Múltiples características físicas de cada sola célula en forma simultanea.
Estas características de las células son evaluadas debido a que las células pasan de forma individual por un sistema de fluido que permite un flujo de 500 a 4,000 células por segundo.
Citometría de flujo
Muestra
Fluido
Cámara defluido
LentesRayo deLuz
QUE NOS PUEDE DECIR LA CITOMETRIA DE FLUJO DE CADA CELULA?
� Su tamaño relativo. (Forward scatter-FSC)
� Su granularidad o su complejidad citoplasmática. (Side scatter-SSC)
� Su intensidad de fluorescencia relativa. (FL1, FL2, FL3 o FL4)
COMO DETECTA EL CITOMETRO ESTAS CARACTERISTICAS SOBRE LA CELULA?
El citómetro de flujo detecta la interacción entre una célula y un rayo láser. La forma que la célula:
� Desvía la luz incidente.
� Emite fluorescencia.
El como la célula desvía los rayo de luz nos da información acerca del tamaño y la granularidad de cada célula.
Dispersión lateral (SSC)
Dispersión frontal(FSC)LASER
Laser
Amplificador Lentes
Muestra
PRINCIPIOS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
Flu
jo
Dispersion
Lateral
Frontal
¿Qué es un fluorocromo?
• El fluorocromo absorbe la luz del láser
• El fluorocromo emite un rayo luminoso de diferente longitud de onda
488 nm
Luz Luz Fluorescente Fluorescente
EmitidaEmitida
Luz Luz IncidenteIncidente
Molécula de
Fluoresceína
530 nmHO
CO2H
O
Fluorescencia
Intensidad de Fluorescencia Emitida = Sitios de Unión
FITCFITC FITCFITC
FITC
FITCFITC
FITCFITC
FITCFITC
FITCFITC
FITCFITC
FITCFITC
FITCFITC
Intensidad Fluorescente
Número de Eventos
TABLA DE PRINCIPALES FLUOROCROMOS UTILIZADOS EN CIT OMETRÍA DE FLUJO
Fluorocromos Aplicación Excitación (nm)
Emisión (nm)
7-amino Actinomycin D 7-AAD ADN, viabilidad 546 647 Aloficocianina APC IF proteínas 650 660 DAPI ADN 345 455 Fluoresceína FITC IF proteínas 495 519 Ficoeritrina PE IF proteínas 480 ; 565 578 Hidroxicumarina IF proteínas 325 386 Hoechst 33342 ADN 343 483 Mitramicina ADN 445 575 Naranja de Acridina AND/ARN 503 530/640 Peridinina Clorofila PerCP IF proteínas 490 675 Rojo Texas IF proteínas 589 615 Yoduro de Propidio PI ADN, viabilidad 536 617 X-Rodamina XRITC Mitocondría 495 519
FL1FL1
SSCSSC
FL3FL3
670LP
585/42
488/10
488/10
.488 nmLaser azul
FL2FL2
530/30
CCáámaramaraDe flujoDe flujo
FSCFSC
Optica – Fluorescencia
Finalmente la señal análoga de voltaje es pasada a una señal digital numérica que se expresa
en “Canales”
Event 1
Event 2
Event 3
FSC SSC FL1 FL2
30 60 638 840
100 160 245 85
300 650 160 720
List-Mode
Señal digital Resolución0 – 256 0 –1024
Fotones
PRESENTACION DE LOS DATOS
• Gráficas: Histograma y de distribuciónen dos dimensiones.
• Tablas de números
• Valores relativos y absolutos (perlas)
HistogramaHistograma
10005000
Nú
mer
o d
e C
élu
las
510500490
Incremento en intensidad
Voltios transformados a “Canales de intensidad”
IgM (-) IgM (+)
M1M2
Negativas Low Intemediate High
M1
FL-4
FSC
FL-3
FL-2
FL-1
SSC
eje xE
je y
Tamaño relativoFSC
Com
plej
idad
inte
rna
SS
C
Gráfica de puntos
L
G
M
L G M
GG
MM
LL
Como se ubicanespacialmentelas poblacionesde leucocitos
de sangre periférica?
LinfocitosLinfocitos
MonocitosMonocitos
GranulocitosGranulocitos
DetritosDetritos
R1
R1 30%
MARCAJE CON 1 SOLO FLUOROCROMOFLUOROCROMO
Se quiere saber cuantas células CD3+ hay en sangre periférica.
Anticuerpo anti-CD3 marcado con fluorescefluoresce íína FITCna FITC
1. Muestra de sangre periférica.2. Mezcla de la muestra con el antianti --CD3 FITCCD3 FITC.3. Incubar en oscuridad.4. Lisar los glóbulos rojos.5. Lavar con solución tampón.6. Fijar con paraformaldehido.7. Leer en el citómetro de flujo.
Anti-CD3 FITCControl de isotipo
Com
plej
idad
inte
rna
SS
C
Tamaño relativoFSC
Región 1
Control de isotipo
Fluorescencia verde (FL1)Anti-CD3 FITC
Flu
ores
cenc
ia n
aran
ja (
FL2
) Gráfica de puntos
Anti-CD3 FITC
Células marcadas
Fluorescencia verde (FL1)Anti-CD3 FITC
Flu
ores
cenc
ia n
aran
ja (
FL2
)
Gráfica de puntos
UL UR
LL LR
UL 0%UR 0%LL 10% CD3-LR 90% CD3+
Gate: G1
Quad Events % Gated % TotalUL 0 0.00 0.00
UR 0 0.00 0.00LL 931 20.03 3.54LR 3716 79.97 14.14
UL UR
LL LR
CD3+79.97% de R1
CD3+14.14% Población
celular total
MARCAJE CON 2 FLUOROFLUOROCROMOSCROMOS
Se quiere saber cuantas células CD3+ y CD19+ hay hay en sangre de un individuo.
Anticuerpo anti-CD3 marcado con fluorescefluoresce íína FITCna FITCAnticuerpo anti-CD19 marcado con ficoeritrinaficoeritrina PEPE
Tamaño relativoFSC
Com
plej
idad
inte
rna
SS
C
Gráfica de puntos
Región 1
Anti-CD3 FITC
Células marcadas
Anti-CD19 PE
Anti-CD3 FITC
Células marcadas Fluorescencia verde (FL1)Anti-CD3 FITC
Flu
ores
cenc
ia n
aran
ja (
FL2
)A
nti-C
D19
PE
Gráfica de puntos
Anti-CD19 PEUL UR
LL LR
UL 14% CD3- CD19+UR 0% CD3+ CD19+LL 10% CD3- CD19-LR 76% CD3+ CD19-
Gate: G1
Quad Events % Gated % TotalUL 696 16.30 2.71UR 7 0.16 0.03LL 461 10.79 1.80LR 3107 72.75 12.10
CD3+72.75% R1
12.10% Total
CD19+16.30% R12.71% Total
MARCAJE CON 3 FLUOFLUOROCRROCROMOSOMOS
Se quiere saber cuantas células T CD3+/CD4+/CD8+ hay hay en sangre de un individuo.
Anticuerpo anti-CD3 marcado con fluorescefluoresce íína FITCna FITCAnticuerpo anti-CD4 marcado con ficoeritrinaficoeritrina PEPEAnticuerpo anti-CD8 marcado con PeridininaPeridinina clorofila clorofila PerCPPerCP
Anti-CD3 FITCAnti-CD4 PE
Anti-CD8 PrCP
CD3+
CD3+ CD8+
CD3+ CD4+
CD3- CD4- CD8-
Gráfica de puntos
Tamaño relativoFSC
Com
plej
idad
inte
rna
SS
C
Región 1
Fluorescencia verde (FL1)Anti-CD3 FITC
Flu
ores
cenc
ia n
aran
ja (
FL2
)A
nti-C
D4
PE
Gráfica de puntos
UL UR
LL LR
UL 5% CD3- CD4+UR 60% CD3+ CD4+LL 10% CD3- CD4-LR 25% CD3+ CD4-
Anti-CD3 FITCAnti-CD4 PE
Anti-CD8 PrCP
Fluorescencia verde (FL1)Anti-CD3 FITC
Flu
ores
cenc
ia n
aran
ja (
FL3
)A
nti-C
D8
Per
CP
Gráfica de puntos
UL UR
LL LR
UL 5% CD3- CD8+UR 25% CD3+ CD8+LL 10% CD3- CD8-LR 60% CD3+ CD8-
Anti-CD3 FITCAnti-CD4 PE
Anti-CD8 PrCP
Anti-CD3 FITC
Fluorescencia verde (FL3)Anti-CD8 PrCP
Flu
ores
cenc
ia n
aran
ja (
FL3
)A
nti-C
D4
PE
Gráfica de puntos
Anti-CD4 PE
Anti-CD8 PrCP
UL UR
LL LR
UL 65% CD4+ CD8-UR 0% CD4+ CD8+LL 10% CD4- CD8-LR 25% CD4- CD8+
R1
PrC
P
Fluorescencia verde (FL3)Anti-CD3 FITC
Com
plej
idad
inte
rna
SS
C
Región 2
UL UR
LL LR
UL 0% UR 0% LL 25% CD3-LR 75% CD3+
Com
plej
idad
inte
rna
SS
C
Tamaño relativoFSC
Región 1
R1
File: Leydi Vasquez.001 Gate: G1
Quad Events % Gated % TotalUL 0 0.00 0.00UR 0 0.00 0.00LL 592 25.25 9.05LR 1753 74.75 26.79
R2
GRAFICAS
Determinar la proporción relativa de una característica para una población celular, con respecto a la población total.
Ubicación en la gráfica
CD10CD34
CD8
HLA-DR
NK MADUROCD2CD8+/-CD16CD56CD57
TIMOCITO CD1 CD8CD2 CD71CD3 CD38CD4 TCR
LINFOCITO T COOPERADOR
CD4 CD3CD28 TCR
CD5
LINFOCITO T CITOTOXICO
CD8CD3
CD28
CD5
LINFOCITO PRE BCD10CD19CD34CD38
LINFOCITO BCD19CD20CD22IgM
Leucocitos 5800/µlLinfocitos 30%Células CD3+ 70% de los linfocitosCélulas CD4+ 30%Células CD8+ 65%
Cual es el valor absoluto de cada subpoblación en los linfocitos y cual es el significado clínico delresultado.
Aplicaciones de la Citometría de
Flujo en investigación
Monocitos DC inmadura DC madura
Estímulo de maduracióny/o antígeno de pulga
IL-4
GM-CSF
Células dendríticas derivadas de monocitos
CBACD14CD86
HLA-DRCD83
CD14+ CD14- CD14-CD83- CD83- CD83+
0.5%
99.5%
0.5%
99.5%
R1
96.5%
R1
96.5%
R1
96.5%
A
B
A.
B.
A.
B.
HLA-DR
CD
86
CD83
CD
14
CD derivadas de monocitos
CDm Lin- HLA-DRalto CD11c+ CD123int
CDp Lin- HLA-DRalto CD11c- CD123alto
Subpoblaciones de CD
R3
R4 R5
R2
R1
CMSP
NE SEB P
αCD28/αCD49d
12 hBFA x 9 h
Marcaje Citometría
Detección intracelular de citocinas
Selección de la población de LT CD4+
No estimulado SEB Pulga 20 µg/ml
Células T efectoras secretoras de IL17
0.017 0.096 0.064
0.5850.2110.000
No estimulado SEB Pulga 20 µg/ml
Células T reguladoras secretoras de IL-10
0.020 0.492 0.212
0.000 1.178 0.613
IL-10
IL-1
3
IL-2
IL-10
Evaluación de células T multifuncionales
Seder RA. Nat Rev Immunol 2008
LT CD4+
Análisis: Esquema de jerarquías
Betts MR. Blood 2006
Perfil de LT multifuncionales en pacientes con diferentes
estadíos de enfermedad. Ej HIV
El perfil multifuncional de los LT varía de acuerdo con el estadio de la enfermedad
La multifuncionalidad se asocia con menor carga viral
Seder RA. NRI 2008
Virus
VacciniaCMV HIV-2 HIV-1
(LTNP)
HIV-1
Progresores
Carga antigénica y duración
Replicación viral Número de
funciones
Células T reguladoras naturales
IL-12TNFαIL-10IL-6IL-1βIL-8
MIF
per
las
en F
L3 6 perlas con diferente MIFen FL3
Cada perla con acp de capturapara una citocina diferente.
Adición de la muestraO el standard (citocina)
Revela la reacción con unconjugado anti citocina
MIF en FL2
Cuantificación de citocinas en fluidos
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