• Levadura: hongounicelular redondeado uovoide que se reproducesexual o asexualmente.
• La identificación de laslevaduras se puede llevara cabo atendiendo acuatro criterios diferentes:morfológicos,bioquímicos,inmunológicos ogenéticos.
• Las colonias de levadurasen agar glucosado deSaboraud (SDA) sonligeramente abombadas oplanas, de consistenciamantecosa, lisa o rugosa,con olor agradable,tornándose pastosas amedida que envejecen.
• Por lo general las coloniasde levaduras no desarrollanmicelio aéreo, aunque enocasiones pueden aparecerprolongacionesaracneiformes en laperiferia de las colonias. Sise observa un micelio aéreodefinido, debe considerarsela posibilidad de que setrate de un hongo dimórficoo de ciertas especies delevaduras que puedenformar micelio verdadero .
• El laboratorio de micología identifica levaduras quetienen significancia clínica. Para lo cual se dispone demúltiples sistemas bioquímicos rápidos; y también sedeben seguir realizando sencillas pruebas que sonútiles en la identificación tales como:
• Observar la micromorfología.
• Producción de pigmento.
• Asimilación de carbohidratos.
• Producción de ureasa.
• Susceptibilidad a la cicloheximida.
• Desarrollo de película.
• Desarrollo a 37 y 42 °C.
• Colonias
• Se caracterizan por
presentar colonias
cremosas de color
blanco amarillento,
lustrosas, poco
elevadas y de bordes
bien definidos.
Examen microscópico
• Se observan células
redondas u ovaladas
de tres a siete micras
de diámetro, que se
reproducen por
blastoconidias y
forman pseudomicelio
en la mayoría de las
especies.
Pruebas fisiológicas para
identificación• Tubo germinativo (filamentación precoz)
• Permite diferenciar las especies de Candidaalbicans de las no albicans.
• Desarrollo a 42 °C
• C. albicans y C. dubliniensis tienencomportamiento fisiológico y morfológicosimilar y la prueba que los va a diferenciar enel laboratorio de microbiología es eldesarrollo a 42 °C en agar papa dextrosa.
• Producción de clamidosporas, blastoconidias y artrosporas.
Se observa al microscopio en
busca de desarrollo del
tubo germinal y se reporta el
resultado.
Interpretación
• El tubo germinal es una extensiónfilamentosa de la levadura, sinestrechamiento en su origen, cuyo anchosuele ser la mitad de la célula progenitoray su longitud tres o cuatro veces mayorque la célula madre
• La prueba es positiva al visualizar unaestructura elongada que se origina a partirde la levadura.
• Realizar esta prueba empleando cepascontroles en paralelo a la cepa en estudio.
• Sólo C. albicans es capaz de producirverdaderos tubos germinales; sinembargo, otras especies como C.tropicalis pueden producir pseudohifasprecoces de aspecto similar a los tubosgerminales pero con una zona deconstricción característica.
• Si se utiliza un inóculo demasiadoabundante de levaduras, también puedenobtenerse falsos resultados negativos.
Sembrar la cepa aislada
en tubo o placa Petri que
contenga agarpapa dextrosa.
Incubar a 42 ºC por 48
horas
INTERPRETACIÓN
Positivo: C. albicans. con
desarrollo óptimo
Negativo: C. dubliniensis sin
desarrollo
• Ante la presencia de estructuras con aspecto de hifas, loprimero que hay que determinar es si se trata de pseudohifas(resultantes del proceso de formación de blastoconidias y, portanto, con puntos regulares de estrechamiento) o, por elcontrario, son verdaderas hifas que se fragmentan enartroconidias.
• Interpretación
• Si el desarrollo en medios especiales revela la presenciade pseudohifas y blastoconidias, la levadura a identificarpertenece a alguna especie del género Candida.
• Si por el contrario, revela verdaderas hifas yartroconidias, lo más probable es que se trate deespecies de Trichosporon, Geotrichum oBlastoschizomyces.
Producción de clamidosporas,
blastoconidias (Procedimiento)
Incubar a 37 °C por 24 a 48 h.
Artroconidias de
Geotrichum
• Microscópicamente las células de
Cryptococcus neoformans se caracterizan
por presentar una cápsula de polisacárido
visible al examen directo con tinta china.
• Morfología de lascolonias
• Son mucoides ybrillantes. Sobre el ASDdesarrollan un colorblanco amarillento, sonpoco elevadas y debordes continuos,mientras que sobre elagar niger seed (agarsemilla de girasol)desarrollan un colormarrón.
Desarrollo de Cryptococcus
neoformans sobre agar Sabouraud
dextrosa después de 72 horas de
crecimiento a 37 ºC.
• Levaduras redondas de 7 a15 μm de diámetro, emalgunos casos puedenproducir blastoconidias. Suprincipal características esla de presentar una cápsulaque la circunda, visible alexamen directo con la tintachina.
• Control positivo:Cryptococcusneoformans.
• Control negativo: Candidaalbicans.
Cápsula de polisacárido visible
al examen directo con tinta
china (objetivo de 100X).
• Morfología de lascolonias
• Son de crecimiento rápido,en el período de unasemana presentan un colorblanco – grisáceo, queposteriormente cambia a uncolor amarillento conaspecto ceroso, polvorientoa rugoso. La temperaturaóptima de crecimiento es 25°C, la mayoría de las cepasno desarrollan o lo hacendébilmente a 37 ºC.
• Examen microscópico• Se observa artroconidias
unicelulares, en cadena,
• hialinas que resultan de la fragmentación de hifas no
• diferenciadas por fisión a través de un doble septo,
• estas estructuras tienen forma rectangular y redondeada
• en los extremos, semejante a un barril. Carecen
• de blastoconidias, conidióforos y pseudohifas.
Artroconidias de
Geotrichum spp. (objetivo
de 100X).
• Morfología de lascolonias
• Son de rápidodesarrollo, liso,plegado,aterciopelado, ceroso,de color blanco –amarillento – crema.La textura plegada esmás prominente en eltiempo.
Desarrollo de Trichosporon
spp. sobre agar Sabouraud
dextrosa después de 72 horas
de crecimiento a 37 ºC.
• Examen microscópico
• Se visualiza artroconidiasy blastoconidias. Lasblastoconidias sonunicelulares y de formavariable y nacen enbrotes en los ángulos delas artroconidias. Laprincipal característica esla de presentarartroconidias usualmenteen forma cúbica o debarril.
Artroconidias de
Trichosporon sp. (objetivo de
100X).
• Las colonias de Rhodotorula rubra se
caracterizan por presentar pigmentos
carotenoides que confiere a la colonia un
color naranja o rojo anaranjado.
• Microscópicamente las células de
Rhodotorula rubra se encuentran dotadas
de una fina cápsula visible al examen
directo con tinta china.
• Morfología de las
colonias
• Se caracterizan por
ser de color rojo –
anaranjado o naranja,
de aspecto cremoso o
rugoso, brillante y de
superficie lisa.
Desarrollo de Rhodotorula rubra
sobre agar Sabouraud dextrosa
después de 72 horas de crecimiento a
temperatura ambiente.
• Examen microscópico
• Se observan levaduras
redondas, ovoides de 2
– 6,5 micras de
diámetro, en ocasiones
forman pseudomicelio
rudimentario, al examen
directo con tinta china
se visualiza una fina
cápsula. Fina cápsula de Rhodotorula
rubra visible al examen directo
con tinta china.
Los patrones de asimilación
de azúcares (glucosa,
lactosa, sacarosa, maltosa,
galactosa y rafinosa)
permiten identificar las
diferentes especies de
Candida spp, Rhodotorula
rubra, Trichosporon spp. y
Geotrichum spp.
Interpretación:
Positivo: viraje del color
del medio de cultivo hacia
el amarillo.
Negativo: no se produce
viraje de color,
permaneciendo el color
del medio de cultivo en
morado o púrpura.
• Se basa en la
capacidad de producir
la enzima ureasa, la
cual desdobla la urea
en dióxido de carbono
y amonio,
incrementando el pH
del medio produciendo
un cambio de color
rojo– púrpura en el
indicador rojo de fenol.
• Interpretación• La prueba se considera
positiva cuando sealcaliniza el medio lo queproduce un cambio decolor original (amarillo) arosa o rojo.
• Una reacción positiva a laprueba ureasa essugestiva de perteneceral género Cryptococcus,la cepa de C. neoformansson productoras deureasa.
• Algunas especies de
Candida, Geotrichum
y Trichosporon
producen una película
y gas sobre la
superficie del medio
de cultivo (caldo
Sabouraud).
• Interpretación• Se considerará como
prueba positiva si se
produce una película
sobre la superficie del
medio de cultivo.
• Permite distinguir
aquellas levaduras
que son resistentes o
sensibles a la
cicloheximida o
actidione.
• Interpretación
• Cepas que se
desarrollen sobre
el medio de cultivo
se considerarán
como resistentes.
El hisopo inoculado se presiona con firmeza contra el fondo de un tubo vacío para
que se desprendan los microorganismos contenidos
en la fibra de algodón.
Reintroducir el hisopo en el tubo para que absorba los
reactivos.
La capacidad que
tienen algunas
cepas de levaduras
de producir nitritos a
partir de nitratos
(presencia de
enzima
nitratoreductasa Sc.)
• Interpretación:
• El desarrollo de uncolor rojo brillante en elhisopo es positivo.
• Negativo sólo cuandoel hisopo retiene elcolor de la colonia.
• Positivo: Cryptococcus.albidus var albidus
• Negativo: C.neoformans
• Capacidad de C.neoformans de formar unpigmento marrón o negro,denominado melanina, apartir de compuestosdifenólicos. La producciónde este pigmento mediantela prueba de la L – dopa –citrato férrico, es realizadapor la enzima fenoloxidasa.
• La reacción positiva seevidencia con la producciónde un pigmento marrónoscuro o negro alrededorde la colonia de C.neoformans.
Incubar en cámara húmeda a 28 °C de 3 a 18 h.
• Interpretación
• Positivo:
Cryptococcus
neoformans.
• Negativo: Candida
albicans.
Prueba de la fenol-oxidasa (Medio de
TOC). Producción de pigmento
marrón oscuro por C. neoformans.
• Entre estas metodologías tenemos a los medios de cultivoque emplean sustratos cromogénicos que permiten elaislamiento e identificación de algunas especies del géneroCandida.
• El fundamento de los mismos se basa en la detección dedeterminadas actividades enzimáticas por parte de laslevaduras mediante la hidrólisis específica de un sustratocromogénico en presencia de un indicador de la enzima. Unade las principales ventajas de estos medios es permitirdiferenciar fácilmente los cultivos mixtos.
• Se describen sistemas enzimáticos que usan un sustratocromogénico para detectar las enzimas MUGAL y PRO por loque no requieren el uso de lámpara ultravioleta.
Ejemplos
• CHROMagar candida
• Cromogen albicans
• CandiSelect
• CandidaID
• Albicans ID2
• Fluoroplate Candida
• Agar SDCA-MUAG
Procedimiento e interpretación
• La siembra se realizaa partir de cepasmuestras biológicas y seincuban a temperaturasde 30 a 37 °C durante 48horas.
• C. albicans, son lisas y de color verde esmeralda.
• C. dubliniensis, de color verde oscuro.
• C. tropicalis colonia de color azul oscuro con un halo púrpuramarron en el medio de cultivo.
• C. krusei. colonias rugosa con el centro rosado y el borde blanco.
• C. glabrota, colonia de color violetamorado.
Desarrollo de Candida
albicans (a), Candida krusei
(b) y Candida tropicalis (c)
sobre CHROM agar
Candida.
• También hay sistemas enzimáticosdisponibles que permiten la identificaciónrápida de C. albicans a partir de una coloniadesarrollada sobre cualquier medio de cultivoconvencional, éstos sistemas detectan una odos enzimas β – galactosaminidasa y L –prolina aminopeptidasa, presentes sólo enC. albicans. Para detectar estas enzimas lossistemas comerciales pueden utilizarsustratos fluorogénicos y cromogénicos.
• Entre otrasmetodologías deidentificación seencuentran lossistemas enzimáticosque emplean sustratosfluorogénicos,requiriendo para ello eluso de una lámparaultravioleta de 365 nm,es el caso delBactiCard Candida.
• Se fundamenta en el empleo
de diversos nutrientes
hidrocarbonados o
nitrogenados sobre un medio
sintético base, para observar
el crecimiento selectivo de una
levadura alrededor de los
nutrientes necesarios para su
desarrollo.
• Los medios de cultivo se
comercializan deshidratados
como medio base de
levaduras, siendo los más
usados:
• Medio sin carbono
• Medio sin nitrógeno
• Como fuente de
carbono se pueden
emplear todos los
azúcares y alcoholes.
Como sustrato
nitrogenado se puede
usar peptona,
asparagina, úrea,
sulfato de amonio,
nitrato de potasio y
aminoácidos diversos.
• Para su realización pueden emplearse
soluciones acuosas esterilizadas por
filtración, cilindros de Oxford en pocillos
hechos en el agar o bien discos de papel
absorbente empapados con el nutriente.
• Sin embargo, las pruebas de asimilación
en medios líquidos no ofrecen ninguna
ventaja adicional sobre los medios sólidos,
resultando mucho más laboriosas y
costosas.
Auxonograma (procedimiento)
Cada cepa de levadura se suspende en solución salina
fisiológica estéril.
Se introduce en cada tubo un hisopo estéril y se siembra
masivamente cada levadura en su respectiva caja con púrpura
de bromocresol.
Se humedecen los discos de papel filtro estéril (marcar los
discos con lápiz), con cada una de las soluciones de
carbohidratos, se deja secar el exceso y se colocan todos los
discos en la caja petri ya sembrada.
Se incuba a 37° C por 24 a 48 h.Se reporta el crecimiento de cada levadura alrededor de
cada uno de los discos
Interpretación:
Un crecimiento indica que hubo asimilación de ese carbohidrato por parte del hongo, un halo de inhibición alrededor del disco
indica que no hubo asimilación de la azúcar por parte del disco
Auxonograma por la técnica de
Araujo
Es la
fermentación
de azúcares.
Se cultiva la
levadura en un
medio líquido
con un glúcido
y un indicador
coloreado.
• Interpretación
• Presencia de gas
• Fermentación de
carbohidratos por
viraje del medio
• Existen diferentes sistemas deidentificación semiautomatizadosbasados en paneles o galeríasque contienen los nutrientes,como por ejemplo: Auxacolor, Uni– Yeast Tek, API 20 C AUX,Galeria ID32C, Sistema Vitek.
• Entre los sistemas automáticostenemos: Sistema Vitek 2, BiologYT MicroPlate, Rapid YeastIdentification Panel MicroScan.
• También hay sistemas de identificación rápida de levaduras mediante pruebas bioquímicas y enzimáticas, como: Rapid Yeast Plus System, Fungiscreen 4H. Api 20 CAUX.
La lectura de estas reacciones se
hace por comparación con un
control de crecimiento y la
identificación se obtiene, a partir de
un código numérico, mediante un
catálogo analítico o un programa
informático.
Auxacolor
Uni-Yeast-Tek
RapID Yeast Plus System®
• El RapID Yeast Plus System (Remel) es un sistema compuesto por un panel de 18 pocillos; cada uno contiene un sustrato convencional o cromogénico que detecta la asimilación de carbohidratos, ácidos orgánicos aminoácidos, así como la hidrólisis de la urea y de ácidos grasos. Permite identificar hasta 43 especies de levaduras.
• Debido a su requerimiento de ácidos grasos, las levaduraslipófilas no pueden ser identificadas con los sistemas ymedios habituales para otras levaduras, por lo que suidentificación merece un comentario diferenciado.
• Las levaduras de Malassezia furfur por ser lipofílicas, sedesarrollan en medios de cultivo que contengan en sucomposición aceites naturales u otras sustancias grasas,siendo el método más común el cultivo en ASD que contienecicloheximide o actidione y aceite de oliva, sin embargoexisten medios de cultivo alternativos como el agar de Dixónque en su formulación incluye al glicerol mono – oleato queestimula el crecimiento in vitro de la levadura. Laidentificación se basa en comparar característicasmorfológicas y fisiológicas.
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