Métodos Selectivos y Eficientes para la Purificación de enzimas
Procesos de Química Sostenible utilizando enzimas como catalizadores
Curso Posgrado Ciencias y Tecnologías Químicas
Curso Posgrado 2012 Contenido
- Introducción - Purificación de lipasas por adsorción interfacial - Purificación de enzimas por mecanismos de afinidad
1. Máxima actividad catalítica
Extracto crudo de enzima
Purificación
+
Ej. 100 mg enzima/g soporte
-Empleo a Nivel Industrial
-Ampliación rango sustratos no naturales
Importancia de purificación de enzimas Curso Posgrado 2012
Importancia de purificación de enzimas
2. Eliminación Reacciones indeseables
R CO
NH
R' COO R''
E2
E1
Reacción deseada
Reacción a evitar
Lipasa C. antarctica A
Esterasa enantioselectiva
Curso Posgrado 2012
Tetrahedron:Asymmetry.2002, 13,2653-2659
Purificación de enzimas a escala laboratorio
Adsorción de todas las enzimas (1mg de muestra enzima/ml) Desorción selectiva de nuestra enzima Varios procesos cromatográficos… No importa tiempo ni dinero
Curso Posgrado 2012
Purificación Industrial de enzimas
Métodos sencillos, rápidos y baratos Pocos pasos cromatográficos
Curso Posgrado 2012
Purificación de lipasas por adsorción interfacial
Curso Posgrado 2012
Lipasa en solución acuosa
Conformación cerrada
(forma inactiva)
Conformación abierta
(forma activa)
Lid Sitio activo
Área hidrofílica
Área hidrofóbica
Curso Posgrado 2012
Área hidrofílica
Área hidrofóbica
Conformación abierta
Conformación cerrada
Sitio activo
Gota de grasa
Lid
Activación interfacial de lipasas Curso Posgrado 2012
Superficie Hidrofóbica
Pequeños bolsillo hidrofóbicos… Solo se absorben aFI Adsorción selectiva de lipasas
Aumento de actividad hacia substratos solubles pequeños
BAJA FUERZA IONICA
Purificación por absorción interfacial
+
Curso Posgrado 2012
Método 1: Soportes Hidrofóbicos
Curso Posgrado 2012
Grupos butil, fenil, octil, octadecil…
Baja fuerza iónica
+ 25ºC, pH 7
Microambiente hidrofóbico
CADENAS HIDROFOBICAS SUPERFICIE HIDROFOBICA
Adsorción sobre diferentes soportes hidrofóbicos Curso Posgrado 2012
-Mayor dilución enzima
-Menor fuerza iónica Mayor velocidad de adsorción
Purificación más rápida
Formas Monoméricas
Forma Dimérica
Curso Posgrado 2012
Efecto de la fuerza iónica en la adsorción de lipasa de R. niveus en octil-agarosa
pH 7 and 4°C
Sin sulfato amonico
0.1 M sulfato amónico
1M sulfato amónico
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 Time (min)
Res
idua
l act
ivity
(%)
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 Time (min)
Res
idua
l act
ivity
(%)
Sob
Curso Posgrado 2012
Biotechnol. Bioeng. 1998, 58: 486-493
9466
45
30
20,1
1 2 3 4 5 6 7
Mw (KDa)
9466
45
30
20,1
1 2 3 4 5 6 7
Mw (KDa)
PFL
Purificación sobre octil-ararosa
TAL TLL CAL-B
Curso Posgrado 2012
Lipasa de Candida antarctica B (CAL-B)
Lipasa de Pseudomonas fluorescens (PFL)
Lipasa de Thermomyces lanuginosa (TLL)
Lipasa de Thermus aquaticus (TAL)
J. Mol. Cat B: Enzymatic. 2002,19-20,279-286 Biomacromolecules. 2004, 5,249-254
1 2 3 4 5 6
BTL2
97.0 66.0 45.0
30.0
20.1
14.4
Mw
octil hexyl butil
Adsorción de BTL2 a distintos soportes hidrofóbicos Curso Posgrado 2012
Lipasa de Bacillus thermocatenulatus (BTL2)
Diferente hidrofobicidad
Purificación de 3 lipasas del extracto de A. niger (ANL)
octil octadecil
Purificación de distintas lipasas vía adsorción sobre distintos soportes hidrofobicos
ANL
ANL
Curso Posgrado 2012
Biotechnol Bioeng. 2005,92,773-779
Sobrenadante de octil adsorbido Sobre octadecil
FUERZA DE ADSORCION
OCTIL
0.2% TRITON
0.6% TRITON
Curso Posgrado 2012
Biotechnol Bioeng. 2005,92,773-779
Curso Posgrado 2012 Efecto de la purificación en la selectividad
Biotechnol Bioeng. 2005,92,773-779
Método 2: Proteína Hidrofóbica
Curso Posgrado 2012
Adsorción sobre hidrofobinas inmovilizadas
Monómero Hidrofobina
Distinto tamaño
Distinta composición parte hidrofóbica
Modificación química o genética
Hakanpää et al. Protein Sci. 2006 15: 2129-2140
Anfipática
Área hidrofílica
Área hidrofóbica
Trichoderma reesei HFBII
Parte hidrofílica
Parte hidrofobica
Curso Posgrado 2012
:NH2 :NH2
:NH2
glioxil-agarosa
24 h
NaBH4 30 min
O HO HO H CH
N
CH
NO H
O HCH
N
Zona rica en Lys
25ºC, pH 10.1
CH2
NH
CH2
NH
CH2
NH
CH2
OH
Unión Multi-puntual
Soporte Inerte
Preparación de la Matrix
Dioxano/triton x-100 6:4
Curso Posgrado 2012
Baja fuerza iónica
+
25ºC, pH 7
Curso Posgrado 2012
Biomacromolecules.2003,4,204-210
Efecto de la adsorción sobre hidrofobinas en las propiedades catalíticas de lipasas
soluble 0
10
20 30
40 50
60 70
80 90
100
0 20 40 60 80
Tiempo (horas)
% A
ctiv
idad
resi
dual
Estabilidad. CAL-B, pH 7,50ºC.
Hidrofobina-lipasa
Octil-lipasa
Curso Posgrado 2012
Método 3: Lipasa
Curso Posgrado 2012
Adsorción específica
Lipasa inmovilizada
baja fuerza iónica
Otras proteínas
Esterasa
Ej: 5mM fosfato
detergente Lipasa purificada
Purificación via adsorción lipasa-lipasa: un nuevo concepto Curso Posgrado 2012
Requisitos del método: 1. Una enzima con grupos reactivos en la cara opuesta al lid 2. Un método de inmovilización a través de este área que permita conseguir una superficie inerte
Curso Posgrado 2012
Purificación via adsorción lipasa-lipasa: selección de la enzima
Estructura de la conformación abierta de la lipasa de Pseudomonas fluorescens (PFL)
Lisinas Lid
Zonas Hidrofóbicas
Lys en la cara opuesta al lid Lid y zona hidrofobica amplia
Curso Posgrado 2012
J.Cromatogr.A.2004, 1038, 267-273
:NH2 :NH2
:NH2
glioxil-agarosa
24 h
NaBH4 30 min
O HO HO H CH
N
CH
NO H
O HCH
N
Zona rica en Lys
25ºC, pH 10.1
CH2
NH
CH2
NH
CH2
NH
CH2
OH
Unión Multi-puntual
Soporte Inerte
Purificación via adsorción lipasa-lipasa: selección del soporte Curso Posgrado 2012
Baja fuerza iónica
+
25ºC, pH 7
Otras proteínas
Adsorción Específica
Lip-lip
Curso Posgrado 2012
Purificación de lipasa de Bacillus thermocatenulatus (BTL2)
J.Cromatogr A.2004, 1038, 267-273.
Extracto crudo de BTL2
Mw (kDa)
30
45
66
94
20.1
1 2 3
SDS,100ºC
1. Patrones de peso molecular 2. Extracto crudo de BTL 3. BTL purificada
5 mM Tampón fosfato pH 7
detergente
BTL2 purificada
Curso Posgrado 2012
30
43
66 94
20.1
1 2 3
Adsorción a soporte octil-agarosa a baja fuerza iónica
Mw (kDa)
30
45
66
94
20.1
1 2 3
Mw (kDa)
Adsorción a soporte Lipasa a baja fuerza iónica
Más Específica
Comparación de dos métodos de purificación de BTL
Curso Posgrado 2012
Curso Posgrado 2012
Purificación de enzimas por mecanismos de afinidad
Proteína HaloTag
Purificación de proteínas vía inmovilización HaloTag
Proteína de Fusión con HaloTag
Proteasa
Estrategias de purificación de enzimas
Resina HaloLink™
1. Inmovilización Selectiva
Cl
2. Lavado Proteína purificada
M. Urh et al. Cell Notes, 2006,14,15.
Curso Posgrado 2012
-
-
+
Proteínas recombinantes con colas de
poli-His COO
MeHis
HisHis
HisHis
His
COO
Purificación selectiva sobre soportes con quelatos metálicos
imidazol
Estrategias de purificación de enzimas
J. Porath et al. Nature. 1975, 258,598.
His
HisHis
HisHis
His1. Inmovilización
Selectiva 2. Lavado
Proteína purificada
Curso Posgrado 2012
Soporte cromatográfico
Concentración de
quelatos-Zn
% poli-His β-galactosidasa
adsorbida
% enzimas naturales
adsorbidas
* Velocidad de adsorción
Estándar
Alta densidad
30 µEqs/ml
>95%
32%
100
Baja densidad 3 µEqs/ml
>95%
<2%
10
Dextranos alta densidad
30 µEqs/ml
>95%
<2%
80
* 100 referido a la velocidad de inmovilización del soporte activado con 30 µmoles / mL sin recubrir
Curso Posgrado 2012
Adsorción de β-galactosidasa de thermus sp. con colas de polihistidina sobre soportes imac-Zn+2
Adsorción de β-galactosidasa de thermus sp. con colas de polihistidina sobre soportes imac-Zn+2
1- Patrones PM.
2- Extracto crudo.
3- Enzimas adsorbidas a soportes con alta densidad.
4- Enzimas adsorbidas a soportes con baja densidad.
94000
67000
43000
30000
20100
1 2 3 4 5
J. Chromatogr. A. 2001. 915, 97-106
Curso Posgrado 2012
Efecto del metal
Adsorción de glutaril acilasa de E. coli. con colas de polihistidina sobre diferentes soportes
Curso Posgrado 2012
Soporte cromatográfico
EPI-10-IDA
% enzimas naturales adsorbidas
% poli-His Glutaril acilasa
adsorbida
Cu2+
65
100
Zn2+ 5
100
Ni2+ <5
100
Co2+ <5 100
Cu2+
+ 7 mM imidazol <5
100
Biotechnol. Bioeng. 2001, 76, 269-276
Purificacion de enzimas con colas de histidina Curso Posgrado 2012
1- Patrones PM.
2- Extracto crudo.
3- Enzimas adsorbidas a soportes con alta densidad.
3
Biotechnol. Bioeng. 2001, 76, 269-276