peptide 1 has its initial position in Lys15, whereas peptide 58 finishes in
Lys381. Table 2 also shows the reversed-phase fraction (Figure 1) from where each
peptide has been identified. BLAST sequence similarities searches revealed 100%
homology of the whole peptides to the sequence of porcine M-type CK (accession
number NP-001123421 in the NCBI nonredundant database), which is shown in
Figure 2. All spectra were interpreted using the online form of the Mascot program,
the Paragon algorithm, and also manually. Figure 3 shows MS/MS spectrum
corresponding to peptide 36 as example of a mass spectrometric fragmentation.
Peptides 6 to 12, share the common sequence VIQTGVDNPGHPF (peptide 12).
However, at the N-terminal site, these peptides show important differences. Peptide 6
contains an additional leucine in this position with respect to peptide 7, whereas
peptides 8, 9, 10 and 11 show a consecutive loss of the amino acids threonine,
leucine and two aspartic acids, respectively. A similar profile is also observed in
peptides 13 to 18. This group shares the common sequence DVIQTGVDNPGHP
(peptide 18). With regard to the N-terminal side of this group of peptides, peptides 5,
12 and 16, and 6, 13 and 17, show the same profile.
Methionine is a common amino acid in the first and last section of the CK sequence
(Table 2) and all the peptides identified in these sections present at least an oxidation
of this amino acid. In fact, peptide 49 has been identified without modification but also
with one, two and three methionine oxidations (Table 1). On the other hand, peptides
50, 51 and 52 show just two methionine oxidations whereas peptides 5, 53, 55, 56
and 57 present one. Peptide 58 was identified in two ways, with a methionine
oxidation and also presenting an additional modification of glutamic acid to
Capítulo 6
213
pyroglutamic acid in its N-teminal site. Other modifications are glutamine (peptide 33)
and asparagine deamidation (peptides 27, 29, 30, 31 and 45), and aspartic acid
dehydration in peptides 31 and 40. 1 MPFGNTHNKY KLNFKAEEEY PDLSKHNNHM AKALTLEIYK KLRDKETPSG 51 FTLDDVIQTG VDNPGHPFIM TVGCVAGDEE SYVVFKDLFD PIIQDRHGGY 101 KPTDKHKTDL NHENLKGGDD LDPNYVLSSR VRTGRSIKGY TLPPHCSRGE 151 RRAVEKLSVE ALNSLTGEFK GKYYPLKSMT EQEQQQLIDD HFLFDKPVSP 201 LLLASGMARD WPDARGIWHN DNKSFLVWVN EEDHLRVISM EKGGNMKEVF 251 RRFCVGLQKI EEIFKKAGHP FMWNEHLGYV LTCPSNLGTG LRGGVHVKLA 301 HLSKHPKFEE ILTRLRLQKR GTGGVDTAAV GSVFDVSNAD RLGSSEVEQV 351 QLVVDGVKLM VEMEKKLEKG QSIDDMIPAQ K Figure 2. Primary sequence of porcine CK (NCBI nonredundant database accession number NP-001123421). The same sequence also corresponds to the entry KCRM_PIG in UniProtKB/Swiss-Prot protein database. Cleavage sites of the peptides identified in the present work are indicated with black arrows.
As shown in Table 1, peptides have been sequenced matching the MS/MS spectra of
2, 3, 4, and 6 times charged ions. In this way, 27 peptides were sequenced from
double-charged ions, whereas nineteen and thirteen peptides were sequenced from 3
and 4 times charged ions, respectively. Four peptides containing a high proportion of
basic amino acids were sequenced from 6 times charged ions (peptides 1-3 and 32).
Table 1 also indicates the exact position of the identified peptides within the CK
sequence, as well as their observed and calculated masses.
The 58 peptides identified in this study cover around the 44% of the total sequence of
CK protein and a total of 27 peptides have been identified in at least two of the three
studied hams.
Sarcoplasmic proteins correspond to approximately 30% of the total muscle protein
and are generally more susceptible to denaturation than myofibrillar proteins (23).
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214
Peptide 36 (586.712+)
Peptide 36 (586.712+)
b Sequence y 1 72.04 A 11 2 171.04 V 1101.61 10 3 300.07 E 1002.34 9 4 428.12 K 873.50 8 5 541.18 L 745.25 7 6 628.21 S 632.32 6 7 727.25 V 545.29 5 8 856.25 E 446.12 4 9 927.27 A 317.08 3 10 1040.30 L 246.05 2 11 N 133.00 1
Figure 3. MS/MS spectrum of ion 586.712+ (peptide 36). The peptide sequence matching the product ion spectrum is shown in capital letters, together with observed b and y ions. The spectrum is presented with its corresponding table showing the ions matched by MASCOT in bold letters.
Structural studies of rabbit and chicken CK based on the identification of the major
products obtained after digestion by trypsin, chymotrypsin and endoproteinase Glu-C,
showed that the C-terminal region (positions 215 to 380) was more resistant to
Capítulo 6
215
digestion than the N-terminal region (positions 1 to 133), whereas the central tract of
81 residues (positions 134 to 214), was particularly sensitive to digestion by all three
peptidases (24). Contrary to that, most CK fragments identified in this study
correspond to the C- and N-terminal portions of the protein (Figure 2). In the present
study, a total of 34 and 22 peptides from C- and N-terminal sections, respectively,
have been identified, whereas only 2 of the total 58 CK fragments sequenced in this
study come from the central section of the CK sequence. A possible explanation
would be an increased proteolysis suffered by the central area of CK during ripening,
which could have generated fragments smaller than 1000 Da, and thus out of the
peptide mass range studied in the present work.
Muscle sarcoplasmic proteins constitute relevant substrates for proteolysis occurring
during the processing of dry-cured ham. The main enzymes responsible for the
degradation of these proteins during this period are muscle endopeptidases and
certain groups of exopeptidases.
Cathepsins B (EC 3.4.22.1), H (EC 3.4.22.16) and L (EC 3.4.22.15) have been
reported to be stable during dry-cured ham processing, showing activity even after 15
months of processing (7, 25). Several studies relate the action of cathepsins with the
disappearance of CK. In fact, sea bass muscle sarcoplasmic extract was incubated
with a mixture of cathepsins L, B and D (EC 3.4.23.5), showing the degradation of the
CK-aldolase doublet (26). Studies carried out with these enzymes separately
established that both cathepsins B and L were especially active against CK, whereas
cathepsin D was not able to degrade any sarcoplasmic protein (16). However,
calpains (EC 3.4.22.17) might participate in the postmortem muscle proteolysis only
during the first stages of curing processes because both the high salt content and low
pH values found in subsequent steps would completely inhibit their activity. In this
way, it has been summarized that CK is an in vitro substrate of calpain, suggesting
that m-calpain might regulate the activity of this protein as well as its postmortem
degradation (27).
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216
Tabl
e 1.
CK
frag
men
ts id
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in B
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s fe
mor
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Spa
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dry
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d M
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F e
LC-M
S/M
S e
Iden
tifie
d f
Mas
cot
Para
gon
169
8.36
(6+)
4183
.14
1415
-50
XX
267
6.86
(6+)
4055
.04
1416
-50
X3
504.
61(6
+)30
21.6
214
25-5
0X
468
7.99
(3+)
2061
.15
2933
-50
XX
5*53
9.94
(4+)
2155
.99
4215
-32
XX
X6
739.
62(4
+)29
54.4
654
42-6
8X
X7
711.
35(4
+)28
41.3
632
43-6
8X
X8
912.
85(2
+)18
23.8
734
52-6
8X
986
2.3
(2+)
1722
.82
3353
-68
X10
805.
77(2
+)16
09.7
354
54-6
8X
X11
748.
25(2
+)14
94.7
139
55-6
8X
X12
690.
71(2
+)13
79.6
849
56-6
8X
1384
7.05
(3+)
2538
.19
4944
-67
XX
1480
8.71
(3+)
2423
.16
6345
-67
X15
839.
41(2
+)16
76.8
5652
-67
XX
1678
8.79
(2+)
1575
.75
6153
-67
XX
1773
2.25
(2+)
1462
.67
5254
-67
XX
1867
4.84
(2+)
1347
.64
5555
-67
XX
1969
3.83
(2+)
1385
.67
5052
-64
XX
X20
643.
24(2
+)12
84.6
247
53-6
4X
X21
832.
89(2
+)16
63.7
944
44-5
8X
X22
516.
26(3
+)15
45.9
613
31-4
3X
2359
9.24
(4+)
2393
.12
4110
6-12
6X
X24
589.
26(3
+)17
64.7
919
109-
124
XX
2558
4.89
(3+)
1751
.861
108-
123
XX
2655
1.57
(3+)
1650
.75
7210
9-12
3X
X27
712.
72(2
+)14
23.6
214
111-
123
X28
655.
23(2
+)13
08.5
914
112-
123
X29
552.
84(3
+)16
55.7
316
108-
122
X30
519.
25(3
+)15
54.6
815
109-
122
X31
θ65
5.21
(2+)
1308
.56
1411
1-12
2X
Scor
e c
Capítulo 6
217
3243
4.73
(6+)
2602
.323
95-1
15X
3361
7.82
(4+)
2468
.21
1689
-109
X34
552.
28(4
+)22
05.1
314
91-1
09X
3563
0.2
(2+)
1258
.68
4415
3-16
4X
3658
6.71
(2+)
1171
.64
6915
3-16
3X
3749
5.61
(3+)
1483
.81
1730
3-31
4X
3847
9.23
(3+)
1434
.76
3729
9-31
0X
3941
7.82
(3+)
1250
.64
1430
1-31
0X
40θ
842.
41(3
+)25
24.2
813
335-
358
X41
808.
32(2
+)16
14.8
579
344-
358
X42
973.
36(2
+)19
44.9
446
335-
352
XX
4391
7.27
(2+)
1831
.85
6833
5-35
1X
XX
4485
9.31
(2+)
1716
.83
6233
6-35
1X
4576
6.77
(2+)
1531
.71
1533
8-35
1X
4696
9.94
(2+)
1937
.954
332-
349
X47
803.
27(2
+)16
04.7
361
335-
349
XX
X48
739.
26(2
+)14
76.6
740
335-
348
XX
4963
7.75
(4+)
2547
.27
4636
0-38
1X
XX
49*
641.
75(4
+)25
63.2
725
360-
381
XX
X49
**64
5.8
(4+)
2579
.26
4236
0-38
1X
XX
49**
*64
9.75
(4+)
2595
.26
4536
0-38
1X
X50
**61
2.94
(4+)
2448
.22
4836
1-38
1X
51**
588.
22(4
+)23
49.1
541
362-
381
XX
X52
**55
5.97
(4+)
2220
.11
4936
3-38
1X
X53
558.
23(3
+)16
71.8
546
367-
381
XX
53*
563.
57(3
+)16
87.8
445
367-
381
XX
X54
697.
36(3
+)20
89.0
415
361-
378
XX
55*
626.
58(3
+)18
76.9
336
363-
378
XX
56*
582.
88(3
+)17
45.8
944
364-
378
XX
57*
539.
94(3
+)16
16.8
438
365-
378
X58
∆80
8.33
(2+)
1614
.83
3636
4-37
7X
X58
*∆81
6.4
(2+)
1630
.82
3636
4-37
7X
Xa
Mol
ecul
ario
nm
ass
obse
rved
inth
eLC
-MS/
MS
syst
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lcul
ated
inD
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its N
-term
inal
site
.
J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 8982-8988
218
Cathepsins B and L, together with m-calpain, seem to be the main endopeptidases
responsible for the hydrolysis of muscle CK during the first stages of dry-curing.
Observing the results obtained in this study, peptides 4 and 5 (Table 2) appear
consecutively in the sequence of CK. Peptide 5 expands from position 15 to position
32, whereas peptide 4 expands from position 33 to 50. Observing Table 2, it seems
that peptide 1 could be the origin of peptides 4 and 5. Thus, it would be possible that
any of these endopeptidases were responsible for the cleavage suffered between
positions 32 - 33, although more studies would be necessary to assign the
contribution of these enzymes to the generation of these peptides.
Aminopeptidase activity has been detected in dry-cured ham even after more than 12
months of processing. This procedure has been associated with the remarkable
increase in free amino acid concentration observed during dry-cured ham processing.
Glutamic and aspartic acids, alanine, leucine, lysine, valine and threonine appear to
be some of the amino acids experiencing larger increases (7, 28, 29).
CK peptides identified in this study constitute an important evidence of the
contribution of aminopeptidases to the remarkable increase in free amino acids
observed during dry-cured ham processing. As can be seen in Table 2, peptides 8,
15, 19, 25 and 29 show the loss of threonine at N-terminal site, whereas peptides 10,
11, 13, 17, 26, 30 and 43 show the loss of aspartic acid. Table 2 also illustrates the
degradation of CK in the release of free lysine, leucine, asparagine, methionine,
valine and glutamic acid from the N-terminal end. Peptides 6, 9 and 16 show the loss
of a N-terminal leucine, whereas it is possible to appreciate the loss of methionine in
peptides 49 and 55, glutamic acid in peptides 51 and 56, lysine in peptide 1, valine in
peptide 50 and asparagine in peptide 27. Peptides 8 to 12, 15 to 18, 49 to 52 and 55
to 57 show the sequential losses of N-terminal amino acids, proving the important role
of muscle aminopeptidases.
It has been reported that alanyl aminopeptidase (AAP; EC 3.4.11.14) is the most
relevant aminopeptidase found in porcine skeletal muscle. It accounts for as much as
83% of the total aminopeptidase activity, showing a broad substrate specificity
hydrolyzing aromatic, aliphatic, and basic amino acids from the N-terminal end of
Capítulo 6
219
peptides. This enzyme hydrolyzes unblocked N-terminal Ala residues as well as Leu,
Arg, Phe, Tyr and Met.
Table 2. Sequences and fractions of the CK peptides identified in Spanish dry-cured ham after separation by reversed-phase chromatography.
Peptide Identified sequence RP Fraction*
1 2 3 4 5
15KAEEEYPDLSKHNNHMAKALTLEIYKKLRDKETPSG50 16AEEEYPDLSKHNNHMAKALTLEIYKKLRDKETPSG 25KHNNHMAKALTLEIYKKLRDKETPSG
33ALTLEIYKKLRDKETPSG 15KAEEEYPDLSKHNNHMAK32
55 55 53 52 36
6 7 8 9 10 11 12
42LRDKETPSGFTLDDVIQTGVDNPGHPF68 43RDKETPSGFTLDDVIQTGVDNPGHPF 52TLDDVIQTGVDNPGHPF 53LDDVIQTGVDNPGHPF 54DDVIQTGVDNPGHPF 55DVIQTGVDNPGHPF 56VIQTGVDNPGHPF
59 59 54 52 48 48 45
13 14 15 16 17 18
44DKETPSGFTLDDVIQTGVDNPGHP67 45KETPSGFTLDDVIQTGVDNPGHP 52TLDDVIQTGVDNPGHP 53LDDVIQTGVDNPGHP 54DDVIQTGVDNPGHP 55DVIQTGVDNPGHP
55 55 47 44 39 38
19 20 21 22
52TLDDVIQTGVDNP64 53LDDVIQTGVDNP 44DKETPSGFTLDDVIQ58 31AKALTLEIYKKLR43
48 43 55 44
23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
106HKTDLNHENLKGGDDLDPNYV126 109DLNHENLKGGDDLDPN124 108TDLNHENLKGGDDLDP123 109DLNHENLKGGDDLDP 111NHENLKGGDDLDP 112HENLKGGDDLDP 108TDLNHENLKGGDDLD122 109DLNHENLKGGDDLD 111NHENLKGGDDLD 95DRHGGYKPTDKHKTDLNHENL115 89FDPIIQDRHGGYKPTDKHKTD109 91PIIQDRHGGYKPTDKHKTD
43 47 40 40 36 36 38 47 36 40 52 52
35 36
153AVEKLSVEALNS164 AVEKLSVEALN163
45 45
37 38 39
303SKHPKFEEILTR314 299LAHLSKHPKFEE310 301HLSKHPKFEE
48 40 36
40 41 42
335DVSNADRLGSSEVEQVQLVVDGVK358 344SSEVEQVQLVVDGVK 335DVSNADRLGSSEVEQVQL352
55 53 49
J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 8982-8988
220
43 44 45 46 47 48
DVSNADRLGSSEVEQVQ351 336VSNADRLGSSEVEQVQ 338NADRLGSSEVEQVQ 332SVFDVSNADRLGSSEVEQ349 335DVSNADRLGSSEVEQ DVSNADRLGSSEVE348
40 38 36 48 36 36
49 50 51 52 53 54 55 56 57 58
360MVEMEKKLEKGQSIDDMIPAQK381 361VEMEKKLEKGQSIDDMIPAQK 362EMEKKLEKGQSIDDMIPAQK 363MEKKLEKGQSIDDMIPAQK 367LEKGQSIDDMIPAQK 361VEMEKKLEKGQSIDDMIP378 363MEKKLEKGQSIDDMIP 364EKKLEKGQSIDDMIP 365KKLEKGQSIDDMIP 364EKKLEKGQSIDDMI377
44,48 45 44 43 44 50 50 49 48
48,49
* Fractions corresponding to the reversed-phase chromatogram (Figure 2).
Arginyl aminopeptidase (RAP; EC 3.4.11.6), also named aminopeptidase B, is the
second most important aminopeptidase existing in skeletal muscle, showing substrate
specificity against basic aminoacyl bonds (30). Alanyl and arginyl aminopeptidase,
which show good stability during dry-curing and have an optimal neutral pH, appear
to be the main contributors to the generation of free amino acids during the
processing of dry-cured ham (6). Two other aminopeptidases existing in skeletal
muscle are leucyl (LAP; EC 3.4.11.1) and pyroglutamyl aminopeptidases (PGAP; EC
3.4.19.3). LAP catalyzes the release of leucine and methionine as well as other
hydrophobic amino acids such as valine from the N-terminus of polypeptides and,
despite its optimum basic pH, it keeps some of the initial activity at the pH found at
the end of the curing process (pH 6). PGAP activity is negligible at about 40 days of
processing. However, due to its high specificity towards pyroglutamic acid, it could
contribute to the increase in free glutamic acid because of the transformation from
pyroglutamic to glutamic acid. Methionyl aminopeptidase (MAP; EC 3.4.11.18),
whose activity is enhanced in the presence of NaCl, can also generate free amino
acids in cured pork meat products. Methionyl aminopeptidase has a broad substrate
specificity, exhibiting maximal activity against Met and good activity against Leu (31).
Recently, a novel glutamyl aminopeptidase (aminopeptidase A) has been purified
from chicken meat (32). This enzyme liberates glutamic or aspartic acid from N-
Capítulo 6
221
terminus of peptides. However, no information related to its stability during dry-cured
processing has been reported to date.
Taking into account all the experimental data obtained in this study, alanyl
aminopeptidase could be one of the enzymes responsible for the loss of N-terminal
leucine and methionine in peptides 6, 9, 16, 49 and 55 (Table 2). Leucyl
aminopeptidase could be responsible for the N-terminal hydrolysis in these peptides
as well as for the threonine and valine losses in peptides 8, 15, 19, 25, 29 and 50, but
this possibility seems to be less probable due to its low activity in the late steps of the
dry-curing. On the other hand, methionyl aminopeptidase could also be responsible
for the loss of leucine and methionine in the mentioned peptides.
Carboxypeptidases constitute another group of exopeptidases responsible for the
hydrolysis of amino acids from the C-terminal site of peptides. The most studied
carboxypeptidases are tissue carboxypeptidases A and B and lysosomal
carboxypeptidases A and B, but only carboxypeptidases A have been previously
studied in skeletal muscle (33, 34). Tissue carboxypeptidase A (EC 3.4.17.1) is most
active on hydrophobic C-terminal residues such as phenylalanine and leucine
although it is unable to hydrolyze proline. At neutral pH, it can also hydrolyze
threonine and glutamine. Lysosomal carboxypeptidase A (EC 3.4.16.1) has also
preference for substrates with hydrophobic amino acid residues at their C-terminal
site, being phenylalanine and leucine the most preferred substrates at pH 5.0 - 5.2.
Although little is known about the effect of curing agents on the activity of these
enzymes and their stability during the ripening period, it seems that these enzymes
could be the responsible for the C-terminal loss of phenylalanine in peptides 6 to 12,
leucine in peptide 42, glutamine in peptides 46 and 47 (tissue carboxypeptidase A)
and proline in peptides 54 - 57 (lysosomal carboxypeptidase A).
In conclusion, 58 CK fragments have been found for the first time in Spanish dry-
cured ham, proving the intense proteolysis suffered by this protein during the
processing of this product. Observing the obtained sequences, there are evidence of
the contribution of aminopeptidases and carboxypeptidases to the generation of
peptides and the release of free amino acids during dry-cured ham processing. The
generated free amino acids will contribute, together with other compounds, to the
J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 8982-8988
222
development of the characteristic flavour in Spanish dry-cured ham. Further studies
dealing with the enzymatic action that takes place during dry-curing would be needed
to provide a better understanding of muscle proteolysis and flavor generation in these
types of products.
ACKNOWLEDGMENTS Food Standards Agency project Q 01R006 (U.K.), FPU scholarship from Ministerio de
Educación y Ciencia (Spain) to L.M., Grant AGL2007-65379-C02-01/ALI from Ministry
of Education and Science (Madrid, Spain) and FEDER are fully acknowledged. We
give special thanks to the Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF) Proteomics
core facility (Proteored member), Valencia, Spain, for its valuable contribution in the
ProteinPilot data analysis.
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Capítulo 7Identificación de péptidos pequeños derivados de la Troponina T en jamón
curado
Capítulo 7
229
www.elsevier.com/locate/foodchem
Identification of Small Troponin T Peptides Generated in Dry-
Cured Ham
Leticia Mora, Miguel Angel Sentandreu and Fidel Toldrá
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), P.O. Box 73, 46100 Burjassot, Valencia, Spain
Sent for review May 20, 2009.
Abstract
Troponin T (TnT) is a myofibrillar protein present in striated muscle that develops important structural
and regulatory functions. This protein is easily degraded during post-mortem ageing but the details of
the TnT hydrolysis occurring during much longer processes like the dry-cured processing as well as
the specific sequences of the generated fragments still remain undetermined. In the present study,
the isolation and identification of 27 peptides generated from TnT during dry-cured processing are
reported for the first time. This study has been developed using matrix-assisted laser
desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF) and it
evidences the extensive degradation of TnT occurred during the processing of dry-cured ham. Some
of the cleavage sites corresponding to these sequenced fragments confirm the sites reported by
other authors both in vitro and during post-mortem ageing of meat.
Keywords: Dry-Cured ham; proteolysis; proteomics; mass spectrometry; peptides, troponin T.
Capítulo 7
230
INTRODUCTION Troponin T (TnT) is present in striated muscle of vertebrates and invertebrates and it
develops an important regulatory and structural role in thin filaments (Perry, 1998). In
skeletal muscle, the contractile process is regulated by Ca2+ through the troponin
complex in the thin filament. Troponin complex consists of three subunits: troponin C
(TnC), the calcium-binding subunit; troponin I (TnI), the inhibitory subunit; and
troponin T (TnT), the tropomyosin-binding subunit with which the C-terminal region of
tropomyosin is known to interact, being responsible for the location of the troponin
complex along the thin filament of the myofibril (Pearson & Young, 2008). In addition
to this structural role, TnT has the function of transforming the TnI-TnC complex into a
system where its inhibitory activity becomes sensitive to calcium ions. In fact, fibers
containing slow troponin have higher Ca2+ sensitivity than those containing fast
troponin (Perry, 1998).
It has been widely studied that TnT is a myofibrillar protein easily degraded during
post-mortem aging of animal muscles (Kitamura, Muroya, Nakajima, Chikuni &
Nishimura, 2006). In this way, a 30 kDa polypeptide is detected in post-mortem
muscles at about the same time that TnT content is decreasing (Olson, Parrish,
Dayton & Goll, 1977; Ho, Stromer & Robson, 1994). Degradation of TnT has been
positively correlated with the post-mortem tenderization of beef (Olson, Parrish,
Dayton & Goll, 1977), and peptides generated by TnT degradation have been found
to contribute to the improvement of beef taste (Nishimura, Rhue, Okitani & Kato,
1988) Rhue, Okitani and Kato, 1988) and to be useful as conditioning markers in pork
loins (Okumura, Yamada & Nishimura, 2003). Meat quality has also been related to
TnT degradation. In this way, Laville et al. (2005) showed that troponin T was less
proteolysed in defective semimembranosus muscles, obtaining a higher quantity of
whole TnT in PSE zones. In relation to this, also Hwang, Park, Kim, Cho and Lee
(2005) established a negative correlation of troponin T slow type isoform with drip
loss, suggesting that a larger degradation of this protein resulted in a higher drip loss.
The evolution of myofibrillar protein hydrolysis during dry-cured processing has also
been studied by many authors and changes in structural proteins like troponin T have
Capítulo 7
231
been observed along the ripening period (Toldrá, Rico & Flores, 1993; Larrea,
Hernando, Quiles, Lluch & Pérez-Munuera, 2006). However, despite the importance
of TnT degradation in various aspects of meat and its derived products, the details of
the degradation and its effects on quality remain poorly understood. In dry-cured ham
processing, both the specific muscle enzymes responsible for the TnT fragmentation
and its specific cleavage sites are still unknown, mainly due to the lack of information
regarding the peptide sequences derived from TnT degradation existing in dry-cured
ham. Changes observed in the structural proteins help to understand the evolution of
texture and perception of the typical flavour of dry-cured ham.
In the present work, a proteomic analysis has been used for the identification of the
TnT fragments generated in dry-cured ham as a way to improve the knowledge about
the post-mortem proteolysis occurring during dry-cured ham processing and the
potential peptidases responsible for this action.
MATERIALS AND METHODS Dry-cured ham preparation Three Spanish dry-cured hams were produced using raw material from 6-months old
pigs (Landrace x Large White). Selected hams were processed according to
traditional procedures based on: pre-salting using a mixture of curing ingredients
(salt, nitrate and nitrite) for 30 min; salting in chambers for 11-12 days set at 4 ºC and
85-90% relative humidity; resting for 50 days at a temperature below 4 ºC and relative
humidity between 75-85 % and ripening in air-conditioning chambers, where the
hams were subjected to different time, temperature and relative humidity cycles.
Higher temperatures (14-20 ºC) and lower relative humidity (until 70%) were set
during ripening in order to accelerate the drying process. The total length of the curing
process was 9 months.
Extraction of peptides and deproteinisation Fifty grams of muscle coming from the 9 months processed dry-cured hams were
depicted of extramuscular fat, minced and homogenised with 100 mL of 0.01N HCl in
Capítulo 7
232
a stomacher (Seward Laboratory) for 8 min. The homogenate was centrifuged in the
cold (24500 g for 20 min at 4 ºC) and, after filtering through glass wool, the
supernatant was deproteinized by adding 3 volumes of ethanol and maintaining the
sample 20 min at 4 ºC. After that, the sample was centrifuged again (24500 g for 20
min at 4 ºC) and the supernatant was dried in a rotatory evaporator. The dried
deproteinized extract was redissolved in 25 mL of 0.01N HCl, filtered through a
0.45μm nylon membrane filter (Millipore, Bedford, MA) and stored at -20 ºC until use.
Size-exclusion chromatography A 5 mL aliquot of the deproteinized dry-cured ham extract was subjected to size-
exclusion chromatography in order to fractionate the peptides according to their
molecular mass. For this purpose, a Sephadex G25 column (2.5 x 65 cm, Amersham
Biosciences, Uppsala, Sweden), previously equilibrated with 0.01N HCl, was
employed. The separation was performed using an isocratic gradient of 0.01N HCl at
a flow rate of 15 mL/h. Fractions of 5 mL were collected using an automatic fraction
collector and further monitored by ultraviolet (UV) absorption at 214 nm (Agilent 8453
UV spectrophotometer, Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Fractions corresponding
to a molecular weight between 1500 and 4000 Da were pooled together, dried under
vacuum and redissolved in 5 mL of 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) in
water/acetonitrile (H2O:ACN, 95:5, v/v).
Reversed-phase chromatography
A 100 μL aliquot of the redissolved mixture of peptides was injected into an HPLC
Agilent 1100 Series system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) equipped with
an autosampler and a diode array detector, which was used in the range 195-300 nm.
The separation of peptides was carried out using a Symmetry® C18 column (250 x
4.6 mm, 5 μm particle size) from Waters (Milford, MA, USA) at 25 ºC. Mobile phases
consisted of solvent A, containing 0.1% TFA in water and solvent B, containing 0.05%
TFA in water/acetonitrile (5:95). Both mobile phases A and B were filtered through a
0.45 μm filter and degassed prior to any analytical run. The chromatographic
separation consisted of a 5 min isocratic gradient with solvent A, followed by a linear
Capítulo 7
233
gradient from 0 to 40% of solvent B in 70 min at a flow rate of 1 mL/min. The
separation was monitored using a diode array detector at a wavelength of 214 nm
and 1 mL fractions were collected and lyophilised for storage at -20 ºC.
MALDI-TOF/TOF mass spectrometry
Lyophilised fractions were redissolved in 40 μL of 0.1% of formic acid (FA) and 2% of
ACN in water. 1μL of each fraction of interest was spotted onto a MALDI plate by
triplicate. After air-drying, 0.5 μL of α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) solution
(#C2020, Sigma, St Louis, MO) at a concentration of 4.73 mg/mL in 8 mM of
ammonium phosphate, 50% of ACN and 0.1% of TFA was added as matrix solution.
Mass spectra were recorded in positive-reflectron mode using a 4700 Applied
Biosystems MALDI-TOF/TOF mass spectrometer (CA, USA) equipped with delayed
extraction by summing 2000 shots with a laser intensity of 5000 (YAG LASER, 200
Hz). For the MS/MS analyses, in first aliquot of every fraction five of the most intense
precursor ions were selected. The next five most intense precursors were selected in
the second aliquot. In the third aliquot the ten more intense precursors were
excluded, being precursors selected from an inclusion list to a maximum of five. Every
time selection was done according to the threshold criteria (minimum signal-to-noise
10; minimum cluster area, 500; maximum precursor gap, 200 ppm; maximum fraction
gap, 4).
The mass spectrometer was calibrated externally once before each analysis using the
4700 Proteomics Analyzer calibration mixture (#4333604, Applied Biosystems, CA,
USA) containing des_Arg1-Bradykinin, Angiotensin I, Glu1-Fibrinopeptide B,
Adrenocorticotropic hormone (ACTH; 1-17 clip), ACTH (18-39 clip) and ACTH (7-38
clip) and covering the m/z range 904.47-3657.93 Da. The calibration of the MS/MS
acquisition method was done using the Angiotensin I fragmentation spectra.
Peptide identification The MS/MS information was sent to Mascot via the GPS Explorer software (Applied
Biosystems). Identification of the protein origin of peptides was done against NCBI
nonredundant protein database using the Mascot search engine
Capítulo 7
234
(hppt://www.matrixscience.com). Matched peptides for the obtained MS/MS data
were further verified manually.
RESULTS Fractionation and isolation of peptides A deproteinized dry-cured ham extract was submitted to size-exclusion
chromatography in order to fractionate the peptides mixture according to their
molecular mass sizes. Fractions corresponding to an elution volume between 125 -
190 mL and containing peptides with sizes ranging between 1500 - 4000 Da were
pooled together, concentrated and subjected to reversed-phase chromatography.
After separation on a Symmetry C18 column, peptides eluting at a concentration of
ACN from 21 to 27%, corresponding to a total volume of 6 mL, were collected in
aliquots of 1mL, dried and analyzed by MALDI-TOF/TOF mass spectrometry.
Peptide sequencing using mass spectrometry Fractions obtained after reversed-phase chromatography were analyzed by MALDI-
TOF/TOF MS in order to identify the sequence of the TnT fragments generated after
the dry-curing process. By this way, a total of twenty-five fragments corresponding to
fast troponin T and two fragments corresponding to slow troponin T were obtained
(listed in Table 1).
Figure 1 shows the MALDI-TOF mass spectrum of the fraction eluted at a
concentration of 22 % ACN in the reversed-phase chromatography. The mass
spectrum shows the molecular masses of the singly charged ions ([M + H]+) 1760.84,
2045.06, 2057.01, 2158.05, 2213.12, 2314.16, 2515.21, 2583.33, 2643.37, 2690.42,
2811.42 and 2912.48, which are in accordance with peptides 23, 17, 22, 21, 16, 15,
4, 8, 3, 26, 2 and 1, respectively, presented in Table 1. The molecular masses of
peptides 26 and 27 (Table 1), from slow skeletal muscle troponin T, are in
accordance with the signals obtained from the MALDI-TOF mass spectrum indicated
in Figure 2, eluting at a concentration of 26% ACN in the RP-HPLC separation. In
that respect, peptide 26 can be observed in both spectra (see Figures 1 and 2) but its
Capítulo 7
235
intensity is much higher in Figure 2, where it appears next to peptide 27, the second
peptide coming from slow skeletal muscle TnT identified in this study.
Figure 1. MALDI-TOF mass spectrum obtained for the RP-HPLC fraction containing most fragments of fast skeletal troponin T.
Figure 2. MALDI-TOF mass spectrum of the RP-HPLC fraction containing most fragments of slow skeletal troponin T.
Capítulo 7
236
All peptides of interest, obtained after MALDI-TOF MS analysis, were sequenced by
matching data obtained from MS/MS spectra of the singly charged ions ([M + H]+)
with sequences contained in protein databases. Table 1 also shows the expected and
calculated masses of the identified peptides, as well as the scores obtained using the
Mascot search engine.
Table 1. Troponin T fragments identified in Biceps femoris muscle of Spanish dry-cured ham. Peptides corresponding to slow TnT (protein accession number Q75ZZ6 in NCBI nonredundant database) are indicated with an asterisk (*). The rest of the peptides correspond to fast TnT (protein accession number BAD15381 in NCBI nonredundant database). Peptide Observed Mass (Da)a Expected Mass (Da)b Calculated Mass (Da)c Scored Identifiede
1 2912.48 2911.47 2911.54 50 X2 2811.42 2810.42 2810.49 105 X3 2643.37 2642.36 2642.40 31 X4 2515.27 2514.26 2514.31 59 X5 2799.39 2798.38 2798.46 256 2698.34 2697.33 2697.41 60 X7 2684.36 2683.35 2683.43 56 X8 2583.33 2582.32 2582.38 82 X9 2415.26 2414.25 2414.29 7310 2287.16 2286.15 2286.20 5411 2442.21 2441.20 2441.29 3212 2341.20 2340.19 2340.24 73 X13 2173.17 2172.16 2172.15 3814 3162.76 3161.75 3161.76 2115 2314.16 2313.15 2313.23 90 X16 2213.12 2212.12 2212.19 130 X17 2045.06 2044.05 2044.10 88 X18 1916.97 1915.96 1916.00 92 X19 1706.80 1705.79 1705.86 110 X20 3006.64 3005.63 3005.65 3221 2158.05 2157.05 2157.13 3822 2057.01 2056.00 2056.08 52 X23 1760.84 1759.84 1759.90 3624 1550.70 1549.70 1549.76 38 X25 1971.05 1970.04 1970.10 3326* 2690.48 2689.47 2689.48 3927* 2561.42 2560.41 2560.44 21a Molecular mass observed after MALDI-TOF/TOF mass spectrometry analysis.b Expected relative molecular mass of the matched peptide.c Calculated relative molecular mass of the matched peptide.d Scores obtained in Mascot using the NCBI non-redundant protein database. e Peptides marked with an 'X' were identified in at least two of the three hams.
Capítulo 7
237
Table 2 shows the sequences of the 27 TnT fragments identified by MALDI-TOF/TOF
from dry-cured ham. Peptides have been arranged and aligned according to their
positions in the sequence of either fast or slow skeletal muscle TnT (see Figure 3).
Table 2. Sequences of the 27 troponin T fragments identified in dry-cured ham using MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. Peptides corresponding to slow TnT (protein accession number Q75ZZ6 in NCBI nonredundant database) are indicated with an asterisk (*). The rest of the peptides correspond to fast TnT (protein accession number BAD15381 in NCBI nonredundant database). Peptide Residue in P1 Identified Sequence Residue in P'1 Positiona
1 L TAPKIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL M 57-812 T APKIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL M 58-813 P KIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL M 60-814 K IPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL M 61-815 L TAPKIPEGEKVDFDDIQKKRQNKD L 57-806 T APKIPEGEKVDFDDIQKKRQNKD L 58-807 L TAPKIPEGEKVDFDDIQKKRQNK D 57-798 T APKIPEGEKVDFDDIQKKRQNK D 58-799 P KIPEGEKVDFDDIQKKRQNK D 60-7910 K IPEGEKVDFDDIQKKRQNK D 61-7911 L TAPKIPEGEKVDFDDIQKKRQ N 57-7712 T APKIPEGEKVDFDDIQKKRQ N 58-7713 P KIPEGEKVDFDDIQKKRQ N 60-7714 E EKPRPKLTAPKIPEGEKVDFDDIQKKR Q 50-7615 L TAPKIPEGEKVDFDDIQKKR Q 57-7616 T APKIPEGEKVDFDDIQKKR Q 58-7617 P KIPEGEKVDFDDIQKKR Q 60-7618 K IPEGEKVDFDDIQKKR Q 61-7619 P EGEKVDFDDIQKKR Q 63-7620 E EKPRPKLTAPKIPEGEKVDFDDIQKK R 50-7521 L TAPKIPEGEKVDFDDIQKK R 57-7522 T APKIPEGEKVDFDDIQKK R 58-7523 K IPEGEKVDFDDIQKK R 61-7524 P EGEKVDFDDIQKK R 63-7525 R KKEEEELVALKERIEK R 96-11126* R EEERPKPSRPVVPPLIPPKIPEGE R 36-5927* R EEERPKPSRPVVPPLIPPKIPEG E 36-58a Position of the peptides inside the TnT sequence of porcine specie.
The whole fast TnT fragments identified in this work share the common sequence
EGEKVDFDDIQKK (peptide 24), with the exception of peptide 25. Neverthless, as
can be observed in Table 2, peptides 1 to 23 show remarkable differences at their N-
and C- terminal end. Looking at the N-terminal site, peptides 1, 5, 7, 11, 15 and 21
Capítulo 7
238
have an additional threonine with respect to peptides 2, 6, 8, 12, 16 and 22, whereas
peptides 3, 9 and 17 present an extra lysine with respect to peptides 4, 10 and 18. In
addition to this, dipeptide losses were also observed at the N-terminal side. In this
way, peptides 2, 8, 12 and 16 show an additional Ala-Pro compared to peptides 3, 9,
13 and 17, whereas Ile-Pro losses were detected in peptides 19 and 24 with respect
to peptides 18 and 23. With regard to the C-terminal side, the loss of amino acids
leucine (peptides 1 to 4), aspartic acid (peptides 5 and 6), glutamine (peptides 11 to
13), arginine (peptides 14 to 19) and glutamic acid (peptide 26) were observed.
Peptide 25 is the only peptide identified from a different region of the fast TnT
sequence (see Figure 3). On the other hand, peptides 26 and 27 are fragments of the
slow skeletal muscle TnT. Peptide 26 presents an additional glutamic acid at the C-
terminal position with respect to peptide 27. Table 2 also indicates the amino acid
residue situated before and after the cleavage site and the position of the peptide in
the TnT sequence (Figure 3).
BLAST sequence similarities searches revealed 100% homology of the peptides 1-25
to porcine fast TnT (protein accession number BAD15381 in NCBI nonredundant
database) and peptides 26 and 27 to porcine slow TnT (protein accession number
Q75ZZ6 in NCBI nonredundant database).
DISCUSSION One of the most important biochemical changes that occur during the ham dry-curing
process is the intense proteolysis that takes place as a result of the action of
endogenous muscle peptidases. It is assumed that the main enzymes responsible for
the degradation of muscle proteins during this period are several endopeptidases and
certain groups of exopeptidases, but the exact role of each individual enzyme is not
known in detail (Toldrá, 2002; Sentandreu, Coulis & Ouali, 2002) . Endopeptidases
degrade the myofibrilar structure by cleaving intact proteins, giving rise to large
polypeptides which are further degraded by exopeptidases. In this way, dipeptidyl
peptidases would contribute, in addition to aminopeptidases and carboxipeptidases,
to the extensive degradation of the polypeptide fragments and to the generation of
Capítulo 7
239
dipeptides and free amino acids that, together with other volatile compounds, are
responsible for the characteristic flavour of dry-cured ham (Toldrá, 2002).
Fast TnT type (protein accession number BAD15381 in NCBInr database)
1 MSDEEVEHVE EEYEEEEEAQ EEAPPPPAEV HEVHEEVHEV HEPEEVQEEE KPRPKLTAPK
61 IPEGEKVDFD DIQKKRQNKD LMELQALIDS HFEARKKEEE ELVALKERIE KRRAERAEQQ
121 RIRAEKERER QNRLAEEKAR REEEEAKRRA EDDLKKKKAL SSMGANYSSY LAKADQKRGK
181 KQTAREMKKK VLAERRKPLN IDHLSEDKLR DKAKELWDAL YQLEIDKFEY GEKLKRQKYD
241 IINLRSRIDQ AQKHSKKAGT TPKGKVGGRW K
Slow TnT type (protein accession number Q75ZZ6 in NCBInr database)
1 MSDAEEQEYE EEQPEEEEAA EEEEAPEEPE PVAEREEERP KPSRPVVPPL IPPKIPEGER
61 VDFDDIHRKR MEKDLLELQT LIDVHFEQRK KEEEELVALK ERIERRRAER AEQQRFRTEK
121 ERERQAKLAE EKMRKEEEEA KKRAEDDAKK KKVLSNMGAH FGGYLVKAEQ KRGKRQTGRE
181 MKQRILSERK KPLNIDHMGE DQLREKAQEL SDWIHQLESE KFDLMAKLKQ QKYEINVLYN
241 RISHAQKFRK GAGKGRVGGR WK
* *
*
Figure 3. Primary sequence of fast and slow troponin T proteins from porcine skeletal muscle. Letters in bold indicate the position of the identified peptides into the protein. Black arrows indicate endo and exo cleavage sites of the peptides identified in this study. Arrows marked with an asterisk indicate agreement with calpains cleavage site reported by other authors.
Contribution of endopeptidases: cathepsins and calpains Cathepsins B (EC 3.4.22.1) and L (EC 3.4.22.15) are peptidases located in
lysosomes that have been reported to be stable at the end of the dry-curing process,
Capítulo 7
240
showing activity even after 15 months of processing. In the case of cathepsin D, even
if its activity in the dry-curing process could be restricted to the first few months of
processing (Toldrá, Rico & Flores, 1993) its action on dry-cured ham proteolysis
seems to be relevant (Sentandreu et al., 2007). Many authors have studied the
contribution of cathepsins in the hydrolysis of muscle myofibrillar proteins, obtaining
opposite results with respect to the action of these endopeptidases on TnT
degradation. In vitro proteolysis of myofibrillar proteins coming from sea bass white
muscle demonstrated that troponin T was degraded by cathepsins B and L with a
concomitant appearance of a 30 kDa band, whereas it was resistant to cathepsin D
action (Ladrat, Verrez-Bagnis, Noel & Fleurence, 2003). Aoki and Ueno (1997)
agreed in that mackerel cathepsin L hydrolysed TnT but, according to their results,
cathepsin B did not hydrolyse any of the myofibrils from mackerel white muscle. The
effect of cathepsins L and D on myofibrilar proteins coming from beef, pork, rabbit or
chicken samples was also studied by some authors. Zeece, Katoh, Robson and
Parrish (1986) incubated cathepsin D with bovine skeletal sample myofibrils under in
vitro conditions and, contrary to the above mentioned results obtained by Ladrat et al
(2003), they observed the degradation of a small amount of TnT. On the other hand,
(Mikami, Whiting, Taylor, Maciewicz & Etherington, 1987) studied the degradation of
rabbit, chicken and beef myofibrils by cathepsin L and lysosomal lysates, reporting
the disappearance of troponin T just after 15 min of incubation in the presence of
cathepsin L.
Calpains (EC 3.4.22.17) can participate in the post-mortem muscle proteolysis only
during the first stages of the curing processes due to their relatively poor stability and
because both the high salt content and low pH values found in subsequent stages
would inhibit the enzyme. Post-mortem degradation of TnT has been associated with
the action of both μ-calpain (Lametsch, Roepstorff & Bendixen, 2002) and m-calpain
(Whipple & Koohmaraie, 1991).
In relation to μ-calpain, Hughes, Geary, Dransfield, McSweeney and O'Neill (2001)
incubated rabbit skeletal muscle TnT with this enzyme and identified four principal
cleavage sites, two of them being Thr45-Ala46 and Leu69-Met70. According to the
results obtained by these authors, μ-calpain could be responsible for the cleavage
Capítulo 7
241
site Leu81-Met82 corresponding to the C-terminal side of peptides 1 to 4 identified in
this work (see table 2). However, we cannot assure that this enzyme is the
responsible for the cleavage site Thr57-Ala58 in the generation of peptides 2, 6, 8, 12,
16 and 22 because in all cases the same peptide but with an additional threonine in
the N-terminal side have been identified (peptides 1, 5, 7, 11, 15 and 21,
respectively), suggesting any aminopeptidase action as main responsible for the
cleavage site Thr57-Ala58.
The effect of m-calpain in longissimus pork muscle was studied in vitro by Kitamura et
al. (2005). These authors determined the N-terminal amino acid sequences of the
TnT degradation fragments generated both during post-mortem ageing of meat and
by the incubation of this enzyme with TnT. Postmortem TnT degradation was also
studied in bovine longissimus muscle by Muroya et al. (2004). These authors
determined the specific cleavage sites of the two fast TnT isoform types
predominantly expressed in this muscle, together with the N-terminal amino acid
sequence of the generated TnT fragments. The results obtained by Kitamura,
Muroya, Tanabe, Okumura, Chikuni and Nishimura (2005) and Muroya, Kitamura,
Tanabe, Nishimura, Nakajima and Chikuni, (2004) confirmed the cleavage site Thr57-
Ala58 (table 2). These authors determined the N-terminal amino acid sequences
APKIPEGEKVDF and APKIPEGE, respectively. On the other hand, sequences
EKPRPKLTAPKIPEG and EKPRPKLT, determined respectively by same authors,
coincide with the N-terminal sequence of peptides 14 and 20 (Table 2). The fact that
in vitro proteolysis of TnT by calpains generate cleavage sites that have also been
found in post-mortem meat samples and in naturally generated peptides at the end of
the dry-cured ham processing indicates the importance of calpains in the
biochemistry of dry-cured ham.
It is important to take into account that compositions of both the intact TnT isoforms
and the post-mortem fragments differed among the muscles examined, indicating that
each TnT isoform degrades into an specific fragment in each muscle (Muroya,
Nakajima, Oe & Chikuni, 2006). In this way, Whipple et al. (1992) examined the
amount of post-mortem proteolysis in three different lamb muscles and concluded
that degradation products derived from TnT in supraspinatus, a slow type muscle,
Capítulo 7
242
were distinct from those in longissimus and gluteus medius, fast type muscles. On
the other hand, Muroya, Nakajima and Chikuni (2003) established that slow-oxidative
muscles were richer in slow TnT isoforms than fast muscles. In this study, twenty-five
fragments of fast TnT have been identified against only two slow TnT fragments. A
possible explanation for these differences between the quantity of fragments
identified in slow and fast TnT could be the nature of biceps femoris as a fast skeletal
muscle.
Contribution of exopeptidases: dipeptidyl peptidases, aminopeptidases and carboxipeptidases. Dipeptidyl peptidases (DPP I, II, III, and IV) are enzymes able to release different
dipeptides from the N-terminal side of peptides. In relation to their substrate
specificity, DPP I and III are unable to attack those peptides containing a proline
residue in any side of the peptide bond (Smyth & O'Cuinn, 1994; Sentandreu &
Toldrá, 1998; Sentandreu & Toldrá, 2000), whereas DPP II and IV from porcine
skeletal muscle are able to release dipeptides from the N-termini having a proline
residue in penultimate position. According to Sentandreu and Toldrá (2001), DPP II
activity would be restricted during salting and resting times due to its poor activity at
low temperatures and optimum relatively acid pH, so its activity would be relevant
only from the end of the post-salting period (50 days) till 240 days when its activity
decreases. The contribution of DPP IV activity during dry-curing is also expected
although in a lower degree, as it expresses a low percentage of activity at pH around
6.0 and low temperatures, in addition to be partially inhibited by NaCl (Sentandreu &
Toldrá, 2001). Thus, considering both the high stability of DPP II and IV during the
processing of dry-cured ham and their substrate specificity, these enzymes could be
responsible for the observed loss of dipeptide Ala-Pro in peptides 3, 9, 13 and 17
(Table 2) with respect to peptides 2, 8, 12 and 16, respectively, and dipeptide Ile-Pro
in peptides 19 and 24 with respect to peptides 18 and 23.
A remarkable increase in free amino acid concentration has been observed during
dry-cured ham processing. Glutamic and aspartic acids, alanine, leucine, lysine,
valine and threonine appear to be some of the amino acids experiencing larger
Capítulo 7
243
increases (Rodríguez-Nuñez, Aristoy & Toldrá, 1995; Toldrá, Aristoy & Flores, 2000).
Troponin T peptides identified in this study constitute an important evidence of the
contribution of aminopeptidases and carboxipeptidases to such increase in free
amino acids.
Aminopeptidase activity has been detected in dry-cured ham even after more than 12
months of processing, suggesting that these enzymes may be involved in the latter
stages of protein degradation (Toldrá, Cervero & Part, 1993; Toldrá et al., 2000).
Alanyl (AAP; EC 3.4.11.14) and arginyl aminopeptidases (RAP; EC 3.4.11.6), which
show good stability during dry-curing and have an optimal neutral pH, appear to be
the main contributors to the generation of free amino acids during the processing of
dry-cured ham. Methionyl aminopeptidase (MAP; EC 3.4.11.18), whose activity is
enhanced in the presence of low amounts of NaCl, can also generate free amino
acids in cured pork meat products. This enzyme has broad substrate specificity,
exhibiting maximal activity in the hydrolysis of N-terminal Met (100%) and Lys (81%)
(Flores, Marina & Toldrá, 2000). Table 2 shows the contribution of TnT fragments to
the increases of free threonine (peptides 1, 5, 7, 11, 15 and 21) and lysine (peptides
3, 9 and 17). Considering the stability of aminopeptidases during dry-cured
processing, alanyl, arginyl and methionyl aminopeptidase could be responsible for the
loss of N-terminal lysine in peptides 3, 9 and 17 (Table 2).
Carboxipeptidases constitute another relevant group of exopeptidases. These
enzymes are responsible for the hydrolysis of amino acids from the C-terminal site of
peptides. Looking at the TnT fragments identified in this study (Table 2), it is possible
to appreciate the intense action of carboxipeptidases over the C-terminal end of
peptides. In this way, the loss of leucine (peptides 5 and 6 with respect to peptides 1
to 4), aspartic acid (peptides 7 to 10 with respect to peptides 5 and 6), glutamine
(peptides 11 to 13 with respect to peptides 7 to 10) and arginine (peptides 20 to 24
with respect to peptides 14 to 19) were observed in fast skeletal muscle TnT. Peptide
26, derived from slow TnT, present an additional glutamic acid at the C-terminal
position with respect to peptide 27 (Table 2). Only carboxipeptidase A has been
previously studied in skeletal muscle. Tissue carboxypeptidase A (EC 3.4.17.1) is
most active on hydrophobic C-terminal residues such as leucine (peptides 1 to 4) at
Capítulo 7
244
pH 7.5 whereas at neutral pH, it can also hydrolyze glutamine (peptides 11 to 13)
(Bodwell & Meyer, 1981). Lysosomal carboxypeptidase A (EC 3.4.16.1) has also
preference for substrates with hydrophobic amino acid residues at their C-terminal
site, being phenylalanine and leucine the most preferred substrates at pH 5.0-5.2
(Pshezhetsky, 2004). Although little is known about the effect of curing agents on the
activity of these enzymes and their stability during the ripening period, it seems that
carboxipeptidases would be responsible for the C-terminal loss of the mentioned
amino acids in Table 2.
CONCLUSION In this study, the identified fragments coming from troponin T provide clear evidence
of the extensive hydrolysis suffered by this protein during the processing of dry-cured
ham and prove the relevant action of endogenous muscle enzymes during this period.
In fact, some of the cleavage sites corresponding to the peptides identified in this
work have been already reported by other authors both in vitro, incubating TnT in the
presence of μ- and m-calpains, and during post-mortem ageing of meat.
ACKNOWLEDGMENTS FPU scholarship from Ministerio de Educación y Ciencia (Spain) to L.M. and grant
AGL2007-65379-C02-01/ALI from Ministry of Education and Science (Madrid, Spain)
and FEDER are fully acknowledged. We give special thanks to the Centro de
Investigación Príncipe Felipe (CIPF) Proteomics core facility (Proteored member),
Valencia, Spain, for its valuable contribution to the MALDI-TOF/TOF MS analysis.
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248
IV. Discusión general
Discusión general
251
IV. Discusión general
El proceso de elaboración empleado en la fabricación de productos cárnicos es
crucial debido a la gran influencia que éste tiene sobre las características del
producto final. Por ello, parte de este estudio se ha centrado en el desarrollo y la
aplicación de nuevos métodos no destructivos y rápidos para el control de los
procesos de producción, tanto del jamón cocido como del tradicional jamón curado.
A la vista de los resultados presentados en esta tesis, se concluye que los
compuestos bioquímicos participantes en el metabolismo energético muscular, como
la creatina y creatinina, son potenciales marcadores de calidad de la carne y los
productos cárnicos. Su participación en el conjunto de las reacciones químicas y
enzimáticas que tienen lugar en el músculo desde las primeras horas postmortem los
convierten en buenos marcadores para conocer el estado de maduración en la carne
y el tiempo de curado y/o cocción en productos cárnicos.
Con el fin de desarrollar nuevos métodos rápidos para el control de calidad de la
carne y los productos derivados, en esta tesis se ha desarrollado un nuevo método
de análisis por HPLC basado en la cromatografía de interacción hidrofílica para la
determinación simultánea de creatina y creatinina, así como de los dipéptidos
carnosina, anserina y balenina (capítulo 1). Para ello, se han establecido las
condiciones óptimas de separación mediante el estudio de los efectos del par iónico,
el pH, y el gradiente de acetonitrilo en la separación. Este método cromatográfico
requiere una manipulación mínima de la muestra, evitando el tedioso paso de
extracción en fase sólida o derivatización. Además, se trata de un método rápido y
fiable, como indica su validación en términos de linealidad, repetibilidad,
reproducibilidad, y recuperación, donde se han obtenido resultados similares a los
publicados por otros autores en la cuantificación de creatina y creatinina (Pais et al.,
1999; Purchas et al., 2004) y los dipéptidos carnosina, anserina y balenina (Aristoy y
Toldrá, 1998; Cornet y Bousset, 1998; Aristoy y Toldrá, 2004; Aristoy et al., 2004). La
ausencia de pasos intermedios en el procesado de la muestra, la fiabilidad
demostrada, y su compatibilidad con el análisis posterior de los compuestos por
Discusión general
252
espectrometría de masas, hacen de este método una alternativa interesante a los ya
existentes para el análisis tanto estos compuestos como de otras sustancias polares.
Aplicando la metodología desarrollada al análisis de creatina y creatinina en siete
músculos de cerdo de distinto tipo metabólico, se observaron diferencias
significativas en el contenido de estos compuestos en función del tipo de
metabolismo muscular (p < 0.05). En este sentido, los niveles más altos de creatina y
creatinina, coincidiendo con lo anteriormente publicado por otros autores para
carnosina (Macy et al., 1970; Aristoy et al., 1998), se encontraron en los músculos
glucolíticos Semimembranosus, Longissimus dorsi, Gluteus maximus y Biceps
femoris. Estos valores más altos de creatina podrían provenir de la fosfocreatina, que
transfiere el grupo fosfato al ADP para formar ATP en el metabolismo anaeróbico
postmortem del músculo esquelético. Los músculos Gluteus medius y Trapezius,
ambos con un metabolismo energético intermedio, presentaron concentraciones de
creatina y creatinina intermedias, mientras que el Masseter, músculo oxidativo,
mostró los contenidos más bajos en estos compuestos.
La conversión de creatina en creatinina se ve favorecida por el aumento de la
temperatura, el tiempo, y los cambios en el pH (Edgar G. y Shiver H.E., 1925; Fuller y
Elia, 1988; Kvasnicka y Voldrich, 2000). Los estudios realizados con patrones y con
músculos de distinto tipo metabólico (y, por tanto, con distintas concentraciones
iniciales de creatina), demostraron que existía una relación entre la cantidad inicial de
creatina y la cantidad de creatinina formada tras el calentamiento, indicando que la
concentración inicial de creatina, además de la temperatura, el tiempo y el pH,
constituye un factor decisivo en la formación de creatinina. Dado que esta conversión
es inducida por calor durante la cocción, los contenidos en creatina decrecen
mientras que los de creatinina se incrementan (Macy et al., 1970; Purchas et al.,
2006). Este hecho, junto a que los músculos principales del jamón
(Semimembranosus, Bíceps femoris y Gluteus maximus) presentan metabolismos
similares y, por tanto, concentraciones de creatina y creatinina muy parecidas, hacen
de estos compuestos unos posibles marcadores de calidad a tener en cuenta durante
el procesado del jamón cocido.
Discusión general
253
Así pues, tras evaluar el efecto de los dos procedimientos de cocción más
comúnmente empleados en la elaboración de jamón cocido (a temperatura constante
y por incremento de temperatura o ΔT), se observó que, efectivamente, se producía
una disminución en la concentración de creatina y un incremento en la de creatinina.
En este sentido, se obtuvieron valores de la ratio creatinina/creatina mayores en los
jamones cocidos mediante el procedimiento de incremento de temperatura por
etapas que con el procedimiento de temperatura constante. Por otro lado, se ha
observado que la conversión de creatina es más rápida en la superficie que en el
centro de la pieza de jamón, probablemente debido al mayor tiempo en contacto con
el agua de cocción y a los mayores valores de transferencia de calor que
corresponden a esta posición en la pieza. En base a los resultados obtenidos y tras
estudiar las ratios creatinina/creatina en jamones comerciales, se ha establecido que
dicha ratio podría utilizarse como índice para determinar el alcance del tratamiento
térmico aplicado durante el procesado de jamón cocido, tratándose de una técnica no
destructiva que requiere únicamente de una pequeña porción de jamón tomada en la
superficie. Según los resultados obtenidos, en piezas de 5.5 Kg de peso sería
necesaria una ratio de creatinina/creatina superior a 0.4 para asegurar un tratamiento
térmico mínimo de 70 ºC en el centro de la pieza de jamón.
El curado del jamón es un proceso muy largo donde se producen numerosos
cambios en los componentes de la carne. Como se ha comentado anteriormente, la
conversión de la creatina en creatinina depende en gran medida de la temperatura y
el tiempo, factores que son fundamentales durante el proceso de curado del jamón.
Así pues, se decidió estudiar el efecto del proceso de curado de jamones salados
con distintas formulaciones sobre la concentración de creatina, creatinina, y su ratio
con el fin de determinar la posibilidad de utilizar estos compuestos como marcadores
de calidad del producto final. Este estudio demostró claramente que el tiempo de
procesado de jamón curado tiene un efecto significativo (p < 0.001) sobre las
concentraciones de creatina y creatinina, mientras que no se encontraron diferencias
significativas en las concentraciones de estos compuestos entre jamones salados
con distintas formulaciones y cantidades de sal. Las principales diferencias en
creatina y creatinina se observaron entre el periodo de postsalado (20, 50 y 80 días)
Discusión general
254
y el de curado (7, 9 y 11 meses), obteniendo un valor estable tanto para la creatina
como creatinina a partir de los 7 meses de curado.
Para comprobar la estabilidad de los valores de creatina y creatinina tras 7 meses de
curado, se aplicaron condiciones extremas de temperatura (20, 30, 40 y 70 ºC) y
tiempo (20, 40 y 70 min) sobre el músculo Semimembranoso de jamón curado de 11
meses. Por otro lado, también se analizaron jamones comerciales curados durante
un periodo entre 12 y 18 meses. El hecho de que bajo condiciones extremas de
tiempo y temperatura no se observaran cambios significativos (p < 0.001) en las
concentraciones de creatina y creatinina, junto con la estabilidad detectada en estos
compuestos (p < 0.001) en los análisis de jamones comerciales con tiempos de
curado de hasta 18 meses confirma que, tras los 7 meses de curado, se alcanzan
unos valores constantes mínimo de creatina y máximo de creatinina que ponen de
manifiesto la utilidad de estos compuestos para tener una estimación del tiempo
mínimo de curado.
Como se ha visto, el proceso de curado de jamón conlleva numerosos cambios en
compuestos relacionados con el metabolismo energético como son la creatina y la
creatinina pero, además, durante el proceso ocurren una serie de reacciones
bioquímicas que se traducen en una intensa proteolisis, la cual afecta tanto a
proteínas miofibrilares como sarcoplásmicas (Macy et al., 1970; Toldrá y Flores,
1998; Di Luccia et al., 2005). Esta proteolisis es debida a la acción de varias enzimas
musculares: por un lado, las endopeptidasas musculares (catepsinas y calpaínas,
principalmente), las cuales son responsables de la rotura inicial de las proteínas,
generando grandes polipéptidos (Toldrá et al., 1998; Lametsch et al., 2003; Nagaraj y
Santhanam, 2006); y, por otro lado, las exopeptidasas musculares, responsables de
la ruptura a nivel de enlace peptídico de estos polipéptidos, generando aminoácidos
libres y péptidos de pequeño tamaño responsables de las características
organolépticas del producto final (Toldrá et al., 1997; Toldrá, 1998; Toldrá et al.,
2000).
Aunque se asume que estas enzimas endógenas del músculo son las principales
responsables de la degradación de las proteínas musculares durante el proceso de
curado, todavía se desconoce la participación concreta de cada enzima en este
Discusión general
255
proceso. Es más, a pesar de tener la evidencia de la presencia de oligopéptidos y
péptidos de pequeño tamaño al final del proceso de curado, se sabe muy poco
acerca de la secuencia específica de estos péptidos.
En el análisis mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas
con analizadores híbridos del tipo cuadrupolo-tiempo de vuelo de algunos de los
péptidos generados durante el proceso de curado de jamón, se identificaron por
primera vez un total de catorce fragmentos derivados de proteínas miofibrilares.
Nueve de los péptidos identificados procedían de la cadena ligera de miosina I y
evidenciaban la contribución de las dipeptidilpeptidasas en la generación de
dipéptidos durante el procesado de jamón curado. Las dipeptidilpeptidasas son
enzimas muy estables durante todo el proceso de curado (Sentandreu y Toldrá,
2001) y parecen ser las responsables de la pérdida consecutiva de dipéptidos
ocurrida en el extremo N-terminal de los fragmentos identificados en este trabajo
(capítulo 4). Los dipéptidos generados, Pro-Ala y Ala-Ala, podrían contribuir, junto
con otros compuestos no volátiles, al desarrollo del flavor en el jamón curado. Los
cinco fragmentos restantes provenían de la región PEVK de la proteína titina,
responsable de la elasticidad del sarcómero. Las enzimas μ-calpaína y calpaína 3,
junto con las dipeptidilpeptidasas, serían pues potenciales responsables de la
generación de estos fragmentos durante las primeras fases del curado (Virgili et al.,
1995; Huff-Lonergan et al., 1996; Koohmaraie y Geesink, 2006).
Las proteínas sarcoplásmicas son, por lo general, más susceptibles a la
desnaturalización que las proteínas miofibrilares (Farouk et al., 2002). La enzima
creatina quinasa se ha relacionado en muchos estudios con la calidad de la carne en
lo que se refiere a pérdidas por exudado (Ryu et al., 2005; van de Wiel y Zhang,
2007), al color (Ryu et al., 2005; Sayd et al., 2006) y a la textura (Toyohara et al.,
1999). La identificación de 58 fragmentos de creatina quinasa generados de forma
natural por la acción de enzimas endógenas del músculo es una prueba evidente de
la intensa proteolisis sufrida por esta proteína durante el proceso de curado del
jamón. Esta es la primera vez que se identifica la secuencia completa de péptidos
procedentes de la hidrólisis de la creatina quinasa durante el curado. El total de los
péptidos identificados constituye aproximadamente un 44 % del total de la secuencia
Discusión general
256
de esta proteína. Durante el proceso de curado de jamón se produce un importante
aumento en la concentración de aminoácidos libres (Mc Cain et al., 1968; Virgili et al.,
1999; Toldrá et al., 2000; Martín et al., 2001). En relación con esto, los fragmentos de
creatina quinasa identificados en este estudio evidencian la contribución de las
aminopeptidasas y carboxipeptidasas al aumento en la cantidad de aminoácidos
libres observada durante el proceso de curado.
Estudios realizados mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF permitieron
identificar un total de 27 péptidos derivados de la troponina T, proteína miofibrilar
presente en el músculo estriado. La degradación postmortem de esta proteína ha
sido ampliamente estudiada (Kitamura et al., 2006); sin embargo, los detalles de su
degradación en procesos más largos como el curado de jamón, así como las
secuencias específicas de los fragmentos que se generan quedaban sin determinar
hasta la realización del presente trabajo (capítulo 7). La identificación de estos
fragmentos ha permitido demostrar la relevancia que tienen las endopeptidasas
musculares durante este periodo. Hay que destacar que algunos de los sitios de
corte correspondientes a los fragmentos identificados en este trabajo ya habían sido
anteriormente reproducidos por otros autores mediante incubación in vitro de la TnT
en presencia de μ- y m- calpaínas (Hughes et al., 2001; Kitamura et al., 2005), y
durante el almacenamiento postmortem de la carne (Muroya et al., 2004).
Los compuestos que se generan a partir de la proteolisis en jamón curado podrían
ser marcadores de calidad del proceso y, además, podrían estar ejerciendo
importantes actividades antihipertensivas, antimicrobianas, etc. en el producto final.
La identificación de la secuencia completa de estos compuestos y de sus proteínas
de origen es básica para fundamentar una investigación posterior que pueda permitir
estudiar tanto su potencial como marcadores de calidad del proceso como sus
propiedades como compuestos bioactivos. En este trabajo se han identificado
péptidos de una masa molecular comprendida entre los 1000 y los 3000 Da. La
contribución de péptidos de este tamaño a la generación del aroma y sabor
característicos del jamón ha sido estudiada (Aristoy y Toldrá, 1995; Flores et al.,
1997), aunque no se han descifrado aún todos los péptidos presentes en dicha
fracción. Este hecho y la existencia de péptidos marcadores del grado de terneza y
Discusión general
257
maduración de la carne (Nakai et al., 1995) nos indica la importancia de los péptidos
generados, lo que fundamenta la necesidad de futuras investigaciones con el fin de
mejorar el control de la calidad y del proceso de curado del jamón.
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V. Conclusiones
Conclusiones
263
V. Conclusiones - Se ha desarrollado un nuevo método sencillo, fiable y rápido para el análisis
simultáneo de carnosina, anserina, balenina, creatina y creatinina en músculo
haciendo uso de la cromatografía de interacción hidrofílica (HILIC) en HPLC.
Este nuevo método supone un avance con respecto a métodos anteriores que
requieren etapas más complejas de preparación de las muestras e incluso la
derivatización de estos compuestos.
- La creatina y creatinina son compuestos bioquímicos presentes en la carne y los
productos cárnicos que pueden ser potenciales marcadores de calidad de dichos
productos. Ambos, al igual que la carnosina, pueden ser indicadores del tipo de
metabolismo muscular. Los valores de creatinina y creatina podrían ser utilizados
para verificar la eficacia del tratamiento térmico aplicado durante el procesado de
jamones cocidos y para el control del tiempo de curado mínimo aplicado en el
proceso de jamones curados.
- Se ha realizado por primera vez la identificación masiva de péptidos provenientes
de la degradación de las proteínas miofibrilares y sarcoplásmicas durante el
curado del jamón haciendo uso de las técnicas actuales en espectrometría de
masas aplicadas al campo de la proteómica. Los péptidos identificados en este
trabajo constituyen una clara evidencia de la intensa proteólisis que las proteínas
cadena ligera de miosina I, titina, creatina quinasa, y troponina T durante el
proceso de curado de jamón. También se evidencia la utilidad y el potencial de
las técnicas de proteómica en la identificación de péptidos y en su contribución a
aumentar el conocimiento de la bioquímica del jamón, confirmando la acción de
las calpaínas, catepsinas, dipeptidilpeptidasas, aminopeptidasas y
carboxipeptidasas en la generación de péptidos. Algunos de los péptidos
identificados podrían ser utilizados en un futuro como marcadores de calidad del
jamón curado.
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