INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
Departamento de Biotecnología
“Extractos de plantas micropropagadas deAristolochia elegans Mast. con actividadrelajante en la contracción inducida porveneno de alacrán (Centruroides limpidus
limpidus Karsch.) en íleon aislado de cobayo”
T E S I S
P R E S E N T A
ALEJANDRO MORA IZQUIERDO
DIRECTOR: Dr. ANTONIO JIMÉNEZ APARICIO
Que para obtener el grado de M a e s t r o e n C i e n c i a s e n Desarrollo de Productos Bióticos
Yautepec, Morelos Dic, 2004
EL TRABAJO EXPERIMENTAL DE ESTA TESIS SE REALIZÓ EN EL
DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA DEL CEPROBI–IPN Y EN LOS
LABORATORIOS DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL Y DE
FARMACOLOGÍA DEL CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA DEL
SUR–IMSS. EL DR. ANTONIO JIMÉNEZ APARICIO FUE EL DIRECTOR
DE ESTA TESIS Y SE CONTÓ CON LA VALIOSA ASESORÍA DE LA
DRA. ELSA VENTURA ZAPATA Y LA DRA. LIDIA OSUNA TORRES;
ADEMÁS DE LAS CONTRIBUCIONES DEL DR. ENRIQUE J. JIMÉNEZ
FERRER, LA DRA. SILVIA EVANGELISTA LOZANO Y EL DR.
ROBERTO MONTES BELMONT.
RECONOCIMIENTOS
AL CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA POR LA BECA
RECIBIDA PARA LA REALIZACIÓN DE ESTUDIOS DE MAESTRÍA Y EL
APOYO PARA LA REALIZACIÓN PARCIAL DE ESTE TRABAJO.
AL PROGRAMA DE FORMACIÓN DE INVESTIGADORES DEL IPN
POR EL APOYO RECIBIDO COMO BECARIO EN LOS PROYECTOS
CGPI 20030340, 20030343 Y 20040547.
A mis padres, su amor y respeto por la naturaleza ha sido un ejemplo que me ha impulsado a seguir esta disciplina del conocimiento.
A mi familia,
una de las razones mas importantes que me hacen continuar adelante.
A mis profesores, compañeros y amigos de hoy y de siempre…
CONTENIDO
ÍNDICE DE CUADROS ÍNDICE DE FIGURAS LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS GLOSARIO RESUMEN ABSTRACT 1 INTRODUCCIÓN 2 ANTECEDENTES 2.1 PLANTAS MEDICINALES 2.2 IMPORTANCIA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS 2.3 MICROPROPAGACIÓN 2.4 GÉNERO Aristolochia 2.5 Aristoloch a elegans i 2.6 ENVENENAMIENTO POR PICADURA DE ALACRÁN
2.7 PLANTAS USADAS EN EL TRATAMIENTO DE PICADURA DE ALACRÁN 2.8 GÉNERO Aristolochia EN EL TRATAMIENTO DE PICADURA ALACRÁN 2.9 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA 3 JUSTIFICACIÓN 4 OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL 4.2 OBJETIVOS PARTICULARES 5 MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 MATERIALES 5.1.1 Material biológico 5.1.2 Reactivos y material de laboratorio 5.2 METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
pag. i ii
iv
vi
1
2
3
6
6
8
9
12
13
16
18
18
20
23
24
24
24
25
25 25 25
25
5.3 MICROPROPAGACIÓN Y CULTIVO 5.3.1 Condiciones generales de preparación de medio de cultivo 5.3.2 Desinfestación de semillas 5.3.3 Inducción de brotes 5.3.4 Multiplicación y elongación de brotes 5.3.5 Inducción de raíces 5.3.6 Aclimatización 5.3.7 Cultivo en invernadero y cosecha 5.4 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA 5.4.1 Obtención de extractos 5.4.2 Obtención de veneno 5.4.3 Animales de experimentación 5.4.4 Preparación de soluciones stock 5.4.5 Preparación del equipo y cámara de incubación 5.4.6 Contracción inducida por veneno de alacrán 5.4.7 Prueba de relajación 5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS 6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 MICROPROPAGACIÓN 6.1.1 Desinfestación de semillas 6.1.2 Inducción de brotes 6.1.3 Multiplicación y elongación de brotes 6.1.4 Inducción de raíces 6.1.5 Aclimatización 6.1.6 Desarrollo en invernadero y cosecha 6.2 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA 6.2.1 Obtención de extractos 6.2.2 Cuantificación de la contracción inducida por el veneno 6.2.3 Prueba de relajación 7 CONCLUSIONES 8 PERSPECTIVAS 9 BIBLIOGRAFÍA
26 26 26 28 30 30 32 33
35 35 35 36 36 36 38 38
39
40
40 40 43 47 48 50 54
56 56 57 58
62
64
66
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Compuestos químicos encontrados en A. elegans. Cuadro 2. Tratamientos para la desinfestación de semillas de A. elegans mediante la
combinación de tres concentraciones de NaClO con tres tiempos de inmersión. Cuadro 3. Tratamientos con los fito-reguladores ANA y/o BAP para la inducción de
brotación múltiple en dos tipos de explante (yemas apicales y yemas axilares). Cuadro 4. Tratamientos con los fito-reguladores AIB y ANA para la inducción de raíces en
explantes de yemas axilares. Cuadro 5. Efecto de soluciones de NaClO a diferentes concentraciones y tiempos de
inmersión, en la desinfestación de semillas. Cuadro 6. Efecto del uso de etanol al 70% con diferentes tiempos de inmersión combinado
con el tratamiento E (NaClO 1.0 % / 10 min), en la desinfestación de semillas. Cuadro 7. Formación de brotes en yemas apicales y axilares por efecto de diferentes
tratamientos con fito-reguladores. Cuadro 8. Formación de raíces en yemas axilares por efecto de diferentes tratamientos con
los fito-reguladores AIB y ANA. Cuadro 9. Valores de velocidad específica de cambio de los cuatro parámetros de
crecimiento de las plantas, evaluados durante la etapa de aclimatización. Cuadro 10. Valores de humedad relativa (HR) y potencial hídrico (Ψ) dentro del sistema
hidropónico y la cámara de incubación, durante las primeras cinco semanas de aclimatización.
Cuadro 11. Material vegetal cosechado de plantas cultivadas de A. elegans. Cuadro 12. Rendimientos de extracción de las plantas cultivadas de A. elegans. Cuadro 13. Efecto de los extractos de las partes aéreas y raíces de A. elegans sobre la
relajación del íleon contraído por efecto del veneno de alacrán.
pag.
15
27
29
31
40
41
43
49
51
53
55
56
59
i
t
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Distribución en México de las especies de alacranes de mayor peligro para los
humanos, todas pertenecientes al género Centruroides. Figura 2. Flor de Aris olochia elegans. Figura 3. Diagrama de flujo del desarrollo experimental. Figura 4. Diagrama de flujo de la desinfestación de semillas. Figura 5. Representación de los sitios de corte en las plántulas para obtener los explantes. Figura 6. Esquema en el que se muestran las diferentes fases de micropropagación de A.
elegans. Figura 7. Equipo de prueba para el modelo de íleon aislado de cobayo. En (a), fotografía
del equipo y principales componentes; y (b), esquema que representa la cámara de incubación.
Figura 8. Ejemplo de los registros gráficos típicos proporcionados por el equipo y los
componentes para obtener el porcentaje de relajación. Figura 9. Efecto de diferentes tratamientos en la desinfestación de semillas de A. elegans.
En (a) se representan los valores obtenidos mediante tratamientos de NaClO y en (b) los valores de etanol 70 % en diferentes tiempos de inmersión combinado con el tratamiento E. En (a), los valores representan la media de tres unidades experimentales y en (b), de seis + error estándar.
Figura 10. Fotografías que representan los brotes formados por efecto de BAP 10 µM
(tratamiento 4) en yemas axilares (A) y yemas apicales (B). Figura 11. Efecto de los diferentes tratamientos de fito-reguladores, en la formación de
brotes en yemas apicales y yemas axilares. Los valores representan la media de tres unidades experimentales + error estándar.
Figura 12. Vistas diferentes de cuatro tratamientos de fito-reguladores para la inducción de
brotes en yemas axilares. Figura 13. Efecto de diferentes tratamientos de fito-reguladores en la formación de raíces en
yemas axilares. Los valores representan la media de tres unidades experimentales + error estándar.
pag.
3
14
25
26
28
30
37
39
42
44
45
47
50
ii
Figura 14. Cinética de desarrollo de las plantas durante la aclimatización. En (a), se
representa la longitud de la raíz y de la parte aérea. En (b), el número de raíces secundarias y de nudos. Los valores representan la media de 72 plantas ± desviación estándar.
Figura 15. Imagen de las plantas de A. elegans en el quinto mes de cultivo en el
invernadero. Figura 16. Efecto de la concentración de veneno de alacrán sobre la contracción del íleon.
En (a) la primera curva de la respuesta de contracción con concentraciones en intervalos logarítmicos y en (b), la segunda curva en el intervalo de concentración de 10-100 µg/ml. Los valores representan la media de tres determinaciones ± error estándar.
Figura 17. Dos registros sobrepuestos de la prueba de relajación. En (A), la respuesta de
contracción por aplicación del veneno (40 µg/ml) y en (B), la respuesta de relajación por la aplicación del veneno (40 µg/ml) + extracto metanólico de partes aéreas (200 µg/ml).
Figura 18. Efecto de relajación del íleon (contraído por acción del veneno de alacrán), como
resultado de la aplicación de los extractos en diferentes concentraciones. Los valores representan la media de seis determinaciones ± error estándar. La línea más gruesa corresponde con la curva del Extracto Hexánico de raíces de plantas silvestres reportado por Jiménez (2004) y en el reporte original los valores representan la media de cinco determinaciones.
51
55
57
58
60
iii
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS
AIA ácido indolacético
AIB ácido indolbutírico
ANA ácido naftalenacético
BAP 6-bencilaminopurina
DL50 dosis letal media
EE error estándar de la media
EH extracto hexánico
EM extracto metanólico
ES peso del extracto seco
EtOH etanol
F(ab´)2 fragmentos de anticuerpos purificados que se obtienen del suero de caballos hiper-
inmunizados con venenos.
FCA fuerza de contracción A
FCB fuerza de contracción B
H humedad
HR humedad relativa
IBE índice de brotes por explante
IRE índice de raíces por explante
MI peso de la muestra inicial (antes del secado)
MF peso de la muestra final (después del secado)
MS medio de cultivo Murashige-Skoog
MV material vegetal de inicio (en la extracción)
iv
NES número de explantes sembrados
NaClO hipoclorito de sodio
NSS número de semillas sembradas
NSD número de semillas desinfestadas
PA partes aéreas
PLA2 fosfolipasa-A2
p/v peso a volumen
RA raíces
RE rendimiento de extracción
RI valor de relajación del íleon
SD semillas desinfestadas
SE sistema entérico, que se refiere al sistema nervioso en el intestino
t tiempo de un intervalo
TBU número total de brotes por unidad experimental
TRU número total de raíces por unidad experimental
UE unidad experimental; es la entidad en la cual se aplicó un tratamiento
VE velocidad específica
VNI valor numérico inicial (del parámetro de crecimiento)
VNF valor numérico final (del parámetro de crecimiento)
Ψ potencial hídrico
% porcentaje
v
GLOSARIO
Aclimatización: es el fortalecimiento que desarrollan las plantas cultivadas in vit o para tolerar
las condiciones ex vitro mediante un sistema artificial controlado por el hombre.
r
Agrolita: material volcánico utilizado en la preparación de sustratos de cultivo. Está
compuesto de pequeñas piedras (1-4 mm de diámetro) muy ligeras y con excelentes
propiedades de aireación y retención de humedad.
Alacranismo: ocurrencia de picaduras de alacrán en personas y el problema de salud pública
que implica.
Anafilaxia: sensibilidad excesiva de algunas personas a la acción de ciertas sustancias
presentes en los alimentos y/o medicamentos.
Autacoide: sustancia formada por un grupo de células que a nivel local altera la función de
otras.
Bioprospección: la búsqueda de aplicaciones útiles de los organismos vivos o sus derivados.
Desinfestación de semillas: eliminación de esporas y otros microorganismos que se
encuentran en la superficie de las semillas.
Edema: hinchazón blanda de una parte del cuerpo, que cede a la presión.
Elongación: alargamiento.
Emenagogo: remedio que provoca la regla o evacuación menstrual de las mujeres.
Embriogénesis somática: proceso mediante el cual se obtienen embriones a partir de células
somáticas (no sexuales) de cualquier tipo de tejido.
Eritema: enrojecimiento persistente de la piel o las mucosas, generalizado o localizado,
debido a vasodilatación y congestión capilar.
Etnobotánica: rama de la botánica que estudia la interacción entre las plantas y los seres
humanos en las sociedades antiguas y actuales.
Explante: pequeño fragmento de una planta (hoja, tallo, raíz, yemas, anteras, etc.) para iniciar
un cultivo in vitro.
vi
Extracto: producto sólido o espeso obtenido por evaporación del disolvente utilizado para
extraer sustancias de algún material (vegetal o animal).
Fito-reguladores: sustancias naturales (fito-hormonas) o artificiales que controlan el
crecimiento y desarrollo de una planta.
Herbolaria: práctica terapéutica en la que se utilizan plantas medicinales.
Hidroponía: técnica de cultivo de plantas con la adición de soluciones nutritivas que no
incluye el uso de tierra.
Íleon: tercera porción del intestino delgado de los mamíferos que se encuentra entre el
yeyuno y el ciego.
Índice: expresión numérica de la relación entre dos cantidades.
Inducción: provocar el estímulo para obtener una respuesta.
Irradiancia: es el flujo de energía radiante recibido por unidad de superficie plana.
Laparotomía: operación quirúrgica que consiste en abrir las paredes abdominales.
Liofilizar: separar el agua de una sustancia, o de una disolución, mediante congelación y
posterior sublimación a presión reducida del hielo formado.
Macerar: mantener sumergido algún material sólido en un líquido a temperatura ambiente,
con el fin de ablandarlo o de extraer de él las sustancias solubles.
Medio: la suma de las influencias externas que modifican el crecimiento, la estructura y
reproducción de los organismos en un lugar dado.
Metabolitos secundarios: sustancias producidas por las plantas que tienen un papel muy
importante en su adaptación al ambiente.
Micropropagación: procedimiento que consiste en la multiplicación vegetativa in v o para
regenerar nuevas plantas a partir de un explante.
itr
Neurotransmisor: sustancia liberada selectivamente de una terminal nerviosa por la acción de
un potencial de acción, que transmite los impulsos nerviosos en la sinapsis.
Nudo: La parte de un tallo donde una o más hojas están pegadas, donde se encuentra la
yema axilar.
vii
Peat moss: materia orgánica seca proveniente de musgos que se utiliza en la preparación de
sustratos para cultivo.
Plántula: planta joven que resulta de la germinación de la semilla.
Potencial hídrico: es el potencial químico del agua en un sistema o parte de un sistema,
expresado en unidades de presión, comparado con el potencial químico del agua pura a la
presión atmosférica y a las mismas temperaturas y altura, y con el potencial químico del agua
de referencia fijado en cero.
Solución Tyrode: solución isotónica.
Sustentabilidad: es un proceso que hace referencia a una forma de desarrollo en la que se
busca el bienestar humano sin dañar el equilibrio del ambiente y sus recursos naturales.
Sustrato: material que sirve de soporte a una planta.
Totipotencia: se refiere a que cada célula vegetal tiene la misma información genética que le
permite desarrollar por sí misma un individuo idéntico a la planta de la cual se derivó.
Vermiculita: material volcánico (silicato de aluminio) utilizado en la preparación de sustratos
para cultivo, que tiene la característica de retener hasta cuatro veces su peso en agua.
Yema: tallo embriónico protegido por hojas jóvenes y es el sitio de crecimiento ubicado en la
punta de las ramas (yema apical) o en los nudos (yema axilar).
viii
RESUMEN
Aristolochia elegans Mast. es una planta que crece de manera silvestre en México y que
se utiliza en la medicina tradicional para aliviar los efectos de la picadura de alacrán. Como
una alternativa biotecnológica de producción, en este trabajo se estableció la metodología
para la micropropagación de A. elegans, que incluyó las siguientes etapas: desinfestación,
inducción de brotes, enraizamiento y elongación; así como aclimatización a condiciones ex
vitro (mediante un sistema hidropónico). Posteriormente, las plantas se cultivaron en
invernadero y al término de cinco meses se cosecharon las partes aéreas y raíces. Una
vez seco el material vegetal, se obtuvieron extractos con metanol y hexano. Finalmente,
como un indicativo de la actividad farmacológica anti-veneno de alacrán, se aplicaron
diferentes concentraciones de los extractos en un modelo biológico in vi ro; en el que se
evaluó la respuesta de relajación en íleon aislado de cobayo previamente contraído por
efecto del veneno de alacrán Centruroides limpidus limpidus.
t
r
Los principales resultados fueron los siguientes: se obtuvieron plántulas asépticas por la
germinación de semillas desinfestadas mediante un protocolo establecido en este trabajo,
que incluyó lavados con detergente, etanol e hipoclorito de sodio. Las plántulas asépticas
se utilizaron como fuente de explantes. El tratamiento con BAP 10 µM indujo la formación
del mayor número de brotes por explante (3.1 en promedio); mientras que con AIB 1.5 µM
se indujo la mayor formación del número de raíces por brote (12 en promedio). La
aclimatización mediante el sistema hidropónico permitió obtener el 100 % de supervivencia
de las plantas en condiciones ex vitro y las plantas en el invernadero alcanzaron una altura
de 1.33 m después de cinco meses de cultivo. Se obtuvo mayor rendimiento en los
extractos con metanol que con hexano. En la evaluación farmacológica in vitro, con la
mayor concentración de los extractos aplicados (300 µg/ml), se alcanzaron valores en el
intervalo de 42 al 73 % de relajación, semejantes a los reportados con extractos de raíces
de plantas silvestres. Se concluye que con la metodología establecida para la propagación
in vit o de A. elegans y su crecimiento en invernadero, se obtuvieron plantas que contienen
los metabolitos secundarios con la capacidad de relajar en íleon aislado de cobayo, la
contracción inducida por efecto del veneno de alacrán (C. limpidus limpidus), de manera
semejante a la reportada para plantas silvestres.
– 1 –
ABSTRACT
Aristolochia elegans Mast. is a plant that grows wild in Mexico and is used in folk medicine
to alleviate the effects of scorpion sting. As a biotechnological alternative of production, in
this work was established the methodology for the micropropagation of A elegans that
included the following stages: disinfestation, shoot induction, rooting and elongation; as
well as acclimatization to ex-vi ro conditions (using a hydroponic system). Further, the
plants were cultivated in the greenhouse and at the end of five months the aerial parts and
roots were harvested. Once the vegetal material was air dried, extracts were obtained with
methanol and hexane. Finally, as an indicative of the pharmacological action as anti-
scorpion venom, different concentrations of the extracts were applied in a in vit o biological
model, that consisted in evaluating the response of relaxation in isolated guinea-pig ileum
(contracted by the effect of scorpion venom Centruroides limpidus limpidus).
.
t
r
t
-
The main results were: aseptic plantlets were obtained by germination of disinfested seeds
by means of the established protocol in this work that included washes with detergent,
ethanol and sodium hypochlorite. The aseptic plantlets were used as a source of explants.
The treatment with BAP 10 µM induced the formation of the highest number of shoots for
explant (3.1 on the average); while the maximum number of roots by explant (12 on the
average) was induced with IBA 1.5 µM. The acclimatization by means of the hydroponic
system allowed obtaining 100% of survival of the plants in ex-vi ro conditions and the plants
in the greenhouse reached a height of 1.33 m after five months of cultivation. The yield of
the extracts with methanol was higher than the obtained with hexane. In the
pharmacological in-vitro test, values in the range of 42 to 73 % of relaxation were reached
with the highest concentration of the applied extracts (300 µg/ml), similar to those reported
with root extracts of wild plants. It was concluded that with the methodology established for
the in vitro propagation of A. elegans and growth in the greenhouse, were obtained plants
that contain secondary metabolites with the ability to relax the isolated guinea-pig ileum,
previously contracted by effect of the scorpion venom (C. limpidus limpidus), in a similar
way to the one reported for wild plants.
– 2 –
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
El alacranismo se considera un problema de salud pública en México donde ocho especies
tóxicas para el ser humano se encuentran distribuidas a lo largo de su territorio y todas
ellas pertenecen al género Centruroides (Figura 1). La especie Centruroides limpidus
limpidus Karsch. es la segunda en orden de toxicidad y se localiza en la región que abarca
todo el estado de Morelos y parte de Guerrero, México, Puebla y Michoacán (Dehesa y
col., 1995). La presencia de C. limpidus limpidus se ve reflejada en los altos índices de
morbilidad por picaduras de alacrán reportados para dichos estados, entre los que resalta
Morelos donde se presenta la mayor tasa de incidencias a nivel nacional (Secretaría de
Salud, 2004).
C. suffusus suffusus
C. sculpturatus y pallidiceps C. limpidus limpidus C. limpidus tecomanus C. infamatus infamatus C. elegans C. noxius
Figura 1. Distribución en México de las especies de alacranes de mayor peligro para los humanos, todas pertenecientes al género Centruroides (Adaptado de
Dehesa y co ., 1995). l
r r t
Durante muchos años la medicina tradicional mexicana ha usado plantas para el
tratamiento de la picadura de alacrán, incluyendo especies pertenecientes al género
A istolochia. La etimología griega del término A is olochia podría ser ‘aristokeia, que da a
luz los mejores hijos’, lo que se relaciona con uno de sus principales usos que es el de
favorecer el parto y contribuir a la expulsión de la placenta (Camacho, 1990).
– 3 –
INTRODUCCIÓN
En náhuatl, estas plantas se conocen con el nombre de ‘ lacopatli, vara o junquillo
medicinal’ (Rojas, 1998). Francisco Hernández (1959) hace referencia de varios tlacopatli
y de sus aplicaciones como remedio en sus estudios realizados entre los años 1571-1576;
pero es notorio que no mencionó la pretendida propiedad contra veneno, o como remedio
al momento del parto; lo cual no se sabe si atribuirla a que los indígenas ocultaron esas
propiedades, o que Hernández no consideró esas plantas como remedio efectivo para
tales casos (Martínez, 1959).
t
.
Aristolochia elegans Mast. es una especie originaria de Brasil. En México se conoce
comúnmente como ‘guaco’, ‘pato’ o ‘tlacopatli’, donde crece de manera silvestre en varios
estados de la república. A. elegans podría ser la especie vegetal más usada en el estado
de Morelos para el tratamiento de picaduras de alacrán (Monroy y Castillo, 2000; Jiménez,
2004). Se ha demostrado mediante pruebas de laboratorio que las raíces de plantas
silvestres de A elegans tienen la capacidad de antagonizar algunos efectos causados por
el veneno de alacrán (Jiménez, 2004); esta propiedad resulta interesante para el desarrollo
de nuevos productos que permitan ofrecer una alternativa de solución a este problema de
salud como un tratamiento efectivo, económico, fácil de obtener, almacenar y administrar.
Nuestro país es reconocido como uno de los de mayor riqueza vegetal en el mundo, pues
se estima que existen más de 30 mil especies de plantas en su territorio. De esta
diversidad vegetal, se han registrado alrededor de 4 mil especies con atributos
medicinales; lo que ha llevado a México a ser clasificado en el 2° lugar a nivel mundial en
cuanto a riqueza de plantas medicinales (Conabio, 1998). Por otro lado, se estima que el
80% de la población mexicana usa plantas medicinales y la frecuencia de su uso puede
ser cotidiana o esporádica, dependiendo de la región y del nivel socioeconómico de la
población (Taddei y col., 1999; Castellanos, 2002). En las zonas rurales se utilizan
frecuentemente plantas como A. elegans para el tratamiento de los efectos del
envenenamiento por picadura de alacrán, debido a que los alacranes viven en las
cercanías de las viviendas y la atención médica es escasa.
Sin embargo, es preocupante saber que más del 90 % de las plantas medicinales que se
utilizan en México son de origen silvestre y que no existen programas agro-biológicos para
hacer un uso racional y sustentable de este recurso vegetal; por lo que su colecta
– 4 –
INTRODUCCIÓN
indiscriminada ha contribuido a la reducción de las poblaciones en su hábitat natural.
Particularmente, plantas como A. elegans son más susceptibles a la desaparición debido a
que de ella se aprovecha principalmente la raíz.
Por otro lado, se sabe que el uso de plantas medicinales de origen silvestre no siempre
garantiza la efectividad terapéutica (Castellanos, 2002), debido a la variabilidad en sus
componentes químicos; lo que se atribuye a diferentes factores inherentes a la planta,
ambientales o de manejo al ser colectadas en campo (Wheeler y col., 1992; Veerporte y
Beck, 1998; Raskin y col., 2002).
El panorama que se presenta parece contraponer los esfuerzos de conservación de
nuestra riqueza biológica y el aprovechamiento de los conocimientos etnobotánicos
heredados de nuestros antepasados; lo cual nos conduce al siguiente cuestionamiento:
¿Qué desarrollo tecnológico puede contribuir con la conservación de la forma tradicional
de uso de este recurso vegetal, que a su vez también contribuya a evitar la desaparición
de esta especie en estado silvestre?
La micropropagación es una alternativa biotecnológica mediante la cual se puede obtener
un suministro continuo y uniforme de plantas homogéneas, sanas, vigorosas y en menor
tiempo al que requiere la planta para multiplicarse en condiciones naturales (Rout y col.,
2000; Rates, 2001; Chawla, 2002); lo que además puede contribuir a la conservación de
las poblaciones en su hábitat natural. De esta manera, mediante el cultivo en invernadero
de plantas micropropagadas de A. elegans se puede disponer de un suministro de plantas
homogéneas con la capacidad de presentar actividad farmacológica semejante a la que
presentan individuos en estado silvestre, como se ha demostrado en especies de otros
géneros.
– 5 –
ANTECEDENTES
2.1 PLANTAS MEDICINALES
México es reconocido como uno de los países con mayor riqueza vegetal en el mundo, ya
que se estima que existen más de 30 mil especies de plantas en su territorio. Esta
diversidad vegetal se ha originado gracias a su ubicación geográfica con una amplia gama
de climas y suelos. Otra característica importante de nuestro país es su gran diversidad
cultural, que combinada con la riqueza biológica, favorecieron el valioso conocimiento
etnobotánico de las plantas; lo que ha llevado a México a ser clasificado en el 2° lugar a
nivel mundial en cuanto a riqueza de plantas medicinales con alrededor de 4 mil especies
registradas (Conabio, 1998). La medicina tradicional en nuestro país es una importante
manifestación cultural, y se estima que 80 millones de personas (80 % de la población)
utilizan plantas medicinales; de las cuales 20 millones recurren exclusivamente a la
medicina tradicional y el resto combinan su uso con la medicina institucional (Estrada y
Morales, 2002).
A pesar de que la investigación sobre el uso de plantas medicinales ha tenido una amplia
trayectoria a lo largo de la historia de México, el rescate y validación de estos
conocimientos son recientes; esta situación ha retrasado la incorporación de sus productos
como medicamentos en la medicina moderna de nuestro país (Rivera, 1999; Estrada y
Morales, 2002). En la actualidad se ha incrementado el interés a usar terapias alternativas,
especialmente aquellas derivadas de plantas (Conabio, 1998; Rates, 2001); lo cual se
puede atribuir a diferentes factores como:
▫ La ineficiencia de la medicina institucional en muchos casos.
▫ La dificultad para personas de bajos recursos de tener acceso a los tratamientos
farmacológicos convencionales.
▫ provoca
▫ ión primaria de la salud con costos
accesibles a la mayor parte de la población.
El abuso y/o uso incorrecto de medicamentos de origen sintético que
efectos colaterales o secundarios en las personas que los consumen.
▫ La tendencia a creer que todos los productos naturales son inocuos.
La herbolaria se puede utilizar para la atenc
– 6 –
ANTECEDENTES
Desafortunadamente, la sobreexplotación de las plantas medicinales está conduciendo a
la desaparición de las especies de su hábitat natural; ya que más del 90 % de las plantas
edicinales que se usan en México son de origen silvestre, y no existe una regulación
den alimentar de ellas, lo cual indica una
xicidad inusual y una estrecha relación evolutiva entre la planta y el insecto (Rojas, 2000;
os de bioprospección, pero al mismo tiempo buscar los mecanismos para no
obreexplotar los recursos biológicos en los diferentes ecosistemas (Massieu y Chapela,
ralmente, como en el conocimiento de las condiciones de su cultivo, lo que
ervirá para contribuir con la conservación de las poblaciones silvestres (Pelt, 1992; Bye y
ol., 1995).
m
legal para su uso personal.
Pero quizá la mayor amenaza a la conservación de las plantas medicinales es la alteración
de su hábitat natural (Craker, 1999); por lo que también es importante considerar el papel
que tienen algunas especies dentro de los ecosistemas que forman parte. El ejemplo más
ilustrativo se tiene en la India, donde Aristolochia indica es una especie medicinal que ha
sido declarada en peligro de extinción, lo cual ha colocado a la mariposa Tros aristolochae
(‘cola de golondrina’) también en riesgo, ya que ésta deposita sus huevecillos sobre la
planta; la cual no solo sirve como fuente de alimento para sus orugas, sino que éstas
aprovechan las sustancias químicas para utilizarlas como defensa contra sus
depredadores. De hecho, la mayoría de las orugas de la tribu Troidini se alimentan
exclusivamente del follaje de plantas de la familia Aristolochiaceae; y aparentemente
pocos insectos además de la tribu Troidini se pue
to
Sime y Feeny, 2000; Mebs y Schneider, 2002).
En este sentido, es importante buscar el aprovechamiento de la biodiversidad a través de
proyect
s
2002).
La necesidad de conservar plantas medicinales para los usos tradicionales, modernos y
futuros, requiere de muchos esfuerzos tanto en el hábitat donde las plantas medicinales
crecen natu
s
c
– 7 –
ANTECEDENTES
2.2 IMPORTANCIA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS
De manera general, las plantas producen una gran variedad de compuestos químicos
involucrados en sus interacciones ecológicas llamados ‘metabolitos secundarios’
(Veerporte y Beck, 1998). Las funciones del metabolismo secundario se pueden referir
como mediadoras de la interacción de las plantas con el medio donde se desarrollan
como: interacciones planta-insecto, planta-microorganismo y planta-planta; estas
interacciones pueden desempeñar funciones de defensa (contra animales herbívoros,
microbios patógenos y virus), funciones de señal (atracción de animales polinizadores o
ispersores de semillas), y/o alelopáticos (fenómenos de competencia entre especies
stos bioactivos ha sido poco estudiada o se desconoce (Craker, 1999); sin
como:
▫ ntrar diferencias entre plantas de diferentes
▫ Tejidos, órganos y estados de desarrollo. En la mayoría de las plantas la
síntesis y acumulación de metabolitos secundarios esta regulada en espacio y
mente varía en los diferentes
tejidos y órganos de la planta y en algunos casos, se ha observado que existe
▫
tivos, que se convierten a compuestos
d
vegetales por espacio, luz y nutrientes), (Wink, 1999; Wink, 2003).
Aunque los metabolitos secundarios son muy comunes en el reino vegetal, esto no
significa que todas las plantas pueden producir cualquier metabolito. Para la mayoría de
las especies medicinales la relación entre los factores ambientales y la producción de
compue
embargo, se ha observado que en general su contenido es variable y depende de factores
Ecotipos o razas. Se pueden enco
poblaciones de una especie, e incluso diferentes genotipos entre individuos de
la misma población. (Wink, 1999).
tiempo; esto es, el perfil de los compuestos normal
una variación estacional e incluso diurna.
Estado de salud. Una planta herida o infectada puede contener compuestos que
no están presentes normalmente en plantas intactas y sanas; esto puede ser
por la presencia de precursores inac
activos por mecanismos de respuesta al estímulo; o bien, porque los
compuestos son sintetizados en el momento que se requieren para la defensa
(Veerporte y Beck, 1998; Wink, 2003).
– 8 –
ANTECEDENTES
▫
a los diferentes cambios del medio (temperatura, precipitación
pluvial, luz, altitud, tipo de suelo, etc.) con variaciones durante su ciclo de
n la industria farmacéutica (Bye y col., 1992). Cabe señalar que las
ondiciones de cosecha y procesamiento de las plantas también pueden influir en el
encionó anteriormente, diferentes factores pueden afectar su
omposición química. Para asegurar esa composición y por lo tanto la eficacia de las
lantas medicinales se requiere de cultivos uniformes en condiciones estandarizadas
otipotencia’ de las células vegetales, que significa que cada una de ellas tiene la misma
Medio. Es la suma de las influencias externas que modifican el crecimiento, la
estructura y reproducción de los organismos en un lugar dado. Las plantas son
susceptibles
desarrollo, lo que incluye la producción de metabolitos secundarios (Estrada y
col., 1992).
Una cantidad importante de metabolitos secundarios como alcaloides, terpenoides,
flavonoides, entre otros, han sido aprovechados por el hombre de diversas maneras: por
ejemplo, para la producción de colorantes, insecticidas, saborizantes, fragancias y
estimulantes (Wink, 1999; Veerporte y Memelink, 2002). Adicionalmente, sus propiedades
farmacológicas son la base del uso de las plantas en la medicina tradicional, así como de
su explotación e
c
contenido de metabolitos secundarios del producto destinado para ser explotado
comercialmente.
Las plantas pueden ser la fuente renovable más abundante y de menor costo para la
obtención de metabolitos secundarios complejos con propiedades farmacológicas; sin
embargo, como se m
c
p
(Raskin y col., 2002).
2.3 MICROPROPAGACIÓN
Micropropagación, propagación por cultivo de tejidos y propagación in vitro son sinónimos
de un procedimiento que consiste en la multiplicación vegetativa in vitro para regenerar
nuevas plantas a partir de un ‘explante’ que es un pequeño fragmento de cualquier parte
de la planta (hoja, tallo, raíz, yemas, anteras, etc.). Este procedimiento se basa en la
‘t
– 9 –
ANTECEDENTES
información genética que le permite desarrollar por sí misma un individuo completo
idéntico a la planta de la cual se derivó (Lozoya, 1985; Robert y col., 1993; Chawla, 2002).
La micropropagación puede llevarse a cabo por diferentes procedimientos; sin embargo,
como el principal objetivo de la micropropagación es multiplicar con eficacia una planta
produciendo individuos idénticos a la planta madre, los procesos más comúnmente
empleados son: a) la embriogénesis directa a partir de algún explante y, b) el cultivo de
yemas que es el método más comúnmente utilizado. En ambos casos se obtienen
rocesos eficientes de multiplicación y con estabilidad genética ya que se evitan las
a micropropagación difiere de otros métodos convencionales de propagación en que las
condicio ép
micropropagación
ase 0 Inducción. El explante es cortado de la planta, desinfestado y sembrado
ase 1 Multiplicación. Los brotes inducidos en la fase anterior son cortados y
Fase 3
as plantas requieren
ser aclimatizadas, mediante una reducción gradual de la humedad para
de microorganismos (Robert y col., 1993).
p
diversas fases que se tienen con los tejidos desdiferenciados conocidos como callos
(Robert y col., 1993).
L
nes as ticas de cultivo son esenciales para tener éxito. El proceso de
se puede dividir en cuatro fases:
F
en un medio de cultivo. En este medio se induce la formación de brotes
adventicios o de la embriogénesis.
F
resembrados para incrementar el número de individuos. Este proceso
puede repetirse varias veces.
Fase 2 Enraizamiento. El total de brotes obtenidos de la fase anterior son
tratados para inducir la formación de raíces y formar plantas completas.
Transplante. Las plantas salen del ambiente in vitro para iniciar su
desarrollo en condiciones externas. En esta fase, l
que las plantas no mueran por pérdida excesiva de agua o por el ataque
– 10 –
ANTECEDENTES
Son var
importante
▫ El origen del explante (raíz, tallo, hojas, etc.) y la edad fisiológica de la fuente
▫
lativa a la concentración de auxinas induce la
formación de brotes y por el contrario, alta concentración de auxinas relativa a la
concentración de citocininas induce la formación de callos y en algunos casos
▫ Factores físicos tales como: el pH del medio de cultivo; la iluminación, tanto la
aria; ya que el proceso está estrechamente ligado a la producción de plantas libres
e patógenos. Incluso se pueden establecer procesos de micropropagación para obtener
e una sola
lanta madre en cuestión de meses. Sin embargo, es muy importante tomar en cuenta la
fraestructura del sistema que es su principal desventaja, ya que se requiere personal
de energía y equipo de laboratorio (Lozoya, 1985).
ios los factores que determinan la inducción de brotes y raíces; algunos de los más
s son:
del explante, ya que los tejidos jóvenes tienen mayor capacidad de
diferenciación que los viejos.
La combinación de fito-reguladores para estimular una característica particular
del crecimiento y desarrollo a partir de los explantes. Las auxinas y las
citocininas son las más comúnmente empleadas. En general, una alta
concentración de citocininas re
de raíces (Robert y col., 1993).
duración diurna (fotoperíodo) como la calidad (longitud de onda e intensidad) y
la temperatura que dependerá de la especie (Lozoya, 1985; Rout y col., 2000).
La utilidad de la micropropagación con fines comerciales se basa en la uniformidad
genética del material, evitándose las variaciones genotípicas propias de poblaciones
generadas por semilla sexual en muchas especies. Otras ventajas de la técnica son la
disponibilidad de la planta todo el año, y la obtención de material de alta calidad
fitosanit
d
plantas libres de virus (Lozoya, 1985; Robert y col., 1993; Villarreal, 1993; Rout y col.,
2000).
En teoría, es posible producir cientos de miles de individuos clonales a partir d
p
in
capacitado, gran suministro
– 11 –
ANTECEDENTES
2 4
ias de ellas son endémicas; debido a la semejanza de su
orfología a muchas de ellas se les conoce comúnmente como ‘guaco’, ‘pato’ o ‘tlacopatli’
lacrán e inductor de contracciones uterinas (El-Tahir, 1991);
ntiasmático, contra mordedura de serpiente, infecciones generales, inducción de aborto
9), contra veneno de serpientes
eyes, 1995; Otero y col., 2000), tratamiento contra el SIDA (Achenbach y col., 2002), y
ca por su uso medicinal y como plantas de ornato. Al respecto,
ólo tres estudios con plantas del mismo género se encontraron disponibles en la
bibliogra
a)
n
. GÉNERO Aristolochia
Aristolochia es el género más grande de la familia Aristolochiaceae con aproximadamente
550 especies distribuidas en gran parte del mundo. En México existen cerca de 65
especies de Aristolochia y var
m
(Martínez, 1959; Kelly, 2000).
A las especies de este género, se les atribuyen diversas propiedades terapéuticas, entre
las que se pueden mencionar: purgante, antihelmíntico, antipirético, emenagogo, antídoto
contra veneno de a
a
(Lemos y col., 1993).
Recientemente se han reportado varios estudios de la actividad biológica de plantas
pertenecientes a este género como: citotóxico (Mongelli y col., 2000), antimicrobiano y
citotóxico (Murillo y col., 2001), antiespasmódico (Haruna y Choudhury, 1997),
antiinflamatorio (Hutt y Houghton, 1998), antifúngico (Gadhi y col., 2001), antibacteriano
(Shafi y col., 2002), insecticida (Broussalis y col., 199
(R
contra veneno de alacrán (Rojas, 2002; Jiménez, 2004).
Existen escasos reportes de micropropagación de las especies de éste género, a pesar de
su importancia económi
s
fía consultada:
En A. indica, mediante el uso de ácido naftalenacético (ANA) 0.5 µM + 6-
bencilaminopurina (BAP) 13.3 µM en el medio MS, se obtuvieron de 2 a 3
brotes por explante en 4 subcultivos de 28 días. Se indujo la formación de
raíces con ácido indolbutírico (AIB) 2.46 µM en el medio, con lo que se logró un
85 % brotes enraizados. Después de su aclimatización en un medio líquido co
– 12 –
ANTECEDENTES
vermiculita como soporte, las plantas se transfirieron a tierra y se cultivaron en
b)
nudos a partir de uno. La inducción de raíces se logró con la adición de AIB 2.5
c) edio de 4.2 brotes por explante
mediante el uso de BAP 2.0 µM en el medio MS. La inducción de raíces se
logró con la adición al medio de ácido indolacético AIA 5.0 µM, logrando un 24
o raizados (Svensson, 2000).
ia de Brasil, la cual se
ncuentra distribuida en el continente americano desde Florida (en E.U.) hasta Argentina
de diámetro de color verde-limón cuando inmadura, parda cuando madura.
emillas numerosas, planas, ovaladas, de 3-6.5 mm de largo, 2-5 mm de ancho, 0.5 mm
de grueso, la testa delgada, aceitosa, brillante, lisa, el endospermo abundante, el embrión
pequeño.
invernadero, donde se logró el 90 % de supervivencia (Manjula y col., 1997).
En A. fimbriata, mediante el uso de BAP 5.0 µM en el medio MS, se logró el
crecimiento de un solo brote (3.79 cm de largo), con el que se obtuvieron 8
µM al medio (MS al 50 %), con lo que se lograron poco mas de 10 raíces por
brote; mientras que ANA solo indujo la formación de callos (Bravo y col., 1999).
En A. manchuriensis, se reportó un prom
% de br tes en
2.5 Aristolochia elegans
Aristolochia elegans Mast., sin. A. littoralis, es una especie originar
e
(Ortega y Ortega, 1997); aunque también se reporta su cultivo como planta ornamental en
algunos países como Egipto y Taiwán (El-Sebakhy y col., 1984).
Ortega (1997), describe las plantas de esta especie con las siguientes características:
Lianas perennes, de 1-5 m de largo, el tallo rugoso. Hojas acorazonadas-triangulares, de
3.5-12.5 cm de largo, 4.5-12 cm de ancho. Flores axilares, solitarias de 14.5-27 cm de
largo, color verde-cremoso y púrpura (Figura 2). Cápsula cilíndrica, de 2.5-5 cm de largo,
0.7-2.5 cm
S
– 13 –
ANTECEDENTES
Figura 2. Flor de Aristolochia elegans
En México se ha identificado la presencia de esta especie en estado silvestre
principalmente, en zonas desde los 380 hasta los 700 m sobre el nivel del mar; dentro de
vegetación de tipo bosque caducifolio, bosque de encino, selva mediana subperenifolia y
selva baja caducifolia en los estados de Nuevo León, Tamaulipas, Estado de México,
Morelos, Chiapas y Veracruz (Ortega y Ortega, 1997). Sus nombres comunes más
conocidos son igualmente, guaco, pato y tlacopatli y su época de floración es de Marzo a
Julio.
Son amplios los estudios fitoquímicos que se han realizado en esta especie, de la que se
han identificado hasta 142 compuestos (Cuadro 1), muchos de los cuales podrían estar
relacionados con las diferentes propiedades terapéuticas que se le atribuyen.
– 14 –
ANTECEDENTES
Cuadro 1. Compuestos quím cos encontrados en A. elegans. i
PARTE DE LA PLANTA COMPUESTOS REFERENCIA
hoja y raíz Bisbencilisoquinolinas: (-)-temuconina y (-)-(R,R)-7´-O-metilcuspidalina
Alcaloide aporfínico: magnoflorina Alantoína
El-Sebakhy, 19841989
hoja, raíz y tallo
Se identificaron 58 compuestos volátiles: 4 monoterpenos (p.ej. α y β-pineno) 5 monoterpenos oxigenados (p.ej. 1,8 cineol, borneol
y acetato de bornilo) 28 sesquiterpenos (p.ej. cariofileno) 18 sesquiterpenos oxigenados (p.ej. nerolidol)
Vila y col., 1997
hoja, raíz y tallo
Ácidos aristolóquicos (AA): AA I, AA D y aristolósido Dímero (diterpeno+AA): Aristolina Metilesteres de AA: metilester de AA Ia, AA IV, AA D,
metil aristoloquiato Aporfinas: magnofolina, oxonuciforina,
isomoschatolina, 4,5dioxodehidroasimilobina Isoquinolinas: aristoquinolina A, B, C, pericampilinona-
A, coridaldina, talifolina, nortalifolina, N-metil-coridaldina
Aristolactamas: Aristolactama E, A II, A IIIa, C N-β-D-glucósido, A IIIa -6-O-β-D-glucósido, 9-metoxiaristolactama, isoaristolactama
Esteroides: β-sitosterol, β-sitosterilglucósido, felocriseina
Sesquiterpenoides: Aristololido Diterpenoides: ent-kauran-16β,17-diol, ent-16β,17-
epoxikauran, ent-kaur-15-en-17-ol, ent-15β,16-epoxikauran-17-ol
Tetralonas: Aristelegona A, B, C, D Amidas: N-trans-feruloiltiramina, N-cis-feruloiltiramina,
N-trans-cinamiltiramina, N-p-trans-cumariltiramina Lignanos: (-)-cubebina, α-metilcubebina, β-
metilcubebina, (-)-hinokinina, (-)-5’’-metoxihinokinina, (-)-kobusina, (+)-medioresinol, aristelegina A, B, C
Bifenil éteres: ácido 4-metoxi-3-4’-oxidibenzoico Aristogina A, B, C, D, E, F Bencenoides: metilparabeno, metilvainillato, p-
hidroxibenzaldehido, vainillina, metil4-hidroxi-metoxicinamato, ácido cinámico, ω-hidroxipropioguayacona, ficusol
Wu y col., 20002002
Shi y col., 2004
– 15 –
ANTECEDENTES
2.6 ENVENENAMIENTO POR PICADURA DE ALACRÁN
El veneno de los alacranes es producido por glándulas que se localizan en la cola. Al
ocurrir el piquete, el veneno se inyecta subcutáneamente y posteriormente se distribuye a
otras partes del cuerpo a través del sistema circulatorio (Hutt y Houghton, 1998). Se trata
de una mezcla compleja de diferentes sustancias entre las que se encuentran proteínas,
péptidos, aminoácidos libres y aminas activas entre otros (Osnaya y col., 2001; Rojas,
2002); sin embargo, los componentes responsables de la toxicidad del veneno son
principalmente los péptidos. Los péptidos, también llamados neurotoxinas, están formados
por 30-80 residuos de aminoácidos y tienen como blanco los canales iónicos de Na+, K+,
Cl- y Ca2+ en las membranas de células excitables (como las nerviosas y musculares); la
acción de estas toxinas en los canales iónicos provoca muchos de los síntomas tóxicos del
veneno.
Particularmente la toxicidad del veneno de la especie Centruroides limpidus limpidus Kash,
reside principalmente en péptidos de 60-70 residuos de aminoácidos; los cuales son
altamente estables por su bajo peso molecular y por 4 puentes disulfuro que consolidan su
estructura tridimensional. Estos péptidos afectan los canales iónicos de sodio (Na+)
modificando sus mecanismos de apertura y cierre. Como resultado de esto, ocurre la
alteración de la transmisión de impulsos nerviosos en los sitios presinápticos de los
nervios colinérgicos y adrenérgicos, favoreciendo la liberación súbita y masiva de
acetilcolina y catecolaminas respectivamente; lo que provoca a su vez alteraciones
funcionales de diversos órganos y tejidos (Possani y col., 1999).
Los efectos principales de la intoxicación se da en los sistemas cardiovascular y
respiratorio pero también hay estimulación de las actividades del sistema nervioso
simpático y parasimpático, lo que explica la mayoría de los síntomas clínicos del
envenenamiento. El veneno contiene además hialuronidasa que aumenta la permeabilidad
capilar para facilitar su absorción y 5-hidroxitriptamina (serotonina) de la que depende la
producción de dolor y edema en el sitio de la picadura (Montoya, 1996; Possani y col.,
1999; Osnaya y col., 2001).
– 16 –
ANTECEDENTES
En condiciones de laboratorio, la toxicidad del veneno depende principalmente de la
especie del alacrán; por ejemplo, C. limpidus limpidus presenta una dosis letal en ratones
de 0.61 a 3.31 mg de veneno por kg de peso corporal (promedio 2 mg/kg), para reducir en
un 50 % la población de animales de experimentación (parámetro conocido como DL50).
Otras especies como C. noxius, muestra una DL50 de 0.26 mg/kg; en otras palabras, es
casi 10 veces más letal (Dehesa y col., 1995). Sin embargo, también es muy importante
considerar las características de los animales de experimentación (generalmente ratones)
como la cepa, el sexo y la edad (Padilla y col., 2003).
Diferentes factores pueden contribuir a la variación de los efectos del envenenamiento por
la picadura de alacrán, como son: la especie del alacrán, la condición de la glándula
venenosa al momento de la picadura, la ruta de inyección, el número de picaduras, la parte
del cuerpo que sufrió la picadura, la cantidad de veneno inyectada, y la época del año;
además de factores propios de la víctima como: la edad, peso, estado nutricional y estado
de salud (Rangel y Gómez, 1997; Hutt y Houghton, 1998, Padilla y col., 2003).
Generalmente la población más afectada son los menores de edad sin distinción por el
género; las picaduras son más frecuentes en los miembros inferiores, ocurren
principalmente durante la noche (lo que demuestra sus hábitos nocturnos ya que durante
el día se esconden) y las picaduras son más frecuentes durante la temporada primavera-
verano (Marzo a Julio), lo que coincide con la temporada de su reproducción (Montoya,
1996; Rangel y Gómez, 1997; Osnaya y col., 2001). Las manifestaciones leves son dolor,
eritema e inquietud; además de entumecimiento y salivación excesiva, sensación de
hormigueo nasal y palpitaciones. El cuadro severo se manifiesta con fiebre, distensión
abdominal, movimientos oculares rápidos y visión borrosa; se acompañan de vómito,
sudoración profusa, insuficiencia cardiaca, edema pulmonar y choque. Los cuadros
severos también pueden acompañarse de convulsiones (Rangel y Gómez, 1997).
El anti-veneno de alacrán usado en México contiene fragmentos de anticuerpos
purificados [F(ab´)2]; este anti-veneno se obtiene a partir de suero de caballos hiper-
inmunizados con los venenos de los alacranes más peligrosos. El producto al ser
liofilizado, tiene la ventaja de que no requiere refrigeración y se puede mantener a
temperatura ambiente por varios meses por debajo de los 37 °C. El anti-veneno de alacrán
– 17 –
ANTECEDENTES
debe ser usado solo cuando se observen síntomas moderados o severos; y en general,
dos ámpulas son suficientes para controlar incluso casos severos. No obstante, dado que
el suero antialacrán proviene de anticuerpos de caballo, constituye a su vez un antígeno
ajeno al huésped y se corre el riesgo de alguna reacción anafiláctica (Osnaya y col., 2001;
Rojas, 2002).
2.7 PLANTAS USADAS EN EL TRATAMIENTO DE PICADURA DE ALACRÁN
El uso de plantas para aliviar los efectos de picaduras de alacrán es común en las
regiones donde existen alacranes, principalmente de países subdesarrollados. Hutt y
Houghton (1998) reportaron un total de 141 especies de 53 familias de plantas de
diferentes partes del mundo, a las que se les ha atribuido esta propiedad. La supuesta
propiedad anti-veneno de alacrán de estas plantas puede estar relacionada con diferentes
actividades, ya que los efectos terapéuticos de los productos naturales generalmente son
el resultado de mas de un compuesto activo y el resultado final puede deberse a diferentes
efectos (aditivos, complementarios, sinérgicos, antagónicos) de sus componentes.
(Blumenthal, 2000; Stermitz y col., 2000; Raskin y col., 2002; Loew y Kaszkin, 2002).
Sin embargo, son muy escasos los estudios para validar la efectividad de dichas
propiedades, para identificar los compuestos activos y sus mecanismos de acción contra el
efecto del veneno (Rojas, 2002; Jiménez 2004). El demostrar la efectividad de estas
plantas contra picaduras de alacrán es una tarea para países como México que sufre de
éste problema de salud y que tiene a su disposición recursos vegetales para explotarlos de
una manera racional.
2.8 GÉNERO Aristolochia EN EL TRATAMIENTO DE PICADURA DE ALACRÁN
Las plantas del género Aris olochia son ampliamente usadas en México para contrarrestar
los efectos del envenenamiento por picadura de alacrán (y otros animales ponzoñosos). Lo
anterior quedó establecido en los resultados de una encuesta realizada a nivel nacional
para conocer las plantas medicinales mas frecuentemente utilizadas por los terapeutas
t
– 18 –
ANTECEDENTES
tradicionales, donde se mencionó el uso del ‘guaco’ para alivio de este padecimiento en 18
sitios (aproximadamente el 50 % del total) donde se aplicó la encuesta (Lozoya y col.,
1987).
Como ejemplo, se puede mencionar la receta del uso de tlacopatli que describe Rojas
(1998): “… la raíz fresca o seca (10 g) se remoja en un cuarto de litro de alcohol durante 20
días, éste alcohol se unta en el piquete 2 o 3 veces”; aunque también otras recetas
recomiendan ingerir la infusión o tintura como lo menciona Cabrera (1996): “Tlacopatle.
Remedio: tomar uno o dos gramos de polvo de la raíz, o hacer una infusión con 20 grs. de
la misma en un litro de agua y tomar una tac ta. También puede prepararse una tintura con
50 grs. de la raíz machacada en 200 grs. de alcohol de caña puro, que se dejan reposar
durante una semana. Tomar una cucharadita cada hora, con un poco de agua”.
i
r t
r
r
El veneno de alacrán al ser inyectado ejerce una fuerte respuesta de inflamación en la
víctima; por lo tanto, no es de sorprender que ciertas plantas con propiedades anti-
inflamatorias como las del género A is olochia sean recomendadas para aliviar la picadura
(Hutt y Houghton, 1998). Es interesante que algunas plantas usadas para tratar el
envenenamiento por mordeduras de serpientes sean también usadas para dar alivio contra
picaduras de alacrán; dentro de este grupo se encuentran muchas especies del género
A istolochia. El ácido aristolóquico, un componente común de éste género, se ha
observado que interactúa con enzimas de venenos de serpientes como la fosfolipasa-A2
(PLA2), donde actúa como inhibidor no competitivo. PLA2 participa en la liberación de
ácidos grasos de fosfolípidos de membrana de la posición sn-2 (especialmente
araquidonato), necesarios para la biosíntesis de los eicosanoides; los cuales están
implicados en la cascada de reacciones de enfermedades inflamatorias (Chandra y col.,
2002). Puesto que las fosfolipasas tienen un papel importante en la respuesta de
inflamación y dolor, la inhibición de su actividad podría aliviar de manera similar esos
síntomas en el envenenamiento por picadura de alacrán (Hutt y Houghton, 1998; Rojas,
2002).
En particular, con respecto al uso de A. elegans como anti-veneno de alacrán, Jiménez
(2004) realizó una investigación con extractos de raíces de plantas silvestres en pruebas
farmacológicas tanto in vivo como in vit o. Los resultados mostraron en general, que los
– 19 –
ANTECEDENTES
extractos antagonizaron los efectos del veneno de Centruroides limpidus limpidus en los
modelos experimentales estudiados. Al respecto, A. elegans podría ser la especie vegetal
más frecuentemente usada para el tratamiento de picaduras de alacrán en el estado de
Morelos (Monroy y Castillo, 2000; Jiménez, 2004); aunque otros autores han reportado su
uso también contra picaduras de animales ponzoñosos (Avilés y Suárez, 1994) y como
anticrotálico Rojas (2002).
2.9 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA
Una prueba farmacológica se aplica en un sistema biológico para conocer el efecto que le
provoca la interacción con una sustancia (extracto crudo, fracciones parcialmente
purificadas o compuestos puros) y puede ser mediante algún modelo in vivo o in vit o. Las
especies comúnmente utilizadas en animales intactos son los ratones, ratas y en algunos
casos gatos y cobayos; en tanto que en las pruebas in vi ro normalmente se utilizan
preparaciones aisladas de órganos o tejidos, y existen muchas modalidades dependiendo
del sistema fisiológico que se desea probar.
r
t
r
El modelo del ‘íleon aislado de cobayo’ se fundamenta en la capacidad de contracción del
íleon y es muy empleado para el estudio in vit o de los efectos de diferentes sustancias
como antiespasmódicas y en el sistema nervioso parasimpático. Sus principales ventajas
son: a) las contracciones son relativamente simples y rápidas de registrar, y b) se
requieren pequeñas cantidades de los compuestos. Sin embargo, la complejidad de los
posibles sitios y mecanismos de acción hace difícil la tarea de elucidar la manera exacta
en la cual la sustancia produce o inhibe las contracciones en el órgano (Samuelsson,
1991; Williamson y col., 1998).
El intestino delgado en los mamíferos está constituido de tres partes: duodeno, yeyuno e
íleon; el íleon es la parte más larga y constituye aproximadamente el 55 % de la longitud
total. La parte más externa del intestino se conoce como serosa. Bajo la serosa se
encuentran dos capas de músculo liso: en la primera las células musculares están
orientadas longitudinalmente, mientras que en la segunda están orientadas de forma
circular. Posteriormente se encuentra la submucosa y la mucosa.
– 20 –
ANTECEDENTES
Los intestinos contienen un sistema nervioso intrínseco: el sistema entérico (SE); pero
además contienen fibras nerviosas de origen extrínseco. Las fibras nerviosas y los
ganglios del SE están arregladas en varios plexos, que se encuentran en todas partes del
tubo digestivo y se extienden desde la parte del músculo liso del estómago hasta la parte
interna del esfínter anal. Los dos plexos dominantes son el plexo mientérico que se
encuentra entre las capas longitudinales y circulares de músculo y el plexo submucoso que
se encuentra dentro del tejido conectivo de la submucosa. Grupos de fibras nerviosas
conectan los ganglios en los plexos y forman redes continuas. La principal característica
del SE es la presencia de muchas diferentes substancias neurotransmisoras: acetilcolina,
noradrenalina, 5-hidroxitriptamina, sustancia P, etc. (Samuelsson, 1991).
Existen varias razones para considerar por separado el SE como una división específica
del sistema nervioso autónomo además de las divisiones del simpático y parasimpático:
▫ El SE es relativamente independiente del control central. El daño al sistema en
las rutas extrínsecas tiene poco efecto en las funciones digestivas.
▫ El número de neuronas en este sistema (107-108), es equivalente al número
total de neuronas en la médula espinal.
▫ Existen al menos diez diferentes tipos de terminales nerviosas en el SE.
ste cambio de estado
uede ser registrado durante todo el tiempo en que dura la prueba.
Las células musculares de un fragmento aislado del tejido están bajo la influencia de
señales de este SE y su estado contráctil depende del balance de la información que lo
controla (de estímulo o inhibición) transmitido mediante neurotransmisores, hormonas,
autacoides y otras sustancias; y este balance puede ser alterado por diferentes
compuestos. La adición de un compuesto bioactivo al baño en el cual está suspendido el
fragmento aislado del íleon, puede causar un cambio en el estado contráctil de los
músculos, provocando una contracción o relajación del tejido. E
p
– 21 –
ANTECEDENTES
Los cambios provocados por el o los compuestos bioactivos pueden ser el resultado de
ferentes mecanismos:
▫ ón de neurotransmisores.
▫ La interferencia con segundos mensajeros, p.ej. adenosina monofosfato (AMP)
influyen en los niveles de
▫ La acción directa sobre las células del músculo liso.
▫ Tratándose de extractos, los efectos pueden ser una combinación de diferentes
mecanismos, ya que son mezclas generalmente de una gran cantidad de
sustancias desconocidas.
di
La interferencia en la liberación o desactivaci
▫ La acción directa del compuesto en los receptores de los transmisores ó en los
receptores para las hormonas o autacoides.
o guanosina monofosfato (GMP) cíclicos, los cuales
calcio que participan de manera muy importante en la contracción muscular.
– 22 –
JUSTIFICACIÓN
La disminución de las poblaciones silvestres de Aristolochia elegans es una consecuencia
de la colecta indiscriminada para uso medicinal. La micropropagación y cultivo en
invernadero de ésta especie, es una alternativa biotecnológica para la obtención de
plantas sanas y homogéneas; con lo que se puede disponer de material vegetal para
futuras investigaciones de su aplicación en el tratamiento de la picadura de alacrán, lo que
además puede contribuir a evitar la desaparición de las poblaciones en estado silvestre.
En esta investigación se propone que mediante la micropropagación y cultivo de A.
elegans se pueden obtener plantas con capacidad de antagonizar en íleon de cobayo, el
efecto de contracción inducido por veneno de alacrán, semejante a la reportada de plantas
silvestres; lo cual será un indicativo de su efectividad terapéutica como anti-veneno de
alacrán.
– 23 –
4.1 Objetivo general
• Determinar si los extractos de las plantas de Aris olochia elegans Mast. (obtenidas
por micropropagación y crecidas en invernadero), tienen la capacidad de relajar el
íleon de cobayo contraído por efecto del veneno de alacrán Centruroides limpidus
limpidus Karsch, de manera semejante a la reportada para plantas silvestres.
t
r
r
4.2 Objetivos particulares
• Establecer las condiciones de desinfestación y germinación in vit o de semillas de
A. elegans.
• Establecer las condiciones de micropropagación de A. elegans a partir de yemas
axilares y apicales.
• Obtener plantas por cultivo in vit o y aclimatizarlas a condiciones ex vitro mediante
un sistema hidropónico.
• Obtener extractos metanólicos y hexánicos de las plantas cultivadas.
• Evaluar el efecto relajante de los extractos en íleon aislado de cobayo, contraído
por veneno de alacrán C. limpidus limpidus.
– 24 –
MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 MATERIALES
5.1.1 Material biológico
Se utilizaron semillas de plantas de A. elegans cultivadas en la parcela experimental del
Centro de Investigación Biomédica del Sur-IMSS en el Municipio de Xochitepec, Morelos.
Estas plantas fueron identificadas previamente por personal del herbario del IMSSH y
registradas con el número HPMIMSS13595.
5.1.2 Reactivos y material de laboratorio
Todos los reactivos usados fueron grado analítico de las marcas Merck, Sigma, Baker y
Mallinkrodt; el material de vidrio fue el común de laboratorio.
5.2 METODOLOGÍA EXPERIMENTAL.
En la Figura 3 se muestra el diagrama de flujo de las etapas experimentales. Cabe
mencionar que las etapas correspondientes a la micropropagación, aclimatización y cultivo
en invernadero fueron realizadas en el Laboratorio de Cultivo de Células Vegetales y en el
Invernadero del CeProBi en Yautepec, Morelos; mientras que la obtención de los extractos
de las plantas micropropagadas y la prueba farmacológica se efectuaron en las
instalaciones del CIBIS-IMSS en Xochitepec, Morelos.
Colecta de semillas
Plántulas asépticas Desinfestación Germinación
Factorial (explantes y fito-
reguladores) Aclimatización Enraizamiento Multiplicación
Transferencia a invernadero
Obtención de extractos
Cosecha Prueba farmacológica en íleon de cobayo
Figura 3. Diagrama de flujo del desarrollo experimental.
– 25 –
MATERIALES Y MÉTODOS
5.3 MICROPROPAGACIÓN Y CULTIVO
5.3.1 Condiciones generales de preparación de medio de cultivo
El medio de cultivo basal empleado fue el MS (Murashige y Skoog, 1962). En la
preparación del medio de cultivo, antes de la adición del agar, se ajustó el pH
(Potenciómetro Jenco Electonics, LTD mod. 1671) a un valor de 5.8 (con HCl 0.1 N).
Todos los componentes del medio fueron mezclados antes de la esterilización. La
esterilización se llevó a cabo en autoclave (AESA, modelo C.V. 250) a una temperatura de
120 °C durante 20 min. En los diferentes experimentos cada unidad experimental (UE)
consistió de un frasco de vidrio transparente tipo ‘gerber’ (6.0 cm de diámetro y 6.0 cm de
altura con tapa de plástico) conteniendo el medio de cultivo (20 ml) y los explantes. Las
condiciones generales en la cámara de incubación fueron: temperatura de 25±2 °C, 16
horas de fotoperíodo con una irradiancia de 310 µmol m-2 s-1 (luxómetro Mavolux digital
B400, Bélgica) generados con lámparas de luz blanca fluorescente.
5.3.2 Desinfestación de semillas
Con la finalidad de obtener plántulas asépticas, se buscaron las condiciones de
desinfestación de semillas; para ello se siguió el proceso señalado en la Figura 4.
b1) tratamientos con etanol al 70 %
a) lavado de semillas con sol. detergente 1 % b) enjuague
i
desionizada; c) inmersión de las semillas a diferentes tratamientos con soluciones de
Figura 4. D agrama de flujo de la desinfestación de semillas.
En la primera etapa se aplicó el siguiente proceso: a) lavado con solución de detergente al
1% p/v en agua desionizada durante 30 min; b) tres enjuagues sucesivos con agua
c) tratamientos con NaClO d) enjuague e) siembra b2) enjuague
1ª etapa2ª etapa
– 26 –
MATERIALES Y MÉTODOS
hipoclorito de sodio (NaClO) de acuerdo a lo que se describe en el Cuadro 2; d) enjuague y
e) siembra en medio nutritivo.
Cuadro 2. Tratamientos para la desinfestación de semillas de A. elegans mediante la
TRATAMIENTO (% re)
combinación de tres concentraciones de NaClO con tres tiempos de inmersión.
NaClO Tiempo de inmersión cloro lib (min)
A 10
10
10
B C D E F G H I
0.5 0.5 0.5 1.0 1.0 1.0 1.5 1.5 1.5
5
15 5
15 5
15
on base en los resultados de la primera etapa, se eligió un solo tratamiento de acuerdo
n la desinfestación se trabajó con lotes de 25 semillas. La aplicación de las soluciones de
dentro de ella.
C
con el porcentaje de desinfestación y de germinación obtenido. En la segunda etapa se
modificó el proceso en el inciso (b) de la Figura 4, donde se aplicaron tratamientos con una
mezcla de etanol al 70 % v/v en agua desionizada con tres tiempos de inmersión: 1, 3 y 5
min previos al tratamiento en NaClO. El proceso finalizó con el enjuague y la siembra de
las semillas en el medio de cultivo.
E
lavado, desinfestante y enjuague se hicieron en una proporción de 1 ml de solución por
semilla tratada. La solución de detergente y de NaClO se prepararon a partir de los
productos comerciales Roma® y Cloralex® respectivamente; éste último con un contenido
de cloro libre de 6 %. Las semillas en contacto con las soluciones de etanol se agitaron
manualmente, mientras que con las soluciones de NaClO se utilizó un agitador magnético.
Los lavados con detergente, etanol y los enjuagues respectivos se realizaron fuera de la
campana; mientras que la inmersión en NaClO y la siembra de las semillas se realizaron
– 27 –
MATERIALES Y MÉTODOS
En la siembra se utilizó el medio MS al 50 % de concentración de nutrientes, sacarosa al
1.5 % (p/v) y agar al 0.4 % (p/v). Se colocaron cinco semillas (NSS = número de semillas
% SD = NSD x 100 NSS (1)
na vez que comenzó la germinación (emergencia de la radícula), se incubaron las
plántulas en una irradiancia de 310 µmol m s y 16 horas de fotoperíodo.
manas de edad. Los explantes se obtuvieron por cortes de
s plántulas en segmentos de 0.5 cm de longitud que contenían la yema apical y
Figura 5. Representación de los sitios de corte en las plántulas para obtener los explantes.
sembradas) sobre el medio de cultivo en cada unidad experimental (UE). Cada tratamiento
se aplicó en tres UE en la primera etapa y en seis en la segunda. Las cuales se
mantuvieron dentro de la cámara de incubación durante dos semanas en oscuridad; al
término de este tiempo se realizó la evaluación del número de semillas desinfestadas
(NSD). Se consideraron como desinfestadas a aquellas semillas en las que no se observó
crecimiento de microorganismos a su alrededor. El porcentaje de semillas desinfestadas
(% SD) se obtuvo mediante la siguiente ecuación:
÷
U-2 -1
5.3.3 Inducción de brotes
Se utilizaron plántulas de 8 se
la
segmentos de tallo de 1 cm con un solo nudo que incluía la yema axilar (Figura 5).
yema axilar
yema apical
– 28 –
MATERIALES Y MÉTODOS
Se pla ción
últiple, donde se evaluaron las variab EXPLANTE (yemas apicales y yemas
ión se realizó al cumplirse la sexta semana de incubación; para lo cual se contó
l número total de brotes en cada unidad experimental (TBU). El índice de brotes por
Cuadro 3. Tratamientos con los fito-reguladores ANA y/o BAP para la inducción de brotación múltiple en dos tipos de explante (yemas apicales y yemas axilares).
nteó un diseño experimental bifactorial para obtener la respuesta de brota
les: TIPO DEm
axilares) y TRATAMIENTOS CON LOS FITO-REGULADORES ANA y BAP; éstos se adicionaron al
medio de cultivo en las concentraciones como se indica en el Cuadro 3, donde se incluyó
también un control sin fito-reguladores. Se utilizó el medio MS al 100 % de concentración
de nutrientes, sacarosa al 3.0 % (p/v) y agar al 0.8 % (p/v). En cada UE se sembraron tres
explantes (NES = número de explantes sembrados) y cada tratamiento se realizó por
triplicado.
La evaluac
e
explante (IBE) se obtuvo mediante la siguiente ecuación:
IBE = TBU ÷ NES (2)
ANA BAP
TRATAMIENTOConcentración (µM)
1
0.0
5.0
2
3
4
5
6
7
8
0.0
0.0 2.5
0.0
0.5
0.5
0.5
0.5
0.0
10.0
0.0
2.5
5.0
10.0
as diferentes fases que se siguieron para la micropropagación de A. elegans, se
presentan en la Figura 6.
L
re
– 29 –
MATERIALES Y MÉTODOS
Multiplicación
Inducción de brotes
Explantes asépticos
Aclimatización
Elongación y enraizamiento
Transferencia al sustrato
Figura 6. Esquema en el que se muestran las diferentes fases de
.3.4 Multiplicación y elongación de brotes
a multiplicación se realizó con diez explantes colocados en medio de cultivo con el
.3.5 Inducción de raíces
imultáneamente a la elongación de brotes y con base en los trabajos reportados sobre
micropropagación de A. elegans.
5
L
tratamiento que presentó el mayor rendimiento, incubados durante 4 semanas y al término
de éste período, se separaron los brotes mayores a 0.5 cm para subcultivarse. La etapa de
multiplicación concluyó al terminar el segundo período de cultivo y todos los brotes
resultantes se sembraron en medio de cultivo sin fito-reguladores para su elongación; en el
que permanecieron durante 3 semanas.
5
S
inducción de raíces en otras especies de Aristolochia, se desarrolló un diseño experimental
para definir las condiciones de inducción de raíces en brotes de A. elegans. Para ello se
– 30 –
MATERIALES Y MÉTODOS
utilizaron plántulas asépticas de 6 semanas de edad, de las que se cortaron las yemas
axilares, que se sembraron en el medio de cultivo MS al 100 % de concentración de
nutrientes, sacarosa al 3.0 %, agar al 0.8 % y los fito-reguladores: ácido indolbutírico (AIB)
y ANA en diferentes concentraciones de acuerdo con el Cuadro 4.
Cuadro 4. Tratamientos con los fito-reguladores AIB y ANA para la inducción de
AIB ANA
raíces en explantes de yemas axilares.
TRATAMIENTOConcentració ) n (µM
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.0
0.0
0.5
1.5
2.5
5.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.5
1.5
2.5
5.0
ada UE consistió en la siembra de 2 explantes (NES = número de explantes sembrados)
IRE = TRU ÷ NES (3)
l término de la prueba de inducción de raíces, los brotes elongados se transfirieron al
C
y cada tratamiento se realizó con cuatro UE. La evaluación se hizo al cumplirse la sexta
semana de incubación y para ello se contó el número total de raíces en cada unidad
experimental (TRU). El índice de raíces por explante (IRE) se obtuvo mediante la siguiente
ecuación:
A
medio de cultivo adicionado con el tratamiento que indujo el mayor número de raíces.
– 31 –
MATERIALES Y MÉTODOS
5.3.6 Aclimatización
as plantas enraizadas se aclimatizaron mediante el método desarrollado por Ventura
a aclimatización se hizo al exponer gradualmente las plantas a las condiciones ex vitro,
urante el proceso de apertura de la cubierta de plástico, se tomaron lecturas de humedad
÷ HR) (4)
Donde T se debe expresar en ° K (Salisbury y Cleon, 1994).
L
(1998; 2001). Éste consistió en un sistema hidropónico, conformado por un frasco de vidrio
que contenía solución nutritiva de Hoagland (Hoagland y Arnon, 1950), el pH se ajustó a
5.5. Después el frasco se tapó con papel aluminio, al que se le hizo un corte en forma de
‘V’ de 1 cm por lado para insertar la raíz, de esta forma el sistema radical quedó inmerso
en la solución. La parte aérea de las plantas se cubrió con una bolsa de plástico
transparente de 10 x 20 cm (Figura 6). La bolsa quedó boca abajo y se sujetó con una liga
cubriendo la planta; de esta forma se creó un ambiente semi-hermético en el sistema
hidropónico.
L
para ello, se hicieron perforaciones circulares de 0.6 cm de diámetro en la bolsa (parte
superior), con una perforadora manual (en cada perforación se obtienen dos orificios: uno
de cada lado de la bolsa). La apertura gradual se realizó de la siguiente manera: en el
transcurso de la primera semana las bolsas se mantuvieron intactas; al cumplirse la
primera semana, se realizó una perforación y uno de los orificios se cubrió con cinta
adhesiva para dejar sólo uno abierto; al cumplirse la segunda semana se abrió el orificio
que estaba cubierto. Al término de la tercera semana se realizó la segunda perforación; al
cumplirse la cuarta semana se realizó la tercera y cuarta perforación; finalmente en la
quinta semana se abrió totalmente la bolsa mediante un corte con tijeras, de manera que
las plantas quedaron expuestas a las condiciones de la cámara de cultivo: 16 h de
fotoperíodo con irradiancia de 310 µmol m-2 s-1, temperatura de 25 ± 2°C y humedad de 45-
48 % HR (termo-higrómetro digital Cole Parmer modelo PT8708).
D
de la cámara de incubación y dentro del sistema hidropónico de diez plantas. Con estos
valores se determinó el potencial hídrico (Ψ) atmosférico en la cámara y dentro del sistema
hidropónico, mediante la siguiente ecuación:
Ψ (MPa) = –1.06 T log (100
– 32 –
MATERIALES Y MÉTODOS
Cabe mencionar que al cumplirse el primer mes de aclimatización se cambió la solución
on la finalidad de comparar los parámetros mencionados, se obtuvo la velocidad
VE = (VNF (t2 – t1) (5)
.3.7 Cultivo en invernadero y cosecha
e utilizó un sustrato preparado en el invernadero con una mezcla de peat-moss, agrolita y
as plantas del sistema hidropónico se transfirieron a vasos de unicel de 0.2 l de
contenida en los frascos por solución recién preparada; en estas condiciones las plantas
se mantuvieron hasta cumplirse el segundo mes. Durante la aclimatización (tiempo 0, 1 y 2
meses), se evaluaron los siguientes parámetros de crecimiento: 1) número de nudos, 2)
número de raíces secundarias (las formadas en la interfase raíz-tallo), 3) longitud de la raíz
y 4) longitud de la parte aérea (desde la interfase raíz-tallo hasta la yema apical).
C
específica (VE) de cambio de cada uno, mediante los valores numéricos de los parámetros
evaluados al final de cada tiempo (VNF) y los del inicio (VNI) en los intervalos de tiempo:
0-1 mes (t1 y t2) y de 1-2 meses (t1 y t2), de acuerdo con la siguiente ecuación:
– VNI) ÷
5
S
vermiculita en una relación 3:1:1 respectivamente. El pH se ajustó dentro del intervalo de
6.0-6.5, mediante el uso de óxido de calcio (CaO), el cual se agregó en polvo sobre la
mezcla seca. La medición de pH se realizó de la siguiente manera: se pesaron 5 g de la
mezcla seca y se agregaron 50 ml de agua desionizada; se filtró sucesivamente con gasa
y papel filtro de poro grande; finalmente se midió el pH del filtrado. Una vez ajustado el pH,
el sustrato se esterilizó en autoclave durante 1 h a 120 °C.
L
capacidad que contenían el sustrato estéril. Una vez plantadas, se agregaron en cada vaso
50 ml de la misma solución nutritiva utilizada en el sistema hidropónico. Debido a la
heterogeneidad de la altura de las plantas y para facilitar su manejo, se realizó una poda
en todas ellas, dejándolas con una altura de 0.1 m. Las plantas contenidas en los vasos de
unicel se mantuvieron durante 3 semanas dentro del laboratorio; posteriormente, se
transfirieron a macetas de 2 l de capacidad cuyo volumen fue cubierto con el sustrato
antes descrito.
– 33 –
MATERIALES Y MÉTODOS
En estas macetas, al inicio y al cumplimiento de cada mes se agregaron 100 ml de la
solución nutritiva de Hoagland; además de los riegos con agua de la llave una vez por
semana. En cada maceta se colocó un tutor de madera (1.20 m aprox.) que sirvió como
guía a la planta. Las macetas se colocaron dentro del invernadero sobre una mesa (2.50 x
1.20 m) que tenía una altura de 0.70 m del piso.
Adicionalmente, se colocó una red (tela de malla de apertura muy fina) para cubrir el
espacio sobre la mesa (1.5 m de altura) donde se desarrollaron las plantas; esto sirvió de
barrera física para evitar la invasión de insectos. En estas condiciones de cultivo las
plantas se mantuvieron durante 5 meses. Durante el período de cultivo en el invernadero,
se obtuvieron lecturas de temperatura, humedad e irradiancia.
En la cosecha, se cortó la parte aérea y la raíz de cada planta a partir de la interfase tallo–
raíz. Las raíces se separaron manualmente del sustrato y tanto las raíces como las partes
aéreas se lavaron a chorro de agua para eliminar polvo y material del sustrato. El material
vegetal se mantuvo durante una semana para su secado a temperatura ambiente, en un
lugar sombreado y con ventilación. Los diferentes materiales (raíces y partes aéreas) se
molieron y se pesaron.
Se determinó la humedad de cada material por diferencia de peso a 70° C durante 32 h en
estufa (Imperial V, modelo 3471 Lab line instruments) con muestras de aproximadamente
0.5 g colocadas en una caja petri de vidrio. Una vez que se retiraron de la estufa, se
dejaron enfriar dentro de un desecador y se pesaron nuevamente. El porcentaje de
humedad (% H) se calculó mediante la siguiente ecuación:
% H = (MI – MF) x 100 ÷ MI (6)
Donde MI es el peso de la muestra inicial y MF es el peso de la muestra después de 32 h.
– 34 –
MATERIALES Y MÉTODOS
5.4 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA
5.4.1 Obtención de extractos
Las partes aéreas y raíces se maceraron sucesivamente con hexano y metanol en dos
etapas de 24 h para cada disolvente. El procedimiento fue el siguiente: cada material
vegetal se colocó dentro de un matráz erlenmeyer de 2 l, se agregó hexano en razón de
0.8 ml por gramo de material seco. Se tapó el matráz y se dejó en reposo durante 24 h; el
macerado (el producto líquido de la maceración) se filtró sucesivamente con gasa y con
papel Watman No 4. El extracto se obtuvo por evaporación del disolvente a presión
reducida en rotavapor (Buchi mod. R-114) hasta casi el punto de sequedad. El extracto se
transfirió a frascos viales previamente pesados y el disolvente recuperado se agregó
nuevamente al matráz con el material vegetal. En la segunda etapa se repitieron todos los
pasos excepto al final donde en lugar de agregar el mismo hexano al matráz, se agregó
metanol en la misma proporción.
Los extractos de las diferentes etapas del mismo disolvente se colectaron en un frasco vial
y se dejaron secar a temperatura ambiente durante tres días; posteriormente se colocaron
en un liofilizador (Heto drywinner, mod. DW3) para eliminar al máximo los residuos de
disolvente y se pesaron los frascos con los extractos secos. Los rendimientos de
extracción (RE) se obtuvieron con una base de cálculo de 100 g de material vegetal de
inicio (MV) y el peso de extracto seco (ES) mediante la siguiente ecuación:
RE (%) = ES x 100 ÷ MV (7)
5.4.2 Obtención de veneno
Se colectaron alrededor de 100 alacranes de la especie Centruroides limpidus limpidus√∫
en una zona rural del Municipio de Puente de Ixtla, Morelos; de los cuales se obtuvo el
veneno por medio de un impulso eléctrico aplicado al telsón; el veneno secretado fue
depositado en cajas petri de vidrio. Posteriormente, el veneno se redisolvió en agua
√ ∫ Que es la especie más abundante en la región y sus características de color y tamaño permiten identificarlo fácilmente.
– 35 –
MATERIALES Y MÉTODOS
destilada y se clarificó por centrifugación. El sedimento se eliminó y el sobrenadante se
repartió en alícuotas de 300 a 500 µl dentro de frascos viales con capacidad de 1 ml
(previamente tarados); éstos se liofilizaron y finalmente se pesaron para determinar la
cantidad de veneno en cada uno.
5.4.3 Animales de experimentación
Se usaron cobayos machos de la cepa Hartley de 3 a 5 meses de edad, con un intervalo
de peso de 400 a 600 g, los cuales se mantuvieron en el bioterio del CIBIS-IMSS bajo
condiciones de temperatura controlada (22 ± 2 °C), bajo un ciclo de 12 h de luz por 12 de
oscuridad y con acceso libre a agua y alimento. Los cobayos se sacrificaron por
dislocación cervical. El íleon distal se obtuvo por laparotomía y se lavó cuidadosamente
con solución Tyrode (concentraciones mM de: NaCl 136.9, glucosa 11.1, NaHCO3 11.9,
CaCl2 1.4, KCl 2.7, MgCl2 0.5, NaH2PO4 0.4; con pH de 7.4).
5.4.4 Preparación de soluciones stock
Se prepararon soluciones stock de carbamilcolina, veneno y de los extractos vegetales. La
solución stock de carbamilcolina se preparó como solución acuosa en concentración de 1
mg/ml. Las soluciones stock de veneno se prepararon partiendo de la de mayor
concentración (6000 µg/ml); de esta se prepararon las soluciones stock restantes con
alícuotas de: 50, 79, 125, 199, y 315 µl, las cuales se completaron a un volumen de 500 µl
(con solución Tyrode) para tener concentraciones finales de: 600, 950.88, 1507.08,
2388.60 y 3780.00 µg/ml. Las soluciones stock de extractos se prepararon de la siguiente
manera: 300 mg de extracto (con tres gotas de Tween 20) se mezclaron con agua
destilada a un volumen final de 10 ml; de esta solución se tomaron alícuotas de: 0.3, 0.6,
0.9, 1.2, 1.5 y 1.8 ml y se completó el volumen a 3 ml con agua destilada para tener las
soluciones en concentraciones finales de: 3, 6, 9, 12, 15 y 18 mg/ml.
5.4.5 Preparación del equipo y cámara de incubación
Se cortó una sección de aproximadamente 2 cm del íleon. Uno de los extremos se sujetó
con hilos de seda al fondo de la cámara y el otro al transductor de fuerza (FT 100, CB
– 36 –
MATERIALES Y MÉTODOS
Sciences Inc.) el cual a su vez está conectado a un equipo digital de adquisición de datos
(Maclab 8) que envía la señal a un procesador de datos (Figura 7).
(b)
(1) Cámara de incubación
(2) Transductor de fuerza
(3) Equipo digital de adquisición
de datos
(4) Tanque de gases (O2 / CO2)
(5) Procesador de datos
(6) Regulador de temperatura
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(a)
iF gura 7. Equipo de prueba para el modelo de íleon aislado de cobayo. En (a),
fotografía del equipo y principales componentes; y (b), esquema que representa la cámara de incubación.
La porción del íleon siempre se mantuvo sumergido en solución Tyrode dentro de la
cámara de incubación (3 ml de capacidad) con burbujeo de una mezcla de CO2 y O2 (5 y
95% v/v respectivamente). El flujo de la mezcla de gases fue en el intervalo de 20-30
burbujas/min a temperatura constante de 37 °C, donde el fragmento de íleon se estabilizó
a 1 gf de tensión (Jiménez, 2004). Por la parte inferior, la cámara tiene un sistema de
drenaje para eliminar las soluciones de prueba y enjuague, además de un tubo delgado
para administrar la mezcla de gases; el control de temperatura se logra mediante una
doble pared de la cámara, donde se hace circular agua a la temperatura requerida (Figura
7b). Después de 20-30 min necesarios para la estabilización del sistema, se procedió al
inicio de las pruebas de contracción y relajación del íleon.
– 37 –
MATERIALES Y MÉTODOS
5.4.6 Contracción inducida por veneno de alacrán
Se consideró como el 100 % de contracción del fragmento del íleon, la fuerza de
contracción inducida por una solución de carbamilcolina (análogo de acetilcolina) en
concentración de 10-4 M. Para obtener la concentración final requerida, se aplicó una
alícuota de 55 µl de la solución stock.
Para cuantificar la contracción del íleon provocada por el veneno, se realizaron dos curvas
de concentración-respuesta. La primera consistió de un intervalo amplio de
concentraciones de veneno: 1, 10, 100 y 1000 µg/ml. En la segunda curva, se delimitó al
intervalo donde se alcanzó la mayor respuesta 10–100µg/ml; las concentraciones probadas
fueron: 101, 101.2, 101.4, 101.6, 101.8 y 102 µg/ml. En todos los casos se aplicaron alícuotas
de 50 µl de las soluciones stock de menor a mayor concentración para obtener la
concentración final requerida en la cámara. Después de cada prueba, el íleon se lavó
durante 10 min con solución Tyrode para recuperar la condición de reposo.
5.4.7 Prueba de relajación
Se agregaron 50 µl de la solución stock de veneno para alcanzar la concentración de 101.6
µg/ml (40 µg/ml) en el volumen de la cámara. Esta concentración se mantuvo fija para el
resto de las pruebas y se derivó de la prueba de la contracción inducida por el veneno. A
partir de la aplicación del veneno se inició el conteo del tiempo; transcurridos 0.5 min se
agregaron 50 µl de la solución stock de cada uno de los extractos (de menor a mayor
concentración) para obtener concentraciones finales en la cámara de 50, 100, 150, 200,
250 y 300 µg/ml y éstos se mantuvieron en interacción hasta cumplirse 2 min. En la Figura
8 se ilustra la forma como se procesaron los datos a partir de la respuesta gráfica que
proporcionó el equipo, para obtener el valor de porcentaje de relajación de íleon (%RI)
mediante la siguiente ecuación:
% RI = RI x 100 ÷ FCA (8)
– 38 –
MATERIALES Y MÉTODOS
Figura 8. Ejemplo de los registros gráficos típicos proporcionados por el equipo y los componentes para obtener el porcentaje de relajación.
5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
El análisis estadístico de los experimentos de desinfestación e inducción de raíces
consistió de un Análisis de Varianza (ANOVA) de un solo factor completamente al azar,
mientras que para el diseño experimental de inducción de brotes, así como en la prueba de
relajación, se aplicó un ANOVA de dos factores. Cuando el ANOVA indicó una diferencia
significativa entre los tratamientos, se aplicó el método de comparación de medias de
Tukey para encontrar los grupos que fueron estadísticamente diferentes. En todas las
pruebas se aplicó un nivel de significancia del 5 % (α = 0.05). Se utilizó el software Sigma-
Stat versión 3.0.
Tiempo de aplicación (min)0.5 0.0 2.0
1.0
4.0
7.0
Fuerza de contracción A (FCA)
Fuerza de contracción B (FCB)
Relajación de la porción de íleon (RI = FCA - FCB)
Fuer
za d
e co
ntra
cció
n (g
)
veneno 40 µg·ml-1 extracto
– 39 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 MICROPROPAGACIÓN Y CULTIVO
6.1.1 Desinfestación de semillas
En el Cuadro 5 se presentan los resultados de desinfestación de las semillas
correspondiente a la primera etapa con hipoclorito de sodio (NaClO). Después de realizar
el análisis estadístico, los porcentajes de desinfestación se clasificaron en dos grupos de
acuerdo con las diferencias significativas que presentaron entre ellos: el grupo 1 que
incluyó los tratamientos A, B, C y D con medias del % de semillas desinfestadas (%SD) en
el intervalo de 6.7–13.3; y el grupo 2 que incluyó los tratamientos E, F, G, H e I, con los que
se obtuvieron valores en el intervalo de 46.7-60 %SD.
Cuadro 5. Efecto de soluciones de NaClO a diferentes concentraciones yiempos de inmersión, en la desin estación de semillas.
t f
TRATAMIENTO
NaClO (% cloro libre)
t de inmersión (min)
% SEMILLAS DESINFESTADAS
A
B
C
D
E
F
G
H
I
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1.0
1.5
1.5
1.5
5
10
15
5
10
15
5
10
15
6.7
6.7
6.7
13.3
46.7
46.7
40.0
53.3
60.0
±
±
±
±
±
±
±
±
±
6.7
6.7
6.7
6.7
6.7
6.7
11.5
6.7
11.5
b
b
b
ab
a
a
a
a
a
i
rLos valores de % de semillas desinfestadas representan la media de tres un dades
experimentales ± e ror estándar. Los valores seguidos por diferente letra son significativamente diferentes (prueba de Tukey, α=0.05).
– 40 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los tratamientos dentro de cada grupo no fueron estadísticamente diferentes entre sí. En
el caso de los tratamientos A, B y C los bajos %SD se atribuyen principalmente a la baja
concentración de NaClO (0.5 %) y en el tratamiento D, aunque se incrementó la
concentración de NaClO a 1.0 %, el tiempo de contacto (5 min) no fue suficiente para que
el efecto en la desinfestación fuera diferente a los tres primeros tratamientos. En el grupo 2
no se encontró diferencia entre los tratamientos a pesar del incremento tanto de la
concentración de NaClO como del tiempo de contacto. Es importante señalar que con los
tratamientos E, F, G, H e I se observó una disminución de la capacidad de germinación de
las semillas desinfestadas como respuesta al incremento del tiempo de inmersión o de la
concentración de NaClO. Bajo estas circunstancias, se eligió el tratamiento E, ya que
dentro del grupo con mayor capacidad desinfestante es el tratamiento en el que se utiliza
la menor concentración de NaClO con el menor tiempo.
En el Cuadro 6 se muestran los resultados de la desinfestación logrados con la segunda
etapa. En estos resultados se observó un efecto importante en la desinfestación de las
semillas con respecto a los resultados de la primera etapa. El %SD incrementó con
relación al tiempo de contacto y se hallaron diferencias significativas entre los tres
tratamientos. Con el tratamiento de inmersión en etanol 70 % durante 5 min combinado
con el tratamiento E (NaClO 1.0 % durante 10 min de inmersión), se logró eliminar la
contaminación superficial de las semillas al 100 %, de las cuales el 93 % germinaron.
Cuadro 6. Efecto del uso de etanol al 70% con diferentes tiempos de inmersión combinado con el tratamiento E (NaClO 1.0 % / 10 min), en la des nfestación de
semillas. i
TRATAMIENTO % SEMILLAS DESINFESTADAS
Ea [etanol / 1 min + trat E]
Eb [etanol / 3 min + trat E]
Ec [etanol / 5 min + trat E]
56.7
76.7
100.0
±
±
±
6.1
6.1
0.0
c
b
a
Los valores de % de semillas desinfestadas rep esentan la media de seis unidades experimentales ± e ror estándar. Los valores seguidos por diferente letra son significativamente
diferentes (prueba de Tukey, α=0.05).
rr
– 41 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la Figura 9 se representan comparativamente los resultados del proceso global de las
dos etapas para la desinfestación, en la que se puede observar la tendencia a incrementar
el porcentaje de desinfestación por la combinación de los tratamientos con NaClO y etanol.
Ea Eb Ec
TRATAMIENTO
0
20
40
60
80
(b) 100
A B C D E F G H ITRATAMIENTO
Sem
illas
Des
infe
stad
as (%
)
(a)
Figura 9. Efecto de di erentes tratamientos en la desinfestación de semillas de A. elegans. En (a) se representan los valores obtenidos mediante tratamientos
de NaClO y en (b) los valores de etanol 70 % en diferentes tiempos de inmersión combinado con el tratamiento E. En (a), los valores representan la
media de tres unidades experimentales y en (b), de seis + error estándar.
f
Para lograr la esterilización superficial de las semillas de A. elegans, se requirió de un
proceso que involucró tres agentes químicos (detergente, etanol y NaClO) Generalmente
se recomienda el uso de varios agentes en un solo proceso ya que ninguno es ideal como
desinfestante por sí mismo (Pelczar, 1982). Al respecto, se sabe que la actividad del
detergente provoca la disminución de la tensión superficial del agua, lo que incrementa su
capacidad humectante; la actividad del etanol para desnaturalizar proteínas y disolver
lípidos; y la alta capacidad oxidante del NaClO. Estas actividades al combinarse en el
mismo proceso contribuyeron a reducir el número de esporas y microorganismos en la
superficie de las semillas.
– 42 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1.2 Inducción de brotes
En el Cuadro 7 se presentan los resultados de la formación de brotes en los explantes por
la inducción de los diferentes tratamientos de fito-reguladores. En los dos tipos de explante
se observó una tendencia a aumentar el número de brotes con el incremento de la
concentración de BAP (tratamientos 2 y 3), hasta alcanzar el valor máximo de brotación
con BAP 10 µM (tratamiento 4) el cual fue significativamente diferente al resto de los
tratamientos; es decir, que indujo el mayor número de brotes (3.1 en promedio, Cuadro 7).
Cuadro 7. Formación de brotes en yemas apicales y axilares por efecto de diferentes tratamientos con fito-reguladores .
TRATAMIENTO ÍNDICE DE BROTES POR EXPLANTE
ANA BAP Concentración
(µM) Yemas Axilares Yemas Apicales
1
2
3
4
5
6
7
8
0.0
0.0
0.0
0.0
0.5
0.5
0.5
0.5
0.0
2.5
5.0
10.0
0.0
2.5
5.0
10.0
1.3
1.6
1.7
3.1
1.9
2.2
2.1
1.9
±
±
±
±
±
±
±
±
0.2
0.1
0.2
0.1
0.2
0.3
0.1
0.4
b
b
b
a
b
ab
b
b
1.0
1.0
2.0
3.1
1.0
0.9
1.0
1.4
±
±
±
±
±
±
±
±
0.0
0.0
0.6
0.4
0.0
0.1
0.0
0.2
c
c
b
a
c
c
c
bc
Los valores de índice de brotes por explante representan la media de tres un dades experimentales ± e ror es ándar. En cada tipo de explante, os valores seguidos por diferente
etra son significativamente diferentes (prueba de Tukey, α=0.05).
ir t l
l
En cuanto al tipo de explante, no se encontró diferencia significativa en el número de
brotes inducidos con en tratamiento 4; sin embargo, un aspecto importante a considerar
fue el tamaño de los mismos ya que con los de mayor longitud se requieren períodos
– 43 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
menores de elongación. Con yemas axilares se obtuvieron brotes con una altura de 1-2
cm; mientras que con yemas apicales de 0.5-1 cm (Figura 10).
A B
Figura 10. Fotografías que representan los brotes formados por efecto de BAP
10 µM (tratamiento 4) en yemas axilares (A) y yemas apicales (B).
La adición de ANA 0.5 µM (tratamiento 5), no tuvo efecto significativo en la formación de
brotes con respecto al tratamiento 1 (control), en ambos tipos de explantes.
Para analizar la interacción de los dos fito-reguladores en el mismo medio (tratamientos 6,
7 y 8), se compararon contra los tratamientos con la misma concentración de BAP
tratamientos 2, 3 y 4, con los que se formaron las siguientes parejas: (2 , 6) , (3 , 7) y (4 ,
8); la diferencia es que el segundo tratamiento de cada pareja, contenía ANA 0.5 µM. De
acuerdo con los resultados, los tratamientos mediante la combinación de ANA 0.5 µM con
concentraciones crecientes de BAP tuvieron un efecto negativo en la inducción de brotes;
ya que se observó una tendencia a disminuir el IBE que se obtuvieron mediante el uso solo
de BAP. Para el caso de yemas axilares no se encontró diferencia significativa entre las
parejas de tratamientos 2-6 y 3-7, pero sí entre los tratamientos 4-8 con valores de 3.1 y
1.4 brotes por explante respectivamente. En cuanto a yemas apicales, el efecto fue más
marcado, ya que se halló diferencia significativa entre los tratamientos 3-7 y 4-8.
– 44 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
0
1
2
3
1 2 3 4 5 6 7 8TRATAMIENTO
Índi
ce d
e Br
otes
por
Exp
lant
eyemas axilares yemas apicales
Figura 11. Efecto de los diferentes tratamientos de fito-reguladores, en laformación de brotes en yemas apicales y yemas axilares. Los valores
representan la media de tres unidades experimentales + error estándar.
r
t
Del género Aristolochia solo tres especies se han cultivado in vit o según los reportes
disponibles; con respecto a A. elegans, no se tiene conocimiento de su cultivo in vi ro, por
lo que en este trabajo sería la primera ocasión que se está reportando. En esta
investigación se indujo la formación de brotes principalmente por efecto de BAP en una
concentración de 10 µM, que es diferente a las condiciones de inducción de brotes
reportadas para A. indica con BAP 13.3 + ANA 0.5 µM (Manjula y col., 1997), A. fimbriata
con BAP 5.0 µM (Bravo y col., 1999) y A. manchuriensis con BAP 2.0 µM (Svensson,
2000).
Se sabe que los procesos del desarrollo en las plantas están regulados por la acción y el
balance de diferentes tipos de fito-reguladores, los cuales pueden actuar como promotores
o inhibidores de estos procesos. Los niveles endógenos de estos reguladores pueden ser
muy variables ya que están regulados en su síntesis, movilización de reservas, activación,
y degradación a otros compuestos (Ortuño y col., 1999). Las diferencias en las respuestas
a la inducción de brotes es algo que se puede relacionar principalmente con el balance
– 45 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
endógeno de fito-reguladores de las distintas especies, en este caso del género
A istolochia. r
En las plantas ocurre el fenómeno conocido como dominancia apical que se refiere a la
inhibición del desarrollo de brotes laterales dominado por el desarrollo de las yemas
apicales; esto se debe al flujo de auxinas (como AIA) de las yemas apicales hacia las
partes inferiores de la planta, siendo la forma como dirige su crecimiento. En trabajos de
micropropagación se busca la pérdida de esa dominancia apical para inducir el desarrollo
de brotes laterales, lo cual se logra mediante la aplicación exógena de citocininas en el
medio de cultivo.
Las citocininas tienen un papel importante como promotores de división celular y actúan en
la inducción y desarrollo de centros meristemáticos que conducen a la formación de
órganos, principalmente brotes (Moncaleán y col., 2003); BAP es la citocinina usada con
mayor frecuencia en procesos comerciales de micropropagación ya que induce mayor
proliferación de brotes que zeatina o cinetina que son otras muy conocidas. Por lo anterior,
se puede decir que las distintas especies presentan diferentes balances de fito-
reguladores y por lo tanto requieren también diferentes concentraciones de citocininas en
el medio de cultivo para romper esa dominancia apical.
Es importante mencionar que en el experimento realizado para buscar las condiciones de
inducción de brotes se pudieron observar también otras características en los diferentes
tratamientos como la formación de estructuras callosas principalmente en presencia de
ANA; también se presentó la formación de algunas raíces gruesas sobretodo en
concentraciones bajas de ANA y BAP (Figura 12); lo que nos da una idea de los cambios
que sufre el desarrollo de la planta en presencia de diferentes balances de fito-
reguladores.
En el cultivo control se observó el desarrollo vigoroso de uno o hasta dos brotes de cada
explante, con alturas aproximadas de 7 cm y que contenían de 7 a 9 nudos por brote;
además de la formación de algunas raíces finas y largas. Estas características podrían ser
interesantes para la propagación mediante micro-estacas, sin la necesidad de aplicar fito-
reguladores al medio de cultivo y con la ventaja de que se induce la formación de raíces, lo
– 46 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
que reduciría el tiempo de elongación y de inducción de raíces; aunque posiblemente la
productividad sea menor que mediante la propagación por brotes laterales.
Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4
Vista abajo
Vista arriba
Vista frente
Figura 12. Vistas di erentes de cuatro tratamientos de fito-reguladores para la inducción de brotes en yemas axilares. f
En síntesis, en esta etapa se logró la mayor inducción de brotes (3.1 en promedio) y de
mayor tamaño (1-2 cm de altura) en yemas axilares con el medio de cultivo MS al 100 %
adicionado con BAP 10 µM.
6.1.3 Multiplicación y elongación de brotes
Se obtuvo un total de 41 brotes en el primer período de cultivo (4.1 brotes en promedio /
explante inicial) y en el segundo 135 (3.3 brotes / explante inicial). La diferencia en el
número de brotes por explante, podría atribuirse a que en el primer período de cultivo los
brotes no presentaron ramificaciones y el tamaño de éstos fue homogéneo (1-2 cm); sin
– 47 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
embargo, en el segundo, los brotes tuvieron la tendencia a ramificarse, en muchos de ellos
los brotes secundarios fueron muy pequeños (menores a 0.5 cm), los cuales no fueron
separados del brote primario, por esta razón el rendimiento de brotes fue aparentemente
menor en el segundo período de cultivo. Después de la etapa de elongación los brotes
alcanzaron alturas en el intervalo de 3-4 cm.
El rendimiento obtenido para A. elegans (3-4 brotes por explante) es semejante a los
reportados para otras especies: Svensson (2000) reportó un promedio de 4.2 brotes por
explante de A. manchuriensis mediante el uso de BAP 2.0 µM; Manjula y col. (1997) para
A indica mediante el uso de BAP 13.3 µM + ANA 0.5 µM, obtuvieron de 2-3 brotes por
explante; mientras que para A. fimbriata Bravo y col. (1999) reportaron para la formación
de un solo brote mediante el uso de BAP 5.0 µM.
.
6.1.4 Inducción de raíces
Los valores obtenidos de la prueba de inducción de raíces se presentan en el Cuadro 8. En
el control (tratamiento 1) se formaron 6.8 raíces por explante en promedio, lo cual sugiere
la inducción de raíces por la presencia de los fito-reguladores endógenos. En el
tratamiento 2 (AIB 0.5 µM), no hubo diferencia significativa con respecto al control. Por el
contrario, el tratamiento 3 (AIB 1.5 µM) sí resultó ser significativamente diferente al resto
de los tratamientos, ya que indujo la formación del mayor número de raíces por explante
(12 en promedio). Mientras que en los tratamientos 4 y 5 (AIB a 2.5 y 5.0 µM
respectivamente) se observó una tendencia de disminución del número de raíces.
En la Figura 13 se representan gráficamente los resultados de inducción de raíces en
donde es posible observar la tendencia del incremento de raíces con respecto al
incremento en la concentración de AIB, hasta llegar a una concentración de máxima
respuesta (1.5 µM); a partir de la cual, el incremento de la concentración provoca un efecto
de disminución de la cantidad de raíces formadas, incluso en menor cantidad que el mismo
control. Con respecto al uso de ANA, se observó principalmente la formación de
estructuras callosas alrededor del explante y no se logró la inducción de raíces.
– 48 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cuadro 8. Formación de raíces en yemas axilares por efecto de di erentes tratamientos con los fito-reguladores AIB y ANA.
f
TRATAMIENTO
AIB ANA Concentración
(µM)
ÍNDICE DE RAÍCES POR EXPLANTE
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.0
0.5
1.5
2.5
5.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.5
1.5
2.5
5.0
6.8
8.9
11.8
4.6
2.4
0.6
0.0
0.1
0.4
±
±
±
±
±
±
±
±
±
0.6
0.6
1.0
0.8
0.8
0.4
0.0
0.1
0.2
bc
b
a
cd
de
e
e
e
e
r
rLos valores de índice de raíces por explante rep esentan la media de tres unidades
experimentales ± e ror estándar. Los valores seguidos por diferente letra son significativamente diferentes (prueba de Tukey, α=0.05).
En la prueba de inducción de brotes sí se observó la formación de raíces en los explantes
en presencia de ANA 0.5 µM; sin embargo no se obtuvo el mismo resultado cuando se
realizó la prueba de inducción de raíces. Esto podría atribuirse a diferencia en la edad de
las plántulas (fuente de explante), ya que se sabe que la edad fisiológica determina el tipo
y la velocidad de morfogénesis en los explantes (Lozoya, 1985).
En el caso de la prueba de inducción de brotes se utilizaron plántulas de 8 semanas y en la
inducción de raíces de 6 semanas; lo que pudo influir en contenido endógeno de fito-
hormonas en los diferentes explantes, y se vio reflejado en el número de raíces formadas.
– 49 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
0
4
8
12
1 2 3 4 5 6 7 8 9
TRATAMIENTO
Índi
ce d
e R
aíce
s po
r Exp
lant
e
Figura 13. Efecto de diferentes tratamientos de fito-reguladores en la formación de raíces en yemas axilares. Los valores representan la media de tres unidades
experimentales + error estándar.
Es conocida la capacidad de las auxinas en bajas concentraciones para inducir la
formación de raíces y de las citocininas para inhibirlas (Rout y col., 2000); en los trabajos
reportados para otras especies de A istolochia, se logró la mayor inducción de raíces
mediante el uso de AIB en concentraciones de 2.5 y 5.0 µM; en cambio en A elegans se
logró la inducción del mayor número de raíces (12 en promedio) con una concentración de
1.5 µM (tratamiento 3), lo cual se puede atribuir también a las diferencias en el contenido
endógeno de fito-reguladores, el cual varía en las distintas especies (Salisbury, 1994).
r
.
Finalmente, debido a que el tratamiento 3 indujo la formación del mayor número de raíces,
los brotes multiplicados y elongados se cultivaron en el medio MS 100 % adicionado AIB
1.5 µM para inducir la formación de raíces.
6.1.5 Aclimatización
En la Figura 14 se muestra la cinética de desarrollo de las plantas de acuerdo con los
parámetros de crecimiento evaluados durante esta etapa. La velocidad específica (VE) de
cambio de los diferentes parámetros se presenta en el Cuadro 9.
– 50 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Figura 14. Cinética de desarrollo de las plantas durante la aclimatización. En (a), se representa la longitud de la raíz y de la parte aérea. En (b), el número de raíces
secundarias y de nudos. Los valores representan la media de 72 plantas ± desviación estándar.
Cuadro 9. Valores de velocidad específica de cambio de los cuatro parámetros de crecimiento de las plantas, evaluados durante la etapa de aclimatización.
Parámetro Primer mes Segundo mes
Raíz mas larga (cm/mes) 2.6 6.7
Parte aérea (cm/mes) 2.4 15.8
Raíces (número/mes) 2.9 10.4
Nudos (número/mes) 4.7 7.3
En el segundo mes se incrementó la VE de todos los parámetros de crecimiento, en
comparación con el primero; este efecto es común del proceso de aclimatización donde las
plantas modifican su fisiología y desarrollan nuevos tejidos y órganos para soportar las
nuevas condiciones ambientales principalmente de menor humedad ambiental
(Pospíšilová, 1999).
Al respecto, se sabe de la incapacidad de las plantas cultivadas in vit o para regular la
transpiración; esto se deriva de su cultivo dentro de contenedores cerrados para prevenir
la contaminación por microorganismos, lo que genera un ambiente de alta humedad en el
interior con valores cercanos al 100 % HR. En estas condiciones las plantas desarrollan
r
0
10
20
30
40
50
Inicio 1 mes 2 meses
Núm
ero
RAÍCESNUDOS
0
10
20
30
40
50
Inicio 1 mes 2 meses
Long
itud
(cm
)RAÍZ M AS LARGA
PARTE AÉREA
(a) (b)
– 51 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
estomas anormales en su morfología y fisiología, particularmente en la apertura y cierre de
las células guarda (Santamaría y col., 1993). Cuando las plantas son expuestas al
ambiente exterior, se enfrentan a condiciones de humedad menor y muy variable (del 40 –
90 % HR dependiendo de la hora del día y de la temporada del año). La falla en el
funcionamiento de los estomas ocasiona la pérdida rápida de humedad por transpiración,
si esta situación no es corregida de manera eficiente, las plantas pueden marchitarse
rápidamente y morir (Santamaría y Kerstiens, 1994; Pospíšilová, 1999).
La situación mencionada anteriormente, es la principal razón por la que el uso de la
micropropagación haya sido restringido en sistemas comerciales, ya que a menudo se
presenta un alto porcentaje de pérdidas o daños cuando las plantas son transferidas a
condiciones de invernadero o campo. Por lo que durante el transplante a condiciones ex
vitro, las plantas generalmente requieren algunas semanas de aclimatización con una
disminución gradual en la humedad del aire.
Por otra parte, los resultados correspondientes a la humedad relativa (HR) y potencial
hídrico (Ψ) en la atmósfera del sistema hidropónico se muestran en el Cuadro 10. Con
estos valores se pueden conocer los cambios de humedad en el medio, que sirven para
relacionar el movimiento másico del agua en el sistema sustrato–planta–aire; debido a que
el agua se moviliza en respuesta a diferencias en el Ψ (Salisbury y Cleon, 1994). Cuando
el Ψ es mayor en una región del sistema que en otra y no hay una barrera impermeable
que impida la difusión del agua, ésta se difunde desde la región con potencial elevado
(cercano a cero) a la de bajo potencial (de mayor valor negativo).
Generalmente en los contenedores sellados que se utilizan para el cultivo in vit o, la
humedad se mantiene cercana al 100 % HR (Aguilar y col., 2000). En estas condiciones el
potencial hídrico adquiere un valor cercano a cero. Al comparar este valor con el de la
cámara de incubación (-100 aproximadamente), se produce una diferencia de dos órdenes
de magnitud de Ψ. Este gradiente es tan grande que habría provocado una gran pérdida
de agua por transpiración a través de las hojas, de no haberse establecido un sistema
eficiente de aclimatización. El utilizar el sistema hidropónico con la apertura gradual de la
cubierta de plástico durante el tiempo de aclimatización, permitió reducir el gradiente de
r
– 52 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
potencial hídrico entre la atmósfera de la cámara y el medio de desarrollo de la planta; con
lo que se logró regular la pérdida de agua por transpiración.
Cuadro 10. Valores de humedad relativa (HR) y potencial hídrico (Ψ) dentro delsistema hidropónico y la cámara de incubación, durante las primeras c nco
semanas de aclima ización.
i
t
Semana 1 2 3 4 5
HR sistema hidropónico (%) 90.2 ± 1.2 81.0 ± 1.8 80.1 ± 1.6 75.3 ± 1.1 55.7 ± 1.3
Ψ (MPa) –14.1 –28.9 –30.4 –38.9 –80.3
HR cámara de incubación 47.2 47.3 47.8 48.7 45.0
Ψ (MPa) –103.0 –102.7 –101.2 –98.7 –109.5
Los valores de HR de sistema hidropón co es la media de diez unidades experimentales ± error estándar y los valores de la cámara de incubación son únicos. T = 298 K (25 °C).
l i
r
Por otro lado, la misma solución nutritiva pudo haber contribuido a amortiguar el cambio de
humedad mediante un equilibrio entre las fases líquido–vapor de la solución con el aire; a
esto podría atribuirse el hecho de que en la quinta semana de aclimatización, a pesar de
que ya se habían abierto las bolsas que cubrían las plantas, la humedad del sistema (55.7
% HR) se mantuvo por arriba del valor de la cámara de incubación (47.2 % HR). No
obstante, bajo estas condiciones se logró tener el 100 % de supervivencia de las 72
plantas aclimatizadas en el sistema hidropónico.
Otros factores que pudieron haber influido en el desarrollo lento de la planta durante el
primer mes fueron: ausencia de fuente de carbono en el medio nutritivo, la baja capacidad
fotosintética de la planta y la acumulación de CO2 en el interior del frasco. Se ha reportado
que en las condiciones del cultivo in vitro, altas concentraciones de sacarosa en el medio
de cultivo y la acumulación de CO2 pueden limitar el desarrollo del sistema fotosintético en
las hojas (Davies y Santamaría, 2000). En el cultivo in vit o de A. elegans se adicionó
sacarosa como fuente de carbono, con lo cual la planta no requería realizar la fotosíntesis,
o hacerlo en una pequeña cantidad (cultivo mixotrófico); sin embargo, cuando las plantas
fueron transferidas a la solución nutritiva del sistema hidropónico (que no contenía
– 53 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
sacarosa), la planta se vio obligada a reactivar su capacidad de fijación de CO2 mediante
su sistema fotosintético (cultivo autotrófico).
Al comparar el desarrollo de las plantas en el segundo mes con respecto al primero, se
observó una tendencia de incremento en todos los parámetros de crecimiento. La VE de la
longitud de las partes aéreas se incrementó casi siete veces (Cuadro 9), sin embargo, la
VE del número de nudos sólo se incrementó casi al doble; lo que indicó que las plantas
presentaron un crecimiento principalmente en las secciones internodales, pero no en
cuanto al número de nudos. Por otro lado, la VE de la raíz más larga se incrementó en una
magnitud poco más del doble; y la del número de raíces secundarias aumentó a poco más
del triple, en comparación con la VE del primer mes. Estos parámetros indicaron que
durante esta etapa de aclimatización las raíces y partes aéreas se desarrollaron
vigorosamente.
6.1.6 Desarrollo en invernadero y cosecha
En la Figura 15 se presenta una imagen de las plantas en el invernadero. La cobertura con
malla resultó útil como barrera contra plagas al no presentarse ningún ataque masivo de
insectos en las plantas durante su cultivo. Las condiciones promedio dentro del
invernadero fueron: 23 °C de temperatura, 55 % de HR y 1554 µmol m-2 s-1 de irradiancia
(bajo la malla). Después de cinco meses de cultivo, se observó en las plantas que las
guías mas largas alcanzaron una altura de 1.33 m (promedio de 50 plantas). Dado que
todas las plantas se podaron a una altura de 0.1 m al inicio del cultivo en invernadero,
aumentaron casi 14 veces su longitud; sin embargo, este crecimiento no es sorprendente
ya que se trata de una planta que desarrolla lianas que le sirven para trepar. Incluso podría
esperarse un mayor crecimiento de no tener restricción para seguir trepando; ya que en
este caso, después de haber alcanzado la altura máxima del tutor (1.20 m) se observó una
tendencia a la disminución en el crecimiento.
– 54 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Figura 15. Imagen de las plantas de A. elegans en el quinto mes de cul ivo en el invernadero.
t
t
De las 72 plantas cultivadas, 22 se mantuvieron vivas como reserva y las 50 restantes se
cosecharon para la preparación de extractos. En el Cuadro 11 se presentan las cantidades
del material vegetal seco y molido que se obtuvo en la cosecha.
Cuadro 11. Material vegetal cosechado de plantas cul ivadas de A. elegans.
Partes aéreas Raíces
Total 50 plantas base seca (g) 380.90 115.50
Humedad (%) 8.18 7.76
– 55 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.2 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA
6.2.1 Obtención de extractos
En el Cuadro 12 se presentan los rendimientos de extracción que se obtuvieron a partir del
material vegetal proveniente de la micropropagación de A. elegans. Se observó que los
extractos metanólicos de raíces presentaron una consistencia viscosa de color ámbar y de
partes aéreas con color verde; en contraste, los extractos hexánicos presentaron una
consistencia pastosa de olor penetrante y color amarillento.
Cuadro 12. Rendimientos de extracción de las plantas cul ivadas de A. elegans. t
Extracto hexánico
EH (%)
Extracto metanólico
EM (%)
Partes aéreas (PA) 0.83 18.06
Raíces (RA) 0.37 9.44
Con los extractos hexánicos se obtuvieron rendimientos bajos a diferencia de los extractos
metanólicos, en los que se obtuvieron rendimientos altos para PA y RA equivalente en
proporción a 21 y 25 veces mayor respectivamente.
Los rendimientos de extracción a partir de raíces son diferentes a los reportados por
Jiménez (2004) de raíces silvestres (0.57 % EH y 5.50 % EM). Esta diferencia podría
atribuirse a la variabilidad estacional que influye en la composición química de las plantas,
donde las condiciones ambientales cambiantes, influyen en la biosíntesis y acumulación de
metabolitos. Un efecto semejante lo reportaron Vila y col. (1997), en un estudio de
compuestos volátiles de plantas de A. elegans, donde se analizaron hojas de dos meses
en diferentes estaciones del año, y se encontraron algunas diferencias en la composición
del aceite esencial principalmente de sesquiterpenos (72.8 y 85.1 % respectivamente) que
lo atribuyó a una mayor actividad enzimática en el estado de floración de una de las
muestras.
– 56 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.2.2 Cuantificación de la contracción inducida por el veneno
Con base en los resultados de la primera curva (Figura 16a), se estableció que dentro del
intervalo de 10–100 µg/ml de veneno se podría encontrar el valor máximo de respuesta;
mientras que con la segunda curva (Figura 16b) se encontró que 40 µg/ml fue la
concentración con la que se obtuvo la mayor respuesta de contracción.
0 20 40 60 80 100
Concentración de Veneno (µg/mL)
0
20
40
60
80
1 10 100 1000
Concentración de Veneno (µg/mL)
Con
tracc
ión
de T
ejid
o (%
)
(b)(a)
F gura 16. Efecto de la concentración de veneno de alacrán sobre la contracción del íleon. En (a) la primera curva de la respuesta de contracción con
concentraciones en intervalos logarítmicos y en (b), la segunda curva en el intervalo de concentración de 10-100 µg/ml. Los valores representan la media
de tres determinaciones ± error estándar.
i
Asimismo, en las respuestas de contracción del íleon se observaron tendencias de tipo
sigmoidal; en la Figura 16b, se pueden identificar las tres fases características de este tipo
de curvas (Williamson y col., 1998): la primera es una corta fase estacionaria en la
respuesta con las concentraciones de 10 a 20 µg/ml donde se alcanzó el umbral de
recepción del estímulo; la segunda fase de 20 a 40 µg/ml, que se caracteriza por la
tendencia lineal en la gráfica donde hay un incremento de la respuesta directamente
proporcional a la concentración donde alcanza un valor máximo de respuesta, que se
puede atribuir a una saturación de los receptores que perciben el estímulo; y finalmente la
tercera fase de 40 a 100 µg/ml, en donde la respuesta se mantiene constante a pesar del
incremento de la concentración de veneno. Con base en estos resultados, se estableció el
valor de concentración de veneno de 40 µg/ml para las pruebas de relajación.
– 57 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.2.3 Prueba de relajación
En la gráfica de la Figura 17 se muestran dos registros superpuestos típicos,
correspondientes a las respuestas de la prueba de relajación; en total se obtuvieron 144
registros de esta naturaleza para las concentraciones y extractos ensayados. La curva (A)
es la referente a la aplicación de veneno (40 µg/ml), donde se observa la contracción
sostenida del íleon; mientras que la curva (B), se refiere a la aplicación del veneno (40
µg/ml) al tiempo cero + la aplicación del extracto a los 0.5 min, que provocó la relajación
hasta los 2 min, que es el tiempo total en que dura la prueba.
Cabe mencionar que con las concentraciones más altas de extractos (250-300 µg/ml) se
observó que el efecto de relajación continuó aumentando aún después de los 2 min; sin
embargo, no se corrió la prueba en tiempos mayores, debido a que con concentraciones
bajas (50 y 100 µg/ml) no se presentó una respuesta de relajación importante, y el efecto
prolongado del veneno podría haber dañado el íleon, e incluso provocarle la muerte. De
estos registros se obtuvieron los valores de relajación correspondientes a cada
determinación, los cuales se presentan en el Cuadro 13.
Fuer
za d
e C
ontra
cció
n (g
)
4
0.5 0.0 2.0
1 B
A
7
Tiempo de aplicación (min)
Figura 17. Dos registros sobrepuestos de la prueba de relajación. En (A) la respuesta de contracción por aplicación del veneno (40 µg/ml y en (B), la respuesta de relajación por la aplicación del veneno (40 µg/ml) + extracto
metanólico de partes aéreas (200 µg/ml).
)
– 58 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cuadro 13. Efecto de los extractos de las partes aéreas y raíces de A. eleganssobre la relajación del íleon contraído por efecto del veneno de alacrán.
CONCENTRACIÓN (µg/ml) EXTRACTO
50 100 150 200 250 300
EH – PA -0.17 ± 8.45 b 5.46 ± 6.71b 31.73 ± 7 .48 a 38.15 ± 3.16 a 39.96 ± 4.17 a 45.04 ± 4.28 a
EH – RA 15.14 ± 4.36 a 24.38 ± 7.13 a 35.56 ± 5 .16 a 39.05 ± 5.29 a 39.26 ± 8.90 a 42.32 ± 10.58 a
EM – PA -2.43 ± 4.88 c 13.44 ± 8.26 c 42.63 ± 13.58 b 58.99 ± 8.79 ab 74.38 ± 6.68 ab 73.17 ± 4.59 a
EM - RA 0.07 ± 8.04 b 10.91 ± 13.55 b 35.81 ± 9 .94 a 57.04 ± 3.74 a 57.40 ± 3.92 a 65.60 ± 7.93 a
r
l
Los valores de relajación representan la media de seis dete minaciones ± error estándar. En cada reng ón, los valores seguidos por diferente letra son significativamente diferentes (prueba
de Tukey, α=0.05). EH = extracto hexánico; EM = extracto metanólico; PA = partes aéreas; RA = raíces.
Dentro de los resultados del análisis estadístico, en la comparación de la variable
CONCENTRACIÓN en los diferentes extractos, se encontraron diferencias significativas
principalmente entre los valores más altos (300 y 250 µg/ml) con respecto a los más bajos
(50 y 100 µg/ml); y una zona de transición con las concentraciones de 150 y 200 µg/ml. El
extracto EH-RA fue la excepción de ésta tendencia, ya que no se encontraron diferencias
significativas en los valores de ninguna de las concentraciones.
En la comparación de la variable EXTRACTO, se encontraron diferencias significativas en
EM-PA con respecto al EH-PA. Es importante notar que cada tipo de extracto (metanólico
y hexánico), está constituido por uno o más compuestos activos (polares y no polares
respectivamente), inmersos en una mezcla compleja del resto de las sustancias extraídas.
El efecto de los extractos en la relajación del íleon se representan como curvas de
concentración–respuesta en las gráficas de la Figura 18, donde se incluyó una gráfica de
los resultados que obtuvo Jiménez (2004) con el extracto hexánico de raíces silvestres de
A. elegans.
– 59 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
50 100 150 200 250 300
Concentración de Extracto (µg/mL)
Rel
ajac
ión
de T
ejid
o (%
)
Extracto Metanólico Partes Aéreas (EM-PA)
Extracto Metanólico Raíces (EM-RA)
Extracto Hexánico Partes Aéreas (EH-PA)
Extracto Hexánico Raíces (EH-RA)
Extracto Hexánico Raíces Silvestres
Figura 18. Efecto de relajación del íleon (contraído por acción del veneno de alacrán), como resul ado de la aplicación de los extractos en diferentes
concentraciones. Los valores representan la media de seis determinaciones ± error estándar. La línea más gruesa corresponde con la curva del Extracto
Hexánico de raíces de plantas silvestres reportado por Jiménez (2004) y en el reporte original los valores representan la media de cinco determinaciones.
t
En general, se observan curvas con tendencia concentración–dependiente; es decir que el
incremento de la concentración de extracto provoca un incremento en la respuesta de
relajación; lo cual es una respuesta semejante al efecto que se mencionó en la prueba de
contracción de veneno.
– 60 –
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En las gráficas, también se pueden identificar las tres fases características de curvas de
tipo sigmoidal: la primera es una corta fase estacionaria donde se alcanzó el umbral de
recepción del estímulo; la segunda fase que se caracteriza por la tendencia lineal en la
gráfica donde hay un incremento de la respuesta directamente proporcional a la
concentración con un valor máximo de respuesta que se puede atribuir a la saturación de
los receptores que perciben el estímulo; y finalmente la tercera fase en que la respuesta se
mantiene constante a pesar del incremento de la concentración de extracto, precisamente
por la saturación de esos receptores (Williamson y col., 1998).
Jiménez (2004) evaluó la actividad relajante sólo de raíces de plantas silvestres y la
tendencia del EH que reportó (Figura 18), es semejante a los valores de relajación
obtenidos con los extractos de las plantas cultivadas. Una contribución interesante del
presente trabajo, son los resultados del extracto metanólico de partes aéreas; con los que
se alcanzó la mayor respuesta de relajación sobretodo en concentraciones de 250 y 300
µg/ml, incluso aparentemente mayores a los observados por Jiménez (2004) en raíces. Por
esta razón, el EM-PA se considera un prospecto interesante para la búsqueda de
compuestos bioactivos provenientes de A. elegans.
La evidencia experimental acumulada en el presente trabajo, indica que los extractos
(metanólico y hexánico) de las plantas de A. elegans obtenidas por micropropagación y
posterior cultivo en invernadero, presentaron actividad relajante en íleon de cobayo
contraído por efecto del veneno de alacrán, semejante a la actividad de las plantas
silvestres reportada en la literatura. Estas evidencias sugieren que las plantas de A.
elegans en campo o en invernadero, tienen la característica de producir de manera
constitutiva los compuestos bioactivos como estrategia de supervivencia, como se ha
reportado en especies de otros géneros (Dixon, 2001; Wittstock y Gershenzon, 2002).
– 61 –
CONCLUSIONES • El protocolo de desinfestación establecido permitió el 100 % de desinfestación de
semillas de A. elegans, de las cuales el 93 % germinaron.
• Mediante el uso de yemas axilares en el medio de cultivo MS al 100 % adicionado
con BAP 10 µM, se logró la inducción del mayor número de brotes y de mayor
tamaño.
• La presencia de ANA 0.5 µM en el medio de cultivo no indujo la brotación; y su
combinación con BAP disminuyó la capacidad de inducción de brotes de éste último.
• El tratamiento con AIB 1.5 µM indujo la formación del mayor número de raíces.
• Durante la aclimatización de las plantas, la apertura gradual de la cobertura de
plástico permitió la reducción paulatina del gradiente del potencial hídrico en el
ambiente del sistema hidropónico.
• Se logró el 100 % de supervivencia de las plantas después de la aclimatización.
• Se obtuvo mayor rendimiento en la extracción con metanol que con hexano.
– 62 –
• Los extractos (hexánicos y metanólicos) obtenidos de plantas cultivadas de A.
elegans, presentaron la capacidad de relajar de manera dependiente de la
concentración, el íleon de cobayo contraído por efecto del veneno de alacrán.
• Los valores de la respuesta de relajación de 300 y 250 µg/ml de los diferentes
extractos fueron mayores y significativamente diferentes a los de 50 y 100 µg/ml.
• Con la metodología establecida para la micropropagación de A elegans y su
crecimiento en invernadero, se obtuvieron plantas con la capacidad de relajar en íleon
aislado de cobayo, la contracción inducida por efecto del veneno de alacrán (C.
limpidus limpidus), de manera semejante a la reportada para plantas silvestres.
.
– 63 –
PERSPECTIVAS
• Con respecto a la micropropagación, para tratar de incrementar la inducción de brotes
por explante, se sugiere estudiar el efecto de mayores concentraciones de BAP que
10 µM, con lo que se podría obtener un mayor número de plantas micropropagadas.
Por otro lado, estudiar la propagación in vit o mediante el cultivo de micro-estacas sin
el uso de fito-reguladores, podría facilitar el manejo del proceso e incluso disminuir el
costo de producción.
r
.
• En el proceso de aclimatización, el cultivo de A. elegans en el sistema hidropónico
podría ser un modelo interesante desde el punto de vista fisiológico, dado que se
logró el 100% de supervivencia de las plantas. Esta característica permitiría estudiar
la recuperación de la función estomatal y fotosintética de esta especie, para contribuir
al conocimiento de este fenómeno tan crítico en los sistemas comerciales de
micropropagación de otras plantas.
• Con relación al cultivo de las plantas de A elegans en invernadero, una de las
perspectivas de este trabajo sería evaluar la relación que existe entre la edad de la
planta y la producción de compuestos bioactivos. Otra perspectiva sería aplicar
diferentes elicitores bióticos y abióticos para inducir el metabolismo secundario en las
plantas, buscando incrementar la producción de compuestos con actividad
farmacológica. Adicionalmente, se sugiere cultivarlas en diferentes estaciones del
año dentro del invernadero, para evaluar la posible variación estacional de la
producción de los compuestos bioactivos. Con los extractos obtenidos de cualquiera
de estos experimentos, se podría evaluar la respuesta fisiológica en algún modelo
biológico.
– 64 –
• Por otro lado, se sugiere que mediante el fraccionamiento de los extractos se realice
el aislamiento e identificación de algunos compuestos, principalmente de los
extractos metanólicos de partes aéreas que fue con los que se obtuvo la mayor
respuesta de relajación en este trabajo. Asimismo, evaluar los perfiles químicos de
producción en plantas cultivadas en diferentes condiciones como las que se
mencionó en el punto anterior. Estos estudios químicos se podrían dirigir sólo a
aquellas fracciones en las que previamente se haya encontrado una actividad
importante como antagonista del efecto del veneno de alacrán; utilizando por ejemplo,
el modelo del íleon aislado de cobayo.
• Para dar continuidad a las pruebas de actividad de las plantas cultivadas, se sugiere
la evaluación de los extractos completos o fraccionados en los modelos biológicos
adecuados, como antagonistas de otros efectos del veneno de alacrán; como por
ejemplo: dosis letal media, respuesta inflamatoria, frecuencia y fuerza de contracción
cardiaca, etc.
• Estos estudios serían importantes para contribuir con la validación del uso de plantas
cultivadas de A. elegans, como punto de partida en la búsqueda de agentes
terapéuticos para el alivio de los efectos del envenenamiento por picadura de alacrán.
– 65 –
BIBLIOGRAFÍA
Achenbach, H., Navarro, C., Navarro., A. 2002. Use of extracts from Aristolochia in the treatment of AIDS. United States, Patent Aplication Publication No. US 2002/0099086A1.
Aguilar, M.L., Espadas, F.L., Coello, J., Maust, B.E., Trejo, C., Robert, M.L., Santamaría, J.M. 2000. The role of abscisic acid in controlling leaf water loss, survival and growth of micropropagated Tage es erecta plants when transferred directly to the field. Journal of Experimen al Botany. 51:1861-1866.
tt
Avilés, M., Suárez, G. 1994. Catálogo de plantas medicinales del jardín etnobotánico. INAH, Morelos. pp: 18.
Blumenthal, M. 2000. Interactions between herbs and conventional drugs: introductory considerations. Herbalgram. 49:52-63. [En línea] Disponible: www.herbalgram.org/ herbalgram/articleview.asp?a=2262
Bravo, C., Yormann, B., Llorente, B. 1999. Micropropagation of Aristolochia fimbria a Cham. Acta Horticulturae (ISHS). 502:339-346.
t
fr
)
Broussalis, A.M., Ferraro, G.E., Martino, V.S., Pinzón, R., Coussio, J.D., Calle, A.J. 1999. Argentine plants as potential source of insecticidal compounds. Journal o Ethnopha macology. 67:219-223.
Bye, R., Estrada, L.E., Linares, M.E. 1992. Recursos genéticos en plantas medicinales de México, pp. 361-369. En: Estrada, L.E. (ed.), Plantas medicinales de México Introducción a su estudio. Unidad de estudios etnobotánicos, Departamento de Fitotecnia, Universidad Autónoma Chapingo. 4ª ed. México.
Bye R.; Linares, E., Estrada, E. 1995. Phytochemistry of Medicinal Plants, pp. 65-82. In: Arnason, J.T., Mata, R., Romeu, J.T. (Eds.), Recent Advances in Phytochemistry. Plenum Press, New York.
Cabrera, M.L. 1996. Remedios caseros con las yerbas y plantas curativas de México. Editores mexicanos unidos, S.A. 5ª ed. México. pp: 26-27.
Camacho, U.D. 1990. Estudio químico de Aristolochia littoralis. Tesis de maestría. Facultad de Química, UNAM. México. 91 pp.
Castellanos, P. 2002. La herbolaria mexicana, un proyecto ambicioso. Entrevista con el Dr. Erick Estrada Lugo. Herbolaria Universal. 37:60-62.
Chandra, V., Jasti, J., Kaur, P., Srinivasan, A., Betzel, Ch., Singh, T.P. 2002. Structural basis of phospholipase A2 inhibition for the synthesis of prostaglandins by the plant alkaloid aristolochic acid from a 1.7 Å crystal structure. Biochemistry. 41:10914-10919.
Chawla, H.S. 2002. Introduction to plant biotechnology. Science Publishers, Inc. Enfield (NH) USA; Plymouth, UK. pp: 18.
Conabio. 1998. La diversidad biológica de México: estudio del país. Comisión Nacional para el Conocimiento y uso de la Biodiversidad, México. pp: 127.
Craker, L.E. 1999. Trends in medicinal and aromatic plants production in the U.S.A. Acta Horticulturae (ISHS . 502:71-75.
Davies, W.J. y Santamaría, J.M. 2000. Physiological markers for microplant shoot and root quality. Acta Horticulturae. (ISHS). 530:363-376.
– 66 –
Dehesa, D.M., Alagón, A., Possani, L.D. 1995. Clinical toxicology of scorpion sting, pp. 221-
238. En: Jürg Meir Julian White (ed.), Clinical toxicology of animal venoms and poisons. CRC Press, USA.
Dixon, A.R. 2001. Natural products and plant disease resistance. Nature. 411:843-847.
El-Sebakhy, N; Waterman, PG. 1984. (-)-(R,R)-7'-O-methylcuspidaline from the leaves of Aristolochia elegans. Phytochemis ry. 23:2706-2707. t
r
r r
El-Sebakhy, N; Richomme, P; Taaima, S; Shamma, M. 1989. (-)-Temuconine, a new bisbenzylisoquinoline alkaloid from Aristolochia elegans. Journal of Natural Products. 52:1374-1375.
El-Tahir, K.E.H. 1991. Pharmacological actions of magnoflorine and aristolochic acid-1 isolated from the seed of Aristolochia b acteata. International Journal of Pharmacognosy. 29:101-111.
Estrada, L.E., Marín, A.C., Quintana R.V., Paz, A. 1992. Germinación y fenología, pp. 397-410. En: Estrada, L.E. (ed.), Plantas medicinales de México Introducción a su estudio. Unidad de estudios etnobotánicos, Departamento de Fitotecnia, Universidad Autónoma Chapingo. 4ª ed. México.
Estrada, L.E., Morales, B.J.L. 2002. La prodigiosa yerba del sapo. Edimich Inter writers. México. pp. 117-142.
Gadhi, CA; Benharref, A; Jana, M; Basile, AM; Contet-Audonneau, N; Fortier, B. 2001. Antidermatophytic properties of extracts from the leaves of Aristolochia paucinervis Pomel. Phytotherapy Research. 15:79-81.
Haruna, A.K., Choudhury M.K. 1997. Antispasmodic property of the aqueous extract of Aristolochia albida Dutch. Phytothe apy Resea ch. 11:527-528.
Hernández F. 1959. Historia de las plantas de Nueva España, en: Historia Natural de la Nueva España, Obras Completas Tomo III. Universidad Nacional Autónoma de México. México.
Hoagland, D.R., Arnon, D.I. 1950. The water culture method of growing plants without soil. California Agriculture Experiment Station Circular 347.
Hutt, M.J., Houghton, P.J. 1998. A survey from the literature of plants used to treat scorpion stings. Journal of Ethnoparmacology. 60:97-110.
Jiménez, F.J.E. 2004. Evaluación farmacológica de especies vegetales utilizadas en la Medicina Tradicional Mexicana contra la picadura de alacrán. Tesis de doctorado. División de Ciencias Biológicas, Universidad Autónoma Metropolitana unidad Iztapalapa. México. 85 pp.
Kelly, L.M. 2000. Flora del Valle de Tehuacán-Cuicatlán. Aristochiaceae Juss. Instituto de Biología, UNAM 29:1-88.
Lemos, V.S., Thomas, G., Barbosa, J.M.F. 1993. Pharmacological studies on Aristolochia papillaris Mast. (Aristolochiaceae). Journal of Natural Products. 40:141-145.
Loew, D., Kaszkin, M. 2002. Approaching the problem of bioequivalence of herbal medicinal products. Phytoteraphy Research. 16:705-711.
Lozoya, S.H. 1985. Micropropagación de especies herbáceas, pp. 65-79. En: Robert, L.M. y Loyola, V.M. (eds.), El cultivo de tejidos vegetales en México. CICY-CONACYT. 1ª ed. México.
Lozoya X, Aguilar A, Camacho JR. 1987. Encuesta sobre el uso actual de plantas de la medicina tradicional mexicana. Revista Médica del IMSS. 25:283-291.
– 67 –
Manjula, S; Thomas, A; Daniel, B; Nair, G.M. 1997. In vitro plant regeneration of Aristolochia
indica through axillary shoot multiplication and organogenesis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 51:145-148.
Martínez, M. 1959. Las plantas medicinales de México. Ediciones Botas. pp: 268-276.
Massieu, Y., Chapela, F. 2002. Acceso a recursos biológicos y bio-piratería en México. El Cotidiano. UAM-I 114:72-87.
Mebs, D., Schneider, M. 2002. Aristolochic acid content of South-East Asian troidine swallowtails (Lepidoptera: Papilionidae) and of Aristolochia plant species (Aristolochiaceae). Chemoecology. 12:11-13.
Moncaleán, P., Rodríguez, A., Fernández, B. 2003. Effect of different benzyladenine time pulses on the endogenous levels of cytokinins, indole-3-acetic acid and abcisic acid in micropropagated explants of Actinidia deliciosa. Plan Physiology and Biochemistry. 41:149-155.
t
r
t
Mongelli, E., Pampuro, S., Coussio J., Salomon, H., Ciccia, G. 2000. Cytotoxic and DNA interaction activities of extracts from medicinal plants used in Argentina. Journal of Ethnopha macology. 71:145-151
Monrroy, O.C., Castillo, E.P. 2000. Plantas medicinales utilizadas en el estado de Morelos. Centro de Investigacion en Biotecnología (CEIB), Universidad Autónoma del Estado de Morelos (UAEM). México. pp. 47.
Montoya, C.M.A. 1996. Alacranismo. Gaceta Médica de México. 132:645-648.
Murashige, S.T. y Skoog, F. 1962. A revised médium for rapid growth and bioassays with tobaco tissue culture. Physiolgy Plant. 15:473-497.
Murillo, A.J.I., Encarnación, D.R., Franzblau, S.G. 2001. Antimicrobial and cytotoxic activity of some medicinal plants from Baja California Sur (México). Pharmaceutical Biology. 39:445-449.
Ortega, O.J.F., Ortega, O.R. 1997. Aristolochiaceae. Flora de Veracruz. INIREB. Fascículo 99. pp: 30.
Ortuño, A., Oncina, R., Botia, J.M., Del Río, J.A. 1999. Regulation of the diosgenin expresión in Trigonella foenum-graecum plants by different plant growth regulators. Food Chemistry. 65:227-232.
Osnaya, R.N., Medina, H.T.J., Flores, H.S.S., León, R.G. 2001. Clinical symtoms observed in children envenomated by scorpion stings, at the children´s hospital from state of Morelos, México. Toxicon. 39:781-785.
Otero, R., Nunez, V., Barona, J. 2000. Snakebites and ethnobotany in the northwest region of Colombia: part III: neutralization of the haemorrhagic effect of Bothrops atrox venom. Journal of E hnopharmacology. 73:233-241.
Padilla, A., Govezensky, T., Possani, L.D., Larralde, C. 2003. Experimental envenoming of mice with venos from the scorpion Centruroides limpidus limpidus: differences in mortality and symptoms with and without antibody therapy relating to differences in age, sex and strain of mouse. Toxicon. 41:959-965.
Pelczar, J.M., Reid, D.R., Chan, C.S.E. 1982. Microbiología. Ed Mc Graw-Hill. 2ª ed. México. pp: 389-407.
Pelt, J.M. 1992. Las plantas medicinales florecen de nuevo, pp. 499-504. En: Estrada, L.E. (ed.), Plantas medicinales de México Introducción a su estudio. Unidad de estudios
– 68 –
etnobotánicos, Departamento de Fitotecnia, Universidad Autónoma Chapingo. 4ª ed. México.
Pospíšilová, J., Tichá, I., Kadleček, P., Haisel, D., Plzáková, Š. 1999. Acclimatization of micropropagated plants to ex vitro conditions. Biologia Plantarum. 42:481-497.
Possani, D.L., Becerril, B., Delepierre, M., Tytgat, J. 1999. Scorpion toxins specific for Na+-channels. European Journal of Biochemistry. 264:287-300.
Rangel, H., Gómez, H. 1997. El alacrán, crán crán... ayyy the va a picar. Salvia. 15:1-2.
Raskin, I., Rignicky, M.D., Komamytsky, S., Ilic, N., Poulev, A., Borisjuk, N., Brinker, A., Moreno, A.D., Ripoll, C., Yakoby, N., O´neal, M.J., Comwell, T., Pastor, I., Friendler, B. 2002. Plants and human health in the twenty-first century. Trends in Biotechnology. 20:522-531.
Rates, S.M.K. 2001. Plants as source of drugs. Toxicon. 39:603-613.
Reyes, Ch.R. 1995. Química de las plantas alexíteras. Interciencia. 20:257-264.
Rivera, A.E. 1999. Investigación reciente sobre plantas medicinales mexicanas. Arqueología Mexicana. 7:54-59.
Robert, M.L., Arce, M.M., Eastmond A. 1993. Biotecnología Vegetal, pp: 69-102. En: García, G.M., Quintero, R.R., López-Munguía, C.A. (eds.), Biotecnología Alimentaria. Ed. Limusa, grupo Noriega Editores 1a ed. México.
Rojas, A.M. 1998. Etimología náhuatl y usos de las plantas medicinales en Xoxocotla, Mor, Mex. Ed. Thahui. Cuernavaca.
Rojas, De la P. V.M. 2000. Alacaloides y otros compuestos nitrogenados de Aristolochia asclepiadifolia. Tesis de licenciatura. Facultad de Química, UNAM: México. pp: 48.
Rojas, De la P.V.M. 2002. Validación de actividad biológica y caracterización de componentes del género Aristolochia. Tesis de maestría. Facultad de Química, UNAM: México. pp: 67.
Rout, G.R., Samantaray, S., Das, P. 2000. In vitro manipulation and propagation of medicinal plants. Biotechnology Advances. 18:91-120.
Salisbury, B.F., Ross, W.C. 1994. Plant Physiology. 4a ed. Wadsworth Pub. U.S.A. pp. 15-207.
Samuelsson, G. 1991. Assays for pharmacological activity: non-specific assays, pp. 261-275. In: Methods in plant biochemistry. Academic Press Limited, vol. 6. U.K.
Santamaría, J.M., Davies, W.J., Atkinson, C.J. 1993. Stomata of micropropagated Delphinium plants respond to ABA, CO2, light and water potential, but fail to close fully. Journal of Experimen al Botany. 44:99-107. t
Santamaría, J.M., Kerstiens, G. 1994. The lack of control of water loss of micropropagated plants is not related to poor cuticle development. Physiologia Plantarum. 91:191-195.
Secretaría de Salud. 2004. Anuarios de morbilidad. [En línea] Disponible: www.dgepi.salud.gob.mx/infoepi/index.htm
Shafi, P.M., Rosamma, M. K., Jamil, K., and Reddy, P. S. 2002. Antibacterial activity of the essential oil from Aristolochia indica. Fitoterapia. 73:439-441.
Shi, L.S., Kuo, P.Ch., Tsai, Y.L., Damu, A.G., Wu, T.S. 2004. The alkaloids and other constituents from the root and stem of Aristolochia elegans. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 12:439-446.
Sime, K.R, Feeny, P.P. 2000. Sequestration of aristolochic acids by the pipevine swallowtail, Battus philenor (L.): Evidence and ecological implications. Chemoecology. 10:169-178.
– 69 –
Stermitz, R.F., Lorenz, P., Tawara, N.J., Zenewicz, A.L., Lewis, K. 2000. Synergy in a
medicinal plant: antimicrobial action of berberine potentiated by 5’-methoxyhydnocarpin, a multidrug pump inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97:1433-1437.
Svensson, M. 2000. Effect of irradiance level during in vitro propagation of Aristolochia manchuriensis. Acta Horticulturae (ISHS). 530:403-410.
Tabuti, J.R.S., Lye, K.A., Dhillion, S.S. 2003. Tradicional herbal drugs of Bulamogi, Uganda: plants use and administration. Journal of Ethnopharmacology. 88:19-44.
Taddei, B.G., Santillana, M.M., Romero, C.J., Romero, T.M. 1999. Aceptación y uso de herbolaria en medicina familiar. Salud Pública de México. 41:216-220.
Veerporte, H.M., Beck, E. 1998. Leaf alkaloid contents of Tabernaemontana pachysiphon as influenced by endogenous and environmental factors in the natural habitat. Planta Medica. 64:148-152.
Veerporte, R., Memelink, J. 2002. Engineering secondary metabolite production in plants. Current Opinion in Biotechnology. 13:181-187.
Ventura, Z.E. 1998. Estudios para la optimización de la cantidad, calidad y preservación de los embriones somáticos de alfalfa (Medicago sativa L. Var. A-70-34). Tesis doctoral. ECNB-Instituto Politécnico Nacional. México. pp: 111.
Ventura, Z.E., Salcedo, M.G., Hernández, L.A., Martínez, B.B., Jiménez, A.A., Trejo, T.G., De Jesús, S.A., Velázquez, D.V.M. 2001. Propagación in vitro y aclimatación de plantas de cúrcuma (Curcuma longa L.) en un sistema hidropónico. Memoria de Investigación 2001. Centro de Desarrollo de Productos Bióticos; Instituto Politécnico Nacional. México. pp. 34-42.
Vila, R., Mundina, M., Muschietti, L., Priestap, H.A., Bandoni, A.L., Adzet, T., Canigueral, S. 1997. Volatile constituents of leaves, roots and stems from Aristolochia elegans. Phytochemistry. 46(6)1127-1129.
Villarreal, M.L. 1993. Actualidad de la biotecnología vegetal con plantas medicinales, pp. 171-176. En: La investigación científica de la herbolaria medicinal mexicana. Secretaría de Salud. México.
Wheeler, C.N., Jech, K., Masters. S. 1992. Effects of genetic, epigenetic and environmental factors on taxol content in Taxus brevifolia and related species. Journal of Natural Products. 55:432-440.
Williamson, E. Okpak, T.D., Evans, J.R. 1998. Selection, preparation and pharmacological evaluation of plant material. Willey and Sons. Vol. I. 2a ed. U.K. pp. 25-27, 169-189.
Wink M. 1999. Functions of plant secondary metabolites and their exploitation in biotechnology. CRC Press. USA. 376 pp.
Wink, M. 2003. Evolution of secondary metabolites from an ecological and molecular phylogenetic perspective. Phytochemistry. 64:3-19.
Wittstock, U., Gershenzon, J. 2002. Constitutive plant toxins and their role in defense against hervivores and pathogens. Current Opinion in Plant Biology. 5:300-307.
Wu, T.S., Tsai, Y.L., Wu, P.L., Lin, F.W., Lin, J.K. 2000. Constituents from the Leaves of Aristolochia elegans. Journal of Natural Products. 63:692-693.
Wu, T.S., Tsai, Y.L., Damu, A.G., Kuo, P.Ch., Wu, P.L. 2002. Constituents from the root and stem of Aristolochia elegans. Journal of Natural Products. 65:1522-1525.
– 70 –
Top Related