Potenciacin de la capacidad antioxidante mediante interaccin
sinergista entre bioactivos de frutas nativas colombianas
Jeanine Kathleen Pealoza1, Benjamin Alberto Rojano2
1Investigadora lnea extractos antioxidantes y bioactivos Tecnas S.A., Medelln, Colombia 2Investigador Universidad Nacional de Colombia, Medelln, Colombia
Email: [email protected]
RESUMEN
Los componentes activos de frutas nativas Colombianas fueron obtenidos a travs
de procesos de extraccin en medios hidroalcohlicos y micro encapsulados en
goma arbiga a travs del secado por atomizacin.
Las condiciones del proceso fueron optimizadas empleando un diseo
experimental de superficie de respuesta y correlacionadas con los valores de
capacidad antioxidante ORAC (Oxygen radical absorbance capacity) donde se
obtiene la combinacin adecuada de cinco bioactivos obtenidos de frutas
(antocianinas, flavonoides, taninos, polifenoles y carotenoides) que interaccionan
positivamente y cuya funcionalidad no se ve afectada en el tiempo.
Valores ORAC de 60000 molTrolox/100 g extracto seco son logrados, siendo
mucho mayores que los reportados para los polifenoles de uva, polifenoles del t
verde y otros productos comercializados en el mercado. Esto indica la potencialidad
antioxidante de la sinergia conseguida.
Los contenidos de antocianinas, carotenoides, polifenoles, flavonoides y taninos se evaluaron a travs de tcnicas de fluorescencia y HPLC-MS en tiempo real y acelerado, usando modelos predictivos que indican la estabilidad qumica y la vida til fundamentada en la ecuacin de Arrhenius.
Palabras clave: ORAC, Frutas nativas Colombianas, Antioxidante, Radicales libres, Bioactivos
Vol 23, No 33 (2014), Revista Alimentos Hoy - 3
YURITexto tecleado Recibido 22/09/2014, Aceptado 23/09/2014, Disponible online 31/12/2014
ABSTRACT
The active compounds of Colombian native fruits were obtained through extraction
processes in hydroalcoholic media and micro encapsulated in acacia gum by spray
drying.
Process conditions were optimized using an experimental design of response
surface and correlated with the values of antioxidant capacity ORAC (radical Oxygen
absorbance capacity) where the right combination of five bioactive derived from fruits
(anthocyanins, flavonoids, tannins, polyphenols and carotenoids) that interact
positively and whose functionality is not affected over time.
Values of 60,000 molTrolox /100 g dry matter like ORAC are achieved, being
much higher than those reported for grape polyphenols, green tea polyphenols and
other products sold in the market. This indicates the antioxidant potential of the
synergy achieved.
The contents of anthocyanins, carotenoids, polyphenols, flavonoids and tannins
were evaluated through fluorescence techniques and HPLC-MS in real-time and
accelerated using predictive models that indicate the chemical stability and lifetime
based on the Arrhenius equation.
Keywords: ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity), Colombian native fruits, Antioxidant, Free radicals, Bioactives
I-Introduccin
Las frutas nativas Colombianas
poseen una gama de compuestos
bioactivos con actividad antioxidante,
que consumidos tienen la capacidad
de alterar los procesos metablicos del
organismo (Beecher, 2003). Por esta
razn, buscando el aprovechamiento
de los componentes que favorecen la
salud y la gran demanda de aditivos
naturales en los mercados
internacionales, se inicia este proceso
investigativo.
Dentro de ese gran grupo de
componentes activos se encuentran:
los polifenoles, las antocianinas, los
carotenoides, los taninos y los
flavonoides.
Polifenoles
Los polifenoles, son un grupo de
fitoqumicos que no se identifican como
nutrientes esenciales, pero se les
atribuyen efectos positivos de carcter
antioxidante sobre la salud de los
consumidores que los incorporan
dentro de la dieta. Estos compuestos
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son metabolitos secundarios de las
plantas y se caracterizan por presentar
en su estructura uno o ms anillos
aromticos unidos a uno o ms grupos
hidroxilo (OH) responsables de la
capacidad, de atrapar y/o estabilizar
radicales libres y quelar iones
metlicos que pueden actuar como
pro-oxidantes (Blasa et al., 2010). No
obstante, el mecanismo de accin de
estos constituyentes depende de
numerosos factores an no
comprendidos totalmente, debido a
que poseen numerosos efectos
biolgicos tales como la regulacin de
la expresin de los genes, de la
actividad de diversas enzimas
(Beecher, 2003) como las
lipooxigenasas involucradas en los
procesos de peroxidacin lipdica, y la
NADPH oxidasa y Xantina oxidasa
implicadas en la formacin de EROS
(Guardado-Yordi et al., 2012). Al igual,
debe tenerse en cuenta que la mayora
de los polifenoles tienen efectos
adversos en la interferencia de
absorcin de la protenas y por ende
un efecto prooxidante.
Dentro de este grupo de
compuestos se incluyen un gran
nmero de metabolitos que difieren
entre s por su estructura y reactividad;
van desde estructuras simples, como
los cidos fenlicos, hasta compuestos
con estructuras complejas como los
flavonoides (Eskin y Przybylski, 2000).
Antocianinas
Las antocianinas pertenecientes al
grupo de los flavonoides se encuentran
ampliamente distribuidas en las frutas
principalmente en los berries siendo
responsables del color rojo
caracterstico de estos frutos (Prencipe
et al., 2014). Su consumo se ha
asociado con efectos neuroprotectores
particularmente con la disminucin del
riesgo a padecer la enfermedad de
Parkinson (Flanigan y Niemeyer,
2014), adems se ha encontrado que
el consumo de estos pigmentos
naturales ejerce un efecto
anticancergeno y cardioprotector;
adems ayuda a mejorar la visin y a
prevenir enfermedades como la
diabetes (Wiczkowski et al., 2015).
Carotenoides
Otros compuestos antioxidantes de
gran importancia son los carotenoides.
Estos son los pigmentos liposolubles
ms ampliamente distribuidos en la
naturaleza. Hasta el momento se han
identificado ms de 600 carotenoides
diferentes, pudindose presentar en
diferentes formas estructurales
designadas como -caroteno y -
caroteno, seguidas por: , y -
caroteno. Estos compuestos pueden
actuar como antioxidantes previniendo
las reacciones de peroxidacin lipdica
a travs de la desactivacin de
radicales libres, particularmente de
oxgeno singlete (Blasa et al., 2010).
Su consumo se ha asociado con la
disminucin del riesgo a padecer
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enfermedades degenerativas; adems
actan como precursores de la
vitamina A (Kljak y Grbea, 2015). La
estabilidad de los carotenoides
depende de diversos factores entre los
que se destacan los procesos de
extraccin, tiempo de almacenamiento
y temperatura, la presencia de luz y
oxgeno y el tipo de carotenoide
presente en el alimento (Wibowo et al.,
2015).
Taninos
Los taninos son compuestos
polifenlicos muy astringentes y de
gusto amargo cuyo color va desde el
amarillo hasta el castao oscuro. Son
solubles en agua y forman soluciones
coloidales en alcohol y acetona. Son
polmeros de cidos fenlicos o
flavonoides presentes en la naturaleza
como taninos condensados (no
hidrolizables) e hidrolizables. Los
primeros, tambin llamados
proantocianidinas, son principalmente
polmeros de flavonoides con un alto
peso molecular; tienen la particularidad
de liberar una antocianidina tras una
hidrlisis cida. Los segundos, son
polmeros heterogneos formados por
cidos fenlicos, en particular cido
glico y cido elgico, se hidrolizan
con facilidad por la accin de los
cidos, bases o enzimas, en un
azcar, un polialcohol y un cido
fenolcarboxlico. Los taninos son
potentes antioxidantes pero son
escasamente absorbidos en el
intestino y son considerados factores
antinutricionales debido a que tienen la
habilidad de precipitar protenas e
inhibir enzimas del intestino (Blasa et
al., 2010).
Los principales objetivos de esta
investigacin fueron:
- Identificar las frutas nativas
colombianas que presentan
bioactivos con capacidad
antioxidante.
- Establecer los mtodos de
extraccin que posibilitan la
obtencin de bioactivos especficos
(antocianinas, carotenoides, taninos,
flavonoides y polifenoles).
- Encontrar las mezclas de bioactivos
que en sinergia potencian la
actividad antioxidante
II-Materiales y mtodos
Reactivos y equipos para ensayos de capacidad antioxidante.
Reactivos como el acetonitrilo y los cidos frmico y fosfrico grado HPLC. El 2,2'-azinobis (2-imidinopropano) diclorhidrato (AAPH), fluorescena, cido glico, ferlico, clorognico, cafeico, cumrico, trolox, pelargonidina, cianidina, delfinidina y malvidina fueron comprados a Aldrich Chem. Co (Millwakee, WI); el persulfato de potasio, carbonato de sodio y el reactivo de Folin-Ciocalteu, se obtuvieron de Merck (Alemania). El metanol y otros solventes se compraron en Fisher Scientic Co. (Fair Lawn, NJ, USA). Los
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experimentos ultravioleta-visible se realizaron en un espectrofotmetro Jenway 6405. El agua usada en los experimentos es grado HPLC. Todos los experimentos espectrofotomtricos se realizaron en un ultravioleta-visible Jenway 6405. La disminucin en la intensidad de la fluorescencia medida en el ensayo ORAC se efectu en un espectrofluormetro Perkin-Elmer LS-55, Beaconstield, U.K. Los estudios cromatogrficos se hicieron en un cromatgrafo lquido Shimadzu UGLC.
Frutas.
Se realiz un bagaje inicial de frutas
nativas, determinando su actividad
antioxidante y de acuerdo a los
resultados exhibidos en la capacidad
de absorcin de radicales oxgeno
(ORAC), polifenoles totales, se
seleccionaron las siguientes: Mora
(Rubus glaucus), Maracuy (Passiflora
edulis), Anana (Ananas comosus)
variedad cayena lisa, Granadilla
(Passiflora ligularis), Guayaba comn
(Psidium guajava L. Radd) y Feijoa
(Acca sellowiana).
Obtencin de los extractos de frutas para determinacin de capacidad antioxidante y sus bioactivos.
A cada una de las frutas evaluadas
se les identific el componente activo mayoritario, de modo que, se pudieron establecer los mtodos de extraccin adecuados que no afectaron la naturaleza de los mismos. Las soluciones de anlisis de las frutas, se
obtuvieron a travs de extracciones hidroalcohlicas en relaciones mximas de 1:3 (m/m) entre fruta y solventes. La cantidad de fruta se dej constante y se variaron los contenidos de solventes (agua destilada y etanol al 96%). Para la determinacin de las relaciones adecuadas de solventes que permitieron la mayor capacidad antioxidante, se plante un diseo de mezclas con vrtices extremos en las relaciones de solventes (1:1, 1:2 y 1:3) y con ocho (8) variables de respuesta dentro de las cules se encuentran: Capacidad de absorcin de radicales oxgeno (ORAC), capacidad para reducir hierro (FRAP), antocianinas, carotenoides, polifenoles totales, taninos, flavonoides y capacidad para atrapar el radical DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazilo). Las frutas se trituraron en un procesador de vegetales marca Black&Decker modelo FP1550S con cinco velocidades y se homogenizaron en un ultraturrax T-50 Basic marca IKA-WERK.
Ahora, teniendo los anteriores
resultados, se analiz la influencia de
las variables de proceso temperatura,
tiempo y agitacin en la actividad
antioxidante. Por esta razn, se plane
un diseo compuesto central en 2
bloques (16 corridas experimentales
por fruta) que permiti optimizar los
valores de las variables que
proporcionaron la mayor capacidad
antioxidante.
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Identificacin de variables respuesta
que influyeron en la actividad
antioxidante.
Basados en el primer diseo de
mezclas, en donde las respuestas
fueron ocho (8): Capacidad de
absorcin de radicales de oxgeno
(ORAC), capacidad para reducir hierro
(FRAP), antocianinas, carotenoides,
polifenoles totales, taninos, flavonoides
y capacidad para atrapar el radical
DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazilo), se
plante un nuevo estudio multivariado
basado en el anlisis de componentes
principales (ACP), con el fin de reducir
la dimensionalidad de las variables que
relacionadas entre s, tuvieron la
principal incidencia en la afectacin de
la capacidad antioxidante.
Capacidad de absorcin de
radicales oxgeno (ORAC).
El procedimiento experimental est
basado en reportes previos de Ou y
colaboradores (Ou, B., Huanng, D.,
Hamppsch-Woodill, 2002), en el cual
se emplea TROLOX como estndar,
en condiciones controladas de
temperatura a 37 C y pH 7.4. Las
lecturas se realizaron a una de
excitacin 493 nm y slit de excitacin
10, de emisin 515 nm y slit de
emisin 15, con atenuador del 1%.
Para el desarrollo de la tcnica se
utilizaron soluciones de fluorescena
1x10-2 M y AAPH 0.6 M en buffer
fosfato (75 mM, pH 7.4). Una alcuota
de 30 L muestra se mezcl con 21 L
de fluorescena, 2.899 L de buffer
fosfato y 50 L de AAPH. El efecto
protector del antioxidante se calcul
usando las diferencias de reas bajo la
curva de decaimiento de la
fluorescena entre el blanco y la
muestra, y se compar con la curva
patrn.
Los resultados se expresaron en
micromoles equivalentes de Trolox por
litro de muestra (mol Trolox/ 100 g
producto seco), de acuerdo a la
siguiente ecuacin.
Donde AUC es el rea bajo la curva
de la muestra, AUC rea bajo la curva
para el control, AUCTrolox rea bajo la
curva para el Trolox, f es el factor de
dilucin del extracto (Prior et al., 2005).
La fluorescencia se midi en un
espectrofotmetro de fluorescencia
PerkinElmer LS55.
Actividad atrapadora de radical libre
DPPH (radical 1,1-difenil-2-
picrilhidrazilo).
El 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)
es un radical libre estable que presenta
una coloracin prpura en medio
metanlico, su coloracin disminuye
como consecuencia de la donacin de
un electrn o un protn de un
antioxidante u otro radical.
Para la determinacin de la
capacidad antioxidante por este
mtodo, 10 L de muestra se
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adicionaron a 990 L de una solucin
metanlica de DPPH, y se evalu la
capacidad de las muestras para
atrapar el radical DPPH, por medio de
la disminucin en la absorbancia a 517
nm, luego de 30 minutos de reaccin, y
se compar este valor con la curva de
referencia construida con Trolox como
patrn primario, los resultados fueron
expresados como valores TEAC (mol
Trolox / 100 g producto seco) (Bondet,
et al., 1997). La absorbancia fue
medida en un espectrofotmetro
Jenway 6405 UV/ Vis.
Contenido de polifenoles totales.
La determinacin de fenoles se
realiz por el mtodo colorimtrico de
Folin-Ciocalteu descrito por Singleton y
Rossi, 1965 con algunas
modificaciones. A 50 L de la muestra
se adicionaron 125 L del reactivo de
Folin, y 400 L de carbonato de Sodio
7.1% (p/v), ajustando con agua
destilada hasta 1000 L, se realiz la
lectura espectrofotomtrica a 760 nm y
se compar con la curva patrn
usando como estndar cido glico
(fenol). Los resultados fueron
expresados como mg de cido glico
equivalentes por 100 g producto seco
(mg GAE/100 g producto seco)
Determinacin de capacidad para
reducir el hierro (Ensayo FRAP).
Este mtodo evala el poder
reductor de una muestra en base a su
capacidad para reducir el hierro frrico
(Fe+3) acomplejado con 2, 4,6-tri (2-
piridil)-s-triazina (TPTZ) a su forma
ferrosa (Fe+2), que presenta un
mximo de absorbancia a una longitud
de onda entre 590-595 nm, segn
Benzie et al., 1996. Se adicionaron 50
L de muestra a 900 L de una
solucin de FRAP (Buffer cido
actico-acetato de sodio pH 3.4, TPTZ,
FeCl3, en relacin 10:1:1), luego de 30
min de reaccin se determin la
absorbancia a una longitud de onda de
593 nm. Este valor se compar con la
curva de referencia construida con
cido ascrbico como patrn primario,
y los resultados fueron expresados
como equivalentes de cido ascrbico
(AEAC).
Determinacin de antocianinas por
espectrofotometra UV-Vis.
Se determinaron mediante el
mtodo diferencial de pH. Las
absorbancias se midieron a 530 y 700
nm en buffers de pH 1,0 y 4,5; usando
la expresin A= [(A530 - A700) pH1.0 -
(A530 - A700) pH4.5], y cianidina-3-
glucsido con un coeficiente de
extincin molar de 26900, como
referencia. Los resultados son
expresados como miligramos
equivalentes de cianidina-3-glucsido/L
(Gaviria, et al., 2009)
Anlisis de antocianinas por HPLC-DAD.
Se analizaron mediante la inyeccin directa de la muestra, previamente filtrada a travs de 0,45 de nailon de tamao de poro del filtro, en un HPLC-
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DAD utilizando un Shimadzu LC-20AD/T HPLC equipado con un detector de SPD 6AUV (Kyoto, Japn) y una Pinacle (II) C18 columna (5 ) 250 x 4,6 mm (Restek, Bellefonte, EE. UU) con un autoinyector y un detector de matriz de fotodiodos (PDA). Los disolventes utilizados fueron de grado HPLC acetonitrilo/cido frmico/agua (3:10:87) como solvente A y acetonitrilo/a. frmico/agua (50:10:40) como disolvente B. El perfil de elucin fue el siguiente: mnimo 0, 94 % A, 6 % B; 10 min, 80 % A, 20 % B; 20 min, 60 % A, 40 % B; 30 min, 50 % A, 50 % B; 35 min, 94 % A, 6 % B. Las antocianinas se identificaron y cuantificaron por los tiempos de retencin cromatogrficos, los espectros ultravioleta-visible y las curvas de calibracin de estndares (Osorio et al., 2010 y Schauss et al., 2006)
Determinacin de flavonoides.
La determinacin de flavonoides se
realiz siguiendo el mtodo descrito
por Debnath y otros 2011. Se
construy una curva patrn usando
como estndar (+)-catequina. Los
resultados se expresaron como de mg
catequina/100 g producto seco. Las
lecturas se realizaron a 510 nm.
Determinacin de carotenoides.
Se tom en un tubo de ensayo una
porcin representativa de la muestra,
se adicion 4 mL de acetona y se agit
en un agitador vortex Genie II modelo
G560 marca scientific industries por 2
min. Se centrifug a 4000 rpm/ 10 min
en centrfuga Hettich rotofix 51 y se
recolect el sobrenadante en otro tubo
de ensayo. Se hizo la reextraccin del
precipitado siguiendo el procedimiento
antes descrito. Finalmente, se
combinaron ambos extractos
acetnicos, y se filtr. Se determin la
absorbancia de la solucin a 449 nm.
Determinacin de taninos.
Los anlisis de taninos se realizaron
de acuerdo a los mtodos de la
farmacopea y el mtodo AOAC tras
algunas modificaciones. Se midieron
25 ml de los extractos en un matraz
cnico de 1L, y se adicionaron 25 ml
de solucin ndigo y 750 ml de agua
desionizada. Se realiz la titulacin con
una solucin acuosa de permanganato
de potasio (KMnO4) 0,1N hasta que la
solucin azul vir a un color verde. La
solucin estndar de ndigo carmn se
prepar de la siguiente manera: 6 g de
ndigo carmn se disuelven en 500 ml
de agua desionizada con
calentamiento y luego cuando se enfra
se adicionan 50 ml de cido sulfrico
(H2SO4) al 97%, la solucin se diluy a
1 L y se filtr. El blanco de la prueba se
hizo con 25 ml de la solucin de ndigo
carmn en 750 ml de agua desionizada.
Las muestras se analizaron por
triplicado.
Determinacin de los taninos
condensados.
El mtodo se fundamenta en la
reaccin de los taninos condensados
con vainillina bajo condiciones cidas,
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usando como estndar catequina. Una
alcuota de solucin recin preparada
de vainillina (1 g/100 mL) en cido
sulfrico al 70% se agreg a 500 mL
de extracto de cada fruta (0,01 g/mL).
La mezcla se incub a 20C por 15
minutos y se ley la absorbancia a 500
nm. Se us (+) catequina para
construr la curva de referencia, y los
resultados se expresaron como mg
catequina/100 g de producto seco.
Determinacin de cidos fenlicos
por cromatografa de alta resolucin
(HPLC).
Los contenidos de cidos ferlico,
cafeico y cumrico, se determinaron
mediante el anlisis cromatogrfico por
HPLC. Se utiliz un cromatgrafo
lquido marca Shimadzu, LC20AD,
equipado con autoinyector SIL-20A/HT,
un mdulo de comunicacinCBM-20Ay
un detector con arreglo de fotodiodos
(PDA) SPD-M20A, calibrado a 280 nm.
La separacin de los cidos fenlicos
se llev a cabo en una columna C-18
ultra acuosa, cuyas dimensiones eran
5m*250 mm de longitud y 4,6 mm de
dimetro. Como fase mvil se utiliz
metanol acidulado con cido frmico
0,1% con gradientes de elucin de
0,01 min con 60% metanol; 5-12 min
con 80% de metanol; 13-14 min con
60% de metanol. La razn de flujo de
la fase mvil fue de 1 mL/min. La
cuantificacin se realiz mediante el
empleo de estndares.
Combinaciones ptimas de
extractos de frutas.
Una vez evaluadas las frutas por
separado y definidos los mtodos
extractivos, se efectu un diseo
experimental de mezclas con vrtices
extremos evaluando 5 efectos (5
bioactivos) en 8 corridas
experimentales y se correlacionaron
con la actividad antioxidante medida en
trminos de capacidad de absorcin de
radicales oxgeno (ORAC). Las
ecuaciones de regresin indicaron el
grado de relacin y la
dependencia/independencia de los
valores exhibidos en cada uno de los
bioactivos, revelando que la medida de
polifenoles es la que mayormente se
ve afectada por la interaccin entre los
componentes de estudio (antocianinas,
polifenoles, taninos, carotenoides y
flavonoides). Una vez se seleccion la
mejor mezcla, se someti a la
interaccin con goma arbiga como
material carrier para ser
microencapsulada a travs del secado
por atomizacin.
Anlisis de tamao de partcula de
emulsin goma arbiga-extracto
frutas (ptimo).
Para su evaluacin se emple un
analizador de tamao de partcula
mastersizer 2000 marca Malvern con
intervalos de medida entre 0,2 micras a
2000 micras (con sistema de deteccin
de luz roja y azul, sistema de
alineacin ptica automtico) cuyo
principio de funcionamiento es el
principio de dispersin de Mie.
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Para el anlisis de las muestras
(evaluacin en seco y en hmedo), se
seleccionaron los valores ptimos de
obscuracin, de tal modo que, se
garantiz la orientacin ptima de los
rayos difractores (acordes a las
caractersticas de concentracin y
tamao de partcula de cada sistema).
Los resultados obtenidos dieron
informacin sobre el porcentaje en
volumen para cada tamao de
partcula, tamaos expresados como
D32, D43 e informaciones sobre reas
superficiales Aesp.. Los datos se
analizaron de dos maneras: a.
Incorporando los datos en el diseo de
mezclas con vrtices extremos
establecido para las combinaciones
ptimas de extractos de frutas y b. A
travs de un anlisis de varianza
(ANOVA), que permiti observar la
variabilidad entre las rplicas y las
combinaciones comunes
Medicin de la viscosidad de
emulsin goma arbiga-extracto
frutas (ptimo).
Para esto se emple un
reoviscosimetro Brookfield R/S Plus
(torque 0,05-50 mN-m; Shear rate de
0,9 s-1 a 4*103 s-1). Se llev a cabo
mediante el ajuste del modelo de
Hershel Bulkley a la curva de flujo del
sistema evaluado. Con dicho modelo
se encontr el valor del coeficiente de
consistencia (K), el cual present una
relacin directa con la viscosidad. Para
obtener la curva de flujo, se hizo un
barrido ascendente de shear rate. Del
mismo modo, durante la evaluacin de
la estabilidad de la emulsin en el
tiempo, se determin el cambio del
valor del coeficiente de consistencia (la
estabilidad tiene una relacin inversa
con el cambio en dicho parmetro).
Los valores obtenidos se incorporaron
dentro del diseo experimental
establecido para esta etapa (Diseo de
mezclas).
Medicin de Tixotropa de emulsin
goma arbiga-extracto frutas
(ptimo).
Se determin el perfil de tixotropa el
cual consta de tres etapas: a.
Deformacin del sistema mediante un
barrido ascendente de shear rate; b.
Deformacin del sistema a un shear
rate constante; c. Deformacin del
sistema mediante un barrido
descendente de shear rate (bajo las
mismas condiciones de la primera
etapa). Se busc que a travs de la
tixotropa identificar la estructuracin
de los sistemas (antes, durante y
despus de la deformacin). Estas
evaluaciones requirieron de 100 mL de
muestra en cada mtodo (cada una de
las cuales se cambia para cada
medicin, debido a la destruccin de la
estructura del sistema). Para esta
medicin se us un reoviscosmetro
Brookfield R/S Plus (torque 0,05-50
mN-m; Shear rate de 0,9 s-1 a 4*103 s-
1).
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Secado por atomizacin de
emulsin goma arbiga-extracto
frutas (ptimo).
Este proceso se realiz en dos
fases: Primero se efectu en un
secador por atomizacin B-290 marca
BUCHI de vidrio (capacidad de
evaporacin 1 L/h, flujo mximo de aire
de 35 m3/h, temperatura mxima de
200 C, rango de dimetro de partcula
de 1 a 25 m y tiempo medio de
residencia de 1 a 1,5 s) en donde se
analizaron las variables de proceso de
secado, se probaron las emulsiones
con goma arbiga y se evaluaron las
microcapsulas obtenidas. De este
modo, se determinaron las condiciones
para el escalamiento en un equipo de
mayor capacidad.
El segundo proceso se realiza en un
secador marca Vibrasec con capacidad
de evaporacin de 1,5 L agua/hora,
elaborado en acero inoxidable 304, con
motor trifsico a 220 V y con variador
de frecuencia para la unidad de
atomizacin que permiti regular la
velocidad hasta 30000 rpm. Las
variables, los factores y los respectivos
niveles (se tomaron de acuerdo a
experimentaciones previas) fueron: a.
Temperatura de entrada (niveles 125
C, 150 C y 175 C), b. Porcentaje de
bombeo (niveles 15%, 20% y 25 %), c.
Porcentaje de aspiracin (niveles
60%,70% y 80%).
Por medio de un diseo factorial
multinivel con dos puntos centrales por
bloque se analizaron los efectos de los
factores de entrada sobre las
respuestas de importancia
(rendimiento, eficiencia de
microencapsulacion y tamao de
partcula) para luego buscar la
optimizacin del proceso por medio de
una superficie de respuestas.
Finalmente, se correlacionaron los
resultados obtenidos entre los equipos
empleados, de modo que, se
determinaron las relaciones de las
variables de proceso que no afectaron
la actividad antioxidante de la
combinacin sinrgica de bioactivos de
frutas.
III-Resultados y discusin
Seleccin de variables de proceso
adecuadas para extraccin de
bioactivos.
De acuerdo con el anlisis de los
datos para el diseo experimental de
Box-Behnken (se hicieron 15 corridas
experimentales con 3 puntos centrales
por bloque), se logra que a las
condiciones mostradas en la tabla 1 se
obtenga la capacidad antioxidante
ptima. Para esta primera etapa en
donde se conciben 8 variables de
respuesta, se especifica que la
capacidad de reduccin de hierro
(ensayo FRAP) y la capacidad
atrapadora del radical libre DPPH (1,1
difenil, 2-picrilhidrazilo), no tienen
influencia sobre la actividad
Vol 23, No 33 (2014), Revista Alimentos Hoy - 13
antioxidante en trminos de capacidad
de absorcin de radicales oxgeno
(ORAC) y contenido de polifenoles
totales.
Tabla 1. Condiciones de proceso que optimizan la capacidad antioxidante de las
frutas nativas en estudio
FRUTA TEMPERATURA
(C)
AGITACIN
(rpm) TIEMPO (min)
Mora (Rubus
glaucus) 50 400 75
Maracuy
(Passiflora
edulis)
60 400 120
Anana (Ananas
comosus) 70 800 75
Granadilla
(Passiflora
ligularis)
70 600 30
Guayaba
(Psidium
guajava L.
Radd)
50 800 75
Feijoa (Acca
sellowiana) 50 400 75
Identificacin de bioactivos y
actividad antioxidante de frutas en
estudio.
A travs de mtodos de
espectrofotomtricos y HPLC-MS se
identifican para cada una de las frutas
los bioactivos mayoritarios de tipo
antioxidante.
En la mora (Rubus glaucus) se
identificaron las antocianinas: cianidina
3-O--piransido como compuesto
mayoritario. Estudios realizados en
frutas del gnero Rubus muestran que
la antocianidina ms frecuente es la
cianidina.
Qingguo Tian et al., reportaron las
antocianidinas cianidina 3-glucsido,
cianidina 3-sambubisido, y cianidina
3-rutisido en la especie Rubus
occidentalis con un contenido de
antocianinas totales de 170-430
mg/100 g fruta fresca.
Vol 23, No 33 (2014), Revista Alimentos Hoy - 14
En la maracuy (Passiflora edulis),
granadilla (Passiflora ligularis) y Feijoa
(Acca sellowiana) predominan los
flavonoides que podran tener
propiedades antimicrobianas y
antioxidantes (Vuotto et al., 2000; lelpo
et al., 2000). Ver tabla 2 en donde se
muestran los contenidos de bioactivos
de las frutas en estudio
Tabla 2. Bioactivos y actividad antioxidante de frutas nativas fin de estudio
FRUTA
Fenoles Carotenoides Antocianinas ORAC
mg de cido
glico / 100 g
de producto
fresco
mg de -caroteno/100 g
producto fresco
mg Cianidin-3-
glucsido/100 g
producto fresco
mol Trolox/100
g producto
fresco
Mora (Rubus glaucus)
460-600 No presentes 13.8 - 14.7 3829-5860
Maracuy (Passiflora edulis)
632.29-637.71 No presentes No presentes 2500-3000
Anana (Ananas comosus)
100-150 30 (como -
caroteno) No presentes 3100-4000
Granadilla (Passiflora ligularis)
637.75-643.65 No presentes No presentes 1250-3000
Guayaba (Psidium guajava L.)
376.39- 394.39 No presentes No presentes 10188.26-
10478.54
Feijoa (Acca sellowiana)
150-200 No presentes No presentes 2800-4200
Seleccin de variables influyentes
en la respuesta de actividad
antioxidante medidas como
capacidad de absorcin de radicales
oxgeno (ORAC).
A travs del mtodo multivariado de
componentes principales se reduce la
dimensionalidad de las ocho (8)
variables inicialmente contempladas. El
primer eje de componentes
corresponde a la capacidad ORAC que
explica el 63,39% de la variabilidad y el
segundo componente concierne a los
polifenoles totales que explican el 95%
de la varianza. Ver tabla 3.
Vol 23, No 33 (2014), Revista Alimentos Hoy - 15
Tabla 3. Valores de anlisis de componentes principales (ACP) para las
variables
COMPONENTE NMERO
EIGENVALOR PORCENTAJE DE VARIANZA
PORCENTAJE ACUMULADO
1 (ORAC) 31,695 63,390 63,390
2 (POLIFENOLES) 158,401 31,680 95,070
3 (FLAVONOIDES) 0,24649 4,930 100,000
4 (ANTOCIANINAS) 2,48E-11 0 100,000
5 (CAROTENOS) 0 0 100,000
Se aprecia que los resultados de
la capacidad de absorcin de
radicales oxgeno (ORAC) son
esenciales para explicar el cambio
en la capacidad antioxidante. Los
mtodos fluorimetricos para
determinar la actividad antioxidante
han tenido una gran
implementacin en los ltimos
aos debido a su gran sensibilidad
y precisin. El mtodo ORAC mide
la capacidad antioxidante mediante
un mecanismo de transferencia de
protones HAT (Hydrogen Atom
Transfer), es la tcnica avalada por
el Departamento Federal de
Agricultura de Norteamrica para
medir el potencial antioxidante total
de alimentos y suplementos
nutricionales (Wu et al., 2004).
El mtodo consiste, en evaluar
la degradacin oxidativa de una
molcula fluorescente
(fluorescena) en presencia de
iniciadores de radicales libres
como los Azocompuestos (AAPH).
Los iniciadores de radicales libres
producen radicales peroxilos que
causan dao a las molculas
fluorescentes. Las especies
antioxidantes como los extractos
de frutas inhiben el proceso
oxidativo atrapando los radicales
peroxilos formados (Bisby et al.,
2008). El mecanismo se describe
a continuacin:
2ROONRNNR 2O2
oxidada Sust.ROOHfluoresc. Sust.ROO 2O
AROOHAHROO
ROOAAROOrpida
El valor ORAC total encontrado para la mezcla ptima de las frutas
seleccionadas fue de 60000 mol de Trolox/ 100g de producto seco es ms alto que la mayora de granos, legumbres y frutas
Vol 23, No 33 (2014), Revista Alimentos Hoy - 16
incluidos muchos berries como mortio (Vaccinium meridionale), fresas, uvas, arndanos; y superados solamente por fracciones seleccionadas de extractos de acai (Euterpe Oleraceae) y algunos flavonoides separados de esta especie, por algunos tipos de sorgos ricos en taninos, y de algunas especies como organo seco (Origanum vulgare), crcuma (Curcuma longa), y por algunas flores de plantas de la familia Anacardiaceae (Zulueta A, Esteve MJ, Frgola A, 2009).
Combinacin ptima de frutas
para lograr efecto sinrgico de
bioactivos.
Los metabolitos secundarios con
caractersticas polifenlicas, son
determinantes en la actividad
antioxidante de las frutas. En la
tabla 4 se exhiben las cantidades
de bioactivos tras el proceso de
obtencin de la interaccin ptima,
en donde se aprecia el aumento de
la concentracin de los
componentes, al compararse con
el contenido inicial de los mismos
en las frutas frescas.
Tabla 4. Composicin de bioactivos y cidos fenlicos en la sinergia de frutas
obtenida (optimizada)
MUESTRA
cido
Ferulico
cido
cafeico
cido
cumrico ORAC Antocianinas Polifenoles Taninos Flavonoides
mg de a.
ferlico/
100 g de
extracto
seco
mg de
a.cafico/
100 g de
extracto
seco
mg de
a.cumrico/
100g de
pulpa seca
mol
Trolox/100
g extracto
seco
mg cianidin-3-
glucsido/Kg
extracto seco
mg
a.glico/100
g extracto
seco
mg de
catequina/
100 g de
extracto
seco
mg de
catequina/
100 g de
extracto
seco
Mezcla de
frutas
optimizada
(Sinergia
de
bioactivos)
106 10.5 63 60000 2300-3000 4500-5000 8500 1500
Se presentan cantidades
importantes de flavonoides, los
cules estn asociados a muchos
efectos benficos para la salud,
debido a sus propiedades
antioxidantes. Para los flavonoides,
se han reportado muchas
actividades biolgicas como:
antiinflamatorios, antivirales y
antibacteriales; de otro lado se ha
asociado la ingesta de flavonoides
con efectos benficos en
Vol 23, No 33 (2014), Revista Alimentos Hoy - 17
enfermedades cardiovasculares
(Middleton et al., 2000 y Knekt et
al., 1996). De igual manera los
contenidos de flavonoides de la
sinergia de frutas obtenida son
muy superiores a diversos
extractos de plantas y frutas
(Debnath et al., 2011; Biglari et al.,
2008 y Biglari, 2009).
Caracterizacin de la mezcla
ptima de bioactivos destinada
para micro encapsulacin.
Tras las corridas del diseo de
mezclas simplex-lattice (nueve
experimentos con tres puntos
centrales por bloque) se
identificaron la composicin
multicomponentes (extractos de
frutas) que mayor capacidad
antioxidante presentaron, medidas
en trminos de ORAC, contenido
de polifenoles, antocianinas,
flavonoides y carotenoides.Estos
tres ltimos componentes fueron
independientes y no se
correlacionaron. Lo anterior,
posibilit modificar las
caractersticas del sistema coloidal
en algunas de sus propiedades sin
verse influencia en las dems.
Las emulsiones se desarrollaron
de modo que la viscosidad no
sobrepasara los 300 cps
garantizando as, que el
comportamiento en el secador es
adecuado para la formacin de las
microcpsulas de la mezcla de
bioactivos de frutas. El anlisis de
tamao de partcula (DTP) indica
buena homogeneidad dimensional.
Ver figura 1.
Figura 1. Distribucin de tamao de partcula (DTP) de la emulsin (sinergia de
bioactivos) destinada para microencapsulacin
Vol 23, No 33 (2014), Revista Alimentos Hoy - 18
Por tanto, el tamao de la
partcula establece la superficie de
transferencia de calor disponible a
la velocidad de secado. En las
partculas con un tamao ms
pequeo, el agua migra una
distancia ms corta desde el
interior de hasta la superficie y as
la gota se seque ms rpido
proporcionando una mayor
superficie de las partculas por
consiguiente mayor cantidad de
humedad puede escapar. Sin
embargo, durante la cada en el
perodo de secado, este se ve
limitado por mecanismos internos
de transferencia de masa, como la
difusin de lquido y vapor
(Adamopoulos et al., 2006)
Determinacin de las
condiciones ptimas de secado
por atomizacin.
Las variables de proceso
planteadas para la
microencapsulacin a travs del
secado por atomizacin fueron:
temperatura de entrada,
temperatura de salida, bombeo y
aspiracin. La temperatura de salida es dependiente de la
temperatura de entrada y de la
termodinmica del sistema.
Una vez se corre el diseo
experimental para la optimizacin
de las variables, se obtiene que la
temperatura de entrada y la
aspiracin tienen influencia sobre
el contenido de humedad de los
polvos de bioactivos de frutas (ver
figura 2). A mayor temperatura y
menor aspiracin se obtuvieron
valores bajos de humedad
(variables directamente
relacionadas).
Si se trabaja a baja temperatura
no se consiguen secar caudales
altos de lquido. Esto se debe a
que el aire caliente empleado para
el secado no contiene suficiente
calor para producir la evaporacin
total del lquido que llega al cilindro
de atomizacin.
Vol 23, No 33 (2014), Revista Alimentos Hoy - 19
Superficie de Respuesta EstimadaBOMBEO=10,0
120 125 130 135 140 145 150TEMPERATURA
6568
7174
7780
ASPIRACION
2,6
2,9
3,2
3,5
3,8
4,1
4,4
HU
ME
DA
D
HUMEDAD
2,6-2,78
2,78-2,96
2,96-3,14
3,14-3,32
3,32-3,5
3,5-3,68
3,68-3,86
3,86-4,04
4,04-4,22
4,22-4,4
4,4-4,58
Figura 2. Superficie de respuestas para microencapsulacin de la mezcla de
bioactivos de frutas a travs del secado por atomizacin
Para la microencapsulacin de
la mezcla de bioactivos de frutas
se requiere una T de entrada al
secador de 180 C, 80% de
aspiracin y de 6 a 10 % de
bombeo. Las cpsulas obtenidas
se registran a travs de
microscopia de barrido electrnico
(SEM), garantizando que los
mismos componentes activos se
encuentran protegidos de la
humedad, la luz y otras
condiciones medioambientales o
de almacenamiento. Ver figura 3.
No se aprecia afectacin de la
capacidad antioxidante a las
condiciones de secado
anteriormente mencionadas.
Vol 23, No 33 (2014), Revista Alimentos Hoy - 20
Figura 3. Microcpsulas de bioactivos de frutas nativas (mezcla sinrgica
ptima) tras el secado por atomizacin
La actividad antioxidante en los
productos alimenticios, sugiriendo
que la mezcla compleja de
antioxidantes en las frutas
proporciona beneficios sobre la
salud, principalmente a travs de la
combinacin de efectos aditivos
y/o sinrgicos. Cao et al. (1996) y
Wang et al. (1996), realizaron
estudios en frutas y hortalizas,
demostrando que la mayor parte
de la actividad antioxidante
proviene principalmente del
contenido de flavonoides y otros
compuestos fenlicos (Gil et al.,
2006).
Se observa por los resultados
que las altas temperaturas no han
afectado a la estabilidad de las
antocianinas. Esto parece indicar
que los tiempos de residencia
empleados en el secado por
atomizacin son tan pequeos (=
1s) que no tiene lugar la
degradacin de las mismas. .
Al igual que se hizo en las
medidas de contenido en
antocianinas, se calcul el
rendimiento de fenoles totales
dividiendo los gramos totales de
fenoles obtenidos en un
experimento de secado entre los
gramos totales presentes en la
disolucin que se sec. Si no se
gener destruccin de estas
molculas en el proceso de
secado, el rendimiento de fenoles
debi ser similar al rendimiento
msico del experimento. En vista
de los resultados, se puede
concluir que los fenoles no
desaparecieron tras el secado por
atomizacin, y el carrier de
encapsulacin (goma arbiga) no
Vol 23, No 33 (2014), Revista Alimentos Hoy - 21
interfiri en el mtodo de
determinacin de los mismos.
IV-Conclusiones
Los taninos condensados,
proantocianidinas o procianidinas
son oligmeros o polmeros
formados por unidades de flavan-
3-ol (catequina, epicatequina,
antocianinas); son uno de los
principales componentes de
muchos vegetales como el t y el
cacao donde su contenido puede
llegar hasta el 35% de los
polifenoles totales. En nuestro
estudio encontramos un contenido
de taninos en la mezcla sinrgica
de bioactivos muy superior a los
reportados para cacao, t, algunos
arndanos y otras frutas (Gu et al.,
2002 y Zapata et al., 2011).
La sinergia de bioactivos
presentes en las frutas nativas
estudiadas, posibilitan la obtencin
de valores alrededor de 60000 UI
ORAC (mol Trolox/100 g producto
seco), con los cules a travs de la
dosificacin de 1,71 g se facilita un
buen equilibrio oxidativo y se suple
el 25% de la capacidad
antioxidante medida en unidades
ORAC que recomienda la FDA y la
USDA (5000 ORAC/da). El
contenido que se presenta en el
producto final indica que se tiene
una alta capacidad atrapadora de
radicales libres peroxilos (ROO.),
hidroxilos (OH.), especies reactivas
al oxgeno y nitrgeno (ROS y
RNS).
De igual manera, proporcionar
efectos benficos a la salud, los
cules se corroborarn en estudios
posteriores a este, mediante la
evaluacin en clulas
cancergenas.
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Agradecimientos
A la familia, por comprender las
ausencias en las fechas especiales
pues, estbamos trabajando en lo
que nos apasiona,
A Tecnas S.A., por los aos de
apoyo incondicional y por permitir
la obtencin de productos
novedosos a partir de la
investigacin,
A los compaeros de innovacin,
desarrollo e investigacin de
Tecnas S.A. por sus crticas
constructivas
Vol 23, No 33 (2014), Revista Alimentos Hoy - 25
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