CROMATOGRAFIAHistórico
M. TSWEET (1903): Separación de diferentespigmentos vegetales en columnas rellenadas con
adsorventes sólidos y solventes variados.
éter depetróleo
CaCO
3
mistura depigmentos
pigmentosseparados
Cromatografia =kroma [color] + graph [escribir]
(griego)
CROMATOGRAFIAModalidades y Clasificación
FM = Líquido
FM = Gas
CromatografiaLíquida
CromatografiaGasosa (CG)
En CG a FEpuede ser:
Sólida
Líquida
CromatografiaGas-Sólido (CGS)
CromatografiaGas-Líquido (CGL)
Cromatógrafo Gaseoso
1
2
3
4
6
5
1 - Reservorio de Gas y Controles de Vapor / Presión.2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra.3 - Columna Cromatográfica.4 - Detector.5 – Amplificador de Señal.6 - Registro de Señal (Registrador con Computadora).
Observación: en rojo: temperatura controlada
INSTRUMENTACIÓNGas de Arraste
Fase Móvil en CG: NO interacciona con la mues-tra - apenas se desliza a través de la columna.
Siendo usualmente referida como GAS DE GAS DE ARRASTEARRASTE
Requisitos:
INERTE No debe reaccionar con la muestra, fase estacionaria o superfícies del instrumento.
PURO Debe ser exento de impurezas que puedan degradar la fase estacionaria.
Impurezas típicas en gases y sus efectos:
oxida / hidroliza algunas FE
incompatibles con el DCEH2O, O2
hidrocarbonetos ruído sin señal del DIC
INSTRUMENTACIÓNGas de Arraste
Requisitos:
COSTO Gases de altísima pureza pueden ser muy caros.
COMPATIBILIDAD CON EL DETECTOR Cada detector demanda um gas de arraste específico
para mejor funcionamiento.
Selección de Gases de Arraste en Función del Detector:
He , H2DCT
DIC N2 , H2
DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4
CO
ST
O
PUREZA
AB
CA = 99,995 % (4.5)
B = 99,999 % (5.0)
C = 99,9999 % (6.0)
INSTRUMENTACIÓNAlimentación del Gas de Arraste
Componentes necesarios en la linea de gas:
controladores de vapor / presión de gas
dispositivos para purificación de gas (“traps”)
1
2
34
5
6
1 - Cilindro de Gas2 - Regulador de Presión Primario
3 - “Traps” para eliminar impurezas del gas4 - Regulador de Presión Secundario
5 - Regulador de Vapor (Controlador Diferencial de Flujo)6 - Medidor de Vapor (Rotametro)
Nota: Tubos y Conecciones: Acero Inox o Cobre
INSTRUMENTACIÓNInyector “en-columna” Convencional
1
2
3
4
1 - Septo (silicona)2 - Alimentación de gas de arraste3 - Bloque metálico caliente4 - Punta de columna cromatográfica
INSTRUMENTACIÓNInyección “en-columna” de líquidos
1 2 3
1 - Punta de aguja de microjeringa introducida al inicio de la coluna.
2 – La muestra inyectada y vaporizada instantaneamente al inicio de la columna.
3 - “Plug” de vapor de mustra forzado para gas de arraste a fluir por la columna.
INSTRUMENTACIÓNParametros de Inyección
TEMPERATURA DE INYECTOR Debe ser sufi-cientemente elevada para que la muestra se vaporice imediatamente, sin descomposición
Regla Gral: Tinj = 50oC encima de la temperatura de ebulición del componente
menos volátil
VOLUMEN INYECTADO Depende del tipo de columna y del estado físico de la muestra
Columna empaq.
muestrasGasosas
muestrasLíquidas
= 3,2 mm (1/4”)0,1 ml ... 50 mL0,2 L ... 20 L
capilar = 0,25 mm 0,001 ml ... 0,1 mL0,01 L ... 3 L
Sólidos: convencionalmente se disuelve en un solvente adecuado y se inyecta la solución
INSTRUMENTACIÓNMicrojeringas para Inyección
LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L
êmbolo
cuerpo (pirex)
aguja (inox 316)
Microjeringa de 10 L:
Microjeringa de 1 L (sección ampliada):
cuerpo
guia
embolo
aguja
INSTRUMENTACIÓNColmunas: Definiciones Básicas
EMPAQUETADA = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 mRelleada con sólido pul-verizado (FE sólida o FE líquida depositada sobre las partículas de relleno)
CAPILAR = 0,1 a 0,5 mmL = 5 m a 100 m
Paredes internas recubier-tas con un film fino
(fracción de m) de FE líquido o sólido
INSTRUMENTACIÓNTemperatura de la Columna
TE
MP
ER
AT
UR
A D
E L
A
CO
LU
MN
A
CONTROL CONFIABLE DE LA TEMPERATURA DE LA COLUMNA ES ESENCIAL PARA OBTENER BUENA
SEPARACIÓN EN CG
INSTRUMENTAÇÃOForno da Coluna
Características Desejáveis de um Forno:
FÁCIL ACESSO À COLUNA A operação de troca de coluna pode ser frequente.
AQUECIMENTO E ESFRIAMENTO RÁPIDO Importante tanto em análises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analíticas novas.
TEMPERATURA ESTÁVEL E REPRODUTÍVEL
A temperatura deve ser mantida com exatidão e precisão de ± 0,1°C.
Em cromatógrafos modernos (depois de 1980),o controle de temperatura do forno é totalmente
operado por microprocessadores.
INSTRUMENTAÇÃOProgramação Linear de Temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes)
separadas ISOTERMICAMENTE:
TCOL BAIXA:
- Componentes mais voláteis são separados
- Componentes menos volá-teis demoram a eluir, saindo
como picos mal definidos
TCOL ALTA:
- Componentes mais volá-teis não são separados
- Componentes menos volá-teis eluem mais rapidamente
INSTRUMENTAÇÃOProgramação Linear de Temperatura
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:
Consegue-se boa separação dos
componentes da amostra em menor
tempo
TEMPO
TE
MP
ER
AT
UR
A
tINI tFIM
TINI
TFIM
R
Parâmetros de uma programação de temperatura:
TINI Temperatura Inicial
TFIM Temperatura Final
tINI Tempo Isotérmico Inicial
tFIM Tempo Final do Programa
R Velocidade de Aquecimento
INSTRUMENTAÇÃOProgramação Linear de Temperatura
Possíveis problemas associados à PLT:
VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura.
viscosidade vazão
DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE Devido ao aumento de volatilização de FE líquida
INSTRUMENTAÇÃODetectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluido, gerando sinal quando da pas-
sagem de substâncias que não o gás de arraste
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMAIdealmente: cada substância separada aparece
como um PICO no cromatograma.
INSTRUMENTAÇÃODetectores
Mais Importantes:
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS
(DCE OU ECD) Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos.
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA
(DCT OU TCD) Variação da condutividade térmica do gás de arraste.
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC
OU FID) Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H2 + ar.
REGISTRODE
SINAL
ANALÓGICORegistradores XY
DIGITALIntegradores
Computadores
FASES ESTACIONÁRIASConceitos Gerais
LÍQUIDOS Depositados sobre a superfície de: só-lidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas capilares)
FElíquida
SUPORTESólido inerte
poroso
Tubo capilar de material inerte
SÓLIDOS Colunas recheadas com material finamente granulado (empacotadas) ou depositado
sobre a superfície interna do tubo (capilar)
Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização, normalmente ela é:
Entrecruzada: as cadeias poliméricas são quimicamente
ligadas entre si
Quimicamente ligadas: as cadeias poliméricas
são “presas” ao suporte por ligações químicas
FASES ESTACIONÁRIASCaracterísticas de uma FE ideal
SELETIVA Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra.
Regra geral: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem
separados (polar, apolar, aromático ...)
FE Seletiva: separação
adequada dos constituintes da
amostra
FE pouco Seletiva: má resolução
mesmo com coluna de boa eficiência
FASES ESTACIONÁRIASCaracterísticas de uma FE ideal
AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO Maior flexibilidade na otimização da separação.
BOA ESTABILIDADE QUÍMICA E TÉRMICA Maior durabilidade da coluna, não reage com componentes da amostra
POUCO VISCOSA Colunas mais eficientes (menor resistência à transferência do analito entre fases)
DISPONÍVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZA Colunas reprodutíveis; ausência de picos “fantasma” nos cromatogramas.
FASES ESTACIONÁRIASFE Sólidas: Adsorção
O fenômemo físico-químico responsável pela
interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO
A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida
ADSORÇÃO
Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros)
Solutos polares
Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de eletrons...)
COLUNAS EMPACOTADASDefinições Básicas
Tubo de material inerte recheado com FE sólida gra-nulada ou FE líquida depositada sobre suporte sólido.
MATERIALDO
TUBO
ø = 3 mm a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
aço inox
vidro pirex
níquel
TEFLON
Granulometriado
recheio80 - 100 mesh 149 - 177 m
100 - 120 mesh 125 - 149 m
60 - 80 mesh 177 - 250 m
MESH dp
Eficiência maximizada com:
- Diminuição de dC
- Diminuição de dp
- Recheio regular
Limitados pela resistência à passagem de gás de arraste
COLUNAS EMPACOTADASFE Líquidas: Suporte
A FE líquida deve ser disposta sobre um
SUPORTE sólido
área superficial entre 0,5 e 10 m2.g-1
microporos regulares (~ 1 m)
NÃO interagir com a amostra
boa resistência mecânica
Uso quase universal: TERRA DIATOMÁCEA
Esqueletos fósseis
(SiO2 + óxidos
metálicos) de algas
microscópicas
ChromosorbAnachrom
Supelcoport...
secagem
calcinação
fusão com soda
lavagem com ácido
silanização
COLUNAS CAPILARESDiâmetro Interno
dC = Eficiência
0,10 mm 0,25 mm0,32 mm 0,53 mm
1 2 3
Valores comuns:
1Colunas de altíssima eficiência (amostras
complexas, “Fast GC”); capacidade volumétrica limitada de processamento de amostra
2Diâmetros mais comuns; capacidade
volumétrica limitada de amostra requer dispositivos especiais de injeção
3Colunas “megabore”: menor eficiência, mas maior capacidade de processamento permite
uso de injetores convencionais
COLUNAS CAPILARESColunas Capilares: Injeção
1
2
3
45
6
1 - Septo;2 - Entrada de gás de arraste;3 - “Liner” (misturador);4 - Coluna Capilar5 - Purga de gás de arraste;6 - Válvula de controle de purga.
Baixa capacidade de processamento de amostra (sub-microlitro)
Injeção direta com microseringa muito difícil !!!
Injetores com divisão (“splitters”) Sistema pneumático despreza fração da amostra injetada
- Menor sensibilidade (boa parte da amostra é desprezada)
- Divisão da amostra raramente é uniforme (fração purgada dos constituintes menos voláteis é sempre menor)
- Ajuste da razão de divisão é mais uma fonte de erros
COLUNAS CAPILARESLarge Volume Injection (LVI)
Combinando injetores com temperatura programada, vál-vulas controladas por microprocessador e pré-colunas pode ser feita injeção de grandes volumes (> 100 L) de amostra
1 Colunas e injetor frios;
válvula de purga aberta (solvente é
eliminado)
2 Colunas e injetor aquecidos; válvula de purga
fechada (constituintes de
interesse transferidos para coluna analítica)
COLUNAS CAPILARESColunas Multicapilares
“Feixes” paralelos de colunas capilares
com dC convencional
- Eficiência próxima à das colunas convencionais- Capacidade similar à das colunas empacotadas- Colunas mais curtas: análises mais rápidas
Separação de explosivos em coluna multicapilar (OV-17,
1000 capilares x 6 m)
1 - 2,6-DNT2 - 2,4-DNT3 - 2,4,6-TNT4 - 3,4,5-TNT5 - 2,3,4-TNT6 - RDX ?7 - tetryl
DETECTORESParâmetros Básicos de Desempenho
QUANTIDADE MÍNIMA DETECTÁVEL Massa de um analito que gera um pico com altura igual a três vezes o nível de ruído
SIN
AL
(S
)
RUÍDO (N)
= 3SN
RUÍDO Qualquer componente do sinal gerado pelo detector que não se origina da amostra
Fontesde
Ruído
Contaminantes nos gases
Impurezas acumuladas no detector
Aterramento elétrico deficiente
DETECTORESDetector por Ionização em Chama
PRINCÍPIO Formação de íons quando um composto é queimado em uma chama de hidrogênio e oxigênio
O efluente da coluna é misturado com H2 e O2 e
queimado. Como numa chama de H2 + O2 não
existem íons, ela não conduz corrente elétrica.
Quando um composto orgânico elui, ele também é
queimado. Como na sua queima são formados íons, a
chama passa a conduzir corrente elétrica
DETECTORESDetector por Ionização em Chama
COLETOR
FLAME TIP
BLOCO
AR
H2
COLUNA
O ar e o H2 difundem para o interior do coletor, onde se
misturam ao efluente da coluna e queimam:
Uma diferença de potencial elétrico é aplicada entre o flame
tip e o coletor - quando se formam íons na chama, flue uma
corrente elétrica:
DETECTORESDetector por Ionização em Chama
Química da Chama de Hidrogênio:
Incandescência
Reação
Quebra
Estrutura da chama
três regiões básicas
Região de quebra Mistura dos gases, pré-aquecimento, início da quebra das moléculas de H2, O2 e dos analitos.
Zona de reação Reações exotérmicas com produção e/ou consumo de radicais H, O, OH, HO2 (provenientes do H2), CH e C2 (proveniente do analito) e íons CHO+ (analito).
Zona de incandescência Emissão de luz por decaimento de espécies excitadas: OH (luz UV), CH e C2 (visível).
Queima de substâncias com ligações C-H
CH + O CHO+ + e-
1 íon formado a cada ~105 átomos de C queimados
Queima de H2
Formam-se apenas radicais !!!
ventajas de la cromatografía gaseosa
limitaciones de la cromatografía gaseosa
1.eficiente, permite alta resolución
1.la muestra debe ser volátil
1.requiere muestras pequeñas (ml)
1.no aplicable a muestras termolábiles
1.alta sensibilidad, detecta ppm y a menudo ppb
1.muestras “sucias” requieren de un clean-up
previo
1.cuantitativa (en ciertas condiciones)
1.se debe utilizar otro sistema de detección (ej. MS) para la confirmación
la identificación
1.alta velocidad de análisis1.es necesario algo de
entrenamiento y experiencia
1.buena exactitud
1.fácil de usar, bien conocida
BIBLIOGRAFIA
• http://mail.fq.edu.uy/~planta/pdf/FarmacognosiaPE80/GC.doc
• http://www.chemkeys.com/esp/md/mds_7/cgced_1/cgced_1.htm