Tema:12. Obtención y análisis de datos cinéticos.
1. Integración de la ecuación de Michaelis-Menten: 1.1. Orden cero de reacción 1.2 . Orden uno de reacción 1.3. Orden mixto de reacción
2. Linearización de la ecuación de Michaelis-Menten: 2.1. Representación de dobles inversos o de Linenweaver-Burk. 2.2. Representación de Hanes 2.3. Representación de Eadie-Hofstee.
2.4. Representación lineal directa o representación de Einsenthal y Cornish-Bowden
1. Integración de la ecuación de Michaelis-Menten: Estudio de acuerdo con el orden de reacción
Dependencia de la velocidad con respecto a la [S]
SKm
SVv
max
maxmax VS
SV
dt
dSv
tVSoSt
dtVdS
max
max
1.1. Orden cero de reacción
S>>>Km10 veces la Km
Integrando entre So y St y entre 0 y t
Permite comparar cantidades totales de enzima
Vmax1= kcat [E01] Vmax2= kcat [E02]
2max
1max
02
01
V
V
E
E
La razón de las cantidades de enzima es proporcional a la razón de velocidades máximas o de las actividades enzimáticas obtenidas experimentalmente
Comparar cantidades de una misma enzima de un tejido o en circunstancias metabólicas diversas, diferenciación, patologías, etc
1.2. Orden uno de reacciónS<<<<KmA concentraciones 1/10 Km
SKm
SVv
max
Km
SV
dt
dSv max
tKm
V
tSt
So
eSoSt
tKm
V
St
So
tKm
VSoSt
dtKm
V
S
dS
max
0
maxln
maxlnln
max
Integrando entre S0 y St
Conociendo cantidad incial de enzima [Eo] puede obtenerse la
constante de especificidad (kcat/Km)
Obtener el valor de Vmax/Km
1.3. Orden mixto de reacción
SKm
SVv
max
t
SS
KmKm
V
St
So
t
tVStSoSo
StKm
dtVdsdt
dSKm
dtVS
SKmdS
SKm
SV
dt
dSv
to
St
So
tSt
So
)(1maxln
1
maxln
max
max
max
0
Km
m1
S ≈ Km
Dividiendo los dos términos por Km y por t
VmaxSt
So
tln
1
t
SS to )(
Linearización de la ecuación integrada de M-M a S ≈ Km
Estudiando el avance de una sola reacción cuando estamos en orden mixto se pueden obtener:
Vmax y Km
Para obtener los parámetros cinéticos de una enzima lo que solemos hacer es obtener la velocidad inicial, v, a diferentes concentraciones de S.
v frente a [S]
Lo primero es obtener los correspondientes parámetros cinéticos.
2. Linearización de la ecuación de Michaelis-Menten
v
[S]
Vmax
SKm
SVv
max
Imaginemos que estamos estudiando una reacción S P catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes resultados:
[S] (mmol L-1) vo(mol L-1 min-1)0,30 0,570,50 0,850,75 1,181,50 1,823,00 2,507,50 3,23
A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la representación V [S].
Calcúlenlo ahora y escriban sus resultados en la pizarra.
* Estas dificultades, fueron ya tenidas en cuenta por Michaelis y Menten, quienes intentaron representar v frente a log[S]. Esta
representación tiene ciertas ventajas, aparte de su valor histórico, pero debido a su poco éxito, en la bioquímica moderna, no
comentaremos nada más sobre ella.
Como acabamos de ver la representación de v frente a [S] es poco útil para estos fines, debido a:
- la dificultad para dibujar con precisión una hipérbola rectangular
- la dificultad para encontrar las asíntotas (Vmax), de manera correcta, y consecuentemente para calcular Km
Analicen los datos.
¿Alguna conclusión?
Para resolver este problema, y poder calcular Vmax y Km con mayor fiabilidad, se han propuesto varios procedimientos o
métodos. La mayoría de ellos basados en la linealización de la ecuación de Michaelis-Menten
Quizás las tres representaciones más usadas sean:
- Representación de Linenweaver-Burk o de dobles inversos (1/v 1/[S])
- Representación de Hanes ([S]/v [S])
- Representación de Eadie-Hofstee (v v/[S])
Además de estas tres representaciones, basadas en la linealización de la ec. de M&M, existe una curta basada en la
representación directa v [S], o representación de Einsenthal y Cornish-Bowden.
- Si escribimos la ecuación de Michaelis-Menten en su forma inversa, obtenemos:
1 1 Km 1
---- = ------------- + ------------- ---------
v Vmax Vmax [S] y = b + m x
SV
Km
SV
S
v
SV
KmS
v
maxmax
1
max
1
2.1.Representación de dobles inversos o de Linenweaver-Burk
1/v
1/[S]
1/Vmax
- 1/Km
m =Km/Vmax
-Pendiente Km/Vmax
-Corte en el eje-x 1/v =0 -1/Km
-Corte en el eje-y 1/[S] =0 1/Vmax
1/v
1/[S])
La representación más utilizada, no es la más recomendable ya que da impresiones extremadamente engañosas de los errores experimentales: así para pequeños valores de v, pequeños errores en la medida de v, conducen a grandes
errores en 1/v, mientras que para valores grandes de v los mismo pequeños errores en la medida de v conducen a errores apenas apreciables en 1/v.
Si multiplicamos ambos miembros de la ec. de dobles inversos, por [S], obtendremos,
La representación de [S]/v frente a [S], da una recta:
y = b + m x
- Esta representación se conoce como representación de Hanes, representación de Woolf o de Hanes-Woolf.
2.2. Representación de Hanes
SVV
Km
v
S
max
1
max
SSV
Km
Vv
1
maxmax
11
maxmax V
S
V
Km
v
S
[S]/v
[S]
Km/Vmax
- Km
m = tg = 1/Vmax
Pendiente = 1/Vmax
corta en el eje [S]/v en un punto = Km/Vmax,
corta en el eje [S] en un punto = - Km
* En esta representación, como puede verse en la siguiente figura, los errores en [S]/v son un reflejo mucho más fiel de los errores cometidos al medir el valor de v. Por este motivo, la representación de Hanes es preferible a otras linealizaciones de la ecuación
de Michaelis-Menten.
[S]/v
[S]
¿Cómo afectarán los errores de medida de la velocidad de reacción en esta representación?
Tarea 1 Imaginemos que estamos estudiando una reacción S P catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes resultados:
[S] (mmol L-1) vo(mol L-1 min-1)0,30 0,570,50 0,850,75 1,181,50 1,823,00 2,507,50 3,23
A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la representación de Hanes.
Si multiplicamos ambos miembros de la ecuación de inversos por v * Vmax
obtenemos,Vmax = v + (Km v)/[S]
y reordenando
y = b - m x
Esta representación se conoce como representación de Eadie-Hofstee
2.3.Representación de Eadie-Hofstee.
Sv
KmVv max
max1
maxmax
11vV
SV
Km
Vv
La representación de v frente a v/[S] nos da una recta de:- pendiente = -Km- corte en el eje v = Vmax- corte en el eje v/[S] = Vmax/Km
v
v/[S]
Vmax
Vmax/Km
m = tg = -Km
Esta representación en general proporciona resultados realmente buenos, ya que v aparece en ambas coordenadas
como factor multiplicativo, por lo que los errores cometidos en la medida de v, harán que la curva se acerque o aleje del origen en
lugar de hacerlo paralelamente al eje de ordenadas.
v/[S]
v
Esta representación, contrariamente a la de dobles inversos que hace aparecer como buenos malos resultados, hace
aparecer como malos, buenos resultados, dificultando grandemente el ocultamiento
de puntos que se desvíen de la recta.
Aspectos Positivos
Aspectos Negativos
Por lo que esta representación es la más adecuada para el estudio de comportamientos que se desvíen del modelo de Michaelis-Menten.
Tarea 2 Imaginemos que estamos estudiando una reacción S P catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes resultados:
[S] (mmol L-1) vo(mol L-1 min-1)0,30 0,570,50 0,850,75 1,181,50 1,823,00 2,507,50 3,23
A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la representación de Eadie-Hofstee.
Independientemente, en 1974:
- J. Jiménez Vargas y J.M. Macarulla. Fisicoquímica Fisiológica, Interamericana (4ª Edición), Madrid, (1974)
- R. Eisenthal y A. Cornish-Bowden. Biochem J., 139, 715-720, (1974)
* Publicaron un procedimiento, totalmente diferente a los anteriores, para la obtención de Vmax y Km, conocido como
representación lineal directa.
2.4.Representación lineal directa o representación de Einsenthal y Cornish-Bowden
- La ecuación de M y M podemos transformarla en la ecuación canónica de una recta en la que tratamos a Vmax y Km como
variables, y a [S] y v como constantes,
Dividiendo por v(S)
Reordenando,
1max
S
Km
v
V
Si r es la recta que pasa por los puntos (a, 0) y (0,b), la ecuación la podemos escribir
v
V
S
Km
SVSKmv
SKm
SVv
max1
max
max
Si el primer par de valores observados de v y [S] son v1 y [S1] y representamos la recta que definen:
Km
Vmax
v1
-S1
Si tomamos ahora un segundo par de valores observados: v2 y (S2), ....
Km
Vmax
v1
-S1-S2
v2
Y luego un tercer par: v3 y (S3), ....
- Como podemos observar, las distintas rectas se cortan, intersecan, en un punto, común a todas ellas, de coordenadas
(Km, Vmax).
Km
Vmax
v1
-S1-S2
v2
-S3
v3
(Km, Vmax)
NOTA: Experimentalmente, de manera general, no obtendremos un punto, si no un entorno de puntos, y la media de las
coordenadas de estos puntos nos dará el valor medio de Km y Vmax con sus correspondientes desviaciones estándar.
Km
Vmax
v1
-S1-S2
v2
-S3
v3
(Km, Vmax)
- El número máximo de puntos de corte vendrá dado por: [n(n-1)]/2, donde n es el número de rectas.
Tarea 3. Suponga que estamos estudiando una enzima E que cataliza la reacción S P, y que obtenemos los siguientes datos
experimentales:
Concentración inicial Concentración de producto (mol L-1)
de sustrato (mmol L-1) a distintos tiempos (t = min) t=0 t=1 t=2 t=3 t=4
5,0 0 150 300 450 6006,5 0 180 360 540 72010,0 0 235 470 705 94020,0 0 325 650 975 130040,0 0 410 820 1230 1640
Calcular Km y Vmax utilizando todos los procedimientos estudiados.
Resumen
Estudiada la ecuación de Michelis-Menten de acuerdo con el orden de reacción podemos encontrar las siguientes circunstancias-a)A concentraciones saturantes de substrato nos encontramos en el orden cero de reacción La comparación de actividades enzimáticas en ordén cero de reacción puede servir para comparar cantidades de una misma enzima en diferentes circunstancias metabólicas. b) A concentraciones de substrato menores que un décimo de la constante de Michaelis, nos encontramos en orden uno de reacción.c) A concentraciones de substrato del orden de la constante de Michaelis es posible obtener una ecuación a partir de la ecuación integrada de Michaelis-Menten permite determinar graficamente los parámetros dinéticos Vmax y Km estudiando la curva del avance de una reacción con respecto al tiempo
La ecuación de Michaelis-Menten es una cónica, hipérbola que pasa por el centro de coordenadas v:S, cuya asintota paralela al eje de las abcisas representa la velocidad máxima.
Diferentes transformaciones algebráicas permiten la linealización de la ecuación de M-M para una determinación más fácil de los parámetros Vmax y Km.Entre estas se encuentran: Representación de dobles inversos o de Linenweaver-Burk. Representación de Hanes Representación de Eadie-Hofstee Representación lineal directa o representación de Einsenthal y Cornish-Bowden
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