Diapositiva 1

Estudios preliminares de la formacin de complejos insolubles entre pectinasa de A. niger y alginato

Pablo, Faccendini1*; Gonzalo, Tulin1; Diana, Romanini1 2**.

1 rea Fsico-Qumica -Dto Qumico-Fsica - Facultad Cs. Bioq. y Farm. - Universidad Nacional de Rosario (U.N.R.)

2 Instituto de Procesos Biotecnolgicos y Qumicos Rosario (IPROByQ) CONICET- U.N.R.

* pablo_faccendini@yahoo.com.ar ** dianaromanini@hotmail.com

Introduccin

Las pectinasas son un conjunto de enzimas que catalizan la degradacin de sustancias pcticas de la pared celular de las plantas. Se utilizan en las industrias alimenticias para clarificar jugos de frutas, vinos, vinagres, jarabes y gelatinas. La poligalacturonasa (PG), EC 3.2.1.15, cataliza la hidrolisis del enlace 1-4 del cido poligalacturnico para producir poligalacturonatos de menor peso molecular [1].

La formacin de complejos insolubles entre protenas y polmeros inicos de cadena flexible (PE) ha surgido como una alternativa a aplicarse en distintas reas de la biotecnologa con el fin de contribuir a la industria en la purificacin de protenas o en la inmovilizacin de enzimas en biorreactores [2], entre otras aplicaciones. La interaccin entre una protena y un PE de carga opuesta depende de las condiciones del medio como pH, temperatura, fuerza inica y por la relacin molar ptima de la protena y el PE. Cambiando las condiciones del medio como el pH se puede redisolver el complejo y disociar el PE de la enzima de inters [3].

Objetivo

El objetivo de este trabajo fue analizar las variables fisicoqumicas del medio que conducen a la formacin de complejos insolubles entre PG y el alginato (ALG) de sodio como punto de partida del diseo de una estrategia bioseparativa de dicha enzima a partir de cultivos de Aspergillus niger.

Materiales y mtodos

Los diagramas de solubilidad de los complejos PG/ALG y de cintica de formacin se realizaron midiendo absorbancia a 420nm.

La precipitacin del complejo se realiz mezclando alcuotas de ambas especies a diferentes relaciones entorno a la ptima.

Las actividades enzimticas se determinaron cuantificando azcares reductores con el reactivo de DNS [4]. La reaccin enzimtica se llevo adelante a 40 C durante 15 min utilizando pectina al 1% en citrato 50 mM pH= 4,2. La unidad enzimtica se defini como la cantidad de enzima que produce 1 mol de extremo reductor por minuto.

Bibliografa

[1] D. Biscaro Pedrolli, A. Costa Monteiro, E. Gomes, E. Cano Carmona. The Open Biotechnology Journal, 3 (2009) 9-18.

[2] A. Lali, N. Aruna , J. Roshnnie , T. Devika. Proc. Biochem. 35 (2000) 777-785.

[3] J. Breccia, B. Mattiasson, F. Sieriz. J Biotech 61 (1998) 219-223

[4] G. L. Miller. Analytical Chemistry. 31(3) (1959) 426-428

Conclusiones

Los resultados obtenidos han demostrado que la formacin del complejo insoluble entre la PG y ALG involucra un alto nmero de molculas de enzima unidas por molcula de polmero, lo que hace a esta metodologa una estrategia apta para la purificacin de PG a partir de un cultivo de A. Nger con bajo impacto ambiental.

Resultados y discusin

La mejor recuperacin de actividad en el precipitado se consigui utilizando ALG al 0,004% m/V, PG de 0,19 mg/mL en solucin tampn HAc/NaAc 50 mM, de pH=3,00; el pH de redisolucin ptimo fue 6,00. El porcentaje de actividad recuperada fue del 50% a temperatura ambiente.

La relacin molar ptima de precipitacin fue 0,375 milimoles de PG por gramo de ALG. El complejo enzima-polmero es insoluble en el rango de pH 1,85 a 5,60 y

El presente trabajo se realiz en el marco del proyecto de investigacin Desarrollo de mtodos de obtencin de enzimas que combinan metodologias novedosas aplicables a escala industrial" BIO 391 ,UNR.

Cintica de formacin de los complejos PG/ALG, a 20 C el complejo madura a los 120 segundos.

PG

T =20 C pH =3,0

ALG

Pectina 1 %

pH 4,2

T =40 C

15 min

PG

T =20 C pH =6,0

PG/ALG

PG

T =20 C pH =3,0

DNS

T =100 C

10 min

Volumen acumulado ALG 0,1% m/V (

m

L)

0

20

40

60

80

100

120

140

Abs 420 nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

pH

1

2

3

4

5

6

7

Abs 420 nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Tiempo (s)

0

100

200

300

400

500

Abs 420 nm

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

20 C

30 C

40 C