FORO: “ DEFENSA DEL PATRIMONIO CULTURAL Y PATRIMONIO
GENÈTICO DEL PERÙ”
RECURSOS GENÈTICOS DESARROLLADOS EN
EL PERÙ Y SU CARACTERIZACIÒN PARA SER
CONSIDERADOS PATRIMONIO GENÈTICO
EXPOSITOR : NICOLAS A. ROMÁN CABELLO
ENTER THE NEW WORLD !!
SON LA BASE FUNDAMENTAL PARA EL DESARROLLO DENUEVAS RECOMBINACIONES DEL MATERIAL GENÈTICO;VARIEDADES, HÌBRIDOS Y SUS MUCHAS APLICACIONES:MEDICINA, AGRICULTURA, INDUSTRIAS DE ALIMENTOSBIORREMEDIACIÒN CONTROL DE PLAGAS Y ENFERMEDADESDE TODO TIPO.
TALLER LINEA DE BASE (22 Y 23/102013. MINISTERIO DEL AMBIENTE
PRIORIDAD CULTIVO N. CIENTÌFICO GRUPOS P
1 PAPA Solanum sp 4
2 MAIZ Zea mays 4
3 ALGODÒN Gossipium sp 3
4 PAPAYA Carica papaya 3
5 AJIES Capsicum sp 3
6 FREJOL Phaseolus vulgaris 3
7 CACAO Theobroma cacao 2
8 QUINUA Chenopodium quinoa 2
9 TOMATE Solanum lycopersicum 2
10 CALABAZA Cucurbita sp 2
.Azotobacter- Alu I
Coefficient0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
E.coli
21112
21151
24114
24113
22215
21152
24115
24133
21123
21243
E.coli
. CEREALES: Trigo, cebada, avena, centeno,
triticale, maíz (amiláceo, duro)
. GRANOS: quinua, cañihua, kihuicha
. LEGUMINOSAS: Frejol, haba, soya, arveja
. RAICES Y TUBEROSAS: papa, oca, mashua, olluco,
arracacha, chicuro, yacòn
. PASTOS Y FORRAJES: Costa sierra y selva
. MICROORGANISMOS: Azospirillum, Azotobacter,
Pseudomonas, Rhizobium.
.
ES UN CONJUNTO DE METODOS Y TECNICAS OPERACIONES Y PROCEDIMIENTOS DESTINADOS AL AISLAMIENTO, CLONAJE CARACTERIZACION, MODIFICACION, Y EXPRESION DEL MATERIAL GENETICO (DNA)
ES UN AMPLIO RECETARIO QUE INCORPORA PROCEDIMIENTOS MUY DIVERSOS Y EN CONSTANTE ACTUALIZACION.
SUS LIMITES SE VEN MODIFICADOS DIA A DIA LO QUE HACE MUY DIFICIL LA PRESENTACION
ACTUAL Y COMPLETA QUE INCLUYE:
* Electroforesis en geles y capilar
* Electroforesis de geles en gradientes
denaturantes (DGGE)
* DNA complementario (DNAc)
* Banco genómico y banco de genes.
* Mapeo de genes: mapas físicos, de
genes.
* Hibridación “in situ” fluorescente (FISH)
* Transgénesis
BANCO DE GENES ENZIMAS DE RESTRICCION
Secuenciación del DNA y de genomas
Enzimología del DNA
Enzimas de restricción
Vectores de clonación: Plásmidos, BACs, YACs,
Charon, Virus, Lanzaderas etc.
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
Espectrofotometría UV
Microarrays (“chips” de DNA)
MARCADORES MOLECULARES DE DNA
El DNA unido a una matriz proteica forma el cromosoma en los eucariotas y en las bacterias (procariotas) se presenta “desnudo”
La información para construir proteínas está contenida en la secuencia de bases del DNA
y es traducida a partir de un código de señales.
Son segmentos o fragmentos de DNA obtenidos o identificados por cualquier procedimiento y que corresponden a regiones expresadas o no del genoma de un individuo.
Generalmente son fragmentos de zonas no expresadas del genoma o sea cualquier fragmento o segmento o “pedazo” de DNA
Incluso hasta de dos simples nucleótidos (SSR)
Si el fragmento de DNA incluye a una zona expresiva del genoma se le denomina “marcador genético” o “marcador de expresión”
El DNA es una molécula gigantesca y de
una increíble longitud.
El DNA de una sola bacteria mide
alrededor de un metro!!! (una bacteria
mide 1 micra )
El DNA de un cerebro humano, o de una
planta de maíz extraído y puesto en
línea
tiene una longitud de…
…CIENTO CINCUENTA MILLONES DE KILOMETROS MULTIPLICADO X 15!!!!
O SEA QUE ESTE DNA PODRIA IR Y VOLVER DE
LA TIERRA AL SOL UNAS…150 VECES!!!
Si utilizamos un enzima de restricción y cortamos el DNA de un individuo en 20,000 o 30,000 fragmentos de diferente longitud, tamaño o peso (fragmentos de restricción)…
Entonces tendríamos unas 20,000 o 30,000
“huellas digitales” moleculares o “finger
printings”…
Cualquiera de esos fragmentos puede servir para identificar a un individuo (sea humano, planta o microorganismo) aunque no se sepa su secuencia de bases
En la actualidad se utiliza esta tecnología llamada de “marcadores moleculares” para identificar, caracterizar individuos de todo tipo incluyendo virus con un margen de seguridad de… 99,99999%
Los marcadores moleculares son en la actualidad una tecnología fundamental e indispensable para:
Determinación de las relaciones filogenéticas y taxonómicas entre individuos
La estimación de la semejanza genética
Análisis de la diversidad genética
Identificación de genes
Organización del germoplasma
Caracterización de cepas de microorganismos
Múltiples aplicaciones en la medicina, industria alimentaria, terapia génica, transgénicos, medio ambiente, genética, bioingeniería etc.
Técnicas basadas en sondas radioactivas (RFLPs)
Técnicas basadas en la PCR (RAPiDs)
Mixtos
Microarrays
QTLs
RFLPs: Polimorfismo en la longitud de Fragmentos de Restricción
RAPDs: DNA Polimórfico Amplificado al Azar
SSRs: Secuencia Simple Repetida (microsatélites)
VNTRs: Número Variable de Secuencias Repetidas en Tándem (Minisatélites)
AFLPs: Polimorfismo de Longitud de Fragmentos Amplificados
Otras Técnicas: SNPs, STS, FLAPs, GRAPs etc.
A la fecha se reportan alrededor de unas 40 técnicas que combinan uno o varios procedimientos y la tendencia es mejorar la discriminación del polimorfismo, la repetitibilidad, la Codominancia, la automatización, simplicidad y el costo.
• Caracterizar (identificar) molecularmente individuos y/o colecciones de individuos (plantas, animales, microorganismos etc
• Identificar secuencias de DNA en el genoma de los individuos que permitan su diferenciación y su utilidad potencial.
• Almacenar información en banco de datos a nivel local, regional y nacional para su uso y para su identidad como propiedad de uso.
EXTRACCION DE DNA
DIGESTION
PCR
DGGE
VISUALIZACION EN UV
ANALISIS DE BANDAS (NTSYS/ UPGMA)
EVALUACION Y RESULTADOS
1. EXTRACCION DE DNA
Eliminación de la matriz proteica, RNAs y componentes celulares; paredes, membranas celulares órganos etc.
Se utilizan sustancias que atacan a las proteínas y las precipitan y procesos físicos como la homogenización y centrifugación
Identificación molecular
___________________________________
AISLAMIENTO DE
DNA
Figura 4.4: DNA genómico de cepas Azospirillum sp, Azotobacter sp. y Pseudomonas sp. visto enelectroforesis en gel de agarosa al 1%, (M) Marcador de peso molecular Lambda DNA/Hind III, (1) 11225,(2) 23134, (3) 14242 (4)32155 , (5) 34235.(6) E coli
LOS ENZIMAS DE RESTRICCION CORTAN AL DNA EN SITIOS ESPECÍFICOS Y ORIGINAN MILES DE FRAGMENTOS DE DIFERENTES TAMAÑOS Y PESOS
ESTOS FRAGMENTOS DE RESTRICCION PUEDEN SER SEPARADOS DE ACUERDO A SU PESO Y TAMAÑO.
SE UTILIZAN COMO MARCADORES O HUELLAS DACTILARES (“fingerprintings”) PARA IDENTIFICAR INDIVIDUOS
La PCR es una técnica poderosa que permite multiplicar, clonar fragmentos de DNA: de un solo fragmento se pueden obtener hasta 30 000 000 fragmentos en un tiempo determinado
Para clonar el DNA se necesita:Desnaturalizar al DNA (el DNA se abre en dos
hebras)) a una temperatura de 92-94 ºC
• Un iniciador o primer, (un pequeño fragmento de DNA) que permite la actividad del enzima Taq polimerasa y se “pega” a una de las hebras del DNA a una temperatura de 40 -57 ºC.
• Taq polimerasa: Enzima que es capáz de sacar “copias” del una hebra del DNA y actúa a 72 ºC
Cada ciclo comprende tres pasos:
Desnaturalización: (92-94 ºC)
Alineación/Hibridación ( 47-56 ºC)
Extensión (72ºC)
Estas tres temperaturas son conjugadas en un termociclador.
También se necesita:
ClMg 2 mM
DNTP (oligonucleótidos)
Solución buffer 10X
Estos elementos forman el “máster mix” que se mezclan en un tubo Eppendorf y se disponen en el termociclador
PERKINS ELMER 2400
MEZCLA DE REACCION
Reactivos Volumen c.c. final
H2O 11,3
Buffer 10x 2,6 1X
DNTP 1 mM 5,2 0,2 Mm
PRIMER 10uM 1,3 0,5 Mm
MgCl2 23 mM 1,6 1,5 ng
DNA 1,0 30 ng
Taq DNA pol 0,36 uL
Nº PASOS Tº (º C) T (min) nº CICLO1 94 1.0 12 37 1.0 13 72 1.0 14 94 0.5 405 37 1.0 30 6 72 1.5 307 72 5,0 1
4. ELECTROFORESIS en geles de gradiente denaturalizante (DGGE)
El DNA amplificado vía PCR incluido en un soporte (gel de poliacrilamida) es sometido a un campo eléctrico en una cámara i en la cubeta DGGE que incluye un sistema para producir gradientes lineales denaturantes de temperatura (Tm).
El DNA corre hacia el polo positivo a través del gel en este ambiente denaturante diferencial debido a que posee una carga neta total negativa .
Los fragmentos pequeños corren mas de prisa y quedan en la parte inferior del gel.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR
___________________________________
AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN 9-27-1542 DE LA
ZONA 16S rDNA
Figura 4.5 Productos de PCR de la región 9-27-1542 M Marcador 100bp DNA ladder
plus (cada banda representa 100pb) 1) Ecoli , carril 3,6,9,10,11,13,15,16,18
resultado de Pseudomona fluoresces (60ng/µL) carril 4,5,7,8,12,14,17 resultado de
Azotobacter (40ng/µL).
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR___________________________________
RFLP – RNA ANÁLISIS DE LOS PERFILES DE
RESTRICCIÓN DE LA REGIÓN 9-27 – 1542 DE
BACTERIAS Azotobacter sp
Figura 4.6: Resultados de los cortes con las enzimas de restricción Alu I, Hpa
II y Rsa de los amplificados de Azotobacter.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR
___________________________________
RFLP – rDNA ANÁLISIS DE LOS PERFILES DE
RESTRICCIÓN DE LA REGIÓN 9-27 – 1542 DE
BACTERIAS Azospirillum sp.
Figura 4.6 . Resultados de los cortes con las enzimas de restricción Alu I, Hpa II y
Rsa de los amplificados de Azospirillum
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR
___________________________________
RFLP – RDNA ANÁLISIS DE LOS PERFILES DE
RESTRICCIÓN DE LA REGIÓN 9-27 – 1542 DE
BACTERIAS Pseudomonas fluorescens .
Figura 4.6 . . Resultados de los cortes con las enzimas de restricción Alu I, Hpa II y
Rsa de los amplificados de Pseudomona fluorescens (resultado negativo).
GENE BANK
BLAST
ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO
ANALISIS BIOINFORMÁTICO ________________________
ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO
___________________________________
_________________________________Agrupamiento UPGMA de las cepas de Azospirillum realizado con
los cortes de la enzima de restricción Alu I, Hpa II,
Azospirillum - Alu I
Coefficient
0.35 0.49 0.63 0.78 0.92
11242
11242
12141
11232
14211
12121
12145
13245
11241
Azospirillum-Hpa ll
Coefficient
0.29 0.39 0.49 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
E.coli
11242
12141
12121
12145
13245
11241
11232
E.coli
14211
__________
Agrupamiento UPGMA de las cepas de Azotobacter realizado con Alu I y Hpa II s
cortes de la enzima de restricción Alu I, Hpa II, Rsa IAzotobacter- Alu I
Coefficient0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
E.coli
21112
21151
24114
24113
22215
21152
24115
24133
21123
21243
E.coli
Azotobacter- Hpa II
Coefficient
0.5 0.6 0.7 0.7 0.8 0.9 0.9 1.0
E.coli
21112
21151
24114
24113
22215
21152
24115
24133
21123
21243
E.coli
Azotobacter - Rsa I
Coefficient
0.2 0.3 0.4 0.5 0.7 0.8 0.9 1.0
21112
21112
24113
24114
21151
24115
21123
21243
22215
21152
Ecoli
24133
. Determinar políticas y estrategias, acciones para la colección, caracterización y evaluación de los R.G. para promover su uso respetando el derecho de pueblos y naciones involucrados.
. Unificar Instituciones y tecnologías para el manejo, utilización y conservación de los R.G. Compartir información.
. Desarrollar Proyectos Integrales de gestión, colección, caracterización (morfológica, bioquímica, molecular) y conservación.
.Desarrollar proyectos de transferencia tecnológica.
Fuga y apropiación ilìcita de genes y/o material genético
18 casos relacionados con maca, Sachainti (2)
Yacòn, camu camu y pasuchaca.
Hay muchos otros casos reportados de fuga de genes: Quinua, oca, mashua, olluco, arracacha, sachatomate, aguaymanto etc
En el caso de maca una empresa patentó un extracto (2012) y desarrolló productos que le reportaron $ 200,000 mensuales, y en un año 2,4 millones de dólares y en 10 años 20 millones de dólares, los cuales no fueron redituados al Perú (Andina. Agencia Peruana de
Noticias)
1. capacitación continua y permanente de recursos humanos.
2. Equipamiento.
3. Medios de integración
4. Investigación compartida en autopistas informáticas veloces.
5. Estandarizaciòn de métodos y técnicas.
.
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IR HACIA ADELANTE Y HACER MEJOR LA
MISMAS COSAS…O IR HACIA ARRIBA Y
HACER COSAS NUEVAS
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