Consejo Superior de Universidad de Granada
Investigaciones Científicas
“Papel de la Proteína Adaptadora Numb en la
Modulación de la Señal
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
Dra.
Consejo Superior de Universidad de Granada
TESIS DOCTORAL
“Papel de la Proteína Adaptadora Numb en la
Modulación de la Señalización por TCR”
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
PRESENTADO POR:
Dª Nadia María Martín Blanco
Lda. Biología
BAJO LA DIRECCIÓN DE:
Dra. Dª Matilde Cañelles López
Científico Titular del CSIC
Granada, 2010
Consejo Superior de Universidad de Granada
“Papel de la Proteína Adaptadora Numb en la
por TCR”
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR
Editor: Editorial de la Universidad de GranadaAutor: Nadia María Martín BlancoD.L.: GR 1473-2010ISBN: 978-84-693-0734-2
Dra. MATILDE CAÑELLES LÓPEZ, Científico Titular del CSIC
CERTIFICA:
Que Dña. Nadia María Martín Blanco, Licenciada en Biología, por la Universidad de Granada,
ha realizado bajo su dirección en el departamento de Biología Celular e Inmunología del Instituto
de Parasitología y Biomedicina “López Neyra” del CSIC, la presente tesis titulada:
“Papel de la Proteína Adaptadora Numb en la
Modulación de la Señailización por TCR”
Para la obtención del Título de Doctor en Ciencias.
Y para que conste y surta sus efectos en el expediente correspondiente expido la presente
certificación en Granada, a 1 de Diciembre de 2009.
DIRECTORA DEL TRABAJO LA ASPIRANTE
Dra. Matilde Cañelles López Lda. Nadia Mª Martín Blanco
Esta Tesis Doctoral ha sido realiza en el Departamento de Biología Celular e Inmunología del
Instituto de Parasitología y Biomedicina “Lopéz Neyra” (CSIC) de Granada y ha podido ser
realizada gracias a un Contrato Asociado a Proyecto de la Junta de Andalucía (2007-2008).
Parte de los resultados de esta tesis han sido descritos y enviados para su publicación en la revista
científica: BLOOD, aceptado con revisión:
Aguado R., Martín-Blanco N., Canelles M. The endocytic adaptor Numb regulates
thymus size by modulating pre-TCR signaling during asymmetric division.
A M ercedes y R aúl.
…..Caminante, no hay camino,
se hace camino
Al andar se hace el camino,
y al volver la vista atrás
se ve la senda que nunca
se ha de volver a pisar…..
Antonio Machado.
A M ercedes y R aúl.
…..Caminante, no hay camino,
se hace camino al andar.
Al andar se hace el camino,
y al volver la vista atrás
se ve la senda que nunca
se ha de volver a pisar…..
Antonio Machado.
Agradecimientos:
Porque una persona es el resultado de todo lo que tiene alrededor, porque los buenos momentos
y los éxitos hay que compartirlos, y porque no todo el mundo ve esto como una competición, a lo
largo de cuatro años te encuentras con gente a la que estás obligado a agradecerle su ayuda,
porque realmente se lo merece.
Gracias a Matilde Cañelles por confiar en mi y darme esta oportunidad, espero no haberte
defraudado; y gracias no solo por ser la directora de mi tesis sino también por preocuparte por
mi futuro, por mi presente y por mi pasado. Por guiarme hacia el objetivo cuando yo pierdo el
punto de referencia.
Gracias Ignacio Molina por su ayuda para conseguir mi financiación, y por sus clases se
Inmunología durante la carrera.
Gracias a Balbino Alarcón por toda su ayuda científica, y por acogerme en su laboratorio, por su
trato tan cercano y amabilidad, gracias a todo su equipo que me hicieron sentir como en casa.
A Javier León, por su ayuda, porque hablar con él no es como hablar con un jefe, y a todo su
equipo por su trato, su amabilidad, por su acogida, por preocuparse por enseñarme Santander. A
Gabi, gracias especialmente por su ayuda, y porque es capaz de enseñar todo lo que sabe sin
guardarse nada para el, no pierdas eso nunca.
Gracias a mis compañeros de laboratorio, a Rocío por esa primera etapa de tesis en las que
fuimos cómplices y nos perdíamos juntas por estos pasillos del López, y por las discusiones
durante el café que nos hicieron comprender un poco mas nuestro proyecto. Y a Michael por
esta última etapa.
A Esther Zumaquero, gracias por ser mi puente de conexión con el López, por su sonrisa
contagiosa y por sus visitas al 210. Porque no tiene ningún reparo en enseñarte todo lo que sabe,
que es mucho aunque ella lo niegue. Siempre está dispuesta a ayudarte, es una gran compañera.
A Pili por su dulzura, por su sonrisa, por su ayuda, gracias. A Marién, por sus visitas cada vez
que pisa de nuevo el López. Y a Per y Nieves por su ayuda técnica, gracias. A Angélica y a
Virginia por esta última etapa, gracias.
Gracias en general a todos mis compañeros del López Neyra, bueno excepto a uno, que no se
quien es, y que me voto como ácido acético, jajajaja!!! Es broma, a este/a también. Gracias al
personal del López porque sin ellos tampoco hubiese sido posible, Paco, Clara, Ángeles, Mª José,
José Luis Rafa, Salva…. Gracias por hacer bien vuestro trabajo.
Y ahora que está finalizando esta etapa, me pongo a pensar como llegue hasta aquí, y me doy
cuenta que es producto de un gran número de coincidencias. Gracias a mi profesora de bilogía,
que hizo que me gustara esta profesión. Porque no escogí Inmunología en mi primera matrícula,
y alguien me convenció en el último momento, gracias Paco y Susana, porque yo quería trabajar
en Desarrollo y allí no me quisieron, también gracias; y por último, Gracias a Ramón Cañelles,
porque es el último eslabón de esta cascada de coincidencias, este trabajo también es gracias a
ti. Y a veces el destino también parecía enviar señales contradictorias, porque casi suspendo
biología en selectividad, porque no conseguí eliminar el primer examen de inmunología, pero
como naci cabezona, yo seguí en mis treces.
A mis amigos, que son pocos pero grandes. Gracias a Elena, Irene, Jordi, Antonio, Chico y
David, porque sois parte de una de las etapas más felices de mi vida, que recuerdo como aquellos
maravillosos años. Gracias a Miriam, porque al final llegue a entender tu letra mejor que la mía
propia, porque estuviste cuando te necesitaba, por levantarme y sostenerme en el momento
adecuado, gracias porque se que eres incondicional, gracias por todas las anécdotas comunes
que podemos contar, muchas horas de risas, de lágrimas, de chistes…. Que se yo!!. Por decirme
que yo valgo para esto. A Nuria, gracias por su sensatez, por su sabiduría, porque de las cuatro
representa la cordura, la fortaleza, las palabras justas, gracias por contagiarme de todo esto, por
tu cariño y por tus muestras de este. A Luismi, mi mejor amigo consorte, porque si estas tu en la
reunión seguro que acabo riéndome a carcajadas, por tu calidad humana, porque es increíble ese
aire de bondad infantil que trasmites, nunca pierdas esto último, gracias. A Nieves, gracias por
tu sonrisa, por tu humor, por tu espontaneidad, porque con tus cualidades consigues que cada
momento contigo este muy lejos del aburrimiento
A Javi, gracias, porque también formó parte de esto, por su ayuda y amor.
A mi Pablito, por su amor, su compañía, siempre dando ánimos, por convencerme de que mi
trabajo será recompensado, por llamarme “maquinón”, por decirme “no te preocupes por el
western ese, mañana te saldrá”. Por toda tu ayuda, disposición y amor sin razón, porque eres el
que estas todos los días, gracias.
Y a mi familia, a mi Madre, Mercedes, que se yo que puedo decir..!, porque me ha enseñado todo,
y porque estoy aquí por una de sus frases “estudia lo que te guste”. Por ser un ejemplo de
valentía, y como madre por su respeto, por la educación que me dio, por enseñarme el valor de
las cosas, y por su amor incondicional, gracias. A mi hermano Raúl, por ser mi ejemplo a seguir,
porque está lleno de bondad y porque es un ejemplo de superación, porque me decía “Tata tu
hasta el final”, porque se le nota orgulloso de mí, porque es mi hermano, gracias. A mi padre,
Raúl, por quererme y estar junto a mí, por decirme “que fuerza de voluntad tienes, hija”, porque
sin el aquí tampoco habría sido posible, por sus sabios consejos, por toda su ayuda gracias. A mi
hermano Issey, porque es la alegría que me lleva a casa todos los días, porque sigue siendo un
niño y con su sonrisa me hace feliz, gracias. A Merce, por cuidarme todos los días, por su
cariño, ayuda y comprensión, porque sin ti habría sido mucho más difícil, a la madrina gracias.
A Paula y Julia, por sus abrazos tan sinceros, nunca dejéis de abrazarme así. A Ana, porque
siempre sabe escuchar, porque siempre quise ser como tú. A Alexis por ser como un hermano. A
Justo, Ángel, Mª Sol, Eva, gracias por estar ahí. A Jose, por su cariño desde hace muchos años. A
Ramoncito, porque aún tenemos un gran proyecto juntos que cumplir. A María y Elena, porque
puedo ver en sus ojos su alegría al verme. A Gema por cuidarme, gracias. A todos mis tíos y
primos porque en la lejanía os siento cerca y orgullosos, Manolo, Pedro, Paco y Jesús, y a mi
padrino Ramón, gracias. A mi abuela, por cuidarnos con tanto amor, por toda su preocupación,
por sus rezos, por ser tan valiente y luchadora, gracias. Y para los que ya no lo podrán leer,
Manolo, gracias, para Mimi y Justo, ojala os llegue este agradecimiento, porque os llevo dentro
de mí, gracias.
Bueno, y acabo ya, porque casi tengo más agradecimientos que dar, que resultados que mostrar,
y ya lo último.
A TODOS, quiero que comprendáis, que me soy consciente de vuestra ayuda, de vuestra amistad
y de vuestro amor, porque soy quien soy, y se lo que se por vosotros, porque espero tener la
suerte de seguir teniendo que hacer agradecimientos durante muchos años…..
GRACIAS.
ÍNDICE
Índice
- RESUMEN………………………………………………………………………..19
- INTRODUCCIÓN………………………………………………………………..23
1. Desarrollo y maduración de linfocitos T en el timo……………….23
1.1 Etápas tempranas de desarrollo tímico………………………..23
1.2 Selección positiva y toma de linaje……………………………25
1.2.1 Modelos clásicos de selección positiva y toma de linaje..26
1.2.2 Modelo de “kinetic signaling”. ……………………….....27
1.3 Papel de Notch en el desarrollo de linfocitos T……………….30
2. Modulación de los niveles superficiales de TCR…………………..32
2.1 Mecanismos de modulación del TCR superficial……………..34
2.1.1 Diferencias en la dinámica………………………………34
2.1.2 Diferencias en el mecanismo…………………………...35
2.2 Mecanismo del ciclo Constitutivo del TCR…………………....37
2.3 Mecanismos de Modulación del TCR…………………………37
2.3.1 Modulacion del TCR independiente de ligando………...37
2.3.2 Modulación del TCR dependiente de ligando…………..38
2.3.3 Degradación del TCR……………………………………39
3. Proteína adaptadora Numb………………………………………..41
3.1 Estructura y regulación de Numb…………………………….41
3.2 Funciones de Numb…………………………………………...42
3.2.1 Proteína endocítica……………………………………...44
3.2.2 Modulador negativo de Notch…………………………..46
3.3 Numb en el sistema inmune…………………………………..47
- OBJETIVOS……………………………………………………………………53
- MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………………57
- RESULTADOS…………………………………………………………………73
Nadia Mª Martín Blanco
1. El dominante negativo para Numb inhibe la función de Numb endógena………..73
2. Análisis fenotípico en timo de ratones TG dnNumb y TG Numb…………………76
2.1 Fenotipo de ratones TG dnNumb……………………………………………….76
2.2 Fenotipo de ratones TG Numb……………………………………………….....76
3. Marcadores de activación en timo………………………………………………….79
3.1 Alteración en marcadores de activación en células DP de ratones TG
dnNumb………………………………………………………………………….79
3.2 Secuestro en timo de células CD8SP en ratones TG dnNumb…………………81
4. Análisis fenotípico de nódulos linfáticos en ratones TG dnNumb y TG Numb……85
4.1 Expresión de proteínas transgénicas en nódulos de ratones TG
dnNumb y TG Numb, modulación de la actividad de Notch ………………….85
4.2 Alteración en la relación CD4/CD8 en nólulos en ratones TG dnNumb……..86
4.3 Alteración en la relación de células Virgenes /Efectoras-Memoria en
ratones TG dnNumb……………………………………………………………...87
5. Modulación de los niveles superficiales de TCR……………………………………90
5.1 Dinámica normal del ciclo constitutivo del TCR en ratones TG dnNumb…….90
5.2 Alterada lamodulación del TCR dependiente de ligando en ratones TG
dnNumb…………………………………………………………………………...92
5.3 Aumento en el número de vesículas de TCR en citoplasma…………………..94
5.4 El dominante negativo de Numb compite con Numb endógena por su
unión al complejo del TCR tras la estimulación de este……………………….96
5.5 Disminución en la colocalización entre Numb y TCR en ratones TG
dnNumb…………………………………………………………………………97
5.6 Numb coinmunoprecipita con CD3ε tras la activacion del TCR por
ligando, y el dominante negativo mantiene esta capacidad……………………99
5.7 Disminución en la tasa de colocalización entre TCR y Cbl en ratones
TG dnNumb……………………………………………………………………..101
5.8 El dominante negativo Numb no es capaz de unirse a la ubiquitin ligasa
Cbl……………………………………………………………………………….102
5.9 Los niveles endógenos de Numb aumentan ligeramente durante la
estimulación…………………………………………………………………….103
Índice
5.10 Normal modulación de los niveles superficiales de TCR en ratones
TG dnNumb………………………………………………………………104
5.11 Alteración en la polarización de Numb hacia la zona de sinapsis……..105
6. Segregación de Numb durante la división de linfocitos T CD4 maduros…...107
- DISCUSIÓN………………………………………………………………………113
- CONCLUSIONES………………………………………………………………....131
- BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………….135
- PUBLICACIONES……………………………………………………………….145
RESUMEN
Resumen
21
Los linfocitos T se generan a partir de precursores de medula ósea que viajan hasta el timo. Es en
este órgano donde pasarán por diferentes fases de desarrollo antes de convertirse en linfocitos T
maduros. Uno de los procesos que los timocitos deben superar durante su maduración es la
selección positiva, durante esta fase se decide el linaje que van a tomar las futuras células
maduras, linfocito T CD4 o linfocito T CD8. El proceso de selección positiva se encuentre regulado
por la unión del TCR con el MHC-I o MHC-II, de esta manera se generan células CD8 o CD4
respectivamente. Uno de los mecanismos que regula la elección de linaje es la señalización a
través de TCR, así las señales generadas por el TCR resultan ser cuantitativamente diferentes
según se haya activado a través de MHC-I o MHC-II. De esta manera, una fuerte señalización a
través de TCR genera células CD4 mientras que señales más débiles producen células CD8.
Uno de los mecanismos por los cuales se puede modular la señalización a través de
TCR es regulando la disponibilidad del receptor en membrana. Los niveles TCR en membrana
dependen de cuatro procesos, internalización, reciclaje, degradación y nueva síntesis. De esta
manera, la alteración en cualquiera de estos procesos puede llevar a una alteración en los niveles
de TCR y en la señalización por éste. Cuando el TCR es activado por la unión a su ligando, se
produce una disminución en los niveles de expresión en superficie que se lleva a cabo por un
aumento en el proceso de internalización y de degradación mediado por la ubiquitin ligasa c-Cbl,
así este mecanismo constituye una manera de extinguir la señal generada por TCR.
La proteína adaptadora Numb participa en procesos de endocitosis y de degradación de
receptores. Anteriormente se ha demostrado que Numb colocaliza con el TCR en la zona de
sinapsis y que es capaz de coinmunoprecipitar junto con c-Cbl. Es por esto que Numb parece ser
un buen candidato para regular la modulación de los niveles de TCR.
Mediante el estudio de ratones TG que expresan un dominante negativo para Numb (TG
dnNumb) hemos podido demostrar que la inhibición de Numb provoca un aumento en los niveles
de señalización por TCR en timocitos que están pasando por el proceso de selección positiva,
debido a esto aparece en ratones TG dnNumb un aumento en la eficiencia de producción de
células CD4 frente a una producción normal de células CD8. Mediante el estudio del mecanismo
de modulación del TCR hemos podido demostrar que en ratones TG dnNumb se encuentra
parcialmente inhibida la degradación del TCR tras activación. Asimismo, hemos descrito que Numb
es capaz de coinmunoprecipitar junto a CD3ε de manera dependiente de activación, y de reclutar
Nadia Mª Martín Blanco
22
a c-Cbl hacia el complejo del TCR con el fin de facilitar su degradación y modular la señalización a
través del receptor.
Con los resultados descritos en este trabajo hemos podido establecer un modelo para la
degradación del TCR de manera dependiente de ligando, en el cual Numb actúa como una
proteína adaptadora en su degradación. Por tanto, Numb parece ser una proteína indispensable
para la correcta modulación de los niveles de señalización por TCR, y por tanto para el desarrollo
de células T
INTRODUCCIÓN
Introducción
25
1. DESARROLLO Y MADURACIÓN DE LINFOCITOS T EN EL TIMO.
1.1 Etapas tempranas de desarrollo tímico.
Los linfocitos, tanto B como T, se desarrollan a partir de precursores comunes que se
generan en la médula ósea. En el caso de los linfocitos T, los precursores migran por los vasos
sanguíneos desde la médula ósea hasta el timo, y es en este órgano donde se producirá la
maduración y desarrollo de los linfocitos T a partir de timocitos. Las diferentes etapas de
desarrollo por las que pasan los timocitos durante su desarrollo antes de convertirse en células
maduras se encuentran muy bien definidas [1, 2].
Cuando los precursores de médula ósea llegan hasta el timo se convierten en timocitos
dobles negativos (DN), que no expresan ni CD4 ni CD8 en su superficie, es en este estadio
cuando las células proliferan para dar lugar al número definitivo de timocitos que conformarán el
timo y que darán lugar a células maduras; dentro de este estadio de DN se pueden diferenciar
cuatro etapas de desarrollo que se distinguen entre si por la expresión de CD25 y de CD44 en
superficie, así se denominan células DN1 a timocitos CD44+ CD25¯ , DN2 a CD44+ CD25+, DN3 a
CD44¯ CD25+ y DN4 a timocitos CD44¯ CD25¯ . En el estadio de DN las células pueden
diferenciarse hacia célula T γδ o hacia célula T αβ [3]. Estas últimas comienzan en el estadio DN3
a expresar el receptor de membrana pre-TCR en su superficie, formado por una cadena pre-Tα
que no sufre reordenamiento somático, y por una cadena β que sí ha sufrido reordenamiento, y
que por tanto será la cadena β definitiva. En esta etapa es necesaria la activación de los genes
RAG 1 y RAG 2 que intervienen en el reordenamiento de las cadenas del TCR. En este estadio los
timocitos DN3 sufren lo que se denomina β-selección. Así, tanto fallos en el reordenamiento de la
cadena β, como fallos en la función de segundos mensajeros que intervienen en la señalización
por pre-TCR, llevan al aumento del número de DN3, debido a un bloqueo del desarrollo [2] . Otro
proceso importante que ocurre en los timocitos durante la selección β, y que es necesario para el
paso de DN a DP, es la modulación de la expresión del pre-TCR. Esta modulación, al contrario que
la que se da en el TCR en células maduras, es independiente de estimulación, se produce por
tanto de forma constitutiva [4, 5]. La degradación del pre-TCR provoca una disminución de su
expresión en superficie, mas tarde comienza el reordenamiento de la cadena α del TCR, y la
expresión en superficie del TCR definitivo; a su vez, los timocitos, comienzan a expresar CD4 y
Nadia Mª Martín Blanco
26
CD8, pasando a un estadio de desarrollo denominado doble positivo (DP) y son estas células DP
las que constituyen la mayor población del timo tras el nacimiento del individuo.
Las células dobles positivas (DP) acabarán dando lugar a linfocitos T CD4 o CD8
maduros, que más tarde migrarán hacia órganos periféricos. Antes de que ocurra esto las células
DP deberán pasar por dos tipos de selección: la selección positiva y la selección negativa.(Fig 1).
Figura 1: Etapas de desarrollo de timocitos.
Diferentes etapas de desarrollo de células T en timo y
localización de cada una de ellas, en corteza hasta el
estadio de DP y en médula en el estadio de SP.
Introducción
27
1.2 Selección positiva y toma de linaje
En este estadio, solo las células DP cuyos TCRs presenten la avidez y afinidad correcta
por el complejo MHC sobrevivirán. Los timocitos que no tengan afinidad por el complejo MHC-
péptido morirán por falta de estimulación, en lo que se denomina muerte por negligencia; mientras
que los timocitos capaces de reconocer con baja afinidad al complejo MHC serán positivamente
seleccionados. De esta manera, si el TCR es capaz de reconocer a MHC de clase I, las células DP
se diferenciarán hacia célula CD8SP, mientras que las células cuyo TCR sea capaz de reconocer
a MHC de clase II se diferenciarán hacia células CD4SP. Más tarde los timocitos que superan la
selección positiva pasan por el proceso de selección negativa, en este caso los timocitos que
presentan una alta avidez por el complejo MHC-péptido propio sufrirán una fuerte estimulación lo
que les lleva a una muerte por apostosis. Este proceso evita que timocitos susceptibles de ser
autoreactivos maduren y pasen a órganos periféricos. Por tanto, solo los linfocitos que presentan
un grado de avidez y afinidad óptimo sobreviven y se diferencian hacia célula madura.
El proceso de selección positiva es crucial en el desarrollo intratímico de las células T, no
solo porque determina la especificidad de las células Tαβ en la periferia, sino porque también
controla la especialización de las células T, en CD4 T colaboradora y en CD8 T citotóxica,
dependiendo de si su TCR reconoce MHC de clase II o I respectivamente, además esta toma de
linaje entre CD4 y CD8 determina la relación entre células CD4/CD8. Dentro del estadio de DP,
las células pasan por diferentes fases de desarrollo. Tras la estimulación por TCR las células
comienzan a expresar altos niveles de CD69 [6] en superficie, en los estadios más tempranos las
células son CD4+ CD8+ TCRlow y CD69- . En una etapa posterior en la que aumenta la expresión
de TCR, las células pasan a ser CD4+, CD8+, CD69+ y TCRhi, simultáneamente también aparece
en esta fase la expresión de CD5 [7]. Tras este estadio irán poco a poco perdiendo la expresión de
CD69, así como de uno de los co-receptores CD4 o CD8, hasta llegar al estadio de simple positiva,
SP. Por tanto, la expresión de CD69 y de CD5 se considera como marcadores de células que
están dentro de la etapa de selección positiva.
Nadia Mª Martín Blanco
28
1.2.1 Modelos clásicos de selección positiva y toma de linaje.
Clásicamente existen dos modelos que explican el proceso de toma de linaje de las
células DP hacia CD4 o CD8; estos son conocidos con el nombre de modelo Instructivo y modelo
Estocástico.
Modelo Estocástico: Defiende que el paso de células DP a SP se desarrolla en dos
etapas, una primera etapa en la que la activación del TCR lleva a la disminución de los niveles de
expresión de uno de los receptores de forma aleatoria, dando lugar a unos intermediarios
comunes, y un segundo paso en el que solamente las células que hayan disminuido los niveles
superficiales del co-receptor correcto sobrevivirán y pasarán a SP. Es decir, si la activación se ha
realizado mediante el MHC-II y la modulación afecta a CD4 esta modulación, aunque aleatoria, es
correcta, sin embargo las células que disminuyeron los niveles superficiales del co-receptor
incorrecto, en este caso CD8, morirán por falta de estimulación, y al contrario se producirá cuando
la estimulación se lleve a cabo por MHC-I. El modelo Estocástico se basa en el hecho de que
ratones β2m knockout (deficientes en MHC-I) contiene células CD8hiCD4medium, y defienden que
este estadio de desarrollo conforma los precursores inmediatos de CD8SP, apareciendo así
células que deben desarrollarse a partir de la unión TCR-MHC I; y que ratones deficientes para
MHC-II contienen células CD4highCD8medium, precursoras de CD4SP [8, 9], por tanto el linaje que
toman las células DP es independiente de la especificidad del TCR, según este modelo. Existen
dos importantes contradicciones en este modelo, en primer lugar, el modelo Estocástico predice
un 50% de eficiencia de la selección positiva, ya que existe el 50% de probabilidades de modular
el co-receptor adecuado, sin embargo, por trabajos posteriores se conoce que la eficiencia de la
selección positiva es de un 90% [10]. En segundo lugar más tarde se comprobó que las células
CD4highCD8medium, son precursores tanto de CD4 como de CD8 [6-8].
Modelo Instructivo: El modelo instructivo defiende que diferentes señales son
generadas por la activación de TCR+CD4 o por la activación de TCR+CD8, a partir de la unión con
clase II o clase I respectivamente. En este caso la visión más aceptada es la propuesta por Robey
Fowlkes, en la que se defiende que las señales generadas son cuantitativamente pero no
cualitativamente diferentes, así difieren en la intensidad de señal. De esta manera, la activación de
TCR+CD4 por MHC-II genera una fuerte intensidad de señal que llevaría al desarrollo de células
CD4, mientras que la activación de TCR+CD8 por MHC-I lleva a señales con intensidad más baja
Introducción
29
dando lugar a células CD8 [11-13]. Esta teoría se basa en el hecho de que el co-receptor CD4, a
diferencia del CD8 presenta un mayor número de motivos de unión de Lck [14], siendo Lck una
tirosinquinasa encargada de amplificar la cascada de señalización del TCR. La mayoría de los
trabajos realizados por Robey y colaboradores se basan en la manipulación de los dominios
intracelulares de los co-receptores CD4 y CD8, o bien en la alteración de los niveles superficiales
de estos [15-17].
No solo los experimentos realizados por Robey avalan este modelo, otros grupos han
demostrado que manipulaciones de la señalización por TCR alteran el linaje de las DP, por
ejemplo manipulaciones directas de la actividad de Lck [18, 19] , de MAPK [20], alteraciones en la
cadena ζ del TCR [21], o en CD5 [22]; estas alteraciones provocan que en ratones que expresan
TCRs específicos para MHC I o II se desarrollen células CD8 o CD4 respectivamente [19].
Como alternativa a estos modelos clásicos aparece otro modelo denominado “Kinetic
Signaling”[23], que se presenta como una modificación del modelo instructivo propuesto hasta
ahora.
1.2.2 Modelo de “Kinetic signaling”.
Los dos modelos anteriormente definidos se basan en las mismas presunciones. En
primer lugar se basan en que la selección positiva y la toma de linaje ocurren simultáneamente en
células DP que han sido estimuladas a través de su TCR, y en segundo lugar presuponen que la
toma de linaje termina cuando se produce el silenciamiento de uno de los co-receptores, siendo
este fenómeno irreversible. Sin embargo, el modelo de la señalización cinética de basa en
diferentes presunciones.
Este modelo defiende que la selección positiva y la toma de linaje son dos procesos
independientes que no se desarrollan simultáneamente sino consecutivamente, así la selección
positiva se desarrolla en el estadio de DP y este fenómeno si sería dependiente de la intensidad de
señal, mientras que la toma de linaje se decide en un estadio posterior de desarrollo denominado
CD4highCD8medium, por tanto en este estadio, las células a pesar de haber disminuido sus niveles
superficiales de CD8 aún son capaces de diferenciarse hacia los dos linajes, manteniendo su
Nadia Mª Martín Blanco
30
capacidad de diferenciación [24-29]. De esta manera las células DP que han sido positivamente
seleccionadas tras la activación de su TCR+co-receptor con el MHC específico se convierten en
células CD4highCD8medium [29-31]. Si la señal por TCR persiste, estos intermediarios se
diferenciaran hacia CD4SP, produciéndose un silenciamiento definitivo del co-receptor CD8. Sin
embargo, si la señal por TCR cesa, se diferenciaran hacia células CD8, en este caso cesará la
expresión de CD4 y se reanudará la expresión de CD8 en un proceso denominado “coreceptor
reversal” convirtiéndose en células CD4medium CD8high[32] (Fig 2).
Figura 2: Diferentes etapas de desarrollo de timocitos según
la expresión de CD4 y CD8, los colores indican el posible
linaje con el que están comprometidos los timocitos, naranja
para CD4 y azul para CD8.
. Por tanto, según este modelo, el linaje hacia el cual se diferencian los precursores
depende de la duración de la señalización por TCR y no de la intensidad, como defiende el modelo
instructivo (Fig3), en este caso la intensidad de señal regula solamente la eficiencia de la selección
positiva tanto de células CD4 como de células CD8. Este hecho explicaría que la eficiencia de la
Introducción
31
selección positiva de CD4 sea más elevado que la de CD8 debido al aumento en el número de
sitios de unión a Lck que presenta el co-receptor CD4, hecho que se produce de forma natural
durante el desarrollo de linfocitos T.
Pero, ¿de qué depende que la señalización por TCR persista o cese?. Puesto que la
disminución de los niveles superficiales de CD8 se realiza independientemente del linaje a seguir,
en el caso en el que el TCR haya sido estimulado por MHC-I esta disminución en el CD8
superficial lleva a un cese en la señalización por TCR, puesto que en este caso el co-receptor CD8
estaba siendo estimulado y estaba participando en la señalización por TCR, en el caso opuesto,
cuando el TCR es activado por MHC-II la disminución de los niveles superficiales de CD8 no afecta
a la señalización por TCR, por tanto esta persiste.
La importancia de la señalización por TCR dentro de la selección positiva es un fenómeno
ampliamente aceptado, pero sigue existiendo controversia acerca de la diferencia entre el papel de
la intensidad de señalización y del tiempo que dura la señalización, en cualquier caso ambas
teorías se pueden englobar dentro del Modelo Instructivo de selección positiva
Pero evidentemente, se trate de uno u otro modelo, la conclusión que se puede sacar es
que la señalización por TCR juega un papel determinante en la selección positiva y en la toma de
linaje de los timocitos, por tanto cualquier alteración en la señalización puede causar alteraciones
en el linaje CD4/CD8 .
Nadia Mª Martín Blanco
32
Figura 3: Esquema del modelo de la señalización cinética, en el que se defiende
que la toma de linaje depende de la duración de la señalización por TCR.
1.3 Papel de Notch en el desarrollo de linfocitos T.
Otro de los receptores, a parte del TCR, que se ha propuesto para intervenir en el
desarrollo de linfocitos T es el receptor de membrana Notch. Notch ha sido altamente estudiado
como un determinante del destino de desarrollo y diferenciación celular, no solo dentro del
desarrollo del sistema inmune, sino que también en el desarrollo de otros sistemas.
Numerosos trabajos han demostrado que la activación de Notch en los progenitores que
viajan desde médula produce el desarrollo de células T frente a B [33], y viceversa, la inactivación
de Notch provoca un aumento en la producción de células B [34, 35]. En el estadio de DN3 Notch
participa en el desarrollo de células Tαβ versus Tγδ, se ha demostrado que la activación de Notch
es necesaria para la expresión de pre-TCRα y para el reordenamiento Vβ-DJβ [36], por tanto la
activación de Notch es necesaria para el desarrollo de células Tαβ frente a Tγδ [37]. El punto que
ha generado más controversia en el papel de Notch dentro del desarrollo en el sistema inmune, es
su función en la diferenciación de células DP hacia CD4 o CD8, trabajos realizados por Robey y
colaboradores defienden que la activación de Notch es necesaria para el desarrollo de células
CD8, de esta manera demostraron que la sobreactivación de Noch mediante la sobreexpresión de
su dominio intracelular producía la diferenciación de células CD8 en ratones deficientes en MHC-I
[38, 39] , sin embargo otros trabajos han visto que la sobreactivación de Notch lleva a un aumento
en la maduración de células SP tanto CD4 como CD8, produciéndose un acúmulo de estas en el
timo, y que no participa en la toma de linaje CD4/CD8 [40], en relación a esto la inactivación de
Notch tampoco provoca alteraciones en el desarrollo de células CD4 o CD8 según el trabajo de
Wolfer y colaboradores [41] . Recientemente se ha visto que el papel de Notch dentro de la
diferenciación CD4/CD8 está relacionado con la señalización a través de TCR [42], así la
activación de Notch lleva a una disminución en los niveles de señalización por TCR, esta
disminución en la señalización por TCR produciría el desarrollo de células CD8 frente a CD4 según
el Modelo Instructivo de selección positiva.
Introducción
33
Figura 4: Papel del receptor Notch en el desarrollo de timocitos.
Es posible que la determinación del linaje hacia CD8 o hacia CD4 este determinada no
por uno de los receptores, TCR o Notch, sino por una actuación conjunta que tenga como fin un
equilibrio entre ambas señalizaciones que lleve a la elección correcta del linaje.
Nadia Mª Martín Blanco
34
2. MODULACIÓN DE LOS NIVELES SUPERFICIALES DE TCR.
Los linfocitos T presentan en su superficie un receptor denominado TCR, el TCR se
encarga de reconocer los antígenos unidos a MHC en la superficie de células presentadoras de
antígenos. El TCR está constituido por una cadena α y otra β, que son las encargadas de unirse al
complejo péptido-MHC además el TCR se asocia con diferentes cadenas CD3 para formar el
complejo TCR/CD3, existen cuatro tipos de cadenas de CD3 denominadas ζ, ε, γ y δ. Las
cadenas del TCR se asocian con las cadenas CD3 que forman tres dímeros diferentes, ζζ, εγ y εδ.
Una vez que el TCR es estimulado por su unión al ligando la señal es transmitida hasta las
cadenas de CD3, esta estimulación lleva a la fosforilación de las secuencias ITAMs presentes en
los dominios citoplasmáticos de las cadenas CD3, por parte de la familia de tirosin quinasas Src
(Lck y Fyn); los ITAMs fosforilados constituyen un sitio de unión para proteínas con dominios SH2,
tales como ZAP-70, a partir de aquí se genera una cascada de transducción de señales generadas
por la activación del TCR.
El TCR que se expresa en la superficie celular de los linfocitos T está continuamente
siendo internalizado o endocitado hacia el interior celular para posteriormente reciclarse a la
membrana, este proceso se realiza de manera constitutiva sin necesidad de estímulo, además de
forma constitutiva también se pueden producir otros dos fenómenos que regulan los niveles de
TCR, como la degradación del TCR internalizado y el aporte de nuevo TCR sintetizado hacia la
membrana [43]. Por tanto, los niveles superficiales de TCR dependen de la tasa de internalización,
de las tasas de degradación, de reciclaje y de de síntesis de novo (Fig 5); pero de manera
constitutiva los niveles superficiales de TCR se mantienen constantes. Así, la mayoría del TCR
total en células en reposo se encuentra en la superficie celular, frente a una pequeña fracción
intracelular que puede estar en diferentes compartimentos, endosomas, lisosomas o vesículas de
nueva síntesis. Este proceso se denomina ciclo constitutivo del TCR.
Introducción
35
Figura 5: Ciclo del TCR. Diferentes
compartimentos en los que se puede encontrar
el TCR.
Cuando el TCR es activado por su unión a MHC-péptido, se produce una polarización
tanto del TCR como de otras proteínas hacia el punto de estímulo, este zona es conocida como
sinapsis inmunológica. Tras la formación de este complejo se produce una rápida disminución de
los niveles superficiales de TCR, este fenómeno es conocido como “down-modulation”, o
modulación del TCR, y su objetivo parece ser la modulación de los niveles de señalización por
TCR, participando así en una correcta activación de las células T tras la activación vía TCR. La
modulación del TCR puede llevarse a cabo de una manera dependiente o independiente de
ligando. En el primer caso se origina por su unión al complejo MHC-péptido, o bien por métodos in
vitro mediante la estimulación con anticuerpos frente a TCR o CD3, en el segundo caso la
modulación o disminución del TCR expresado en superficie se origina in vitro por la activación
celular mediante el empleo de ésteres de forbol, como el PMA (PMA + Ionomicina).
Si atendemos al esquema del ciclo del TCR anteriormente descrito, la disminución del
TCR superficial se puede producir por un incremento en la tasa de internalización y/o
Nadia Mª Martín Blanco
36
degradación, o bien por una disminución de la tasa de reciclaje y/o síntesis de novo, o bien por
una conjunción de los cuatro fenómenos.
2.1 Mecanismos de modulación del TCR superficial.
El ciclo o tráfico celular del TCR es diferente en células no activadas y en células
activadas, estas diferencias son en cuanto a su dinámica y en cuanto a su mecanismo.
2.1.1 Diferencias en la dinámica.
En cuanto a su dinámica, en el caso del ciclo constitutivo del TCR existe un equilibrio
entre la cantidad de TCR retirado de la membrana y la cantidad de TCR aportado a esta, de tal
manera que la cantidad de TCR en membrana se mantiene constante con el tiempo, así mientras
que las células se encuentran en reposo, el 85% del TCR se encuentra en membrana y sólo un
15% aparece en compartimentos intracelulares [44]. En el caso del ciclo constitutivo, diferentes
grupos han determinado una tasa constante de degradación y de síntesis de novo del TCR en
0,0011min-1, frente a una tasa de internalización de 0,012min-1 y una de reciclaje de 0,055min-1,
estos indican que la tasa de degradación es muy baja en células sin activar [45]. El papel del ciclo
constitutivo del TCR no se conoce, pero podría representar un mecanismo por el cual se someta
al receptor a un “control de calidad”, de esta manera se ha visto que complejos con cadenas
CD3ζ defectuosas o ausentes sufren una internalización más rápida que cadenas en perfecto
estado [46], tal vez cuando la cadena ζ se encuentra en perfecto estado se reduce la accesibilidad
de la maquinaria de internalización. Otra posible función para el ciclo constitutivo del TCR sería
asegurarse la disponibilidad de un pool de TCR intracelular que pueda ser reexpresado en la zona
de estimulación en cualquier momento.
Sin embargo, cuando se produce la activación vía TCR, los niveles superficiales decrecen
drásticamente. La activación del TCR lleva a un aumento en la tasa de internalización y de
degradación respecto a células no estimuladas , así diferentes grupos han observado un aumento
de 3 a 4 veces en la tasa de internalización del TCR tras su activación [47], y un aumento en la
tasa de degradación de 3 veces [48, 49], aunque este aumento puede variar según se trate de
una u otra cadena del TCR, ya que diversos grupos defienden que la dinámica de degradación es
Introducción
37
diferente para cada cadena [50]. Otra posibilidad que también ha sido contemplada por otros
autores es que la tasa de internalización se mantenga constante y que sea solamente un aumento
en degradación y una disminución en reciclaje lo que produzca la modulación del TCR superficial
[51] , de cualquier modo la modulación del TCR dependiente de ligando debe de ser producida
por un aumento en la tasa de degradación del TCR. De esta manera, mientras que en células sin
activar la vida media del TCR es calculada en 10 horas, tras la activación la vida media del TCR
disminuye hasta 3,5 horas [49].
2.1.2 Diferencias en el mecanismo.
La internalización de receptores, en general, se encuentra mediada por la presencia de
diferentes motivos de internalización en los dominios citosólicos de los receptores. Estos motivos
pueden ser de dos tipos, motivos de tirosina del tipo YXXØ o NPXY y motivos de dileucina
(D/L)XXXL(L/I) . En el caso del TCR las cadenas CD3 γ, ζ, ε y δ presentan motivos de tirosina, y
las cadenas γ y δ contienes motivos de dileucina, cuando estos motivos se encuentran accesibles
van a ser los encargados de reclutar las proteínas necesarias para activar la maquinaria de
internalización.
Tradicionalmente se han descrito dos mecanismos diferentes para la modulación del
TCR. De esta manera el primer mecanismo lleva a la internalización y reciclaje de nuevo a la
membrana, mientras que el segundo mecanismo lleva a la internalización y degradación del TCR.
- Mecanismo de Internalización-Reciclaje: El mecanismo que lleva a la
internalización y reciclaje del TCR es dependiente de la proteín-kinasa C, así la PKC se encarga
de fosforilar la Serina 126 de la cadena CD3γ, esta fosforilación probablemente cause un cambio
conformacional en la cadena CD3γ que provocaría que el motivo de dileucina presente en esta
cadena [52] quede accesible para su unión al complejo AP-2 [53, 54], este complejo es capaz de
reclutar moléculas de clatrina que conformaran las vesículas de internalización. De esta manera,
la desfosforilación de la serina 126 por Serin/Treonin fosfatasas es necesaria para el reciclaje del
TCR de nuevo a la membrana [55]. Este mecanismo actúa durante el Ciclo Constitutivo del TCR
asi como durante la Modulacion del TCR dependiente e independiente de ligando.
Nadia Mª Martín Blanco
38
- Mecanismo de Internalización y Degradación: Al contrario que el mecanismo
anterior, este mecanismo de Internalización y Degradación aparece tras la estimulación por
ligando de TCR. En líneas generales se considera dependiente de Lck, ZAP-70 y Cbl, así la
activación del TCR lleva a la fosforilación de las secuencias ITAM de sus dominios
citoplasmáticos por la actuación de Lck [56, 57], los ITAMs fosforilados constituyen el sitio de
unión de ZAP-70 [58]. El proceso de degradación de la cadena ζ se lleva a cabo por un proceso
de ubiquitinización mediado por la ubiquitin ligasa Cbl [48, 59], debido a que no se ha
demostrado una asociación directa entre la cadena ζ y Cbl, o entre otras cadenas del TCR y Cbl,
la asociación de Cbl al complejo del TCR se debe realizar mediante la actuación de una proteína
adaptadora que actúe como un puente de unión entre el complejo del TCR y Cbl, como proteína
adaptadora se ha propuesto a ZAP-70.
Figura 6: Mecanismos de modulación del TCR.
Por tanto se han descrito dos mecanismos diferentes para el tráfico del TCR, estos dos
mecanismos coexistan tanto durante el ciclo constitutivo del TCR como durante la modulación del
TCR ya sea esta dependiente de ligando o independiente de ligando. Según las condiciones
celulares será uno u otro mecanismo en que predomine.
Introducción
39
2.2 Mecanismo del Ciclo constitutivo del TCR.
La internalización constitutiva del TCR se lleva a cabo por el mecanismo de
Internalización y Reciclaje del TCR anteriormente descrito. En este caso, la internalización
constitutiva parece ser independiente de la actividad PKC y de la Serina 126, pero dependiente de
los motivos de diLeucina de la cadena CD3γ, estos datos indican que los motivos de diLeucina
de la cadena CD3γ deben estar parcialmente expuestos a su unión con AP-2 y clatrina en células
no estimuladas, para su posterior internalización [60].
Dentro del ciclo constitutivo del TCR, además de producirse la internalización y reciclaje
del receptor, también aparece una pequeña tasa de degradación. Puesto que el mecanismo
regulado por la cadena CD3γ no lleva a la degradación del receptor, en células no estimuladas
debe existir una cierta activación del mecanismo de degradación del TCR; es posible que esta
degradación se deba a una cierta actividad basal de Lck [49], o bien podría ser causada por una
conexión entre el ciclo de reciclaje y el ciclo de degradación en lisosomas. De esta manera, se ha
comprobado que TCRs cuyas cadenas ζ son defectuosas son degradados de manera constitutiva
más rápidamente, así se propone un modelo en el cual la proteólisis de la cadena ζ enmascara
los motivos de la cadena CD3γ, llevando al TCR desde el ciclo de reciclaje hasta el de
degradación [46, 49, 61].
2.3 Mecanismos de Modulación del TCR.
La modulación del TCR o disminución de los niveles superficiales se produce tras la
activación celular, esta activación puede ser producida farmacológicamente mediante la utilización
de ésteres de forbol como el PMA, o mediante la activación por ligando del TCR. De esta manera,
la modulación del TCR se puede producir de manera independiente o dependiente de ligando.
2.3.1 Modulación del TCR independiente de ligando.
La modulación del TCR independiente de ligando se lleva a cabo por el mecanismo de
Internalización- Reciclaje del TCR. Así, tras la activación celular con esteres de forbol se produce
Nadia Mª Martín Blanco
40
un aumento en la actividad PKC que llevaría a la fosforilación de la Serina 126. Esta fosforilación
probablemente provoque un aumento en los niveles de accesibilidad del motivo de diLeucina,
aumentando así la tasa de internalización, en este caso la internalización si aparece para ser
dependiente de Serina 126 y del motivo de diLeucina. Así, la activación de PKC mediante el uso
de esteres de forbol, lleva a un acumulo del TCR internalizado en vesículas de reciclaje pero no
aumenta la tasa de degradación del TCR [62].
2.3.2 Modulación del TCR dependiente de ligando.
Un segundo mecanismo se produce tras la activación del TCR por ligando, este
mecanismo lleva a la internalización y degradación del receptor en lisosomas. En la
internalización del TCR tras su estimulación con ligando existe una gran controversia acerca de si
es dependiente o no de la actividad protein tirosin-quinasa PTK . La internalización del TCR tras
su activación por ligando necesita de un mecanismo aparentemente más complicado que en el
caso de la internalización constitutiva, de esta manera son necesarios diferentes motivos de
internalización localizados en distintas cadenas del TCR [62, 63]. Cuando se produce la activación
del TCR por ligando, no todos los complejos del TCR se encuentran directamente asociados con
su ligando, pero sí todos los complejos van a ser modulados, estén o no unidos directamente a su
ligando. Respecto a esto, algunos estudios indican que la modulación del TCR unido a ligando y
el no unido se desarrollan por mecanismos diferentes, así la modulación del TCR unido a ligando
sería independiente de la actividad PTK, sin embargo, la modulación del TCR no unido a ligando
sería dependiente de la actividad de PTK. De esta manera según la dosis de ligando utilizada
para la estimulación variará la cantidad de TCR unido directamente a ligando y con esto la
dependencia o independencia de PTK [64]. De esta manera, el TCR no unido directamente a
ligando presenta una modulación dependiente de PKC, del motivo de diLeucina presente en la
cadena CD3γ y de la fosforilación de la Serina 126 de la misma cadena, produciéndose una
internalización mediada por clatrina [65, 66]. De esta manera la estimulación del TCR por parte
del ligando provoca una activación de PTKs que activan PKC y desencadenan la modulación del
TCR no acoplado a ligando. Sin embargo, la modulación de los TCRs directamente acoplados al
ligando no se ve afectada cuando se produce la inhibición de PTKs, PKC o de endocitosis
dependiente de clatrina [64], por tanto es posible que la internalización con este tipo de ligandos
se lleve a cabo por un mecanismo independiente de clatrina. Este puede ser el motivo por el cual
Introducción
41
existe tanta controversia acerca de la dependencia de PTK o no de la modulación del TCR tras
estimulación con ligando, ya que diferentes dosis de anticuerpo a la hora de estimular las células
produce diferentes requerimientos de la actividad PTK, de esta manera una alta dosis de
anticuerpo disminuiría los requerimientos de actividad PTK, puesto que aumentaría el número de
receptores unidos directamente a ligando.
2.3.3. Degradación de TCR.
Para que se produzca la modulación del TCR tras la activación por ligando es necesario
que se vea aumentada la tasa de degradación del TCR. La degradación del TCR es mediada por
un proceso de ubiquinización llevado a cabo por la ubiquitin ligasa Cbl. ZAP-70 se ha a pesar de
ser una PTK, se ha propuesto como la encargada de reclutar Cbl al complejo del TCR, así
alteraciones que llevan a inhibición en la formación del complejo TCR-ZAP-70-Cbl, llevan a una
disminución en los niveles de ubiquitinización de la cadena ζ, y en la degradación de esta; sin
embargo esta disminución en los niveles de ubiquitinización y de degradación no es total, por
tanto otras proteínas adaptadoras podrían estar participando en este proceso [58, 67]. Por otro
lado, en células con baja actividad de Lck también se ha observado una disminución en la
degradación de la cadena ζ [56, 57] , aunque Cbl también es capaz de asociarse a Lck, y este a
los correceptores CD4 y CD8, probablemente la inhibición en la degradación de la cadena ζ
venga determinada por la actividad quinasa de Lck, ya que es esta la encargada de fosforilar los
motivos ITAMs de la cadena ζ, y esta fosforilación resulta indispensable para la unión de ZAP-70
a ζ, así ratones KO para Lck presentan altos niveles de TCR en la superficie de células DP [68].
Sin embargo alteraciones en ZAP-70 y en Lck no afectan a la modulación del TCR
superficial cuando se utilizan altas dosis de estimulación, efecto que coincide con el hecho de que
la modulación del TCR se lleva a cabo por dos mecanismos diferentes según este el receptor
asociado directamente a ligando o no; de esta manera células con baja actividad de Lck son
capaces de internalizar TCR, apareciendo el TCR retenido en endosomas citoplasmáticos, que no
son capaces de pasar a lisosomas para la degradación del complejo [69].
Otra proteína que ha sido implicada en este proceso es SLAP, que es capaz de
asociarse a la cadena ζ y a Cbl, de esta manera, ratones KO para SLAP presentan una aumento
Nadia Mª Martín Blanco
42
de TCR superficial en células DP debido a la inhibición en la degradación de la cadena ζ, SLAP
es capaz de asociarse a la cadena ζ de manera dependiente de fosforilación, por tanto parce que
la actividad de SLAP es dependiente de Lck. En ratones KO para SLAP se observa una normal
internalización del complejo del TCR, sin embargo el TCR internalizado queda retenido en
vesículas de internalización que mas tardes son recicladas de nuevo a la membrana por falta de
degradación [70, 71]. En este caso despista el hecho de que SLAP participa en la degradación del
TCR de manera independiente de ligando, y especialmente en timocitos que se encuentran en
una fase de preselección positiva, y no en células SP de timo o en células maduras de periferia,
donde la expresión de SLAP es mucho más moderada, de esta manera en ratones KO SLAP no
se lleva a cabo la disminución de los niveles superficiales de TCR durante la transición de célula
DN a DP [72]. Debido a esto es posible que la actividad de SLAP dependa de la actividad basal
de Lck que se produce en células DP de timocitos [73].
Recientemente se publicaba un trabajo en el que se proponía un modelo para la
degradación del TCR durante la etapa de pre-selección positiva, según este trabajo, la
degradación constitutiva de la cadena ζ es dependiente de una secuencia rica en prolina (PRS)
de la cadena CD3ε, esta secuencia es capaz de reclutar a una proteína adaptadora denominada
Nck, en este trabajo trabajan con ratones en los que se ha sustituido la secuencia RPPPVPNP
(PRS) de la cadena CD3ε, en los que se observa un fenotipo similar a los ratones KO para SLAP;
proponen un modelo por en el cual la zona PRS recluta a la proteína Nck, que actúa como puente
de unión con Lck, necesaria para la fosforilación de la cadena ζ, unión de SLAP y para la
degradación de la cadena ζ [74]. Puesto que la degradación descrita se realiza de manera
constitutiva, este modelo implica que la región PRS se encuentra accesible de manera
constitutiva, hecho que contradice numerosos trabajos realizados anteriormente. A este respecto
anteriormente se había demostrado por diferentes procedimientos que Nck se une a CD3ε de
manera dependiente de activación por ligando, así la unión del TCR a ligando provoca un cambio
conformacional que lleva a la exposición de la zona PRS de CD3ε y a la unión de Nck [75-77]
Por tanto, durante la degradación del TCR dependiente de ligando ZAP-70 actúa
reclutando a Cbl hacia el complejo del TCR, pero los trabajos realizados, concluyen que otras
proteínas adaptadoras pueden estar implicadas en este proceso, ya que la inhibición de ZAP-70
no provoca la inhibición total de la degradación del TCR. En este caso no es SLAP la responsable
Introducción
43
de reclutar a Cbl puesto que SLAP participa en una degradación independiente de ligando, y
además no es expresada ni en timocitos SP ni en células de periferia.
4.PROTEÍNA ADAPTADORA NUMB.
4.1 Estructura y regulación de Numb.
Numb es una proteína adaptadora de localización intracelular, con potencial para unirse
a un gran número de proteínas por diferentes motivos presentes en su estructura. Así, en su
extremo amino-terminal posee un dominio de unión a fosfotirosina o PTB y en el extremo carboxi-
terminal una zona rica en prolina o PRR que es capaz de unirse a motivos SH3. Numb contiene
también en el extremo carboxi-terminal motivos altamente conservados como DPF (aspartate-
proline-phenylalanine) y NPF (asparagine-proline-phenylalanine), que le permiten interaccionar
con motivos EH. Tanto estos dos últimos motivos, como el PTB, se encuentran altamente
conservados en todas las isoformas de Numb en vertebrados, así como en su homólogo Numblike
[78].
Existen cuatro isoformas de Numb que se designan según su peso molecular [79]; p65,
p66, p71 y p72 (Fig 8); las cuatro informas se diferencian entre sí por:
- Ausencia o presencia de un inserto de 11 aminoácidos dentro del PTB, PTBi.
- Ausencia o presencia de un inserto de 49 aminoácidos dentro de PRR, PRRi.
Figura 8: Isoformas de Numb.
Nadia Mª Martín Blanco
44
La presencia de PTBi confiere la capacidad de unirse a la membrana plasmática, por
tanto las isoformas p66 y p72 se encuentran en esta localización, mientras que las isoformas p65 y
p71 se encuentran en el citoplasma o en el núcleo. La localización de Numblike es también
citoplasmática. La expresión de las diferentes isoformas de Numb varía de un tejido a otro, así
dentro del timo las isoformas más expresadas son p66 y p65 [79], aunque funcionalmente las 4
isoformas son equivalentes en términos de división asimétrica.
Los dominios PTB aparecen en un gran número de proteínas, que actúan como
proteínas adaptadoras en diversos procesos, tales como desarrollo neuronal, inmunidad,
crecimiento celular o homeostasis de tejidos. Los PTBs se unen a proteínas por secuencias
NPXY, según la necesidad de que la tirosina esté fosforilados o no, los PTBs se pueden dividir en
dos subgrupos, PTBs dependientes de fosforilación o familia IRS-like, y PTBs independientes de
fosforilación o familia Dab-like. Dentro de esta familia se encuentra Numb, y se ha descrito que su
PTB presenta una gran versatilidad para unirse a diferentes secuencias tanto fosforiladas como
sin fosforirilar, de esta manera es capaz de asociarse a secuencias de tipo NPAY, AYIGPpYL y
GFSNMSFEDFP [80-82], algunas de las cuales difieren de la secuencia canónica de unión de los
PTB. Actualmente las proteínas que contienen PTB se pueden dividir en tres familias según su
estructura y función, las familias Shc e IRS que están principalmente implicadas en procesos de
transducción de señales desde RTKs (receptor tyrosine kinases) y receptores de citoquinas, y la
familia Dab que intervienen en procesos de endocitosis y exocitosis de receptores de membrana;
dentro de este último grupo se encuentran Numb, Numblike, Dab2 y ARH. De esta manera ARH
participa en la modulación del receptor LDLR (low density lipoprotein receptor), asociado a
mutaciones en el dominio PTB de ARH aparece el desarrollo de la enfermedad denominada
“Autosomal Recessive Hipercholesterolemia”, en pacientes con esta enfermedad se ha observado
que mutaciones en el dominio PTB de ARH llevan a una falta de internalización y degradación del
receptor LDLR, y la función del receptor pude ser restaurada mediante la expresión retroviral de
ARH1 [83-85]. El porcentaje de similitud del PTB de Numb con proteínas de su mismo grupo es
relativamente elevado, sin embargo, este porcentaje disminuye si se compara con proteínas del
tipo Shc. (Tabla 1) [86].
Introducción
45
% similitud
Numblike 68,2%
Dab2 43,9%
ARH 41,2%
SHC 25,7%
Tabla1: Porcentaje de similitud del PTB de Numb con otros PTB.
La actividad de Numb es regulada por procesos de fosforilación y desfosforilación
mediada por quinasas dependientes de Ca2+/Calmodulina [87], así tres quinasas diferentes han
sido implicadas en la fosforilación de Numb. Nak o quinasa asociada a Numb, es una
Serin/Treonin quinasa que es capaz de unirse al PTB de Numb de forma muy específica, así Nak
es capaz de fosforilar a Numb, llevando esta fosforilación a una inhibición de Numb, ya que
aumentos en la expresión de Nak llevan a un aumento en la fosforilación de Numb y al desarrollo
de un fenotipo igual que el que se desarrolla con la inhibición de Numb durante el desarrollo de
los órganos sensoriales externos en Drosophila [80]. Además se ha demostrado que la
fosforilación de Numb lleva a una disminución en su interacción con AP-2 [88], de esta manera
otra quinasa denominada AAK1 se ha visto implicada en este proceso [89]. Por último, la quinasa
aPKC también se ha relacionado con procesos de fosforilación de Numb, en este caso parece
regular la localización asimétrica de Numb durante la división de precursores del sistema nervioso
de Drosophila [90, 91]
Los niveles de Numb se encuentran regulados mediante un mecanismo de degradación
dependiente de ubiquitinización que es mediado por las ubiquitin-ligasas de tipo E3 NLX y
Mdm2, en el caso de NLX se ha demostrado que es capaz de unirse al PTB de Numb de las
isoformas p72 y p66, que son las que contienen los insertos de 11 aminoácidos dentro del PTB
(PTBi) [92, 93]. Por otra parte, también se ha demostrado que Numb es capaz de unirse a la
ubiquitin ligasa Mdm2, y que esta es capaz de regular los niveles de Numb mediante su
degradación [94].
Nadia Mª Martín Blanco
46
4.2 Funciones de Numb.
4.2.1 Proteína endocítica.
Uno de los mecanismos de internalización de receptores es el mediado por clatrina. En
este proceso participa una proteína adaptadora denominada AP-2, esta es un heterotetrámero
compuesto por dos subunidades grandes, α y β; una subunidad mediana µ 2 y una pequeña σ2.
AP-2 es capaz de unirse a la membrana plasmática, a moléculas de clatrina y a secuencias de
internalización presentes en los dominios intracelulares de receptores de membrana ( YXXΦ y
[DE]XXXL[LL] ), actuando así como una proteína adaptadora de todo el complejo de
internalización. Además AP-2 es capaz de unirse a otras proteínas necesarias para la
internalización. Otros receptores sufren una internalización, dependiente de clatrina, pero
independiente de AP-2, son receptores con secuencias de internalización de tipo FXNPXy, como
LDLR y EGFR. Diferentes trabajos han demostrado que la internalización de estos receptores no
se ve alterada cuando la actividad de AP-2 se encuentra comprometida. Así, en estos casos, son
otras proteínas, y no AP-2, las que actúan como adaptadoras para el complejo de internalización
[95].
Tanto Numb como ARH y Dab2 son capaces de actuar como proteínas adaptadoras
uniéndose a secuencias de internalización de tipo FXNPXY o NPXY y a membrana por sus
dominios PTBs, actuando así de forma semejante a como lo hace AP-2 [95, 96]. Santolini y
colaboradores describían en el 2000 [97], que Numb es capaz de unirse a la subunidad α-adaptina
de AP-2 mediante su dominio DPF. Puesto que Numb se ha visto asociado a la molecula AP-2, es
probable que Numb también participe en procesos de modulación de receptores mediados por AP-
2.
Además, Numb es capaz de interaccionar mediante sus dominios NPF con dominios EH
presentes en Eps15 , otra proteína que está implicada en procesos de endocitosis. Por otra parte,
se ha visto como Numb colocaliza con receptores, como EGFR y TfR, que están siendo
internalizados en orgánulos endocíticos, en este caso Numb parece competir con Eps15 por su
unión a vesículas de internalización, ya que no se ha detectado la presencia de las dos proteínas
simultáneamente en la misma vesícula, siendo la unión de Numb de menor afinidad que la de
Eps15. Sin embargo Numb y Eps15 si aparecen simultáneamente en endosomas que están
Introducción
47
transportando EGFR y TfR. Estos datos indican que Numb no sólo parece estar implicado en
procesos de internalización sino que probablemente actúe a diferentes niveles dentro de la ruta de
endocitosis de receptores. En este mismo trabajo vieron cómo fragmentos de Numb actúan como
inhibidores de la endocitosis; construcciones en las que se deleccionan los motivos DPF y NPF
actúan inhibiendo la endocitosis de EGFR y TfR [97].
En otro trabajo posterior, Smith y colaboradores [98], describían que Numb es capaz de
unirse a proteínas de la familia EHD/Rme1 que intervienen en procesos de endocitosis
dependientes e independientes de clatrina. Además, en este mismo trabajo describían que Numb
no solo está implicado en procesos de internalización sino también en reciclaje de receptores.
Por otro lado, parce que Numb no solo interviene en procesos de endocitosis de
receptores sino que también participa en su degradación, así se ha demostrado que es capaz de
asociarse a la ubiquitin ligasa de tipo E3 Itch y de degradar el dominio intracelular de Notch [99],
además se ha demostrado que coinmunoprecipita junto con otra ubiquitin ligasa de tipo E3, Cbl,
en timocitos [100].
Por tanto, parece que Numb es capaz de actuar en procesos de internalización
dependientes de clatrina, de manera dependiente o independiente de AP-2 y en procesos de
endocitosis independientes de clatrina. Además parece estar implicado en otros procesos que
ocurren dentro de la ruta de endocitosis tales como reciclaje [98], y degradación [99], actuando
como un regulador de los niveles de expresión superficial de estos, de esta manera puede
representar una proteína esencial para la modulación de los niveles de señalización de receptores.
En relación a esta función de Numb, también se ha demostrado que Numb es capaz de
unirse a las cadenas β3 y β5 que conforman las intergrinas, de esta manera Numb se une por su
PTB a secuencias NPXY presentes en los dominios citoplasmáticos de las cadenas β de
integrinas[101], participando así en su internalización.
Nadia Mª Martín Blanco
48
4.2.2 Modulador negativo de Notch.
Numb ha sido altamente estudiada como un inhibidor del receptor transmembranal
Notch [102], el cual está implicado en la toma de decisiones de los precursores hacia diferentes
vías de desarrollo. En mamíferos existen cuatro isoformas de Notch, Notch 1 ,2 ,3 y 4; que pueden
interactuar con cinco ligandos diferentes Deltalike 1,3 y 4, y Jagged 1 y 2.
Notch está formado por dos dominios, un dominio extracelular o NEC y un dominio
intracelular o NIC. Esta proteína es activada por la unión con sus ligandos, que se localizan en la
membrana plasmática de células adyacentes. Tras la unión de Notch con su ligando se producen
dos cortes sucesivos en el receptor, un primer corte que afecta al dominio extracelular de Notch, y
hace que el dominio intracelular quede activado, este corte se lleva a cabo por una ADAM
metaloproteasa, y un segundo corte en el dominio NIC es llevado a cabo por la γ-secretasa, que
hace que NIC se desprenda de la membrana y que se dirija hacia el núcleo; una vez allí, se asocia
con el factor de transcripción CSL. En su estado normal, CSL se encuentra asociado con co-
represores, pero en presencia de NIC se desplazan los co-represores y se reclutan co-activadores,
que estabilizan la asociación entre CSL, NIC y el ADN, por tanto NIC actúa como activador de la
transcripción de genes diana de Notch como HES 1, HES 5 y pre-Tα.
La señalización a través de Notch es minuciosamente regulada por proteínas
extracelulares, citoplasmáticas y nucleares. Los reguladores citoplasmáticos de Notch incluyen a
Numb y Deltex.
Numb actúa inhibiendo la translocación de NIC al núcleo, el PTB de Numb se une al
dominio intracelular de Notch [103], y actúa como una proteína adaptadora reclutando a una
ubiquitin ligasa de tipo E3, Itch [99], y a otros componentes de la maquinaria de degradación , de
esta forma NIC es degradado antes de ser translocado al núcleo (Fig 9), reprimiendo de esta
manera la transcripción de genes dianas de Notch.
Introducción
49
Figura 9: Regulación de la degradación del dominio
intracelular de Notch por Numb, en el caso 1 se representa la
activación de Notch tras su unión a ligando, y en el caso 2 la
degradación de NIC por Numb.
Otro mecanismo por el cual Numb podría mediar la regulación de la actividad Notch es
la endocitosis de este, así la endocitosis de cualquier receptor representa un mecanismo por el
que se regulan los niveles superficiales del receptor en membrana, regulando así la disponibilidad
de éste para ser activado por la unión a su ligando. De esta manera, Numb parece participar
también en la internalización y en la degradación de Notch mediante un proceso independiente
del proteasoma [104, 105].
4.3 Numb en el sistema inmune.
La proteína Numb fue descrita por primera vez dentro del sistema nervioso de Drosophila
como un modulador negativo de Notch y como un determinante de división asimétrica dentro del
desarrollo del sistema nervioso [106], mas tarde fue descrito su homólogo en mamíferos, mNumb
[107] y desde que se demostró que Numb también era expresado en timo [79, 108] se ha
Nadia Mª Martín Blanco
50
intentado determinar la función de Numb durante el desarrollo del sistema inmune. Puesto que
ratones deficientes en Numb mueren prematuramente durante el desarrollo, para el estudio de la
función de Numb dentro del sistema inmune se ha tenido que recurrir al uso de ratones con
delección condicional de Numb. E. Robey y colaboradores [100] veían como los ratones
condicionales para Numb no presentaban ninguna alteración en el desarrollo del sistema inmune,
apareciendo en estos ratones un fenotipo igual que el de ratones WT, probablemente debido a la
expresión de Numblike. En este mismo trabajo pudieron ver como Numb se polariza hacia la zona
de sinapsis en linfocitos periféricos tras su estimulación, y cómo Numb se encuentra unido al
complejo del TCR y co-inmunoprecipita junto con Cbl. Más tarde, en el laboratorio de Anne Wilson
[109] se analizaban ratones dobles condicionales para Numb y Numblike, apareciendo
aparentemente un leve secuestro en el desarrollo en el estadio de DN3, y no se conoce el
fenotipo que muestran estos ratones en periferia ya que estos datos no han sido publicados. En
cuanto a experimentos en los que se aumenta expresión de Numb solamente ha sido publicado
un trabajo por el laboratorio de C.J. MacGlade [110], en el que se sobreexpresa la isoforma p66
de Numb bajo el promotor de Lck, en este caso observaron una disminución en la función de
Notch, pero no vieron alteraciones en el desarrollo de timocitos. Por último, el trabajo más
recientemente publicado ha sido en el laboratorio de Steven Reiner, en el que demuestran que
los linfocitos T CD8 se dividen asimétricamente tras ser estimulados, siendo Numb heredada por
solamente una de las células hijas, además demostraron que esta división asimétrica derivaba en
la generación de dos células hijas con diferente fenotipo, por un lado se desarrollaba un fenotipo
efector en aquella célula que estaba heredando TCR y Numb, y por otro lado aparecía un
fenotipo memoria en la otra célula hija [111]. De esta manera, estos últimos datos publicados
abren una vía de investigación para determinar cuál es el papel de Numb dentro de la división
asimétrica de linfocitos T en periferia, y no solo en el desarrollo de células efectoras versus
células memoria, sino también dentro del desarrollo de una respuesta de tipo Th1 o Th2, ya que el
receptor Notch también ha sido implicado en este proceso, de esta manera la activación de Notch
parece desarrollar un fenotipo Th2 frente a Th1 debido a la activación del factor de transcripción
GATA-3 [112] , en este aspecto, la regulación que ejerce Numb sobre Notch, y la segregación
asimétrica de Numb en la división de linfocitos, podría estar implicada en el desarrollo de una
respuesta Th1 o Th2.
Con anterioridad en nuestro laboratorio hemos podido demostrar que Numb es segregado
asimétricamente durante la división de timocitos DN3, y que esta segregación asimétrica
Introducción
51
determina la vía de desarrollo que van a seguir estos timocitos, diferenciación o proliferación,
apareciendo así por primera vez el proceso de división asimétrica asociado al desarrollo del timo.
De esta manera, Numb determina el grado de proliferación de las células DNs y la celularidad
total del timo. En cuanto al mecanismo por el cual Numb media en este proceso, hemos podido
determinar que Numb participa en la modulación de la señal por pre-TCR, de esta manera
timocitos que expresan un dominante negativo para Numb presentan altos niveles de señalización
por pre-TCR, así la herencia o no de Numb por las células hijas repercute en la señalización por
pre-TCR.
Puesto que hasta el momento los intentos realizados para estudiar el papel de Numb
dentro del sistema inmune han sido infructuosos, debido probablemente a que los sistemas
propuestos hasta ahora para este estudio no parecen ser los adecuados, en este trabajo y en
otros realizados en el laboratorio pretendemos determinar la función de Numb dentro del sistema
inmune mediante el uso de ratones que expresan un dominante negativo para Numb,
constituyendo un sistema de inhibición de Numb que no había sido anteriormente utilizado.
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
Justificación y Objetivos
55
La proteína adaptadora Numb es altamente expresada tanto en timocitos como en células
T maduras, pero poco se sabe a cerca del papel que desempeña dentro del desarrollo y función
de las células T. En otros sistemas Numb ha sido descrita como una proteína endócitica que
participa tanto en procesos de internalización como de degradación de diferentes receptores, así
como una proteína que participa en la decisión delinaje durante el desarrollo mediante un proceso
de división asimétrica. Debido a esto en el laboratorio hemos intentado estudiar el posible papel
de Numb en el desarrollo de linfocitos T, de esta manera los objetivos que persigue la presente
tesis son:
- Estudio del papel de Numb durante la Selección positiva y Migración de timocitos.
- Estudio del papel de Numb en la Modulacíon de la Señalización a través del TCR en
linfocitos maduros.
- Estudio del papel de Numb en División Asimétrica de linfocitos T maduros.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Métodos
59
1. MATERIALES
1.1 Ratones transgénicos.
Para el desarrollo de este trabajo fueron empleadas dos líneas de ratones transgénicos,
una primera línea que expresa un dominante negativo para Numb, este dominante negativo está
constituido por el propio PTB de la isoforma p71 de Numb, y por la secuencia
c-myc tag humana, el transgen es expresado bajo el promotor de CD2 humano. La segunda línea
de ratones transgénicos sobreexpresa la isoforma p71 de Numb también bajo en promotor de CD2
humano, y unido a la proteína transgénica también aparece la secuencia de c-myc tag humana
(Fig 1). Los ratones utilizados para la producción de los transgénicos son C57BL/6. Los ratones
fueron creados por la Dra. Matilde Cañelles en el laboratorio de la Dra. B.J. Fowlkes en NIH y
fueron cedidos a nuestro laboratorio por la Dra. Fowlkes.
Dominante negativo de Numb: c-myc
PTB
Isoforma sobreexpresada de Numb: c-myc
PTB
1.2 Medios de cultivo.
RPMI Completo Medio RPMI 5% Suero bovino fetal inactivo 2 mM L-glutamina 50ug/ml y 50unit/ml Penicilina-Estreptomicina 50uM β-mercaptoetanol
Medio 199 Completo Medio 199 5% Suero bovino fetal inactivo 50ug/ml y 50unit/ml Penicilina-Estreptomicina
Nadia Mª Martín Blanco
60
1.3 Reactivos para tipaje de ratones
Buffer digestión de muestra 0’2% SDS 100mM Tris HCl ph 8
100mM NaCl 10mM EDTA ph 8
Reactivos de PCR 0,15 µ l Enzima Taq Biotools 3µ l Buffer de Taq 4µ l Agua DEPC
0,6 µ l DNTPs, oligonucleótidos UP y DOWN 1,2µ l MgCl2
18,72µ l Agua DEPC Buffer de carga 0’25% Azul Bromofenol
0’25% Xilencianol 30% Glicerol
Gel de agarosa 1,2% 1,8gr de Agarosa + 150ml TAE1x
1.4 Reactivos para western-blotting
Buffer Lisis celular Buffer de lisis NP40. Biosource 1mM PMSF
100µ l/ml de Cocktail de inhibidores de proteasa. Sigma
Geles 4-12% Bis-Tris Comerciales Invitrogen Buffer de Electroforesis Comercial Invitrogen Buffer de Transferencia Comercial Invitrogen Buffer de lavado PBS+tween-20 Buffer de bloqueo PBS+tween-20+5% Leche en polvo Solución de Revelado (HRP) Bio Rad
1.5 Anticuerpos para western-blotting
Ratón Anti-Myc Clon 9.E10, Upstate Conejo Anti-Numb cedido por el Dr. Weimin Zhong Conejo Anti-TCR ζ cedido por el Dr. Balbino Alarcón Ratón Anti-GADPH SIGMA Cabra Anti-CD3 epsilon cedido por el Dr. Balbino Alarcón Ratón Anti- Cbl Clon A-9, Santa Cruz Conejo Anti- Cbl Clon C-15, Santa Cruz Anti- Ig G ratón HRP Santa Cruz Anti- Ig G conejo HRP Santa Cruz Anti- Ig G cabra HRP Santa Cruz
Materiales y Métodos
61
1.6 Anticuerpos para citometria
CD25 FITC Clon 7D4, Pharmingen CD44 CYC Clon IM7, Pharmingen, CD4 FITC, BIO y PE Clon RM4-5, Pharmingen, CD8 FITC,BIO, PE y PERC Clon 53-6.7, Pharmingen TCR β PE Clon H57-597, Pharmingen, CD5 FITC Clon 53-7.3, Pharmingen CD69 FITC Clon H1.2F3, Pharmingen CD62L BIO Clon MEL-14 BD, Pharmingen CD2 BIO Clon RM2-5, Pharmingen Estreptavidina APC Anti-Biotina ,eBioscience 7-AAD Sigma
1.7 Reactivos para congelación de tejidos.
Paraformaldheido Panreac Sucrosa Sigma Compuesto O.C.T Tissue Tek Criomolde Tissue Tek
1.8 Reactivos para microscopía confocal
Paraformaldehido Panreac. Poli-L-lisina Sigma Buffer bloqueo y permeabilización 5% Normal Goat Serum. Invitrogen
3% Albumin bovine. Sigma 0’2% Triton –X- 100. Sigma
Cloruro amónico Sigma Medio de montaje Molecular Probes
1.9 Anticuerpos para microscopia confocal
Anti- CD4 Alexa 647 y 555 Clon RM4-5, Pharmingen Anti- CD8 Alexa 647 y 555 Clon 53-6.7, Pharmingen Anti- TCR Alexa 647 y 555 Clon H57-597 , Pharmingen Anti- Myc Clon 9.E10, Upstate Anti- Cbl Clon A-9, Santa Cruz Anti- Numb Clon H-70, Santa cruz Anti- Citoqueratina FITC SIGMA Anti- Armenian Hamster IgG1 Cross-linking, eBioscience anti- Ig G conejo Alexa 488 Invitrogen anti- Ig G ratón Alexa 488 Invitrogen
Nadia Mª Martín Blanco
62
Topro-3 iodide Molecular Probes
1.10 Reactivos para medida de apostosis
Anexina-V FITC Invitrogen Buffer de unión Invitrogen
2. MÉTODOS.
2.1 Ratones transgénicos.
Los cruces de ratones se realizaron entre un macho transgénico y una hembra WT con el
fin de obtener descendientes heterocigoticos, por esta razón es necesario el tipaje de todos los
ratones de cada camada nacida, ya que dentro de la misma camada puede haber ratones WT y
TG. Los cruces para la obtención de los ratones dobles transgénicos se realizaron entre un macho
TG dnNumb y una hembra TG Numb, en este caso el tipaje también era necesario ya que dentro
de la progenie podían aparecer ratones WT, TG dnNumb, TG Numb y dobles trangénicos, y fue
realizado mediante western-blot.
Todos los ratones utilizados en este trabajo fueron sacrificados con una edad
comprendida entre 4 y 12 semanas.
2.2 Tipaje de ratones.
Puesto que los cruces de ratones se realizaron entre un macho TG y una hembra WT
era necesario el tipaje de las camadas. Los tipajes se realizaron mediante la toma de muestras de
las orejas de los ratones, las muestras fueron digeridas durante dos horas con 47,5µ l de Buffer de
digestión mas 2,5µ l Proteinquinasa K a una temperatura de 55ºC y en movimiento a 1300rpm en
Termoblot, con el producto de la digestión se realizó una PCR con el fin de amplificar una
secuencia sólo presente en las proteínas transgénicas, para esto se utilizaron los siguientes
cebadores:
Materiales y Métodos
63
Forward: 5´ AACAAACTACGGCAAAGCTTCAGG 3´
Reverse: 5´ CTTCTCCCGCTTCTGTTTACGCTC 3´
El producto de la PCR fue cargado en un gel de agarosa al 1,8% y corrido durante 30
minutos, así en los ratones transgénicos podía visualizarse una banda amplificada correspondiente
a 600 pb (Fig 1).
Figura 2: Imagen de gel de agarosa en el que se han corrido
los productos de una PCR para determinar el tipaje de
ratones. Se observa una banda de 600pb en el ratón TG.
2.3 Tipaje de ratones dobles transgénicos.
Puesto que la PCR diseñada para el tipaje de ratones TG dnNumb y TG Numb no
permite diferenciar entre unos y otros ratones, el tipaje de ratones dobles trangénicos fue realizado
mediante un western blot frente a c-myc, de este modo en ratones dobles trangénicos aparecen
dos bandas de diferente peso molecular, una de menor peso molecular que corresponde al
dominante negativo de Numb, y otra de mayor peso molecular que corresponde a la isoforma p71
de Numb transgénica. Para esto, 10x106 timocitos fueron lisados en 100µ l de buffer de lisis
durante 30 minutos a 4ºC, tras esto el producto de la lisis fue centrifugado a 13000rpm durante 10
minutos, el sobrenadante producido tras la centrifugación fue recogido y reservado para la
electroforesis. 10µ l de muestra fue mezclado con 6,25µ l de buffer de carga 4X y completado el
volumen hasta 25µ l con H2O m.q., posteriormente 20µ l de cada muestra fueron cargados en un
gel NuPAGE 4-12% Bis-Tris y corridas durante 1 hora aproximadamente, tras la electroforesis se
realizó una transferencia en membrana de nitrocelulosa durante 1 hora, la membrana fue
bloqueada durante 30 minutos en agitación con leche al 5%, tras el bloqueo la membrana fue
incubada con anti-myc en agitación toda la noche, posteriormente fue lavada con PBS-Tween e
Nadia Mª Martín Blanco
64
incubada con el anticuerpo secundario durante 30 minutos en agitación, tras esto fue de nuevo
lavada con PBS-Tween, y revelada con el sustrato de la peroxidasa. (Fig2)
Figura 3: Imagen de wester blot frente a c-myc, en la que se diferencian
dos bandas de diferente peso molecular correspondientes a dnNumb y
p71 Numb. En el primer pocillo aparece una muestra de raton WT, en el
segundo TG dnNumb, en el tercero TG Numb y en el cuarto pocillo doble
TG.
2.4 Citometría de flujo para marcaje superficial e intracelular.
Una vez extraídos el timo o los nódulos estos fueron disgregados en medio Medium 199
y lavados con PBS. 1x106 células fueron teñidas durante 15 minutos a 4ºC con 10µ l de la
concentración adecuada de cada anticuerpo, tras la incubación las células fueron lavadas dos
veces con PBS y resuspendidas en 200µ l de PBS, las muestras fueron analizadas con un FACs
Calibur de Becton Dickinson (BD).
Para el caso de las tinciones intracelulares se realizaron primero las tinciones
superficiales, posteriormente se permeabilizó y fijó con el kit Cytofix/Cytoperm de BD, utilizándose
éste según las instrucciones del fabricante.
Todos los datos fueron analizados con el software FlowJo.
2.5 Medida de muerte celular por apoptosis con Anexina V.
Durante el proceso de apoptosis los fosfolípidos de membrana son translocados al
exterior de la membrana plasmática, la Anexina V es capaz de unirse a la fosfatildilserina, asi la
Materiales y Métodos
65
unión de la anexina V a membrana indica que la célula se encuentra en un estadio temprano de
apoptosis.
Una vez disgregados los órganos, timo o nódulos, las células fueron lavadas con PBS,
1x106 células fueron primero teñidas superficialmente y posteriormente se añadió 100µ l de
Binding Buffer 1X y 5µ l de Anexina V-FITC, las células se incubaron durante 5 minutos a Tª
ambiente, inmediatamente fueron analizadas con un FACs Calibur.
2.6 PCR-RT.
Extracción de ARN: Tras la disgregación de nódulos de animales WT, TG dnNumb y
TG Numb, 10x106 células de nódulos fueron empleadas para la extracción de ARN mediante el
uso de Rneasy Kit de Quiagen, el protocolo fue realizado según se indica por el fabricante.
Transformación de ARN a cDNA: Para la transformación se utilizo el kit Super
Script de Invitrogen y el protocolo fue realizado según las instrucciones del fabricante.
PCR-RT: Con el cDNA obtenido anteriormente se realizo una PCR semicuantitativa por
incorporación de SYBR Green a la doble cadena de ADN. Los datos obtenidos se analizaron
normalizando respecto al gen de referencia endógeno 18S y se realizaron las medias entre dos
replicas, los valores obtenidos para los animales transgénicos son relativos respecto al WT.
Los oligos empleados en la PCR fueron:
18S Forward: 5´ CGGCTACCACATCCAAGGAA 3´
18S Reverse: 5´ GCTGGAATTACCGCGGCT 3´
HES-1 Forward: 5´ GCCAGTGTCAACACGACACCGG 3´
HES-1 Reverse: 5´ TCACCTCGTTCATGCACTCG 3´
Nadia Mª Martín Blanco
66
2.7 Microscopia confocal. Protocolos generales.
Congelación de Tejidos: Timos aislados de ratones WT y TG dnNumb fueron
lavados con PBS frio y posteriormente fijados con paraformaldehido 4% durante 15 minutos en frio,
tras esto fueron lavados dos veces con PBS y tratados con sucrosa al 20% durante 1 hora, de
nuevo fueron lavados en PBS y los timos fueron inmersos en medio OCT para su posterior
congelación. Las secciones de tejidos fueron realizadas mediante el empleo de un criostato.
Tinción de tejidos y de células: En el caso de cortes de tejidos estos ya se
encuentran adheridos a un soporte, pero en el caso de las células previamente hay que adherirlas
a un cristal con una base de poli-L-lisina, para esto se prepara poli-L-lisina a 50 µ g/ml y se
recubren los cristales dejándolos durante toda la noche a 4ºC. Tras esto las células se echaron
sobre los cristales en una concentración de 1x106 cel/50µ l formando una gota sobre estos y se
incuban durante 30 minutos a 37ºC para que se adhieran las células a la matriz. Tras esto se
procede al protocolo de tinción que se realiza igual en el caso de tejidos y de células.
Las muestras se fijan con paraformaldehido al 4% durante 15 minutos a Tª ambiente,
posteriormente se lavan con PBS y se incuban durante 10 minutos con 50mM de NH4Cl en PBS,
tras esto se someten de nuevo a lavado con PBS, posteriormente se realizaron primero las
tinciones superficiales, y posteriormente se incuban con una solución de bloqueo y
permeabilización durante 1 hora a temperatura ambiente, tras esto se procedió a realizar las
tinciones intracelulares. Las muestras fueron montadas con medio de montaje y visualizadas con
un microscopio confocal Leica SP5.
2.8 Internalización constitutiva del TCR .
Para el estudio de la internalización del TCR independiente de ligando, células de
nódulos de ratones WT y TG dnNumb fueron aisladas y 1x106 fueron incubadas en medio RPMI
mas10µ g/ml de Cicloheximida (inhibidor de la síntesis de novo) y 10ug/ml de Brefaldin (inhibidor
de procesos de exocitosis) durante 30minutos a 37ºC. Tras esto fueron cultivadas durante
diferentes tiempos en placas de 48 pocillos con medio RPMI completo. Para cada tiempo de cultivo
las células fueron teñidas con anti-CD4, anti-CD8 y anti-TCR y analizadas con FACS.
Materiales y Métodos
67
El % de TCR internalizado a cada tiempo fue calculado con las medias de expresión
superficial de TCR y aplicando la siguiente fórmula:
%TCR internalizado = 100 - MFI de células CD4 a tiempo t x 100
MFI de células CD4 a t=0
2.9 Modulación del TCR dependiente de ligando.
Modulación del TCR superficial: Para el estudio de la modulación de los niveles
superficiales de TCR dependiente de ligando, células de nódulos fueron aisladas y 1x106
células/ml fueron cultivadas a 37ºC en medio RPMI completo con 1µ g/ml de anti-CD28 durante
diferentes tiempos, el cultivo se realizó en placas de 48 pocillos a las que había sido unido
10µ g/ml de anti-CD3. Tras diferentes tiempos de estimulación, las células fueron teñidas con
anti-CD4, anti-CD8 y anti-TCR y analizadas con FACS.
El % de TCR modulado fue calculado utilizando las medias de la fluorescencia para el
TCR superficial, y según la siguiente fórmula:
% TCR modulado= 100x MFI de células CD4 no estimuladas a tiempo t- MFI de células CD4 estimuladas a tiempo t
MFI de células CD4 no estimuladas a tiempo 0
Degradación: Para el estudio de la dinámica de degradación del TCR, células de
nódulos de ratones WT y TG dnNumb fueron aisladas y 10x106 /10ml células fueron estimuladas
con 10µ g/ml de anti-CD3 unido a placa y 1µ g/ml de anti-CD28 en frascos de cultivo durante
diferentes tiempos con medio RPMI completo. A cada tiempo de estimulación las células fueron
lavadas y los pellets de células fueron lisados con 100ul de buffer de lisis durante 30minutos a 4ºC,
con el producto de la lisis se realizó un western utilizando el mismo protocolo anteriormente
descrito. La membrana resultante se reveló primero para anti-TCR ζ, tras esto la membrana fue
stripeada con PBS-Tween+Azida 10% durante 30 minutos en agitación, tras esto fue incubada y
revelada para el segundo anticuerpo o GAPDH.
Nadia Mª Martín Blanco
68
Recuento de vesículas: Para el recuento de vesículas de TCR, células de nódulos
de ratones WT y TG dnNumb fueron aisladas y lavadas con PBS, 1x106 células fueron
resuspendidas en 50µ l de medio y puestas sobre un cristal cubierto de polilisina, los cristales
fueron incubados durante 30 minutos a 37ºC para favorecer la adhesión de las células a la matriz
de polilisina, tras la adhesión las células fueron teñidas superficialmente con anti-TCR Alexa647
durante 30 minutos en hielo, posteriormente fueron lavadas dos veces con PBS, y se las incubó
durante otros 30minutos con un anti- Armenian Hamster IgG con el fin de provocar el cross-linking
del TCR, tras esto fueron lavadas de nuevo e incubadas con 1ml de medio RPMI completo durante
1 hora a 37ºC, excepto en el caso de los controles sin estimular, que fueron mantenidos a 4ºC. La
tinción previa realizada con anti-TCR, nos permite visualizar la localización del TCR mediante
microscopía confocal y actúa como activador de la internalización del TCR. Tras la hora de
estimulación las células fueron lavadas y fijadas con paraformaldheido durante 15 minutos,
posteriormente se realizó la tinción superficial con anti-CD4 Alexa555 durante 30 minutos. Tras
esto las células fueron lavadas y preparadas para su visualización al microscopio confocal Leica
SP5. Las imágenes fueron tomadas con una resolución de 1024x1024 y con un objetivo de
inmersión de 63x.
El recuento de vesículas se realizó en los z-stacks de cada célula, y se calcularon las
medias para 50 células de WT y 69 células de TG dnNumb.
2.10 Cálculo del porcentaje de colocalización.
Para el cálculo del porcentaje de colocalización del TCR con Numb y c-Cbl se realizo la
misma estimulación y tinción anteriormente descrita en el Recuento de Vesículas, tras la tinción
superficial con anti-CD4 Alexa555, se procedió a realizar una tinción intracelular frente a Numb o c-
Cbl, para esto las células fueron permeabilizadas y bloqueadas durante una hora a temperatura
ambiente con el buffer anteriormente descrito en el apartado Materiales, tras el bloqueo fueron
teñidas con un anticuerpo primario frente a Numb o c-Cbl durante toda la noche a 4ºC,
posteriormente las células fueron lavadas y teñidas con anticuerpo secundario Alexa 488 durante 2
horas a temperatura ambiente, tras los lavados posteriores las células fueron preparadas para su
visulalización al microscopio. Las imágenes fueron tomadas con una resolución de 1024x1024 y
con un objetivo de inmersión de 63x.
Materiales y Métodos
69
Los píxeles de TCR que colocalizan con Numb o c-Cbl para cada célula fueron
analizados con el programa LAS-F, los umbrales de colocalización empleados fueron iguales para
las células de WT y de TG dnNumb, y el porcentaje de TCR que colocaliza con Numb o c-Cbl fue
calculado según la siguiente fórmula:
%TCR colocalizado= 100x Nº de píxeles de TCR que colocalizan
Nº de píxeles totales de TCR
Se calculó la tasa de colocalización para cada célula y posteriormente se halló la media
para 25 y 49 células de WT y TG dnNumb respectivamente en el caso de la colocalización con
Numb, y para 32 y 42 células de WT y TG dnNumb, respectivamente, en el caso de la
colocalización con c-Cbl.
2.11 Visualización de sinapsis inmunológica.
Para la visualización de la sinapsis inmunológica mediante microscopía confocal, las
células de nódulos de ratones WT y TG dnNumb fueron aisladas y 1x106 células fueron
estimuladas con 10µ g/ml de anti-CD3 unido a placa y 1µ g/ml de anti-CD28 en medio RPMI
completo durante una hora a 37ºC en placas de 48 pocillos, tras el tiempo de estimulación el
medio de cultivo fue retirado de los pocillos y las células fueron fijadas durante 15 minutos con
paraformaldehido 4% directamente sobre la placa, tras la fijación las células fueron lavadas con
PBS y despegadas de la placa, las células fueron resuspendidas en 50µ l de medio y depositadas
sobre cristales cubiertos de polilisina que se incubaron durante 2 horas a 37ºC, en este caso el
tiempo de incubación se prolongó debido a que las células fijadas se adhieren con mayor dificultad
a la matriz de polilisina. Tras este proceso las células se tiñeron con anti-TCR Alexa 647 y anti-
CD5 Alexa 555 superficialmente, e intracelularmente con anti-Numb Alexa 488 según el protocolo
anteriormente descrito. Tras la tinción las células fueron preparadas para su visualización con el
microscopio confocal. Esta técnica fue descrita anteriormente en el trabajo [113].
Nadia Mª Martín Blanco
70
2.12 Cálculo del porcentaje de segregación asimétrica de Numb
Células de nódulos de ratones WT, TG dnNumb y TG Numb fueron estimuladas con
5µ g/ml de anti-CD3 unido a placa y 1µ g/ml de anti-CD28 durante 72 horas, tiempo suficiente para
provocar la división de las células, tras eso las células fueron adheridas a cristales con matriz de
polilisina y teñidas con Topro, anti-CD4 y anti-Numb, según el protocolo de tinción para
microscopía confocal anteriormente descrito.
Para calcular el porcentaje segregado de Numb por cada célula hija se realizaron z-stack
con el microscopio confocal de células que se encontraban dentro de mitosis, en cada plano de la
célula se cuantificaron los píxeles totales de Numb y se sumaron los píxeles de cada plano, dando
lugar a la cantidad total de Numb en la célula en división, por otro lado se cuantifico de la misma
manera la cantidad total de Numb que heredaba una de las células hijas, mediante la construcción
de una gate que englobaba la futura célula hija, con estas cantidades relativas de Numb se
calculó el porcentaje de Numb segregado por cada célula hija con la siguiente fórmula:
% Numb heredado por célula hija 1 = Numb total heredado por la célula hija 1 X 100
Total de Numb en célula por división
% Numb heredado por célula hija 2 = 100 - % Numb heredado por célula hija 1
2.13 Purificación de células CD4 de nódulos.
Del total de células extraídas de nódulos se purificaron células CD4 utilizando un proceso
de selección negativa mediante el empleo de un Kit de Miltenyi Biotec, el protocolo se desarrollo
según las instrucciones del fabricante, una vez obtenida una fracción pura de CD4, comprobamos
que la fracción tenía una pureza mayor del 90% (Fig 4).
Materiales y Métodos
71
2.14 Coinmunoprecipitación.
Células de nódulos o timo, previamente estimuladas o no, fueron lisadas durante 30
minutos con 700µ l de buffer de lisis que contenía 20mM Tris-HCl, 138mM NaCl, 2mM EDTA, 9,5%
glicerol, 1% NP-40, 1mM Sodium Ortovanadato , 10mM NaF y 100ul por ml de inhibidores de
proteasas (Sigma). Los lisados obtenidos fueron incubados con 1,5µ l de anti-myc o 3µ l de anti-
Numb durante 2 horas a 4ºC, tras esto los lisados fueron incubados durante 1 hora con Proteina
G-Microbeads a 4ºC. Los lisados fueron pasados por columnas magnéticas, recogiendo el eluido
que pertenece a la porción de No IP, la porción IP fue recogida de la columna mediante la
utilización de Laemmli previamente calentado a 100ºC. Posteriormente se realizó la separación de
las proteínas inmunoprecipitadas mediante una electroforesis SDS-PAGE.
RESULTADOS
Resultados
75
1 EL DOMINANTE NEGATIVO DE NUMB INHIBE LA FUNCIÓN
ENDÓGENA DE NUMB.
Para estudiar el papel de Numb en el sistema inmune, en el laboratorio hemos trabajado
con dos líneas de ratones trangénicos; los ratones TG dnNumb que expresan un dominante
negativo de Numb con el fin de inhibir la función de la proteína Numb endógena, este dominante
negativo está constituido por la región PTB de la isoforma p71 de Numb y por la secuencia c-myc
tag, este dominante negativo es expresado bajo el promotor de CD2 humano, que es expresado
en células B y T desde los primeros estadios de desarrollo. Por otro lado, los ratones TG Numb
sobrexpresan la isoforma p71 de Numb bajo el mismo promotor. Esto implica que en las dos líneas
de ratones transgénicos se conserva la expresión de la proteína Numb endógena, debido a esto la
asociación de la secuencia c-myc tag a las dos proteínas transgénicas nos permite identificarlas y
diferenciarlas de la proteína Numb endógena, mediante la utilización de un anticuerpo anti-myc
tag.
Para comprobar la expresión de las proteínas transgénicas en timo de ratones TG
realizamos un western blot frente a c-myc tag, de esta manera detectamos la presencia de las
proteínas trasngénicas tanto en ratones TG dnNumb como TG Numb, siendo estas diferenciadas
por su distinto peso molecular. (Fig 1 A). Mediante citometría medimos los niveles de expresión de
CD2 en las distintas etapas de desarrollo en timo, y pudimos comprobar que la expresión aumenta
durante el desarrollo, siendo más baja en células DP que en células SP, por tanto, puesto que las
proteínas transgénicas se expresan bajo el promotor de CD2, los niveles de expresión de estas
irán aumentando durante el desarrollo de los timocitos. (Fig 1 B)
El fenotipo de ratones TG dnNumb en el timo se caracteriza por una disminución en el
número total de células respecto a ratones WT, por el contrario en ratones TG Numb, el fenotipo
de caracteriza por un aumento en el número total de células en el timo. Puesto que durante el
desarrollo del timo son las células DN las responsables de proliferar hasta alcanzar el número
definitivo de timocitos, la variación en la celularidad total del timo puede ser ocasionada por una
alteración en este estadio de desarrollo, así en el laboratorio hemos podido comprobar
anteriormente que las células DN en ratones TG dnNumb presentan una alta tasa de muerte
celular por apoptosis así como una disminución en su tasa de proliferación (Aguado, R.).
Nadia Mª Martín Blanco
76
Para descartar esta posibilidad de que además de Numb se esté inhibiendo a otras
proteínas, y poder asegurar que el fenotipo obtenido en estos ratones se debe a la inhibición de
Numb, cruzamos ratones que expresan el dominante negativo con ratones que sobreexpresan
Numb con el objetivo de restaurar el fenotipo en los ratones dobles transgénicos al aumentar la
cantidad de Numb funcional, los ratones dobles transgénicos fueron tipados mediante western blot
frente a c-myc tag, así en ratones que habían heredado las dos proteínas transgénicas se podía
detectar dos bandas de diferente peso molecular (Fig 1 A, cuarto panel). Como resultado de este
cruce obtuvimos que los ratones que expresaban las dos proteínas transgénicas eran capaces de
restaurar la celularidad total en timo, sin que aparecieran diferencias significativas con ratones WT,
de este modo podemos decir que la cantidad de Numb funcional correlaciona con la celularidad
total del timo. (Fig 1 C)
Por otro lado, Numb ha sido altamente estudiada como un inhibidor de Notch [99, 103],
de esta manera la inhibición de Numb produciría un aumento en la actividad de Notch y por tanto
un aumento en la transcripción de HES-1 (gen regulado por Notch) en timo. Con anterioridad en el
laboratorio hemos podido comprobar mediante PCR-RT, que en ratones TG dnNumb se
encuentran aumentados los niveles de HES-1, por tanto el dominante negativo de Numb produce
una inhibición de Numb endógena que lleva a un aumento en la función de Notch (Aguado, R.).
Debido a esto podemos decir que el dominante negativo de Numb empleado es capaz de
inhibir la función de Numb endógena, convirtiéndose en un buen sistema para el estudio del papel
de Numb dentro del sistema inmune.
Resultados
77
Figura 1: A. Expresión de proteínas trangénicas en timo de ratones WT,
dnNumb, Numb y dnNumbXNumb. B Niveles de expresión superficial de CD2
en ratones WT. C Celularidad total en timo de ratones WT, dnNumb, Numb y
dnNumb X Numb, los asteriscos muestran las diferencias significativas.
Nadia Mª Martín Blanco
78
2 ANÁLISIS FENOTÍPICO DEL TIMO DE RATONES TG dnNUMB Y TG
NUMB.
2.1 Fenotipo de ratones TG dnNumb.
En ratones TG dnNumb se orservó que se encuentran reducidas las poblaciones de DP y
de CD8SP en ratones TG dnNumb respecto a WT , sin embargo el número absoluto de células
CD4SP no se encuentra alterado respecto a ratones WT, pero el % de células CD4SP se
encuentra aumentado en ratones TG dnNumb (Fig 2 A primer panel y 2 B). Utilizamos la relación
entre DP/CD4SP y DP/CD8SP, como un índice de tasa de producción de células SP, ya que las
células DP son los precursores inmediatos de las células SP, así pudimos comprobar que la tasa
de producción de células CD8SP no se encontraba alterada en ratones dnNumb, es decir el
número de células CD8SP producidas en ratones TG dnNumb es normal en relación con el
número de DP que aparecen en el timo, sin embargo la tasa de producción de células CD4SP se
encuentra aumentada tres veces en ratones TG dnNumb respecto a WT (Fig 2 C) . Este aumento
en la tasa de producción de células CD4SP se refleja también en un aumento en el porcentaje de
células TCRhigh en el timo de ratones TG dnNumb respecto a WT (Fig 2 D), estas células con altos
niveles de TCR son células maduras o SP. Además, mediante microscopía confocal hemos podido
visualizar este aumento en el número de células SP dentro del timo, de esta manera en ratones
TG dnNumb se observa un aumento de células SP localizadas dentro de las áreas de médula (Fig
2 E).
2.2 Fenotipo de ratones TG Numb.
El fenotipo de ratones TG Numb se caracteriza por un aumento significativo en la
celularidad total del timo así como en las diferentes subpoblaciones, DP y SP (Fig 2A, segundo
panel), pero no aparecen alterados sus porcentajes (Fig 2B), además no aparece ninguna
alteración en las relaciones DP/CD4SP y DP/CD8SP (Fig 2C) ni en los niveles de células TCRhigh
en ratones TG Numb respecto a WT (Fig. 2 D). Por tanto a nivel fenotípico el único fenómeno
observable es un aumento en la celularidad total del timo en ratones TG Numb (Fig 2A).
Resultados
79
Nadia Mª Martín Blanco
80
Figura 2: Analisis fenotípico en timo de ratones TG dnNumb y TG Numb:
A. Números absolutos de células en timo de WT versus TG dnNumb en el
primer panel y de WT versus TG Numb en el segundo panel, WT en negro y
TG en gris. B. Citometria de flujo frente a CD4 y CD8 en células totales de
timo WT y TG dnNumb en el primer panel, en els egundo papel con una gate
para TCR high. C. Relación del número absoluto de células entre
DP/CD4SP y DP/CD8SP en ratones WT(negro), TG dnNumb (gris) y TG
Numb ( blanco). D. Niveles totales de TCR en timo, las barras indican el
porcentaje de células con niveles altos de TCR. Los asteriscos indican
diferencias significativas. E. Imágenes de secciones de timo visualizadas
con microscopia confocal, en las que se observa la zona de transición
cortico medular delimitada mediante tinción frente a citoqueratina.
Resultados
81
3 MARCADORES DE ACTIVACIÓN EN TIMO.
3.1 Alteración en marcadores de activación en células DP de ratones TG
dnNumb.
Puesto que el fenotipo observado en ratones TG dnNumb no corresponde con el fenotipo
que aparece en ratones en los que se aumenta la función de Notch, es decir aumento en la
selección positiva de células CD8SP [38], pensamos que Numb puede estar desarrollando, aparte
de su función como modulador negativo de Notch, otra función diferente a la regulación de Notch.
Para intentar dilucidar este asunto hicimos un estudio de las células DP, que son las precursoras
de las SP, para esto medimos mediante citometría de flujo la expresión de diferentes marcadores
de activación en las distintas subpoblaciones del timo, estos marcadores TCR, CD69 y CD5
aumentan sus niveles de expresión superficial en células que están dentro de la selección positiva,
siendo indicativos de la activación del TCR, así pudimos comprobar que en células DP, que son
células que aun no han entrado en selección positiva, los niveles de TCR, CD69 y CD5 no
presentan ninguna alteración en ratones TG dnNumb respecto a WT (Fig 4 B), sin embargo en un
estadio más avanzado de selección positiva, en células CD4high CD8medium, que son células cuyos
TCRs ya han sido activados [29], se observa un aumento en los niveles de expresión de TCR,
CD5 y CD69 en ratones TG dnNumb respecto a WT (Fig 4 B). En ratones TG Numb encontramos
unos niveles normales de TCR, CD5 y CD69 en células que están dentro de la selección positiva
en relación al WT (Fig 4 C). Puesto que la señalización por TCR es uno de los factores
fundamentales que intervienen en la selección positiva, este aumento en ratones TG dnNumb
podría ser indicativo de una alteración en la toma de linaje CD4 versus CD8, explicando el
aumento en la tasa de producción de células CD4SP en ratones TG dnNumb a 4 semanas de
edad. Sin embargo en ratones TG Numb la tasa de producción de células CD4 es normal, así
como los niveles de CD5, CD69 y TCR.
Por tanto, Numb no sólo interviene en la regulación de la actividad de Notch, sino que de
alguna manera contribuye a la modulación de la señalización por TCR en células que están
sufriendo selección positiva en el timo.
Nadia Mª Martín Blanco
82
Figura 4: Alteración en marcadores de selección positiva en ratones
TG dnNumb A. Gates para células DP y CD4high CD8medium en ratones
Resultados
83
WT y TG dnNumb. B Niveles de expresión de TCR, CD5 y CD69 en
células DP y CD4high CD8medium de ratones WT (línea continua) versus
ratones TG dnNumb (línea discontinua). C. Niveles de expresión de
TCR, CD5 y CD69 en células DP y CD4high CD8medium de ratones WT
(línea continua) versus ratones TG Numb (línea discontinua).
3.2 Secuestro en el timo de células CD8SP en ratones TG dnNumb.
El análisis fenotípico de nódulos en ratones TG dnNumb revela una disminución drástica
en el porcentaje de células CD8 frente a un aumento en el porcentaje de células CD4 (Fig 9 A).
Diferentes causas podrían explicar esta alteración:
En primer lugar, se puede deber a un aumento de la muerte celular por apoptosis de las
células CD8SP en timo o en nódulos. Para analizar esta posibilidad medimos los niveles
superficiales de anexina V (Fig 5), la anexina es capaz de unirse a fosfolípidos que están
presentes en la cara externa de la membrana plasmática en células que están sufriendo
apoptosis, así pudimos comprobar que ni en células de timo ni de nódulos aparecían aumentados
los niveles de anexina, o de muerte celular por apoptosis en ratones TG dnNumb respecto a WT.
Figura 5: Niveles superficiales de anexina V. A. Niveles de anexina
V para células de timo, WT (línea continua) versus TG dnNumb (línea
discontinua). B. Niveles de anexina V para células de nódulos, WT
(línea continua) versus TG dnNumb (línea discontinua).
Nadia Mª Martín Blanco
84
En segundo lugar, la ausencia de linfocitos T CD8 en nódulos podría ser causado por
una disminución en la producción de células CD8SP en timo, hipótesis también descartada, ya que
la relación DP/CD8SP en timo de ratones TG dnNumb es normal respecto a WT.
En tercer lugar, esta alteración podría ser causada simplemente por el hecho de los
números absolutos de células CD8SP producidas en timo sea menor, frente a un número normal
de células CD4SP, precursores inmediatos de células CD8 y CD4 maduras respectivamente, lo
que alteraría los porcentajes en periferia. En este caso la relación entre CD4SP/CD4 y
CD8SP/CD8 no se tendría que ver alterada. Para comprobar esto calculamos la relación entre las
células SP que se están produciendo en timo y las células maduras que aparecen en periferia, así
pudimos comprobar que para las células CD4 la relación era normal respecto al WT, sin embargo
la relación de células CD8 era mayor en ratones TG dnNumb respecto al WT, es decir en relación
al número de células CD8SP que se están produciendo en timo, el número de células CD8 en
periferia se encuentra disminuido (Fig 6).
Figura 6: Relación entre células SP/Maduras en periferia.
Relación CD4SP/CD4 en el panel de la derecha y CD8SP/CD8 en
el panel izquierdo en números absolutos de células en ratones de 4
semanas de edad WT (negro), TG dnNumb (gris) y TG Numb
(blanco).
La relación entre SP/Maduras podría considerase en este caso como una tasa de
migración desde el timo hacia nódulos, así el aumento de esta relación en el caso de células CD8
podría indicar una alteración en la tasa de migración hacia la periferia, lo que produciría un
acúmulo de células CD8SP en timo a lo largo del tiempo. Para comprobar esto, calculamos el
número absoluto de células CD8SP en el timo a diferentes edades, así pudimos ver que mientras
Resultados
85
que en ratones WT lo normal es una disminución en el número de células CD8SP por la propia
involución del timo, en ratones TG dnNumb se producía un aumento en el número absoluto de
células a 12 semanas de edad, indicando una acumulación de células CD8SP dentro del timo (Fig
7 A), sin embargo las células CD4SP presentan una dinámica de migración hacia la periferia
normal respecto a ratones WT.
Trabajos anteriores habían mostrado que en ratones que sobreexpresan CD69 durante
el desarrollo del timo se produce un secuestro de células SP en timo [114, 115], para comprobar si
en nuestro caso se producía el mismo fenómeno medimos los niveles superficiales de CD69 en
células SP maduras, pudimos comprobar que en células CD8SP de ratones TG dnNumb se
encontraban aumentadas los niveles superficiales de CD69 respecto a ratones WT, pudiendo ser
este el mecanismo por el cual las células quedan retenidas en timo (Fig 7 B). Por otro lado, las
células SP maduras cuando salen hacia la periferia expresan altos niveles de CD62L, aunque la
expresión de CD62L no es necesaria para la migración de los timocitos, si es imprescindible para
su entrada en órganos periféricos [116] , en ratones TG dnNumb hemos podido observar un
aumento en el número de células CD8SP que expresan niveles bajos de CD62L (Fig 7C).
Nadia Mª Martín Blanco
86
Figura 7: Retención de CD8SP en timo de ratones TG dnNumb. A. Números
absolutos de células CD8SP y CD4SP en timo a diferentes edades de ratones
WT (negro) y TG dnNumb (gris).B. Niveles superficiales de TCR en células
CD4SP y CD8SP y niveles superficiales de CD69 en células con TCRhigh
(maduras) WT (línea continua) versus TG (dnNumb línea discontinua). C.
Niveles superficiales de CD62L en células CD4SP y CD8SP con TCRhigh de timo
WT (línea continua) versus TG (dnNumb línea discontinua).
Resultados
87
Por tanto, debido a la alteración de los números absolutos de células CD4SP y células
CD8SP en timo, se produce una alteración en la relación CD4SP/CD8SP, como es lógico esto
lleva a una alteración en el mismo sentido de la relación CD4/CD8 por ser las células SP sus
precursores, pero en nuestro caso a esta alteración lógica se le suma el hecho de que las células
CD8SP quedan retenidas en el timo lo que acentúa aun más la alteración en la relación CD4/CD8
en nódulos (Fig 9, página X)
4. ANÁLISIS FENOTÍPICO DE LOS NÓDULOS LINFÁTICOS EN
RATONES TG dnNUMB Y TG NUMB.
4.1 Expresión de proteínas transgénicas en nódulos de ratones TG dnNumb y
TG Numb, modulación de la actividad de Notch en nódulos de ratones TG .
De la misma manera que en timo, en nódulos hemos trabajado con dos líneas de ratones
transgénicos, TG dnNumb y TG Numb. Para comprobar la expresión de las proteínas
transgénicas, tanto la del dominante negativo como la de la isoforma p71 de Numb, realizamos un
western blot en células de nódulos frente a c-myc tag (Fig 8A), así pudimos comprobar que igual
que en timo, en nódulos también se produce la expresión de las proteínas transgénicas, además
pudimos ver que los niveles de expresión de estas eran parecidos a los que aparecen en células
SP de timo, ya que los niveles de CD2 son iguales entre células de la periferia y células SP de timo
(Fig 8 B). Por otro lado hemos podido comprobar que no existen diferencias en la expresion de
Numb entre linfocitos T CD4 y CD8 (Fig 2D).
Puesto que con anterioridad en el laboratorio habíamos comprobado que la inhibición de
Numb en los ratones TG dnNumb provocaba un aumento en los niveles de HES-1 en el timo,
quisimos comprobar que en nódulos ocurría el mismo fenómeno, así mediante PCR-RT
cuantificamos la cantidad de HES-1 en ratones WT, TG dnNumb y TG Numb, así igual que ocurre
en el timo se produce un aumento de HES-1 en ratones TG dnNumb, y en ratones TG Numb se
produce el fenómeno contrario, una disminución de los niveles de expresión de HES-1 debido a
que la sobreexpresión de Numb inhibe la actividad de Notch (Fig 8 C).
Nadia Mª Martín Blanco
88
Figura 8: A. Expresión de las proteinas transgénicas dnNumb y Numb
p71. B. Niveles de expresión superficiales de CD2 en células CD4 y CD8
de ratones WT. C. Niveles relativos de ARN-m de HES-1 en ratones WT,
TG dnNumb y TG Numb. D.Niveles de expresion de Numb en células CD4
y CD8 purificadas de nódulos de ratones WT.
4.2 Alteración en la relación CD4/CD8 en nólulos en ratones TGdnNumb.
La retención de células CD8SP en el timo produce, como es lógico, un disminución
drástica en el porcentage de células CD8 frente a un aumento en el porcentaje de CD4, sin
embargo este aumento en el porcentaje de células CD4 se debe a la reducción en el número de
CD8 ya que los números absolutos de CD4 no se ven alterados en ratones TG dnNumb. Esta
alteracion en los porcentajes y en los números absolutos provoca una alteración en la relación
CD4/CD8 (Fig 9 A y B). Esta alteración no se obsrva en ratones TG Numb.
Resultados
89
Figura 9: Análisis fenotípico en nódulos. A Citometría de flujo en células
extraídas de nódulos frente a CD4 y CD8. B. Relación en números
absolutos entre CD4/CD8 en nódulos para ratones WT, TG dnNumb y TG
Numb.
4.3 Alteración en la relación de células Virgenes/Efectoras-Memoria en ratones
TG dnNumb
Lo siguiente que quisimos estudiar fue el fenotipo que presentan las células T en
periferia, en ratones WT se mantiene una relación entre el número de células T vírgenes y en
número de células T con fenotipo efector-memoria dirigida por el fenómeno conocido como
homeostasis [117]. De esta manera en animales jóvenes en los que aparece un timo muy
desarrollado las células de la periferia son predominantemente células T vírgenes, por el contrario
en animales de más edad cuando el timo involuciona, el pool de células T en periferia está
constituido por una gran proporción de células memoria. Es conocido que este fenómeno se
agrava cuando se produce en periferia una disminución de células T, algunos autores denominan a
Nadia Mª Martín Blanco
90
este proceso proliferación inducida por linfopenia o LIP. Para analizar el fenotipo de las células T
en nódulos aislamos células de nódulos de ratones de cuatro semanas de edad e hicimos una
citometría de flujo frente a CD44 y CD62L, de esta manera se pueden diferenciar las células con
fenotipo virgen; CD44low CD62Lhi, de células con fenotipo efector-memoria; CD44hi CD62Llow [118].
Así pudimos observar que en ratones TG dnNumb se produce un aumento en el porcentaje de
células CD4 con fenotipo virgen frente a un aumento en células CD8 con fenotipo efector-memoria
respecto a WT, alterando la relación entre Naive/Efectora-Memoria. (Fig 10 A y B).
Puesto que las células CD44hi CD62Llow, pueden ser células efectoras o bien un tipo de
células memoria denominados TEM, para poder comprobar si este aumento en células CD8 con
fenotipo efector-memoria se debía a un aumento en el número de células efectoras o bien a un
aumento en el número de células memoria, hicimos una citometría de flujo frente a CD44 y CD25,
de esta manera podemos diferenciar entre los tres fenotipos posibles, siendo las células T
vírgenes CD44low CD25low, las células efectoras CD44hi CD25hi, y las células memoria CD44hi
CD25low [118]. Así, pudimos comprobar que este aumento de células CD8 con fenotipo efector-
memoria se debía a un aumento en el número de células memoria (Fig 11).
Por tanto, la mayoría de las células CD8 de ratones TG dnNumb que aparecen en
periferia presentan un fenotipo memoria, mientras que las células CD4 son mayoritariamente
células T vírgenes.
En cuanto a ratones TG Numb no hemos observado ninguna alteración significativa en el
fenotipo adoptado por las células T en periferia.
Resultados
91
Figura 10: Fenotipo de células T en nódulos. A. Citometría de flujo frente a
CD44 y CD62L de células CD4 y CD8 en ratones WT, TG dnNumb y TG Numb
de cuatro semanas de edad, los números representan el tanto por ciento de
células CD44lowCD62hi y de células CD44hiCD62Llow. B Relación entre
porcentajes de células con fenotipo virgen/efector-memoria.
Nadia Mª Martín Blanco
92
Figura 11: Aumento en el porcentaje de células CD8 memoria en
ratones TG dnNumb. Citometría de flujo para células CD8 de
nódulos de ratones WT y TG dnNumb frente a CD25 y CD44, los
números indican el porcentaje de células contenido en cada gate.
5. MODULACIÓN DE LOS NIVELES SUPERFICIALES DE TCR.
Puesto que Numb ha sido descrita con anterioridad como una proteína adaptadora que
interviene en procesos de endocitosis y de degradación de receptores de membrana como EGFR
y Tfr [97], y puesto que anteriormente hemos descrito una alteración de los niveles de TCR en
timocitos que están sufriendo selección positiva, pensamos que Numb podría estar implicada en la
modulación de los niveles superficiales de TCR. El TCR que se expresa en la superficie está
continuamente siendo internalizado de manera constitutiva, este TCR internalizado puede de
nuevo ser reciclado hacia la membrana o puede dirigirse hacia lisosomas donde es degradado,
manteniéndose así constantes los niveles de TCR superficiales, sin embargo tras la estimulación
del TCR se produce una drástica disminución de los niveles superficiales de TCR, producida por
un aumento en la tasa de internalización y/o en la tasa de degradación.
5.1 Dinámica normal del ciclo constitutivo del TCR en ratones TG dnNumb.
En primer lugar pudimos comprobar que los niveles de TCR superficial en células CD4
de nódulos no se encuentran alterados en ratones TG dnNumb respecto a WT (Fig 12 B), siendo
esto un indicativo de que la tasa de internalización constitutiva del TCR no se encuentra alterada,
Resultados
93
para comprobar esta hipótesis medimos la tasa de internalización del TCR a diferentes tiempos,
para ello células de nódulos fueron cultivadas a 37ºC en presencia de cicloheximida y brefeldin A
con el objetivo de inhibir la síntesis de novo y el reciclaje de vesículas hacia la membrana, a cada
tiempo de estimulación se midieron los niveles superficiales de TCR mediante citometría de flujo
(Fig 12 B), así pudimos comprobar que esta no se encuentra afectada en ratones TG dnNumb.
Estos datos explicarían que los niveles de TCR en células CD4 de nódulos no se encuentren
alterados, así como que los niveles de TCR en células DP de ratones TG dnNumb sean también
normales, ya que en este estadio de desarrollo las células DP aún no han sido estimuladas a
través del TCR.
Figura 12: Internalización constitutiva del TCR. A Niveles superficiales
de TCR en células CD4 de nódulos, WT (línea continua) versus TG (línea
discontinua). B. Dinámica de la internalización del TCR a diferentes
tiempos de cultivo, WT (línea continua) versus TG (línea discontinua).
Nadia Mª Martín Blanco
94
5.2 Alteración de la modulación del TCR dependiente de ligando en ratones TG
dnNumb.
Puesto que en la modulación de los niveles superficiales de TCR dependiente de ligando
participa un segundo mecanismo diferente al mecanismo que participa en el del ciclo constitutivo
del TCR [64], era lógico pensar que Numb podría afectar a la modulación dependiente de ligando,
aunque no fuese así con el ciclo constitutivo. Además, anteriormente habíamos observado una
alteración en los niveles de TCR en células DP de timo que están dentro de la selección positiva o
que han sido activadas por TCR. Para estudiar este punto, estimulamos células extraídas de
nódulos con 10 µ g/ml de anti-CD3 unido a placa y con 1 µ g/ml de anti-CD28 a diferentes tiempos,
tras los diferentes tiempos de estimulación medimos por citometría de flujo los niveles superficiales
de TCR, y calculamos el porcentaje de TCR modulado según se explica en el apartado de
métodos, de esta manera pudimos comprobar que la modulación del TCR se producía de manera
más rápida en ratones TG dnNumb respecto a WT durante tiempos cortos de estimulación (Fig 13
C), sin embargo cuando el tiempo de estimulación se ampliaba hasta 12 horas, se observaba un
aumento de los niveles de TCR superficial en ratones TG dnNumb respecto a WT (Fig 13 A).
Además este aumento del TCR también se observó cuando se midieron los niveles totales de TCR
tras 12 horas de estimulación mediante el empleo de tinción intracelular y superficial
simultáneamente (Fig 13 B).
Resultados
95
Figura 13: Modulación del TCR dependiente de ligando. A. Niveles
superficiales de TCR en células CD4 de nódulos tras 12 horas de
estimulación en ratones WT (línea continua) versus ratones TG dnNumb
(línea discontinua). B. Niveles totales de TCR en células CD4 de nódulos
tras 12 horas de estimulación en ratones WT (línea continua) versus ratones
TG dnNumb (línea discontinua). C. Representación grafica de la dinámica
de modulación del TCR en células CD4 de nódulos a diferentes tiempos de
estimulación en ratones WT (línea continua) versus ratones TG dnNumb
(línea discontinua).
El aumento tanto de TCR superficial como del TCR total tras 12 de horas de
estimulación, puede ser explicado mediante dos hipótesis, en primer lugar, puede ser producido
por una falta de internalización del TCR hacia el citoplasma, y en segundo lugar, por una inhibición
en la degradación del TCR, puesto que la primera hipótesis queda descartada por el hecho de que
Nadia Mª Martín Blanco
96
a tiempos cortos de estimulación la modulación del TCR se produce de manera más rápida en
ratones TG dnNumb respecto a WT, lo que indica que no existe una falta de internalización,
quisimos comprobar la segunda hipótesis. Para esto estimulamos a diferentes tiempos células
extraídas de nódulos con anti-CD3 unido a placa y anti-CD28, tras la estimulación se realizó un
western blot frente a la cadena ζ del TCR, así pudimos comprobar que la degradación de la
cadena ζ del TCR se encontraba parcialmente inhibida en ratones TG dnNumb respecto a WT
(Fig 14).
Figura 14: Degradación del TCR. Dinámica de degradación de la
cadena ζ del TCR en células de nódulos estimuladas a diferentes
tiempos.
Por tanto, aunque el ciclo constitutivo del TCR no aparece afectado en ratones TG
dnNumb, sí se produce una alteración en la modulación del TCR dependiente de ligando debido a
una inhibición en la degradación del TCR.
5.3 Aumento en el número de vesículas de TCR en el citoplasma
La inhibición parcial de la degradación del TCR explica el aumento de los niveles de TCR
superficial y total, pero no aclara el hecho de que a tiempos cortos de estimulación se produzca
una modulación más rápida del TCR en ratones TG dnNumb, por esto pensamos que la inhibición
en la degradación del TCR podría alterar la tasa de reciclaje a la membrana, quedando retenidas
las vesículas de TCR en citoplasma, para comprobar esta hipótesis utilizamos la microscopía
Resultados
97
confocal con el fin de analizar el número de vesículas citoplasmáticas de TCR tras estimulación.
Para esto, células de nódulos fueron aisladas e incubadas con anti-TCR Alexa 647, tras el cross-
linking del TCR las células fueros cultivadas a 37ºC durante una hora, la tinción con TCR y su
posterior cross-linking nos sirve no sólo para poder visualizar el TCR sino de activación de la
internalización del TCR, por tanto las vesículas de TCR observadas representan el TCR
internalizado tras su unión a ligando, así pudimos observar que tras una hora de estimulación se
producía un aumento significativo de vesículas citoplasmáticas de TCR en células CD4 de ratones
TG dnNumb respecto a ratones WT(Fig 15).
Figura 15: Aumento en el número de vesículas retenidas en
citoplasma en ratones TG dnNumb. A Imágenes de microscopia
confocal de células CD4 de nódulos de ratones WT y TG dnNumb,
células no estimuladas en el primer panel y estimuladas en el segundo
panel, en rojo el TCR y en verde CD4. B. Recuento del número total de
vesículas de TCR por célula en linfocitos T CD4 de ratones WT y TG
dnNumb.
Nadia Mª Martín Blanco
98
5.4 El dominante negativo de Numb compite con Numb endógena por su unión
al complejo del TCR tras la estimulación de éste.
Por tanto Numb parece tener un papel directo en la modulación de los niveles superficiales
de TCR tras estimulación con ligando, para comprobar esto utilizamos microscopia confocal con
el fin de intentar visualizar una colocalización entre Numb y el complejo del TCR tras la activación.
Con este fin células de nódulos WT fueron teñidas con anti-TCR Alexa 647 y cultivadas durante
una hora a 37ºC tras el cross-linking, posteriormente fueron permeabilizadas y teñidas frente a
Numb , de esta manera pudimos observar una colocalización entre Numb y el complejo del TCR
en ratones WT (Fig 16).
Figura 16: Asociación de Numb al complejo del TCR tras activación. Imágenes
de microscopia confocal de células CD4 de nódulos en las que se observa la
colocalización entre vesículas de TCR y Numb en ratones WT. Las flechas
indican los puntos de colocalización de Numb con vesículas de TCR.
Mediante la misma técnica empleada anteriormente pudimos comprobar la localización del
dominante negativo de Numb en ratones TG dnNumb, en este caso utilizamos un anticuerpo frente
a c-myc tag humana para detectar la presencia del dominante negativo de Numb, así pudimos
observar que el dominante negativo se localizaba en el complejo del TCR tras la activación del
mismo. Estos datos podrían indicar que el dominante negativo de Numb compite con la proteína
Numb endógena por su unión al complejo del TCR (Fig 17). Además probablemente Numb se une
al complejo del TCR a través de su dominio PTB, ya que el dominante negativo mantiene su
capacidad para colocalizar con el complejo del TCR.
Resultados
99
Figura 17: Localización del Numb dominante negativo. Imágenes de
microscopia confocal de células CD4 purificadas y estimuladas
durante una hora en las que se observa la colocalización entre
vesículas del TCR y dnNumb. En el panel superior se muestran células
WT como control negativo de la tinción frente al dominante negativo.
5.5 Disminución en la colocalización entre Numb y TCR en ratones TG
dnNumb.
Esta competencia entre Numb y su dominante negativo por unirse al complejo del TCR,
produciría una disminución en la asociación entre la proteína Numb endógena y el complejo del
TCR en ratones TG dnNumb, para comprobar esto, medimos el porcentaje de colocalización del
TCR con la proteína Numb endógena en células activadas durante una hora de ratones WT y de
ratones TG dnNumb utilizando la misma técnica anteriormente descrita, en este caso utilizamos un
anticuerpo frente a Numb que reconoce la región carboxi-terminal de Numb, por tanto el anticuerpo
no reconoce al dominante negativo de Numb, sino que solo se une a la proteína Numb endógena,
de esta manera pudimos comprobar que en ratones TG dnNumb se reducía el porcentaje de TCR
que colocalizaba con Numb en células CD4 estimuladas (Fig 18 A y B).
Nadia Mª Martín Blanco
100
Figura 18: Tasa de colocalización entre TCR y Numb: A. Imágenes de
microscopía confocal de células CD4 tras una hora de estimulación en las
que se observa la colocalización de TCR y Numb. B. Cuantificación del %
TCR que colocaliza con Numb en células CD4 de ratones WT y TG dnNumb
calculado según se describe en Materiales y Métodos.
Por tanto Numb colocaliza con el complejo del TCR tras la estimulación por ligando, siendo
necesario para esta localización el dominio PTB, puesto que el dominante negativo empleado está
constituido por el propio PTB de Numb y este sigue manteniendo su capacidad para colocalizar
con el complejo del TCR, de esta manera Numb y su dominante negativo compiten por la unión al
complejo, disminuyendo la cantidad de Numb endógena que es capaz de unirse al complejo del
TCR.
Resultados
101
5.6 Numb y su dominante negativo coinmunoprecipita con CD3ε tras la
activación del TCR por ligando.
El PTB de Numb tiene la capacidad de unirse a secuencias de internalización NPXY
presentes en los dominios intracitoplasmáticos de diferentes receptores [81]. Puesto que
anteriormente habíamos demostrado que tanto Numb como el dominante negativo colocalizan con
el complejo del TCR, quisimos estudiar a qué cadena de éste son capaces de asociarse. Puesto
que la cadena CD3ε s la única cadena que presenta un dominio canónico de unión al PTB, NPXY
(Human protein reference database), fue el primer candidato para estudiar su asociación con Numb y
con el dominante negativo, para ello células totales de timo de ratones WT fueron lisadas y se
realizó una inmunoprecipitación para Numb mediante la cual pudimos comprobar que una pequeña
fracción de Numb se encuentra asociada a CD3ε (Fig 19 A). Puesto que dentro de la población
total del timo solo una pequeña porción de células se encuentra activada, pensamos que la
asociación de Numb a CD3ε podría ser dependiente de estimulación, así quisimos comprobar si la
estimulación con ligando aumentaba la fracción de Numb unida a CD3ε, para esto células de
nódulos de ratones WT y TG dnNumb fueron estimuladas con anti-CD3 unido a placa durante 4
horas. Tras el tiempo de estimulación las células fueron lisadas y se realizó una
inmunoprecipitacion de Numb, de esta manera pudimos comprobar que en células sin estimular
Numb no aparece asociado a CD3ε, sin embargo tras la estimulación por ligando CD3ε es capaz
de inmunoprecipitar junto con Numb (Fig19 B). Puesto que anteriormente habíamos comprobado
por microscopia confocal que el dominante negativo mantiene su capacidad para colocalizar con el
complejo del TCR, quisimos realizar el mismo experimento para el dominante negativo, para esto
células de nódulos de ratones WT y TG dnNumb fueron estimuladas con anti-CD3 unido a placa
durante 4 horas, tras el tiempo de estimulación las células fueron lisadas y se realizó una
inmunoprecipitación del dominante negativo mediante la utilización de un anti-myc, así pudimos
observar que el dominante negativo actúa de la misma manera que Numb endógeno, es decir es
capaz de coinmunoprecipitar con CD3ε tan solo en células estimuladas (Fig 19 C). Por tanto, estos
datos indican que la coinmuoprecipitación de CD3ε con Numb es dependiente de la estimulación
del TCR por ligando, y del dominio PTB de Numb.
Nadia Mª Martín Blanco
102
Figura 19: Numb y dnNumb coinmunoprecipitan con CD3ε
dependientemente de activación por ligando: A. Células totales de timo WT
en las que fue inmunoprecipitado Numb. El producto de la
inmunoprecipitación fue separado por western blot y revelado frente a
CD3ε y Numb. B. Células de Nódulos de ratones WT estimuladas durante 4
horas y sin estimular, en las que fue inmunoprecipitado Numb, el producto
de la inmunoprecipitación fue separado por western blot y revelado frente a
CD3ε y Numb. C .Células de nódulos WT y TG dnNumb estimuladas y sin
estimular en las que fue inmunoprecipitado el dominante negativo con anti
c-myc, el producto de la inmunoprecipitación fue separado por western blot
y revelado frente a CD3ε y c-myc.
Resultados
103
5.7 Disminución en la tasa de colocalización entre TCR y Cbl en ratones TG
dnNumb.
En condiciones normales la proteína Numb endógena se uniría al complejo del TCR
mediante su PTB y actuaría como una proteína adaptadora reclutando mediante su dominio
carboxi-terminal a otras proteínas necesarias para la correcta modulación del TCR. Este modo de
actuación ha sido descrito con anterioridad para la modulación de Notch, en este caso Numb se
une por su dominio PTB al dominio IC de Notch y mediante su dominio carboxi-terminal es capaz
de reclutar a la ubiquitin ligasa Itch [103], en el caso del TCR la ubiquin ligasa encargada de su
degradación es Cbl, y debido a que anteriormente habíamos descrito que en ratones TG dnNumb
se encuentra alterada parcialmente la degradación del TCR, quisimos abordar el estudio de este
posible mecanismo de actuación de Numb en la modulación del TCR .
Nadia Mª Martín Blanco
104
Figura 20: Tasa de colocalización entre TCR y Cbl: A. Imágenes de
microscopía confocal de células CD4 incubadas durante una hora tras el
cross-linking del TCR en las que se observa la colocalización de TCR y Cbl. B.
Cuantificación del % TCR que colocaliza con Cbl en células CD4 de ratones
WT y TG dnNumb tras una hora de estimulación, el % de colocalización fue
calculado según se describe en Materiales y Metodos.
Para abordar esta cuestión utilizamos microscopía confocal con el fin de cuantificar el
porcentaje de asociación entre el TCR y Cbl en células que habían sido estimuladas durante una
hora tras el cross-linking del TCR, de esta manera pudimos ver que en ratones TG dnNumb
disminuía el porcentaje de TCR que colocalizaba con Cbl. Esta disminución en la tasa de
reclutamiento de Cbl hacia el complejo del TCR explica la parcial inhibición en la degradación de la
cadena ζ observada con anterioridad, puesto que es Cbl la ubiquitin ligasa encargada de la
degradación del TCR. (Fig 20 A y B).
5.8 El dominante negativo de Numb no es capaz de unirse a la ubiquitin ligasa
Cbl.
Anteriormente se había demostrado que Numb coinmunoprecipita junto con Cbl en
timocitos [100], de esta manera nosotros hemos sido capaces de reproducir estos datos en nuestro
laboratorio (Fig 21 A), sin embargo, hemos podido demostrar mediante el empleo de la misma
técnica que el dominante negativo de Numb pierde la capacidad de unirse a Cbl, indicando que Cbl
se une a Numb mediante el dominio carboxi terminal de éste. Puesto que este dominio no se
encuentra presente en el dominante negativo, éste pierde la capacidad de coinmunoprecipitar con
Cbl (Fig 21 B). De esta manera Numb actúa en la degradación del TCR del mismo modo que
opera en la degradación del dominio intracelular de Notch.
Resultados
105
Figura 21: El dominante negativo no es capaz de unirse a Cbl. A.
Inmunoprecipitación de Numb en timocitos de ratones WT, western blot para
Cbl y Numb B. Inmunoprecipitación del dominante negativo en timocitos de
ratones WT y TG dnNumb, western blot para Cbl y el dominante negativo.
5.9 Los niveles endógenos de Numb aumentan ligeramente durante la
estimulación de linfocitos T.
Con los experimentos expuestos anteriormente hemos demostrado que Numb participa
en la degradación del TCR tras la estimulación por ligando de linfocitos. Para comprobar como se
comporten los niveles endógenos de Numb durante la estimulación de linfocitos T, células de
nódulos fueron extraídas y estimuladas durante 4 y 6 horas con anti-CD3 unido a placa y anti-
CD28, tras los diferentes tiempos de estimulación las células fueron lisadas y se analizó la
cantidad total de Numb en cada tiempo mediante western blot (Fig 22). Los resultados obtenidos
indican que durante la estimulación de linfocitos T, los niveles de Numb endógeno aumentan
ligeramente.
Nadia Mª Martín Blanco
106
Figura 22: Los niveles de Numb no varían durante la estimulación de
linfocitos T. Células de nódulos totales de ratones WT estimuladas
durante 4 y 6 horas. Western frente a Numb, Cadena ζ y GAPDH.
5.10 Normal modulación de los niveles superficiales de TCR en ratones que
sobrexpresan Numb.
Para comprobar si la sobreexpresión de Numb afecta a la modulación de TCR
dependiente de ligando, células de nódulos extraídas de ratones TG Numb y WT fueron
estimuladas durante 12 horas con anti-CD3 unido a placa y anti-CD28, tras este tiempo de
estimulación se midieron por citometría los niveles superficiales y totales de TCR en células CD4
(Fig. 23 A y B), así pudimos comprobar que en relación al WT la modulación del TCR dependiente
de ligando no se encontraba alterada en ratones que sobreexpresan Numb. Además de presentar
una modulación normal respecto a WT, también comprobamos que la degradación de la cadena
CD3ζ era normal en ratones TG Numb, para esto células de nódulos fueron estimuladas durante 4
y 6 horas con anti-CD3 unido a placa y anti-CD28, tras la estimulación los niveles de CD3ζ fueron
analizados mediante western blot (Fig. 23 C).
Resultados
107
Figura 23: Modulación del TCR en ratones TG Numb: A. Niveles superficiales
de TCR en células CD4 de nódulos tras 12 horas de estimulación (WT línea
continua y TG línea discontinua). B. Niveles totales de TCR en células CD4 de
nódulos tras 12 horas de estimulación (WT línea continua y TG línea
discontinua). C. Dinámica de degradación de la cadena CD3ζ en células totales
de nódulos a diferentes tiempos de estimulación.
5.11 Alteración en la polarización de Numb hacia la zona de sinapsis.
Puesto que hemos podido comprobar con anterioridad que el dominante negativo de
Numb compite con Numb endógena por unirse al complejo del TCR, pensamos que este fenómeno
podría estar alterando la polarización de Numb hacia la zona de sinapsis, hecho que anteriormente
ha sido demostrado en otros trabajos [100, 111]. Para comprobar esta hipótesis inducimos en
células CD4 de nódulos la polarización del TCR mediante una estimulación con anti-CD3 unido a
placa, mediante este sistema de estimulación conseguimos que el TCR se una a ligando
solamente en la zona de contacto entre la células y la placa, provocando la polarización del TCR
hacia esta zona de activación [113]. Tras la activación celular pudimos observar mediante
microscopia confocal que en ratones WT se producía una migración de Numb hacia la zona de
polarización del TCR, por el contrario en ratones TG dnNumb no se observaba esta polarización y
Numb quedaba simétricamente localizada en toda la membrana plasmática (Fig 24).
Nadia Mª Martín Blanco
108
Figura 24: Polarización de Numb durante la sinapsis inmunológica:
Imágenes de microscopía confocal que muestran células CD4 de nódulos
durante la sinapsis inmunológica, en las que se observa la polarización o
no de Numb hacia la zona de sinapsis.
Pudimos comprobar que las sinapsis observadas eran sinapsis maduras analizando por
microscopia confocal la polarización de la tubulina, otra de las proteínas que se polarizan durante
la sinapsis inmunológica.
Figura 25: Polarización de tubulina hacia la zona de sinapsis.
Células CD4 de ratones WT en las que se observan sinapsis
maduras.
Resultados
109
6. SEGREGACIÓN DE NUMB DURANTE LA DIVISIÓN DE
LINFOCITOS T CD4 MADUROS.
La proteína Numb ha sido descrita anteriormente en numerosos trabajos como una
proteína que se segrega asimétricamente durante la división celular en el desarrollo del sistema
nervioso, y que influye de esta manera sobre la diferenciación de las células hijas [119],
participando así en procesos de división asimétrica. Pero no solo se ha visto implicada en el
desarrollo del sistema nervioso, en cuanto al sistema inmune, Numb migra hacia la zona de
sinapsis inmunológica colocalizando con TCR y Notch [100], y se ha descrito con anterioridad que
Numb se segrega asimétricamente durante la división de células CD8 [111].
Previamente en otros trabajos realizados ya se había descrito que Numb se segrega
asimétricamente durante la división de linfocitos T CD8 [111], por esto quisimos comprobar si esta
distribución asimétrica de Numb también se producía durante la división de linfocitos T CD4. Para
comprobar esto, estimulamos células aisladas de nódulos con anti-CD3 unido a placa y anti-CD28
durante 72 horas, tras este tiempo las células se prepararon para su visualización mediante
microscopía confocal , de esta manera utilizando TOPRO como marcador de ADN pudimos
diferenciar entre células que se encuentran en mitosis y células que se encuentran en estado pre-
mitótico. Como resultado pudimos observar que en células CD4 de ratones WT que se encuentran
en anafase se produce una polarización de Numb hacia uno de los polos celulares (Fig 26 A primer
panel). Mediante la cuantificación de la cantidad de Numb localizada en cada polo o futura célula
hija pudimos comprobar que la polarización de Numb no era total, es decir, se produce una
segregación asimétrica de Numb, heredando de media una de las células hijas el 63% de Numb
total frente a un 36% de Numb heredado por la segunda célula hija , por tanto no se trata de un
sistema en el que se hereda “ todo o nada”.
Lo siguiente que quisimos comprobar es cómo afecta a la segregación de Numb durante
la mitosis tanto la expresión del dominante negativo de Numb como la sobreexpresión de la
isoforma de Numb p71, para esto realizamos el mismo experimento anterior con células aisladas
de ratones TG dnNumb y TG Numb. Sorprendentemente pudimos ver que el efecto en los dos
ratones era el mismo, se producía una segregación de Numb mas simétrica que en el caso de
células CD4 de WT. Para ratones TG dnNumb encontramos que la media de segregación de
Numb era de un 46% de Numb total para la célula que hereda la menor cantidad y de un 53% la
Nadia Mª Martín Blanco
110
que hereda más cantidad, y para ratones TG Numb las medias eran de un 44% y un 55% (Fig 26
A, segundo y tercer panel).
Por tanto, tanto el dominante negativo para Numb como la sobreexpresión de Numb
producen una pérdida en la segregación asimétrica de Numb durante la división celular, sin
embargo el hecho del que en ratones TG dnNumb las dos células hijas hereden Numb, no implica
el mismo comportamiento que en ratones TG Numb, ya que a pesar de heredar Numb esta
preoteína se encuentra inhibida en ratones TG dnNumb debido a la expresión del dominante
negativo.
Figura 26: Segregación de Numb durante la división celular. A. Imágenes
de microscopía confocal que muestran células CD4 durante la etapa de
Resultados
111
anafase de la mitosis en las que se observa la polarización o no
polarización de Numb, los números indican las medias del porcentaje de
Numb heredado por cada célula hija. B. Representación gráfica de la
cuantificación del porcentaje de Numb heredado por cada célula hija, la
célula que hereda mayor cantidad se representa en la columna izquierda y
la que hereda menor cantidad en la columna derecha de cada ratón WT, TG
dnNumb o TG Numb.
En la siguiente tabla aparece el % de Numb heredado por cada célula hija que se
ha cuantificado para células CD4 de nódulos de ratones WT, TG dnNumb y TG Numb. En la
primera columna de cada ratón se muestra el % de Numb segregado hacia las células que
hereda mayor cantidad, y en la segunda columna de cada ratón el porcentaje de la célula que
hereda la menor cantidad de Numb, en la última fila se muestran las medias. Las diferencias
entre el % de Numb heredado por cada célula hija son significativamente diferentes tanto en
ratones WT como en los dos tipos de ratones TG, pero se observa una disminución de la
segregación asimétrica de Numb en ratones TG dnNumb y TG Numb respecto a WT.
WT TG dnNumb TG Numb
DC#1 DC#2 DC#1 DC#2 DC#1 DC#2
75 25 58,1 41,9 59,01 40,98
65,72 34,28 56,78 43,23 57,87 42,12
65,1 34,9 53,07 46,93 57,20 42,79
64,23 35,77 52,95 47,05 57,03 42,98
62,99 37,01 51,53 48,47 54,77 45,22
61,25 38,75 51,07 48,03 52,48 47,51
59 41 50,94 49,06 52,05 47,94
55,36 44,64 50,28 49,72 52,04 47,95
63,58 36,41 53,09 46,79 55,30 44,68
DISCUSIÓN
Discusión
115
DISCUSIÓN GENERAL
Mediante el empleo de ratones que expresan un dominante negativo para Numb hemos
podido estudiar el papel de Numb en la modulación del TCR. El empleo de dominantes negativos
para la inhibición de la función de una proteína puede potencialmente acarrear la inhibición de
otras proteínas que presenten un alto grado de homología en la región utilizada como dominante
negativo. En nuestro caso, puesto que el dominante negativo utilizado en nuestros ratones se
encuentra constituido por la región PTB de Numb, las proteínas homólogas a Numb podrían ser
Dab-2 y ARH, cuyos PTBs presentan un alto grado de similaridad con el PTB de Numb [86]. Esta
posibilidad queda descartada por el hecho de que ratones dobles transgénicos para dnNumb y
Numb restauran el fenotipo totalmente en timo, recobrando unos números absolutos normales. Los
ratones que expresan Numb dominante negativo se caracterizan por una disminución en la
cantidad de Numb endógena funcional, por el contrario los ratones que sobreexpresan Numb van a
presentar un aumento en la cantidad de Numb funcional, de esta manera en los ratones dobles
transgénicos se consiguen restaurar los niveles funcionales de Numb y con esto un fenotipo
normal en timo. Puesto que los ratones TG dnNumb se caracterizan por una disminución en la
celularidad total del timo, y los ratones TG Numb por un aumento, podemos decir que los niveles
funcionales de Numb regulan la celularidad total del timo. Puesto que los ratones con delección
condicional de Numb no muestran ninguna alteración en el desarrollo del timo [100],
probablemente debido a la presencia de su homólogo funcional Numblike [78, 120], dada la alta
homología entre los PTBs de Numb y Numblike el dominante negativo de Numb empleado en este
trabajo debe estar inhibiendo tanto a Numb como a Numblike de forma simultánea.
Numb ha sido anteriormente descrito como un modulador negativo del receptor Notch
[99, 103], en concordancia con ello hemos podido comprobar que la inhibición de Numb mediante
el dominante negativo provoca una sobreactivación de Notch en timo (Aguado, R.) y en nódulos de
ratones TG dnNumb, mientras que la sobreexpresión de Numb produce una disminución en la
actividad de Notch en nódulos de ratones TG Numb. La sobreactivación de Notch se ha
demostrado con anterioridad que lleva a una disminución del linaje B versus T [33], y a una
disminución del linaje Tγδ versus Tαβ [37], en ratones que expresan el dominante negativo, y por
tanto presentan una sobreactivación de Notch, se observa el mismo fenotipo (datos no
publicados), sin embargo, la sobreexpresión de Notch está relacionada con el aumento en la
selección positiva de células CD8SP [38] en nuestro caso, ratones que expresan el dominante
Nadia Mª Martín Blanco
116
negativo no presentan aparentemente un aumento en selección de células CD8SP, puesto que la
relación DP/CD8SP es normal, fenotipo que no encaja con la sobreactivación de Notch. Es por
esto que cabe la posibilidad de que Numb no solo actúe como modulador de Notch sino que
además desarrolle otra función durante el desarrollo del timo.
El aumento o disminución de la celularidad total en timo en ratones TG Numb y TG
dnNumb respectivamente, ha sido aestudiado anteriormente en nuestro laboratorio (Aguado,R.).
Este fenotipo se debe a una alteración en la segregación de Numb durante la división asimétrica
de timocitos DN3 durante el desarrollo del timo. El aumento en la celularidad total del timo que se
observa en ratones TG Numb va acompañado de un aumento en todas las poblaciones que
conforman el timo, sin embargo en ratones TG dnNumb se observa una alteración en los
porcentajes de estas subpoblaciones, de esta manera, la disminución en la celularidad total de
células DP es consecuencia de alteraciones en la división de células DN que constituyen sus
precursores inmediatos, consecuentemente observamos también una disminución en el número
total de células CD8 SP derivado de la disminución en el número de precursores DP. Estas
disminuciones en los números absolutos de células DP y CD8SP son derivadas de la disminución
en el número de sus precursores, ya que no existe en ratones TG dnNumb ningún aumento en la
muerte celular por apoptosis dentro de estas subpoblaciones, además la relación entre células
DP/CD8SP es normal para ratones TG dnNumb a 4 semanas de edad, indicando que la
producción de células CD8SP es normal. Sin embargo, el número total de células CD4SP es
normal en ratones TG dnNumb respecto a WT, esto produce un aumento en la relación entre
células DP/CD4SP. Esto es un indicativo de un aumento en la tasa de producción de células
CD4SP frente a una tasa de producción de células CD8SP normal. Esta alteración no sería
consecuencia de la sobreactivación de Notch, sino que sería consecuencia de otra función de
Numb, ya que la sobreactivación de Notch está relacionada con un aumento de la selección de
CD8SP [38].
La toma de linaje CD4 versus CD8 viene determinada por la unión del complejo del TCR
a clase II o a clase I respectivamente, que se una a uno o a otro provoca una señalización por TCR
cuantitativamente diferente que desemboca en la diferenciación de células DP hacia células CD4 o
CD8. Según la teoría de “strenght of signaling” [11] las señales generadas por la activación del
TCR difieren entre sí en su intensidad, así señales generadas por la unión de clase II a TCR-CD4
son de alta intensidad y generan células CD4, mientras que señales generadas por la unión de
Discusión
117
clase I a TCR-CD8 son de menor intensidad y resultan en el desarrollo de células CD8SP. Según
esta teoría, la intensidad de la señal determina la toma de linaje, lo que implica que un aumento en
la intensidad de señalización es capaz de producir células CD4SP en ratones con un TCR
específico para clase I, siendo capaz de revertir la diferenciación de las células DP, y al contrario
en el caso de la selcción de las CD8SP[19]. Por el contrario, la teoría de “Kinetic signaling” [24]
defiende que las señales difieren en la duración, siendo las señales generadas por clase II más
prolongadas en el tiempo que las generadas por clase I. Según esta teoría, el aumento en la
intensidad de la señal lleva a un aumento en la eficacia o en la tasa de producción tanto de células
CD4 como CD8, es decir, ratones que expresan un TCR especifico para clase II con un aumento
de intensidad serían capaces de aumentar la tasa de producción de CD4SP, pero un aumento de
la intensidad en ratones con TCR especifico para clase I no produciría células CD4, sin embargo
un aumento en la duración si seria capaz de revertir el fenotipo en este caso. Debido a que la
señalización por TCR está implicada en la toma de linaje quisimos comprobar los niveles de
activación de células que están sufriendo selección positiva, CD4highCD8medium [29], de esta
manera hemos comprobado que en ratones TG dnNumb se producía un aumento en el número de
células que expresan altos niveles superficiales de marcadores de activación, tales como CD5 y
CD69, así como de TCR, en comparación con WT. Estos datos indican que se esta produciendo
un aumento en la señalización por TCR durante la selección positiva, pero no nos permiten
diferenciar entre un aumento en la intensidad o en la duración de la señal, y por tanto no somos
capaces de diferenciar si se esta produciendo un aumento de la eficiencia de la selección positiva
de CD4 o bien si se trata de un cambio en la toma de linaje.
Según esto, es probable que la regulación de la señalización por TCR dentro de la
selección positiva esté regulada por una actuación conjunta entre Notch [42] y Numb. En ratones
TG dnNumb, aunque se produce una sobreactivación de Notch que llevaría a una disminución en
la señalización por TCR [42], y a la generación de células CD8SP, la inhibición de Numb podría
provocar también un aumento en el tiempo de la señalización por TCR, siendo este fenómeno
probablemente predominante sobre la sobreactivación de Notch. Por otra parte, previos estudios
han demostrado que GATA-3 es un regulador de la diferenciación de DP hacia SP, de esta manera
la expresión de GATA-3 parece favorecer el desarrollo de células CD4SP, además los niveles de
expresión de GATA-3 correlacionan con la intensidad de la señalización por TCR [121],
posiblemente sea este uno de los mecanismos que actúan tras la señalización por TCR y que
determinan el linaje de las células DP según la modulación de la señalización por TCR.
Nadia Mª Martín Blanco
118
Sin embargo, la sobreexpresión de Numb no produce ninguna alteración en la relaciones
DP/CD8SP y DP/CD4SP, indicando una selección positiva normal, además en ratones TG Numb
no encontramos alteraciones en los niveles superficiales de TCR, CD5 o CD69 en células que
están dentro de la selección positiva, este mismo fenómeno aparece en ratones que
sobreexpresan la isoforma p66 de Numb [110]. En estos ratones de la misma manera que ocurre
en los ratones que hemos empleado en este trabajo, el aumento en la expresión de Numb provoca
una disminución en la actividad de Notch, sin embargo no aparecen alteraciones en la producción
de células CD4 y CD8SP. Es posible que se precise una mayor sobreactivación de Numb que la
obtenida en nuestros ratones TG para observar un efecto. Además en otros trabajos realizados
anteriormente se observaba como la inhibición de Notch no produce alteraciones en la toma de
linaje CD4/CD8 [41].
Para explicar estos resultados quisimos estudiar el mecanismo por el cual Numb podría
regular la señalización por TCR. La señalización mediada por receptores puede ser regulada a dos
niveles, una forma de regulación es mediante la disponibilidad de segundos mensajeros que
participen en la cascada de señalización generada por la activación del receptor, en cuanto a esto
muchos son los trabajos anteriores en los que se ha demostrado que la alteración de la
señalización por TCR lleva a una alteración en la selección positiva, así cuando se produce una
reducción en la actividad Lck timocitos con TCR especifico de MHC-II se desarrollan hacia CD8 y
viceversa, cuando se produce un aumento en la actividad Lck, timocitos con TCRs específicos
para MHC-I se diferencian hacia CD4 [19]. Por otro lado ERK actúa de la misma manera, el
aumento en su actividad lleva a favorecer el linaje CD4 y su disminución favorece al linaje CD8
[20]. Un segundo mecanismo es regulando la disponibilidad del receptor para ser activado por su
ligando, este fenómeno puede ser regulado mediante la modulación de los niveles de expresión
del receptor en membrana, proceso que se lleva a cabo mediante endocitosis, reciclaje y
degradación del receptor. En cuanto a este mecanismo, tanto los KO de Cbl [122] como los KO de
SLAP [72], muestran un aumento en los niveles superficiales de TCR en células DP, que llevan a
un aumento en la señalización y en el desarrollo de células CD4SP. Puesto que Numb había sido
anteriormente relacionado con procesos de modulación de receptores [97] quisimos estudiar la
posibilidad de que Numb regula la modulación de los niveles superficiales del TCR.
El ciclo del TCR se lleva a cabo por dos mecanismos diferentes según se produzca de
manera constitutiva o tras estimulación por ligando [57-59]. Hemos podido demostrar en este
Discusión
119
trabajo que en ratones TG dnNumb no se encuentra afectado el ciclo constitutivo, puesto que los
niveles de TCR superficiales en células CD4 de nódulos no se encuentran alterados. Estos datos
coinciden con lo observado en células DP de timo, así las células DP, que son células que aún no
han sido estimuladas, es decir que no están sufriendo modulación de TCR dependiente de ligando,
no muestran alterados los niveles de TCR superficiales en ratones TG dnNumb respecto a WT, por
tanto podemos decir que Numb no participa en el ciclo constitutivo del TCR . Este mismo
fenómeno se observa en ratones KO para c-Cbl y Cbl-b [59], apareciendo intacto el ciclo
constitutivo del TCR. Anteriormente se había descrito que el ciclo constitutivo es independiente de
Cbl, y parece ser también independiente de Numb.
Puesto que la modulación dependiente de ligando se lleva a cabo por un mecanismo
diferente [60, 64, 123], quisimos estudiar este segundo mecanismo, así pudimos observar una
inhibición en degradación de la cadena ζ del TCR que lleva a un aumento en los niveles
superficiales de TCR tras 12 horas de estimulación. Este fenómeno está aparejado con a un
aumento en el número de vesículas de TCR internalizado en el citoplasma, probablemente
acumuladas por la falta de degradación.
Sin embargo, el hecho de que a tiempos cortos de estimulación la modulación del TCR
superficial sea más rápida en ratones TG dnNumb que en WT es un fenómeno menos claro. El
que la modulación sea más rápida puede ser explicado o bien por un aumento en la tasa de
internalización o bien por una disminución en la tasa de reciclaje hacia la membrana. Puesto que
un aumento en la tasa de internalización sería más propio de la sobreexpresión de Numb y no de
su inhibición, pensamos que el hecho de que las vesículas de TCR internalizado se acumulen en
el citoplasma podría estar alterando la tasa de reciclaje del TCR hacia la superficie celular. Esta
alteración de la tasa de reciclaje explicaría el hecho de que a tiempos cortos de estimulación los
niveles superficiales de TCR sean menores en ratones TG dnNumb respecto a WT. El defecto en
la degradación lleva a un acúmulo de vesículas de TCR internalizado en ratones TG dnNumb, que
tras quedar retenidas en el citoplasma vuelven a la membrana citoplasmática, este mismo
fenómeno fue descrito en ratones KO para SLAP [70], en los que se observa un aumento en el
pool de reciclaje del TCR debido a una inhibición en la degradación de la cadena ζ, siendo este
TCR de nuevo expresado en la membrana. Este mecanismo implica una conexión entre el ciclo de
internalización/reciclaje del TCR y el ciclo de internalización/degradación. De esta manera, está
descrito que para el reciclaje del TCR es necesario la desfosforilación de la Ser 126 presente en
Nadia Mª Martín Blanco
120
CD3γ por parte de serin/treonin fosfatasas [52]. Tal vez el TCR retenido en el citoplasma por una
falta de degradación acabe siendo reciclado de nuevo a membrana por falta de fosforilación de la
Ser 126.
El aumento de los niveles de TCR superficiales tras 12 horas de estimulación coincide
con el hecho de que en células que están sufriendo selección positiva dentro del timo de observen
igualmente altos niveles de TCR superficial. Por tanto, Numb participa en la modulación de los
niveles superficiales del TCR tras estimulación por ligando. De esta manera, se produce un
aumento del tiempo de residencia en superficie del TCR que llevaría probablemente a la
prolongación en el tiempo de la señalización mediada por TCR, lo que hemos podido observar en
células que están sufriendo selección positiva mediante el aumento en los niveles superficiales de
marcadores de activación, alargando así el tiempo de señalización. Este fenómeno también
aparece en ratones KO para Cbl [59, 122], en el caso de los KO para Cbl se observa un aumento
en los tiempos de señalización por TCR que lleva a una prolongación del tiempo de fosforilación de
ERK tanto a nivel de timocitos como en células de periferia.
La modulación dependiente de ligando del TCR engloba dos fenómenos: la
internalización del TCR y su degradación. En cuanto a su degradación hemos demostrado que se
encuentra alterada en ratones TG dnNumb, y en cuanto a la internalización pesamos que el
dominante negativo no inhibe este proceso, primero debido a que la modulación es más rápida en
ratones TG dnNumb; y en segundo lugar hemos podido observar un aumento en vesículas de TCR
internalizado tras estimulación con ligando en ratones TG dnNumb. Además, ratones KO para c-
Cbl y Cbl-b son capaces de internalizar TCR de manera dependiente de ligando, lo que indica que
este proceso de internalización no es dependiente ni de Cbl ni de Numb [59]. Además en otro
trabajos realizados en los que se encuentra alterada la degradación de ζ, por inhibición de ZAP-70
o Lck [67, 69], no se encontraba alterada la tasa de internalización, por tanto parecen ser dos
mecanismos independientes.
En este trabajo hemos podido demostrar mediante microscopía confocal que Numb
colocaliza con vesículas de TCR tras la estimulación de células CD4 en nódulos, anteriormente en
otros trabajos se había demostrado que Numb colocaliza en vesículas que transportan diferentes
receptores, tales como Tfr y EGFR [97]. Del mismo modo proteínas con estructura homóloga a
Numb, como ARH, se han visto también implicadas en procesos de modulación de receptores, en
Discusión
121
este caso en internalización del receptor LDL [84]. Mediante microscopia confocal hemos podido
observar que Numb dominante negativo mantiene la capacidad de unión a las vesículas de TCR,
este hecho indica que Numb es capaz de colocalizar con vesículas del TCR dependientemente de
su dominio PTB. Además, dentro de este trabajo hemos demostrado que Numb es capaz de
coinmunoprecipitar junto a la cadena CD3ε mediante su dominio PTB, puesto que el dominante
negativo sigue manteniendo esta capacidad. Probablemente esta unión se lleve a cabo a través
del motivo canónico NPXY de unión del PTB de Numb que se encuentra presente junto a uno de
los motivos ITAM de la cadena CD3ε. Además, hemos podido comprobar que esta
coinmunoprecipitación es dependiente de activación, lo que explica que no se encuentre alterado
el ciclo del TCR constitutivo en ratones TG dnNumb. Por tanto Numb parece solo actuar en la
modulación del TCR dependiente de ligando. Si tanto Numb como el dominante negativo de Numb
son capaces de unirse al complejo del TCR, es lógico pensar que estos compiten entre sí, esta
situación es la causa de que disminuya la tasa de colocalización entre Numb y TCR en linfocitos
activados de ratones TG dnNumb. Por otra parte, anteriormente se había demostrado que Numb
coinmunoprecipita con la ubiquitin ligasa Cbl en timocitos [100]. En nuestro laboratorio hemos
podido reproducir estos datos, así mediante inmunoprecipitacion hemos podido observar que Cbl
coinmunoprecipita junto a Numb en timocitos de ratones WT, según estos datos es una pequeña
fracción de Numb la que se une a Cbl, probablemente debido a que los pellets celulares utilizados
en el experimento eran de timocitos totales, y dentro de los timocitos totales solamente una
pequeña fracción de ellos son timocitos activados. Por tanto, probablemente la asociación entre
Numb y Cbl se produce tras la activación celular, con el fin de facilitar la degradación del TCR, de
esta manera pensamos que la tasa de unión aumentaría si se realizara el experimento con
timocitos activados. Mediante la misma técnica hemos podido demostrar que el dominante
negativo de Numb no posee la capacidad de coinmonoprecipitar junto a Cbl, y por tanto de reclutar
a este hacia el complejo del TCR, esto demuestra que Numb coinmunoprecipita junto a Cbl
mediante su dominio carboxi-terminal, el cual en el caso del dominante negativo se encuentra
ausente.
En resumen, nuestros datos indican que Numb actúa como una proteína adaptadora
capaz de asociarse al complejo del TCR tras su activación por ligando, de esta manera Numb
actúa reclutando a Cbl hacia la vesícula del TCR, lo que lleva al paso a lisosomas y a su posterior
degradación. Nuestros experimentos indican, que el dominante negativo para Numb sigue
manteniendo su capacidad para unirse al complejo del TCR, desplazando de esta manera a Numb
Nadia Mª Martín Blanco
122
endógena, ya que los niveles de colocalizacion entre Numb y TCR se encuentran disminuidos en
células activadas de ratones TG dnNumb, sin embargo el dominante negativo de Numb pierde la
capacidad para reclutar a Cbl hacia este complejo, este hecho provoca que células activadas del
TG dnNumb muestren una disminución en los niveles de colocalización entre Cbl y TCR. Estos
datos indican que Numb es capaz de unirse al complejo del TCR por su dominio PTB y reclutar a
Cbl mediante su unión a la región carboxi-terminal, que en el caso del dominate negativo se
encuentra ausente. La disminución en los niveles de colocalizacion entre Cbl y TCR podría llevar a
una disminución en los niveles de ubiquitinización de las cadenas del complejo CD3-TCR, y puesto
que los niveles de ubiquitinización están relacionados con el paso de endosomas a lisosomas
[124], este fenómeno podría provocar una inhibición del paso del TCR a lisosomas y de su
degradación, este mismo efecto aparece en ratones dobles KO para c-Cbl y Cbl-b en los que el
TCR queda retenido en endosomas sin aparecer dentro de lisosomas [59]. Este modelo de
actuación de Numb encaja con lo descrito acerca del papel de Numb en la degradación del
dominio intracelular de Notch, en este caso Numb es capaz de unirse por su región carboxi-
terminal a la ubiquitin ligasa Itch y a NIC por su PTB [99].
Discusión
123
Modelo propuesto para el papel de Numb en la modulación de los
niveles superficiales de TCR. La ruta 1 explica el papel de Numb en
condiciones normales, y la ruta 2 explica el efecto del dominante
negativo.
Otra proteína adaptadora implicada en la modulación de los niveles superficiales de TCR
es SLAP, en este caso SLAP tiene la capacidad de asociarse a la cadena ζ [70], y de actuar como
proteína adaptadora reclutando a Cbl hacia el complejo del TCR [71].
Es posible que Numb y SLAP desarrollen un papel parecido en cuanto a la modulación de los
niveles superficiales de TCR, pero tal vez actúen durante fases del desarrollo diferentes, en
nuestro caso, Numb solo participa en la modulación del TCR tras la activación de este por ligando,
proceso que ocurre durante la selección positiva y durante la activación de linfocitos en periferia,
debido a esto encontramos en células DP niveles normales de TCR, y la alteración en los niveles
superficiales de TCR solo aparecen tras la unión del TCR con su ligando, tanto en células de timo
que ya han entrado en selección positiva como en linfocitos T maduros de nódulos. Sin embargo,
durante el desarrollo de las células DP, existe una fase de pre-selección positiva en la que se
produce una modulación de los niveles de TCR de manera independiente a la unión MHC-TCR,
este mecanismo garantiza que la célula entre en selección positiva con la cantidad de TCR
superficial idónea. En ratones SLAP deficientes, las células DP que aún no han entrado en
selección positiva presentan altos niveles de TCR, es probable que sea en este proceso en el que
participa SLAP, este fenómeno constituye un mecanismo de degradación del TCR independiente
de ligando, dependiente de Lck y de clatrina [72] [70]. De esta manera en ratones KO para Cbl,
ocurre el mismo fenómeno, un aumento de TCR en células DP, en este caso Cbl participaría tanto
en la degradación del TCR en la etapa de pre-selección positiva como en la degradación del TCR
durante la selección positiva.
Por tanto, tanto en el caso de Cbl como de SLAP, los ratones KO muestran elevados
niveles de TCR superficial en células DP, lo que provoca que las células entren en selección
positiva con niveles superficiales de TCR alterados, sin embargo en ratones TG dnNumb las
células DP presentan niveles normales de TCR superficial, y esta alteración se produce tras la
estimulación de la células DP por parte de MHC. Aunque tanto en unos como en otros ratones la
alteración fenotípica es la misma, un aumento en selección positiva de CD4 producida por una
alteración en la modulación de los niveles superficiales de TCR, sin embargo esta alteración se
produce en diferentes etapas de desarrollo de los timocitos, antes de la selección o durante la
selección positiva. Por tanto, parece que SLAP y Numb participan en dos mecanismos diferentes
Nadia Mª Martín Blanco
124
de la degradación del TCR, uno en la etapa de pre-selección positiva y otro tras la estimulación por
ligando. También es posible que Numb y SLAP actúen sobre la degradación de cadenas
diferentes, CD3ε y CD3ζ respectivamente, las cuales pueden ser accesibles a unión de estos
adaptadores en momentos distintos durante el desarrollo de timocitos.
Tras la activación del TCR por ligando se produce un cambio conformacional de la
cadena CD3ε [75], este cambio conformacional es anterior a la fosforilación de tirosinas, y conduce
a la asociación de una proteína adaptadora denominada Nck, tras esta unión se produce la
fosforilación de los ITAMs, debido a esto se ha propuesto un mecanismo por el cual esta unión
podría ser la responsable de la asociación de Lck a TCR, pero esto está sin demostrar. Nck se
asocia a una zona rica en prolina presente en la cadena CD3ε, RPPPVPNP, dentro de esta
secuencia se encuentra parte del motivo NPXY (RPPPVPNPXY) que nosotros mostramos como
candidato para su unión al PTB de Numb, esto indica que probablemente el cambio
conformacional que se produce tras la activación de TCR sea necesario para que el PTB de Numb
sea capaz de unirse al motivo NPXY, de esta manera la unión de Numb con CD3ε sólo se
produciría tras la activación del TCR. Este mecanismo constituye una forma muy elegante para
limitar la participación de Numb en la degradación del TCR sólo tras activación. Pero aún queda
por estudiar si la unión del PTB de Numb a CD3ε es dependiente o independiente de la
fosforilación de tirosinas, ya que el PTB de Numb tiene capacidad para asociarse tanto a motivos
fosforilados como sin fosforilar. Según uno u otro caso, Numb se asociaría antes o después de la
unión de Nck a CD3ε, o tal vez compitan por esta unión. En contraste, no se conoce un
mecanismo similar de cambio conformacional para CD3ζ, por tanto SLAP se uniría
constitutivamente a ésta cadena.
Nuestro modelo entra en contraposición con el trabajo de Malissen anteriormente
descrito en la introducción, en el que describían que la región PRS de CD3ε se encuentra
constitutivamente accesible a Nck. Si esto fuese así, puesto que la secuencia que nosotros
postulamos para que Numb se una CD3ε se encuentra parcialmente dentro de la región PRS,
Numb tendría la capacidad de asociarse a CD3ε sin necesidad de activación. Los datos que
hemos obtenido demuestran que Numb no es capaz de inmunoprecipitar con CD3ε en células sin
estimular, y en segundo lugar el trabajo de Malissen se basa en la observación de una asociación
de Nck a CD3ε en lisados de timocitos totales, algo que no sería incomplatible con la teoría del
cambio conformacional ya que dentro del total de timocitos, una pequeña fracción se encuentra
activada por la unión MHC-TCR. Por otro lado, numerosos trabajos demuestran que la unión de
Discusión
125
Nck a CD3ε es dependiente de la activación por ligando, así en ratones OT-1 β2mg -/- Rag-/- en los
cuales no es posible la activación de TCR por ligando durante la selección positiva no se observa
la unión de Nck a la cadena CD3ε [76].Otro punto en contra de las conclusiones de Malissen, es
que ellos describen un modelo por el cual CD3ε es necesario para la degradación de la cadena ζ
por parte de SLAP. Pues bien, anteriormente se demostraba mediante la expresión de una
quimera constituida por el dominio intracelular de la cadena ζ y el dominio extracelular de CD8,
que solamente la expresión del dominio intracelular de ζ era necesario para una correcta
degradación mediada por SLAP, es decir la función de SLAP se muestra para ser independiente
de cualquier otra cadena del TCR [71]. Hay que tener en cuenta que la delección de la zona PRS
de CD3ε utilizada en el trabajo de Malissen afecta a los dos primeros aminoácidos de la secuencia
NPXY que nosotros proponemos como sitio de unión para Numb, de esta manera la alteración de
la secuencia PRS no solo podría repercutir en la asociación de Nck, sino también de Numb. A
este respecto, los ratones utilizados en este trabajo presentan dos características fenotípicas que
coinciden con los ratones TG dnNumb, tales como una disminución en la celularidad total del timo
y una disminución en el estadio DN4. Probablemente, el fenotipo de estos ratones sea ocasionado
por una suma de diferetes alteraciones, entre ellas la falta de unión de Numb a CD3ε.
Por otra parte, hemos comprobado que los niveles de Numb aumentan ligeramente
durante la activación de linfocitos T, probablemente Numb sea degradado junto con el TCR en
lisosomas tras la activación, de la misma manera que sucede con otros componentes de la
maquinaria de degradación, pero en el caso de Numb es posibles que se mantenga su síntesis de
novo con el fin de mantener los niveles de Numb endógeno constantes o incluso aumentarlos. Este
sería el motivo por el cual encontramos que en ratones TG que sobreexpresan Numb no se
encuentra alterada la modulación del TCR dependiente de ligando, apareciendo así una relación
normal entre DP/CD4SP y DP/CD8SP, indicativo de una selección positiva normal, siendo este
fenotipo el mismo que aparece en ratones que sobreexpresan Numb p66 y en ratones en los que
disminuye la actividad de Notch [110].
Anteriormente se había demostrado que Numb migra hacia la zona de sinapsis
inmunológica colocalizando con el complejo del TCR [100, 111]. Nosotros hemos podido observar
el mismo fenómeno en células CD4 de nódulos de ratones WT, en este caso la expresión del
dominante negativo provoca en ratones TG que Numb endógena no sea capaz de polarizar hacia
la zona de sinapsis, quedando repartida homogéneamente por la membrana celular. Este
Nadia Mª Martín Blanco
126
fenómeno podría ser debido a la competencia que se establece entre Numb endógena y el
dominante negativo, de esta manera el dominante negativo sí sería capaz de migrar hacia la zona
de sinapsis desplazando así de esta localización a Numb endógena. Probablemente en ratones
que sobreexpresan Numb, Numb endógena mantiene su capacidad de migrar hacia la zona de
sinapsis y modular los niveles de TCR tras la estimulación ya que no expresa ningún dominante
negativo que altere esta función. La función que desarrolla Numb dentro de la sinapsis era hasta
ahora desconocida, pero con los resultados obtenidos en este trabajo se puede deducir que Numb
migra hacia la zona de sinapsis con el objetivo de regular los niveles superficiales de TCR y
consecuentemente la señalización por este, de esta manera mientras que en las células que se
encuentran en reposo Numb se distribuye homogéneamente por la membrana celular, sin
participar en procesos de endocitosis de TCR, tras la activación de la célula y la formación de la
sinapsis, Numb se polariza en esta zona para regular la modulación del TCR. Probablemente, la
polarización de Numb hacia la zona de sinapsis se lleve a cabo de la misma manera que se
produce la polarización de Numb durante la división de precursores del sistema nervioso, en este
caso, un complejo formado por diferentes proteínas Par y una protein-quinasa atípica o aPKC,
parecen ser responsables de la fosforilación de Numb y de la polarización de esta hacia un polo de
la células [90, 91]; además este mismo mecanismo se ha descrito para la polarización de Numb
durante procesos de migración en los que interviene regulando la endocitosis de integrinas de
superficie [125]; y por último este mismo sistema participa en la polarización de receptores de
quimioquinas en linfocitos [126]. También es posible que Numb migre junto al TCR sin necesidad
de mecanismos alternativos.
En base a los datos descritos, se puede contruir un mecnaismo en el cual Numb es el
adaptador endocítico responsable de la degradación de CD3ε tras la activación del TCR, jugando
un importante papel en la modulación de la señalización a través del TCR, tanto en timocitos como
en linfocitos T maduros.
Discusión
127
PERSPECTIVAS
Papel de Numb en división asimétrica de linfocitos T.
Una de las funciones más estudiadas de Numb es su participación en el proceso de
división asimétrica durante el desarrollo del sistema nervioso, posteriormente también se ha
demostrado que participa en el desarrollo de muchos otros sitemas. Numb se segrega
asimétricamente durante la división de los progenitores, el hecho de que la célula herede Numb o
no influye en los niveles de activación de Notch, y mediante este mecanismo se regula la
capacidad de las células hijas para diferenciarse o bien para seguir manteniéndose como
progenitoras y seguir proliferando. Recientemente se publicaba que células CD8 naive de nódulos
sufrían tras su primera estimulación una división asimétrica que llevaba a la aparición de un
fenotipo diferente en cada célula hija, de esta manera aparecía una célula de fenotipo efector y
otra de fenotipo memoria, pero este trabajo era puramente descriptivo, y aunque veían una
segregación asimétrica de Numb este hecho no se relacionaba con la adquisición de uno u otro
fenotipo [111]. En este trabajo hemos podido observar que Numb se segrega asimétricamente
durante la división de células CD4 en ratones WT, así cuando se produce la sinapsis inmunológica
Numb migra hacia esta zona, quedando polarizada durante la división celular, puesto que la zona
de sinapsis marca el plano de división de la células, tras la finalización de la mitosis una de las
células hereda mayor cantidad de Numb que la otra. Sin embargo hemos podido observar que el
dominante negativo altera la migración de Numb hacia la zona de sinapsis quedando distribuida
por toda la membrana, de esta manera la segregación de Numb tras la división resulta más
simétrica en ratones TG dnNumb que en WT. En ratones que sobreexpresan Numb encontramos
de igual modo que Numb se hereda de forma más simétrica, probablemente debido a que la
sobreexpresión de Numb hace que no sea posible la polarización del total de la proteína. En este
trabajo no hemos estudiado el papel de Numb en la división asimétrica de linfocitos maduros, pero
puesto que hemos observado una alteración en la segregación de Numb durante la división de
células T CD4 en ratones TG dnNumb y TG Numb, este parece ser un buen modelo para el
estudio de la implicación de Numb en la división asimétrica de linfocitos maduros, y no solo en el
estudio de la adquisición de un fenotipo memoria o efector, sino que en muchos trabajos se ha
demostrado que la activación de Notch es necesaria para el desarrollo de células Th2 [112, 127], a
este respecto es posible que la herencia o no de Numb regule los niveles de activación de Notch y
esto regule, junto con otros factores, el desarrollo de células Th2.
Nadia Mª Martín Blanco
128
Migración de células CD8SP.
Por otra parte, el fenotipo en nódulos de ratones TG dnNumb se caracteriza por una
drástica disminución en el porcentaje de células CD8 y un aumento en el porcentaje de células
CD4. Puesto que en ratones TG dnNumb se podría estar produciendo un aumento en la
producción de células CD4 frente a una producción normal de células CD8, este fenómeno
explicaría la alteración en el fenotipo de nódulos. Sin embargo, la relación entre CD8SP/CD8 en
ratones TG dnNumb es cuatro veces mayor respecto al WT, lo que nos indica que para el número
de células CD8SP que se están produciendo en timo, aparecen demasiado pocas en periferia.
Puesto que no existe un aumento en la muerte celular por apostosis en células CD8SP que
pudiera reducir el número de células en periferia, pensamos que la falta de CD8 en periferia podría
estar causado por una falta de migración de células CD8SP hacia la periferia. En cuanto a esto
hemos observado que en ratones de 8 y 12 semanas de edad se produce un aumento en el
número de células CD8SP, mientras que lo esperado sería una disminución debido a la propia
involución del timo, de esta manera estos datos indican que se produce un secuestro de células
CD8SP dentro del timo, impidiendo su salida a periferia y disminuyendo drásticamente el
porcentaje de CD8 en periferia. Este fenómeno podría estar causado o bien por un secuestro de
células CD8SP maduras dentro del timo, o bien por una falta de maduración de células CD8SP
que quedarían secuestradas en un estadio de desarrollo semi-maduro y por tanto no habrían
alcanzado aún la capacidad de migración hacia la periferia. Este estadio de semi-madurez,
engloba a células que una vez superada la selección positiva pasan a la médula, manteniéndose
como semi-madura con el fin de prolongar su estancia en el timo y permitir durante este tiempo la
eliminación de células autorreactivas. En este estadio se caracterizan por tener una expresión de
CD69high y de CD62Llow , sin embargo al madurar adquieren un fenotipo CD69low y de CD62Lhigh,
de esta manera la expresión de CD62L no parece ser necesaria para la salida del timo pero si para
el ingreso de las células en nódulos, sin embargo sí que es necesario para la migración de células
tímicas que expresen niveles bajos de CD69 [114, 115]. En ratones que sobreexpresan CD69 se
produce un acúmulo de células SP maduras en timo, este efecto parece ser debido a que la
expresión de CD69 modula los niveles de expresión del receptor S1P1 necesario para que las
células salgan del timo [128], de esta manera durante la fase de maduración de las células SP los
niveles de CD69 y de S1P1 se antagonizan mutuamente, así ratones S1P1-/- presentan una
población de células SP con fenotipo maduro pero con un aumento en los niveles de CD69
superficial, lo que imposibilita la migración de las células SP hacia la periferia. Por otro lado,
Discusión
129
parece que los niveles de expresión tanto de CD62L como S1P1, dos proteínas necesarias para
una correcta migración, se encuentran reguladas por el mismo factor de transcripción [116]. En
nuestro caso las células CD8SP presentan un fenotipo de células semi-madura, ya que presenta
altos niveles de CD69 y bajos de CD62L, sin embargo, es posible que los altos niveles de CD69
vengan producidos por la alteración en la modulación de los niveles superficiales de TCR, que
produciría una prolongación en los tiempos de estimulación y por tanto un aumento en los niveles
superficiales de CD69 ya que este es un marcador de activación; en este caso, el aumento de
CD69 impediría la expresión de S1P1 y de CD62L, ya que CD69 y S1P1 se antagonizan
mutuamente. Lo interesante de este fenómeno es que se produce de forma exclusiva en células
CD8SP, lo que indica que podría existir un mecanismo diferencial entre la migración de células
CD4SP y CD8SP.
Alternativamente, la alteración en la migración de células CD8SP podría estar
relacionada con procesos de endocitosis de integrinas, ya que anteriormente se ha descrito que
Numb participa en estos procesos, mediante su unión a cadenas β de integrinas [101]. De esta
manera se ha descrito que Numb participa en procesos de migración mediante su polarización
hacia uno de los polos de la célula y su participación en la modulación de los niveles superficiales
de integrinas [125]. Algunas de las integrinas expresadas en la superficie de los timocitos son
LFA-1, VLA3, 4, 5 y 6, estar integrinas son capaces de asociarse con componentes de la matriz
extracelular tales como, fibronectina, laminina y colágeno. Aparentemente la expresión de
integrinas en la superficie de timocitos puede afectar a la migración de timocitos, así la
disminución en la expresión de VLA-5 lleva a una alteración en la migración de timocitos [129]. Tal
vez exista un mecanismo de expresión diferencial de integrinas dentro de células CD4SP y
CD8SP, el cual podría estar afectado por la expresión del dominante negativo para Numb.
CONCLUSIONES
Conclusiones
133
1. Los niveles de Numb functional determinan la celularidad total del timo. Así, se observa
una gradación en la celularidad total del timo con bajos niveles d funcionales de Numb
(TGdnNumb), seguidos por ratones con niveles normales de Numb (TGdnNumb x
TGNumb), y finalmente elevada celuridad en ratones TG Numb.
2. La inhibición funcional de Numb aumenta la eficiencia de la selección postiva de timocitos
CD4SP en timo (DP/CD4SP), manteniéndose sin diferencias significativas la eficiencia de
la selección positiva de timocitos CD8SP.
3. La inhibición funcional de Numb provoca una disminución en la tasa de migración de
células CD8SP hacia la periferia.
4. La proteína adpatadora Numb facilita la degradación del receptor TCR de manera
dependiente de activación, tanto en timocitos dobles positivos como en linfocitos maduros,
contribuyendo de esta manera a la modulación de la señalización por TCR.
5. Numb es segregado asimetricamente durante la división de linfocitos T CD4 que son
activados in vitro con anti-CD3 y anti-CD28. Tanto la inhibición de Numb como la
sobreexpresión de Numb lleva a una segregación símetrica endógeno durante la división
de lifocitos T.
REFERENCIAS
Referencias
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PUBLICACIONES
Title
The endocytic adaptor Numb regulates thymus size by modulating pre-TCR signaling
during asymmetric division.
AUTHORS: Aguado R.1, Martin-Blanco N.1, Canelles M.1,�
Affiliations
1 Instituto de Parasitologia y Biomedicina, CSIC, P. T. Ciencias de la Salud, 18100
Granada, Spain.
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Matilde Canelles
Tel: 34-958-181660
Fax: 34-958-181632
Running Title
Numb and pre-TCR in asymmetric division.
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Abstract: 148
Text: 4801
Figure legends: 965
References: 1048 (45 references)
Abstract
Stem cells must proliferate and differentiate to generate the lineages that
shape mature organs; understanding these two processes and their interaction is one
of the central themes in current biomedicine. An intriguing aspect is asymmetric
division, by which two daughter cells with different fates are generated. Several cell
fate determinants participate in asymmetric division, with the endocytic adaptor
Numb as the best known example. Here we have explored the role of asymmetric
division in thymocyte development, visualizing the differential segregation of Numb
and pre-TCR in thymic precursors. Analysis of mice where Numb had been inhibited
by expressing a dominant negative revealed enhanced pre-TCR signaling and a
smaller thymus. Conversely, Numb over-expression resulted in loss of asymmetric
division and a larger thymus. The conclusion is that Numb determines the levels of
pre-TCR signaling in dividing thymocytes and, ultimately, the size of the pool from
which mature T lymphocytes are selected.
Introduction
The mammalian thymus contains different cell types originated from initially
equivalent precursors that undergo several rounds of division. To ensure correct
numbers of mature lineage specific cells in adult organs precursors divide
asymmetrically, generating two sister cells with different fates [130, 131]. One of the
“cell fate determinants” asymmetrically segregated is Numb, a plasma membrane-
associated protein that contains a phosphotyrosine binding (PTB) domain and
antagonizes Notch signaling. Numb function was first described in Drosophila sensory
organ precursor cells [132], where loss of Numb resulted in both daughter cells
adopting the fate of the cell that normally inherits Notch, while the opposite result
was caused by Numb over-expression [102, 103, 106]. In mammalians, asymmetric
division has been studied most extensively during neurogenesis [107]. Deletion of
Numb and its homologue Numblike resulted in loss of neural progenitors and block of
neurogenesis [78], as a result of progenitor over-differentiation and death of young
neurons in mice. In other systems, Numb binds to integrins [101] and Src family
kinases [108], mediates receptor internalization [97, 105] and participates in clathrin
dependent endosomal association [95]. Thus, Numb plays multiple and important
roles in development and signaling, however little is known about its role in the
thymus.
T lymphocytes develop from precursors that undergo a series of cell fate
decisions resulting in differentiation into single positive (SP) thymocytes, the
immediate precursors of fully functional CD4 and CD8 T lymphocytes [2, 133]. The
initial CD4-CD8- double negative (DN) stages are influenced by signals from the pre-
TCR [134-136] and Notch [137],[138]. Only DN thymocytes receiving proper pre-TCR
and Notch signals are able to evolve into the CD4+CD8+ double positive (DP) αβ
lineage stage. Pre-TCR internalization and degradation is very important for correct
signaling [139-141]. As a consequence of pre-TCR signaling, DN thymocytes
proliferate, enabling normal numbers of DP thymocytes in the adult thymus [142-
144].
Both Numb and its homologue Numblike are expressed in hemopoietic stem
cells [109] and lymphoid tissues [79, 108, 110], also Numb co-localizes with the TCR
complex in mature T cells [100] and segregates asymmetrically in hemopoietic stem
cells [145] and mature T lymphocytes [111]. Moreover, Numb over-expression in
thymocytes results in reduction of Notch activity [110]. These data strongly suggest
that Numb may play a role during the DN stage in the thymus.
Here we have shown that double negative thymocytes asymmetrically
segregate Numb, but not the pre-TCR, during cell division. Our analysis of thymic
development in transgenic mice over-expressing dominant negative or full length
Numb has shown that Numb inhibition enhanced the pre-TCR pathway and resulted in
a smaller thymus, while Numb over-expression resulted in less signaling, loss of
asymmetric division and a larger thymus. These results show that Numb helps
modulate pre-TCR signaling in double negative thymocytes in order to direct cell fate
and regulate thymus cellularity.
Methods
Mice, embryos and cell lines. 15d embryos or 4-week-old mice were used for
experiments with fetal and adult thymus, respectively. All experimental procedures
involving mice were performed in agreement with the CSIC Ethical Committee
directives.
Antibodies. The following antibodies were obtained from BD Pharmigen: FITC anti-
CD25 (7D4), CD4 (L3T4), CD8 (53-6.7), CD5 (53-7.3), AnnexinV; PE anti-TCRβ (H57-
597), Lin [CD4 (RM4-5), CD8 (53-6.7), CD3 (145-2C11), CD11b (M1/70), NK1.1
(PK136), TCRβ (H57-597), TCRγδ (GL3), B220 (RA3-6B2)]; CyC anti-CD44 (IM7);
Biotinylated anti-CD4 (RM4-5), CD8 (53-6.7), pre-Tα (2F5), Fc Block (2.4G2), IgG1
(A85-1). Biotinylated Myc (9E10, Upstate). Biotinylated antibodies were revealed with
Streptavidin-APC (eBioscience). FITC anti-cytokeratin was obtained from Sigma.
Western blotting. 1x107 thymocytes were lysed in 100 µl NP40 cell lysis buffer
(Sigma) supplemented with protease inhibitor cocktail (Sigma) and 1mM PMSF for 30
min on ice. The lysates run on a NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) and
transferred to nitrocellulose. Subsequently, membrane was blotted with primary
antibodies, washed, incubated in secondary antibodies coupled to HRP (Santa Cruz)
and detected with enhanced chemiluminescence (Bio-Rad).
Flow cytometry. Thymocytes were washed twice with PBS and stained for 15
minutes at 4ºC with antibodies. For intracellular staining, cells were incubated with
Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience) and stained with antibodies. Analysis was
performed on a FACs Calibur (Becton Dickinson). Files were analyzed with software
(FlowJo; Tree Star, Inc.).
OP9/OP9DL co-cultures. Fetal thymocytes were cultured onto OP9/OP9DL
monolayers for 6 days at 37ºC and 5% CO2, in the presence of 5ng/ml IL-7 (RD
System). All co-cultures were maintained in complete α-MEM (Gibco) medium
supplemented with 10% FBS (Gibco) and antibiotics (Gibco).
Immunofluorescence and Confocal Microscopy. Thymii were fixed with a 4%
paraformaldehyde solution in PBS, washed with PBS, treated with a 20% sucrose
solution in PBS, immersed in O.C.T. (Tissue Tek) and frozen using a mixture of 2-
methylbutane (Sigma) and dry ice. 10 µm sections were fixed with 4%
paraformaldehyde in PBS, permeabilized with Triton-X100 and stained with antibodies
in a solution containing 5% normal goat serum and 3% bovine serum albumin.
Sections were mounted with ProLong Antifade (Molecular Probes). The following
primary antibodies were used for immunofluorescence: anti-Numb (Santa Cruz
Biotechnology Inc.), anti-c-Cbl (Santa Cruz Biotechnology Inc.), anti-CD25 (BD
Pharmingen), rabbit anti-Ubiquitin (Sigma), TOPRO-3 iodide (Molecular Probes). The
secondary antibodies were anti-rabbit Alexa-647, anti-rabbit Alexa-488, anti-mouse
Alexa-488, anti-mouse Alexa-555 (Molecular Probes). Using a Leica TCS SP5 confocal
microscope, images were collected at 8-bit depth, with a resolution of 1024 x 1024
pixels.
Quantification of fluorescence staining in z-stacks of dividing cells. The
software LAS AF (Leica Microsystem) was used to analyze fluorescent images.
Inside each picture, one gate for each daughter cell was drawn, using CD25 as a
marker, and threshold intensities of total pixels were determined for Numb. The
positively staining pixels on each daughter cell were expressed as a percentage of
the total pixels in the sum of the two gates, for each picture. This was performed
for all pictures of each z-stack. As a result, each daughter cell was associated with a
percent of positive pixels (which corresponds to the percent of inherited Numb
protein).
RNA Analysis. Total RNA was extracted with RNasy Kit (Quiagen). RT-PCR was
carried out with an I Script cDNA Synthesis Kit (Biorad). The resulting cDNA pool was
amplified by 40 cycles of PCR. The RT-PCR primers were mouse 18S (5' sense,
CGGCTACCACATCCAAGGAA; 3' antisense, GCTGGAATTACCGCGGCT ), Hes1 (5' sense
GCCAGTGTCAACACGACACCGG; 3' antisense, TCACCTCGTTCATGCACTCG). Fold
differences were calculated after normalizing cDNA levels of 18S transcripts.
Statistical Analysis. Statistical comparisons were made using the Student t-test.
Differences were considered statistically significant if p <0.05.
Results
Double negative thymocytes segregate asymmetrically Numb, but not
the pre-TCR, during cell division.
In order to explore asymmetric division in thymocytes, we focused on fetal
day-15 thymus, where most cells are at the DN stage, as evidenced by flow
cytometry (Fig. 1A) and immunofluorescence (high frequency of CD25+ cells, Fig.
1B). CD25 was used to detect dividing cells because it is only expressed on DN2 and
DN3 thymocytes and it is not polarized or asymmetrically segregated during signaling
and cell division (our own observations). We analyzed frozen sections of day 15 fetal
thymii by immunofluorescence, using TOPRO (to detect DNA), CD25 and Numb. We
were able to localize high numbers of CD25+ dividing cells at all stages of mitosis
(Fig. 1C). Since DN2 thymocytes do not divide and DN4 thymocytes do not express
CD25, these cells were at the DN3 stage. We observed Numb polarization in 43% of
CD25+ pre-mitotic DN3 cells. In dividing DN3 thymocytes, Numb was polarized in
most cells at the prophase and metaphase stages of mitosis (Fig. 1C, higher panels).
At the anaphase stage Numb did not polarize (Fig. 1C, middle panel), while at the
telophase stage, it was inherited exclusively by one of the daughter cells in 30% of
the cases, and equally segregated into both daughter cells in the rest of the cases
(Fig. 1C, lower panels). The fact that Numb looked homogeneously distributed at
anaphase was surprising. We hypothesized that some degree of asymmetry could
exist at anaphase that would not be detected by simple visual examination. To study
this possibility, we quantified Numb in the two daughter cells of dividing fetal
thymocytes at anaphase (see Methods). For each telophase, “dividing cell #1”
(DC#1) was the daughter cell with more Numb, and “dividing cell #2” (DC#2) the
daughter cell with less Numb. If Numb were always distributed homogeneously
between the two daughter cells at anaphase, the values for Numb intensity on DC#1
and DC#2 would always be similar. However, this was not the case (Fig. 1D).
Although some pairs of cells showed equal Numb inheritance at the anaphase stage,
there was a significant difference in 3 of the 10 analyzed Z stacks (Table 1, see
column marked DC#1/DC#2). These cells were probably destined to segregate Numb
asymmetrically at the telophase stage. Therefore, as expected, the percentage of
cells that presented asymmetric Numb segregation was similar at the anaphase and
telophase stages, but the degree of asymmetry seemed greater at telophase. Taking
into account that Numb is a marker of asymmetric division, these data show that a
subset of developing thymocytes divides asymmetrically.
Numb is co-localized with the TCR machinery in mature lymphocytes [100]-
[111], therefore we wanted to investigate how Numb localizes relative to the pre-TCR
in DN thymocytes. We analyzed by confocal microscopy pre-TCR localization in
dividing fetal thymocytes, and we did not find asymmetric pre-TCR segregation: all
the telophases showed uniform membrane (including the nascent membrane) and
cytoplasmic pre-TCR localization (Fig. 2A). In order to exclude the possibility that the
observed pre-TCR staining on sections might be unspecific, we stained fetal thymus
sections using an isotype control and observed no unspecific staining caused by the
secondary antibody (data not shown). We also stained adult thymus sections using
anti-preTα, CD4 and cytokeratin (expressed on thymic stromal cells, see [146]). If
the anti-preTα antibody is specific, there should be no staining on thymocytes located
either in the adult cortex (DPs) or medulla (SPs). Indeed, we could not detect pre-
TCR staining on CD4+ thymocytes (Sup. Fig. 1A, B); there was some degree of
staining, but it always correlated with cytokeratin (Sup. Fig. 1A, B). Since cytokeratin
staining in d15 fetal thymus is absent (our own observations), the observed pre-TCR
staining on fetal thymus sections must be specific.
To study pre-TCR localization during the cell cycle, we analyzed dividing fetal
thymocytes at the prophase stage, and could observe that the pre-TCR is always
polarized at the prophase and metaphase stages, similar to Numb (Fig. 2B). This
indicates that probably Numb polarization during the prophase in thymocytes is
related to signaling. If this is the case, thymocytes not receiving pre-TCR signals
would not polarize Numb during the prophase. To address this question, we analyzed
Numb localization in dividing Rag-/- thymocytes and, accordingly with our hypothesis
that Numb localization in dividing thymocytes is related to pre-TCR signaling, we
found that Numb is neither polarized or asymmetrically segregated in dividing Rag -/-
thymocytes (Fig. 2C). Together, these data indicate that Numb may be needed for
pre-TCR signaling and asymmetric division at the DN stage.
Functional Numb levels in thymocytes determine adult thymus size.
In order to further investigate the role of Numb in thymocyte development, we
used mice that expressed either a dominant negative Numb (dnNb TG mice) or full
length Numb (Numb TG mice) under the human CD2 promoter. DnNb TG mice
express the Numb PTB domain, while Numb TG mice over-express the full length p71
Numb isoform. A truncated protein similar to dnNb has a dominant negative effect in
neural cells [108].
Both the dnNb and the Numb construct contained the human Myc tag,
therefore we used an anti-hMyc tag antibody to detect by western blotting transgenic
proteins in thymocytes of the transgenic mice. We found that, while there was no
detectable hMyc epitope in WT mice, both Numb and dnNb TG thymocytes expressed
large amounts of transgenic protein, and these could be distinguished by their size,
since dnNb is a truncated product (Fig. 3A). Taking advantage of the size difference,
we verified that dnNb x Numb TG mice expressed both transgenic proteins (Fig. 3A).
Additionally, we performed western blotting to detect dnNb protein in DN thymocytes
of dnNb TG mice, and could confirm the expression of high quantities of the
transgenic protein in this cell subset (Fig. 3B).
We observed in Numb TG mice, compared with WT mice, an increase in
cellularity of both the DN and the DP compartments (Fig. 3C). Conversely, dnNb TG
mice showed a marked decrease in absolute numbers of these two thymic
subpopulations (Fig. 3D). The same results were obtained for two independent lines
of either dnNb or Numb TG mice (Supplemental Fig. 2, and our own observations).
Since DP thymocytes do not divide, differences in DP cellularity are originated at the
DN stage, therefore we analyzed by flow citometry the different DN thymocyte
subpopulations in transgenic mice. We observed a block at the DN3 stage in dnNb TG
mice, as compared with WT mice, with a 2-fold increase in the percentage of DN3 and
a 2-fold reduction in the percentage of DN4 thymocytes (Fig. 3E). This block was
absent in Numb TG, and was reverted by Numb over-expression in dnNb x Numb TG
mice, (Fig. 3E). The fact that sole over-expression of Numb is able to revert the dnNb
TG phenotype indicates that the dnNb protein is exclusively inhibiting Numb.
Interestingly, we observed a gradation in thymus cell numbers as functional levels of
Numb increased, starting with dnNb TG mice to reach a maximum in Numb TG mice
(Fig. 3F).
Impaired proliferation in the thymus of dnNb TG mice.
The results described above suggest that inhibiting Numb interferes seriously
with thymic development. Since both proliferation and pre-TCR signaling start during
the DN3 stage, we wanted to study the effect of Numb inhibition on these processes.
To study thymocyte proliferation, we used the OP9 system [147], which consists on
two cell lines, OP9 and OP9-DL1, the later expressing a Notch ligand that enhances
Notch signaling and differentiation into the DP stage. We labeled d15 fetal WT or
dnNb TG thymocytes with CFSE and co-incubated them with OP-9 or OP9-DL1 cells
for 6 days. While few thymocytes expressing CD4 and/or CD8 developed on OP9 cells
after a 6-day incubation, the number increased considerably in both WT and dnNb TG
mice when fetal thymocytes were incubated with OP9-DL1 cells (Fig. 4A). As
expected, very few DN3 and DN4 cells developed on OP9 cells, but these numbers
were higher when incubated on OP9-DL1 cells, and the observed DN3 block in dnNb
TG thymocytes was still observed (Fig. 4B). Analysis of CFSE binding on the
recovered thymocytes showed that dnNb thymocytes had proliferated to a lesser
extent than WT thymocytes (Fig 4C). Thus, Numb inhibition results in decreased
proliferative potential of DN thymocytes.
We suspected that dnNb inhibited Numb by competing for endogenous Numb
binding sites. Obviously, dnNb would not be able to exert normal Numb function at
those sites because of lacking the C-terminus. Therefore, we analyzed Numb and
dnNb localization on CD25+ fetal thymocytes by confocal microscopy. The Numb
antibody used in our studies is raised against the Numb C-terminus, which is absent
from the dnNb protein, therefore it only recognizes endogenous Numb, while dnNb
can be detected using an anti-Myc antibody. We observed that, as we hypothesized,
dnNb is localized at the cell membrane, and polarizes together with endogenous
Numb in CD25+ thymocytes (Fig. 4D). This is consistent with competence between
Numb and dnNb for binding sites: probably, dnNb partially blocks Numb access to its
physiological sites.
Increased Notch signaling and abnormal pre-TCR expression in dnNb
TG DN thymocytes.
We hypothesized that Numb inhibition would result in increased Notch
signaling, evidenced by augmented Hes-1 mRNA levels in thymocytes. This was,
indeed, the result obtained by analyzing Hes-1 expression in WT and dnNb
thymocytes by RT-PCR (Fig. 5A). Taking into account the observed parallelism in
asymmetric protein segregation between Notch and the pre-TCR, and the fact that
Numb co-localizes with the pre-TCR, the question arose of whether Numb inhibition
would enhance pre-TCR signaling, in a similar way to its described effect on Notch.
We looked first at pre-TCR surface levels by flow cytometry using an antibody
against the pTα chain, and observed that dnNb TG DN thymocytes expressed higher
pTα surface levels than WT DN thymocytes (Fig 5B). Increased pre-TCR levels on the
surface of developing thymocytes would result in enhanced pre-TCR signaling,
therefore we analyzed CD5 expression on DN thymocytes of WT and dnNb TG mice.
CD5 expression was increased at both the DN3 and DN4 stages in dnNb TG
thymocytes, as compared with WT thymocytes (Fig. 5B). Conversely, DN thymocytes
of Numb TG mice expressed lower CD5 levels, as compared to the WT (data not
shown).
If DN thymocytes of dnNb TG mice express higher surface pre-TCR levels and
present increased CD5 expression as a consequence of enhanced pre-TCR signals,
this may result in either death or premature differentiation [148]. In order to assess
whether a higher fraction of DN thymocytes is undergoing cell death in dnNb TG
compared to WT mice we performed Annexin-V staining and observed that indeed,
there is more cell death in DN thymocytes of dnNb TG mice (Fig. 5B). However, the
thymus of dnNb TG mice contained DP and SP thymocytes, indicating that not all the
DN thymocytes die; we therefore wanted to investigate how excessive pre-TCR levels
affect those DN thymocytes that end up developing into SP cells. In mice deficient for
Numb and Numblike, neural progenitors differentiate prematurely, before expanding
[78]. We hypothesized that DN thymocytes receiving enhanced pre-TCR signaling
would bypass the proliferation burst associated with the DN-DP transition,
differentiating prematurely into DP thymocytes, which would be the cause of the
observed decrease in thymus size. DN thymocytes must down-regulate both CD25
and pre-TCR levels previous to transitioning to the DP stage, therefore an indicator of
premature differentiation would be high surface CD25 and/or pre-TCR expression at
the DP stage. We observed increased surface levels of these two proteins in DP
thymocytes of dnNb mice, as compared with WT mice (Fig. 5C). In addition, CD5
levels were also increased in DP thymocytes of dnNb TG mice (Fig. 5C). Using TOPRO,
we observed an increase of apoptotic nuclei, with the characteristic DNA
fragmentation, in dnNb TG fetal thymii, as compared with WT thymii (Fig. 5D and E).
Together, these results indicate that excessive pre-TCR signaling induces cell death in
a fraction of DN thymocytes and a premature DN3-DP transition in another subset of
DN thymocytes in dnNb TG mice.
Such changes in proliferation may affect the number of thymocytes undergoing
each stage of the cell cycle, therefore we counted the number of metaphases and
telophases on fetal thymic sections of WT, dnNb TG or Numb TG mice, stained with
TOPRO. We found more metaphases and less telophases in dnNb TG than in WT fetal
thymii, conversely there were less metaphases and more telophases in Numb TG than
in WT fetal thymii (Fig. 5F). This may indicate that thymocytes progress faster
through the cell cycle in Numb TG mice than in either WT or dnNb mice, while the
opposite effect is caused by Numb inhibition in dnNb TG mice.
Defect in c-Cbl endosomal localization in dnNb TG DN thymocytes.
In view of the data presented above, we hypothesized that the dnNb protein
must be interacting (perhaps even more efficiently than endogenous Numb) with
proteins implicated in pre-TCR signaling in thymocytes. If this happened, endogenous
Numb would be excluded from sites where its function is needed for normal
development. In this aspect it is interesting that the ubiquitin ligase c-Cbl, an
essential player in pre-TCR signaling and early thymocyte development [149], co-
immunoprecipitates with Numb [100]. Moreover, there is a remarkable parallelism
between the phenotypes of c-Cbl/Cbl-b double knockout and dnNb TG mice, both of
which show reduced thymus size and abnormal pre-TCR surface expression on both
DN and DP thymocytes. In order to assess whether dnNb expression affected c-Cbl
function, we stained 15-day WT and dnNb TG fetal thymic sections using antibodies
against Numb and c-Cbl. C-Cbl was expressed at high levels in both WT and dnNb TG
thymii. However, while c-Cbl was localized in vesicles in fetal WT thymocytes, it was
mostly on the membranes of dnNb TG fetal thymocytes (Fig. 6A). Interestingly, Numb
expression pattern was largely conserved in dnNb TG mice (Fig. 6A). When both
proteins were observed on the same image (Fig. 6A, Merge), there was an evident
loss of “yellow dots” (c-Cbl+ Numb+ vesicles) in dnNb TG thymii, as compared with
the WT. Detailed quantification of vesicles containing Numb, c-Cbl, or both in CD25+
fetal thymocytes showed that, while the average number of Numb containing vesicles
per cell did not change in dnNb TG mice with respect to WT mice, there was an
important decrease in the average number of both c-Cbl+ and double positive
Numb+/c-Cbl+ vesicles per cell in dnNb TG mice, as compared with WT mice (Fig.
6B).
We wanted to investigate whether the observed vesicles corresponded to
endosomes, therefore we stained fetal thymic sections with an antibody against
ubiquitin, together with either Numb or c-Cbl. We found that both Numb and c-Cbl
containing vesicles also contained ubiquitin (Sup. Fig. 3A, B). The fact that c-Cbl
access to endosomes is blocked in dnNb TG mice suggests that dnNb must be able to
access sites normally occupied by endogenous Numb, displacing endogenous Numb
from those sites. Numb is probably a mediator of c-Cbl access to endosomes,
therefore expressing a truncated Numb protein blocks this process, interfering with
pre-TCR degradation. This would result in more pre-TCR bound to ubiquitin on the
surface of dnNb TG CD25+ thymocytes as compared to WT thymocytes. We observed
this effect by visualizing pre-TCR together with ubiquitin on fetal thymic sections (Fig.
6C). Also, changes in TCRβ localization would be expected in dnNb TG thymocytes.
We analyzed TCRβ expression on CD25+ fetal thymocytes and could observe high
TCRβ expression on the membrane of dnNb TG DN thymocytes (Sup. Fig. 3, C). This
is in agreement with the observed excessive pre-TCR signaling in dnNb TG
thymocytes.
Symmetric Numb segregation in Numb TG mice.
It is known that little Numb is necessary to guarantee normal asymmetric
division [150], however it is not known how excessive Numb levels affect this
process. Visualization of Numb expression in cycling Numb TG CD25+ DN thymocytes
on fetal sections revealed homogeneous, high Numb expression on both daughter
cells at all stages of cell division (Fig. 7A, higher panels). Interestingly, similar results
were obtained by analyzing dnNb TG mice (Fig. 7A, lower panels). Numb signal on Z-
stacks corresponding to dividing DN3 thymic cells at the telophase stage of WT, Numb
TG and dnNb TG mice was quantitated (see Methods). Our analysis showed that,
while there was a high degree of asymmetry in WT mice at telophase (higher than at
the anaphase stage, see Fig. 7B and Table 2), both Numb TG and dnNb TG
thymocytes segregated Numb in a more symmetric fashion (Fig. 7B and Table 2). The
fact that dnNb TG mice show a more symmetric Numb segregation in thymocytes is
irrelevant in terms of asymmetric division, given that endogenous Numb function is
blocked by dominant negative Numb. It rather adds to the notion that Numb
degradation is inhibited by dominant negative Numb. These data show that, during
asymmetric division in the thymus, it is not the quantity of Numb inherited by each
cell, but its functionality as an internalization adaptor, what determines the different
daughter cell fates.
Discussion
Although asymmetric division is associated with precursor differentiation in an
increasing number of developing organs, the question of whether this also applies to
thymocyte development has remained elusive. We have explored this matter by
visualizing dividing thymocytes on fetal thymic frozen sections. Our finding that Numb
asymmetrically segregates in a subset of dividing fetal thymocytes is in good
agreement with the observed pattern of Numb segregation during mouse cortical
neurogenesis [107, 151]. On the other hand, both Numb and the pre-TCR polarize
early during the cell cycle, indicating a possible role for Numb in pre-TCR signaling.
Localization of the pre-TCR on lipid rafts [152] and its polarization associated with
signaling [153] had been observed before. Therefore, despite its capacity to signal in
a ligand-independent fashion, the pre-TCR is probably able to signal more efficiently
when the TCR signaling machinery is polarized. Moreover, Numb seems to be
associated with this machinery in DN thymocytes. Membrane pre-TCR localization
through the cell cycle indicated that, although pre-TCR synthesis is stopped early
[144], its expression and signaling must continue through the cell cycle. Based on our
data showing that Numb, but not the pre-TCR is asymmetrically segregated, it can be
speculated that when the division is asymmetric, the cell inheriting both Numb and
pre-TCR continues proliferating, while the cell inheriting pre-TCR but not Numb
differentiates further. This is a simple model, based on data from other systems
where symmetric division has been studied in detail [102, 103, 106]. In this regard,
our observation that, in fetal thymus, just 30% of the precursors divide
asymmetrically seems logical, since at this stage of development proliferation must
be promoted at the expense of differentiation to ensure correct numbers of
thymocytes in the adult organ. Possibly, at later stages of development (e.g. adult
thymus) differentiation may be promoted at the expense of proliferation, by changing
the symmetric/asymmetric division rate.
In this context, the mild block at the DN3 stage observed in mice where Numb
and Numblike had been conditionally deleted (see Fig. 4C in [109]) and the down-
modulation of Notch target genes in thymocytes of mice over-expressing p61 Numb
[110] both support the idea that Numb may modulate important signaling events at
early stages of development. The mentioned knockout study must be interpreted with
caution, in the light of data showing that as little as 5% of normal levels of Numb or
Numblike is enough to guarantee normal asymmetric division and development in
mammalians [150]. It is possible that, in the work by Wilson and colleagues,
remnants of Numb and Numblike in precursors were enough to allow thymocyte
development, resulting in the observed mild defect. We have used a dominant
negative approach to avoid these and other problems related to knockout models
[154]. A dominant negative protein binds to the same ligand than the endogenous
protein, but is functionally defective. In dnNb TG mice, the dnNb protein should bind
to endogenous Numb PTB ligands, but proteins that are normally associated to the
Numb C-terminus would be excluded from the complexes. In the case of c-Cbl, it is
associated to endogenous Numb in endosomes of WT, but not dnNb TG DN
thymocytes. Therefore, dnNb does probably bind to Numb ligands within the TCR
complex but is unable to bind to c-Cbl and help it translocate into the endosomes
because of lacking the C- terminus, necessary for this function [95, 97]. The
similarity between c-Cbl/Cbl-b knockout [149] and dnNb TG thymic phenotypes does
also favor this notion. Thus, our data indicate a role for Numb in facilitating c-Cbl
access to endosomes. Obviously, this affects pre-TCR degradation and signaling, since
c-Cbl is directly involved in this function [149]. It is important to note that protein
degradation plays an essential role during development [155] and asymmetric
division [156, 157], therefore a link between Numb and pre-TCR degradation seems a
reasonable developmental mechanism to regulate thymic development.
Another indication of the mechanism by which dnNb blocks Numb function
comes form visualization of endogenous Numb in dnNb TG DN thymocytes. The fact
that endogenous Numb is not polarized in premitotic thymocytes of dnNb TG mice
indicates that dnNb associates with pre-TCR complexes on the membrane. However,
without the C-terminus dnNb does not allow pre-TCR translocation into the
endosomes. This results in the observed pre-TCR accumulation on the cell surface and
endogenous Numb cytoplasmic distribution in dnNb TG thymocytes. We have
excluded the possibility that dominant negative Numb may inhibit other PTB-
containing proteins other than Numb by showing that Numb over-expression reverts
the dominant negative phenotype. Additionally, the observed opposite effects on
thymus size by either inhibiting or over-expressing Numb, and the lack of asymmetric
Numb segregation in Numb TG thymocytes indicate that Numb and asymmetric
division play a key role in regulating thymus size.
Together, the data support a model for thymocyte asymmetric division where
Numb presence in daughter cells mitigates pre-TCR signaling and allows further
proliferation. On the other hand, dividing thymocytes that do not inherit Numb
receive more pre-TCR signals and differentiate (Fig 7C). It seems, thus, clear that
Numb directs thymocyte decisions between differentiation and division. This is in
agreement with the proposed general role of asymmetric division as a way to
diversify cell progeny [158]. Future studies in the thymus and other organs will,
hopefully, clarify what cues above Numb dictate at a certain developmental stage the
rate of precursor differentiation versus proliferation.
Acknowledgments
We thank Drs. Weimin Zhong (Yale University, New Haven, U.S.) for
discussion and support, M.L. Toribio (CBMSO, Madrid, Spain), B.J. Fowlkes
(NIADID, NIH, U.S.) and S. Hilfiker (IPBLN, Granada, Spain) for discussion, B.J.
Fowlkes for providing Numb and dnNb transgenic mice, Juan Carlos Zuniga-Pflucker
for providing OP9 and OP9-DL1 cells, Francisco Ferrer and Maria Isabel Gutierrez for
expert technical mouse work, Jose Luis Luque for expert technical help with
microscopy. The work was funded by grants BFU2004-01771 and BFU2007-67476
from the Spanish Science and Education Ministry, a Special Intramural CSIC
(Spanish Science Council) grant and the Excellence Grant P06-CTS-02112 from the
Department of Science and Innovation of the Regional Government of Andalucia,
Spain. R.A. was supported by an I3P CSIC scholarship co-financed by the European
Social Fund.
Authorship
R.A. and N.M. planned, designed and performed the experiments.
M.C. planned, designed, performed the experiments and wrote the paper.
Conflict-of-interest disclosure: The authors declare no competing
financial interests.
References
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Tables
Table I. Percentages of Numb in each daughter cell at anaphase
DC# 1
DC# 2
DC#1/DC#2
60,69
39,00
1,56
55,44
44,56
1,24
54,00
46,00
1,17
53,00
47,00
1,13
52,86
47,14
1,12
52,75
47,25
1,12
51,56
48,44
1,06
51,30
48,70
1,05
51,00
49,00
1,04
50,72 49,27
1,03
Table II. Percentages of Numb inherited by each daughter cell at telophase
WT
Numb TG
dnNb TG
DC#1
DC#2
DC#1
DC#2
DC#1
DC#2
71,36
28,64
58,77
41,23
59,50
40,50
65,14
34,86
56,90
43,00
59,32
40,68
60,00
40,00
56,00
44,00
54,00
46,00
58,49
41,51
56,00
44,00
52,91
47,09
58,00
42,00
54,52
45,48
52,72
47,28
57,00
43,00
53,32
46,68
52,00
48,00
53,60
46,39
53,00
47,00
53,44
46,56
52,40
47,60
53,24
46,76
52,20
47,80
51,96
48,04
50,34
49,66
Figure Legends
Figure 1- Asymmetric Numb segregation in dividing thymocytes. (A) CD4
and CD8 expression in fetal thymocytes of WT mice, analyzed by flow cytometry.
(B) Confocal image of a 15d fetal frozen WT thymus stained with CD25 in red. (C)
Confocal images of mitotic WT fetal thymocytes stained with antibodies against
Numb (green), CD25 (red) and treated with TOPRO-3 iodide (blue). The images are
representative of at least three independent experiments. (D) Percentage of Numb
protein contained in each daughter cell at the anaphase stage. Quantification of
Numb signal was performed as indicated in Methods. DC #1 and #2 represent the
daughter cells that inherited more and less Numb on each z-stack, respectively. A
total of ten anaphases were analyzed.
Figure 2- Symmetric pre-TCR segregation in dividing thymocytes (A)
Confocal images of WT fetal mitotic thymocytes at the telophase stage stained with
antibodies against CD25 (red), pre-TCR (green) and treated with TOPRO-3 iodide
(blue). (B) Confocal images of WT fetal mitotic thymocytes at the prophase (upper
panels) and metaphase (lower panels) stages stained with antibodies against pre-
TCR (red), Numb (green) and treated with TOPRO-3 iodide (blue). (C) Confocal
images of mitotic Rag2-/- thymocytes in prophase, metaphase, anaphase and
telophase stages stained with antibodies against CD25 (red), Numb (green), and
treated with TOPRO-3 iodide (blue). The images are representative of at least three
independent experiments.
Figure 3- Levels of functional Numb correlate with thymus cellularity. (A)
Western-blot analysis, using an anti-Myc tag antibody, of dnNb and p71 Numb
expression in thymus of WT, Numb TG, dnNb TG and dnNb x Numb TG mice. (B)
Western-blot analysis, using an anti-Myc tag antibody, of dnNb expression in DN
thymocytes of WT and dnNb TG mice. (C) Absolute numbers of DN and DP cell
subsets in thymus of WT (black) and Numb TG (grey) mice. (D) Absolute numbers
of DN and DP cell subsets in thymus of WT (black) and dnNb TG (grey) mice. (E)
CD25 and CD44 expression in Lin- thymocytes of 4-week old WT, Numb TG, dnNb
TG and dnNb x Numb TG mice. (F) Total cell numbers in dnNb TG (grey), dnNb x
Numb TG (white), WT (black) and Numb TG (light grey) adult thymii. Means ± SD of
at least three independent experiments are plotted.
Figure 4- Proliferation block in DN thymocytes of dnNb TG mice.
(A) Maturation of WT and dnNb TG fetal (15d) thymocytes to the DP stage after 6
days of co-culture with OP9 or OP9-Deltalike cells. The DP stage was monitored by
expression of CD4 and CD8. (B) Differentiation of WT and dnNb TG fetal DN
thymocytes after 6 days of co-culture with OP9 or OP9-Deltalike. Lin- thymocytes
were stained with CD44 and CD25. (C) CFSE expression in fetal thymocytes of WT
(solid line) or dnNb TG (broken line) mice cultured for 6 days over OP9-Deltalike
cells. (D) Confocal images of fetal thymocytes of WT (upper panels) and dnNb TG
(lower panels) mice stained with Numb (green), dnNb (anti-Myc, red) and CD25
(blue). Data are representative of at least three independent experiments.
Figure 5- Increased surface pre-TCR levels, apoptosis and premature
differentiation in dnNb TG thymocytes. (A) HES-1 gene expression levels,
measured by RT-PCR, in WT (black) and dnNb TG (grey) thymocytes. (B) Pre-TCR
(upper panel), CD5 (middle panel) and Annexin V (bottom panel) flow cytometry
measurement of DN3, DN4 or total DN WT or dnNb TG thymocytes. WT-solid line;
dnNb TG- broken line. (C) Pre-TCR (upper panel), CD5 (middle panel) and CD25
(lower panel) flow cytometry measurement in WT or dnNb TG DP thymocytes. WT-
solid line; dnNb TG- broken line. (D) Confocal images of fetal thymic frozen
sections treated with TOPRO-3 to detect DNA. Apoptotic nuclei are marked with red
arrows. (E) High magnification images of the nuclei marked with red arrows in (D).
(F) Average number of metaphases (left panel) and telophases (right panel) per
fetal thymic section of WT (black), dnNb TG (dark grey) or Numb TG (light grey)
mice. All data are representative of at least three independent experiments.
Figure 6- Less endosomal Numb and more ubiquitylated membrane pre-TCR
in fetal dnNb TG thymocytes. (A) Confocal images of fetal thymic frozen sections
stained with antibodies against Numb (red), c-Cbl (green) and CD25 (blue). (B)
Average number of CD25+ cells containing from zero to four c-Cbl+, Numb+ and c-
Cbl+Numb+ vesicles. Four independent images for each line (WT and dnNb TG)
were processed. For co-localization, analysis masks for c-Cbl (green colour) and for
Numb (red colour) were made with Photoshop 7.0. Numbers of vesicles per CD25+
cell in each mask were counted. The same analysis was performed in masks
containing Numb and c-Cbl together (yellow colour). An average of 34 and 45
CD25+ cells per image were counted for WT (black bars) and dnNb TG (grey bars),
respectively. (C) Confocal images of fetal thymic frozen sections of WT (left panel)
and dnNb TG (right panel) mice, stained with antibodies against ubiquitin (red),
pre-TCR (green) and CD25 (blue). White arrows point to cells with intracellular
ubiquitin+/pre-TCR+ vesicles (left panel) or membrane ubiquitin+/pre-TCR+
accumulations (right panel). All data are representative of at least three
independent experiments.
Figure 7- Symmetric Numb segregation in Numb and dnNb TG DN
thymocytes. (A) Confocal images of mitotic Numb TG (upper panels) or dnNb TG
(lower panels) fetal thymocytes at metaphase, anaphase and telophase stages
stained with antibodies against CD25 (red), Numb (green) and treated with TOPRO-
3 iodide (blue). The images are representative of at least three independent
experiments. (B) Percentage of Numb inherited by each daughter cell at the
telophase stage in WT (♦), Numb TG (•) and dnNb TG (�) mice. A total of 10 (WT
and Numb TG mice) and 6 (dnNb TG mice) Z-stacks were analyzed. (C) A model of
Numb influence on thymocyte decisions.
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