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PROTOCOLO PROYECTO DE GRADO
PROTOCOLO PARA REALIZACIÓN DE VENTANA CRANEAL
CRÓNICA EN MURINOS
ASISTENTE DE INVESTIGACIÓN
ALEJANDRA GUTIÉRREZ BERNAL UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE MEDICINA X SEMESTRE
200721976
JUAN CARLOS BRICEÑO TRIANA INGENIERO MECANICO, PhD INGENIERÍA BIOMÉDICA
PROFESOR TITULAR DEL DEPARTAMENTO DE INGENIERIA MECÁNICA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
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Tabla de contenido
Lista de Tablas ........................................................................................................................ 3
Lista de Figuras ....................................................................................................................... 3
Resumen ................................................................................................................................ 4
Palabras Clave ........................................................................................................................ 4
Abstract ................................................................................................................................. 4
Marco teórico ........................................................................................................................ 5
Planteamiento del problema .................................................................................................. 7
Objetivos ................................................................................................................................ 9
Método .................................................................................................................................. 9
Resultados ........................................................................................................................... 12
Análisis y conclusión ............................................................................................................. 16
Bibliografía ........................................................................................................................... 18
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Lista de Tablas
Tabla 1. Propiedades de vasos piales vs. parenquimatosos. ............................................................ 5
Tabla 2. Anestésicos utilizados para ventanas craneales en murinos. ............................................. 7
Tabla 3. Cronograma .................................................................................................................... 12
Tabla 4. Características de murinos intervenidos y dosis de medicamentos aplicadas. ................. 13
Lista de Figuras
Figura 1. Animal anestesiado previo a procedimiento. ................................................................ 14
Figura 2. Área de intervención rasurada. ...................................................................................... 14
Figura 3. Marco de estereotaxia. .................................................................................................. 15
Figura 4. Luego del lavado y previo a la incisión. .......................................................................... 15
Figura 5. Calota limpia y seca antes de la craneotomía. ................................................................ 15
Figura 6. Craneotomía delineada.................................................................................................. 15
Figura 7. Craneotomía de 4mm en hueso parietal. ....................................................................... 16
Figura 8. Post operatorio de ventana craneal. .............................................................................. 16
Figura 9. Visualización de ventana craneal en el microscopio. ...................................................... 16
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Resumen
Se realizó un diseño experimental para evaluar la microcirculación pial y de la circulación cerebral
por medio de microscopia in vivo. La intervención consiste en una craneotomía de 4mm de
diámetro en el hueso parietal de murinos wistar. Posterior a la hemostasia esta se sella con un
vidrio y se asegura con acrílico y un tornillo. La duración máxima de esta ventana fue de cinco días
y se postula que puede ser mayor al adquirir más experiencia. El comportamiento del animal no se
ve afectado por la cirugía y, excluyendo el efecto de la anestesia o la posible infección subsecuente
(que se observó en uno de los animales sujetos al procedimiento), no se relaciona con signos
clínicos de focalización ó deterioro. La perfección de la técnica permite la evaluación del efecto de
medicamentos e injuria en la microcirculación que podrá tener una amplia aplicación en muchos
escenarios de investigación.
Palabras Clave
MeSH: Craneotomy/methods, mice, animals, microcirculation, brain/blood supply, Brain/surgery,
Cerebrovascular Circulation, Cerebral Veins/physiology, Capillaries/physiology.
Abstract
An experimental procedure is proposed to evaluate pial and brain microcirculation of mice in vivo.
The protocol consists of a cranial window of 4mm in the parietal bone of Wistar mice. The
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Marco teórico
El cerebro, protegido por la bóveda craneana, se encuentra cubierto por un conjunto de tejido
conectivo conocido como meninges y líquido céfalo raquídeo. Las meninges están conformadas
por tres capas; la pia, la más profunda que se encuentra en aposición con el cerebro, la aracnoides
y la más externa, la dura que está en contacto con el cráneo. El flujo sanguíneo cerebral y
meníngeo proviene de sistemas arteriales distintos, el primero proviene de la carótida interna y el
segundo de la carótida externa. [1]
El flujo sanguíneo intracerebral esta dado por grandes arterias cerebrales como son la cerebral
anterior y media, ramas de la carótida interna. Al transcurrir por la corteza estas arterias se
ramifican generando arteriolas que pasan por la superficie cerebral y se conocen como vasos
piales. Histológicamente estos vasos están formados por una capa de células endoteliales, una de
musculo liso y finalmente una capa de leptomeninge que los recubre e incluye la pia. Los separa
del tejido cerebral un espacio llamado Virchow-Robin. Este espacio se oblitera a medida que los
vasos van penetrando aún más el parénquima cerebral donde la membrana basal del vaso entra
en contacto directo con las terminales de los astrocitos y los vasos se nominan intracerebrales. [2].
Los vasos piales y los parenquimatosos tienen varias diferencias (tabla 1) sin embargo estos
interactúan juntos para responder a los diferentes estímulos generando cambios en el flujo
sanguíneo cerebral. [2].
Vaso pial Parenquimatoso
Inervación perivascular- PNS ó extrínseca Inervación intrínseca
Una capa de músculo liso; tono basal mayor y no responden a ciertos neurotransmisores
Más músculo liso Mayor respuesta a neurotransmisores
Circulación colateral extensa Menos colaterales, la oclusión de una rama genera más daño.
Tabla 1. Propiedades de vasos piales vs. parenquimatosos.
La regulación del flujo cerebral está dada por la unidad microvascular [2]. El flujo sanguíneo
cerebral puede aumentar hasta 8 veces cuando el hematocrito cae más del 10% [3]. El aporte de
oxigeno cerebral depende del contenido arterial de oxigeno lo cual incluye el hematocrito. El
máximo aporte de oxigeno a los tejidos se mantiene hasta un hematocrito alrededor del 30%, si
disminuye más que esto, el aporte de oxigeno cae [3]. La unidad neurovascular está conformada
por las neuronas, los astrocitos el músculo liso y las células endoteliales. El endotelio capilar es
continuo con los astrocitos, células que regulan el flujo sanguíneo cerebral, aumentan las uniones
estrechas, contribuyen al balance electrolítico e interactúan directamente con las neuronas y el
endotelio liberando factores vasoactivos [2]. El cambio en el flujo sanguíneo cerebral responde a
los cambios metabólicos de la célula, incluyendo la razón de lactato/piruvato, y la transmisión
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sináptica. Los neurotransmisores actúan como vasodilatadores ó inducen su liberación [2]. Se ha
documentado que la dopamina, la noradrenalina y la serotonina son vasodilatadoras y la
acetilcolina es vasoconstrictora. Por otro lado, el aumento de calcio causado por la glutamina
activa la producción de adenosina y metabolitos del ácido araquidónico. [2-4].
Las arterias piales, son las que tienen más resistencia, y por lo tanto controlan el flujo. Aunque las
arteriolas más profundas se dilaten, el flujo sanguíneo no aumentará a menos de que el flujo en
las arterias piales que suplen las arterias parenquimatosas se incremente. Se sugiere que la señal
de vasodilatación se transmite desde el lugar acción a los vasos externos por medio de la
señalización intramural vascular por las uniones comunicantes. Otra teoría es la vasodilatación
dependiente del flujo en la cual el aumento del flujo distalmente genera un aumento en el flujo en
arterias más proximales causando un estrés mecánico que genera la liberación de vasodilatadores
[2].
Ya que la circulación de la pia es un reflejo de la circulación cerebral, la ventana craneal es una
herramienta para valorar la circulación cerebral in vivo de una forma crónica. Esto permite evaluar
el comportamiento del flujo cerebral en respuesta a la injuria incluyendo la hipovolemia, los
medicamentos y la sepsis entre otros. La primera descripción del procedimiento fue realizada por
Forbes en 1928. Más tarde en 1975 Levasseur et. al. describe una ventana craneal crónica en gatos
usando tornillos, una ventana de acrílico y válvulas para circular líquido simulando el LCR ya que
removían la dura y la aracnoides [5]. Svodoba et. al hicieron unos experimentos similares en
murinos, removiendo la dura y aplicando Sigma Tipo III-A (líquido céfalo raquídeo artificial) para
medir potenciales de acción e inyectar corriente en especímenes in vivo con microscopia laser de
dos fotones. [6-9]
Si el objetivo es obtener una visión de la microcirculación corporal, se puede hacer una ventana
craneal sin incidir en la duramadre para observar los vasos de la dura madre. Con los nuevos
microscopios es posible visualizar los vasos piales mirando un plano más profundo sin embargo
para mirar directamente los vasos piales es necesario remover la dura. La dura madre es la capa
más externa de las meninges. Su irrigación proviene de la carótida externa por medio de la arteria
meníngea media que ingresa al cráneo por el foramen espinoso, por ramas de la arteria etmoidal,
carótida interna, faríngea ascendente y occipital y por lo tanto es un reflejo de la microcirculación
corporal general. [1] Estos vasos no se ven influenciados por la presión intracraneales ni demás
variables que afectan la circulación intraparenquimatosa.
Mostany et al de la Universidad de California han desarrollado un protocolo para la realización de
una ventana craneal crónica para ver los vasos de la dura sin incidir en esta. Para fijar el objetivo
usan cianocrilato y acrílico dental en vez de tornillos. El procedimiento es fácil, la visualización de
los vasos es buena y la recuperación es rápida. [10]
7
Otros grupos se han acercado a la visualización cerebral adelgazando el cráneo. Se ha diseñado un
protocolo para la visualización de neuronas, glia y vasos sanguíneos marcados con fluorescencia
por medio de un procedimiento para adelgazar la corteza dejándola transparente y usando el
microscopio de doble fotón. Este procedimiento es mucho menos invasivo que los que se han
mencionado previamente y por lo tanto menos lesivo para el animal, riesgoso y más duradero. [11,
9]. En el 2012 Iida H. et. al compararon el efecto de la anestesia en la microcirculación intracraneal
y medular haciendo ventanas craneales y medulares en ratas. [12]
Por su parte Masuda et al. hicieron tres trépanos en el área parietal de ratas para evaluar el
efecto de la radiofrecuencia en el flujo cerebral. Insertaron por los trepanos un termómetro, y dos
fibras ópticas una de las cuales conectaron a un doppler para medir el flujo cerebral. [13]
En los estudios más recientes la craneotomía se realiza a un lado de la línea media en el hueso
parietal para evadir el seno sagital superior que podría sangrar mucho. Las ventanas se hacen de
3-4mm. El anestésico utilizado varía mucho en los diferentes estudios (ver tabla 2)
Estudio Anestesia
Mostany et. al isofluorane (4% para inducción y 1.5-2% cx)
Klenke et. al inyección intraperitoneal ketamina (65mg/k) xilacina(13mg/k),
acepromazina(2mg/k)
Svoboda et. al, 1997 uretano 2mg/k intraperitoneal
Kelly et. al. 2011 Fentanyl 0.05mg/kg, midazolam 5mg/k, metatomadina 0.5mg/k, avertin
(tribromoetanol)0.0075mg/ml.
Masuda H et. al Ketamina 100mg/k y xilacina 10mg/k IM y pentobarbital 12.5mg/k SC
Tabla 2. Anestésicos utilizados para ventanas craneales en murinos.
En su protocolo Mostany y col. inyectan dexametasona (0.2mg/kg) y carprofeno (5mg/kg) intra
peritoneal para disminuir el edema cerebral que puede causar el procedimiento. Para el control
del dolor y sangrado en el área quirúrgica aplican un poco de lidocaína y epinefrina al periosteo.
[10] Kelly et. al administran analgésico buprenorfina 0.5mg/kg SC [11].
Planteamiento del problema
Generalmente los estudios se han dedicado a medir parámetros macroscópicos incluyendo el
gasto cardiaco, el aporte de oxígeno, la presión, entre otras. La microvasculación no ha sido muy
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estudiada pero este es el sitio en el cual se da el intercambio de oxígeno y nutrientes. Las
intervenciones que mejoran la perfusión orgánica inherentemente deben mejorar la perfusión
microvascular. En los últimos años se han dado grandes avances tecnológicos que incluyen
microscopios de polarización espectral (OPS) y de campo obscuro (SDF) que permiten una
evaluación de la microvasculación. De acuerdo a un panel de expertos los parámetros que
determinan con mayor confiabilidad la función microvascular deben incluir la densidad capilar y su
heterogeneidad [14]. La ventana craneal permite hacer este tipo de medidas en especímenes in
vivo y por lo tanto constituye un elemento esencial para la investigación.
En este momento hay muchos protocolos existentes para la visualización craneal crónica. Con la
cantidad de tecnología, equipos y opciones disponibles es necesario generar un protocolo
estándar que se acople a las instalaciones y material de nuestra institución. Este trabajo pretende
generar un método que sea repetible para hacer una ventana craneal cónica que permita la
observación de los vasos de la dura (un acercamiento a la microvasculación corporal) y los vasos
piales (un reflejo de la circulación intracerebral).
Se ha determinado que la hemodilución isovolemica que se da al hacer reposición de líquidos con
cristaloides como dicta el protocolo del ATLS genera un efecto hiperemico en la circulación
cerebral. El contenido arterial de oxigeno se ve disminuido al caer el hematocrito. Para compensar
esto debe aumentar el gasto cardiaco ó la extracción de oxigeno [15]. Cuando hay un descenso
moderado del hematocrito la suplencia de oxígeno puede mejorar ya que el aumento del flujo
sanguíneo excede la disminución en el contenido arterial de oxigeno. [3]El aumento de flujo se
genera ya que la hemodilución normovolémica disminuye la viscosidad sanguínea lo cual mejora el
retorno venoso y disminuye la post carga, un aumento de la vasodilatación dado por ON y un
aumento del estímulo simpático al corazón lo cual aumenta el gasto cardiaco. Esto sugiere una
redistribución del flujo sanguíneo regional y un ajuste microvascular que incluye la aceleración del
flujo sanguíneo [15].
Se ha demostrado que la resucitación luego de la hipovolemia y la anemia requieren en primer
lugar la reposición de líquidos para recuperar la función y hemodinámica microvascular y, en
segunda instancia, el aporte de oxígeno [16]. Contrario a lo esperado, la supervivencia en choque
hemorrágico se ha relacionado con el mantenimiento de la densidad capilar funcional más que con
el aporte de oxigeno. La densidad capilar se mantiene con líquidos con alta viscosidad, contratrio
a lo planteado previamente donde para la restitución hídrica se usaban fluidos de baja viscosidad
para acelerar el flujo sanguíneo. Los sustitutos con alta viscosidad mantienen la presión de
perfusión y el movimiento de la curva de disociación de la hemoglobina hacia la izquierda
asegurando que la extracción de oxígeno se mantenga elevada y los capilares permeables [16]. Es
posible que la reposición de líquidos con hemosustitutos tenga un perfil benéfico en la
microcirculación cerebral. Para evaluar el efecto en la dinámica microvascular del hemosustituto
9
es importante estandarizar un método que permita la evaluación de la microcirculación in vivo en
respuesta a este compuesto.
No hay reportes del efecto que tienen este tipo de procedimientos en los animales. Por lo tanto en
este protocolo se pretende determinar el estado pre y post quirúrgico de los murinos. Para esto se
propone una evaluación neuropsicológica del murino que permita hacer una aproximación global
al comportamiento del animal. Generalmente se exploran siete esferas: la apariencia y respuesta
al estimulo general, el comportamiento sensitivo, la postura y movilidad, la capacidad de
locomoción, la habilidad para realizar movimientos más complejos que incluye el manejo de la
comida, el comportamiento especifico de su especie y la capacidad de aprendizaje.
Objetivos
• Primario
• Crear un protocolo para la realizar una ventana craneal crónica en murinos.
• Secundarios
• Generar un procedimiento viable y reproducible.
• Evaluar la seguridad, efectividad y el efecto del procedimiento en murinos y la
duración de la ventana.
Método
Materiales:
6 ratas de 400-550 g
Rasuradora
Gasas
Isodine solución
Isodine espuma
Alcohol al 70%
Cloruro férrico al 10%
Solución salina al 0.9%
Bolsa de agua caliente
Plataforma quirúrgica
Jeringa de insulina
isopos
Equipo de disección
Marco de estereotaxia
Equipo de microcirugía-
microtijeras, microcureta.
10
Bisturí
meloxicam
Gelfoam
Vancomicina
Xilacina
ketamina (Rotex Med 50
mg/ml)
Dexametasona
Carprofeno
Lidocaína+epinefrina al 2%
Procedimiento
1) Luego de hacer asepsia en la mesa quirúrgica con alcohol al 70% y tener listo y estéril el
instrumental se procede a preparar el animal que se va a intervenir. Este se pesa, se toma
su frecuencia cardiaca, respiratoria y temperatura.
a. La temperatura debe mantenerse alrededor de 37.5° C, durante todo el
procedimiento. La anestesia puede bajar la temperatura por lo cual es importante
la manta caliente y si es necesario una lámpara de calor.
2) Con la jeringa de insulina se anestesia la rata con ketamina (Rotex Med 50 mg/ml) 67.5
mg/k y xilacina 10 mg/kg como relajante muscular. Luego de esperar unos minutos se
examinan la respuesta al dolor del animal haciéndole presión en el talón y en la cola para
asegurar que esté completamente dormido.
3) Como analgésico se administra meloxicam 2 mg/kg SC.
4) Como antibiótico profiláctico se administra Vancomicina a una dosis equivalente al 10%
del peso del animal.
5) Se rasura la porción superior de la cabeza de la rata desde encima de los ojos hasta la
parte posterior de las orejas.
6) Posicionar la rata en el marco de estereotaxia, ubicándolo en el centro y asegurándolo con
los pines en ambos canales auditivos. Poner la manta caliente debajo del animal. Insertar
un termómetro rectal.
7) Administrar dexametasona 0.2 mg/kg y carprofeno 5 mg/kg SC. Para proteger los ojos,
aplicar terramicina en ungüento en ambos ojos y cubrirlos.
8) Lavar el sitio operatorio con alcohol al 70%, isodine espuma y finalmente isodine solución
iniciando por el lugar de la incisión y haciendo círculos hacia la periferia. Cubrir con
campos estériles el resto del campo quirúrgico.
11
9) Hacer una incisión en forma de U para remover la piel desde detrás de las orejas hasta los
ojos. Disecar y retirar la piel dejando un área de 2X2cm libre de piel y tejido celular
subcutáneo.
10) Aplicar una gota de lidocaína+epinefrina al 2% en el área y retraer los músculos y el
periostio con un bisturí ó una cureta. Es importante que el cráneo quede sin periostio y
esté seco para poder pegar el cubre objetos. De ser necesario aplicar con un isopo un poco
de cloruro férrico para asegurarse de que toda la superficie este limpia.
11) Con un taladro dremel a baja velocidad delinear un círculo de 4mm de diámetro en el
hueso parietal a un lado de la sutura sagital.
12) Aplicar nuevamente una gota de lidocaína+epinefrina a la superficie y luego de unos
segundos, taladrar lentamente irrigando con solución salina alrededor del circulo marcado
previamente hasta sentir que la superficie ósea esta suave y se puede mover.
13) Con una cureta retraer la craneotomía. Humedecer el área con solución salina y con unos
fórceps levantar el hueso y exponer la dura.
14) Humedecer un gelfoam con solución salina y hacer hemostasia.
15) Si se quiere retirar la dura, hacer una pequeña incisión en la misma con una microtijera e
insertar en ella suavemente una cureta para cortar la dura sobre la misma y no dañar la
aracnoides removiendo la dura para exponer los vasos piales. Si sale líquido céfalo
raquídeo se ha dañado la aracnoides y se ha generado una fistula.
16) Suavemente sin hacer mucha presión parar cualquier sangrado con el gelfoam.
17) Luego de que la superficie esté seca y asegurándose que no haya ningún sangrado, poner
un cubreobjetos estéril previamente cortado de 5mm sobre la craneotomía.
18) Aplicar cianoacrilato en el hemisferio opuesto a la craneotomía con cuidado para que este
no dañe la ventana y esparcir por toda la superficie craneana para pegar al cubre objetos.
Esperar a que el pegante esté seco.
19) Aplicar acrílico dental sobre el cráneo y sobre el borde del cubreobjetos para asegurarlo al
hueso.
20) Dejar secar el acrílico por 10 minutos y trasladar el animal a una jaula caliente para que se
recupere.
21) Una vez despierto poner el animal en su jaula tomarle los signos vitales y observar el
comportamiento del animal para evaluar el efecto del procedimiento.
12
Cronograma
Mes Febrero Marzo Abril Mayo
Revisión de
literatura
X X
Comité de ética X
Fase de
experimentación
Animal 1
Animal 2
Animal 3
Animal 4
X
X
X
X
Elaboración de
documento
X
Tabla 3. Cronograma
Resultados
A lo largo de los distintos experimentos se tuvieron que cambiar pasos del método y materiales
utilizados. En la primera ventana realizada se logro retraer la ventana craneal sin complicaciones
sin embargo ya que no tenia surgicel y la hemostasia no fue perfecta. El animal tuvo una excelente
recuperación sin embargo a la semana fue sacrificado ya que un coagulo de sangre tapo la
ventana e impidió la visualización de la circulación.
El segundo animal se hizo la intervención sin complicaciones, la incisión en la piel fue extensa y se
noto que no era necesario que esta fuese tan grande. Estéticamente la ventana no tuvo ningún
problema sin embargo ya que el cianocrialato no se utilizo la ventana quedó suelta. La rata se
enfermo a pesar del medicamento profiláctico. El veterinario dignosticó una infección de la vía
respiratoria ya que presento fiebre, dolor leve, baja actividad, exudado bajo área quirúrgica,
heces blandas estornudos sanguinolentos con estertores y distrés respiratorio. Fue tratada con
trimetopim sulfametaxol 1 mg/kg IM por 5 días y meloxicam para el manejo analgésico. De
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acuerdo al veterinario, no se podía volver a intervenir para fijar bien la ventana hasta que
estuviese sana. La ventana se soltó antes de que fuera posible repetir la intervención y por lo
tanto fue necesario sacrificar el animal.
La tercera cirugía sucedió sin complicaciones, la ventana estéticamente quedo muy bien e incluso
pasamos la rata al microscopio y visualizamos los vasos con claridad. Para prevenir que la ventana
se soltara se puso un tornillo en el hemisferio opuesto a la ventana ya que según la experiencia del
laboratorio esto permite su estabilización. Sin embargo ya que la acción de la anestesia dura
únicamente de 20 a 30min fue necesario poner un refuerzo de anestesia con un cuarto de la dosis.
El animal no se recupero de la anestesia y el diagnostico fue sobredosis de la misma.
La última cirugía se realizó siguiendo el protocolo final. La incisión fue pequeña y la ventana se
realizó en el hueso parietal derecho. El área de la ventana fue adecuada y la visión fue buena. En el
post operatorio la rata evolucionó sin ninguna alteración. Su comportamiento fue normal y la
visión de la ventana fue adecuada con una duración de 6 días. Sin embargo al sexto día se observó
una costra debajo del área de la ventana que impedía la visualización de la corteza y la pia. El
animal se sacrifico y se realizó una autopsia. La ventana estaba bien adherida al cráneo lo cual
apoya la necesidad del tornillo. Debajo de la ventana se encontró que el sangrado provenía de un
vaso muy pequeño de la aracnoides a un lado de la ventana con un sangrado mínimo sin
hematoma epidural u otro hallazgo de importancia.
animal peso Sexo ketamina
(75 mg/kg)
Xilacina
(10 mg/kg)
cefazolina
(50 mg/kg)
Meloxicam
(2 mg/kg)
1
2 480 g Macho 0.648 ml 0.24 ml 0.6 ml 0,96 ml
3 260 g Hembra 0.375 ml 0.125 ml 0.325 ml 0,52 ml
4 240 g Hembra 0.360 ml 0.12 ml 0.30 ml 0.9 6ml
Tabla 4. Características de murinos intervenidos y dosis de medicamentos aplicadas.
El protocolo final es el siguiente:
Materiales
4 ratas wistar de 200-550 g Rasuradora Gasas
14
Isodine solución
Isodine espuma
Alcohol al 70%
Solución salina al 0.9%
Bolsa de agua caliente
Plataforma quirúrgica
Jeringa de insulina
isopos
Equipo de disección
Marco de estereotaxia
Equipo de disección
Bisturí
Taladro y brocas pequeñas
Tornillos de 5mm
meloxicam
surgicel
Cefazolina
Xilacina
ketamina (Rotex Med 50
mg/ml)
Dexametasona
Lidocaína+epinefrina al 2%
1. Luego de hacer asepsia en la mesa quirúrgica con alcohol al 70% y tener listo y estéril
el instrumental se procede a preparar el animal que se va a intervenir. Este se pesa y
se calculan y alistan las dosis de los medicamentos, se toma su frecuencia cardiaca,
respiratoria y temperatura.
a. La temperatura debe mantenerse alrededor de
34.5° C, durante todo el procedimiento. La
anestesia puede bajar la temperatura por lo cual
es importante la manta caliente y si es necesario
una lámpara de calor.
2. Con la jeringa de insulina se anestesia la rata con
ketamina (Rotex Med 50 mg/ml) 75 mg/k y xilacina
10 mg/kg como relajante muscular. Luego de esperar
unos minutos se examinan la respuesta al dolor del
animal haciéndole presión en el talón y en la cola
para asegurar que esté completamente dormido.
3. Como analgésico se administra meloxicam 2 mg/kg
SC.
4. Como antibiótico profiláctico se administra
cefazolina 50 mg/kg previo a la incisión.
5. Se retira el pelo de la porción superior de la cabeza
de la rata desde encima de los ojos hasta la parte
Figura 1. animal anestesiado
previo a procedimiento.
Figura 2. Área de intervención
rasurada.
15
posterior de las orejas descubriendo un área
aproximada de 1X1cm.
6. Posicionar la rata en el marco de estereotaxia,
ubicándolo en el centro y asegurándolo con los pines
en ambos canales auditivos. Poner la manta caliente
debajo del animal. Insertar un termómetro rectal.
7. Administrar dexametasona 0.2 mg/kg. Para proteger
los ojos, aplicar terramicina en ungüento en ambos
ojos y cubrirlos.
8. Lavar el sitio operatorio con alcohol al 70%, isodine
espuma y finalmente isodine solución iniciando por
el lugar de la incisión y haciendo círculos hacia la
periferia. Cubrir con campos estériles el resto del
campo quirúrgico.
9. Hacer una incisión en forma de U para remover la
piel desde detrás de las orejas hasta los ojos. Disecar
y retirar la piel dejando un área de 1X1cm libre de
piel y tejido celular subcutáneo.
10. Aplicar una gota de lidocaína+epinefrina al 2% en el
área y retraer los músculos y el periostio con un
bisturí ó una cureta. Es importante que el cráneo
quede sin periostio y esté seco para poder pegar el
cubre objetos.
11. Con un taladro dremel a baja velocidad delinear un
círculo de 4mm de diámetro en el hueso parietal a
un lado de la sutura sagital.
12. Aplicar nuevamente una gota de
lidocaína+epinefrina a la superficie y luego de unos
segundos, taladrar lentamente irrigando con
solución salina alrededor del circulo marcado
previamente hasta sentir que la superficie ósea esta
suave y se puede mover.
Figura 3. Marco de estereotaxia.
Figura 4. Luego del lavado y
previo a la incisión.
Figura 5. Calota limpia y seca
antes de la craneotomía.
Figura 6. Craneotomía delineada.
16
13. Con una cureta retraer la craneotomía. Humedecer
el área con solución salina y con unos fórceps
levantar el hueso y exponer la dura.
14. Hacer hemostasia cuidadosamente con surgicel y
algodón, cuando se este seguro de que no sangra
retirar este material para dejar el campo visual libre.
15. Poner un cubreobjetos estéril previamente cortado
de 5mm sobre la craneotomía.
16. En el hemisferio o0puesto de la craneotomía taladrar
con una broca pequeña un orificio para atornillar un tornillo de 5mm.
17. Aplicar acrílico dental sobre el cráneo, alrededor del tornillo y sobre el borde del
cubreobjetos para asegurarlo al hueso.
18. Dejar secar el acrílico por 10 minutos y trasladar el
animal a una jaula caliente para que se recupere.
19. Una vez despierto poner el animal en su jaula tomarle
los signos vitales y observar el comportamiento del
animal para evaluar el efecto del procedimiento.
Análisis y conclusión
La evaluación de la micro circulación es muy importante para
entender el efecto de muchos medicamentos y estados
críticos como lo es el shock. Este protocolo pretende generar
un lineamiento para la evaluación de la microcirculación in
vivo. Luego del procedimiento el animal es llevado al
microscopio y se puede hacer un mapa de los vasos piales y
cerebrales.
Como todo procedimiento experimental la clave del mismo es
la experiencia. En este caso el número de especímenes usados
fue limitado y por lo tanto no se logró que éste fuese perfecto.
La duración máxima de la ventana fue de 5 días. La hipótesis
Figura 7. Craneotomía de 4mm en
hueso parietal.
Figura 8. post operatorio de
ventana craneal.
Figura 9. Visualización de ventana
craneal en el microscopio.
17
es que el cianocrilato logró meterse un poco al campo de la ventana y las meninges se adhirieron a
la parte interna de la calota, con un movimiento del animal un vaso se rompió. La recomendación
es que se asegure la ventana únicamente con el acrílico y el tornillo y se evite el uso del
cianocrilato ya que es difícil de limitar su extensión al cráneo sin lesionar la ventana. Además
según lo evaluado post mortem la estabilidad que se logra con el tornillo es suficiente.
Ya que en este laboratorio no contamos con gelfoam el uso de otros métodos hemostáticos es
igual de efectivo si no se lesionan muchos vasos en el evento quirúrgico y se usa la lidocaína con
epinefrina como vasoconstrictor. Es importante asegurarse que el campo esté seco antes de
poner la ventana y no traccionar la piel y el tejido circundante al aplicar el acrílico ya que este
puede lesionar estos tejidos y generar un sangrado que aunque no es importante, puede
obscurecer el campo visual.
El postoperatorio de los animales en este caso no fue el mejor. Un animal se infectó por una
neumonía secundaria al estrés de la anestesia y el procedimiento quirúrgico. En otro caso hubo
una sobredosis de la anestesia. Sin embargo en dos de los casos (la mitad de la muestra) los
animales se sacrificaron ya que la visión de la ventana se ocluyó pero clínicamente estaban en
buen estado.
Para lograr una buena técnica es necesario repetir el procedimiento para superar la pendiente de
la curva de aprendizaje. Así mismo es necesario monitorizar y limpiar la ventana frecuentemente
para asegurar que ésta no se ensucie y detectar cualquier cambio para intervenir rápidamente. El
perfeccionar este procedimiento permitirá evaluar la microcirculación y será de gran utilidad no
solo para la evaluación del hemosustituto sino que es un modelo aplicable a muchos
medicamentos y estados críticos importantes para la investigación.
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