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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
• Componentes de un equipo HPLC• Tipos de Detectores• Fases móviles en HPLC• Parámetros cromatográficos• Tipos de cromatografía• Consideraciones prácticas
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Fase Móvil
Cromatografía Disposición Fase Estacionaria
Cromatografía Abrv.
Gas De gases (GC) Columna LíquidaSólida
Gas-líquidoGas-sólido
GLCGSC
Líquida Planar Superficie Sólida En capa finaSobre papel
TLCPC
Líquida De líquidos(LC, HPLC)
Columna SólidaLigadaIónicaPorosa
AdsorciónParticiónIntercambio iónicoExclusión molecular
LSCLLC/BPCIECSEC/GPC
Los métodos cromatográficos se pueden clasificar en función de diversos parámetros: fase móvil, fase
estacionaria, mecanismo de retención y forma de contacto
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
ESQUEMA DE UN EQUIPO HPLC
Principales componentes de un equipo de HPLC: (1) reservorios; (2) bomba; (3) inyector automático con diferentes carruseles de muestras; (4) columna cromatográfica; (5) detectores en serie; (6) sistema de tratamiento de datos; (7) botella para desechos.
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
OBJETIVO FINAL
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
PRECAUCIONES A SEGUIR CON LA FASE MÓVIL
Filtrar Siempre Desgasificar Gradientes en baja presión Termostatizar Fases móviles con solventes de bajo punto de ebullición
Fases móviles muy viscosas Agitación Fases móviles complejas con solventes poco miscibles
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INYECTORES
• INYECTOR MANUAL
• INYECTOR AUTOMÁTICO
• Precisión
• Termostatización
• Programabilidad
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INYECTORES DE BUCLES (LOOP)
La función del inyector es introducir la muestra en la corriente de fase móvil bajo alta presión
Volumen del loop: 5 μL a 5 mLRecomendación: llenar loop con 5 veces su
volumen
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INYECTORES AUTOMÁTICOS:parámetros
Precisión y linealidad
Volumen de inyección
Refrigeración (Peltier)Compatibilidad con viales, placas
multipocilloCapacidadVolumen interno Tiempo de equilibradoContaminación cruzadaProgramación
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
VIALES para INYECTORES AUTOMÁTICOS
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REQUERIMIENTOS DEL SISTEMA DE BOMBEO
Debe soportar presiones de hasta 6000 psi (aprox. 400 bar)
Para permitir separaciones en tiempos razonables
Debe proporcionar flujos en el rango 0.1 a 10 mL/min, con saltos de 0.1 mL/min
Control de flujo y reproducibilidad < 0.5%
Resistencia a la corrosión
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Las bombas HPLC son casi exclusivamente de PISTÓN
Un dispositivo eléctrico actúa sobre el pistón que entra en una cámara donde se halla la fase móvil, para comprimirlo y enviarlo a presión al resto del sistema.
El flujo deseado se mide y alcanza en función del número de emboladas por unidad de tiempo.
Incorporan un dispositivo electrónico de medida y control de la presión del sistema, en el que el usuario establece un límite máximo de presión .
El principal inconveniente de estas bombas es la aparición de oscilaciones en la línea base por cada embolada. Para evitarlo:
Utilizar atenuador de pulsos a la salida de la bombaBombas de dos pistones en serieBombas de dos pistones en paralelo
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
SISTEMA DE BOMBEO
• GRADIENTELa composición de la fase móvil se modifica durante el análisis para ir aumentando su poder de elución.
• ISOCRÁTICOLa composición de la fase móvil no se modifica durante el análisis
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BOMBAS DE GRADIENTE
Tiempo (min)
Fase Móvil Flujo
0 MeOH:H2O (v/v) 80:20 1,2 ml/min 7 MeOH:H2O (v/v) 80:20 1,2 ml/min 8 MeOH 100% 1,2 ml/min
20 MeOH 100% 1,2 ml/min
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
¿Por qué utilizar gradientes?
1. Para separar mezclas complejas con componentes de polaridad diferente.
0 5 10 15 200
1
2
3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tiempo (h)
Gra
dien
te (%
Met
anol
)
Res
pues
ta (v
olts
)
Ac. oleico
Oleato de metilo Dioleina
Trioleina
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
2. Para reducir el tiempo total de análisis y eliminar las “colas” de los picos.
Isocrático Gradiente
0 40 80 120 0 20 40Tiempo Tiempo
Seña
l
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FORMACIÓN DE GRADIENTES
MEZCLA A ALTA PRESIÓNUna bomba para cada componente de la fase móvil. La mezcla se realiza en una cámara de mezcla situada entre las bombas y el inyector. La mezcla tiene lugar en el lado de alta presión de la bomba
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
FORMACIÓN DE GRADIENTES
MEZCLA A BAJA PRESIÓN
Una válvula situada antes de la bomba controla la composición abriendo la entrada de cada eluyente durante un tiempo proporcional a la composición deseada. La mezcla se realiza en una cámara situada entre la válvula y la bomba. La mezcla tiene lugar en el lado de baja presión de la bomba
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COMPARACIÓN BOMBAS DE GRADIENTEALTA PRESIÓN-BAJA PRESIÓN
ALTA PRESIÓN BAJA PRESIÓN
PRECIO Superior Calidad de la mezcla Buena Buena Desgasificación No necesaria Necesaria Flujos bajos Mejor Porcentajes bajos de algún
disolvente Mejor
Volumen “muerto” Pequeño Grande
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Metal: Acero inoxidable 316, Nitronic 50, Níquel 200, EFNI (electroformed nickel), Hastelloy C-22 (aleación de níquel, cromo y molibdeno), Inconel 600, Titanio, etc.
TUBOS DE CONEXIÓN
No metal: PTFE (politetrafluoroetileno), familia a la que pertenece el popularteflón. Son muy resistentes químicamente, pero no tanto frente a las altas presiones o temperaturas.
FEP (fluoroetilenpropileno). También de la familia de los fluorocarbonos, con similares propiedades de resistencia que el PTFE.
PEEK (polieteretercetona). Es el polímero inerte y biocompatible por excelencia. Excelente resistencia química, térmica y a las altas presiones (5000 psi). Sólo es atacado por dimetilsulfóxido, ácido sulfúrico concentrado, ácido nítrico concentrado y cloruro de metileno.
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
TUBOS DE CONEXIÓNDIÁMETRO EXTERNO
1 in = 25.40 mm½ in = 0.5´´ = 12.70 mm¼ in = 0.25´´ = 6.35 mm1/8 in = 0.125´´ = 3.175 mm1/16 in = 0.06´´ = 1.59 mm
DIÁMETROS INTERNOS TÍPICOS DE LOS TUBOS HPLC0.040´´ aprox. 1 mm (0.8 mL por metro)0.020´´ aprox. 0.5 mm (0.4 mL por metro)0.009´´ aprox. 0.2 mm (50 μL por metro)
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
TUBOS DE CONEXIÓN
0.040’’0.009’’
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
TUBOS DE CONEXIÓN
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
UNIONESSirven para conectar los diferentes módulos del HPLC
ACERO: Férula, conoNo se pueden reutilizarNecesario utilizar herramientas
PLÁSTICO (PEEK) IntegradosReutilizablesSe enroscan a mano
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CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
• Componentes de un equipo HPLC• Tipos de Detectores• Fases móviles en HPLC• Parámetros cromatográficos• Tipos de cromatografía• Consideraciones prácticas
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Respuesta específica a analitos de interés
No afectado por cambios en temperatura o composición de
la fase móvil (ej. gradientes)
Alta sensibilidad (análisis de trazas)
No contribuir al ensanchamiento de bandas, volumen de
celda pequeño
Respuesta rápida
Fácil manejo, duradero y barato
Precisión
Respuesta lineal
CARACTERCARACTERÍÍSTICAS DEL STICAS DEL DETECTOR IDEAL:DETECTOR IDEAL:
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
RUIDO DEL DETECTOR
Frecuencia alta: Toma de tierra, excesiva amplificaciónFrecuencia baja: Fase móvil con impurezas, burbujas, flujo no estable, etc.
Deriva (drift): Uso de gradientes con detectores no adecuados o con fases móviles que absorben, cambio en la Tamb.
Incertidumbre en el valor de la línea base de la señal, en ausencia de un analito.
Corto o frecuencia alta (>1 Hz)
Largo o frecuencia baja(<0.1 Hz)
Deriva
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
LÍMITES DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN
LOD: Cantidad mínima detectable de un analito
LOD LOQ
LOQ: Cantidad mínima cuantificable de un analito
Señal/Ruido = 3 Señal/Ruido = 10
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LINEALIDAD DE UN DETECTOR
bmxy +=
gen en el ori Ordenada b Pendiente m
iónConcentrac x ala muestrspuesta dedonde: y
==== Re
Concentración de analito
Seña
l del
det
ecto
r
Real
IdealIdeal
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Otros parámetros
Volumen de celda:Debe tener una influencia despreciable en la anchura de los picosNo sobrepasar los límites máximos de presión y caudal de cada tipo de celda
Tiempo de respuesta:No debería ser superior a 0.3 segundos para picos muy agudos
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
TIPOS DE DETECTORESTIPOS DE DETECTORES
Generales: Responden a laspropiedades de la fase móvil que varían en presencia de solutos (índice de refracción, viscosimétricos, etc.)
Específicos: Responden a algunapropiedad del soluto, no presente en la fase móvil (absorbancia UV-VIS, masas, etc.)
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Ópticos:• Fotométricos:
Absorbancia UV/VIS: longitud de onda discreta o rango espectral continuo (PDA -fotodiodos)Fluorescencia
• Refractométricos, polarimétricos, evaporativos(light-scattering).
Eléctricos: electroquímicos, conductimétricos.Específicos: radiométricos, viscosimétricos.De técnicas acopladas: espectroscopía de masas, IRTF, AA, ICP.
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Región Longitud de onda (nm)
Ultravioleta lejano 10-200
Ultravioleta cercano 200-380
Visible 380-780
Infrarrojo cercano 780-3,000
Infrarrojo medio 3,000-30,000
Infrarrojo lejano 30,000-300,000
Microondas 300,000-1,000,000,000
El espectro electromagnético está dividido en diferentes regiones espectrales, definidas de acuerdo a la longitud de onda.
DETECTORES FOTOMDETECTORES FOTOMÉÉTRICOSTRICOS
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
DETECTORES DE ABSORBANCIA UV/VISDETECTORES DE ABSORBANCIA UV/VIS
LA MAYORÍA DE LOS COMPUESTOS ORGÁNICOS
ABSORBEN EN ALGUNA ZONA DEL ESPECTRO
ADECUADO PARA TODOS LOS MODOS
CROMATOGRÁFICOS
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
DETECTORES DE ABSORBANCIA UV/VISDETECTORES DE ABSORBANCIA UV/VIS
AMPLIO RANGO DE LINEALIDAD NO AFECTADOS
POR CAMBIOS DE TEMPERATURA
SENSIBILIDAD ALTA
ADECUADO PARA TRABAJAR EN GRADIENTE
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Longitud de onda discretaLongitud de onda discretaDETECTOR DE ABSORBANCIA UV/VISDETECTOR DE ABSORBANCIA UV/VIS
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Identificación de los analitos en un detector de fotodiodos (PDA)
Tiempo de retención
λ
Abs
orba
ncia
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
DETECTORES DE FLUORESCENCIADETECTORES DE FLUORESCENCIA
Ventajas:Ventajas:
Alta selectividad y sensibilidad (1 orden de magnitud mayor que UV-VIS)Aplicaciones típicas: Hidrocarburos aromáticos policíclicos (legislación) y en técnicas con derivatización
Desventaja: Desventaja: Doble de precio que UV-VIS
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
DETECTORES DE DETECTORES DE ÍÍNDICE NDICE DE REFRACCIDE REFRACCIÓÓNN
En la celda de detección se observa la variación en la refracción de un haz de luz cuando la fase móvil
lleva un compuesto disuelto respecto a la fase
móvil pura.
Detector general
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
PROPIEDADES DE UN DETECTOR DE PROPIEDADES DE UN DETECTOR DE ÍÍNDICE DE REFRACCINDICE DE REFRACCIÓÓNN
Complementario a detectores UV-VIS100-1000 veces menos sensible que UV-VISSensible a pulsos de presión (ruido)No permite gradientesAplicaciones típicas: carbohidratos, grasas,
polímeros, etc.
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
DETECTORES EVAPORATIVOS DE DETECTORES EVAPORATIVOS DE DISPERSIDISPERSIÓÓN LUMINOSA N LUMINOSA
(LIGHT(LIGHT--SCATTERING, ELSD)SCATTERING, ELSD)
Están basados en los efectos dispersivos que toda partícula produce sobre una radiación.
Rayo incidente
Rayo dispersado
Detector universal!!
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
COMPONENTES DE UN ELSDCOMPONENTES DE UN ELSD
1. Un sistema de nebulizaciónneumática del líquido procedente de la columna.
2. Un tubo evaporador caliente, donde entra el eluyente y se produce la evaporación de la fase móvil.
3. Un detector alejado del eje de la radiación incidente, normalmente un fotomultiplicador emplazado 90-120°de la fuente de radiación.
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
PROPIEDADES DE UN DETECTOR ELSDPROPIEDADES DE UN DETECTOR ELSD
Fácil manejoMayor sensibilidad que índice de refracciónCompatibilidad con los gradientes de elución
Aplicaciones típicas: Azúcares, triglicéridos, ácidos grasos, polímeros
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
DETECTORES ELECTROQUDETECTORES ELECTROQUÍÍMICOSMICOS
En la célula de detección, equipada con dos electrodos, se genera una diferencia de potencial adecuada para provocar la oxidación o reducción de los analitos. Se mide la intensidad de corriente generada en el proceso.
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
EL POTENCIAL ES CARACTERÍSTICO DE CADA SUSTANCIA
LA CORRIENTE DEPENDE DE LA CONCENTRACIÓN DE DICHA SUSTANCIA
Ejemplos de compuestos detectables con detectores electroquímicos
CetonasAldehídos
OximasÁcidos conjugadosÉsteres conjugadosNitrilos conjugados
Insaturaciones conjugadasHalógenos activados
Halógenos aromáticosCompuestos nitro
Anillos heterocíclicos
FenólicosOximas
DihidroxiMercaptanos
PeróxidosHidroperóxidos
Aminas aromáticas, diaminasPurinas
Anillos heterocíclicosCarbohidratos
ReducciónOxidación
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
DETECTORES CONDUCTIMDETECTORES CONDUCTIMÉÉTRICOSTRICOS
Muy útiles para cromatografía de intercambio iónico
La conductividad es proporcional a la fuerza iónica
Su sensibilidad disminuye a medida que aumenta la conductividad de la fase móvil
Pequeño rango lineal
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
DETECTORES DE MASASDETECTORES DE MASAS
HPLC Espectrómetro de masas+
GRAN POTENCIAL
Cuantificar componentes Cuantificar componentes de bajos pesos molecularesde bajos pesos moleculares
SepararSeparar
IdentificarIdentificar
Caracterizar productos de Caracterizar productos de altos pesos moleculares altos pesos moleculares
(p(pééptidos, proteptidos, proteíínas, etc.). nas, etc.).
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
DETECTORES DE MASAS: DETECTORES DE MASAS: MMÉÉTODOS DE IONIZACITODOS DE IONIZACIÓÓNN
EI: IMPACTO ELECTRÓNICO (Therma-Beam). Es poco eficaz
API: INTERFASES A PRESIÓN ATMOSFÉRICA:
Ionización mediante electrospray (ESI, electrosprayionisation)
Ionización química a presión atmosférica (APCI, atmosphericpressure chemical ionisation).
FAB (fast atom bombardment)
MALDI (matrix-assisted laser desorption)
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
• Componentes de un equipo HPLC• Tipos de Detectores• Fases móviles en HPLC• Parámetros cromatográficos• Tipos de cromatografía• Consideraciones prácticas
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Agua (grado MilliQ, tampones)
Disolventes orgánicos:MetanolAcetonitriloIsopropanolDiclorometanoHexano
Disolventes másusados en HPLC
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Características de los eluyentes
Pureza UV CutoffMiscibilidadpHEstabilidadPropiedades físicas y toxicológicas
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
UV Cutoff de algunas fases móviles
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Miscibilidad de disolventes
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
• Componentes de un equipo HPLC• Tipos de Detectores• Fases móviles en HPLC• Parámetros cromatográficos• Tipos de cromatografía• Consideraciones prácticas
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
La resolución de dos picos adyacentes es el cociente entre la distancia que hay entre los máximos de ambos picos y la media aritmética de sus anchuras respectivas (w). Determina la calidad de la separación de dos picos
Resolución
Se calcula dividiendo la longitud de la columna (L) entre el tiempo que necesita la fase móvil para pasar a través de la columna (to)
Velocidad lineal de la fase móvil
Cociente del factor de capacidad de dos picos adyacentes. Es una medida del potencial del sistema cromatográfico para separar dos compuestos.
Selectividad(factor de
separación)
Cociente del tiempo en que el analito está en interacción con la fase estacionaria (tR – to) y el que permanece en la fase móvil (to)
Factor de capacidad
Suma del tiempo que el analito permanece en la fase móvil y el tiempo que interacciona con la fase estacionaria
tRTiempo de retención
SignificadoFórmulaParámetro
1
2
kk
=α
o
o
tttk −= R
0tL
u =
( )21
12
21 ww
ttR+−=
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Indica que para cada sistema cromatográfico existe un flujo (definido por la velocidad lineal) para el cual la altura equivalente de un plato teórico es mínima. En la ecuación, A es la contribución de la difusión de Eddy, B corresponde a la difusión longitudinal y C a la transferencia de masa
Ecuación de van Deemter
Se calcula dividiendo la longitud de la columna entre el número de platos teóricos.
Altura equivalente de platos teóricos
Este nombre refleja el origen del concepto de la teoría de destilación: una cierta longitud de la columna es ocupada por un plato teórico. Se calcula, para un determinado pico, considerando el tiempo de retención y su anchura.
Número de platos teóricos
SignificadoFórmulaParámetro
o
o
tttk −
= R
2
16 ⎟⎠⎞
⎜⎝⎛⋅=
wtN R
NLHETP =
uCuBAHETP ⋅++=
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
COMPARACIÓN GC-HPLCNÚMERO TÍPICO DE
PLATOS TEÓRICOS
POR COLUMNA POR METRO
GC con columnas
empaquetadas 2000 1000
GC con columnas
capilares 50000 3000
Cromatografía líquida clásica 100 200 HPLC 5000 50000
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
COMPARACIÓN GC‐HPLC
GC HPLC
Separaciones difíciles Posible Posible
Rapidez Sí Sí
Automatización Posible Posible
Forma típica de solucionar los problemas
Cambio de fase estacionaria Cambio de fase estacionaria o
de fase móvil
No aplicable a... Compuestos poco volátiles,
compuestos inestables
térmicamente
Compuestos muy volátiles
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
• Componentes de un equipo HPLC• Tipos de Detectores• Fases móviles en HPLC• Parámetros cromatográficos• Tipos de cromatografía• Consideraciones prácticas
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
CLASIFICACIÓN DE LOS PROCESOS CROMATOGRÁFICOS EN HPLC
Proceso cromatográfico
Abreviatura (inglés) Tipos
Adsorción LSC (líquido-sólido) ⎯
Partición BPC (fase ligada) Fase reversa Interacción hidrofílica
Intercambio iónico IEC Intercambio aniónico Intercambio catiónico
Exclusión por tamaño SEC/GPC ⎯
Los distintos tipos de fuerzas entre fase estacionaria y analitos definen los distintos tipos de cromatografía HPLC
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CROMATOGRAFÍA HPLC DE ADSORCIÓN
Líquido-Sólido
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Es el método cromatográfico más antiguo
La interacción, de tipo electrostático, se produce entre la parte polar del analito y los grupos OH de la sílice.
Esta interacción compite con la que tiene lugar entre la fase móvil y los grupos funcionales de la sílice.
Está basada en el mismo principio que la cromatografía en capa fina (TLC) y la cromatografía de columna en gel de sílice
CROMATOGRAFÍA HPLC DE ADSORCIÓN
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
FASES MÓVILES:
HEXANO
ISOOCTANO
CLOROFORMO
ACETATO DE ETILO
FASES ESTACIONARIAS:
SÍLICE
ALÚMINAHIDROXIAPATITO
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
COMPUESTOS QUE PUEDEN SER SEPARADOS
• OLEFINAS• HIDROCARBUROS AROMÁTICOS• HALUROS, SULFUROS• ETERES• NITRO- DERIVADOS• ÉSTERES, ALDEHIDOS, CETONAS• ALCOHOLES, AMINAS• SULFONAS• SULFÓXIDOS• AMIDAS• ÁCIDOS CARBOXÍLICOS
ListadosListados en en
ordenorden crecientecreciente
de de tiempotiempo de de
retenciretencióónn: de : de
menormenor a mayor a mayor
interacciinteraccióónn con con
la la fasefase
estacionariaestacionaria
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
CROMATOGRAFÍA HPLC DE PARTICIÓN
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
SÍLICE: MODIFICACIÓN QUÍMICA
SiO
Si
OH OH
SiO
SiO
Si
OH OH OH
Si OH SiCH3R
CH3
Cl+ SiCH3R
CH3
OSi
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Se obtiene una faseligada establetérmicamente y resistente a la hidrólisis
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
COMPARACIÓN ADSORCIÓN-PARTICIÓN
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
A) CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN EN FASE REVERSA
FASES MÓVILES:ACETONITRILO
METANOLTHF
con agua como componente de la fase móvil
FASES ESTACIONARIAS:
OCTADECIL- C18
OCTIL- C8BUTIL- C4FENIL- C6H5
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
FASE REVERSA“La fase estacionaria es menos polar que la fase móvil”
FASE MÓVIL:POLAR
FASE ESTACIONARIA:
APOLAR
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
La retención está basada en la interacción, de tipo hidrófobo, entre la fase estacionaria y la
región no polar del analito
FASE REVERSA
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Más del 90% de las aplicaciones HPLC de compuestos de bajo peso molecular se
hacen en cromatografía de partición en fase
reversa
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
CONTROL DE LA RETENCIÓNEN FASE REVERSA
Para aumentar el tiempo de retención de
los analitos, AUMENTAR la POLARIDAD
de la fase móvil.
Esto suele conseguirse incrementando el
porcentaje de agua
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Campo de aplicación Ejemplos Farmacia Antibióticos, analgésicos, esteroides Medio ambiente Pesticidas, Herbicidas, Fenoles, PCBs Industria química Detergentes, Polímeros Alimentación Edulcorantes, emulgentes, antioxidantes Bioquímica Proteínas, Hidratos de carbono, Lípidos Clínica y Diagnóstico Análisis de orina y sangre, Dopaje, Hormonas
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
B) CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN POR INTERACCIÓN HIDROFÍLICA (HILIC)
SEPARACIÓN DE COMPUESTOS MUY HIDRÓFILOS
NO RETENIDOS EN HPLC EN FASE
REVERSA:
Coelución
MUY RETENIDOS EN HPLC DE ADSORCIÓN:
Pero no se pueden disolver en fase móvil
apolar
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
EJEMPLOS DE CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÍLICA (HILIC)
Retention time (min)
0 5 10 15 20 25 30
Sign
al (m
Volts
)
0
5
10
15
20
25
30
Glucose
Maltose
Maltotriose
Columna Lichrospher-NH2250 x 4.6 mmCH3CN:H2O 70:30 v/v0.7 mL/min
ORDEN DE ELUCIÓN: DE MENOS POLAR A MÁS POLAR
SEPARACIÓN DE CARBOHIDRATOS
40
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
EJEMPLOS DE CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÍLICA (HILIC)
SEPARACIÓN DE VITAMINAS
HIDROSOLUBLES
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
FASES ESTACIONARIAS (naturaleza de R)
CIANO -C2H4CNDIOL -C3H6OCH2CHOHCH2OHAMINO -C3H6NH2
DIMETILAMINO -C3H6N(CH3)2
NITRO -C2H4NO2
CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÍLICA (HILIC)
41
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO
IÓNICO
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
• Grupos cargados como SO3-, COO-, NH3
+ o NR3+ son
incorporados en una resina o en un gel.
• Las moléculas cargadas de analito compiten con los ionesde la fase móvil por los sitios de unión de la faseestacionaria.
42
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Intercambiador aniónico
Atrae aniones
Intercambiador catiónico
Atrae cationes
+
-
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
ABREVIATURAS EN COLUMNAS DE INTERCAMBIO IÓNICO
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Columna de intercambio catiónico Partisil SCX (25 cm x 4 mm)Fase móvil A: ácido 2-hidroxi-isobutírico en aguaGradiente de 0.03 a 0.07 MDetección VIS a 520 nm tras derivatización con 4-(piridilazo-resorcinol)
SEPARACIÓN DE LANTÁNIDOS
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA IÓNICA
Determinación de aniones en el agua de bebidaDeterminación de nitratos en vegetalesDeterminación de fluoruros en pasta de dientesDeterminación de ácidos orgánicos en bebidasDeterminación de amonio, potasio, nitrato y fosfatos en fertilizantesDeterminación de sodio y potasio en muestras clínicas (transfusiones)
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Análisis de una mezcla de aniones inorgánicos mediante cromatografía HPLC de intercambio iónico. Columna IonPac AG17-C AS17-C Dionex (250 x 4 mm). Fase móvil: hidróxido potásico (1 mM de 0 a 3 min, 1-12 mM de 3 a 10 min, 12-35 mM de 10 a 14 min). Flujo: 1.5 ml/min. Temperatura: 30 °C. Detección de conductividad con columna supresora. Fuente: catálogo de Dionex.
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
CROMATOGRAFO IÓNICO
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
GPC/SEC
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Fundamento de la separación
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Aspecto importantes de la separación
La separación tiene lugar en el volumen total de líquido en la columna. Se puede predecir el tiempo total de análisis. Los volúmenes de elución son bajos.
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
DESVENTAJASBaja resolución (picos anchos)
Posible interacción entre la fase estacionaria y la muestra.
APLICACIONES
Polímeros (GPC, gel permeation chromatography)
Proteínas y otros compuestos biológicos (SEC, size exclusionchromatography)
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Análisis de una mezcla de patrones de poliestireno mediante cromatografía HPLC de exclusión molecular (GPC). Condiciones: columna Chrompack Microgel 3 Mix (Varian) 250 x 7.7 mm, fase móvil tetrahidrofurano, 1.0 ml/min, detector de índice de refracción.
APLICACIONES: POLÍMEROS
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
CROMATOGRAFÍA QUIRAL
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
CROMATOGRAFÍA QUIRAL
Distribución de fármacos aprobados en el mundo de acuerdo a su quiralidad en el periodo 1983-2002
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
1) La fase móvil es quiral, la fase estacionaria no es quiral
2) La fase estacionaria es sólida y además quiral. La fase móvil no es quiral.
POSIBILIDADES EN CROMATOGRAFÍA QUIRAL
Los enantiómeros se pueden separar por cromatografía líquida, siempre y cuando el
sistema sea asimétrico (quiral)
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
• Componentes de un equipo HPLC• Tipos de Detectores• Fases móviles en HPLC• Parámetros cromatográficos• Tipos de cromatografía• Consideraciones prácticas
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
RIESGOS DE TRABAJO EN HPLCRIESGOS DE TRABAJO EN HPLC
Empleo de disolventes tóxicos
Riesgos derivados del empleo de altas presiones
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
DESGASIFICACIDESGASIFICACIÓÓN DE LA FASE MN DE LA FASE MÓÓVILVIL
Elimina los gases disueltos para prevenir la
formación de burbujas. Especialmente importante en
bombas de mezcla de baja presión.
Sistemas de desgasificación:
Helio
Vacío
Ultrasonidos
Desgasificadores on‐line
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
PRESIÓNLa presión es proporcional al caudal
La presión máxima de trabajo suele venir especificada en la columna:
Columnas de acero con material base de sílice: aprox. 4000-5000 psi
Columnas poliméricas (estireno-divinilbenceno): aprox. 600-1000 psi
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
CAUDAL
El tamaño de partícula, el tipo de relleno, la viscosidad de la fase móvil, la temperatura y las dimensiones de la columna condicionan el caudal.
Para columnas analíticas con base de acero:Material base de sílice: aprox. 0.5-2 mL/minColumnas poliméricas: aprox. 0.3-1 mL/min
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Volumen de inyección:En columnas analíticas, 5-25 µL
VOLUMEN DE INYECCIÓN
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
TROUBLESHOOTINGTROUBLESHOOTINGLO MÁS IMPORTANTE: LOCALIZAR EL PROBLEMA
FASE MÓVIL INYECTORFILTROS DEL SISTEMACOLUMNABOMBAPRECOLUMNATUBOS/CONECTORESDETECTOROPERADOR
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Preparar la muestra para que pueda analizarse en cualquier técnica analítica
HPLCLC – MSEspectrofotometría
Preparación de muestras
GCGC – MS
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Objetivos de la preparación de muestras
Eliminar los compuestos que coeluyen con el analito de interés.
Eliminar impurezas o residuos que puedan producir interferencias
Concentrar muestras para mayor sensibilidad
Eliminar las sales de una muestra
Proteger la columna analítica
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Tipos de preparación de muestras
Filtración
Extracción fase sólida
Extracción líquido – líquido
Precipitación de proteínas
Otros
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
FILTRACIFILTRACIÓÓN DE MUESTRAS Y N DE MUESTRAS Y DISOLVENTESDISOLVENTES
Eliminación de partículas insolubles a través de su paso por una membrana.
Las partículas pueden dañar el equipo, dañar la columna, influir en los resultados
Utilizar los filtros de membrana adecuados: muestrasacuosas - Acetato de celulosa; muestras orgánicas - Nylon, PTFE, PVDF. No utilizar filtros de acetato de celulosa con acetonitrilo
Filtros de las líneas de los disolventes: suelen ser de Titanio, 10 μm poro. Se limpian en sonicador, o pasando NO3H al 1%
Aumenta la vida de la columna
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Extracción en fase sólida (SPE)
Partición selectiva de uno o varios compuestos entre dos fases, donde una de ellas es fase sólida.
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Diferencias entre HPLC y SPE
< 50∼ 10 000No. Platos
∼ 1 cm5 – 30 cmLongitud columna
AltoBajoVol. extra columna
BajaAltaEficacia de empaquetamiento
40-80 μm∼ 5 μmTamaño de partícula
SPEHPLC
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Herramientas para SPE
Cartuchos
Placas
Discos
- Tema 3 -
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Tipo de fuerza a utilizarGravedad
- Tema 3 -
TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Presión positiva
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TEMA 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA (HPLC)
Estrategias para la SPE
Retener los compuestos de interés y eluir las impurezas.
• Retener las impurezas e interferencias en la matriz y dejar que los compuestos de interés pasen a través del cartucho con la fase.
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