UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Pseudomonas spp. Y PATRÓN
DE RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS EN REPTILES EN
CAUTIVERIO”
Trabajo de Grado presentando como requisito para optar por el Título de
Médico Veterinario Zootecnista.
RENÉ OSWALDO SILVA CASTILLO
TUTOR: Dra. MARÍA INÉS BAQUERO MSc.
Quito, Agosto 2015
ii
DEDICATORIA
Este trabajo se lo dedico a mis más fieles compañeros, aquellos que no hablan con
su voz, sino con su mirada. A mis queridos Zeus, Cuca, Mimí y Robert, ellos nunca
fueron mascotas, fueron mis amigos y a pesar de que ya no están lo seguirán siendo.
A Julia, Dulce y Caramelo que espero estén conmigo muchos años más. Cuando
me he sentido triste han sido mi sonrisa, mi consuelo.
René
iii
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, el agradecimiento mayor es para mi familia: a mis padres porque
con ellos empezó todo, por haberme apoyado en todas mis decisiones sin hacer
preguntas, porque siempre confiaron en mí, aunque yo no lo hiciera, gracias a los
dos por haber sacrificado tantas cosas por hacer lo posible para que yo siguiera el
camino que un día elegí. A mi hermano Jorge y Juan Dieguito, que los quiero mucho
aunque a veces no esté para decírselos.
A la doctora María Inés Baquero, tutora de esta tesis, quien ha corregido
minuciosamente este trabajo tengo que agradecerle sus comentarios, sugerencias y
las correcciones con las que he podido elaborar una adecuada memoria de todo el
trabajo realizado durante este año.
Al Dr. Eduardo Aragón, le agradezco sinceramente su confianza y apoyo
económico permitiendo la continuación del proyecto.
A la Dra. Nivia Luzuriaga, le agradezco las lecturas y sus comentarios tanto
científicos como literarios, sus correcciones y su infinita paciencia. Además, su
amistad.
A mis compañeros del laboratorio, quienes me enseñaron a tener confianza, desde
el primer día gracias por escucharme y echarme una mano cuando lo necesitaba.
Al personal administrativo, la señora Saskya, a Cristinita y a Karen, que han estado
siempre pendientes de mi ayudándome a resolver esos trámites que a veces
resultaban ser tan confusos.
A don Leo, dueño del acuario-serpentario por su importante ayuda cada vez que fui
a tomar las muestras.
A mis amigos, aquellos que han estado en todo momento, los cuales no hace falta
mencionarlos pues saben que los llevo en mi corazón, tienen mi más sincera gratitud
por todo.
iv
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, RENÉ OSWALDO SILVA CASTILLO en calidad de autor de la tesis
“AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Pseudomonas spp. Y PATRÓN DE
RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS EN REPTILES EN CAUTIVERIO”,
por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer
uso de todos los contenidos que nos pertenecen o de parte de los que contienen esta
obra, con los fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponde, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con el establecimiento
en los artículos 5, 6, 8,19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y
su reglamento.
v
INFORME DE TUTOR
En mi carácter de Tutor del Trabajo de Grado, presentado por el señor:
RENÉ OSWALDO SILVA CASTILLO, para optar por el Título o Grado de
Médico Veterinario Zootecnista, cuyo título es “AISLAMIENTO E
IDENTIFICACIÓN DE Pseudomonas spp. Y PATRÓN DE RESISTENCIA A
ANTIMICROBIANOS EN REPTILES EN CAUTIVERIO”. Considero que dicho
trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación
pública y evaluación por parte del jurado examinador que se designe.
vi
APROBACIÓN DEL TRABAJO/TRIBUNAL
“AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Pseudomonas spp. Y PATRÓN
DE RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS EN REPTILES EN
CAUTIVERIO”
El tribunal constituido por:
Dr. Christian Vinueza Presidente del Tribunal, Dra. Nivia Luzuriaga Vocal
Principal, Dr. Gustavo Salgado Vocal Principal, y Dr. César Guanoluisa Vocal
Suplente.
Luego de receptar la presentación del trabajo de grado, previo a la obtención del
título o grado de Médico Veterinario Zootecnista, presentado por el señor René
Oswaldo Silva Castillo.
Con el título “AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Pseudomonas spp. Y
PATRÓN DE RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS EN REPTILES EN
CAUTIVERIO”.
Ha emitido el siguiente veredicto: cumplidos los requisitos reglamentarios y una
vez efectuada la defensa de Tesis, se concluye con la Aprobación de la defensa de
la tesis, presentada por el señor René Oswaldo Silva Castillo.
vii
ÍNDICE DE CONTENIDO
DEDICATORIA ..................................................................................................... ii
AGRADECIMIENTOS ......................................................................................... iii
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL ..................................... iv
INFORME DE TUTOR .......................................................................................... v
APROBACIÓN DEL TRABAJO/TRIBUNAL .................................................... vi
ÍNDICE DE CONTENIDO................................................................................... vii
ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................... ix
ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................................... x
RESUMEN ............................................................................................................. xi
ABSTRACT .......................................................................................................... xii
CAPÍTULO I ......................................................................................................... 1
INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1
CAPÍTULO II ....................................................................................................... 4
REVISIÓN DE LITERATURA .............................................................................. 4
Antecedentes ................................................................................................................... 4
Generalidades .................................................................................................................. 5
Fisiología y estructura ..................................................................................................... 5
Patogénesis y patogenicidad ........................................................................................... 6
Resistencia a los antibióticos .......................................................................................... 7
Bombas de expulsión ...................................................................................................... 8
Porinas de membrana ...................................................................................................... 9
Otros mecanismos de resistencia .................................................................................... 9
Enfermedades clínicas .................................................................................................... 9
Enfermedad de Blíster ..................................................................................................... 9
Estomatitis .................................................................................................................... 10
Septicemia y úlceras cutáneas ....................................................................................... 10
Conjuntivitis .................................................................................................................. 11
Otitis .............................................................................................................................. 11
Diagnóstico de laboratorio. ........................................................................................... 11
Microscopia................................................................................................................... 11
Cultivo .......................................................................................................................... 11
Identificación ................................................................................................................ 11
Tratamiento, prevención y control ................................................................................ 13
viii
CAPÍTULO III .................................................................................................... 14
METODOLOGÍA ................................................................................................. 14
Población objeto de estudio .......................................................................................... 14
Toma de muestras ......................................................................................................... 14
Fase de campo ............................................................................................................... 14
Aislamiento e identificación bacteriana ........................................................................ 15
Api 20 NE ..................................................................................................................... 15
Lectura de API .............................................................................................................. 15
Determinación del patrón de resistencia a antimicrobianos. ......................................... 16
Método Difusión de discos de Kirby Bauer .................................................................. 16
Preparación de la placa de Mueller-Hinton ................................................................... 16
Preparación del inóculo ................................................................................................. 16
Inoculación de placas .................................................................................................... 16
Aplicación de los discos. ............................................................................................... 17
Informe de los resultados. ............................................................................................. 17
Medición de tamaño de la zona..................................................................................... 17
CAPÍTULO IV .................................................................................................... 18
RESULTADOS ..................................................................................................... 18
Aislamiento e identificación de microorganismos ........................................................ 18
Patrones de resistencia a antimicrobianos ..................................................................... 20
Chi cuadrado ................................................................................................................. 26
DISCUSIÓN ......................................................................................................... 27
CAPÍTULO V ...................................................................................................... 34
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................... 34
CONCLUSIONES ........................................................................................................ 34
RECOMENDACIONES ............................................................................................... 35
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................. 36
ANEXOS .............................................................................................................. 42
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.- Patrones de resistencia a los antibióticos ............................................ 21
Figura 2.- Chi cuadrado. Grupo de antibióticos vs patrón de resistencia ........... 26
x
LISTA DE TABLAS
Tabla 1.- Listado de animales muestreados del acuario serpentario San Martín De
Baños ..................................................................................................................... 18
Tabla 2.- Aislamiento e identificación de muestras obtenidas de reptiles en
cautiverio ............................................................................................................... 19
Tabla 3.- Especie animal, tipo de muestra y especie de Pseudomonas aislada.... 20
Tabla 4.- Patrones de resistencia de Pseudomonas spp. a antibióticos ................ 21
xi
“AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE Pseudomonas spp .Y PATRÓN
DE RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS EN REPTILES EN
CAUTIVERIO”.
Autor: René Oswaldo Silva Castillo
Tutor: Dra. María Inés Baquero MSc.
Fecha: Julio, 2015
RESUMEN
El género Pseudomonas comprende bacilos Gram negativos pertenecientes a un
grupo de patógenos oportunistas; en los últimos años han constituido un modelo
por su resistencia natural a la mayoría de antibióticos. Además de su extraordinaria
capacidad para permanecer por tiempos prolongados en reservorios, se caracterizan
por producir infecciones oportunistas en individuos con enfermedades crónicas y
sistema inmune deprimido. Con este enfoque, se llevó a cabo la presente
investigación, cuyo principal objetivo fue identificar los patrones de resistencia a
antimicrobianos en aislamientos de Pseudomonas spp. obtenidos de muestras de
hisopado oral y cloacal (n=110) de toda la población de reptiles (n=55) del
Acuario– Serpentario San Martín de Baños mantenidos en cautiverio. Las muestras
fueron sometidas a pruebas de identificación incluyendo Tinción Gram (bacilos
Gram-) oxidasa (+) y API 20NE. Se aislaron 25 Pseudomonas spp. de las cuales se
identificaron 6 especies diferentes: P. alcaligenes, P. fluorescens, P. mendocina, P.
putida, P. luteola, y P. aeruginosa. En cuanto a los patrones de resistencia se
identificó que Pseudomonas spp. mostró una alta sensibilidad para el grupo de
aminoglucósidos (17%), seguido de fluoroquinolonas (14%) y tetraciclinas (5,7%).
Por el contrario, presentó un patrón de resistencia para el grupo de antibióticos
pertenecientes a los beta lactámicos (31%), seguido de sulfas (6,3%) y finalmente
mostraron un patrón intermedio principalmente para el grupo de los fenicoles (4%).
Los antibióticos que mostraron mayor grado de sensibilidad se encuentran
asociados con los de menor uso en el tratamiento y profilaxis de reptiles, mientras
que los que mostraron mayor grado de resistencia, son aquellos en los que su uso
en reptiles es indiscriminado así como aquellos antibióticos de amplio uso en
producción animal y en humanos; en ese sentido se podría inferir una posible
colonización cruzada entre animales y humanos.
Palabras clave: Pseudomonas spp., REPTILES, AISLAMIENTO,
IDENTIFICACIÓN, PATRÓN, ANTIMICROBIANO
xii
"ISOLATION AND IDENTIFICATION OF Pseudomonas spp. AND
RESISTANCE PATTERN TO ANTIMICROBIALS IN CAPTIVE
REPTILES."
Author: René Oswaldo Silva Castillo
Tutor: Dra. María Inés Baquero MSc.
Date: July, 2015
ABSTRACT
The Pseudomonas genus includes Gram negative bacilli belonging to a group of
opportunistic pathogens; in recent years they have become a model due to its natural
resistance to most antibiotics. In addition to its extraordinary ability to remain for
long time in reservoirs. They are characterized by producing opportunistic
infections in individuals with chronic diseases and weakened immune system. This
investigation was conducted with this approach, which main objective was to
identify resistance patterns to antimicrobial in isolation of Pseudomonas spp.
obtained from oral and cloacal swabs (n=110) of all reptiles, (n = 55) of the Aquarium
- Serpentarium San Martin de Baños. These samples were subjected for
identification test including Gram stain (Gram- bacillus) oxidase (+) and API 20NE.
25 Pseudomonas spp. were isolated, of wich 6 different species were identified. P.
alcaligenes P. fluorescens, P. mendocina, P. putida, P. luteola, and P. aeruginosa.
Regarding the resistance patterns it was identified that Pseudomonas spp. showed
high sensitivity for the group of aminoglycosides (17 %), followed by
fluoroquinolones (14%) and tetracycline (5.7 %). On the contrary, it presented a
pattern of resistance to the antibiotic group belonging to the beta-lactam (31%),
followed by sulfa drugs (6.3%) and finally showed an intermediate pattern mainly
for phenicols group (4%). The antibiotics that showed greater sensitivity are
associated with those of less use in the treatment and prophylaxis of reptiles,
whereas those that showed greater resistance are those the use of which is
indiscriminate in reptiles, as well as those antibiotics of wide use in animal
production and humans; with these data we could infer an possible cross
colonization between animals and humans.
Keywords: Pseudomonas spp., REPTILES, ISOLATION, IDENTIFICATION,
ANTIMICROBIAL, PATTERN.
1
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
Las Pseudomonas spp. son bacilos Gram negativos que pertenecen a un complejo
grupo de patógenos oportunistas de plantas, animales y el ser humano (Murray et
al.,2014). Estas bacterias son aerobias estrictas, no formadores de esporas, oxidasa
y catalasa positivas, y muchas de ellas son móviles, debido a la presencia de uno o
varios flagelos polares (Bryan et al., 2013); entre sus características principales se
destaca la producción de pigmentos solubles fluorescentes, como la pioverdina,
piocianina y con menor frecuencia piorrubina y piomelanina; igualmente, la
mayoría de cepas presentan un olor característico a fruta madura (Montero, 2012).
Este género posee requerimientos nutricionales mínimos para su crecimiento y
desarrollo, con frecuencia se observa que crecen inclusive en agua destilada, a
temperaturas entre los 37ºC y los 42ºC (Murray et al, 2014). Estas propiedades
naturales mencionadas, contribuyen a su éxito ecológico como patógenos
oportunistas (Murray et al., 2014).
En los últimos años han constituido un paradigma por su resistencia natural a la
mayoría de antibióticos (Martínez et al., 2013). Además de su extraordinaria
capacidad para permanecer por tiempos prolongados en reservorios húmedos,
líquidos y superficies, es excepcional encontrarla como parte de la microflora
normal de los individuos sanos (Martínez et al., 2013). Se caracterizan por producir
infecciones oportunistas en pacientes con enfermedades crónicas y sistema inmune
deprimido; en seres humanos es causante principalmente de infecciones
nosocomiales (Ochoa et al., 2013), mientras que en los animales, puede ser causante
de un sinnúmero de afecciones tales como mastitis en vacas, endometritis en
yeguas, ha sido aislada a partir de aves silvestres las cuales funcionan como
reservorios (Mona et al., 2014), y también es parte muy importante en patología
aviar, donde se ha aislado a partir de pollos Broiler con pododermatitis y artritis
(Dinev et al., 2013) .
2
En el caso de reptiles se destacan condiciones clínicas tales como: enfermedad de
Blíster (Cohen, 2014), estomatitis (Álvarez & Bedia, 2005), conjuntivitis (İşler et
al., 2015) y otitis (Jiménez et al., 2009).
En el Ecuador la población de reptiles es una de las más diversas en el mundo,
contando con aproximadamente tres especies por cada 2.000 Km2 y registrándose
hasta la fecha al menos 440 especies de reptiles (Pazmiño, 2014), esta diversidad
está siendo amenazada por factores de caza, comercialización, tráfico de fauna
silvestre y/o usos medicinales, sumándole a esto, la pérdida de su hábitat por
procesos de desarrollo económico y físicos que han reducido las poblaciones de
reptiles silvestres (Pazmiño, 2014).
En los últimos años han aumentado el número de centros de manejo con fines
educativos, así como también para la reproducción y reintroducción de especies
reptiles amenazadas; es importante destacar, que el inadecuado manejo de ciertas
condiciones de cautiverio, tales como suministro de agua y luz, cambios bruscos
de temperatura y malas prácticas de higiene, provocan procesos de estrés en estos
animales (Martínez et al.,1994). Dentro de los centros de manejo se tratan
frecuentemente a los reptiles de forma general y superficial con antibióticos de
amplio espectro, lo cual conlleva al desarrollo de cepas resistentes a diversos
antimicrobianos y niegan la posibilidad de futuros tratamientos efectivos (Foti et
el.,2013). Estos factores comprometen su estado inmunitario e incrementan la
posibilidad de contraer enfermedades ocasionadas por patógenos oportunistas,
tales como Pseudomonas spp. (Foti et el., 2013).
El género Pseudomonas presenta diversos mecanismos de resistencia natural hacia
una gama de agentes terapéuticos, incluyendo la mayoría de las penicilinas,
cefalosporinas, tetraciclinas, sulfas (Murray et al., 2014). Además, posee la
capacidad de mutar a cepas aún más resistentes durante el tratamiento, debido a que
desarrollan con extrema facilidad cambios a nivel cromosómico donde adquieren
material genético del medio ambiente que le confiere resistencia a los antibióticos
(Martínez et al.,2013). Se han identificado tres mecanismos principales de
resistencia en este género: producción de β-lactamasas (García, 2012), alteraciones
de la permeabilidad de membrana por la presencia de bombas de expulsión y
mutaciones de porinas transmembranales (Gómez et al.,2005).
3
La resistencia a los antibióticos resulta del uso y abuso de los distintos tipos de
antimicrobianos, lo cual acarrea como consecuencia, el fracaso de los tratamientos
y un incremento en los costos del mismo (Martínez et al., 2013). Por esta razón,
ha sido considerado como un problema de salud pública mundial (Rivera et
al.,2008), y la OMS describe a este fenómeno, como la quinta amenaza del siglo
XXI para la salud, haciendo aún más relevante la importancia de su estudio.
Debido a estas razones, se planteó como principal objetivo de esta investigación el
aislar e identificar Pseudomonas spp. a partir de muestras de hisopado oral y cloacal
de reptiles mantenidos en cautiverio, a fin de determinar su patrón de resistencia a
antimicrobianos.
Los datos obtenidos en esta investigación permitirán no solo la orientación hacia
un mejor uso de los antibióticos, sino también será la base para nuevos estudios
sobre esta temática, la cual ha sido poco desarrollada en el Ecuador.
4
CAPÍTULO II
REVISIÓN DE LITERATURA
Antecedentes
La OMS describe a la multirresistencia a antibióticos, como la quinta amenaza del
siglo XXI para la salud, siendo esto de gran importancia a nivel mundial.
Pseudomonas spp. presenta patrones de multirresistencia a diversos antibióticos
como las cefalosporinas, tetraciclinas, quinolonas y macrólidos (Gómez et al.,
2005).Además, tiene una alta capacidad de adquirir nuevos mecanismos de
resistencia, generalmente mediante mutaciones (Manzur., et al 2007).
Con el fin de establecer los patrones de resistencia y sensibilidad que muestra
Pseudomonas spp. a diversos antibióticos, se han realizado investigaciones en
varios (Foti, Giacopello, Fisichella, & Giuseppe, 2013) lugares tales como Japón
(Harda et al.,2012), Italia (Foti et al., 2013), Buenos Aires (Santella et al., 2011),
Venezuela (Martínez et al., 2013) y Perú (Castillo et al.,2012), en los cuales se ha
demostrado que la bacteria es resistente a un amplio grupo de antimicrobianos
debido a la adquisición de múltiples mecanismos de resistencia de origen
cromosomal o mutación simple (Harda et al.,2012).
El Ecuador cuenta con poca información acerca de la resistencia a antibióticos que
presenta Pseudomonas principalmente a nivel veterinario, siendo necesario
investigaciones que permitan tener una base de datos. Es así que los únicos datos
reportados corresponden a estudios realizados por La Red Nacional de Resistencia
Bacteriana creada en el año 1999, la cual ha sido la encargada de presentar datos
de resistencia bacteriana tanto a nivel comunitario como hospitalario, los últimos
datos disponibles presentados en el año 2008 reportaron que Pseudomonas
aeruginosa fue resistente a gentamicina en un 55% y a ciprofloxacina en un 54%
(Quizhpe et al, 2011).
5
Generalidades
El género Pseudomonas y otros como Burkholderia y Stenotrophomonas se
encuentran estrechamente relacionados y constituyen un grupo que a menudo se
denominan pseudomonadales (Murray et al., 2014). La mayoría de las cepas de este
género son móviles gracias a la presencia de uno o más flagelos polares y suelen
ser citocromo oxidasa positivos (Koneman & Stephen, 2008) .El microorganismo
más importante es Pseudomonas aeruginosa. Los miembros de este género se
encuentran en el agua, suelos y plantas. Comúnmente ha sido encontrada en el entorno
de granjas, particularmente en los suministros de agua y especialmente en la usada para el
lavado de la ubre en el pre ordeño (Hossain et al., 2013). En los centros de manejo de fauna
silvestre ha sido aislada con frecuencia a partir de los recipientes de agua (Lucak et al.,
2013) y en los hospitales puede ser encontrada en respiradores, humidificadores,
vertederos, duchas, piscinas de hidroterapia, ocasionalmente en las manos de los
trabajadores de la salud o incluso en los desinfectantes (Roca, 2014).
El género Pseudomonas se distribuye ampliamente en el ambiente, debido a sus
sencillas exigencias para crecer y su vasto recurso nutricional (Murray et al., 2014).
Pueden emplear muchos compuestos orgánicos como fuente de carbono y
nitrógeno, y algunas cepas consiguen incluso crecer en agua destilada empleando
oligonutrientes (Murray et al., 2014). Estos microorganismos presentan factores
estructurales, toxinas y enzimas que potencian su virulencia y los hacen resistentes
a la mayor parte de los antibióticos de uso común (Murray et al., 2014).
Fisiología y estructura
El género Pseudomonas comprende bacilos Gram negativos no formadores de
esporas (Romero, 2007) rectos o ligeramente curvos, generalmente móviles, con
una longitud que varía de 0,5-1,0µm por 1,5-5,0 µm y un espesor de 0,5 a 1µm. Son
aerobios y anaerobios facultativos (Romero, 2007), y se disponen normalmente en
parejas. Estos microorganismos utilizan los carbohidratos como fuente de energía
mediante la respiración aerobia, de modo que el oxígeno es el aceptor terminal de
los electrones; aunque se describen como aerobios obligados pueden en ocasiones
6
crecer de forma anaerobia utilizando nitratos o arginina como aceptor alternativo
para los electrones (Forbes, 2009).
El rango de temperatura óptima para el desarrollo de la mayoría de estas especies
es de 30 a 37 °C, a pesar de ello algunas especies pueden desarrollarse a 4° C
(Romero, 2007). La presencia de citocromo oxidasa en Pseudomonas spp. se
emplea para distinguirla de la familia Enterobacteriaceae y del género
Stenotrophomonas (Murray et al., 2014).
Patogénesis y patogenicidad
La invasión al organismo por parte de Pseudomonas spp.es precedida por una
ruptura en las defensas del hospedador, tales como lesiones en la piel debido a un
trauma, humedad prolongada, pudrición de lana en las ovejas o por la presencia de
catéteres urinarios o intravenosos tanto a nivel hospitalario humano como
veterinario (Quinn et al., 2011). La adherencia a las células hospedadoras resulta
indispensable para ocasionar la infección en el individuo. Al menos cuatro
componentes de la superficie bacteriana de las Pseudomonas spp. facilitan este
proceso (Murray et al.,2014); la primera etapa de la infección está mediada por
apéndices en la superficie de la bacteria conocidos como el pili y fimbrias
(Koneman & Stephen, 2008).
Los flagelos y el alginato, juegan un papel importante en la adherencia,
colonización y replicación de la bacteria; debido a las propiedades antifagocíticas
de la exoenzima S, la sustancia mucoide extracelular y la membrana externa de
lipopolisacáridos (Quinn et al., 2011; Koneman & Stephen, 2008).
El daño tisular es causado por una variedad de toxinas extracelulares y enzimas,
tales como la exotoxina A, Fosfolipasa C y proteasas (Quinn et al., 2011). La
exotoxina A inhibe la síntesis protéica, ejerce una acción dermonecrótica, provoca
lesión de los tejidos pulmonares y tiene acción inmunosupresora (Ausina &
Moreno, 2006). La fosfolipasa C es una hemolisina, la cual destruye la membrana
citoplasmática, la sustancia tenso activa pulmonar e inactiva las opsoninas
(Koneman & Stephen, 2008). Las Proteasas, incluyendo elastasas, destruyen las
inmunoglobulinas y sustancias del complemento, además interrumpen la actividad
de los neutrófilos (Koneman & Stephen, 2008).
7
La infección puede ser localizada o diseminarse, propagándose a todo el organismo
ayudado por la exoenzima S, la toxicidad sistémica se atribuye a la exotoxina A y
endotoxinas. Los mecanismos de defensa del hospedador contra Pseudomonas spp.
incluyen anticuerpos opsonizantes y fagocitosis por parte de neutrófilos y
macrófagos (Quinn, y otros, 2011).
La producción de la sustancia mucoide extracelular y la formación de biofilm son
particularmente importantes en la patogénesis de las infecciones asociadas al uso
de dispositivos permanentes como catéteres (Quinn et al., 2011). La resistencia al
daño mediado por las células del complemento y la capacidad de obtener hierro a
partir de los tejidos del hospedador, son factores de virulencia adicionales (Quinn
et al., 2011).
Los pigmentos producidos por algunas cepas de Pseudomonas spp. funcionan
como sideróforos (Quinn et al., 2011) y otros como las piocianinas, alteran la
integridad principalmente de tejidos oxigenados tales como el pulmón, y además,
disminuyen la actividad de los cilios respiratorios (Palamthodi et al., 2011).
Resistencia a los antibióticos
El género Pseudomonas spp. presenta diversos mecanismos de resistencia hacia
los agentes terapéuticos, además posee la capacidad de mutar a cepas aún más
resistentes durante el tratamiento (Murray et al., 2014). Se han identificado tres
mecanismos principales de resistencia en este género, tales como producción de β-
lactamasas (García, 2012), alteraciones de la permeabilidad de membrana por la
presencia de bombas de expulsión, y mutaciones de porinas transmembranales
(Gómez et al., 2005). Los genes que codifican para la síntesis de las β-Lactamasas
de espectro extendido (BLEE), pueden estar ubicadas a nivel cromosomal, en
plásmidos o integrones, los cuales participan en la acumulación y la diseminación
de los genes de resistencia o en elementos genéticos móviles como los transposones
(Gónzales et al., 2012).
8
β-Lactamasas
Las β-lactamasas son enzimas que hidrolizan el anillo β-lactámico de los
antibióticos, destruyen el sitio activo del antibiótico e impiden su actividad. Existen
algunas sub clasificaciones como, penicilinasas, cefalosporinasas o
carbapenemasas, dependiendo de la familia de β - lactámicos que tenga mayor
susceptibilidad a ser afectada por la enzima (Gómez et al., 2005). De la misma
manera, estas enzimas son susceptibles de ser inhibidas por los inhibidores de β -
lactamasas como el clavulanato, el sulbactam y el tazobactam (Gómez et al., 2005).
P. aeruginosa posee dos clases de β - lactamasas: Amp-C y las β-lactamasas de
espectro extendido (BLEE) (Ranzola et al., 2010). Amp-C, tiene la capacidad de
ser inducida en cuestión de días por los propios β - lactámicos, especialmente
cefalotina y ampicilina. Cuando esto ocurre, hay resistencia a penicilinas y
cefalosporinas (ceftazidime, cefepime) (Ranzola et al., 2010; Gómez et al, 2005)
La resistencia mediada por este mecanismo se debe sospechar ante un antibiograma
que revele resistencia a todas las penicilinas y cefalosporinas anti-Pseudomonas
(Gómez et al., 2005). La opción terapéutica en este caso son los carbapenémicos,
siempre que no se trate de una carbapenemasa (Gómez et al., 2005).
Bombas de expulsión
Las bombas de expulsión son complejos enzimáticos de membrana, que expulsan
detergentes y sustancias anfipáticas de la célula que de otra manera destruirían la
bacteria (Ranzola et al., 2010) .Este sistema de expulsión se compone de una
bomba protéica ubicada en la membrana citoplasmática, una proteína ligadora
ubicada en el espacio periplásmico y un canal de salida en la membrana externa
(Gómez et al, 2005). El complejo tiene la capacidad de expulsar al exterior de la
bacteria y contra un gradiente de concentración, β-lactámicos, cloranfenicol,
quinolonas, macrólidos, novobiocina, sulfonamidas, tetraciclinas y trimetoprim
(Gómez et al, 2005).
9
Porinas de membrana
Son proteínas transmembranales que se ubican en la membrana externa de las
bacterias y cumplen diversas funciones como permitir la captación pasiva de
aminoácidos básicos a través de la membrana externa. Además, son capaces de
permitir la entrada de carbapenémicos, aunque no de otros β-lactámicos (Gómez et
al., 2005).
Otros mecanismos de resistencia
Se presentan también, resistencia a aminoglucósidos debido a la ausencia de
permeabilidad de la membrana externa y por enzimas modificadoras de
aminoglucósidos y resistencia a fluoroquinolonas gracias a impermeabilidad,
bombas de eflujo o mutaciones de las enzimas de girasa y topoisomerasa (Ramirez,
2014).
Enfermedades clínicas
El género Pseudomonas spp. ha sido asociado a un sin número de enfermedades
tanto en animales como en el hombre (Dégi et al., 2014). En el caso de reptiles se
destacan condiciones clínicas tales como:
Enfermedad de Blíster
Las boas pueden presentar un sin número de problemas de salud, una de las razones
más comunes por las cuales los reptiles son llevados a la consulta veterinaria es por
problemas dermatológicos (Dégi et al., 2014). La causa más importante de tales
problemas es un inadecuado manejo, especialmente los relacionados a cambios
inapropiados de temperatura y humedad (Silvestre, 2000) . La enfermedad de
Blíster conocida también como dermatitis vesicular o dermatitis necrotizante se
presenta al mantener reptiles con demasiada humedad o reducidas condiciones
higiénicas (Cohen, 2014). Cuando el animal se ve obligado a permanecer sobre el
sustrato húmedo, saturado de alimento en descomposición o con las heces y uratos,
la piel se infecta (Dégi et al., 2014). La presencia de ampollas es la primera señal,
más tarde las escamas aparecen inflamadas. La infección puede permanecer en el
cuerpo del animal desapercibida causando septicemia (Cohen, 2014). Los pequeños
10
reptiles o los que se encuentran inmunodeprimidos mueren rápidamente, las
lesiones en la piel se pueden presentar en lugares distantes a la ampolla inicial,
dejando al cuerpo susceptible a la invasión de bacterias y hongos (Dégi et al.,
2014).
Estomatitis
Las alteraciones del tracto digestivo de los reptiles responden a múltiples causas y
presentan cuadros clínicos inespecíficos (Álvarez & Bedia, 2005). La estomatitis
vesicular es el nombre común para describir a las infecciones en la boca (cavidad
oral) de los reptiles (Cohen, 2014); estas infecciones pueden ser bacterianas, virales,
fúngicas, o de origen parasitario. Otras posibilidades son: cáncer, cuerpos extraños
y fracturas mandibulares (Dégi et al., 2014). Frecuentemente están asociadas con
las infecciones de la boca de los reptiles los traumatismos en la región del rostro a
causa de la fricción sobre las paredes de la caja o mordidas por parte de la presa
(Anderson, 2015).
Las tortugas son más propensas a las infecciones virales y parasitarias, las cuales
resultan en infecciones orales y pulmonares, incluso cuando las condiciones
ambientales y de manejo son ideales (Dégi et al., 2014). El pronóstico es reservado
en los casos donde existe material caseoso de manera significativa, y grave para los
pacientes con afectación ósea significativa (Anderson, 2015).
Septicemia y úlceras cutáneas
Generalmente, esta enfermedad tiene un curso agudo con úlceras cutáneas,
anorexia, letargia, septicemia y muerte. La enfermedad se asocia con varias
bacterias, principalmente Gram negativas (Granados et al., 2013). Se ha reportado
la enfermedad ocasionalmente en tortugas marinas y terrestres, y se caracteriza por
llevar un curso crónico con erosión y descamación del caparazón (Jimenez et al.,
2009).
11
Conjuntivitis
La conjuntivitis es vista con frecuencia en las tortugas de orejas rojas, si la
enfermedad no es tratada puede discurrir rápidamente en inanición y muerte (İşler
et al., 2015).
Otitis
En las tortugas suele asociarse a situaciones por falta de higiene o deficiencias de
vitamina A. La hipovitaminosis produce metaplasia escamosa de los epitelios de
conductos auditivos e infección secundaria del oído interno (Jiménes et al., 2009).
Diagnóstico de laboratorio.
Microscopia
La observación de bacilos Gram negativos largos y delgados, sueltos o en pares a
partir de un cultivo sugiere la presencia de Pseudomonas spp; Burkholderia,
Stenotrophomonas y otros microorganismos que comparten una morfología similar
(Murray et al., 2014).
Cultivo
Dado que Pseudomonas spp. tiene exigencias nutricionales muy sencillas, es fácil
recuperar esta bacteria en medios de aislamiento no selectivos tales como agar
sangre o selectivos diferenciales para bacilos Gram negativos como agar Mac-
Conkey (Kumar & Shaker, 2014). El aislamiento puede ser realizado también
directamente en medios selectivos para esta especie tales como Agar Pseudomonas
(Ebani et al., 2008) o agar Cetrimide, el cual puede ser suplementado con ácido
nalidíxico para incrementar su selectividad (Colinon et al., 2009). Para su desarrollo
se somete a incubación aerobia, a 37°C por 24 a 48 horas (Foti et al., 2013).
Identificación
Las cepas aisladas de Pseudomonas spp. pueden identificarse observando
características primarias como el tamaño y forma de las colonias, la presencia de
un olor similar al de uvas maduras y la producción de pigmentos (Koneman &
12
Stephen, 2008). Las colonias son generalmente grandes, mucoides o secas, y a
menudo se propagan (Koneman & Stephen, 2008). La mayoría de las cepas
producen piocianina; pigmento verde hidrosoluble fácilmente identificado al
diseminarse en el medio, la presencia de este pigmento puede ser la única
característica necesaria para identificar al microorganismo (Murray et al., 2014).
Algunas cepas de características mucoides no producen pigmentos y, por lo tanto,
pueden ser mal interpretadas si la producción de este es el único criterio utilizado
para la identificación (Koneman & Stephen, 2008). Existen cepas de Pseudomonas
spp. que pueden producir pigmentos con otros colores tales como piorrubina (rojo),
piomelanina (pardo a negro) y pioverdina (amarillo verdoso) (Murray et al., 2014).
Los medios que contienen peptona 3 y cationes como magnesio o manganeso,
aumentan la síntesis de fluoresceína (Koneman & Stephen, 2008). EL medio de
King B, el medio de Sellers y el agar de Muller-Hinton también son apropiados para
demostrar la fluorescencia, lo cual se evidencia ante una fuente de luz ultravioleta
de longitud de onda larga. La fluorescencia puede aumentar si se incuban los
cultivos a 20 a 30 °C en lugar de hacerlo a 35 a 37 °C (Koneman & Stephen, 2008).
La presencia de un olor similar al de uvas maduras es un indicio útil cuando se
examina el crecimiento en los medios de cultivo (Murray et al, 2014).
Existen otras características que son útiles para identificar cepas de Pseudomonas
aeruginosa. que no producen pigmento como, crecimiento a 42°C, alcalinización
de acetamida, desnitrificación de nitratos y nitritos o puede confirmarse su
presencia con la pruebas de identificación rápida como la reacción positiva a
oxidasa (Lukac et al., 2013).
Pueden hallarse variantes que producen colonias mucoides o enanas con reacciones
bioquímicas atípicas y en estos casos es necesario utilizar una batería bioquímica
completa como la galería API 20 NE que es un sistema estandarizado para la
identificación de los bacilos Gram negativos no pertenecientes al grupo de las
enterobacterias (Lukac et al, 2013). También se utilizan técnicas moleculares, a fin
de identificar aislamientos por PCR; amplificación y secuenciación del gen rARN
(Quinn et al., 2011).
13
Tratamiento, prevención y control
Se requiere de una combinación de antibióticos de amplio espectro para el éxito en
el tratamiento de las infecciones graves (Murray et al., 2014). Elegir el
antimicrobiano apropiado para iniciar el tratamiento es fundamental cuando se trata
de optimizar los resultados y reducir tanto la morbilidad como la mortalidad; sin
embargo, esa selección no es sencilla por la capacidad de la bacteria para extender
todos sus mecanismos de resistencia y suprimir a un gran número de antibióticos
(Santella et al., 2011). La amikacina, gentamicina, trimetoprim sulfametaxol, y
meropenem han mostrado un mayor espectro de acción frente a las infecciones por
Pseudomonas spp. y resultan efectivos para el tratamiento (Iclal et al.,2014). A
pesar de ello, no existe un fármaco de elevada efectividad contra este
microorganismo, por esa razón, en algunos casos, la utilización de vacunas pueden
ser necesarias en crías de visones y chinchillas a modo de prevención (Quinn et al.,
2011), en otros, se mantiene una terapia con inmunoglobulinas polivalentes
comerciales que de forma combinada con los antimicrobianos contribuyen a
eliminar la infección (Cedré et al., 2007).
Los intentos para eliminar Pseudomonas spp. son inútiles en la práctica dada la alta
distribución de los microorganismos en los reservorios de agua. Las continuas
actividades para el control de la infección se deben concentrar en prevenir la
contaminación de los equipos estériles y la contaminación cruzada de los pacientes
por el personal sanitario. También, es importante eludir el uso inapropiado de los
antibióticos de amplio espectro, debido a que este uso puede diezmar la flora
microbiana normal y permitir el crecimiento excesivo de cepas resistentes de
Pseudomonas (Murray et al., 2014).
Resulta de vital importancia corregir a tiempo las deficiencias con respecto al
manejo de los animales mantenidos en cautiverio. Las buenas prácticas de higiene
aseguran el éxito en el tratamiento, estas deben ser realizadas a diario. Al tratarse
de reptiles que usualmente son mantenidos en pequeños contenedores, ligeros
cambios en el ambiente como reducir la humedad del sustrato colocando toallas de
papel, ajustar la temperatura y humedad, mejorar la ventilación y proporcionar una
alimentación adecuada, mantienen un sistema inmunitario elevado. Cuando el
manejo es inapropiado la recuperación es temporal (Maas, 2013).
14
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
Población objeto de estudio
La población objeto de ésta investigación fueron los reptiles mantenidos en
cautividad del Centro de Manejo de Fauna Silvestre Acuario – Serpentario San
Martín, propiedad del Sr. Leonardo Vega, con la patente N° 01-14-SAU/NA. El
Centro está localizado en el Barrio San Martín, Parroquia Lligua, Cantón Baños,
Provincia de Tungurahua.
Las especies animales de las cuales se tomaron las muestras fueron:
boa arcoíris, anaconda, boa constrictor, boa de jardín, caimán, charapa, falsa coral,
iguana verde, tortuga mordedora, tortuga taparrabo, tortuga motelo, y tortuga de
orejas rojas.
Toma de muestras
Fase de campo
Serpientes:
Los ofidios deben ser manejados con sistemas de protección como guantes
adecuados a la mordedura del animal, así como utensilios destinados al manejo a
distancia del ofidio (Silvestre, 2000).
Saurios:
Los saurios serán sujetados a nivel de la cintura escapular con una mano, con el fin
de dominar la cabeza y las patas anteriores, en los animales grandes se sujetarán
también a nivel de la cintura pélvica con la otra mano, de manera que controlaremos
la cola y las extremidades posteriores (Silvestre, 2000).
15
Luego de realizar una sujeción correcta, se procedió al hisopado de la cavidad oral
y cloacal de los especímenes. Las muestras fueron conservadas en el medio Stuart
y se transportaron en frío (4°C) al laboratorio de Bacteriología de la Facultad de
Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador.
Aislamiento e identificación bacteriana
Las muestras fueron cultivadas en el medio selectivo Agar Pseudomonas, y
posteriormente fueron incubadas a 37ºC durante 24-48 horas. A las 48 horas de
incubación, se procedió a escoger una colonia al azar, con las características
morfológicas correspondientes a Pseudomonas spp; después se realizó la
confirmación mediante tinción Gram con la que se rectificó la presencia de bacilos
Gram negativos. Se realizó la prueba de oxidasa en discos, tomando en cuenta para
el estudio solamente los valores positivos. Finalmente se realizó el aislamiento de
la cepa bacteriana en agar Tripticasa de Soya, a fin de realizar a las 24 horas
posteriores de la incubación, la identificación de la cepa por medio de la prueba
API20 NE.
Api 20 NE
Con un hisopo estéril se tomó una colonia del cultivo puro en Tripticasa de Soya y
se realizó una dilución a 0.5 Mc Farland en solución salina al 0,9%. Siguiendo las
instrucciones de la casa comercial se procedió a colocar la dilución bacteriana con
una jeringuilla evitando la formación de burbujas. Se llevó a incubación a 37°C por
24 horas.
Lectura de API
Las reacciones en NO3 y TRP fueron revelados con los reactivos NIT 1, NIT 2 y
JAMES respectivamente de acuerdo a las indicaciones del fabricante. Los datos se
anotaron en la hoja de resultados del kit, y se procedió a sumar los valores positivos
obteniendo así un código numérico, el cual fue analizado en el programa API WEB.
16
Determinación del patrón de resistencia a antimicrobianos.
Luego de haber identificado a las especies de Pseudomonas spp., se realizó el
antibiograma con la técnica de difusión de discos de Kirby Bauer en Agar Mueller-
Hinton con los antibióticos: penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido
clavulánico, cefalotina, gentamicina, trimetoprim sulfametaxol, enrofloxacina,
ciprofloxacina, cloranfenicol, tetraciclina, cefotaxime y estreptomicina.
Método Difusión de discos de Kirby Bauer
Preparación de la placa de Mueller-Hinton
De acuerdo a las indicaciones del fabricante se preparó la placa de Mueller-Hinton
y se conservó en refrigeración hasta su uso. Las placas pueden ser también
colocadas en una incubadora de 35°C o en una campana de flujo laminar a
temperatura ambiente hasta que sequen (normalmente de 10 a 30 minutos)
(Hudzicki, 2009).
Preparación del inóculo
Usando un hisopo estéril se tomó una pequeña muestra del cultivo puro en
Tripticasa de soya, se realizó una dilución de la colonia en 2 ml de solución salina
estéril al 0,9%, se agitó para crear una suspensión uniforme, y finalmente se ajustó
la turbidez de la suspensión a un patrón 0,5 de McFarland (Hudzicki, 2009).
Inoculación de placas
En el tubo de inóculo se sumergió y giró un hisopo estéril contra el lado del tubo
(por encima del nivel de líquido) ejerciendo una presión firme, para eliminar el
exceso de líquido. La superficie seca de una placa de agar Mueller-Hinton fue
inoculada, rayando el hisopo tres veces más de la totalidad de la superficie del agar;
girando a 60 grados para asegurar una distribución uniforme del inóculo en la placa
(Hudzicki, 2009).
17
Aplicación de los discos.
Los discos antimicrobianos fueron colocados de manera anti horaria en la superficie
del agar, utilizando pinzas para dispensar cada uno de los discos en el siguiente
orden: 1 GM (gentamicina), 2 CTX (cefotaxime), 3 CF (cefalotina), 4 P
(penicilina), 5 AM (ampicilina), 6 SXT (trimetoprim sulfametaxol), 7 AMC
(amoxicilina más ácido clavulánico), 8 S (estreptomicina), 9 C (cloranfenicol), 10
ENO (enrofloxacina), 11 TE (tetraciclina) y 12 CIP (ciprofloxacina).
Las placas fueron invertidas y colocadas a 37°C en la incubadora durante 24 horas.
Informe de los resultados.
Medición de tamaño de la zona
Después de la incubación, se midió el diámetro del halo de zona de inhibición por
medio de un calibrador y se registraron los datos.
Los tamaños de las zonas de inhibición fueron interpretados en las tablas del
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), para ser calificados como
Sensible, Intermedio, o Resistente (Hudzicki J. , 2009). Las cepas aisladas en el
estudio fueron conservadas en Brain Heart Infusion (BHI) más glicerol al 10%.a -
80ºC.
18
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
Aislamiento e identificación de microorganismos
De acuerdo al diseño experimental de este estudio se colectaron 110 muestras de
hisopado oral y cloacal respectivamente, correspondientes a 55 reptiles mantenidos
en cautiverio en el Centro de Manejo de Fauna Silvestre Acuario – Serpentario San
Martín (Tabla 1).
Tabla 1. Listado de animales muestreados del acuario serpentario San Martín De
Baños
Nombre común Nombre Científico N°
Boa Arcoíris Epicrates cenchria-cenchria 5
Anaconda Eunectes murinus 1
Boa Constrictor Boa constrictor spp. 20
Boa de jardín Corallus hortulanus 1
Caimán Caiman crocodilus 1
Charapa Podecnemis unifilis 2
Falsa coral Lampropeltis triangulum 1
Iguana verde Iguana iguana 6
Tortuga mordedora Chelydra serpentina 10
Tortuga taparrabo Kinosternon spp. 2
Tortuga motelo Chelonoides denticulata 3
Tortuga de orejas rojas Trachemis scripta elegans 3
Total 55
De cada aislamiento se tomó una colonia al azar, cuyas características morfológicas
y bioquímicas coincidían con Pseudomonas spp., identificándose 4 géneros
bacterianos: Pseudomonas, Aeromonas, Burkholderias y Shewanellas (Tabla 2).
Los géneros de Pseudomonas aislados fueron: P. alcaligenes (n=1), P. aeruginosa
(n=10), P. fluorescens (n=3), P. luteola (n=1), P. mendocina (n=3) y P. putida
(n=7). En Boa constrictor spp. se encontró a P. aeruginosa (n=9),
19
P. mendocina (n=3) y P. putida (n=4); en Epicrates spp. se observó únicamente a
P. fluorescens (n=1); en Eunectes murinus se aisló a P. alcaligenes (n=1) y
P. aeruginosa (n=1); en Lampropeltis. Triangulum se encontró a P. fluorescens
(n=2) y finalmente en Podocnemis unifilis se aisló a P. luteola (n=1) y P. putida
(n=3) (Tabla 2).
Tabla 2. Aislamiento e identificación de muestras obtenidas de reptiles en
cautiverio
En la cavidad oral de los reptiles muestreados, se encontraron las 6 especies de
Pseudomonas ya mencionadas, sin embargo P. putida (n=5) fue aislada en mayor
cantidad seguida por P. aeruginosa (n=4), P. fluorescens (n=2) y finalmente P.
mendocina, P. luteola y P. alcaligens con un aislamiento (n=1). A partir del
hisopado cloacal se aislaron, únicamente 4 especies, de las cuales la más numerosa
fue: P. aeruginosa (n=6), seguida por P. mendocina (n=2) y P. putida (n=2) en igual
cantidad, y finalmente P. fluorescens (n=1). En la Tabla 3 se indica los resultados
de acuerdo a la especie animal tipo de muestra y las especies de Pseudomonas.
Especie animalB
. co
nst
ricto
r
C. cro
co
dil
us
Ch
. d
en
ticu
lata
Ch
. a
cu
tiro
stri
s
C. h
ort
ula
nu
s
Ep
icra
tes
sp
E. m
uri
nu
s
I. i
gu
an
a
Kin
ost
ern
on
sp
L. tr
ian
gu
lum
P. u
nif
ilis
T. sc
rip
ta e
leg
an
s
Tota
l g
ener
al
Po
rcen
taje
Aeromonas hydrophila 13 2 4 12 - 2 - 3 4 - - 4 44 40
Aeromonas sobria - - - 4 - - - - - - - - 4 3,64
Burkholderia cepacia 3 - - 1 2 4 - - - - - - 10 9,09
Burkholderia gladioli 2 - - 2 - 1 - - - - - - 5 4,55
Burkholderia pseudomallei - - - - - 1 - - - - - - 1 0,91
Psesudomonas alcaligenes - - - - - - 1 - - - - - 1 0,91
Pseudomonas aeruginosa 9 - - - - - 1 - - - - - 10 9,09
Pseudomonas fluorescens - - - - - 1 - - - 2 - - 3 2,73
Pseudomonas luteola - - - - - - - - - - 1 - 1 0,91
Pseudomonas mendocina 3 - - - - - - - - - - - 3 2,73
Pseudomonas putida 4 - - - - - - - - - 3 - 7 6,36
Shewanella putrefaciens - - - 1 - 1 - - - - - - 2 1,82
Otras bacterias - Oxidasa (-) 6 - 2 - - - - 9 - - - 2 19 17,27
Total general 40 2 6 20 2 10 2 12 4 2 4 6 110 100
Especie
bacteriana
20
Tabla 3. Especie animal, tipo de muestra y especie de Pseudomonas aislada.
N° Especie animal Especie
bacteriana
Muestra
oral
Muestra
cloacal Total
1 Podocnemis. unifilis P. luteola 1 0 1
2 Podocnemis. unifilis P. putida 1 2 3
6 Boa constrictor spp P. aeruginosa 4 5 9
4 Boa constrictor spp P. putida 4 0 4
2 Boa constrictor spp P. mendocina 1 2 3
1 Eunectes murinus P. alcaligenes 1 0 1
1 Eunectes murinus P. aeruginosa 0 1 1
1 Epicrates spp P. fluorescens 1 0 1
1 Lampropeltis triangulum P. fluorescens 1 1 2
Total 14 11 25
Patrones de resistencia a antimicrobianos
Los antibióticos utilizados fueron P (penicilina), AM (ampicilina), AMC
(amoxicilina más ácido clavulánico), CTX (cefotaxime), CF (cefalotina), ENO
(enrofloxacina), CIP (ciprofloxacina), GM (gentamicina), S (estreptomicina), SXT
(trimetoprim sulfametaxol), C (cloranfenicol), TE (tetraciclina). Los antibióticos
mencionados pertenecen a las principales familias de antimicrobianos con las
cuales se trata comúnmente a especies animales mantenidas en cautividad. En
general, las cepas sometidas al experimento demostraron una variedad de
resultados, los antibióticos más eficaces, es decir aquellos que presentaron un alto
grado de sensibilidad (S) fueron: ciprofloxacina (100%), gentamicina (100%),
estreptomicina (100%), siguiéndole en menor grado, enrofloxacina (68%),
tetraciclina (68%) y cefotaxima (64%). Se determinó un alto grado de resistencia
(R) para los siguientes antimicrobianos: ampicilina (100%), cefalotina (100%),
penicilina (100%) trimetoprim sulfametaxol (76%) y amoxicilina más ácido
clavulánico (72%), el único antimicrobiano que mostró un patrón intermedio en
mayor porcentaje fue cloranfenicol (48%) (Tabla 4) (Figura1).
21
Tabla 4. Patrones de resistencia de Pseudomonas spp. a antibióticos
Antibiótico Patrón Sensible Patrón Intermedio Patrón Resistente
AM 0 0 25
% 0 0 100
AMC 1 6 18
% 4 24 72
C 6 12 7
% 24 48 28
CF 0 0 25
% 0 0 100
CIP 25 0 0
% 100 0 0
CTX 16 8 1
% 64 32 4
ENO 17 8 0
% 68 32 0
GM 25 0 0
% 100 0 0
P 0 0 25
% 0 0 100
EST 25 0 0
% 100 0 0
SXT 1 5 19
% 4 20 76
TE 17 6 2
% 68 24 8
P (penicilina), AM (ampicilina), AMC (amoxicilina más ácido clavulánico), CTX (cefotaxime), CF (cefalotina), ENO
(enrofloxacina), CIP (ciprofloxacina), GM (gentamicina), S (estreptomicina), SXT (trimetoprim sulfametaxol), C (cloranfenicol), TE (tetraciclina)
P (penicilina), AM (ampicilina), AMC (amoxicilina más ácido clavulánico), CTX (cefotaxime), CF (cefalotina), ENO (enrofloxacina), CIP (ciprofloxacina), GM (gentamicina), S (estreptomicina), SXT (trimetoprim sulfametaxol), C
(cloranfenicol), TE (tetraciclina)
Figura 1. Patrones de resistencia a los antibióticos
0
5
10
15
20
25
30
AM AMC C CF CIP CTX ENO GM P EST SXT TE
Antibiótico
N°
de
ce
pas
ais
lad
as
Patrones de resistencia
Patrón Sensible
Patrón Intermedio
Patrón Resistente
22
Finalmente se realizó la clasificación por especie animal y el patrón de resistencia
a los antimicrobianos que presentan las cepas de Pseudomonas spp. (Ver Tablas en
la sección de anexos)
En Lampropeltis triangulum se observó un patrón de resistencia para los
antibióticos penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico, cefalotina,
y trimetoprim sulfametaxol, mientras que un patrón intermedio se determinó para
los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina, cloranfenicol y tetraciclina, finalmente
se encontró un patrón sensible para los antibióticos ciprofloxacina, gentamicina y
estreptomicina. Éste patrón fue observado en ambas muestras, es decir oral y
cloacal.
Para Epicrates spp. se aisló Pseudomonas spp. solamente de la muestra oral, se
observó un patrón resistente para los antibióticos penicilina, ampicilina,
cefotaxima, cefalotina, trimetoprim sulfametaxol y cloranfenicol, el patrón
intermedio fue observado en amoxicilina más ácido clavulánico y tetraciclina,
finalmente el patrón sensible fue establecido para los antibióticos ciprofloxacina,
gentamicina y estreptomicina.
En Eunectes murinus se aisló a Pseudomonas spp. de ambas muestras, el patrón de
resistencia se observó en los antibióticos penicilina, ampicilina, cefalotina y
trimetoprim sulfametaxol, mientras que los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina,
ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina, cloranfenicol y tetraciclina, mostraron
un patrón de sensibilidad, finalmente, amoxicilina más ácido clavulánico fue el
único en mostrar un patrón intermedio.
Para el animal identificado como “Boa 19”, Boa constrictor spp. se aisló
Pseudomonas spp. solamente de la muestra de hisopado cloacal. Se observó un
patrón de resistencia para los antibióticos penicilina, amoxicilina más ácido
clavulánico, ampicilina, cefalotina y trimetoprim sulfametaxol. El patrón
intermedio fue identificado para los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina, y
cloranfenicol, finalmente se estableció un patrón de sensibilidad para
ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina y tetraciclina.
Para el individuo identificado como “Boa 18”, Boa constrictor spp. se aisló
Pseudomonas spp., únicamente de la muestra oral. Se observó un patrón de
23
resistencia para los antibióticos penicilina, ampicilina, cefalotina y trimetoprim
sulfametaxol, el patrón intermedio se identificó en amoxicilina más ácido
clavulánico y cloranfenicol, finalmente el patrón de sensibilidad se determinó en
los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina y
tetraciclina.
Para el animal identificado como “Boa 17”, Boa constrictor spp. se aisló
Pseudomonas spp., únicamente de la muestra oral. Se observó un patrón de
resistencia para penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico,
cefalotina, trimetoprim sulfametaxol y cloranfenicol, mientras que el patrón de
sensibilidad fue observado en los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina,
ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina y tetraciclina.
Para el animal identificado como “Boa 16”, Boa constrictor spp. se aisló
Pseudomonas spp., únicamente de la muestra oral. Se observó un patrón de
resistencia para penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico,
cefalotina y trimetoprim sulfametaxol. El patrón de sensibilidad se observó en
cefotaxima, enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina y
tetraciclina. Solamente cloranfenicol mostró un patrón intermedio.
Para el animal identificado como “Boa 15”, Boa constrictor spp. se aisló
Pseudomonas spp., únicamente de la muestra oral. El patrón resistente se observó
en penicilina, ampicilina, cefalotina, trimetoprim sulfametaxol y cloranfenicol. El
patrón de sensibilidad se determinó en los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina,
ciprofloxacina, gentamicina y estreptomicina. Solamente amoxicilina más ácido
clavulánico mostró un patrón intermedio.
Para el animal identificado como “Boa 13”, Boa constrictor spp. se aisló
Pseudomonas spp. únicamente de la muestra cloacal. Los antibióticos que
mostraron un patrón de resistencia fueron penicilina, ampicilina, amoxicilina más
ácido clavulánico, cefalotina y trimetoprim sulfametaxol. El patrón de sensibilidad
se observó en cefotaxima, enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina,
estreptomicina, cloranfenicol y tetraciclina.
Para el animal identificado como “Boa 8”, Boa constrictor spp. se aisló
Pseudomonas spp. de ambas muestras, es decir, de hisopado oral y cloacal. Con
24
respecto a la muestra oral se observó un patrón de resistencia para penicilina,
amoxicilina, ampicilina más ácido clavulánico, y cefalotina. El patrón de
sensibilidad se observó en los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina,
ciprofloxacina, gentamicina y estreptomicina. Finalmente el patrón intermedio se
observó en trimetoprim sulfametaxol, cloranfenicol y tetraciclina. Con respecto a
la muestra cloacal se observó un patrón de resistencia para los antibióticos
penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico, cefalotina y trimetoprim
sulfametaxol, mientras que se observó un patrón intermedio solamente para
cefotaxima, y finalmente se observó un patrón de sensibilidad para los antibióticos
enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina, cloranfenicol y
tetraciclina.
Para el animal identificado como “Boa 5”, Boa constrictor spp. se aisló
Pseudomonas spp. de ambas muestras, es decir, oral y cloacal. En cuanto a los
patrones de la muestra oral, se observó un patrón de resistencia para penicilina,
ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico y cefalotina. El patrón intermedio se
observó en trimetoprim sulfametaxol, cloranfenicol y tetraciclina. El patrón de
sensibilidad se determinó en los antibióticos cefotaxima, enrofloxacina,
ciprofloxacina, gentamicina y estreptomicina. Para la muestra cloacal, se observó
un patrón resistente para penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico,
cefalotina. El patrón de sensibilidad fue observado en enrofloxacina,
ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina y trimetoprim sulfametaxol.
Solamente cefotaxima mostró un patrón intermedio.
Para el animal identificado como “Boa 4”, Boa constrictor spp. se aisló
Pseudomonas spp. de ambas muestras, tanto de hisopado oral como cloacal. Se
observó un patrón de resistencia para los antibióticos penicilina, ampicilina,
amoxicilina más ácido clavulánico, cefalotina, trimetoprim sulfametaxol y
cloranfenicol. Enrofloxacina mostró un patrón intermedio. Finalmente se determinó
un patrón sensible para ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina y tetraciclina.
El antibiótico cefotaxima, mostró un patrón de sensibilidad para la muestra oral,
mientras que indicó un patrón intermedio para la muestra cloacal.
Para el animal identificado como “Boa 3”, Boa constrictor spp. se aisló
Pseudomonas spp. de ambas muestras. En cuanto a la muestra oral, se observó un
25
patrón resistente para los antibióticos penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido
clavulánico y cefalotina. El patrón intermedio se identificó en trimetoprim
sulfametaxol, cloranfenicol. Finalmente, el patrón de sensibilidad se observó en los
antibióticos cefotaxima, enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina y
estreptomicina. Para la muestra cloacal se observó un patrón de resistencia para los
antibióticos, penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico, cefalotina
y trimetoprim sulfametaxol, mientras que el patrón intermedio se observó en
cefotaxima y enrofloxacina. Finalmente el patrón de sensibilidad se observó en
ciprofloxacina y gentamicina.
Para el animal identificado como “Boa 2”, Boa constrictor spp. se aisló
Pseudomonas spp. de ambas muestras, en cuanto a la muestra oral, se observó un
patrón de resistencia para los antibióticos penicilina, ampicilina, amoxicilina más
ácido clavulánico, cefalotina y trimetoprim. En cuanto al patrón intermedio, este se
observó en cloranfenicol. Finalmente, se observó un patrón de sensibilidad para
cefotaxima, enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina y
tetraciclina. Para la muestra cloacal el patrón resistente se observó en penicilina,
ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico, cefalotina, trimetoprim
sulfametaxol, y cloranfenicol. Cefotaxima y enrofloxacina, mostraron un patrón
intermedio. Finalmente el patrón de sensibilidad se observó en los antibióticos
ciprofloxacina, gentamicina y estreptomicina.
Para el animal identificado como “Pod 1”, Podocnemis unifilis, se aisló
Pseudomonas spp. de ambas muestras, en cuanto a la muestra oral, se observó un
patrón resistente para los antibióticos penicilina, ampicilina, cefalotina y
trimetoprim sulfametaxol. El patrón intermedio fue observado en cloranfenicol.
Finalmente el patrón de sensibilidad se observó en los antibióticos cefotaxima,
enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina, y estreptomicina. Para la muestra
cloacal se observó el patrón de resistencia para los antibióticos penicilina, y
ampicilina, mientras que el patrón intermedio fue observado en amoxicilina más
ácido clavulánico y trimetoprim sulfametaxol. Finalmente el patrón de sensibilidad
fue observado en cefotaxima, enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina,
estreptomicina y cloranfenicol.
26
Para el animal identificado como “Pod 2”, Podocnemis unifilis, se aisló
Pseudomonas spp. de ambas muestras; en cuanto a la muestra oral, se observó el
patrón de resistencia para los antibióticos penicilina, ampicilina y cefalotina,
mientras que el patrón de sensibilidad se observó en los antibióticos amoxicilina
más ácido clavulánico, cefotaxima, enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina,
estreptomicina, cloranfenicol y tetraciclina. Finalmente el patrón intermedio se
observó únicamente en trimetoprim sulfametaxol. En cuanto a los resultados para
la muestra cloacal, se observó el patrón de resistencia para los antibióticos
penicilina, ampicilina, amoxicilina más ácido clavulánico, cefalotina, y trimetoprim
sulfametaxol, mientras que el patrón de sensibilidad fue observado en cefotaxima,
enrofloxacina, ciprofloxacina, gentamicina, estreptomicina, cloranfenicol y
tetraciclina.
Chi cuadrado
Se realizó el test de Chi cuadrado en el cual se observó la asociación entre el patrón
de resistencia y la familia de antibióticos, en los resultados se obtuvo un valor de P
menor a 0.05 (P valor < 2.2e-16), lo cual es estadísticamente significativo entre las
variables. Se determinó el porcentaje de resistencia y sensibilidad de cada grupo de
antimicrobianos utilizados en la prueba. Se identificó un patrón de sensibilidad
para la familia de aminoglucósidos del 17%, fluoroquinolonas del 14 %,
tetraciclinas y betalactámicos del 6% y fenicoles del 2%. En lo que respecta al
patrón resistente, este fue del 31% para la familia de los betalactámicos, del 6%
para sulfas, 2% para fenicoles y finalmente 1% para tetraciclinas. (Ver figura 2)
P valor < 2.2e-16 Altamente significativo
Figura 2.- Chi cuadrado. Grupo de antibióticos vs patrón de resistencia
0%
5% 4% 3% 1,7% 2%0%
31%
2%0%
6,3%
1%
17%
6%2%
14%
0,3%
5,7%
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
AminG BetL Fenicol FlrQ Sulfa Tetra
Intermedio Resitente Sensible
27
DISCUSIÓN
Los estudios realizados acerca de Pseudomonas spp. en reptiles en cautiverio son
escasos, a pesar de ello, los investigadores destacan la gran adaptabilidad genética
y metabólica de la bacteria, para vivir en ambientes acuáticos, terrestres, y diversos
tejidos de animales (Ruíz, 2007).
Los reptiles en cautiverio suelen presentar una amplia variedad de infecciones
bacterianas a causa de lesiones traumáticas por heridas por mordedura, y una mala
calidad del medio ambiente; en este sentido, Pseudomonas spp. es uno de los
patógenos más comúnmente aislados (Yeon et al., 2001). En cuanto a los resultados
de esta investigación, se aislaron cuatro cepas bacterianas fenotípicamente similares
en cuanto al perfil bioquímico inicial realizado en el laboratorio; los géneros
identificados fueron: Pseudomonas, Aeromonas, Burkholderia y Shewanella.
Dichas especies bacterianas, se encuentran generalmente extendidas en ambientes
terrestres y acuáticos, y a menudo son responsables de diferentes patologías en
reptiles (Ebani et al., 2006). Tales microorganismos son capaces de causar
dermatitis en las serpientes y lagartos, otitis de las tortugas galápagos, infecciones
respiratorias, cloacitis y abscesos de manera sistémica, subcutánea o visceral (Ebani
et al., 2008).
Varios estudios mencionan que es frecuente encontrar este microorganismo como
parte de la flora bacteriana normal de individuos sanos (Ruíz 2007), siendo el tracto
gastrointestinal el lugar más habitual de colonización, con lo que respecta a esta
investigación las muestras fueron tomadas a partir de individuos aparentemente
sanos y se aislaron tanto de cavidad oral como cloacal.
El total de cepas aisladas fue 25, de las cuales, 14 fueron aislados de cavidad oral
y 11 en cavidad cloacal. Se observó un mayor número de aislados de
Pseudomonas spp. en cavidad oral, siendo estos resultados congruentes con los
obtenidos por Jho et al.,(2011), quienes a partir de la toma de muestra de 10
serpientes mantenidas en cautividad en un zoológico, obtuvieron una tasa de
aislamiento de Pseudomonas spp del 50% en muestras orales, y tan solo de un 5%
en muestras cloacales.
28
Se identificaron seis especies de Pseudomonas spp. tanto en cavidad oral como en
cloacal respectivamente, de las cuales P. aeruginosa estuvo presente en mayor
número, con 10 aislados, pertenecientes a Boa constrictor spp. (n=9) y a
Eunectes murinus (n=1); se obtuvo 7 aislados de P. putida provenientes de
Boa constrictor spp. (n=4) y Podocnemis unifilis (n=3). Se identificaron 3 aislados
de Pseudomonas fluorescens y mendocina a partir de muestras provenientes de las
especies de reptiles Epicrates spp. y Boa constrictor spp. respectivamente; y un
aislado (n=1) de P. alcaligenes y P. luteola respectivamente, pertenecientes a
Eunectes murinus y Podocnemis unifilis.
Es difícil correlacionar los resultados obtenidos entre las diferentes especies de
Pseudomonas aisladas y la especie de reptil en cautiverio muestreado, debido a que
los estudios existentes en humanos y animales se enfocan solamente en el
aislamiento de Pseudomonas spp, o en su defecto en P. aeruginosa y fluorescens;
no se registran investigaciones en el aislamiento de otras especies de este género,
y son pocos los estudios realizados en reptiles. Es así que, autores como János et
al.,(2012) mencionan en su estudio la presencia de Pseudomonas spp. en un caso
de dermatitis vesicular en Boa constrictor, otros como Chaprazov et al., (2013),
describen el caso de una iguana con un absceso oral y pérdida de piezas dentales,
causado por P. aeruginosa. Así también el estudio de Lukac et al., (2013),
describen el caso de un asilamiento de Pseudomonas aeruginosa en una serpiente
de cascabel que presentó un absceso subcutáneo. En otros estudios realizados, tales
como los de Martínez et al en el año 1994 y López et al.,( 2012 ) describen el
hallazgo de Pseudomonas del grupo fluorescens en un caso de septicemia en una
iguana común, y peces lenguadillo (Dicologlossa cuneata) respectivamente.
El género Pseudomonas spp. ha sido estudiado por presentar diversos mecanismos
de resistencia a antimicrobianos, además de poseer una gran capacidad de mutar a
cepas aún más resistentes durante el tratamiento (Murray et al., 2014). Se han
identificado tres mecanismos principales de resistencia en este género, tales como
producción de β-lactamasas (García, 2012) alteraciones de la permeabilidad de
membrana por la presencia de bombas de expulsión, y mutaciones de porinas
transmembranales (Gómez et al., 2005). Los antibióticos utilizados en esta
investigación fueron escogidos tomando en cuenta el uso indicado en el tratamiento
de reptiles en general (Carpenter, 2006). Se encontró una multirresistencia a varios
29
grupos de antimicrobianos, sin embargo esta resistencia no fue total. Se realizó el
test de Chi cuadrado en el cual se observó la asociación entre el patrón de resistencia
y la familia de antibióticos, en los resultados se obtuvo un valor de P menor a 0.05
(P valor < 2.2e-16), lo cual es estadísticamente significativo entre las variables,
esto, gracias a que se logró cumplir un parámetro de distribución normal.
Los genes que codifican para la síntesis de las β-Lactamasas de espectro extendido
(BLEE), pueden estar ubicados a nivel cromosómico, en plásmidos, integrones o en
elementos genéticos móviles como transposones, los cuales participan en la
acumulación y transferencia de genes de resistencia (Gónzales et al., 2012).
En este estudio, el grupo de los betalactámicos mostró el mayor patrón de
resistencia (31%) en relación al resto de antimicrobianos utilizados. Es así que, el
género Pseudomonas spp., presentó el 100% de resistencia para los β-lactámicos:
ampicilina, cefalotina y penicilina, 72% para amoxicilina más ácido clavulánico, y
4% para cefotaxime. Los resultados obtenidos en esta investigación son similares a
los encontrados por Foti et al., (2013) donde también se reportó una tendencia a la
resistencia para éste grupo de antimicrobianos, encontrando un patrón resistente de
71,7% para ampicilina, 73,9% para cefalotina 95,6%, para penicilina y 50% para
cefotaxime. La resistencia a los betalactámicos en nuestro estudio podría estar
relacionado con el uso indiscriminado de estos antimicrobianos en el tratamiento
de los reptiles mantenidos en cautividad, que le confieren resistencia principalmente
a penicilinas y cefalosporinas (Murillo et al., 2009).
La resistencia al grupo de antimicrobianos pertenecientes a las sulfas puede
aparecer por mutaciones, presencia de plásmidos que codifican formas de
dihidroreductasa y en otros casos es mediada por los genes de los cromosomas
(Camacho, 2003).
En este estudio las sulfas mostraron una resistencia del 6,3% en relación al resto de
grupos de antimicrobianos utilizados. El género Pseudomonas spp. presentó el 76%
de resistencia a trimetoprim sulfametaxol. Los resultados obtenidos en este estudio
son similares a los encontrados por Foti et al., (2013) dónde también reportó una
tendencia a la resistencia en sulfas, encontrando para trimetoprim sulfametaxol un
patrón resistente del 93,5%. Del mismo modo, Vargas et al., (2010) realizaron
aislamientos de Pseudomonas spp.(n=9) a partir de la cavidad rectal de animales
30
mantenidos en cautiverio y obtuvieron un patrón de resistencia del 100% para este
antibiótico.
El antibiótico trimetoprim sulfametaxol ha sido utilizado por décadas en la
producción animal, ya sea como profilaxis o con fines terapéuticos, y en tratamiento
de infecciones humanas, por lo que su resistencia está ampliamente difundida
(Junod et al., 2013). La razón, por la cual en nuestro estudio, Pseudomonas spp.
alcanzó el 76% de resistencia a este antimicrobiano se pueda deber al contacto
estrecho que tiene esta población de reptiles en cautiverio con los humanos, en la
cual podríamos suponer que existe una colonización cruzada de estas cepas.
El mecanismo más común de resistencia a cloranfenicol es la inactivación
enzimática por acetilación principalmente a través de acetiltransferasas o, en
algunos casos, por fosfotransferasas (Fernández et al.,2011). La resistencia a
cloranfenicol también puede ser debido a la mutación en el sitio diana, disminución
de la permeabilidad de la membrana externa, y la presencia de bombas de eflujo
que a menudo actúan como transportadores de extrusión de múltiples fármacos,
reduciendo así la concentración intracelular eficaz del antibiótico (Fernández et
al.,2011).
En este estudio, el grupo de los fenicoles mostro una resistencia del 2%, en relación
al resto de antimicrobianos utilizados. Es así que en esta investigación el género
Pseudomonas spp. mostró el 28% de resistencia a cloranfenicol, un patrón
intermedio del 50% y un patrón sensible del 24%. Los resultados obtenidos en este
estudio difieren a los encontrados por Vargas et al.,(2010) donde indican que el
género Pseudomonas spp. alcanzó un patrón resistente del 55% para para
cloranfenicol. El mantenimiento y diseminación de cepas resistentes dentro de una
población animal , podría deberse a una falta de control en el manejo de sistemas
de producción, tratamientos antibióticos, reservorios, entre otros (Junod et al.,
2013). Este tipo de antibióticos han sido utilizados por décadas en dichos animales,
ya sea como profiláctico o con fines terapéuticos ( Nollet et al., 2005). También es
utilizado en el tratamiento de infecciones humanas, por lo que su resistencia esta
ampliamente difundida, haciendo que los tratamientos con dicho antibiótico en la
actualidad sen poco efectivos ( Nollet et al., 2005).
31
Los aminoglucósidos constituyen un grupo de antimicrobianos de gran importancia
en el tratamiento de las enfermedades infecciosas, principalmente por su actividad
sobre enterobacterias y otras bacterias Gram negativas, especialmente
Pseudomonas, que son con frecuencia resistentes a otros antibióticos (Flóres., et al
2014). La resistencia bacteriana a los aminoglucósidos puede producirse por varios
mecanismos, tales como alteraciones en los puntos de unión en el ribosoma
bacteriano, reducción en el acceso de los aminoglucósidos al citoplasma bacteriano
y finalmente el más importante, al menos desde un punto de vista clínico, es la
síntesis de enzimas bacterinas que, al modificar la estructura química de los
diferentes aminoglucósidos, reducen su actividad antibacteriana (Flóres.,et al
2014).
En este estudio, el grupo de los aminoglucósidos mostró el mayor patrón de
sensibilidad en relación al resto de antimicrobianos utilizados (17%). Es así que, el
género Pseudomonas spp, presentó el 100% de sensibilidad para los
aminoglucósidos: gentamicina y estreptomicina. Los resultados obtenidos en esta
investigación son similares a los encontrados por Foti et al., (2013) donde también
reportaron una tendencia a la sensibilidad en éste grupo de antimicrobianos,
encontrando en gentamicina un patrón de sensibilidad del 85,3%, a diferencia de
los resultados encontrados por Salazar et al., (2001) donde indican un patrón
altamente resistente para estreptomicina. Después de analizar estos resultados, es
necesario destacar la importancia de realizar estudios de los patrones de resistencia
de Pseudomonas spp. en cada zona, y periódicamente, para poder valorar las
diferentes pautas terapéuticas, pues no es posible extrapolar los datos de las
diferentes regiones en dónde se han realizado los estudios. Las diferencias
encontradas se pueden explicar por el distinto uso de los antibióticos en cada centro,
así mismo, por la variación geográfica, lo cual podría ocacionar una modificación
en los mecanismos de resistencia de Pseudomonas spp (Delgado et al, 2007).
Las fluoroquinolonas son antibióticos que bloquean las síntesis de los ácidos
nucleicos mediante la inhibición de enzimas Topoisomerasas de tipo II (en bacterias
Gram negativas) y tipo IV (en bacterias Gram positivas), las cuales son necesarias
para la replicación, recombinación y reparación del ADN de las bacterias
(Contreras et al. 2011). Frente a Gram negativos la fluoroquinolona más potente
es la ciprofloxacina, sin embargo, Pseudomonas, Staphylococcus y Enterococcus
32
pueden desarrollar resistencia, originada por mutaciones en el sitio diana de acción
de estos antibióticos o por la presencia de bombas de eflujo (Contreras., et al 2011).
En este estudio, las fluoroquinolonas mostraron un patrón de sensibilidad del 14%
en relación a los otros grupos de antimicrobianos utilizados. Es así que, el género
Pseudomonas spp, presentó el 100% de sensibilidad para la ciprofloxacina a
diferencia de la enrofloxacina que mostró un patrón de sensibilidad del 68%. Los
resultados obtenidos en esta investigación son similares a los encontrados por
Hossain et al., (2013) y Foti et al., (2013) donde también reportaron una tendencia
a la sensibilidad en éste grupo de antimicrobianos, encontrando en ciprofloxacina
un patrón de sensibilidad del 93,5% y en enrofloxacina un patrón de sensibilidad
del 52,2%. Por otro lado, los estudios realizados por Ebani et al., 2008 indicaron
un patrón de sensibilidad de la enrofloxacina del 22,72%. El alto porcentaje de
sensibilidad que presenta Pseudomonas spp. frente a la ciprofloxacina podría
deberse a que su uso en el tratamiento de enfermedades infecciosas en reptiles en
cautiverio no es común (Arias, 2015), lo cual sugiere que la ciprofloxacina es la
mejor opción ante una infección ocasionada por microorganismos de éste género,
tal como lo mencionan Hossain et al., (2013) en sus estudios.
Cabe mencionar que la creciente disminución de la susceptibilidad observada a la
enrofloxacina, podría deberse a su uso generalizado en el tratamiento de diversos
procesos infecciosos (Calva et al, 2004). Es posible que la resistencia aumente de
manera importante, de tal modo que llegue a comprometer su eficacia clínica en el
futuro. Lo mencionado anteriormente, obliga al uso prudente de las
fluoroquinolonas en la actual práctica médica, así como a la vigilancia periódica de
la susceptibilidad en nuestro medio (Calva et al, 2004).
Las tetraciclinas son antimicrobianos de amplio espectro, con actividad contra una
amplia gama de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, aerobios y anaerobios.
Se han descrito tres mecanismos principales de resistencia a tetraciclinas tales como
eflujo activo, protección ribosomal, e inactivación enzimática (Jara, 2007).
En este estudio, el grupo de las tetraciclinas presentó una sensibilidad del 5,7% en
relación al resto de grupos de antimicrobianos utilizados. Es así que en esta
investigación el género Pseudomonas spp. presentó el 68% de sensibilidad al
33
antibiótico tetraciclina. Los resultados obtenidos en este estudio difieren de los
resultados encontrados por Foti et al., (2013) quienes indican un patrón sensible
del 15,2 %, del mismo modo que estudios realizados por Ebani et al., (2008)
quienes muestran un patrón sensible del 27,28%.
Esta variabilidad de datos podría deberse a que en nuestro medio no se ha
generalizado el uso de este antibiótico en el tratamiento de enfermedades
infecciosas en reptiles, ya que el de preferencia a nivel veterinario es la
oxitetraciclina (Gómez et al., 2009), y ante el surgimiento de nuevos
antimicrobianos de amplio espectro, la tetraciclina ha sido reemplazada antes de
alcanzar mayores niveles de resistencia.
En relación al patrón de sensibiliad hallado en los diferentes grupos de
antimicrobianos la tetraciclina fue la que mostró el menor porcentaje, esto se puede
deber a que en las últimas décadas se han reportado casos de cepas resistentes a este
antimicrobiano (Requelme et al., 2014) debido su uso prolongado en la terapia de
enfermedades infecciosas en animales, empleo de dosis subterapéuticas
profilácticas o como promotores del crecimiento; factores que ejercen una
permanente presión de selección sobre la flora bacteriana lo cual conlleva a la
presentación del fenómeno de resistencia (Jara, 2007).
Durante esta investigación se demostró la presencia de altos niveles de resistencia
a los antibióticos utilizados contra Pseudomonas spp. en este centro de manejo.
Las diferencias encontradas con los otros estudios pueden atribuirse al distinto uso
de los antibióticos en los centros de manejo de fauna silvestre. Por este motivo, se
considera apropiado vigilar los perfiles de resistencia en cada laboratrio
microbiológico, proporcionando la información necesaria para evitar el uso
empírico de los antibióticos.
34
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
CONCLUSIONES
En este estudio se lograron identificar seis especies de Pseudomonas a partir
de hisopado oral y cloacal de reptiles mantenidos en cautiverio en el Acuario
Serpentario San Martín de Baños, Provincia de Tungurahua.
Se determinaron los patrones de resistencia a antimicrobianos en cepas de
Pseudomonas spp. aisladas. En este sentido, se identificó un 100 % de
resistencia a los antibióticos ampicilina, cefalotina y penicilina, mientras
que los antibióticos que mostraron el mayor porcentaje de sensibilidad
fueron gentamicina, ciprofloxacina y estreptomicina.
Mediante el análisis estadístico se determinó que el grupo de antibióticos
que mostró un mayor grado de resistencia fueron los betalactámicos
mientras que para el grupo de los aminoglucósidos y las fluoroquinolonas
se observó un mayor grado de sensibilidad.
En este estudio los antibióticos que mostraron mayor grado de sensibilidad
se encuentran asociados con los de menor uso en el tratamiento y profilaxis
de reptiles, mientras que los que mostraron mayor grado de resistencia
fueron aquellos en los que su uso en reptiles es indiscriminado así como
aquellos antibióticos de amplio uso en producción animal y en humanos; en
ese sentido se podría inferir una posible colonización cruzada entre animales
y humanos.
35
RECOMENDACIONES
Realizar estudios de caracterización de la flora bacteriana bucal de los
reptiles mantenidos en cautiverio, así mismo, de las heces de las presas con
las que se las alimenta con el fin de correlacionar los datos y determinar la
flora bacteriana normal de los reptiles.
Actualizar e instaurar habitualmente investigaciones acerca de los patrones
de sensibilidad y resistencia bacteriana, a fin de conocer datos reales de
forma que el personal médico los conozca al momento de prescribir los
fármacos.
Realizar una próxima investigación acerca de la variabilidad fenotípica y
genotípica de los aislados mediante metodologías moleculares para poder
estudiar las mutaciones y su relación con la resistencia a los antibióticos en
las cepas estudiadas.
36
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42
ANEXOS
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Hoja de campo diseñada para anotar datos
FICHA CLÍNICA
Centro de manejo:
Fecha:
Especie: Sexo:
Edad:
Tiempo de Tenencia: Procedencia:
Alimentación: Frecuencia:
Suplementos:
Tratamientos/Medicinas:
Lesiones:
Observaciones:
Terrario:
Tamaño: Nº habitantes
Especies:
Temperatura: Humedad: Luz:
43
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Esquema de trabajo
Esta figura muestra la estrategia experimental que se abordó para cumplir los
objetivos de esta investigación.
Hisopado
oral/cloacal
Stuart (transporte)
Frio 4ºC
Pseudomonas agar
37ºC/24-48h
Selección morfológica de 1
colonia
Tinción Gram
(bacilos Gram -)
Oxidasa
(positivo)
Cultivo Tripticasa de Soya
API 20 NE
Pseudomona spp.
Patrón de resistencia antimicrobiana
Técnica de Kirby Bauer
lectura
patrones de resistencia
cepario (BHI + 10% glicerol)
44
Tablas por cada individuo, aislamientos de Pseudomonas spp. y patrones de
resistencia. Epicrates spp. (5-epi)
Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal
P Resistente (-)
AM Resistente (-)
AMC Intermedio (-)
CTX Resistente (-)
CF Resistente (-)
ENO Intermedio (-)
CIP Sensible (-)
GM Sensible (-)
S Sensible (-)
SXT Resistente (-)
C Resistente (-)
TE Intermedio (-)
E. murinus (Ana)
Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal
P Resistente Resistente
AM Resistente Resistente
AMC Intermedio Intermedio
CTX Sensible Sensible
CF Resistente Resistente
ENO Sensible Sensible
CIP Sensible Sensible
GM Sensible Sensible
S Sensible Sensible
SXT Resistente Resistente
C Sensible Sensible
TE Sensible Sensible
Boa constrictor spp. (Boa 19)
Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal
P (-) Resistente
AM (-) Resistente
AMC (-) Resistente
CTX (-) Intermedio
CF (-) Resistente
ENO (-) Intermedio
CIP (-) Sensible
GM (-) Sensible
S (-) Sensible
SXT (-) Resistente
C (-) Intermedio
TE (-) Sensible
45
Boa constrictor spp. (Boa 18)
Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal
P Resistente (-)
AM Resistente (-)
AMC Intermedio (-)
CTX Sensible (-)
CF Resistente (-)
ENO Sensible (-)
CIP Sensible (-)
GM Sensible (-)
S Sensible (-)
SXT Resistente (-)
C Intermedio (-)
TE Sensible (-)
Boa constrictor spp. (Boa 17)
Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal
P Resistente (-)
AM Resistente (-)
AMC Resistente (-)
CTX Sensible (-)
CF Resistente (-)
ENO Sensible (-)
CIP Sensible (-)
GM Sensible (-)
S Sensible (-)
SXT Resistente (-)
C Resistente (-)
TE Sensible (-)
Boa constrictor spp. (Boa 16)
Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal
P Resistente (-)
AM Resistente (-)
AMC Resistente (-)
CTX Sensible (-)
CF Resistente (-)
ENO Sensible (-)
CIP Sensible (-)
GM Sensible (-)
S Sensible (-)
SXT Resistente (-)
C Intermedio (-)
TE Sensible (-)
46
Boa constrictor spp. (Boa 15)
Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal
P Resistente (-)
AM Resistente (-)
AMC Intermedio (-)
CTX Sensible (-)
CF Resistente (-)
ENO Sensible (-)
CIP Sensible (-)
GM Sensible (-)
S Sensible (-)
SXT Resistente (-)
C Resistente (-)
TE Sensible (-)
Boa constrictor spp. (Boa 13)
Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal
P (-) Resistente
AM (-) Resistente
AMC (-) Resistente
CTX (-) Sensible
CF (-) Resistente
ENO (-) Sensible
CIP (-) Sensible
GM (-) Sensible
S (-) Sensible
SXT (-) Resistente
C (-) Sensible
TE (-) Sensible
Boa constrictor spp. (Boa 8)
Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal
P Resistente Resistente
AM Resistente Resistente
AMC Resistente Resistente
CTX Sensible Intermedio
CF Resistente Resistente
ENO Sensible Sensible
CIP Sensible Sensible
GM Sensible Sensible
S Sensible Sensible
SXT Intermedio Resistente
C Intermedio Sensible
TE Intermedio Sensible
47
Boa constrictor spp. (Boa 5)
Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal
P Resistente Resistente
AM Resistente Resistente
AMC Resistente Resistente
CTX Sensible Intermedio
CF Resistente Resistente
ENO Sensible Sensible
CIP Sensible Sensible
GM Sensible Sensible
S Sensible Sensible
SXT Intermedio Sensible
C Intermedio Resistente
TE Intermedio Sensible
Boa constrictor spp. (Boa 4)
Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal
P Resistente Resistente
AM Resistente Resistente
AMC Resistente Resistente
CTX Sensible Intermedio
CF Resistente Resistente
ENO Intermedio Intermedio
CIP Sensible Sensible
GM Sensible Sensible
S Sensible Sensible
SXT Resistente Resistente
C Resistente Resistente
TE Sensible Sensible
Boa constrictor spp. (Boa 3)
Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal
P Resistente Resistente
AM Resistente Resistente
AMC Resistente Resistente
CTX Sensible Intermedio
CF Resistente Resistente
ENO Sensible Intermedio
CIP Sensible Sensible
GM Sensible Sensible
S Sensible Sensible
SXT Intermedio Resistente
C Intermedio Intermedio
TE Intermedio Intermedio
48
Boa constrictor spp. (Boa 2)
Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal
P Resistente Resistente
AM Resistente Resistente
AMC Resistente Resistente
CTX Sensible Intermedio
CF Resistente Resistente
ENO Sensible Intermedio
CIP Sensible Sensible
GM Sensible Sensible
S Sensible Sensible
SXT Resistente Resistente
C Intermedio Resistente
TE Sensible Resistente
P. unifilis (Pod 1)
Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal
P Resistente Resistente
AM Resistente Resistente
AMC Intermedio Intermedio
CTX Sensible Sensible
CF Resistente Resistente
ENO Sensible Sensible
CIP Sensible Sensible
GM Sensible Sensible
S Sensible Sensible
SXT Resistente Intermedio
C Intermedio Sensible
TE Sensible Sensible
P. unifilis (Pod 2)
Antibiótico Patrón Muestra Oral Patrón Muestra Cloacal
P Resistente Resistente
AM Resistente Resistente
AMC Sensible Resistente
CTX Sensible Sensible
CF Resistente Resistente
ENO Sensible Sensible
CIP Sensible Sensible
GM Sensible Sensible
S Sensible Sensible
SXT Intermedio Resistente
C Sensible Sensible
TE Sensible Sensible
49
Fotos del trabajo de campo y laboratorio.
Sujeción caimán Sujeción boa
Muestra cloacal en iguana Muestra oral en iguana
Control de viales, P. aeruginosa Control de viales, E coli
ATCC 27853 ATCC 25922
50
Control de viales, S. aureus Siembra en el laboratorio
ATCC 25923
Identificación de colonias Pigmento, Pseudomonas aeruginosa
Fluorescencia bajo luz negra, Pseudomonas aeruginosa
51
Coloración Gram, objetivo de inmersión Identificación de bacilos
Disco de oxidasa (positivo)
Lectura pruebas API 20 NE Lectura pruebas API 20 NE
Antibiograma, colocación de discos Antibiogramas, patrones de resistencia
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