DIAGNÓSTICO BACTERIOLÓGICO DE LA TUBERCULOSIS

BACILOSCOPIA

LABORATORIO REFERENCIAL DIRESA-JUNIN

Blgo. DANIEL FERNANDO ESTRELLA TORERO

• La baciloscopia es la técnica de elección para el diagnóstico rápido y el control del tratamiento de la tuberculosis pulmonar del adulto.

• Es simple, económica y eficiente para detectar los casos infecciosos.

• Es la herramienta fundamental de un programa de control de la tuberculosis

LA MUESTRA

El envase• Boca ancha: de no menos

de 50 mm de diámetro• Capacidad entre 30 y 50

ml• Cierre hermético• Material plástico,

resistente a roturas.

Número de muestras y momento de larecolección

Para Diagnóstico

• Dos o tres muestras por SR, (aumenta probabilidad de detección).

• La primera muestra debe ser tomada en el momento de la consulta (muestra inmediata)

• La segunda muestra la debe recolectar el paciente en su casa por la mañana al despertar (muestra matinal).

• La tercera muestra, cuando sea requerida

Para Control

• Una muestra por mes de cada paciente de tuberculosis pulmonar con baciloscopia inicial positiva.

• Tomar al menos otra muestra para microscopía al finalizar el 4º mes (controlar la evolución del paciente y detectar un posible fracaso), y una al finalizar el tratamiento para confirmar la curación.

Obtención espontánea del esputo

• El primer paso para asegurar la calidad de la baciloscopia consiste en explicar al SR, con mucha claridad, la importancia de examinar muestras de esputo, la necesidad de recolectar esputo y no saliva.

Calidad de la muestra

• La muestra de esputo mucopurulenta, proveniente de árbol bronquial, es la que asegura mayor probabilidad de que se puedan observar bacilos

• Una buena muestra tiene aproximadamente 3 a 5ml, es generalmente espesa y mucoide. Puede ser fluida con partículas de material purulento. El color es variable (blanco, amarillento y hasta verdoso).

Calidad de la muestra

• Orina

• Líquido cefalorraquideo

• Líquidos pleural, ascítico, pericárdico, articular y otros

• Biopsias

• Pus

Otras muestras

CONSERVACION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

• Es conveniente procesar la muestra para baciloscopía o para cultivo el mismo día de la recolección. Si esto no es posible, conservarla siempre en refrigeración (4 °C no congelar) o en un lugar fresco, protegido de la luz y no por más de cinco días.

CONSERVACION Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

• Utilizar una caja de metal o de plástico opaco, con algún mecanismo que trabe su tapa, y con una manija para facilitar su acarreo.

• Evitar:a) Exposición al calor excesivo.b) Exposición a la luz solar

directa.c) Derrame del contenido del

envase.

RECEPCION DE MUESTRASa) Comprobar que las muestras estén bien

rotuladas (la etiqueta con los datos del paciente deberá estar colocada en el cuerpo del envase y no en la tapa) y que corresponda a lo asentado en la solicitud.

b) Limpiar el envase con fenol al 5% si existe un pequeño derrame del contenido. Si el derrame es masivo desechar la muestra por incineración o esterilización en autoclave.

c) Evaluar la calidad y cantidad de la muestra, capturar dicha información en el cuaderno de registro de laboratorio y en la sección apropiada de la solicitud de baciloscopía.

d) Notificar deficiencias en su identificación, calidad, cantidad o forma de envío. Si este es el caso, solicitar una nueva muestra.

LA BACILOSCOPIA

Técnica: Coloración de Ziehl-NeelsenFundamento:• Se basa en la capacidad de las

micobacterias para incorporar y retener ciertos colorantes (fucsina fenicada) ante la acción de ácido y alcohol, propiedad conocida como ácido-alcohol-resistencia. Debido al alto contenido en lípidos, particularmente los ácidos micólicos de la pared celular.

Lugar de trabajo y materiales

• Se recomienda que sea un área exclusiva

Los requisitos mínimos del laboratorio son:

• Buena iluminación• Ventanas o extractor para

renovar el aire una vez finalizado el trabajo.

• Paredes y pisos lavables, que puedan ser desinfectados con solución de hipoclorito de sodio

Lugar de trabajo y materiales

• Una mesa para colocar las muestras que se reciban y realizar los extendidos, con dimensiones mínimas de 1 x 0,50 m, en lo posible cubierta con material liso y resistente a soluciones germicidas (fórmica, acero inoxidable o materiales similares).

• Un lavadero con fuente de agua y desagüe, en el que se pueda lavar las manos y realizar la tinción.

• Una repisa o armario para los reactivos, portaobjetos y demás materiales.

Lugar de trabajo y materiales

• Una mesa para el microscopio.

• Una mesa para escribir los informes y los registros del laboratorio

Equipo mínimo necesario

EPP: • batas o guardapolvos de uso

exclusivo para cada persona que realice baciloscopia.

• Respirador N95• Guantes

Equipo mínimo necesario

• Microscopio binocular con oculares 10x, 40x y lente objetivo de inmersión 100x en excelentes condiciones de funcionamiento.

• Mechero de gas• Material de vidrio (matraces,

probetas pipetas, etc.).• Pizetas, embudos, lápiz de punta

de diamante.• Frascos para soluciones

colorantes y reactivos preparados.

• Gasa o papel para cubrir el área de trabajo.

• Envases para muestras.

• Aplicadores de madera.• Portaobjetos.• Varillas de vidrio para soporte de

la tinción (puente).• Hisopos de algodón.• Soluciones antisepticas: Frasco

con fenol al 5%• Recipientes para eliminación de

material contaminado.• Gradillas para láminas.• Aceite de inmersión.• Papel lente.• Papel filtro.

Reactivos y colorantesa) Fucsina fenicada.

Para 1000 ml:

Fucsina básica..................................................................3 g

Alcohol de 95 ...............................................................100 ml

Fenol acuoso*………………………………………………………….55 ml

(Completar a 1000ml).

b) Solución decolorante: (alcohol ácido).

Para 1000 ml:

Ácido clorhídrico..............................................................30 ml

Alcohol de 95 ................................................................970 ml

c) Azul de metileno.

Para 1000 ml:

Azul de metileno................................................................1 g

Agua destilada 1000 ml

Preparación del extendido

“Para este examen se deben usar sólo portaobjetos nuevos, los rayados o viejos pueden producir como resultado falsos positivos.”

Preparación del extendido

• Ordenar las muestras• Rotular portaobjetos con el

número único de la muestra de acuerdo al orden progresivo del registro de laboratorio.

• Preparar los aplicadores

Preparación del extendido

• Para evitar confusiones, colocar frente al operador solo la muestra y el portaobjeto que se va a procesar.

• Destapar el envase de la muestra, colocándolo junto a la laminilla que ha sido marcada con el mismo número de identificación que la muestra

Preparación del extendido• Usar un aplicador o palillo

de madera al que previamente se le ha quebrado uno de los extremos (captura el material mucopurulento y trasladarlo al portaobjetos)

• Abrir el envase atrás del mechero y colectar con el palillo de madera la fracción útil. (mayor posibilidad de encontrar bacilos).

Preparación del extendido

• Hacer un frotis de 2 cm de largo x 1 cm de ancho, haciendo movimientos circulares para obtener una película uniforme

Preparación del extendido• No debe ser demasiado grueso

ni demasiado delgado. En ambos casos se dificulta la tinción y la lectura microscópica

• Desechar el aplicador de madera en un frasco que contenga fenol al 5%. Usar un aplicador diferente para cada muestra de esputo aunque sean del mismo paciente.

• Dejar secar a temperatura ambiente. Nunca se debe calentar la laminilla mientras está húmedo el frotis. Hacerlo produce aerosoles peligrosos para el operador.

Preparación del extendido

• Solo después que el extendido se ha secado, fijar el frotis pasando la laminilla sobre la flama del mechero con suavidad 2 o 3 veces, evitando el sobrecalentamiento

Fijación deficiente = falso negativa.

Calentar demasiado = alterar la estructura de los bacilos.

Preparación del extendido

• Si es muy grueso, el extendido puede barrerse durante el proceso de tinción.

• Por lo general, cuando es del grosor adecuado, se puede leer un periódico colocado detrás de un extendido seco.

Preparación del extendido

• Al terminar, desinfectar el área de trabajo con fenol al 5% y esterilizar el recipiente con los aplicadores y el papel o gasa usados sobre la mesa.

• Conservar las muestras hasta terminada la observación microscópica, en caso de que sea necesario repetir el extendido, la tinción o la observación al microscopio.

• Solo cuando estos procedimientos se han completado satisfactoriamente, los contenedores con las muestras se esterilizan y desechan.

Tinción

Técnica de Ziehl Neelsen

Coloración

• Se recomienda teñir como máximo 12 frotis en cada oportunidad para lograr una coloración uniforme

• Colocar los frotis, conservando el orden numérico sobre las varillas de vidrio (distancia mínima aproximada de 5 mm – 10mm - para evitar contaminación por arrastre)

Coloración

• Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada recién filtrada. Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero.

Coloración• Con la llama de un hisopo

embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos, con movimientos de vaivén, hasta que observe que se desprenden los primeros vapores blancos. No calentar con mechero.

• En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado.

• Calentar tres veces hasta la emisión de vapores. Dejar reposar 5 min.

Coloración

• Enjuagar con abundante agua. Cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solución de fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado también la parte posterior

• Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua (evitar diluir los reactivos que se utilizarán a continuación).

Decoloración • Cubrir la totalidad del extendido

con solución decolorante y dejar actuar 3 minutos

• Enjuagar con abundante agua.

• Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes más gruesas del extendido a lo sumo conservan un leve tinte rosado). “Si se observan cúmulos rojos o coloración rosada intensa, volver a cubrir con solución decolorante 1-3 minutos” y enjuagar nuevamente.

• Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos

Coloración de fondo • Cubrir todo el extendido con

solución de azul de metileno.

• Dejar actuar durante un minuto.

• Enjuagar las láminas en ambas caras con agua a baja presión.

Coloración de fondo• Limpiar la parte inferior con

un algodón si ha quedado coloreada.

• Observar si las láminas conservan la numeración. Si no es así volver a numerarlas.

• Dejar secar las láminas a temperatura ambiente (no por calentamiento). No apoyar papel absorbente sobre el extendido.

OBSERVACION MICROSCÓPICA Y LECTURA DE EXTENDIDOS

La observación microscópica debe cumplir principalmente dos objetivos:

• Determinar si en el extendido hay BAAR.

• Cuantifica la riqueza en bacilos.

Características morfológicas del bacilo de la tuberculosis

• De 1 y 10 μm de largo. •Con la coloración de Ziehl Neelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente contra el fondo azul.•Pueden presentarse aislados, apareados o agrupados.

Observación microscópica

A. Colocar una gota de aceite de inmersión en el extremo izquierdo del frotis teñido.

B. Enfocar el portaobjetos con el lente objetivo de 40x antes de 100x

C. Después de encontrar el área adecuada, cambiar a la lente objetivo de 100x.

Observación microscópicaD. La lente objetivo no debe tocar el portaobjetos (falsos positivos).E.Examinar sistemáticamente 100 campos útiles. F. Después de observar un campo microscópico, desplazar el portaobjetos longitudinalmente para poder examinar el campo contiguo.

Observación microscópicaCampos útiles

•Aquel en el cual se observan elementos celulares de origen bronquial (leucocitos, fibras mucosas y células ciliadas).

•Los campos sin estos elementos no deben ser considerados para contar el total de campos observados, a menos que contengan BAAR.

Observación microscópicaConteo de BAAR

•Contar el número de campos que ha leído y el número de BAAR que ha identificado.

•Se puede utilizar una cuadrícula de 10 cuadrados por 10 cuadrados, que representan los 100 campos microscópicos, como ayuda para registrar la cuenta.

•En cada cuadrado anotar el número de BAAR que se observa.

•Si no observa BAAR consignar 0.

Reporte de resultados

Reporte de resultados

Resultado: (No. de bacilos/No. de campos)

Resultado: (49/100) = 0.49Entonces: Positivo +

Reporte de resultados

Resultado: (No. de bacilos/No. de campos)

Resultado: (165/50) = 3.3Entonces: Positivo ++

3 0 5 0 6 7 4 5 0 5

4 0 0 5 7 0 6 0 0 4

4 6 0 0 5 7 5 5 0 6

0 5 7 5 0 0 6 0 6 0

6 0 7 0 5 0 6 7 0 6

                   

                   

                   

                   

Reporte de resultados

Resultado: (No. de bacilos/No. de campos)

Resultado: (250/20) = 12.5Entonces: Positivo +++

15 13 0 9 16 20 10 0 18 15

0 20 15 11 17 16 0 18 20 17

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

                   

Registrar el resultado

Qué hacer si es paucibacilar?

-Leer 100 campos utiles más.-Si persiste el resultado, realizar otro extendido de una porción mas representativa.-Si persiste el resultado, anotar el hallazgo y enviar a cultivo.-Anotar en el rubro Observaciones (Ej. 5 BAAR)-Solicitar nuevas mxs.

Algunas razones que causan resultados falsos positivos son:

• Error al manejar la muestra o al registrar la información•Volver a usar recipientes o portaobjetos Positivos•Fucsina Fenicada sin filtrar•Aceite de inmersión contaminado •Decoloración incorrecta.

Algunas razones que causan resultados falsos negativos son:

•Errores al manejar la muestra o al registrar información•Mala calidad del esputo•Decoloración excesiva•Lectura de menos de 100 camposmicroscópicos.

CONTROL DE CALIDAD DE LAS BACILOSCOPIAS

“Objetivo: elevar y mantener la calidad de trabajo”.

•El control de calidad permite evaluar si la información producida por el laboratorio es precisa, reproducible y oportuna.

•Instaura un sistema de alarmas que permite prevenir, descubrir y corregir errores

•Resulta más eficaz para detectar y asistir a los casos de tuberculosis y para controlar la enfermedad

Conservación de las láminas:•Quitar el aceite presionando muy suavemente sobre ellas un papel absorbente.•Sumergirlas en un recipiente con xilol o alcohol 70%, durante no más de 30 segundos.• Dejar secar al aire.•Comprobar que la numeración esté visible en las láminas.•Guardarlas en cajas para láminas portaobjetos, o dentro de una caja común envueltas individualmente en papel, (en paquetes rotulados con la fecha, en el orden en que se realizaron). • Conservarlas en lugar seco y fresco.

Conservación de las láminas:Laboratorios que procesan:

-Más de 100 bks por mes y con màs de 10 bks positivos (diagnostico mas control) conservaran todas la positivas y las dos negativas siguientes-Más de 100 bks por mes y presentan menos de 10 bks positivos conservaran además el 10% de láminas negativas.-Menos de 100 bks como promedio mensual, conservarán todas las positivas y negativas del mes de numeración.-Si durante el periodo un laboratorio no ha tenido láminas positivas, conservará todas la láminas del mes de numeración correlativa.

Evaluación de las láminas:Calidad de la coloración

Evaluación de las láminas:Calidad del extendido

Muestras de frotis: (1)muy chico(2)no uniforme y demasiado grande(3) muy delgado(4) muy grande(5)mal decolorado y muy grueso(6)tamaño y tinción adecuadas

Evaluación de las láminas:Calidad del extendido

Evaluación de las láminas:Calidad del extendido

GRACIAS POR SU ATENCION

LABORATORIO REFERENCIAL DIRESA-JUNINTELF: 064-217394CORREO ELECTRONICO: labreferencial@yahoo.es