Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Paula Michelle Sepúlveda Ramos
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Área Curricular de Farmacia
Bogotá, Colombia
2021
Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Paula Michelle Sepúlveda Ramos
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias Farmacéuticas
Directora:
DSc. Diana Marcela Aragón Novoa
Codirector:
PhD. Geison Modesti Costa
Línea de Investigación:
Plantas con actividad antidiabética
Grupos de Investigación:
Principios Bioactivos en plantas Medicinales (Universidad Nacional de Colombia)
Grupo de Investigación Fitoquímica Universidad Javeriana (Pontifica Universidad Javeriana)
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias, Área Curricular de Farmacia
Bogotá, Colombia
2021
A mis padres.
Ustedes son la luz que guía mi camino.
Agradecimientos
Agradezco a la Universidad Nacional de Colombia, la Facultad de Ciencias, y especialmente, al
Departamento de Farmacia, por mi formación como profesional e investigadora.
Gracias a COLCIENCIAS, por la financiación del proyecto “Estudio de la actividad antidiabética
de un extracto nanovehiculizado de hojas de Passiflora ligularis (granadilla)” (Contrato 836 de
2017).
A mi directora, Marcela Aragón, por darme la oportunidad de hacer parte de este proyecto, por
motivarme desde un principio a ir un poco más allá de lo fundamental; a proponer y solucionar.
Por impulsar mayor confianza en mi criterio y capacidades. No pude haber tenido mejor tutora.
A mi codirector, Geison Costa, por su constante disposición a resolver mis dudas, su apoyo y
motivación permanente.
A los profesores Leonardo Castellanos y Freddy Ramos, por ser parte fundamental de mi
formación académico-investigativa. Gracias por sus enseñanzas, apoyo incondicional, y la
confianza depositada en mí desde el pregrado. Por mantener siempre las puertas abiertas del
grupo “Estudio y aprovechamiento de productos naturales marinos y frutas de Colombia”. A
mis marineros eméritos, Luz Adriana, Sandra, Farja, Charlie, Adriana, Diana, Gabriel, Paola y
Juan David, aprender con y de ustedes, hizo la experiencia a diario mucho más feliz, pues las
risas nunca faltaron. A Vane, tu llegada al grupo, y amistad, fue la más inesperada de todas pero
la más oportuna, hubiese sido más difícil culminar la etapa final del posgrado sin tu apoyo. A
los demás marineros, somos una gran familia para nombrarlos a todos, pero una familia al fin
y al cabo.
Al grupo de trabajo del NanoPK Lab, empezando por el profesor Luis Fernando Ospina, gracias
por los consejos y apoyo en la realización de los bioensayos. A mis compañeras, Diana Vásquez,
Diana Rey, Gina, Maria Isabel, y Andrea, porque no hay mejor motivación que ser parte de un
grupo de mujeres inteligentes y perseverantes. Pero especialmente, a Ivonne, por su
conocimiento y ayuda indispensable en el desarrollo de los ensayos de permeabilidad; y a
Sandra, con quien desde un principio formamos el mejor equipo de trabajo, gracias por
enseñarme tanto, motivarme a diario, pero ante todo, por tu amistad.
A mis mejores amigos. Simón, gracias por tu compañía a largo de este proceso, contar con tu
apoyo es siempre motivo de alegría; y a Mateo, compartir la experiencia de la maestría contigo
hizo que el camino fuese aún mejor, porque aprendimos y crecimos juntos.
Finalmente, a mi familia y motor en la vida. Especialmente a mis padres, que son mi mayor
ejemplo a seguir a diario. Gracias por su amor y apoyo totalmente incondicional.
Resumen y Abstract IX
Resumen
Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Passiflora ligularis, comúnmente conocida como granadilla, es una especie que ha demostrado
resultados prometedores de actividad hipoglicemiante/antidiabética. Con el presente trabajo,
se aplicó la utilidad del Sistema de Clasificación Biofarmacéutica en el estudio de nuevos
principios activos, para caracterizar y evaluar un extracto de hojas de P. ligularis, como matriz
de partida útil en el de diseño y desarrollo de una formulación; y así, contribuir al desarrollo
de un producto fitoterapéutico a partir de las hojas de esta especie.
Inicialmente, se estandarizaron las condiciones de extracción de flavonoides (considerados
como los marcadores activos) a partir de las hojas, mediante extracción asistida por
ultrasonido, para lo cual, previamente se desarrolló y validó una metodología analítica por
UHPLC-DAD. Se evaluó la actividad farmacológica del extracto optimizado según un modelo in
vitro de actividad antiglicante y, en el modelo in vivo de tolerancia a la glucosa en ratones Swiss
ICR. Adicionalmente, se determinó la estabilidad bajo condiciones de estrés, y las
características biofarmacéuticas, solubilidad y permeabilidad intestinal, del extracto
optimizado, en función de los marcadores activos.
De acuerdo con el análisis de superficie de respuesta, las condiciones óptimas de extracción
de flavonoides por ultrasonido fueron, etanol 63%, 70ºC, durante 33 minutos; el extracto
optimizado demostró mayor actividad inhibitoria de la formación de los productos finales de
glicación avanzada, y, mejor actividad anti-hiperglicemiante, que un extracto de las hojas
obtenido por infusión, método de extracción de la medicina tradicional. Por otro lado, se
catalogó el extracto optimizado como prácticamente estable, fotoestable, lábil y muy lábil, bajo
condiciones oxidativas, fotolíticas, de hidrólisis neutra e hidrólisis ácida-básica,
respectivamente.
Por último, se comprendieron algunos de los factores que influencian el proceso de absorción
intestinal de los flavonoides presentes en el extracto, como su alta solubilidad, y baja
permeabilidad en el modelo in situ SPIP (Single Pass Intestinal Perfusion), que permitieron
catalogarlo dentro de la clase III del sistema de clasificación biofarmacéutico (SCB). Con el fin
de evaluar posibles efectos de la matriz vegetal sobre las propiedades biofarmacéuticas de los
marcadores activos, se estudiaron dichas características en el flavonoide mayoritario
(isoquercetina), al ser un componente dentro del extracto o un compuesto puro. En el primer
caso, se clasificó también dentro de la clase III, y en el segundo, como clase II (baja solubilidad-
alta permeabilidad); considerándose la baja solubilidad como uno de los mayores retos a
superar en etapas de investigación y desarrollo
Debido a todo lo anterior, se propone aprovechar el extracto optimizado y caracterizado de
hojas de P. ligularis, aplicando estrategias de tecnología farmacéutica que favorezcan la
permeabilidad de principios activos clase III, para el diseño y desarrollo de un potencial
producto fitoterapéutico, que ayude en el tratamiento de la hiperglicemia y/o diabetes.
Palabras clave: Passiflora, extracción asistida por ultrasonido, SCB, permeabilidad,
solubilidad, diabetes.
Abstract
Contribution to the biopharmaceutical characterization of an extract of leaves of
Passiflora ligularis (granadilla) optimized in flavonoids
Passiflora ligularis, commonly known as granadilla, is a species that has shown promising
results of hypoglycemic/antidiabetic activity. With the present work, the usefulness of the
Biopharmaceutical Classification System in the study of new active principles, was applied to
characterize and evaluate an extract of P. ligularis leaves, as an active multicomponent matrix,
useful in the design and development of a formulation; and thus, contribute to the
development of a herbal medicinal product from the leaves of this species.
Initially, the extraction conditions by ultrasound-assisted extraction of the leaves flavonoids
(considered as active markers) were standardized, for which an analytical methodology was
previously developed and validated by UHPLC-DAD. The pharmacological activity of the
optimized extract was evaluated according to the an in vitro model of antiglycation activity
and, in the in vivo model of glucose tolerance in Swiss ICR mice. Additionally, the stability
under stress conditions, and the biopharmaceutical characteristics, solubility and intestinal
permeability, of the optimized extract were determined, as a function of the active markers.
According to the response surface analysis, the optimal flavonoid extraction conditions by
ultrasound were 63% ethanol, 70 °C, for 33 minutes. The optimized extract showed greater
inhibitory activity on the formation of advanced glycation end products, and better anti-
hyperglycemic activity, than a leaf extract obtained by infusion, an extraction method of
traditional medicine. On the other hand, the optimized extract was classified as practically
stable, photostable, labile and very labile, under oxidative, photolytic, neutral hydrolysis and
acid-base hydrolysis conditions, respectively.
Finally, some of the factors that influence the intestinal absorption process of the flavonoids
present in the extract were understood, such as their high solubility and low permeability in
the SPIP (Single Pass Intestinal Perfusion) in situ model, which allowed it to be classified
within Class III of the Biopharmaceutical Classification System (SCB). In order to evaluate
possible effects of the plant matrix on the biopharmaceutical properties of the active markers,
these characteristics were studied in the major flavonoid (isoquercetin), as a component
within the extract or as a pure compound. In the first case, it was also classified within class
III, and in the second one, as class II (low solubility-high permeability). Low solubility is
considered as one of the greatest challenges to overcome during research and development
stages.
Due to all of the above, it is proposed to use the optimized and characterized extract of P.
ligularis leaves, applying pharmaceutical technology strategies that favor the permeability of
class III active principles, for the design and development of a potential herbal medicinal
product, which helps in the treatment of hyperglycemia and/or diabetes.
Keywords: Passiflora, ultrasound-assisted extraction, SCB, permeability, solubility, diabetes.
Contenido XV
Contenido
Pág.
Resumen IX
Lista de figuras .................................................................................................................................. XVII
Lista de tablas ...................................................................................................................................... XX
Lista de Símbolos y abreviaturas ................................................................................................ XXII
Introducción ............................................................................................................................................ 1
1. Marco Teórico ................................................................................................................................. 5 1.1 Sistema de Clasificación Biofarmacéutica ................................................................................... 5
1.1.1 SCB aplicado a extractos vegetales .................................................................................. 7 1.2 Género Passiflora ..................................................................................................................................... 9
1.2.1 Passiflora ligularis (Granadilla) ...................................................................................... 12
Objetivos 17
2. Desarrollo y validación de metodología analítica para la cuantificación de flavonoides presentes en hojas de P. ligularis ........................................................................... 19
2.1 Metodología............................................................................................................................................. 20 2.1.1 Reactivos y equipos .............................................................................................................. 20 2.1.2 Material vegetal ...................................................................................................................... 20 2.1.3 Extractos analizados ............................................................................................................ 21 2.1.4 Curvas de calibración preparadas ................................................................................. 21
2.2 Resultados y Discusión ...................................................................................................................... 23 2.2.1 Desarrollo de la metodología analítica ....................................................................... 23 2.2.2 Validación de la metodología analítica ....................................................................... 26 2.2.3 Análisis de los flavonoides presentes en el extracto optimizado de hojas de granadilla mediante UHPLC-MS/MS ................................................................................................ 29
2.3 Conclusiones ........................................................................................................................................... 40
3. Obtención de un extracto de hojas de P. ligularis optimizado en flavonoides con actividad hipoglicemiante ................................................................................................................ 41
3.1 Metodología............................................................................................................................................. 41 3.1.1 Material vegetal ...................................................................................................................... 41 3.1.2 Planteamiento del diseño experimental para el proceso de extracción por ultrasonido ................................................................................................................................................... 41 3.1.3 Procedimiento de extracción por ultrasonido......................................................... 42
3.1.4 Ensayo de actividad inhibitoria de la formación de productos finales de glicación avanzada (AGEs)..................................................................................................................... 43 3.1.5 Evaluación in vivo de la actividad hipoglicemiante ............................................... 45 3.1.6 Análisis estadístico ................................................................................................................ 46
3.2 Resultados y Discusión ....................................................................................................................... 47 3.2.1 Determinación del tamaño de partícula del material vegetal a extraer ...... 47 3.2.2 Optimización de flavonoides totales mediante extracción asistida por ultrasonido .................................................................................................................................................... 49 3.2.3 Correlación entre el CFT y la actividad antiglicante de extractos de P. ligularis 61 3.2.4 Evaluación in vivo de la actividad hipoglicemiante de extractos de hojas de Passiflora ligularis ...................................................................................................................................... 66
3.3 Conclusiones ............................................................................................................................................ 68
4. Estabilidad del extracto optimizado de P. ligularis bajo condiciones de estrés ...... 69 4.1 Metodología ............................................................................................................................................. 70
4.1.1 Condiciones de hidrólisis, oxidación y degradación fotolítica ......................... 70 4.2 Resultados y Discusión ....................................................................................................................... 75
4.2.1 Estabilidad bajo condiciones de estrés de hidrólisis neutra ............................. 76 4.2.2 Estabilidad bajo condiciones de estrés de hidrólisis ácida ................................ 78 4.2.3 Estabilidad bajo condiciones de estrés de hidrólisis básica .............................. 80 4.2.4 Estabilidad bajo condiciones de estrés de oxidación ........................................... 82 4.2.5 Estabilidad bajo condiciones de estrés fotolíticas ................................................. 85
4.3 Conclusiones ............................................................................................................................................ 87
5. Caracterización biofarmacéutica del extracto optimizado de P. ligularis ................. 89 5.1 Metodología ............................................................................................................................................. 90
5.1.1 Determinación de la solubilidad ..................................................................................... 90 5.1.2 Determinación de la permeabilidad intestinal mediante el modelo Single Pass Intestinal Perfusion (SPIP) ......................................................................................................... 92 5.1.3 Análisis estadístico ............................................................................................................. 100
5.2 Resultados y discusión .................................................................................................................... 100 5.2.1 Solubilidad de flavonoides totales e isoquercetina en el extracto optimizado .................................................................................................................................................. 100 5.2.2 Evaluación de la permeabilidad de los flavonoides presentes en el extracto optimizado .................................................................................................................................................. 107 5.2.3 Clasificación biofarmacéutica de los flavonoides presentes en el extracto optimizado de P. ligularis .................................................................................................................... 115
5.3 Conclusiones ......................................................................................................................................... 119
6. Conclusiones y recomendaciones ....................................................................................... 121 6.1 Conclusiones ......................................................................................................................................... 121 6.2 Recomendaciones .............................................................................................................................. 122
A. Anexo: Información suplementaria Capítulo 2 y 3......................................................... 123
B. Anexo: Información suplementaria capítulo 5................................................................ 126
Bibliografía ......................................................................................................................................... 131
Lista de Figuras XVII
Lista de figuras Pág.
Figura 1-1: A. Flor de Passiflora ligularis. B. Fruto granadilla. C. Hojas de Passiflora ligularis
(72). ...................................................................................................................................................................................... 12
Figura 2-1: Perfiles cromatográficos (350 ηm) obtenidos para el extracto de hojas de P.
ligularis tras realizar diferentes modificaciones al método A. Se utilizó la Columna
Phenomenex® Kinetex C18 (100 × 2,1 mm; 2,6 μm) y volumen de inyección 10 μL en todos los
casos..................................................................................................................................................................................... 24
Figura 2-2: Cromatogramas del extracto optimizado de hojas de P. ligularis mediante UHPLC-
MS/MS. A) Cromatograma UV a 350 ηm. B) Cromatograma de iones totales (TIC). Se presenta
con numeración los picos con espectros de absorción característicos de flavonoides; en azul
los flavonoides identificados, y en rojo compuestos fenólicos sin identificar. ................................ 30
Figura 2-3: Esqueletos estructurales de las principales clases de flavonoides. Las flechas
indican las posiciones de O- y C- glicosilaciones más comunes (102). ................................................ 37
Figura 3-1: Distribución del tamaño de partícula de las hojas de P. ligularis molidas en un
molino de cuchillas. ...................................................................................................................................................... 48
Figura 3-2: Superficie de respuesta (A) y gráfico de contorno (B) del contenido total de
flavonoides (CFT) (mg-eq isoquercetina/g extracto seco) en función del porcentaje de etanol
y la temperatura, manteniendo el factor tiempo en un nivel medio constante (40 min). ......... 53
Figura 3-3: Superficie de respuesta (A) y gráfico de contorno (B) del contenido total de
flavonoides (CFT) (mg-eq isoquercetina/g extracto seco) en función del porcentaje de etanol
y el tiempo, manteniendo el factor de temperatura a un nivel medio constante (50 ºC). ......... 53
Figura 3-4: Superficie de respuesta (A) y gráfico de contorno (B) del contenido total de
flavonoides (CFT) (mg-eq isoquercetina / g extracto seco) en función de la temperatura y el
tiempo, manteniendo el factor de etanol en un nivel medio constante (80%). .............................. 54
Figura 3-5: Cromatograma del extracto optimizado por ultrasonido (naranja) y el extracto
obtenido por infusión (negro). Condiciones cromatográficas descritas en la sección 2.2.1.... 56
Figura 3-6: Fenómeno de cavitación acústica durante la extracción asistida por ultrasonido.
Modificado de Lavilla I, Bendicho C. Fundamentals of ultrasound-assisted extraction. En: Water
Extraction of Bioactive Compounds: From Plants to Drug Development. Elsevier; 2017. p. 294.
(122) .................................................................................................................................................................................... 58
Figura 3-7: Formación endógena de AGEs. ..................................................................................................... 61
Figura 3-8: Relación monotónica entre el contenido de flavonoides totales y la actividad
antiglicante de los extractos de hojas de P. ligularis. Quercetina utilizada como control positivo
(70 µg/mL) presentó un porcentaje de inhibición de 96.92 ± 3.76 %. ................................................62
Figura 3-9: Actividad anti-hiperglicemiante de extractos de hojas de P. ligularis. NGS: Niveles
de glucosa en sangre. Los datos se expresan como promedio ± SEM, n = 6 animales por grupo;
fueron analizados mediante un ANOVA de dos vías, seguido de una prueba Tukey con un valor
de **p <0.01 y ****p <0.0001 con respecto al grupo vehículo; #p <0.05 respecto al extracto de
infusión. ..............................................................................................................................................................................67
Figura 4-1: Montajes para evaluar condiciones de estrés hidrolíticas. A. Montaje de hidrólisis
neutra, ácida, o básica en reflujo. B. Montaje de hidrólisis neutra, ácida, o básica, a 40ºC. .......71
Figura 4-2: Diagrama de decisión seguido para determinar la estabilidad en condiciones de
hidrólisis neutra (pH del agua entre 5-6)...........................................................................................................71
Figura 4-3: Diagrama de decisión seguido para determinar la estabilidad en condiciones de
hidrólisis ácida y básica. .............................................................................................................................................72
Figura 4-4: Diagrama de decisión seguido para determinar la estabilidad en condiciones de
peroxidación. ....................................................................................................................................................................73
Figura 4-5: A. Cámara de fotoestabilidad. B. Muestras de extracto optimizado de P. ligularis
sometido a las condiciones de estrés fotolíticas. ............................................................................................74
Figura 4-6: Diagrama de decisión seguido para determinar la estabilidad en condiciones de
estrés fotolíticas. .............................................................................................................................................................74
Figura 4-7: Cromatograma UV a 350 ηm del extracto optimizado de hojas de P. ligularis
mediante las condiciones cromatográficas descritas en la sección 2.1.3. Los picos numerados
en azul corresponden a los flavonoides identificados y en rojo compuestos fenólicos sin
identificar. ..........................................................................................................................................................................75
Figura 4-8: Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés de hidrólisis
neutra -agua, 12h, reflujo- en tiempo cero (negro) y punto final (azul). Los picos numerados en
negrilla representan los flavonoides de identidad conocida que presentaron principales
cambios. Condiciones cromatográficas descritas en la sección 2.2.1 ..................................................76
Figura 4-9: Propuesta de degradación por hidrólisis neutra. Ejemplificación de la
transformación de quercetina-3-O-(6''-malonil)-glucósido (1) a quercetina-3-O-glucósido (3).
.................................................................................................................................................................................................77
Figura 4-10: Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés a pH ácido –
HCl 0.01N, 8h, 40ºC- en tiempo cero (negro) y punto final (azul). Los picos numerados en
negrilla representan los flavonoides de identidad conocida que presentaron principales
cambios. Condiciones cromatográficas descritas en la sección 2.2.1. .................................................78
Figura 4-11: Propuesta de degradación por hidrólisis ácida. Ejemplificación de la
transformación de luteolina-7-O-(6''-malonil)-glucósido (9) a luteolina-7-O-glucósido (2). ..79
Figura 4-12: Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés a pH básico –
NaOH 0.01N, 8h, 40ºC- en tiempo cero (gris) y punto final (azul). Los picos numerados en
negrilla representan los flavonoides de identidad conocida que presentaron principales
cambios. Condiciones cromatográficas descritas en la sección 2.2.1. .................................................81
Figura 4-13: Degradación por hidrólisis básica. A. Propuesta del mecanismo de hidrólisis del
enlace tipo éster; ejemplificación de la transformación de crisina-7-O-(6”-O-acetil)-glucósido
(13) en crisina-7-O-glucósido (12). B. Mecanismo de hidrólisis del enlace glucosídico
(179,180); ejemplo de degradación de quercetina-3-O-glucósido (1). El grado de
desprotonación en la estructura depende del pH del medio y valor de pKa de cada uno de los
hidroxilos fenólicos. ..................................................................................................................................................... 82
Figura 4-14: Ejemplo de oxidación de flavonoides (178). ....................................................................... 84
Figura 4-15: Cromatogramas del extracto optimizado bajo condiciones de oxidación con H2O2
30%, temperatura ambiente. A. Comparación perfiles en tiempo cero (negro) y punto final 24h
(rosa). Los picos numerados en negrilla representan los flavonoides de identidad conocida
que presentaron principales cambios. B. Comparación entre el perfil de peroxidación punto
final 24h (rosa) e hidrólisis neutra a las 12h (azul). Condiciones cromatográficas descritas en
la sección 2.2.1. .............................................................................................................................................................. 85
Figura 4-16: A. Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés fotolíticas.
En tiempo cero (negro) y punto final día 30 (azul). B. Características estructurales que
disminuyen la fotoestabilidad de flavonoides. Condiciones cromatográficas descritas en la
sección 2.2.1. ................................................................................................................................................................... 87
Figura 5-1: Montaje para ensayo de perfusión intestinal de un solo paso. A. Calentador de
ambientes. B. Zona quirúrgica. C. Cubeta para recolección de residuos y ubicación de viales
colectores. D. Bomba peristáltica. E. Plancha de calentamiento y agitación magnética con
muestras a perfundir. F. Viales de vidrio de 10 mL vacíos y pesados. G. Balanza analítica. ..... 97
Figura 5-2: Ilustración de la canulación de los segmentos intestinales. ........................................... 98
Figura 5-3: A. Solubilidad aparente de flavonoides totales en soluciones acuosas a diferente
pH y temperatura. B. Solubilidad de isoquercetina como componente del extracto optimizado
(ISQ-OPT) y como compuesto puro (ISQ-EST), en soluciones acuosas a diferente pH y
temperatura. Los datos se expresan como promedio ± DS (n=3); fueron analizados mediante
un ANOVA de dos vías, seguido de una prueba Sidak de múltiples comparaciones para las
solubilidades de cada solución entre las dos temperaturas, con un valor de significancia **p
<0.01, ***p <0.001 y ****p <0.0001. .................................................................................................................. 102
Figura 5-4: Principales mecanismos de permeación intestinal de fármacos. A, difusión
transcelular; B, transporte paracelular; C, transporte transcelular facilitada por
transportadores; D, transcelular activo mediado por transportadores; E, eflujo. Figura creada
en BioRender.com. ..................................................................................................................................................... 110
Figura 5-5: Coeficiente de permeabilidad efectiva de FT (A) e isoquercetina contenida en el
extracto optimizado ISQ-OPT y como estándar ISQ-EST (B), por SPIP en ratas (n=5). ........... 112
Figura 5-6: Posibles mecanismos de absorción reportados para isoquercetina. Q-3-gluc:
quercetina-3-O-glucósido; Q: quercetina; LPH: lactasa-floricina hidrolasa; SGLT1:
transportador de glucosa dependiente de sodio; β-G: β-glucosidasa; UGT: uridina-difosfato
glucuroniltransferasa; Q-glucA: glucurónidos de quercetina. Modificado de Gee,J; et al. 2000,
(220). Figura creada en BioRender.com. ........................................................................................................ 113
Lista de tablas XX
Lista de tablas Pág.
Tabla 1-1: Principales actividades terapéuticas para las hojas de algunas especies del género
Passiflora. ...........................................................................................................................................................................10
Tabla 1-2: Metabolitos identificados a partir de extractos polares de hojas de P. ligularis. ....14
Tabla 2-1: Soluciones preparadas para cada curva de calibración. .....................................................22
Tabla 2-2: Rango de concentraciones para las curvas de calibración de flavonoides totales,
isoquercetina y astragalina que cumplen con el parámetro de linealidad de acuerdo con la
prueba t-student. ............................................................................................................................................................28
Tabla 2-3: Datos de precisión y exactitud de la curva de calibración de flavonoides totales,
isoquercetina y astragalina. ......................................................................................................................................29
Tabla 2-4: Comparación de datos UHPLC-MS/MS entre el extracto optimizado y extractos
acuosos de hojas de granadilla. ...............................................................................................................................32
Tabla 3-1: Condiciones de extracción a evaluar mediante el diseño Box-Behnken. ....................42
Tabla 3-2: Soluciones de reacción evaluadas en el ensayo de antiglicación mediante el modelo
BSA-ribosa. ........................................................................................................................................................................44
Tabla 3-3: Flavonoides totales cuantificados y actividad antiglicante de extractos obtenidos
bajo las condiciones del diseño experimental Box-Behnken. ...................................................................50
Tabla 3-4: Análisis de varianza ANOVA del modelo de regresión. .......................................................51
Tabla 3-5: Cuantificación de flavonoides totales bajo las condiciones óptimas de extracción en
3 días diferentes. ............................................................................................................................................................55
Tabla 3-6: Condiciones optimizadas para la extracción de flavonoides totales en diferentes
especies del género Passiflora. ................................................................................................................................59
Tabla 3-7: Valores de IC50 en ensayo de antiglicación de marcadores terapéuticos y extractos
de hojas de Passiflora ligularis. ................................................................................................................................64
Tabla 3-8: Concentraciones inhibitorias 50 reportadas en la literatura para algunos de los
flavonoides presentes en las hojas de Passiflora ligularis. .........................................................................66
Tabla 5-1: Composición de las soluciones buffers preparadas. .............................................................90
Tabla 5-2: Composición de los medios de perfusión para yeyuno e íleo...........................................94
Tabla 5-3: Preparación de los tratamientos a evaluar mediante el ensayo de perfusión
intestinal en yeyuno e íleo. ........................................................................................................................................94
Tabla 5-4: Solubilidad aparente de flavonoides totales e isoquercetina en el extracto
optimizado de P. ligularis, y estándar de isoquercetina, en diferentes medios acuosos. ......... 101
Tabla 5-5: Número de dosis Do calculado para los flavonoides totales e isoquercetina
contenidos en el extracto optimizado de P. ligularis, e isoquercetina pura. .................................. 106
Tabla 5-6: Coeficiente de permeabilidad efectiva (Peff) de FT, ISQ-OPT e ISQ-EST. ................. 109
Tabla 5-7: Clasificación biofarmacéutica, Peff y Fa predicha en humanos de FT, ISQ-OPT e ISQ-
EST. .................................................................................................................................................................................... 115
Lista de símbolos y abreviaturas XXII
Lista de Símbolos y abreviaturas Símbolos Símbolo Término Do Número de dosis IC50 Concentración inhibitoria 50 log P Coeficiente de reparto log D Coeficiente de distribución λmax Longitud de onda de máxima absorbancia m/z Relación masa carga %CV Porcentaje de coeficiente de variación
Peff Permeabilidad efectiva
Unidades de medida Unidad Término cm Centímetro min Minutos mL Mililitro mM Milimolar mg Miligramo kg Kilogramo ηm Nanómetro µM Micromolar µg Microgramo µm Micrómetro μL Microlitro
Abreviaturas Abreviatura Término ACN Acetonitrilo
AGEs Advanced glycation end products - Productos finales de glicación avanzada
ATP Trifosfato de adenosina BD Biodisponibilidad BE Bioequivalencia
Lista de símbolos y abreviaturas XXIII
Abreviatura Término
BSA Bovine serum albumine - Albúmina sérica bovina
CFT Contenido de flavonoides totales DAD Detector de arreglo de diodos EAU Extracción asistida por ultrasonido
EMA European Medicines Agency - Agencia Europea de Medicamentos
FDA Food and Drug Administration GLUT-4 Transportador de glucosa tipo 4 HPLC High Performance Liquid Chromatography
ICH International Council for Harmonisation of International Conference Harmonization
LC-MS Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas
LC-MS/MS Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem
LDD Límite de detección LDC Límite de cuantificación
LDL Low-density lipoprotein – Lipoproteína de baja densidad
MAPK, MEK/ERK
Vías de proteínas quinasas activadas por mitógenos
MV Material vegetal OMS Organización mundial de la salud PI3K Fosfatidilinositol 3-quinasa RMN Resonancia magnética nuclear
RSM Response Surface methodology – metodología de superficie respuesta
SCB Sistema de clasificación biofarmacéutica TPA 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato
UHPLC Ultra High Performance Liquid Chromatography
USP United States Pharmacopeia – Farmacopea de los Estados Unidos
UV Ultravioleta
Introducción
La diabetes Mellitus es una enfermedad generada por un conjunto de trastornos metabólicos
y cuya principal característica es la presencia de concentraciones elevadas de glucosa en la
sangre de manera crónica y persistente. Debido a esta complejidad, la población que la padece
ha recurrido al uso de plantas medicinales como parte de su tratamiento, es así como más de
1200 plantas a nivel mundial han sido usadas con fines medicinales por personas
diagnosticadas con diabetes (1).
Aunque las fuentes naturales han sido ampliamente utilizadas como tratamientos alternativos
a lo largo de la historia de la humanidad, y a pesar de los avances científicos en el estudio de
los productos naturales, aún hoy en día el uso de las medicinas naturales se basa en
observaciones empíricas en lugar de evidencia científica (2). La importancia de los productos
herbales es tal, que incluso la Organización Mundial de la Salud (OMS), recomienda y promueve
programas nacionales de atención en salud basado en este tipo de productos, ya que están
fácilmente disponibles, son de bajo costo, deben ser seguros y la población confía en ellos (3).
Desafortunadamente, aún existe un factor de gran controversia, que impide la aceptación de
los productos naturales por cierta parte de la población; la falta de caracterización de los
extractos o productos obtenidos a partir de éstos, no permite alcanzar los criterios de
seguridad y eficacia establecidos por las entidades regulatorias en diferentes países (4). En
gran medida la dificultad para desarrollar este tipo de productos se relaciona con el hecho de
que se trata de matrices complejas, con un gran número de metabolitos que en su mayoría son
desconocidos, y de los cuales no se sabe con exactitud los componentes responsables de la
actividad y mucho menos los modos de acción (4). Aunque éstos deben cumplir con los mismos
requerimientos de seguridad y eficacia que los productos elaborados con fármacos sintéticos,
el interés por desarrollar productos naturales bajo las mismas exigencias de calidad es un
campo de estudio reciente (5, 6).
2 Introducción
Con el fin de avanzar en el cumplimiento de dichas exigencias de calidad y tener mayor
aceptación de la terapia convencional, se han propuesto dos líneas de trabajo generales para
un mayor desarrollo de productos fitoterapéuticos: uno, la autenticación, estandarización y
purificación de drogas naturales; y dos, el desarrollo y estandarización de formulaciones de las
mismas (7). Se entiende por producto fitoterapéutico, al “producto medicinal empacado y
etiquetado, cuyas sustancias activas provienen de material de la planta medicinal o
asociaciones de estas, presentado en forma farmacéutica que se utiliza con fines terapéuticos.
También puede provenir de extractos, tinturas o aceites. No podrá contener en su formulación
principios activos aislados y químicamente definidos” (8).
Dentro de las fuentes naturales con actividad antidiabética reportada en la literatura, se
encuentran diversos órganos de las especies del género Passiflora, un conjunto de plantas de
gran relevancia económica y tradicional en Colombia debido a las cualidades de sus frutos. Con
base en información previa descrita en la literatura científica y reportes etnofarmacológicos,
el grupo de investigación Principios Bioactivos en Plantas Medicinales se ha interesado por el
estudio de las hojas de diferentes especies de Passiflora, obteniendo resultados prometedores
como hipoglicemiantes, para extractos de hojas de Passiflora ligularis, comúnmente conocida
como granadilla. Con la participación de diversos grupos de investigación, nacionales e
internacionales, se ha planteado el proyecto “Estudio de la actividad antidiabética de un
extracto nanovehiculizado de hojas de Passiflora ligularis (granadilla)”. Dentro del cual, se han
desarrollado diferentes trabajos relacionados con el estudio químico de extractos de P.
ligularis, su caracterización metabolómica y correlación con el sitio de colecta, así como la
evaluación mediante diferentes técnicas in silico, in vitro e in vivo, de los posibles modos de
acción hipoglicemiante y antidiabético de los extractos, fracciones y compuestos puros
obtenidos. Si bien, los resultados de estos estudios han sugerido a los flavonoides como los
principales metabolitos responsables de la actividad (9–11), es el extracto completo el que se
emplea en el desarrollo de productos fitoterapéuticos, conllevando al análisis de múltiples
factores adicionales al análisis químico y la actividad biológica.
El presente trabajo, tiene como fin realizar aportes a las dos líneas de trabajo mencionadas
(estandarización de drogas naturales y desarrollo de formulaciones a partir de éstas), aplicado
al diseño y desarrollo de un potencial producto fitoterapéutico a partir de las hojas de P.
Introducción 3
ligularis. Para el primer eje, se propone contribuir a la estandarización del extracto obtenido a
partir de las hojas (un subproducto de los cultivos), estableciendo las condiciones óptimas de
extracción por ultrasonido para maximizar el contenido de flavonoides, con el fin de aumentar
la actividad terapéutica. Además, se desarrollarán metodologías analíticas para su estudio y
evaluarán las condiciones de estrés bajo las cuales el extracto optimizado puede sufrir
procesos de degradación.
Para el segundo eje de trabajo, se busca aplicar el sistema de clasificación biofarmacéutica
(SCB) como una herramienta útil en el diseño y desarrollo de productos terapéuticos. El SCB
caracteriza la solubilidad y permeabilidad de los fármacos debido a que son dos parámetros
fundamentales en el proceso de absorción intestinal de los mismos. Este es un requisito para
el desarrollo de estudios de bioequivalencia entre dos productos, ensayos de disolución
durante la etapa de diseño y desarrollo, la correlación de datos in vitro-in vivo que permitan
sustituir los estudios en humanos por estudios de disolución in vitro; entre otras ventajas (12).
Aunque son pocos los reportes que se encuentran respecto a la aplicación del sistema en
extractos o productos herbales , los estudios encontrados describen la utilidad del SCB como
un método para apoyar el desarrollo de productos fitoterapéuticos y garantizar la calidad de
los mismos (6,13,14).
1. Marco Teórico
1.1 Sistema de Clasificación Biofarmacéutica El Sistema de Clasificación Biofarmacéutico (SCB) fue publicado por el Doctor Gordon Amidon
y colaboradores en 1995, como un fundamento de clasificación de fármacos basado en dos
aspectos básicos que se relacionan con la cantidad y velocidad de absorción de los mismos: la
solubilidad acuosa y la permeabilidad gastrointestinal de la dosis terapéutica más alta, dentro
de un rango de pH fisológicamente relevante, pH 1.2 a 7.4. El sistema está constituido por 4
clases de fármacos: Clase I: Fármacos de alta solubilidad y alta permeabilidad; Clase II: Baja
solubilidad, alta permeabilidad; Clase III: Alta solubilidad, baja permeabilidad; Clase IV: Baja
solubilidad, baja permeabilidad (15).
Posteriormente el SCB fue aceptado y modificado por diferentes entidades (FDA, EMA, OMS y
una guía armonizada preliminar de la ICH), como un marco legal para los medicamentos de
administración oral y liberación inmediata que quisieran aplicar a la bioexención de los
estudios de Biodisponibilidad (BD) y/o Bioequivalencia (BE) in vivo. Entendiéndose por
bioexención, el reemplazo de estudios in vivo por una prueba de disolución como base para
aceptar la equivalencia entre dos productos farmacéuticos (16–19). Basado en las guías
anteriores, se estableció en Colombia la ‘Guía que contiene los criterios y requisitos para el
estudio de Biodisponibilidad y Bioequivalencia de medicamentos’, mediante la Resolución
1124 de 2016. De acuerdo con esta guía y basado en el sistema de clasificación
biofarmacéutica, se considera que un fármaco es altamente soluble cuando la dosis más alta
reportada de la formulación, es soluble en 250 mL o menos de medio acuoso a valores de pH
1.2, 4.5 y 6.8, a una temperatura de 37 ± 1 °C. Adicionalmente, el principio activo es altamente
permeable cuando el grado de absorción en humanos es mayor o igual al 85%; la
permeabilidad puede ser determinada mediante estudios en humanos (estudios de balance de
masas, biodisponibilidad absoluta o perfusión intestinal in vivo) o métodos adicionales de
6 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
perfusión intestinal in vivo/in situ en modelos animales, o de permeación in vitro, a través de
células epiteliales cultivadas (por ejemplo, monocapa de células Caco-2) (20).
Además de proporcionar los criterios para la bioexención de un medicamento y así demostrar
la bioequivalencia entre dos productos, el SCB tiene como objetivo la predicción de aspectos
del comportamiento farmacocinético in vivo de los fármacos a partir de la información de
solubilidad y permeabilidad (determinada como el grado de absorción por vía oral)(21,22).
Adicionalmente, tiene aplicaciones útiles en diferentes etapas del desarrollo de medicamentos:
1) Durante el descubrimiento de nuevos compuestos, la caracterización de fármacos en
clasificaciones diferentes al tipo 1, indican la necesidad de mejorar la solubilidad y
permeabilidad de compuestos subsecuentes (23). 2) En la etapa de diseño y formulación, si se
parte de fármacos clase I, éstos dependen principalmente de la velocidad de liberación de la
forma farmacéutica para su disolución a nivel gastrointestinal; por el contrario, si están dentro
de la clase II, la selección adecuada de excipientes es indispensable para favorecer la
solubilidad y promover la mejor condición de disolución posible tanto para formulaciones de
liberación inmediata como controlada. Para el caso de fármacos de las clases III y IV, aunque
pueden ser igualmente formulados, también se puede optar por desarrollar formulaciones
menos convencionales que favorezcan la biodisponibilidad, como por ejemplo, dispersiones
sólidas amorfas, nanotecnología, sistemas de entrega basados en lípidos, entre otros (24,25).
3) En etapas clínicas, en las cuales compuestos con clasificaciones II, III y IV, advierten de
aspectos como posibles interacciones con alimentos (23).
Se han planteado diferentes modificaciones, enfoques y aplicaciones del sistema de
clasificación biofarmacéutica que han servido como base para desarrollar otro tipo de sistemas
de clasificación, como es el caso del BDDCS, Sistema de Clasificación Biofarmacéutica basado
en la Disposición del Fármaco. Este difiere del SCB en no tener en cuenta el parámetro de
permeabilidad, sino un criterio basado en el metabolismo, componente relacionado con la ruta
de eliminación del fármaco (21). En 2010, se planteó un sistema de clasificación enfocado a los
retos asociados al desarrollo de productos orales, ‘Developability Classification System’, DCS;
introduciendo factores importantes para la predicción en el comportamiento in vivo, como la
solubilidad en medios biorelevantes, un mayor volumen de fluidos gastrointestinales
disponible (500 mL) y la subdivisión de la clase II en fármacos cuya absorción se ve limitada
por la velocidad de disolución (IIa) y de absorción limitada por la solubilidad (IIb); entre otras
Capítulo 1 7
modificaciones (26). Este último fue recientemente modificado por los mismos autores en
‘Refined Developability Classification System’, rDCS, con el fin de que el DCS tuviese un enfoque
más pragmático para la aplicación en la industria (27,28). También se ha planteado la
expansión del sistema, realizando subclasificaciones de los fármacos Clase II y IV en subclases
a, b y c, dependiendo del carácter ácido (a), básico (b) o neutro (c) de la molécula (29,30). Otros
sistemas como el ‘ABΓ’, basado en la fracción de dosis absorbida (31), y el ‘ECCS’ (Extended
Clearance Classification System), relacionado con el peso molecular, el estado de ionización y
la permeabilidad de la membrana, entre otros, han sido sistemas de clasificación desarrollados
(32).
Por otro lado, se ha buscado ampliar los ámbitos de aplicación del SCB. Tal es el caso del
sistema de clasificación biofarmacéutico pediátrico (33–35), tópico (36) e incluso para
productos herbales (13).
1.1.1 SCB aplicado a extractos vegetales
Aunque hablar de conceptos como la biodisponibilidad, bioequivalencia, o estudios
farmacocinéticos en matrices complejas de extractos y productos fitoterapéuticos, no es
frecuente como lo es para medicamentos elaborados con fármacos sintéticos, diferentes
autores y entidades regulatorias mencionan la importancia de realizar más estudios
relacionados con el análisis cualitativo y cuantitativo de marcadores químicos, analíticos y/o
terapéuticos en productos herbales medicinales (fitoterpeúticos en Colombia).
Adicionalmente, se contempla la estandarización de los extractos, la realización de estudios
biofarmacéuticos, el desarrollo de modelos preclínicos in vivo o in vitro, y el diseño de ensayos
clínicos adecuados, como parámetros necesarios para el desarrollo de productos herbales de
calidad, que cuenten con efectividad y tolerabilidad clínica (5,37).
Un estudio realizado por Waldman y colaboradores (13), planteó que los fundamentos del SCB
podían ser aplicados en la caracterización biofarmacéutica de los productos herbales
medicinales, ya que, aunque éstos sean matrices complejas en su composición, cada
ingrediente ya sea activo o no, puede clasificarse teniendo en cuenta algunas consideraciones,
como por ejemplo, las características de los marcadores presentes en los extractos de acuerdo
8 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
con la categoría A, B o C, planteadas en la Farmacopea Europea y aceptadas por la Agencia
Europea de Medicamentos EMA:
Clase A: Contienen los constituyentes que son los únicos responsables de la actividad
terapéutica reconocida y documentada.
Clase B: Contienen los constituyentes químicamente definidos que poseen propiedades
farmacológicas relevantes (marcadores activos), que podrían contribuir a la eficacia
clínica, sin embargo, no hay información disponible respecto a si son los únicos
responsables de la actividad terapéutica.
Clase C: Con constituyentes cuya relevancia farmacológica, clínica o en la eficacia del
extracto no se ha documentado. Con fines prácticos en el control de calidad de los
extractos, se pueden utilizar constituyentes o marcadores químicamente definidos, sin
actividad terapéutica conocida (7,38).
De este modo, para los extractos Clase A, se pueden aplicar los principios del SCB de manera
similar que para los fármacos químicamente definidos, es decir, podría utilizarse para
establecer la bioequivalencia entre dos productos, ya que los marcadores responsables de la
actividad son los usados para asignar la clasificación. Para las categorías B y C, la aplicación del
sistema de clasificación se verá enfocada a la selección de marcadores, pruebas o ensayos
adecuados en el control de calidad del material vegetal o del producto terminado y a la
comparación in vitro entre productos.
La clasificación de los marcadores presentes en los extractos de acuerdo con el SCB, presenta
diferentes ventajas. En primera medida, permite proporcionar información valiosa respecto a
dichos constituyentes para seleccionar el(los) marcadore(s) más adecuados respecto a sus
características biofarmacéuticas; esto por ejemplo, con el fin de determinar la calidad lote a
lote de los productos terminados; para demostrar la similitud in vitro de dichos productos
herbales tras realizar cambios posteriores a la aprobación de los mismos, seleccionar el
marcador más apropiado para llevar a cabo ensayos de disolución en el desarrollo del
producto, o incluso la selección de marcadores con propiedades de solubilidad y
permeabilidad adecuadas para su detección in vivo durante los estudios clínicos.
Capítulo 1 9
Por otro lado, el conocimiento de la clasificación según el SCB, permitirá decidir si puede ser
significativa la comparación in vitro entre dos productos para evaluar posibles diferencias
terapéuticas. Todo lo anterior puede verse como un paso importante hacia el diseño,
desarrollo y control de calidad de los productos fitoterapéuticos (13).
Estudios como los realizados por Waldmann et al. y Fong y colaboradores, han logrado
clasificar un gran número de marcadores activos presentes en plantas de uso medicinal gracias
a información ya reportada en la literatura y al uso de métodos in silico que predicen factores
descriptivos de la permeabilidad y solubilidad (log P, log D, o número de dosis Do) (13,14).
Otros reportes han evaluado experimentalmente las características biofarmacéuticas de
especies como Centella asiática y Rosmarinus officinalis L. En el primer caso, se determinó que
a pesar de que el ácido asiático presente en el extracto demostró alta permeabilidad, la baja
solubilidad y rápido metabolismo conllevaban a la baja biodisponibilidad del mismo (39); y en
el segundo, se clasificó a la mayoría de metabolitos de tipo flavonoides, diterpenos, triterpenos
y fenilpropanoides, dentro de las clases III y IV del SCB (40). Por otro lado, en un estudio de
nuestro grupo de investigación, Domínguez y colaboradores evaluaron el efecto de la matriz
en las propiedades biofarmacéuticas de la rutina, metabolito mayoritario en extractos de
cálices de Physalis peruviana. Encontrando que éste presentaba alta solubilidad/baja
permeabilidad (clase III) como componente del extracto hidroetanólico, pero, baja
solubilidad/permeabilidad (clase IV) dentro de la fracción butanólica del extracto y como
compuesto puro (41).
1.2 Género Passiflora El género Passiflora de la familia Passifloraceae está representado por alrededor de 530
especies. En su mayoría son lianas o enredaderas, aunque también existen algunas especies
arbóreas o arbustivas (42,43). En Colombia se han reportado alrededor de 170 especies,
constituyendo así el país con mayor diversidad de Passifloraceae (44).
Algunas especies altamente cultivadas por los agricultores colombianos incluyen las curubas
(P. tripartita var mollisima, P. tripartita var tripartita, P. tarminiana y P. cumbalensis), badea
(P. quadrangularis), gulupa (P. edulis var edulis), cholupa (P. maliformis), granadilla (P.
10 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
ligularis) y maracuyá (P. edulis var flavicarpa). Estas especies se cultivan en 24 departamentos
de Colombia, siendo Huila, Antioquia, Meta, Valle del Cauca y Boyacá las regiones más
productivas (45).
Este género es de gran interés no solo por su valor comercial (en la agricultura y a nivel
ornamental) sino además por su importancia en la medicina tradicional (46). Parte de los usos
etnofarmacológicos y las actividades farmacológicas comprobadas reportadas para las hojas
de algunas especies se muestran en la Tabla 1-1.
Tabla 1-1: Principales actividades terapéuticas para las hojas de algunas especies del género
Passiflora.
Especie Usos tradicionales de las
hojas Actividades biológicas de
extractos de las hojas
P. tripartita var mollisima (Curuba de castilla)
Calmante (47)
Actividad antimicrobiana contra Staphyloccus aureus y
Salmonella typhi (48). Anti-hiperglicemiante (49).
P. edulis var flavicarpa (Maracuyá)
Se reportan usos como tranquilizante, o para el
tratamiento de afecciones inflamatorias cutáneas de P. edulis sin especificación de la
variedad (50).
Actividades ansiolíticas y antidepresivas (51,52).
Propiedades antiinflamatorias (50).
P. edulis var edulis (Gulupa)
Como tranquilizante, diurético, tónico y para el
tratamiento de la hipertensión o enfermedades
de la piel (46).
Ansiolítico y antidepresivo (51).
Actividad antioxidante, antiinflamatorio (53).
P. quadrangularis (Badea)
Tranquilizante, para el tratamiento del insomnio, epilepsia, dolor de cabeza,
bronquitis, asma, tos y como antidiabético (46,54).
Ansiolítico (55), antioxidante (56), actividad hemolítica (57),
sedante (58). Inhibición moderada de
S. aureus, y B. cereus (56).
P. alata (Maracuyá dulce)
Tranquilzante, diurético y analgésico (46).
Efecto ansiolítico (59), gastroprotector (60) y
antioxidante (61).
Capítulo 1 11
Especies del género Passiflora con potencial actividad antidiabética Diferentes estudios se han llevado a cabo para entender el rol que las especies del género
Passiflora pueden jugar en el manejo o tratamiento de la diabetes. En dos estudios de Colomeu
y colaboradores, se evaluó la actividad antioxidante y antiinflamatoria del extracto acuoso de
las hojas de P. alata como los posibles modos mediante los cuales éste ejerce su efecto
antidiabético; los ensayos fueron realizados en ratones NOD (diabéticos no obesos). En estas
investigaciones, se reporta que el grupo tratado con el extracto presentó un nivel de insulitis
(inflamación de los islotes de Langerhans) inferior al grupo control, lo que da un indicio de las
propiedades antiinflamatorias del extracto. Adicionalmente, sugieren que la capacidad
antioxidante y los altos niveles de glutatión obtenidos para el grupo tratado se pueden
relacionar con un efecto protector de los islotes pancreáticos ante el estrés oxidativo. Ambos
efectos son importantes en el tratamiento de la diabetes tipo 1 (62,63).
Resultados positivos se han obtenido en el estudio del efecto hipoglicemiante de la cáscara de
los frutos de Passiflora edulis, aunque no se especifica la variedad de la especie utilizada (P.
edulis var edulis o P. edulis var flavicarpa). Varios autores reportan que la cáscara ejerce un
efecto antioxidante importante para el estrés oxidativo desarrollado durante la enfermedad
(64). Además, debido a su riqueza en fibra, es útil en la prevención de la digestión y absorción
de carbohidratos, de manera que controla y reduce los niveles sanguíneos de glucosa (65,66).
Para el caso específico de Passiflora edulis var flavicarpa, se llevó a cabo un estudio clínico de
fase II con 43 pacientes que presentaban diabetes mellitus tipo 2, a los cuales se les administró
durante 60 días un producto de harina de la cáscara de maracuyá, rica en pectina. Dentro de
los resultados se obtuvo una disminución de los triglicéridos y cambios positivos en los niveles
de glucosa en sangre, evidenciando la utilidad del tratamiento como complemento a las
terapias convencionales (67). Reportes similares se han encontrado para otras especies del
género, como por ejemplo Passiflora mollisima bailey, Passiflora foetida y Passiflora nitida
Kunth (49,68–70).
12 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
1.2.1 Passiflora ligularis (Granadilla)
Generalidades, valor comercial y etnofarmacológico
La granadilla o Passiflora ligularis es una enredadera de tallo herbáceo y leñoso hacia la base.
Sus hojas se insertan al tallo mediante un peciolo largo y grueso, miden entre 8-20 cm de largo
y 6-5 cm de ancho, son gruesas, acorazonadas y de color verde intenso. Las flores son vistosas,
de color violeta, y aproximadamente 7 a 10 cm de diámetro. El fruto, es una baya casi esférica,
de cubierta dura y cuyo color varía de verde a amarillo intenso dependiendo de la etapa de
madurez, usualmente presenta puntos blanquecinos; está constituido por el epicarpio,
exocarpio (corteza dura), mesocarpio (corteza blanca y esponjosa), el endocarpio (pulpa
comestible) y las semillas (71) (Figura 1-1).
A B C
Figura 1-1: A. Flor de Passiflora ligularis. B. Fruto granadilla. C. Hojas de Passiflora ligularis (72).
Passiflora ligularis se distribuye desde México hasta Bolivia, pero especialmente a lo largo de
los Andes y se encuentra entre 1.500 y 2.500 msnm. En Colombia, representa la segunda
especie de mayor importancia económica debido al valor que tienen sus frutos tanto a nivel
nacional como internacional (73). Cuenta aproximadamente con 7219 Hectáreas plantadas,
siendo en Huila el área de mayor producción (74).
Adicionalmente, es de gran valor tradicional teniendo en cuenta los múltiples usos medicinales
que se atribuyen a las diferentes partes de la planta; principalmente como descongestionante
nasal, antitusivo, para la gripa, regulación de la digestión, antidiarreico, para contrarrestar la
gastritis, úlceras, y el insomnio, aliviar contusiones, e incluso controlar ataques epilépticos, la
Capítulo 1 13
presión arterial, o los síntomas del guayabo, entre otras. Las formas más frecuentes de uso son
la preparación de infusiones, y cataplasmas o el consumo del fruto o su jugo. Para el caso de
las hojas, se administra por vía oral una infusión con el fin de regular la digestión y la diarrea;
también se aplica sobre la piel como cataplasma para el alivio de las contusiones (75).
Composición química y actividades biológicas de extractos de hojas de P.
ligularis
La mayoría de estudios encontrados en la literatura sobre la composición química de Passiflora
ligularis han sido realizados a partir de los frutos (76,77) y poca información se encuentra
respecto al estudio de las hojas.
Se conoce gracias al desarrollo de marchas fitoquímicas, la presencia de compuestos fenólicos,
leucoantocianidinas, saponinas, taninos, triterpenos y quinonas (75), mientras que trabajos
realizados dentro del grupo de investigación, han tenido como objetivo contribuir al estudio
químico de las hojas. En el trabajo realizado por Meneses, se identificaron como principales
metabolitos del extracto acuoso y fracción butanólica de hojas colectadas en Anolaima,
diferentes saponinas tipo lanostano y compuestos fenólicos (78), Tabla 1-2. Adicionalmente,
el estudio metabólico llevado a cabo por Monzón permitió la identificación de aminoácidos,
carbohidratos, ácidos orgánicos, saponinas y compuestos polifenólicos (flavonoides en su
mayoría) en muestras de hojas colectadas en Cundinamarca y Huila, que fueron extraídas
mediante ultrasonido por 10 minutos, con una mezcla de metanol-buffer fosfatos 90mM (9). A
partir de estos estudios se confirmó lo previamente planteado por Zuccoloto et al. (79)
respecto a la presencia de flavonoides O-glicósidos, diferentes a los usualmente encontrados
para otras especies del género Passiflora (C-glicósidos).
14 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Tabla 1-2: Metabolitos identificados a partir de extractos polares de hojas de P. ligularis.
Grupo de metabolitos Compuestos
Aminoácidos
Alanina a Ácido glutámico a
Glutamina a Prolina a Tirosina a
Carbohidratos Glucosa a Sacarosa a
Polialcohol Myo-inositol a
Ácidos orgánicos GABA a
Ácido cítrico a Lactato a
Saponinas Ligularósidosb A, B, C* y D
Compuestos fenólicos
Catequina* Quercetina-3-O-glucósido*
Luteolina-7- O-glucósido a
Quercetina-3-O-(6''-malonil)-glucósido a Kaempferol-3- O-glucósido*
Apigenina-7- O-glucósido a
Isoramnetina-3-O-glucósidoa
Kaempferol-3-O-(6”-malonil)-glucósido a
Isoramnetina-3-O-(6”-malonil)-glucósido a
Crisina-7-O-glucósidoa
Crisina-7-O-(6”-O-acetil)-glucósidoa
Apigenina a
Kaempferol a Crisina*
a Compuestos identificados por Monzón (9). b Compuestos identificados por Meneses (78).
*Metabolitos encontrados por los dos autores anteriormente mencionados.
Consecuentemente, son pocos los estudios encontrados en relación con los posibles efectos
terapéuticos de los extractos obtenidos a partir de las hojas. Se describen principalmente la
actividad antioxidante, antimicrobiana, y antiinflamatoria. En el primer caso, el alto contenido
tanto de fenoles como de flavonoides totales se relacionan con la captación de radicales libres
y el poder reductor férrico de los extractos. De acuerdo con el estudio de Navarro et al, los
extractos hidroalcohólicos presentaron mayor actividad respecto a los extractos acuosos
(80,81). En relación con la actividad antimicrobiana, la mayor inhibición de los cultivos de
Capítulo 1 15
Escherichia coli y Staphylococcus aureus se obtuvo para los extractos acuosos; se evidenció un
porcentaje de inhibición mayor para E. coli lo cual se relaciona con el efecto que pueden
generar las saponinas sobre la capa lipídica presente en la membrana de las bacterias Gram
negativas (80).
Por otro lado, en el trabajo de maestría de Meneses se encontró que la fracción butanólica
obtenida a partir del extracto acuoso, junto con dos compuestos mayoritarios (Ligularósido C
y quercetina-3-O-glucósido) presentan un efecto antiinflamatorio promisorio en el modelo de
edema de oreja en ratón inducido por TPA (78).
Respecto al potencial antidiabético de la especie, se encuentran algunos reportes de evaluación
de la actividad a partir de la pulpa de las frutas. De acuerdo con un estudio llevado a cabo por
Anusooriya et al, la administración oral durante 30 días de un extracto acuoso de la pulpa de
granadilla (400 mg / kg) a ratas con diabetes inducida mediante estreptozotocina (STZ, 30
mg/kg de peso corporal), conllevó a la disminución de la glucosa en sangre (similar a los
niveles alcanzados por glibenclamida), además de un aumento significativo de antioxidantes
tanto enzimáticos como no enzimáticos y la disminución de la peroxidación lipídica. El extracto
demostró la actividad hipoglicemiante posiblemente debido a una mejoría de la secreción de
insulina mediante la recuperación de las células β pancreáticas y con potencial antioxidante
para la prevención del daño oxidativo desarrollado durante la diabetes (82). Otro estudio
informa del efecto antidiabético generado por el extracto en acetona del fruto de P. ligularis,
pero en este caso lo reporta como la inhibición de la actividad α-amilasa (82.56%) y α–
glucosidasa (75.36%), demostrando porcentajes de inhibición muy cercanos a los del control
positivo utilizado, acarbosa (79,87%) (83).
Finalmente, y haciendo parte del proyecto de investigación dentro del cual se encuentra
enmarcada esta tesis, se han desarrollado dos trabajos que demuestran el potencial
antidiabético de los flavonoides presentes en las hojas de P. ligularis. Por un lado, teniendo en
cuenta el papel de las enzimas glucosil-hidrolasas en la etapa inicial del metabolismo de los
carbohidratos en humanos, Monzón realizó un estudio de acoplamiento molecular entre los
compuestos identificados en las hojas y las enzimas α-amilasa y α-glucosidasa. El ligularósido
C y varios de los flavonoides mono-glicosidados, presentaron el perfil de interacciones más
energéticamente estables y similares a los del inhibidor de referencia de la α-amilasa; siendo
16 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
la saponina, la quercetina-3-O-glucósido (isoquercetina) y el kaempferol-3-O-glucósido
(astragalina) quienes presentaron valores de IC50 inferiores a los de la acarbosa en el ensayo
de inhibición in vitro. De manera similar, para la inhibición de la α-glucosidasa, solamente los
flavonoides mono-glicosidados demostraron ser los mejores candidatos de acuerdo con el
análisis computacional, y únicamente la isoquercetina presentó un IC50 menor al compuesto de
referencia (9).
Por otra parte, Rey y colaboradores, estudiaron el efecto del extracto acuoso y fracción
etanólica de hojas de granadilla, en un modelo in vivo de tolerancia a la glucosa en ratas
hiperglicémicas, donde ambos redujeron la glicemia de manera dosis-dependiente (125-500
mg/Kg); y la fracción etanólica (500 mg/Kg), aumentó el contenido de glicógeno hepático
(65%) y muscular (40%). Adicionalmente, demostraron mediante el modelo ex vivo de
músculo sóleo, que la isoquercetina (uno de los flavonoides mayoritarios) estimula la
absorción de la glucosa respecto al control hiperglicémico, de 92-129% en un rango de
concentraciones de 10-150 µM; proponiendo como mecanismo de acción, la translocación del
transportador de glucosa al activar las vías de señalización PI3K, MAPK, MEK/ERK y la síntesis
de proteínas de novo del transportador GLUT-4 (11). A su vez, en el estudio del efecto
hipoglicemiante de la astragalina, encontraron que ésta disminuye la glicemia y aumenta la
secreción de insulina a una dosis de 10 mg/Kg en ratas hiperglicémicas, y que dicha secreción,
estaría mediada por la estimulación de la entrada de calcio a través de canales de potasio
dependientes de ATP, canales de calcio dependientes de voltaje tipo L (L-VDCC), la
movilización de calcio desde las reservas intracelulares y la activación de las proteínas
quinasas PKC y PKA (10).
Otros de los flavonoides identificados en la Tabla 1-2 presentan reportes sobre sus posibles
efectos en el control de la diabetes, como por ejemplo, la reducción de la hiperglicemia e
hiperinsulinemia por parte de luteolina-7-O-glucósido en ratones diabéticos (84), la
potenciación de la captación de glucosa ejercida por isoramnetina-3-O-glucósido en un ensayo
in vitro con células musculares de ratón (85), o los efectos protectores de la crisina, frente a
diferentes complicaciones diabéticas al modular el estrés oxidativo, la inflamación y apoptosis
en diferentes modelos animales (86).
Objetivos
Objetivo general
Estudiar las características biofarmacéuticas de un extracto de hojas de Passiflora ligularis,
optimizado en flavonoides, con actividad hipoglicemiante.
Objetivos específicos
Desarrollar y validar una metodología analítica que permita la cuantificación simultánea de
los flavonoides presentes en extractos de hojas de P. ligularis.
Proponer condiciones de extracción que permitan obtener un extracto de hojas de P.
ligularis optimizado en flavonoides, con actividad hipoglicemiante.
Determinar la estabilidad de los flavonoides presentes en el extracto de P. ligularis frente a
condiciones de estrés.
Evaluar la solubilidad y permeabilidad de los flavonoides presentes en el extracto
optimizado de hojas de P. ligularis.
2. Desarrollo y validación de metodología analítica para la cuantificación de flavonoides presentes en hojas de P. ligularis
Como se mencionó anteriormente, tanto reportes de la literatura como estudios previos
realizados dentro del grupo de investigación, permiten relacionar a los flavonoides con la
actividad antidiabética del extracto de granadilla; de modo que se seleccionó el contenido de
flavonoides totales (CFT) como la variable de respuesta a optimizar en el proceso de
extracción, y principal factor a analizar en todos los ensayos de caracterización del extracto.
Por ende, se describe en el presente capítulo, las condiciones desarrolladas para la
cuantificación del CFT como marcador activo del extracto de hojas de P. ligularis,
entendiéndose por tal (según la EMA), al grupo de constituyentes aceptados para contribuir a
la actividad terapéutica de una sustancia o preparación herbal (87). De manera
complementaria y teniendo en cuenta que se ha avanzado en el estudio del mecanismo de
acción de isoquercetina, identificada en el extracto, se muestran los resultados para la
cuantificación individual de este flavonoide.
Por otro lado, y para un mejor seguimiento de los siguientes capítulos, se presentan los
resultados de comparación de los datos de cromatografía líquida acoplada a espectrometría
de masas (LC-MS) entre el extracto optimizado (descrito en el Capítulo 3) y los datos
reportados previamente por Monzón para extractos acuosos de hojas de granadilla (9), con el
fin de confirmar la identidad de los flavonoides observados en los cromatogramas.
20 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
2.1 Metodología
2.1.1 Reactivos y equipos
La metodología analítica desarrollada y validada para la cuantificación de los flavonoides por
cromatografía líquida UHPLC se llevó acabo en un cromatógrafo Thermo scientific Dionex
Ultimate 3000 equipado con un detector de arreglo de diodos Dionex Ultimate 3000, bomba
cuaternaria Dionex Ultimate 3000 RS, desgasificador en línea e inyector automático. Los datos
se procesaron utilizando el software Chromeleon Client, versión 6.80 SR15.
Para el análisis por UHPLC-MS/MS de los flavonoides presentes en el extracto optimizado se
utilizó un cromatógrafo UHPLC Shimadzu Nexera con bomba binaria LC-30AD,
automuestreador SIL-30AC, y detector de UV SPD-20AV, acoplado a un espectrómetro de
masas LC-MS 9030 de cuadrupolo-tiempo de vuelo (Q-TOF), con fuente de ionización
electrospray (ESI). La detección con ESI se realizó en modo negativo para un rango de masas
entre 100-800 m/z. Los resultados fueron analizados por medio del software LabSolutions
LCMS.
Se utilizó acetonitrilo (HoneywellTM) y metanol (Merck®) ambos en grado HPLC y grado LC-
MS, ácido fórmico (Carlo Erba) y agua purificada mediante un sistema Milli-Q Millipore®. El
estándar analítico utilizado fue isoquercetina (Quercetina-3-O-β-D-glucósido, ≥ 90%); de
Sigma Aldrich.
2.1.2 Material vegetal
La colecta del material vegetal (MV) se llevó a cabo en junio de 2018 en el municipio de
Anolaima en Cundinamarca (Latitud: 4°50.0172′ N; Longitud: 74°29.97′ O; Altitud: 1850
m.s.n.m) mediante el permiso de recolección de muestras otorgado por el ANLA y el Ministerio
de Ambiente y Desarrollo: "BIOSPROSPECCION DE ESPECIES DE SOLANUM, PASSIFLORA,
PHYSALIS, HYPERICUM, CECROPIA E ILEX", código 38024, resolución 0699 de abril 26 de
2018, Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible OtroSi No7 al contrato 121 del 22 de
enero del 2016.
Capítulo 2 21
Para ello, se solicitó a uno de los cultivadores la recolección de aquellas hojas que eran cortadas
como parte del proceso de poda de los cultivos, de manera que se aseguró exclusivamente la
recolección de material considerado como subproducto del cultivo. Posteriormente, se
seleccionaron las hojas que no presentaran daños morfológicos por exposición solar, plagas,
entre otros. Un ejemplar de la especie estudiada fue depositado en el Herbario Nacional
Colombiano (COL 602878), Anexo: -Figura S3- 1:.
2.1.3 Extractos analizados
Para el desarrollo de la metodología analítica se utilizaron extractos acuosos de las hojas,
obtenidos mediante infusión con agua durante 10 minutos (proporción 1:10 droga-solvente);
se filtró por gravedad y liofilizó el extracto obtenido (88).
Posteriormente, para el análisis de los flavonoides por LC-MS/MS, se estudió el extracto
optimizado obtenido mediante extracción asistida por ultrasonido, cuyas condiciones de
extracción se discuten en el Capítulo 3.
2.1.4 Curvas de calibración preparadas
Fueron preparadas dos curvas de calibración mediante el método de patrón externo, una para
la determinación del contenido de flavonoides totales (CFT), expresados como mg-
equivalentes de isoquercetina/g extracto seco y otra para la cuantificación individual de
isoquercetina (quercetina-3-O-glucósido). La determinación del CFT se realizó mediante la
suma de las señales cromatográficas que presentaran espectros de absorción característicos
de flavonoides, es decir, dos bandas de absorción máximas entre: 240-295 ηm y 300-400 ηm
(89).
Como se puede observar en la Tabla 2-1, las soluciones preparadas para la curva de
flavonoides totales e isoquercetina fueron las mismas. Sin embargo, se varió la longitud de
onda a la cual se identificaron los valores de área bajo la curva debido a que a 350 ηm se podía
detectar con mayor especificidad los flavonoides en el cromatograma; por el contrario, 260 ηm
corresponde a la longitud de onda de máxima absorbancia de isoquercetina. Todas las
soluciones fueron preparadas por triplicado, disueltas en metanol-agua (1:1) y filtradas por
una membrana de 0.22 µm previo a su inyección en el cromatógrafo.
22 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Tabla 2-1: Soluciones preparadas para cada curva de calibración.
Curva de
calibración
Solución madre
(µg/mL)*
Rango de
concentraciones
(µg/mL)*
Longitud de onda
de detección (ηm)
Flavonoides totales 1170 0.059 – 292.7 350
Isoquercetina 1170 0.059 – 292.7 260
*Se muestran los valores de concentración ajustados de acuerdo con el porcentaje de pureza
de los estándares analíticos utilizados.
Los parámetros de validación analizados se evaluaron de acuerdo con las pautas de la guía ICH
(International Conference Harmonization) (90). Los parámetros validados fueron:
- Linealidad: Definida como la proporcionalidad directa entre la respuesta evaluada, en
este caso área bajo la curva, y la concentración del analito en la muestra. Para su
determinación dentro del rango de concentraciones estudiado, se utilizó la prueba
estadística t-Student.
- Precisión: La precisión del procedimiento analítico se evaluó en dos niveles:
repetibilidad (precisión intra-ensayo) y precisión intermedia (precisión inter-día).
Para ello se analizaron 3 niveles de concentración de las soluciones estándar por
triplicado en un día y en tres días consecutivos, respectivamente.
- Exactitud: La exactitud se expresó como el porcentaje de recuperación obtenido
después de adicionar cantidades conocidas de la solución estándar a una solución de
extracto; se calculó siguiendo la ecuación: Recuperación (%) = (Contenido teórico *
100) / Contenido experimental.
- Límite de detección (LDD) y límite de cuantificación (LDC): Determinados mediante
diluciones sucesivas hasta observar una relación señal-ruido de 3:1 para el LDD y 10:1
junto con un %CV < 5 para el LDC.
Se utilizó el software Microsoft Excel para el análisis estadístico de los parámetros
mencionados anteriormente.
Capítulo 2 23
2.2 Resultados y Discusión
2.2.1 Desarrollo de la metodología analítica
Para el desarrollo de la metodología analítica por UHPLC-DAD se partió de una metodología
previamente validada para la cuantificación de vitexina y crisina en extractos y productos
comerciales de diferentes especies del género Passiflora (91) (Método A, Figura 2-1).
Resolver el cromatograma para la cuantificación de los flavonoides representó un reto debido
a la polaridad alta a media que éstos mostraron y a la complejidad del extracto. Fue necesario
realizar algunas modificaciones al método de elución, flujo y temperatura del horno, con el fin
de lograr la mayor resolución posible de los picos.
Inicialmente se extendió el tiempo de la rampa entre el 20-35% de acetonitrilo (Método B,
Figura 2-1), ya que en estos valores se presentó coelución de la mayoría de metabolitos en el
método A. Sin embargo, solo se observó como resultado la separación de los picos de menor
polaridad. Por tal motivo, se iniciaron las rampas desde un menor porcentaje de ACN, y se
evaluó el efecto de la temperatura. Al comparar el método C con el método D (Figura 2-1) se
ve que en este último la combinación de varias rampas cortas con cambios leves en la
proporción de los solventes, facilitaban más la separación de los metabolitos de mayor
polaridad y que a su vez, en el método C, el cambio de la temperatura de 35 a 40ºC generó
disminución del tiempo muerto. Esto se debe a que aumentos en la temperatura conllevan a la
disminución de la viscosidad de la fase móvil, y por ende menor resistencia al flujo en la
columna, de modo que disminuye la retención y la presión del sistema, lo cual permite utilizar
flujos más altos (92). Finalmente, se decidió combinar el incremento de la temperatura del
horno de la columna (del método C), con la implementación de 5 rampas que aumentaran el
poder de elución lentamente desde 5 al 40% de acetonitrilo (como en el método D), gradiente
que a pesar de prolongarse por un tiempo considerable para una corrida cromatográfica
UHPLC, permitió obtener mayor resolución de todos los picos tal como se observa en la Figura
2-1, Método E.
Método Método Método
24 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Figura 2-1: Perfiles cromatográficos (350 ηm) obtenidos para el extracto de hojas de P.
ligularis tras realizar diferentes modificaciones al método A. Se utilizó la Columna
Phenomenex® Kinetex C18 (100 × 2,1 mm; 2,6 μm) y volumen de inyección 10 μL en todos los
casos.
A: Acido fórmico 0.5%
B: Acetonitrilo Tº: 35ºC.
Flujo: 0.3 mL/min
Método A
10
35
85
100
50
100
0 2 4 6 8 10 12 14 16
%B
min
Método B
A: Acido fórmico 0.5%
B: Acetonitrilo Tº: 35ºC.
Flujo: 0.3 mL/min 10
20 35
85
100
50
100
0 5 10 15 20 25 30
%B
min
Método C
5 1020
25
50
50
20
40
60
0 5 10 15 20 25 30 35%
Bmin
A: Acido fórmico 1%.
B: Acetonitrilo Tº: 40ºC.
Flujo: 0.4 mL/min
Método D
5 10 13 1825
40
50
20
40
60
0 10 20 30 40
%B
min
A: Acido fórmico 1%. B: Acetonitrilo Tº: 35ºC. Flujo: 0.4 mL/min
Método E
A: Acido fórmico 1%. B: Acetonitrilo Tº: 40ºC. Flujo: 0.5 mL/min
5 10 13 1825
40
50
20
40
60
0 10 20 30 40
%B
min
Capítulo 2 25
Al realizar la revisión de la literatura para el estudio de especies del género Passiflora, se
encontró que la principal aplicación de la cromatografía líquida de alta eficiencia es el análisis
cualitativo o estudio químico de diferentes extractos, tanto poco complejos como compuestos
de un gran número de metabolitos, de modo que la mayoría de métodos desarrollados no
buscan la obtención de perfiles cromatográficos con gran resolución de los picos, y por ende,
consisten de condiciones relativamente más sencillas, como por ejemplo: gradientes de 17-
35% ácido fórmico 0.5% en ACN (0-20 min; fase acuosa acidificada 0.5%) (93); acetonitrilo
15-35% (0-8 min), 35% (8-10 min) (94), o combinaciones de las dos fases A: agua, B: ACN
(ambas acidificadas al 0.1%), iniciando al 5% B (0-1 min), 5-95%B (1-16 min), 95%B (16-18
min) para retornar a la condición inicial en 2 minutos (95). Todas las condiciones anteriores
fueron utilizadas para el análisis de diferentes extractos de hojas de Passifloras mediante
UHPLC, en fases estacionarias C-18, sin control de temperatura de la columna (lo cual puede
afectar la reproducibilidad del método), con flujos entre 0.15-0.35 mL/min.
Por otro lado, en caso de requerirse la cuantificación del contenido de flavonoides, muchos
estudios reportan el uso de técnicas colorimétricas como por ejemplo la de cloruro de aluminio
(96); y en caso de desarrollar una metodología por HPLC, se enfocan usualmente en la
cuantificación de 1 o pocos flavonoides específicos, principalmente, vitexina, isovitexina,
orientina, e isoorientina, (97). Mediante condiciones bastante similares a las anteriormente
mencionadas, como mezclas de la fase acuosa acidificada (A) y acetonitrilo como fase orgánica
(B), en un gradiente lineal de 5-20% de B en A durante 30 minutos (96), lo cual se asemeja al
método C evaluado para el extracto de hojas de P. ligularis, pero que no otorgó suficiente
resolución entre los dos primeros picos del perfil ni a los que co-eluían entre el minuto 16-17.
Se encontraron algunos métodos reportados para el estudio de P. ligularis mediante HPLC,
considerablemente diferentes al presentado anteriormente. Por un lado, porque se llevaba a
cabo el análisis de extractos del fruto, donde se utilizaban como fases móviles (A) ácido fórmico
al 0.1% y (B) metanol en un gradiente que alcanzaba condiciones mucho más apolares, desde
10-70%B (0-4 min), 70-100%B (4-7 min), 100-10%B (7-8 min) (98); o por otro lado, porque
el método desarrollado estaba basado en condiciones previamente reportadas para el análisis
de flavonoides C-glicosilados, principales metabolitos identificados en diferentes especies de
Passiflora. El método se diferencia especialmente en la composición de la fase móvil en modo
isocrático: solvente A (tetrahidrofurano:isopropanol:acetonitrilo, 10:2:3, v/v/v) y solvente B
26 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
(H3PO4 0.5%) (12% A en B) a un flujo de 1 mL/min. Sin embargo, en dicho reporte no se
presenta el cromatograma de las hojas de granadilla ya que no se identificó en su extracto los
compuestos C-glicosilados, y adicionalmente, en las matrices complejas evaluadas como el
extracto de P. tripartita var mollissima, los compuestos eluían desde el minuto 5 hasta el 45,
con muy poca resolución de los picos (79).
Con el fin de cumplir con los objetivos planteados en el presente trabajo, era necesario obtener
la mayor resolución posible de los picos observados en los extractos de P. ligularis, para lograr
una cuantificación más certera del contenido de flavonoides totales, identificar la posible
degradación de los metabolitos (ya fuese por desaparición de los picos o aparición de nuevos
compuestos) en las pruebas bajo condiciones de estrés, e igualmente, evaluar y cuantificar
potenciales cambios en el contenido de las muestras biológicas obtenidas tras los ensayos de
permeabilidad. Es así, como finalmente se plantea el siguiente sistema cromatográfico, para la
cuantificación de flavonoides en extractos polares de hojas de granadilla (perfil
correspondiente al Método E en la Figura 2-1):
Fase estacionaria: Phenomenex® Kinetex C18 (100 × 2,1 mm; 2,6 μm)
Temperatura del horno: 40 °C
Flujo constante: 0,5 ml/min
Volumen de inyección: 10 μL.
Fase móvil: ácido fórmico 1.0% en agua (fase A) y acetonitrilo (fase B), comenzando desde 5-
10 %B (0-10 min), 10-13 %B (10-20 min), 13-18 %B (20-25 min), 18-25 %B (25-32 min), 25-
40 %B (32-38 min), 40-5 %B (38-40 min).
2.2.2 Validación de la metodología analítica
A continuación, se presentan los resultados de los parámetros de validación evaluados.
- Linealidad
El grado de correlación entre el área bajo la curva y la concentración de las muestras se
determinó inicialmente mediante el coeficiente de correlación, el cual fue superior a 0.995
para las 3 curvas de calibración. De igual modo, se observa en la Tabla 2-2, los rangos de
Capítulo 2 27
concentraciones que en cada curva cumplieron con las pruebas de hipótesis realizadas
mediante el estadístico t; es decir, que teniendo como criterio el rechazo de la hipótesis nula
con un t calculado mayor al t tabulado, ninguna de las curvas presentó sesgo en la pendiente
(es decir, se rechazó que la pendiente fuese igual a cero), ni en el intercepto (se aceptó punto
de corte en 0). En los tres casos, los datos se ajustaron con un 95% de confianza al modelo
de regresión lineal; cumpliendo así con el parámetro de linealidad.
- Precisión y Exactitud
Como se mencionó anteriormente, la precisión se evaluó como repetibilidad y precisión
intermedia. Se observa en la Tabla 2-3 que se cumple con dicho parámetro, ya que las 3
concentraciones analizadas para cada curva, tanto en un día como en tres días consecutivos,
presentan valores de coeficiente de variación inferiores al 5%, límite recomendado por la
ICH. Adicionalmente, se observa en la misma tabla que la exactitud expresada como el
porcentaje de recuperación, se encuentra entre el 90-110% con coeficientes de variación
aceptables entre 1.141-4.045%.
- Límite de detección y límite de cuantificación
Se determinaron como límites de detección y cuantificación, 0.059 y 0.293 µg/mL para las
curvas de FT e isoquercetina.
28 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de Passiflora ligularis
(granadilla) optimizado en flavonoides
Tabla 2-2: Rango de concentraciones para las curvas de calibración de flavonoides totales, isoquercetina y astragalina que cumplen con el
parámetro de linealidad de acuerdo con la prueba t-student.
Analito
Rango de
linealidad
(µg/mL)
Ecuación de
calibración (r2)a Parámetro Ho b t Calculado t Tabuladoc Criterio
Isoquercetina (FT)
(350 nm) 5.841 – 292.7 y = 0.4393x – 0.2855 0.9991
Pendiente b=0 tb = 137.1 2.119 Rechazar H0
Intercepto a=0 ta = 0.677 2.119 Aceptar H0
Regresión
No hay
correlación
entre X y Y
tr = 133.3 2.119 Rechazar H0
Isoquercetina
(260 nm) 5.841 – 117.1 y = 0.5621x – 1.5005 0.998
Pendiente b=0 tb = 12.43 2.178 Rechazar H0
Intercepto a=0 ta = 0.551 2.178 Aceptar H0
Regresión
No hay
correlación
entre X y Y
tr = 82.64 2.178 Rechazar H0
a Coeficiente de correlación. b Hipótesis nula. c Valor de t de dos colas; n-2 g.l; α = 0.05.
Capítulo 2 29
Tabla 2-3: Datos de precisión y exactitud de la curva de calibración de flavonoides totales,
isoquercetina y astragalina.
Analito (µg/mL) Precisión Exactitud
Repetibilidad (1 día)
X ± %CV (n=3)
Precisión intermedia
(3 días) X ± %CV
(n=3)
%Recuperación X ± %CV (n=3)
Isoquercetina (350 ηm)
5.841 1.960 ± 3.404 1.990 ± 1.714 102.2 ± 2.307
58.55 27.08 ± 2.888 27.18 ± 4.077 108.1 ± 4.045
117.1 53.52 ± 1.014 53.66 ± 1.180 110.7 ± 3.610
Isoquercetina (260 ηm)
5.841 2.342 ± 1.082 2.404 ± 2.489 106.5 ± 3.292
58.55 32.47 ± 2.585 32.67 ± 3.223 108.1 ± 4.199
117.1 64.36 ± 1.812 64.75 ± 0.944 110.2 ± 3.299
2.2.3 Análisis de los flavonoides presentes en el extracto optimizado de hojas de granadilla mediante UHPLC-MS/MS
Como se mencionó anteriormente, se han realizado dos trabajos de investigación enfocados al
estudio químico de extractos polares obtenidos a partir de las hojas de P. ligularis (9,78).
Monzón, logró realizar la identificación de la gran mayoría de picos observados en los
cromatogramas, principalmente mediante la comparación de los patrones de fragmentación
MS/MS con reportes en la literatura, y en algunos casos, confirmó la identificación mediante
resonancia magnética nuclear (RMN). A partir de esta información, se buscó corroborar la
identidad de los flavonoides observados mediante UHPLC-DAD en el extracto optimizado, ya
que, aunque el perfil cromatográfico de éste fuese similar a los presentados en el trabajo
mencionado, se encontraron algunas diferencias en la zona media de los cromatogramas, que
dificultaron la asignación de los flavonoides basándose solamente en los espectros de
absorción. De este modo, se presenta en la Figura 2-2 la numeración de los picos analizados
en los cromatogramas del extracto optimizado.
30 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Figura 2-2: Cromatogramas del extracto optimizado de hojas de P. ligularis mediante UHPLC-
MS/MS. A) Cromatograma UV a 350 ηm. B) Cromatograma de iones totales (TIC). Se presenta
con numeración los picos con espectros de absorción característicos de flavonoides; en azul
los flavonoides identificados, y en rojo compuestos fenólicos sin identificar.
Condiciones cromatográficas similares a las del método E; fase A: ácido fórmico 0.1% y fase B:
acetonitrilo. La fase estacionaria, temperatura del horno de la columna y gradiente de las fases móviles
se mantuvo igual. La muestra se preparó a una concentración de 2 mg/mL, y el volumen inyectado fue
3 µL.
1
2
3ª
3b
4
6
7
8ª
8b
9
12
13
15
A
B
Ab
sorb
anci
a (m
AU
)
1
2 4
6
7 9
12 13
15
Inte
nsi
dad
14
14
5
5
10
10
11
11
3ª
3b
8ª
8b
Capítulo 2 31
Para el análisis de los resultados de UHPLC-MS/MS, se muestra en la Tabla 2-4 los resultados
reportados por Monzón, utilizados como base para confirmar la identificación de los picos
observados en el perfil cromatográfico del extracto optimizado. Adicionalmente, se utilizó una
herramienta de derreplicación en línea con las librerías disponibles en el Global Natural
Products Social Molecular Networking (GNPS), una plataforma de libre acceso para el
almacenamiento, intercambio, análisis y difusión de datos de espectrometría de masas en
tándem (MS/MS), que incluye tanto bases de datos relevantes en productos naturales (como
por ejemplo MassBank, ReSpect, HMDB, NIST, entre otras), como bibliotecas espectrales
experimentales depositados por la comunidad. De modo que el GNPS permite analizar y
comparar un conjunto de datos con todos los disponibles públicamente. Dicha comparación se
basa en un algoritmo de correspondencia o puntuación de coseno, que determina la similitud
en la fragmentación de dos espectros con puntajes desde cero (totalmente diferentes) hasta 1
(idénticos) (99). Por ende, además de presentar los resultados de MS/MS del extracto
optimizado en la Tabla 2-4, se relaciona el valor de coseno obtenido para cada espectro
identificado mediante la comparación con las librerías de datos disponibles en el GNPS. Se
establecieron como parámetros para la búsqueda, un puntaje de coseno mínimo de 0.65 y por
lo menos 6 picos coincidentes entre dos espectros, para reconocer o establecer
correspondencia con una molécula (match o hit). En los casos donde el proceso de
derreplicación no encontró match con un compuesto de referencia, puede deberse a diferentes
circunstancias, como por ejemplo: aún no se ha incluido dicho espectro dentro de las librerías
del GNPS; diferencias en las condiciones para la toma de datos espectroscópicos, entre los
datos experimentales y los almacenados en la plataforma, que cambian significativamente la
calidad de los mismos, como el uso de equipos de baja/alta resolución, o energías de colisión
distintas que alteran los patrones de fragmentación, entre otros.
32 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Tabla 2-4: Comparación de datos UHPLC-MS/MS entre el extracto optimizado y extractos acuosos de hojas de granadilla.
Nº
Monzón, 2019 Extracto optimizado
Identificación propuesta Identificado
por RMN [M-H]-
Datos MS/MS
λmax (ηm)
[M-H]-
Tiempo retención
(min)
Datos MS/MS λmax
(ηm) Coseno
1 Sí 463.0864
301(26), 300(46), 271(33), 255 (8), 151(5)
255
357
463.0881
Tr: 15.44
271.0240 (100)
255.0296 (42)
300.0269 (35)
151.0027 (7)
301.0341 (6)
255 353
0.92
Quercetina-3-O-glucósido
(Flavonol)
2 Sí 447.0937 285(74), 284(83), 175(5)
255
347
447,0900
Tr: 15.92
284.0319 (100)
285.0397 (70)
133.0286 (13)
151.0022 (8)
175.0382 (4)
255 347
0.94
Luteolina-7- O-glucósido
(Flavona)
3a No detectado/No identificado 505.0900
Tr: 18.63
271.0240 (100) 300.0268 (40) 255.0291 (31) 243.0293 (26) 255
354
0.91
Quercetina-3-O-(6''-acetil)-glucósido (Flavonol)
3b No 549.0808 505 (10) 300 (25) 151 (3.1)
255 357
549.0000
Tr: 18.66
271.0240 (100) 300.0266 (72) 255.0292 (46) 243.0296 (18)
0.92
Quercetina-3-O-(6''-malonil)-
glucósido (Flavonol)
Capítulo 2 33
Nº
Monzón, 2019 Extracto optimizado
Identificación propuesta Identificado
por RMN [M-H]-
Datos MS/MS
λmax (ηm)
[M-H]-
Tiempo retención
(min)
Datos MS/MS λmax
(ηm) Coseno
4 No 447.0928
285(22) 284(5),
255(42), 227(44)
265 355
447.0927
Tr: 19.92
227,0343 (100) 255,0291 (95) 183.0443 (15) 284,0327 (12)
265 354
0.92
Kaempferol-3- O-glucósido
(Flavonol)
5 No [M+H]+
433.1115 271(20)
258 350
431.0981
Tr: 20.55
270,0427 (100) 269, 0405 (85) 268, 0365 (48) 241, 0440 (29) 212, 0446 (21)
267 337
0.90
Apigenina-7- O-glucósido
(Flavona)
6 No detectado/No identificado 549,000
Tr: 22.62
271.0233 (100) 300.0267 (65) 255.0294 (53) 301.0348 (17)
255 350
Sin hit Desconocido (Flavonol)
7 No
[M+H]+ 479.1164
317(67) 256 351
477.1034
Tr: 22.98
299.0189 (100) 271.0241 (86) 199.0395 (10) 243.0293 (8) 300.0263 (6) 314.0425 (4)
255 350
Sin hit
Isoramnetina-3-O-glucósido (Flavonol)
34 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Nº
Monzón, 2019 Extracto optimizado
Identificación propuesta Identificado
por RMN [M-H]-
Datos MS/MS
λmax (ηm)
[M-H]-
Tiempo retención
(min)
Datos MS/MS λmax
(ηm) Coseno
8a
No detectado/No identificado 489.1000
Tr: 23.8
255.0291 (100) 227.0342 (77) 284.0324 (23) 285.0401 (9)
265 345
Sin hit
Kaempferol-3-O-(6”-acetil)-glucósido (Flavonol) (100)
8b No 533.0881 489 (8) 285(22)
264 346
533.0934
Tr: 23.8
255.0288(100) 284.0319 (65) 227.0345 (51) 285.0399 (34)
Sin hit
Kaempferol-3-O-(6”-malonil)-
glucósido (Flavonol)
9 No detectado/No identificado 533.0934
Tr: 24.38
285.0398 (100) 284.0325 (87) 151.0029 (5) 133.0285 (5) 489.1033 (2)
266
350 Sin hit
Luteolina-7- O-(6”-O-malonil)-
glucósido (Flavona) (101)
Capítulo 2 35
Nº
Monzón, 2019 Extracto optimizado
Identificación propuesta Identificado
por RMN [M-H]-
Datos MS/MS
λmax (ηm)
[M-H]-
Tiempo retención
(min)
Datos MS/MS λmax
(ηm) Coseno
10 No 565.1119b 519 (10) 317 (15)
254 347
563.1000
Tr: 25.5
300.0269 (100) 271.0234 (66) 255.0290 (29) 315.0487 (3)
251-
260,
350-
355
Sin hit
Isoramnetina-3-O-(6”-malonil)-
glucósido (Flavonol)
11 No detectado/No identificado
473.1000
Tr: 27.2
268.0367 (100) 267.0290 (10) 240.0427 (9) 269.0442 (8)
267
337
Sin hit Desconocido (Flavona)
12 Sí 415.1025
253(100) 267
415.1000
Tr: 27.7
253.0501 (100) 143.0496 (18) 119.0493 (11)
267
305
Sin hit
Crisina-7-O-β-glucósido
(Flavona)
13 Sí 457.1137 253(100) 267 457.1100
Tr: 31.9
253.0497 (100)
267 Sin hit
Crisina-7-O-(6”-O-acetil)-
glucósido (Flavona)
36 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Nº
Monzón, 2019 Extracto optimizado
Identificación propuesta Identificado
por RMN [M-H]-
Datos MS/MS
λmax (ηm)
[M-H]-
Tiempo retención
(min)
Datos MS/MS λmax
(ηm) Coseno
14 No detectado/No identificado 559.1000
Tr: 32,3
253.0499 (100) 209.0604 (4) 143.0491 (3)
267 Sin hit Desconocido (Flavona)
15 Sí 253.050 145(3) 267 253,05
Tr: 36,45
143,0494 (100) 145,0288 (80) 119,0498 (79)
267
315 Sin hit
Crisina (Flavona)
Capítulo 2 37
Los flavonoides, son un grupo de compuestos polifenólicos que se caracterizan por presentar
una estructura básica C6-C3-C6, donde usualmente el puente de 3 carbonos que une los dos
anillos fenólicos (A y B) se ciclan para la formación del anillo C. Dependiendo de la ciclación de
dicho puente, el grado de insaturación y oxidación del anillo C, o del número del carbono al
cual éste se une con el anillo B, los flavonoides se pueden clasificar en diferentes grupos tal
como se muestra en la Figura 2-3 (102).
Figura 2-3: Esqueletos estructurales de las principales clases de flavonoides. Las flechas
indican las posiciones de O- y C- glicosilaciones más comunes (102).
Como se mencionó anteriormente, dos bandas de absorbancia son características en los
espectros UV-Vis de flavonoides. La banda A puede presentarse desde 310-350 ηm para
flavonas y de 350-385 ηm en el caso de los flavonoles. Por el contrario, la banda B, en el rango
de 250-290 ηm es constante a estos dos subgrupos. En el caso de las flavanonas, la banda A se
parece a un hombro reducido entre 300-330 ηm y la banda B, el pico principal, se restringe un
poco de 277-295 ηm (89). De acuerdo con los resultados de la Tabla 2-4, se observa que el
extracto de hojas de granadilla cuenta principalmente con flavonoides tipo flavonol y flavona,
la mayoría glucosilados mediante enlaces O-C en las posiciones 3 del anillo C o 7 del anillo A.
Flavonoles Antocianinas Flavanona
s
Chalconas Flavonas Isoflavonas
38 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Dentro del grupo de los flavonoles, el pico 1, uno de los mayoritarios, ya había sido
previamente identificado por co-inyección con estándar y mediante RMN, como la
isoquercetina (9). Un derivado de este, quercetina-3-O-(6''-malonil)-glucósido (3b, también
mayoritario) fue identificado por Monzón debido a la pérdida del grupo O-hexosa-malonato a
partir del ion pseudo-molecular [M-H]⎺̅ 549 m/z, generando el fragmento m/z=300 junto con
los demás fragmentos característicos del núcleo de quercetina como 271 y 255 m/z (103). Sin
embargo, en el trabajo de Monzón no se contempló la sobreposición de quercetina-3-O-(6''-
malonil)-glucósido con quercetina-3-O-(6''-acetil)-glucósido (3a), este último se puede
explicar por la presencia del ion [M-H]⎺̅ 505 m/z, que al perder el grupo acetil-glucosa,
fragmenta en el ion 300 m/z [M-H-204]⎺ ̅•. Ambos picos 3ª y 3b, fueron identificados por
dereplicación con el GNPS con valores de coseno 0.91 y 0.92, respectivamente.
A su vez los picos 4, 8ª y 8b presentaron iones característicos del patrón de fragmentación del
núcleo kaempferol, 255 m/z (M-CO+H) y 227 m/z (M-2CO+H); sin embargo, en el pico 4, la
fragmentación MS2 del ion pseudo-molecular 447 m/z condujo a la escisión de la hexosa y
detección del fragmento 284 m/z [M-H-162]⎺ ̅•, confirmando la presencia de kaempferol-3-O-
glucósido. Para el pico 8ª [M-H]⎺ ̅ 489 m/z, se propuso la pérdida de 204 unidades de masa
atómica (u) de una acetil hexosa, que generaron el fragmento 285 m/z, lo que corresponde en
la literatura con el kaempferol-3-O-(6”-acetil)-glucósido (100); y en el pico 8b, la pérdida
de 248 u a partir del ion [M-H]⎺̅ 533 m/z, indicó nuevamente la fragmentación de la hexosa
con el grupo malonato, generando el ion m/z =285, es decir, kaempferol-3-O-(6”-malonil)-
glucósido (9).
Por otro lado, se detectó un ion pseudo-molecular [M-H]⎺ ̅ 548 m/z (pico 6), cuya
fragmentación es similar a los derivados de quercetina, sin embargo, se desconoce su
identidad. El pico 7, se relacionó a la identificación propuesta por Monzón como isoramnetina-
3-O-glucósido, debido al ion [M-H]⎺ ̅ 477 m/z y el fragmento característico 315 m/z [M-H-162]⎺ ̅
o 314 m/z [M-H-162]⎺ ̅• causados por la pérdida de la glucosa (104,105); se propuso la
glicosilación en la posición 3 teniendo en cuenta que, al estar sustituido el hidroxilo de dicha
posición, el máximo de la banda A de los flavonoles se presenta alrededor de 348-355 ηm
(106). De igual modo, el pico 10 coincidió con la propuesta de isoramnetina-3-O-(6”-malonil)-
Capítulo 2 39
glucósido debido a los fragmentos 563 m/z [M-H]⎺ ̅ y 315 m/z [M-H-248]⎺ ̅, el último sugiere la
pérdida de la hexosa y el grupo malonato.
Del subgrupo de las flavonas, se contrastó el patrón de fragmentación de luteolina-7-O-
glucósido (pico 2) y siendo los fragmentos m/z 175, 151 y 133 característicos del núcleo de
luteolina (103), se propone que el pico 9 (no detectado o identificado por Monzón) sea un
derivado de éste, específicamente luteolina-7-O-(6”-malonil)-glucósido, teniendo en cuenta
que para este compuesto se reporta en la literatura los fragmentos [M-H]⎺̅ 533 m/z, [M-H-
CO2]⎺ ̅ 489 m/z y [M-H-248]⎺ ̅ 285 m/z; con dos máximos en su espectro de absorbancia en 350
y 267 ηm (101), datos concordantes con los encontrados experimentalmente.
Por otro lado, se confirmó la presencia de apigenina-7-O-glucósido (pico 5) ya que, la pérdida
de 162u (hexosa) a partir del ion [M-H]⎺̅ 431 m/z produjo el fragmento 269 m/z en mayor
proporción que el ion 268 m/z, correspondiente a la aglicona radical, lo cual indica la
sustitución del hidroxilo en la posición 7 (107); además, el espectro de absorción observado
para el pico 5 es similar al reportado en la literatura, λmax 270 y 338 ηm (108). Estos valores
no concuerdan con los de Monzón debido probablemente, a que el espectro de este compuesto
se vió afectado por la co-elución con kaempferol-3-O-glucósido (9).
El pico 11, con un espectro de absorción y fragmentos similares a los observados para el pico
5, podría corresponder a un derivado de apigenina, posiblemente acetil-glucosilada, ya que se
observó la pérdida de 204 u (acetil-hexosa) a partir del [M-H]⎺̅ 473 m/z, obteniendo el ion 269
m/z. Sin embargo, la proporción de este último fragmento fue mucho menor respecto a la del
ion 268 m/z, lo cual podría indicar la sustitución de un hidroxilo diferente al de la posición 7.
Para lo cual no se encontró patrón de fragmentación coincidente en la literatura.
Adicionalmente, se confirmó la presencia de los diferentes derivados de crisina identificados
por Monzón (tanto por LC-MS/MS como por RMN), teniendo en cuenta que éstos presentan
como máximo de absorbancia característico la longitud de onda de 267 ηm y, el fragmento de
[M-H]⎺ ̅ 253 m/z del núcleo de crisina. De modo que los picos 12, 13 y 15, correspondieron a
crisina-7-O-β-glucósido, crisina-7-O-(6”-O-acetil)-glucósido y crisina respectivamente. El pico
14 se propone sea otro derivado de crisina.
40 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Gracias a la derreplicación mediante el GNPS, fue posible corroborar la presencia de seis
flavonoides con valores de coseno superiores a 0.9 (picos 1, 2, 3ª, 3b, 4, 5), de los cuales, los
picos 3b y 5 no pudieron ser confirmados por Monzón mediante otras técnicas como RMN,
debido a su baja concentración en el extracto y/o dificultad para aislarlos; y 3a se propone en
este trabajo como un compuesto coeluyente con 3b (ambos derivados de quercetina-3-O-
glucosa). Asimismo, el análisis derreplicativo encontró un alto grado de similitud de dos
espectros MS/MS con dos procianidinas, indicando la presencia de procianidina B1 ([M-H]⎺ ̅
577.1359 m/z, tr: 2.98 min, coseno: 0.91) y procianidina B2 ([M-H]⎺ ̅ 577.1349 m/z, tr: 5.95
min, coseno: 0.90). Este tipo de flavanoles o taninos condensados se han reportado en otras
especies del género Passiflora como P. coccinea y P. tripartita var. mollissima (109,110).
2.3 Conclusiones
Se desarrolló una nueva metodología analítica mediante cromatografía líquida de ultra-alta
eficiencia, que permite mayor resolución de los picos detectados por UV en un extracto de
hojas de granadilla, respecto metodologías previamente reportadas para el análisis de
diferentes especies del género Passiflora. Gracias a la preparación de 2 curvas de calibración
que cumplen con los parámetros de validación de linealidad, precisión, exactitud, límites de
cuantificación y detección, es posible cuantificar los flavonoides presentes en la matriz
estudiada, tanto flavonoides totales (expresados como mg-equivalentes de isoquercetina/g
extracto seco), como del principal metabolito estudiado hasta el momento, isoquercetina
(quercetina-3-O-glucósido).
Gracias al análisis de UHPLC-MS/MS, se logró corroborar para el extracto optimizado de hojas
de granadilla, la presencia de los principales flavonoides identificados previamente por
Monzón, junto con 3 picos (6, 11, 14) de identidad desconocida pero que presentaron espectros
de absorción característicos de flavonoides. Adicionalmente, se planteó la identidad de tres
picos, 3ª, 8ª y 9, no detectados en el trabajo de referencia, pero cuyos patrones de
fragmentación correspondieron con los flavonoles quercetina-3-O-(6''-acetil)-glucósido,
kaempferol-3-O-(6”-acetil)-glucósido, y la flavona luteolina-7-O-(6”-O-malonil)-glucósido,
respectivamente.
3. Obtención de un extracto de hojas de P. ligularis optimizado en flavonoides con actividad hipoglicemiante
3.1 Metodología
3.1.1 Material vegetal
Colecta
El material vegetal utilizado fue el mismo al descrito en el capítulo anterior, en la colecta
realizada en el municipio de Anolaima (2.1.2 Material vegetal).
Secado, molienda y tamizaje
Se seleccionó como método de secado, la liofilización de las hojas por un periodo de 24-48
horas, esto debido a los resultados obtenidos por Monzón en la evaluación del efecto del
método de almacenamiento y secado de las muestras en la composición química de los
extractos (9).
Las hojas liofilizadas fueron pulverizadas en un molino de cuchillas y tamizadas mediante la
batería de tamices USP Mesh 10, 40, 50 y 80, que se dejó en vibración durante 15 minutos.
3.1.2 Planteamiento del diseño experimental para el proceso de
extracción por ultrasonido
Se utilizó un diseño experimental Box-Behnken el cual es sugerido para estudiar procesos que
no incluyan puntos o niveles extremos, evaluar interacciones entre los factores y plantear
42 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
diseños con menos experimentos (más económicos) pero con el mismo número de factores
que se podrían analizar en otros diseños (111).
Basado en la revisión de la literatura y de acuerdo con las características que podían ser variadas en el equipo de ultrasonido empleado, se seleccionó el tiempo de extracción, la temperatura y porcentaje de etanol, como los factores a evaluar en tres niveles: bajo (-1), medio (0), y alto (1), ( Tabla 3-1). Se evaluó como variable dependiente o variable respuesta a maximizar, el
contenido de flavonoides totales, cuantificados mediante la metodología analítica de FT
descrita previamente en el Capítulo 2.
Tabla 3-1: Condiciones de extracción a evaluar mediante el diseño Box-Behnken.
Nivel
Factor
Tiempo (min) Temperatura (°C) %Etanol
-1 20 30 60
0 40 50 80
1 60 70 100
3.1.3 Procedimiento de extracción por ultrasonido
Se puso un gramo (1g) de material vegetal molido en contacto con 20 mL de la solución hidro-
etanólica en un tubo para centrífuga de 50 mL con tapa. Dicho tubo fue colocado en un baño
de ultrasonido Digital Ultrasonic Cleaner (PS-30A; Shenzhen huatai Ultrasonic Cleaning
Machine Co. Ltd) con capacidad de 6.5L, frecuencia de 40 KHz y potencia de 180W. Para la
preparación del solvente de extracción en los porcentajes planteados en la Tabla 3-1, se utilizó
etanol 99.5% (PanReac AppliChem) y agua destilada.
Los extractos obtenidos se filtraron por gravedad, se concentraron bajo presión reducida a
temperatura controlada (40ºC), fueron congelados y finalmente liofilizados para su posterior
análisis y cuantificación de flavonoides totales.
Una vez obtenidas las condiciones óptimas de extracción mediante la metodología de
superficie respuesta (RSM-Response Surface methodology), estas se emplearon para obtener
Capítulo 3 43
extracto en 3 días diferentes, por triplicado cada uno, con el fin de verificar la validez del
modelo estadístico obtenido y la reproducibilidad del proceso de extracción.
Adicionalmente, se comparó el perfil cromatográfico y el CFT del extracto optimizado con el
de un extracto obtenido por infusión, método de extracción comúnmente utilizado en la
medicina tradicional. La extracción por infusión se llevó a cabo con agua en ebullición durante
10 minutos, en proporción droga-solvente 1:10; se filtró por gravedad y liofilizó el extracto
obtenido (88)
3.1.4 Ensayo de actividad inhibitoria de la formación de productos finales de glicación avanzada (AGEs)
Las proteínas, lípidos y ácidos nucleicos expuestos a niveles elevados de glucosa durante
períodos prolongados de tiempo, sufren varias modificaciones químicas como reacciones de
glicación entre el grupo carbonilo de azúcares reductores y grupos amino libres, que conducen
a la formación de compuestos altamente estables, los productos finales de glicación avanzada
(AGEs - Advanced glycation end products)(112). La formación de AGEs se acelera en la
hiperglicemia, y su acumulación se asocia con diabetes, nefropatía diabética, microangiopatía,
aterosclerosis, entre otros (113). Por lo tanto, el estudio de moléculas con actividad
antiglicante representa una estrategia para la búsqueda de compuestos capaces de prevenir o
retrasar algunas de las complicaciones presentadas durante la diabetes. Adicionalmente, el
ensayo de inhibición de AGES, es una herramienta in vitro de rápido uso que requiere poca
cantidad de material a evaluar. Para ello, el ensayo busca simular la reacción de Maillard
utilizando como modelo de proteína la albúmina sérica bovina (BSA por sus siglas en inglés)
la cual presenta un 76% de homología de secuencia con la albúmina humana (114), principal
proteína glicada en sangre in vivo. Se ha evaluado la reactividad de BSA con diferentes
azúcares, de los cuales se ha visto el siguiente orden de velocidad de reacción: ribosa > fructosa
> glucosa. Sadowska y colaboradores han reportado que la tasa inicial de formación de AGEs
es 2.7 y 14.2 veces respectivamente, más alta con fructosa y ribosa que con glucosa (115), de
modo que se prefiere el uso de ribosa con el fin de disminuir el tiempo de duración del ensayo.
Finalmente, y similar a las condiciones fisiológicas, la reacción se lleva a cabo a 37ºC en buffer
a pH 7.4 (al cual se adiciona azida de sodio con el fin de evitar contaminaciones
44 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
microbiológicas) y se detecta la formación de los productos de glicación avanzada, gracias a
que algunos de ellos exhiben propiedades fluorescentes.
De este modo y como una aproximación inicial para estudiar el efecto del proceso de
optimización del extracto en la actividad biológica del mismo, se evaluó la actividad
antiglicante o inhibitoria de la formación de AGEs de todos los tratamientos del diseño
experimental.
Para esto, se utilizó la fracción V de albúmina sérica bovina (Roche), D(-)-Ribosa, extra pura
(Scharlau) y Quercetina ≥ 95%, (HPLC, Sigma-Aldrich®) como control positivo. Se siguieron
las condiciones experimentales propuestas por Derbré et al, con ligeras modificaciones
(116,117). Brevemente, se incubaron diferentes mezclas de reacción en microplacas de 96
pozos; los diferentes volúmenes especificados en la Tabla 3-2 se tomaron a partir de
soluciones concentradas de cada uno de los reactivos, para obtener concentraciones finales en
los pozos de 10 mg/mL, 0.5 M y 500 µg/mL de BSA, D-Ribosa y extractos, respectivamente. La
quercetina, se evaluó a 70 µg/mL. El volumen final de 100 µL en cada pozo se completó con
buffer fosfato 50 mM (pH 7.4, NaN3 0.02%).
Tabla 3-2: Soluciones de reacción evaluadas en el ensayo de antiglicación mediante el modelo
BSA-ribosa.
Solución
Reactivo (a Ci)
Inhibidor
(Extracto o
quercetina)
Blanco del
inhibidor
Control 100%
formación de
AGEs
Blanco del
control 100%
formación
AGEs
Albúmina
(14.3 mg/mL) 70 µL 70 µL 70 µL 70 µL
D-Ribosa (5M) 10 µL --- 10 µL ---
Muestra (extracto o
quercetina)b 5 µL 5 µL --- ---
Buffer 15 µL 25 µL 20 µL 30 µL
aCi: Concentración inicial de las soluciones a partir de las cuales se tomaron los volúmenes
especificados. bPara los extractos: A partir de soluciones stock preparadas en DMSO a una
Capítulo 3 45
concentración de 12.5 mg/mL, se tomaron 80 µL y se completó con buffer a un volumen de
100 µL; de esta solución diluida se tomaron las alícuotas de 5 µL llevadas a la microplaca. Para
quercetina: 70 µL de una solución de 2 mg/mL de quercetina completamente disuelta en
DMSO, se diluyeron con 30 µL de buffer. Todas las muestras fueron evaluadas por triplicado.
La incubación se realizó durante 24 h, a 37ºC con agitación (50 rpm), en un Heidolph Polymax
1040-Inkubator 1000. La medición de la fluorescencia de los AGEs se realizó en un
espectrofluorómetro TECAN Genios FL (λexc 360 nm; λem 465 nm). El porcentaje de
inhibición de la formación de AGEs se calculó de la siguiente manera:
% Inhibición de AGEs = [1 − (𝐹𝐼 − 𝐹𝐵𝐼
𝐹100% − 𝐹𝐵100%)] × 100
Donde:
FI = Fluorescencia de la solución del inhibidor.
FBI = Fluorescencia de la solución blanco del inhibidor.
F100% = Fluorescencia de la solución control 100% formación de AGEs.
FB100% = Fluorescencia de la solución blanco del control 100% formación de AGEs.
Determinación de la concentración inhibitoria 50
Se determinó la concentración inhibitoria 50 (IC50) de los dos extractos, optimizado y obtenido
por infusión, de los estándares de isoquercetina y astragalina, y de la quercetina como control
positivo. Para ello se evaluaron 5 concentraciones finales en pozo para cada muestra dentro
de los siguientes rangos: 125-1000 µg/mL para los extractos, 10-30 µg/mL para astragalina y
quercetina y 15-250 µg/mL para isoquercetina; cada concentración y su blanco respectivo fue
ensayado por triplicado.
3.1.5 Evaluación in vivo de la actividad hipoglicemiante
Se estudió la actividad hipoglicemiante del extracto obtenido por infusión y optimizado
mediante el ensayo de sobrecarga oral de glucosa. Para ello, ratones adultos, hembras, Swiss
ICR, (24 animales, 47-52 semanas de edad, peso entre 30-43 g) se aclimataron en condiciones
de temperatura constante (22 ° C ± 1), ciclos de luz/oscuridad de 12 horas, y consumo de
alimento y agua ad libitum una semana antes del bioensayo.
46 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Tras 6h de ayuno, se midieron los niveles basales de glucosa en sangre e inmediatamente
después se administró vía oral cada tratamiento. A los 30 minutos se realizó la sobrecarga oral
de glucosa SOG (2000 mg / kg) a los animales; se determinó la glicemia antes de la SOG y a los
30, 60 y 120 minutos después, utilizando el equipo Accu-Chek Performa®. Se evaluaron los
cuatro tratamientos descritos a continuación, la dosis de administración de los grupos III y IV
se basó en estudios previos dentro de nuestro grupo de investigación.
Grupo I: vehículo (agua destilada)
Grupo II: glibenclamida como control positivo (200 mg/kg)
Grupo III: el extracto hidroalcohólico optimizado (125 mg/kg)
Grupo IV: el extracto hidroalcohólico optimizado (250 mg/kg)
Grupo V: el extracto hidroalcohólico optimizado (500 mg/kg)
Grupo VI: extracto por infusión (250 mg/Kg).
Los animales fueron suministrados por el Departamento de Farmacia de la Universidad
Nacional de Colombia. El bioensayo contó con el aval del Comité de Ética de la Facultad de
Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia (Acta 09 de 2018).
3.1.6 Análisis estadístico
El software Minitab® (versión 17 State College, PA, USA) fue utilizado para el planteamiento
del diseño experimental, analizar los resultados y optimizar el contenido de flavonoides
totales. Se utilizó el software GraphPad Prism® (versión 6, San Diego, CA, EE. UU.) para el
análisis de correlación entre la actividad antiglicante y el contenido de flavonoides totales, la
determinación de las IC50 y para el análisis de los datos de la prueba de sobrecarga oral de
glucosa.
Capítulo 3 47
3.2 Resultados y Discusión
3.2.1 Determinación del tamaño de partícula del material vegetal a extraer
Dentro de las variables que pueden influenciar cualquier proceso de extracción, se encuentra
el tamaño de partícula del material vegetal de partida; la reducción de éste conlleva a un
aumento en el área de contacto y disminución de la distancia de difusión de los metabolitos,
aumentando así la tasa de extracción (118).
De acuerdo con la guía de Métodos de Control de Calidad para Materiales de Plantas Medicinales
de la Organización Mundial de la salud, se puede clasificar de la siguiente manera, el corte del
material vegetal según el tamaño de apertura de la malla a través del cual es tamizado (119):
- Corte grueso: 4.00 mm
- Corte medio: 2.80 mm
- Corte fino: 2.00 mm
Teniendo en cuenta lo anterior, el material vegetal liofilizado y molido se clasificó como corte
fino ya que el 100% quedó retenido a lo largo de los tamices con promedios de luz de malla de
0.237, 0.361, 1.213 y 2.000 mm, correspondientes a las mallas (Mesh) No. 80, 50, 40 y 10
respectivamente; y tal como se observa en la ¡Error! No se encuentra el origen de la
referencia., más del 80% de las hojas molidas se retuvieron en el tamiz 40.
48 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Figura 3-1: Distribución del tamaño de partícula de las hojas de P. ligularis molidas en un
molino de cuchillas.
Diversos tamaños de partícula se encontraron reportados en la literatura para la optimización
de la extracción -mediante diferentes métodos- de compuestos fenólicos, desde 5 mm hasta
diámetros inferiores a 1 mm; y en la mayoría de casos concluyen que a menor tamaño, mayor
eficiencia de extracción (118,120). Sin embargo, en el caso de la extracción asistida por
ultrasonido (EAU), es necesario tener en cuenta que el mecanismo en el cual éste se basa, la
cavitación acústica (formación de burbujas debido a la propagación de ondas de presión en un
medio líquido), provee la energía necesaria para romper el material vegetal y reducir el
tamaño de partícula del mismo (121,122). Lo anterior se vio corroborado en el estudio de Both
y colaboradores, en el cual se encontró una disminución del 5%, en el diámetro de partícula al
implementar este método en la extracción de polifenoles a partir de té negro (123). Por otro
lado, Jovanović et al., al optimizar diferentes parámetros para la extracción de polifenoles en
Thymus serpyllum, mediante 3 métodos de extracción, no obtuvieron diferencia
estadísticamente significativa entre los 3 tamaños evaluados (0.3, 0.7, 1.5 mm) para la EAU,
mientras que para los métodos de maceración y extracción asistida por calor, el rendimiento
más bajo sí se obtuvo con el tamaño de partícula más alto estudiado (124).
Al tener en cuenta esta información, que el material vegetal tamizado presentó un tamaño de
partícula considerado como fino y, que en la literatura no se recomienda el uso de fragmentos
ColectorMesh 80
Mesh 50
Mesh 40
Mesh 100,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
< 0,237 0,237 0,361 1,213 2,000
% M
ate
ria
l v
eg
eta
l re
ten
ido
Tamaño de partícula (mm)
Capítulo 3 49
demasiado pequeños ya que pueden ser difíciles de filtrar (121), se seleccionó únicamente el
material retenido en la malla Mesh 40 para continuar con la optimización del proceso de
extracción.
3.2.2 Optimización de flavonoides totales mediante extracción asistida por ultrasonido
Las condiciones consideradas para la evaluación a través del diseño de Box-Behnken -Tabla
3-1- se escogieron con base en la literatura y en experimentos previos realizados dentro del
grupo de investigación. Se seleccionó una proporción droga-solvente de 1:20 como factor
constante, ya que es una relación aceptada a escala de laboratorio y se ha reportado
previamente como una condición óptima de extracción de flavonoides por ultrasonido (125–
127). Se evaluaron temperaturas relativamente altas (30-70ºC) porque los aumentos de
temperatura conducen a un mayor número de burbujas de cavitación, un área de contacto
sólido-solvente más grande y disminución de la viscosidad del solvente, generando una
difusión más rápida de los metabolitos (128,129). Es importante mencionar que se llevaron a
cabo extracciones de prueba, para confirmar que los compuestos no se degradaran a la
temperatura máxima. Las mezclas de etanol-agua fueron elegidas debido a que es un solvente
no tóxico, amigable con el medio ambiente y frecuentemente empleado para la extracción de
flavonoides glicosidados. De este modo, el diseño experimental obtenido consistió de 15
tratamientos con 3 réplicas en el punto central, tal como se observa en la Tabla 3-3. En esta
tabla también se encuentran los resultados obtenidos en la variable de respuesta (CFT) e
inhibición de la formación de AGEs.
50 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Tabla 3-3: Flavonoides totales cuantificados y actividad antiglicante de extractos obtenidos
bajo las condiciones del diseño experimental Box-Behnken.
Ttoa
Factor (nivel)
CFTb
% Inhibición de formación
de AGEs c Temperatura
(ºC) Tiempo (min)
% Etanol
1 30 (-1) 40 (0) 100 (1) 35.56 ± 1.02 43.09 ± 1.06
2 30 (-1) 40 (0) 60 (-1) 53.04 ± 0.91 52.79 ± 1.19
3 50 (0) 20 (-1) 100 (1) 25.97 ± 0.57 32.46 ± 1.68
4 70 (1) 60 (1) 80 (0) 53.26 ± 0.99 52.20 ± 1.13
5 50 (0) 40 (0) 80 (0) 47.68 ± 2.23 48.86 ± 1.85
6 30 (-1) 20 (-1) 80 (0) 48.49 ± 1.08 46.46 ± 1.15
7 70 (1) 40 (0) 60 (-1) 54.59 ± 0.14 54.84 ± 0.84
8 70 (1) 20 (-1) 80 (0) 52.54 ± 1.24 51.77 ± 0.66
9 50 (0) 40 (0) 80 (0) 51.03 ± 1.98 50.89 ± 0.69
10 50 (0) 60 (1) 60 (-1) 50.55 ± 1.17 49.54 ± 0.68
11 50 (0) 40 (0) 80 (0) 51.97 ± 2.28 50.89 ± 1.80
12 50 (0) 20 (-1) 60 (-1) 54.68 ± 1.13 56.77 ± 0.78
13 70 (1) 40 (0) 100 (1) 32.13 ± 0.98 39.97 ± 0.66
14 30 (-1) 60 (1) 80 (0) 44.12 ± 1.51 48.17 ± 2.8
15 50 (0) 60 (1) 100 (1) 32.78 ± 1.07 41.46 ± 0.55
Todos los resultados corresponden al promedio ± desviación estándar (n=3). aTratamiento. bCTF:
Contenido de Flavonoides Totales, expresados como mg-equivalentes de isoquercetina/g extracto seco.
cTodos los extractos fueron evaluados a 500 µg/mL. La quercetina utilizada como control positivo (70
µg/mL) presentó un porcentaje de inhibición de 96.92 ± 3.76 %.
El análisis de superficie respuesta es una metodología que, mediante un conjunto de técnicas
estadísticas y matemáticas permite estudiar el efecto de diferentes variables independientes
en una o más variables dependientes o de respuesta, mediante la generación de un modelo que
permite predecir y por ende optimizar dicha respuesta de interés (111,130).
A partir de los resultados de CFT presentados en la Tabla 3-3, se llevó a cabo el análisis de
varianza del modelo de regresión generado, el cual mediante una prueba de hipótesis permite
estudiar la influencia de los factores en la variable dependiente. Valores relativamente grandes
del estadístico F y valores de p muy pequeños (menores a 0,05), permiten rechazar la hipótesis
Capítulo 3 51
de que ninguno de los factores está relacionado linealmente con la variable respuesta,
indicando que al menos uno de los factores tiene un efecto en la misma (131). De este modo,
se observa en la Tabla 3-4 que el modelo obtenido es significativo y se ajusta a un modelo
lineal (p < 0.01). Además, el valor de p > 0.05 para la falta de ajuste y el coeficiente de
determinación (R2) 0.9613, indicaron que éste tiene la capacidad de explicar correctamente la
variabilidad de la respuesta y por ende, la Ecuación 3-1 de segundo orden, es adecuada para
predecir el contenido de flavonoides totales dentro del rango del diseño experimental.
[CFT] = -14.2 – 0.366 f1 - 0,085 f2 + 2,347 f3 - 0,00433 f1 2 + 0,00277 f2 2 - 0,01878 f3 2
+ 0,00319 f1* f2 + 0,00684 f1* f3 - 0,00312 f2* f3 Ecuación 3-1
Donde, f1: tiempo; f2: temperatura; f3: porcentaje de etanol.
Tabla 3-4: Análisis de varianza ANOVA del modelo de regresión.
Fuente g.l SS MS Valor-F Valor-p* Modelo 9 1219,68 135,520 13,80 0,005
Lineal 3 951,95 317,317 32,32 0,001 Tiempo 1 0,12 0,120 0,01 0,916 Temperatura 1 16,04 16,044 1,63 0,257 %Etanol 1 935,79 935,787 95,32 0,000
Cuadrático 3 225,05 75,015 7,64 0,026 Tiempo*Tiempo 1 11,07 11,075 1,13 0,337 Temperatura*Temperatura 1 4,55 4,548 0,46 0,526 Etanol*Etanol 1 208,40 208,401 21,23 0,006
Producto cruzado 3 42,69 14,228 1,45 0,334 Tiempo*Temperatura 1 6,50 6,499 0,66 0,453 Tiempo*%Etanol 1 29,96 29,965 3,05 0,141 Temperatura*%Etanol 1 6,22 6,221 0,63 0,462
Error 5 49,09 9,818 Falta de ajuste 3 38,86 12,954 2,53 0,296 Error Puro 2 10,23 5,113
Total 14 1268,77 *Nivel de significancia α = 0.05.
Por otro lado, se observa en la Tabla 3-4 que el único factor significativo para la extracción de
flavonoides fue el porcentaje de etanol, junto con el efecto cuadrático etanol*etanol (p < 0.05)
y que no existe un efecto de interacción significativo entre ninguno de los factores (tiempo *
52 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
temperatura, tiempo * etanol, temperatura * etanol, p> 0.05) que pudiese afectar la variable
dependiente.
Los gráficos de superficie y contorno de respuesta son la representación visual (tri- y
bidimensional respectivamente) de la ecuación de regresión (Ecuación 3-1) muestran los
efectos interactivos de dos de los tres factores sobre la variable dependiente y permiten
visualizar más fácilmente el área que cumple con las condiciones de optimización (111).
Como se puede ver en la Figura 3-2 (A) y
Figura 3-3 (A), los cambios en el porcentaje de etanol son los que más afectan el valor de CFT.
Ambas gráficas de contorno, Figura 3-2 (B) y
Figura 3-3¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. (B), muestran claramente
que las mezclas hidroetanólicas entre 60-70% de etanol conducen a la mayor cantidad de
flavonoides (> 50 mg-eq de isoquercetina/g de extracto seco). En el primer caso, con
temperaturas entre 60-70 ºC y en el segundo, independientemente del tiempo. Por el
contrario, a niveles de concentración de etanol superiores al 75%, el contenido de FT comienza
a disminuir. El uso de mezclas hidroalcohólicas ha demostrado ser efectivo en la extracción de
este tipo de compuestos (132,133). El carácter menos polar dado por el etanol permite una
mayor penetración de las paredes celulares y la disolución de metabolitos hidrofílicos, de
media a alta polaridad, azúcares, aminoácidos, nucleótidos y polisacáridos (134,135).
Adicionalmente, la alta polaridad del agua aumenta el contacto soluto-solvente al aumentar la
hinchazón efectiva del material vegetal y disminuir la viscosidad de la mezcla (132). La Figura
3-4 muestra que el tiempo y la temperatura requeridas para el mayor contenido de flavonoides
son alrededor de 40 minutos y 65-70ºC, respectivamente.
Finalmente, de acuerdo con la función de optimización del software, el tiempo, temperatura y
porcentaje de etanol óptimos para la extracción de flavonoides por ultrasonido a partir de
hojas de Passiflora ligularis son: 32.92 minutos, 70ºC y 62.82% respectivamente; valores que
fueron aproximados a 33 minutos, 70ºC y 63% de etanol.
Capítulo 3 53
Figura 3-2: Superficie de respuesta (A) y gráfico de contorno (B) del contenido total de
flavonoides (CFT) (mg-eq isoquercetina/g extracto seco) en función del porcentaje de etanol
y la temperatura, manteniendo el factor tiempo en un nivel medio constante (40 min).
Figura 3-3: Superficie de respuesta (A) y gráfico de contorno (B) del contenido total de
flavonoides (CFT) (mg-eq isoquercetina/g extracto seco) en función del porcentaje de etanol
y el tiempo, manteniendo el factor de temperatura a un nivel medio constante (50 ºC).
B
501
0930
04
5702
40 0606
50
TFC
lonatE %
)nim( opmeiT
Temperatura 50
constante:
Nivel medio
Tiempo (min)
% E
tan
ol
6050403020
100
90
80
70
60
>
–
–
–
–
< 30
30 35
35 40
40 45
45 50
50
TFCA
30
04
50
0345
60
105
09
57
6075
50
06
TFC
lonatE %
)Cº( arutarepmeT
Tiempo 40
constante:
Nivel medio
Temperatura (ºC)
% E
tan
ol
7060504030
100
90
80
70
60
>
–
–
–
–
< 35
35 40
40 45
45 50
50 55
55
TFCA B
54 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Figura 3-4: Superficie de respuesta (A) y gráfico de contorno (B) del contenido total de
flavonoides (CFT) (mg-eq isoquercetina / g extracto seco) en función de la temperatura y el
tiempo, manteniendo el factor de etanol en un nivel medio constante (80%).
Con el fin de validar las condiciones óptimas de extracción, se realizaron extracciones por
triplicado en 3 días diferentes. Se comparó la variable de respuesta predicha por el modelo
(57.77 mg-eq de isoquercetina/g de extracto seco) con el contenido de flavonoides totales
obtenido experimentalmente (59.76 ± 1.903 mg-eq de isoquercetina/g de extracto seco)
mediante el error porcentual medio absoluto (MAPE), Ecuación 3-2.
𝑀𝐴𝑃𝐸 = 100
𝑛∑
|𝐶𝑒𝑖 − 𝐶𝑐𝑖|
𝐶𝑒𝑖
𝑛
𝑖=1
Donde, Cei es el valor de concentración experimental, Cci es el valor de concentración calculado
o predicho y n es el número de datos experimentales. En la Tabla 3-5 se resumen los valores
de cuantificación y el MAPE obtenido para los 3 lotes de extracción evaluados.
64
48
50
0240
54
0306
75
60
25
TFC
arutarepmeT
)nim( opmeiT
%Etanol 80
constante:
Nivel medio
Tiempo (min)
Tem
pera
tura
(ºC
)
6050403020
70
60
50
40
30
>
–
–
–
–
–
< 47
47 48
48 49
49 50
50 51
51 52
52
TFCB A
Ecuación 3-2
Capítulo 3 55
Tabla 3-5: Cuantificación de flavonoides totales bajo las condiciones óptimas de extracción en
3 días diferentes.
Lote CFT ± DS (n=3) Promedio % CV MAPE (%), n=3
1 57.70 ± 4.285
59.76 3.184 3.353 2 60.15 ± 2.119
3 61.44 ± 0.547
CFT: Contenido de Flavonoides Totales. DS: Desviación estándar. CV: Coeficiente de variación.
MAPE: Error porcentual medio absoluto.
Se considera que un modelo es aceptable si el valor del error porcentual medio absoluto es
menor al 10% (136), de modo que se pudo corroborar la capacidad predictiva del modelo de
regresión generado.
Adicionalmente, se comprobó la reproducibilidad del proceso de extracción debido al
coeficiente de variación obtenido, inferior al 5%, para los 3 días estudiados (3.18%).
Por otro lado, teniendo en cuenta que se buscaba aumentar el CFT respecto al método de
extracción más comúnmente realizado para las hojas de Passiflora ligularis, se comparó el
extracto optimizado con el extracto obtenido por infusión. La Figura 3-5 muestra los perfiles
cromatográficos de ambos extractos; se observa para el extracto optimizado un aumento
generalizado en la absorbancia de los metabolitos a 350 ηm y, de acuerdo con la cuantificación
de los flavonoides totales, la optimización del proceso de extracción produjo un incremento
del 33% en comparación con el extracto por infusión (40,22 ± 0,95 mg-equivalentes de
isoquercetina/g de extracto seco).
Adicionalmente, se identificó que el contenido de isoquercetina es 40% superior en el extracto
optimizado en comparación con el extracto obtenido por infusión, presentando: 14.17 ± 0.667
mg de isoquercetina/g extracto seco en el primero y 8.463 ± 0.251 mg de isoquercetina/g
extracto seco en el segundo.
56 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Figura 3-5: Cromatograma del extracto optimizado por ultrasonido (naranja) y el extracto
obtenido por infusión (negro). Condiciones cromatográficas descritas en la sección 2.2.1.
Diversos métodos para la extracción de flavonoides en especies de Passiflora han sido
descritos, dependiendo de la parte de la planta estudiada. Específicamente para las hojas se
han reportado procesos clásicos como soxhlet, sonicación, percolación, decocción e infusión.
Sin embargo, hay pocos estudios disponibles sobre la optimización y validación del proceso de
extracción (137), y la mayoría usan las semillas o pulpa de fruta como droga (138–142). Uno
de los métodos de extracción no convencionales que ha demostrado gran potencial en el
procesamiento de material vegetal es la extracción asistida por ultrasonido, debido a que la
capacidad de disrupción celular de las ondas ultrasónicas y el fenómeno de cavitación,
permiten mayor penetración del solvente en la matriz y, por lo tanto, una difusión más rápida
de los componentes de la planta hacia el solvente. De modo que es un método más simple,
económico y efectivo que otras técnicas, tanto convencionales como no convencionales
(143,144).
Capítulo 3 57
En la Tabla 3-6 se presentan los reportes encontrados en cuanto a la optimización de
flavonoides. Se puede observar que se han establecido condiciones para la percolación de hojas
de Passiflora quadrangularis, las cuales requieren mucho más tiempo (horas a días), cantidad
solventes (más de 150-200 mL) (145,146) que técnicas como la extracción por ultrasonido,
adicionalmente pueden conllevar a una menor recuperación de los metabolitos de interés. Por
otro lado, se ha estudiado la utilización de algunos fluidos supercríticos para la extracción
(SFE) de flavonoides glicosidados de P. edulis (147). También se encuentra reportada la
optimización de la extracción acelerada con solventes (ASE) de flavonoides a partir de hojas
de P. alata, donde posteriormente, las condiciones obtenidas se aplicaron en la extracción de
17 especies de Passiflora, donde P. ligularis no fue incluida (96). Al comparar estos reportes y
los encontrados para la extracción de otras drogas del género Passiflora, con las condiciones
optimizadas para las hojas de granadilla de este trabajo, se hallaron algunas similitudes para
la extracción de flavonoides, como la preferencia de mezclas hidroetanólicas con porcentajes
de etanol entre 50-70% y temperaturas entre 70-80ºC principalmente.
Las metodologías no convencionales utilizadas para la extracción de las hojas (SFE y ASE),
comparten ciertas ventajas con la EAU: el tiempo requerido para la extracción por ultrasonido
puede tomar desde pocos minutos hasta 1 o 2 horas, entre 15 a 100 min mediante fluidos
supercríticos o menos de 1 hora para el caso de ASE. De igual manera, utilizan solventes
amigables con el ambiente y su consumo usualmente se ve reducido a cantidades inferiores a
100 mL en escala laboratorio (148). Sin embargo, en la extracción acelerada por solventes, es
indispensable aplicar altas temperaturas (50-200ºC) y presión (1450-2175 psi) con el fin de
que el solvente que se encuentra en contacto con el material vegetal permanezca en estado
líquido, y por ende, no es adecuado para compuestos termolábiles. Por otro lado, la extracción
por fluidos supercríticos requiere altos costos de inversión y mantenimiento (149,150).
La extracción asistida por ultrasonido es un método eficiente y económicamente viable, útil
para la extracción de compuestos termolábiles (135), y que ha sido eficaz en la extracción de
compuestos fenólicos de diferentes fuentes naturales (135,151). En este método, la onda
mecánica de ultrasonido actúa inicialmente como un pistón que produce un desplazamiento
de las moléculas del medio, las cuales se comprimen pudiendo chocar con otras; luego, una
disminución de la presión durante la fase de rarefacción las separa. Si la presión negativa es
suficiente para exceder las fuerzas de atracción entre ellas, se crea un vacío o una burbuja de
58 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
cavitación. Una vez que las burbujas alcanzan un tamaño crítico y colapsan cerca de la
superficie del material vegetal, se libera una presión y temperatura elevadas, produciendo
micro-burbujas y ondas de choque que impactan e inducen daños en la matriz, liberando el
contenido celular o forzando el solvente hacia las células, disolviendo así los componentes
interiores y transportándolos al exterior (
Figura 3-6). Como consecuencia de este proceso físico de creación, ampliación e implosión de
las micro-burbujas, el ultrasonido mejora la disrupción celular, transferencia de masa y la
penetración del solvente para la extracción de metabolitos (143,152).
Figura 3-6: Fenómeno de cavitación acústica durante la extracción asistida por ultrasonido.
Modificado de Lavilla I, Bendicho C. Fundamentals of ultrasound-assisted extraction. En: Water
Extraction of Bioactive Compounds: From Plants to Drug Development. Elsevier; 2017. p. 294.
(122)
Capítulo 3 59
Tabla 3-6: Condiciones optimizadas para la extracción de flavonoides totales en diferentes especies del género Passiflora.
Especie Droga Método Cuantificación FT Solvente Temperatura Tiempo Referencia
P. quadrangularis Hojas Percolación
1:15
65.29 ± 2.08 mg vitexina-eq /g extracto
seco
Etanol 50%
Ambiente 48h (153)
P. alata a Hojas Extracción
acelerada por solventes
Concentraciones más
altas de: Isoorientina: 1.61
mg/g extracto P. edulis f. flavicarpa.
Orientina: 2.10 mg / g extracto P. morifolia. Vitexina: 2.48 mg / g extracto P. setacea.
Isovitexina: 8,46 mg / g de extracto P.
setacea. Rutina: 3,48 mg / g de
extracto P. galbana. a
Etanol 64 %(P/P)
80ºC
5 ciclos de extracción de
10 min: 50 min. 1500 psi.
En cada ensayo se
extraían 3g de hojas
(96)
P. edulis Hojas
Extracción por fluidos
supercríticos b
6.81 ± 0.19 mg/g material vegetal seco
CO2 modificado
con 10% metanol
70ºC
15 min (0.5g extraídos con
un total de 15mL de solvente)
(147)
60 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Especie Droga Método Cuantificación FT Solvente Temperatura Tiempo Referencia
P. edulis Sims Semillas
Extracción sólido-líquido
en baño termostatado con agitación
constante
1.03 ± 0.02 g Catequina-eq/100 g
semillas en base seca
Etanol 70%
80ºC 30 minutos (140)
P. mollissima Semillas
Extracción líquida
presurizada (100 bar)
0.94 mg-eq quercetina/g extracto
en base seca
Etanol 100%
150ºC No
especificado (139)
P. edulis Sims f. flavicarpa
Pulpa
Sonicación (10 mL de pulpa con 30 mL de
solvente)
158.037 ± 0.602 mg-eq rutina/L
Etanol 60%
25ºC (Factor constante)
1.5 min (141)
a El proceso de optimización se realizó con P. alata para después sí extraer 17 especies de Passiflora bajo las condiciones optimizadas
obtenidas. Aunque una de las variables respuesta del proceso de optimización fue el contenido de FT, solo reportan los valores de los
extractos del diseño experimental. Después de extraer las 17 especies bajo las condiciones optimizadas, cuantificaron los 5 flavonoides
especificados en cada especie.bEn este caso no se llevó a cabo un proceso de optimización, se evaluaron diferentes solventes modificadores
del dióxido de carbono para obtener un extracto con el mayor contenido de flavonoides glicosidados posible a partir de hojas de P. edulis.
Capítulo 3 61
3.2.3 Correlación entre el CFT y la actividad antiglicante de extractos
de P. ligularis
La formación de los productos de glicación avanzada inicia con una glicación no enzimática
temprana, mediada por la adición nucleofílica entre grupos amino de proteínas, lípidos o
ácidos nucleicos y el grupo carbonilo de azúcares reductores, esta reacción de Maillard (dada
durante unas horas) origina bases de Schiff, productos inestables y reversibles que en el
transcurso de días, sufren reordenamientos estructurales para formar cetoaminas más
estables y prácticamente irreversibles, llamados productos de Amadori. Estos posteriormente,
en un periodo de meses o años, sufren diferentes reacciones de deshidratación, oxidación,
transposición o fragmentación, que mediante intermediarios dicarbonilos altamente reactivos,
conllevan a la formación de los productos finales de glicación avanzada (154,155) (Ver Figura
3-7).
Figura 3-7: Formación endógena de AGEs.
Son múltiples los factores que contribuyen al desarrollo de complicaciones diabéticas, dentro
de los cuales, los AGEs, pueden verse implicados mediante diferentes mecanismos.
La glicación de proteínas conlleva a un mal funcionamiento de las mismas, alteraciones en su
tiempo de vida media, en la actividad enzimática, y la unión a ligandos, produciendo daños
celulares y eventualmente organopatías (156). Adicionalmente, la interacción entre los AGEs
y sus receptores celulares (como RAGE, lactoferrina, galectina-3, oligosacaril transferasa-48,
CD36, entre otros) encontrados en tejido muscular liso, macrófagos, astrocitos y células
62 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
endoteliales, puede conllevar a la alteración de rutas de señalización intracelular y la expresión
genética, y consecuentemente, desencadenar procesos inflamatorios y estrés oxidativo (155).
Debido a todas estas implicaciones, el estudio de moléculas inhibidoras de la formación de
AGEs, es una aproximación distinta al control de la glucosa en sangre, como posible
tratamiento de la diabetes y prevención de algunas complicaciones asociadas a la misma.
Los porcentajes inhibitorios de la formación de AGEs de todos los extractos del diseño
experimental (Tabla 3-3), se correlacionaron con el contenido de flavonoides totales
mediante el coeficiente de correlación de Spearman (ρ). Se obtuvo una correlación alta y
significativa entre las variables; ρ = 0.9821, p <0.0001, es decir que existe una relación
monotónica entre las mismas (Figura 3-8¡Error! No se encuentra el origen de la
referencia.) y por ende, un mayor contenido de flavonoides se asocia con mayor actividad
antiglicante. Esto fue confirmado mediante el porcentaje de inhibición obtenido para el
extracto optimizado (500 µg/mL): 58.79 ± 0.51, que fue el valor más alto en comparación con
los tratamientos del diseño experimental.
C F T (m g -e q is o q u e r c e t in a /g e x t r a c to s e c o )
Inh
ibic
ión
de
la
fo
rm
ac
ión
de
AG
Es
(%
)
2 0 3 0 4 0 5 0 6 0
3 0
4 0
5 0
6 0
Figura 3-8: Relación monotónica entre el contenido de flavonoides totales y la actividad
antiglicante de los extractos de hojas de P. ligularis. Quercetina utilizada como control positivo
(70 µg/mL) presentó un porcentaje de inhibición de 96.92 ± 3.76 %.
La actividad antiglicante de algunas especies de Passiflora, se ha evaluado previamente en
ensayos de glicación de glucosa/fructosa-BSA. P. alata y P. edulis mostraron porcentajes de
Capítulo 3 63
inhibición entre 10-20% a concentraciones de 1, 5 y 10 µg/ml (61); y P. manicata disminuyó
significativamente las unidades arbitrarias de fluorescencia en comparación con la albúmina
glicosilada, a 1, 10 y 100 µg/ml (157).
La búsqueda de compuestos o productos de origen natural con actividad inhibitoria de la
formación de AGEs, es de gran interés debido a las múltiples dianas terapéuticas mediante las
cuales pueden ejercer la actividad biológica. De los mecanismos antiglicantes reportados para
compuestos polifenólicos se encuentra: inhibición de las especies reactivas de oxígeno
producidas en la etapa de glicación temprana (de modo que se disminuye la generación de
grupos carbonilos reactivos), inhibición de las bases de Schiff o los productos de Amadori,
bloqueo de carbonilos de azúcares reductores o atrapamiento de los dicarbonilos precursores
de los AGEs, y bloqueo de la interacción AGE-RAGE (158). Además han sido particularmente
estudiados debido a la capacidad antioxidante y antiinflamatoria que presentan, ya que gran
parte de las complicaciones de la diabetes están relacionadas con el aumento del estrés
oxidativo, generado a partir de la formación y acumulación de dichos productos de glicación
avanzada (159).
En el estudio realizado por Séro y colaboradores, se evaluó el potencial anti-AGEs de diferentes
plantas, caracterizadas por presentar alto contenido de polifenoles y capacidad antioxidante o
captadora de dicarbonilos reactivos (160). Las concentraciones inhibitorias 50 (IC50)
encontradas para los extractos acuosos y etanólicos de las 11 especies, evaluados en un modelo
de glicación ribosa-BSA, se encontraron en su mayoría entre 100-700 µg/ml (160), valores
similares a los obtenidos para los dos extractos de hojas de granadilla estudiados. Se observa
en la Tabla 3-7, que la optimización del contenido de flavonoides totales conllevó
efectivamente a un menor valor de IC50 del extracto obtenido por ultrasonido, en comparación
con el extracto por infusión.
64 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Tabla 3-7: Valores de IC50 en ensayo de antiglicación de marcadores terapéuticos y extractos
de hojas de Passiflora ligularis.
Inhibidor IC50 (Límites de confianza del 95%)
(µg/ml)
Extracto optimizado 380.3 (356.6 - 405.4)
Extracto por infusión 641.2 (595.7- 690.2)
Isoquercetina (Quercetina-3-O-glucósido) 78.03 (69.8 – 87.22) – 168.1 µM
Astragalina (Kaempferol-3-O-glucósido) 24.58 (23.68 – 25.51) – 54.82 µM
Quercetina (Control positivo) 22.95 (22.10 – 23.83) - 75.93 µM
Ver curvas de log[concentración] vs % inhibición en Anexo: Información suplementaria
Capítulo 2 y 3, desde la Figura S3- 2 a Figura S3- 5.
Al realizar la revisión de la literatura sobre la actividad inhibitoria de los compuestos puros
evaluados, y otros flavonoides presentes en el extracto de P. ligularis, se encontraron valores
de IC50 muy variados (
Capítulo 3 65
Tabla 3-8). Los resultados obtenidos dependen del modelo de glicación empleado (115) pero
en todos los casos, los reportes consultados se destaca la actividad antiglicante significativa de
los flavonoides estudiados. Se ha visto específicamente que metabolitos pertenecientes a los
grupos flavonas, flavonoles y flavan-3-oles (como es el caso de la mayoría de flavonoides
presentes en el extracto de granadilla), presentan mayor actividad inhibitoria de la formación
de AGEs que las flavanonas e isoflavonas (161).
Respecto al resultado obtenido para la quercetina como control positivo, se han reportado IC50
para el modelo de glicación utilizado de 600 µM (116) y 198.5 µM (160); la diferencia con el
valor experimental 75.95 µM puede deberse a las longitudes de onda utilizadas para realizar
la lectura, ya que en los valores reportados se utilizaron λexc 370 nm-λem 440 nm, mientras
que en el presente ensayo se evaluaron los niveles de fluorescencia a λexc 360 nm y λem 465
nm debido a las características del equipo utilizado.
66 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Tabla 3-8: Concentraciones inhibitorias 50 reportadas en la literatura para algunos de los
flavonoides presentes en las hojas de Passiflora ligularis.
Modelo de glicación
Flavonoide Glucosa-BSA Glucosa/fructosa-BSA Ribosa-BSA
Isoquercetinaa 167 µM (161) 14.6 µM (162) -
Astragalinaa - 90.4 µM (162) -
Kaempferola - - 90 µM (117)
Apigeninab 172 µM (161) - 1000 µM (116)
Luteolina-7-O-
glucósidob 169 µM (161) - -
Catequinac 112 µM (161) 28.7 µM (163)
20.7 µM (162) 60 µM (116)(160)
aFlavonol. bFlavona. cFlavan-3-ol.
3.2.4 Evaluación in vivo de la actividad hipoglicemiante de extractos de hojas de Passiflora ligularis
Los resultados de la actividad hipoglicemiante de ambos extractos de P. ligularis, el obtenido
por infusión y el extracto optimizado por ultrasonido, se muestran en la Figura 3-9. Aunque
no se observaron diferencias significativas entre los tratamientos y el vehículo a los 60-120
minutos, está claro que los extractos atenuaron el pronunciado aumento de la glicemia 30
minutos después de la administración de la sobrecarga oral de glucosa. Este efecto se define
como anti-hiperglicemiante, y no hipoglicemiante, teniendo en cuenta que los niveles de
glucosa finales no fueron inferiores a los niveles basales (164). Sin embargo, esto no implica
que los extractos no puedan presentar actividad hipoglicemiante al considerar que, algunas
plantas sólo muestran tal efecto al alcanzar concentraciones más altas en el cuerpo durante la
realización de estudios crónicos (165). De hecho, en el ensayo de tolerancia a la glucosa
realizado por Rey, et al, en ratas, los extractos hidroalcohólicos de P. ligularis también
mostraron un efecto anti-hiperglicemiante en las dosis 125 y 250 mg/kg; pero a 500 mg/kg se
alcanzaron niveles hipoglicemiantes al minuto 180 (60 mg/dL) (11).
Al comparar entre las tres dosis administradas del extracto optimizado, solo se encontró
diferencia estadísticamente significativa entre 125 y 500 mg/kg (p<0.05). Se observa que el
Capítulo 3 67
extracto optimizado (250 mg/kg) exhibió un efecto anti-hiperglicemiante mayor al del
extracto por infusión (250 mg/kg) (#p<0.01).
Estos resultados son favorables, ya que muestran el potencial de los extractos obtenidos a
partir de hojas de P. ligularis para controlar la glicemia, sin producir una hipoglicemia severa,
efecto adverso grave de algunos fármacos antidiabéticos.
Figura 3-9: Actividad anti-hiperglicemiante de extractos de hojas de P. ligularis. NGS: Niveles
de glucosa en sangre. Los datos se expresan como promedio ± SEM, n = 6 animales por grupo;
fueron analizados mediante un ANOVA de dos vías, seguido de una prueba Tukey con un valor
de **p <0.01 y ****p <0.0001 con respecto al grupo vehículo; #p <0.05 respecto al extracto de
infusión.
También se han obtenido resultados promisorios para otras especies del género Passiflora.
Bajo el ensayo de tolerancia a la glucosa en ratones normoglicémicos, la administración de 200
mg/Kg de un extracto metanólico de hojas de P. incarnata redujo significativamente los niveles
de glucosa en suero en todos los tiempos de muestreo (0, 30, 60 y 120 min) respecto al grupo
control (166).
En otro estudio donde se evaluó el extracto acuoso de hojas de P. suberosa, aunque la
administración de 50 mg/Kg del extracto no produjo resultados significativamente diferentes
a los del grupo control en el ensayo de tolerancia a la glucosa, sí disminuyó la glicemia en un
13% y 18%, 3 y 5 horas post-tratamiento en un ensayo de sobrecarga oral de sacarosa (167)
68 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
En el caso de P. ligularis, se ha reportado la evaluación de la actividad del extracto acuoso de
los frutos en un ensayo de tolerancia a la glucosa en ratas diabéticas, donde se observó
disminución significativa de la glucosa en sangre en el intervalo de 60-120 minutos para las 3
dosis evaluadas, 200, 400 y 600 mg/Kg (82)
Aunque la actividad del extracto puede deberse a la mezcla de diferentes grupos de
metabolitos, se ha demostrado que los flavonoides desempeñan un papel importante en el
control de la glicemia y la diabetes (168–170). Con estos resultados se confirma que la
optimización del CFT en el extracto de hojas de P. ligularis, favorece o mejora el control de la
glicemia ejercido por el mismo.
3.3 Conclusiones
Se logró la optimización de la extracción de los flavonoides presentes en las hojas de Passiflora
ligularis mediante extracción asistida por ultrasonido. Un método práctico y económico que,
según nuestro conocimiento, no se había descrito previamente en la optimización de extractos
a partir de hojas de especies del género Passiflora. El modelo estadístico obtenido por la
metodología de superficie de respuesta, predijo satisfactoriamente los valores óptimos de la
variable dependiente y el proceso de extracción demostró ser reproducible, logrando un
aumento del 33% en el contenido de flavonoides totales respecto al extracto obtenido
mediante infusión.
Se evidenció por medio de diferentes métodos, cómo la optimización del CFT del extracto de
hojas de granadilla puede aumentar la actividad farmacológica del mismo. Primero, mediante
la correlación de Spearman encontrada entre el contenido de flavonoides y la actividad
antiglicante de los diferentes extractos del diseño experimental, obteniendo un valor de IC50
inferior para el extracto optimizado respecto al extracto obtenido por infusión, y segundo,
debido al mayor efecto anti-hiperglicemiante ejercido por el extracto optimizado en el ensayo
de tolerancia a la glucosa en ratones normogliclémicos.
4. Estabilidad del extracto optimizado de P. ligularis bajo condiciones de estrés
Los estudios de estabilidad bajo condiciones de estrés o de degradación forzada, permiten
identificar posibles productos o rutas de degradación de principios activos o productos
terminados, además de demostrar la especificidad de métodos desarrollados y validados para
el análisis de los mismos. Aunque se cuenta con guías de estabilidad como “Stability testing of
new drug substances and products” de la ICH (Q1A-R2), esta detalla las condiciones a evaluar
en los estudios de estabilidad acelerada, intermedia y a largo plazo, pero poca información se
especifica para llevar a cabo las pruebas de degradación forzada. Se establece que se deben
realizar pruebas para evaluar el efecto de la temperatura, oxidación, fotólisis, hidrólisis en un
rango amplio de pH y, humedad en caso de ser necesario (171).
Debido a lo anterior, y teniendo en cuenta la gran variabilidad de condiciones reportadas en la
literatura, Singh y Bakshi propusieron diferentes diagramas de flujo con las condiciones a
seguir en hidrólisis neutra, ácida y alcalina, oxidación y fotólisis, para proponer un sistema de
clasificación de la estabilidad inherente de un principio activo (172). Si bien dicha guía está
propuesta para compuestos puros, se tomó como referencia para evaluar la estabilidad bajo
condiciones de estrés, de los flavonoides presentes en el extracto optimizado de Passiflora
ligularis.
70 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
4.1 Metodología
4.1.1 Condiciones de hidrólisis, oxidación y degradación fotolítica
La metodología planteada por Singh y Bakshi consiste en seguir diferentes diagramas de
decisión. Con estos diagramas, de acuerdo con el nivel de degradación alcanzado en una
condición específica, se decide aplicar condiciones de estrés más leves o severas hasta alcanzar
un nivel de descomposición significativo, el cual es especificado como un porcentaje de
degradación entre el 20-80% del compuesto en estudio. Dependiendo de la severidad de las
condiciones bajo las cuales se llega a un valor dentro de dicho rango, se puede clasificar el
principio activo dentro de las siguientes categorías: prácticamente estable, muy estable,
estable, lábil, muy lábil o extremadamente lábil, en el caso de las reacciones de hidrólisis y
oxidación; o como foto-lábil o foto-estable en el caso de fotólisis.
A continuación, se describen los lineamientos seguidos para determinar la estabilidad
inherente del extracto, según el contenido de flavonoides totales cuantificado.
Hidrólisis
La estabilidad del extracto ante la hidrólisis se evaluó en un rango de pH amplio, siguiendo las condiciones planteadas en la Figura 4-2 para el caso de hidrólisis neutra, y de la Figura 4-3 para hidrólisis ácida y básica.
En los 3 casos, se partió de 125mg de extracto disueltos en 50ml del medio correspondiente
(agua, HCl o NaOH; ver montaje de hidrólisis Figura 4-1); posteriormente, alícuotas de 1 mL
fueron tomadas en los tiempos establecidos, neutralizadas en el caso de las soluciones ácidas
o básicas, y diluidas con MeOH-agua (1:1) hasta alcanzar la concentración esperada de
1mg/mL. Las muestras, por triplicado, fueron filtradas por membranas de tamaño de poro de
0.22 µm, e inyectadas en el cromatógrafo para la cuantificación de flavonoides totales. En cada
muestreo, se realizó la reposición del medio tomado con el mismo volumen de agua, ácido
clorhídrico o hidróxido de sodio, a las concentraciones específicas según el caso.
Capítulo 4 71
Figura 4-1: Montajes para evaluar condiciones de estrés hidrolíticas. A. Montaje de hidrólisis
neutra, ácida, o básica en reflujo. B. Montaje de hidrólisis neutra, ácida, o básica, a 40ºC.
Figura 4-2: Diagrama de decisión seguido para determinar la estabilidad en condiciones de
hidrólisis neutra (pH del agua entre 5-6).
A B
72 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Figura 4-3: Diagrama de decisión seguido para determinar la estabilidad en condiciones de
hidrólisis ácida y básica.
Los diagramas de decisión muestran en paréntesis, la categoría de estabilidad bajo la cual
quedaría clasificada la muestra, al presentar un valor de degradación significativo en la
condición de reacción respectiva.
Oxidación
Para llevar a cabo los estudios de degradación forzada por oxidación, 15 mg del extracto se
disolvieron en 15 mL de peróxido de hidrógeno en las concentraciones descritas en la Figura
4-4. Las muestras tomadas antes de iniciar la reacción o durante el periodo de tiempo
establecido en cada condición, se filtraron por 0.22 µm previo a su inyección directa en el
cromatógrafo.
Capítulo 4 73
Figura 4-4: Diagrama de decisión seguido para determinar la estabilidad en condiciones de
peroxidación.
Fotólisis
En el caso de los estudios de degradación fotolítica, se utilizó una cámara de fotoestabilidad
diseñada para cumplir con las condiciones de exposición propuestas por Singh y Bakshi. El
equipo cuenta con una lámpara halógena y otra fluorescente con el fin de simular las
condiciones solares, fuentes de flujo de aire, para evitar degradación de las muestras debido a
un leve aumento en la temperatura causado por la lámpara fluorescente, y una malla donde se
ubican las muestras. El extracto (50mg) fue depositado de manera homogénea en cajas de
vidrio que se ubicaron en el centro de la malla (Figura 4-5). Los muestreos fueron realizados
antes de empezar la exposición a la luz, a los 10 días y al día 30 de iniciado el ensayo, ya que al
cabo de ese tiempo se alcanza respectivamente la exposición especificada en la primer y
segunda condición del diagrama de decisión (Figura 4-6). En cada caso, 3 muestras de 2 mg
de extracto fueron tomadas, disueltas en 2 mL de MeOH-agua (1:1) cada una, y filtradas por
membranas de 0.22 µm previo a su inyección en el cromatógrafo.
74 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Figura 4-5: A. Cámara de fotoestabilidad. B. Muestras de extracto optimizado de P. ligularis
sometido a las condiciones de estrés fotolíticas.
Figura 4-6: Diagrama de decisión seguido para determinar la estabilidad en condiciones de
estrés fotolíticas.
Capítulo 4 75
4.2 Resultados y Discusión
Con el fin de dar seguimiento a los resultados de este capítulo, se presenta brevemente en la
Figura 4-7 la identificación planteada anteriormente de los flavonoides presentes en el
extracto optimizado de hojas de P. ligularis.
Figura 4-7: Cromatograma UV a 350 ηm del extracto optimizado de hojas de P. ligularis
mediante las condiciones cromatográficas descritas en la Figura 2-2. Los picos numerados en
azul corresponden a los flavonoides identificados y en rojo compuestos fenólicos sin
identificar.
76 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
4.2.1 Estabilidad bajo condiciones de estrés de hidrólisis neutra
La primera condición de degradación forzada evaluada consistió en exponer el extracto a
hidrólisis durante 12 horas. Antes de iniciar el reflujo, el valor de flavonoides totales
cuantificado fue 48.67 ± 1.446 mg-eq de isoquercetina/g de extracto seco; y se obtuvo, 33.51
± 0,767 mg-eq de isoquercetina/g de extracto seco, en el punto final de la reacción,
presentando un porcentaje de degradación de 31.14%; valor que al encontrarse dentro del
rango de 20-80% de degradación significativa, permite clasificar al extracto como LÁBIL, de
acuerdo con el diagrama de decisión de la Figura 4-2.
Figura 4-8: Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés de hidrólisis
neutra -agua, 12h, reflujo- en tiempo cero (negro) y punto final (azul). Los picos numerados en
negrilla representan los flavonoides de identidad conocida que presentaron principales
cambios. Condiciones cromatográficas descritas en la sección 2.2.1
Al analizar los cambios generados en el perfil cromatográfico del punto final de la reacción
respecto a la muestra de partida (Figura 4-8), y teniendo en cuenta la identificación de los
13 12
8
3
1
4
7
2
5 9
6
10 11
14 15
Capítulo 4 77
picos presentada en la Figura 4-7, es posible proponer 5 cambios principales: la
transformación del pico 3 (quercetina-3-O-(6''-malonil)-glucósido) en el pico 1 (quercetina-3-
O-glucósido ), el aumento del pico 2 (luteolina-7-O-glucósido) por la desaparición del pico 9
(luteolina-7-O-(6”-malonil)-glucósido), incremento del pico 4 (kaempferol-3-O-glucósido) tras
la degradación del pico 8 (kaempferol-3-O-(6”-malonil)-glucósido), al igual que 7
(isoramnetina-3-O-glucósido) gracias a la disminución de 10 (isoramnetina-3-O-(6”-malonil)-
glucósido), y finalmente, la formación de 12 (crisina-7-O-glucósido) a partir del compuesto 13
(crisina-7-O-(6”-O-acetil)-glucósido); las 5 transformaciones mediadas por la hidrólisis del
enlace tipo éster en la posición 6” de la unidad de glucosa (Figura 4-9).
Por otro lado, se propone que la degradación total de los picos intermedios, entre el tiempo de
retención 22.5 a 26.5 minutos (Figura 4-8), se debe especialmente a una inestabilidad debida
a la temperatura por un tiempo prolongado más que por efecto del pH. Esto teniendo en cuenta
que la reacción se llevó a cabo por 12h en reflujo al pH del agua (entre 5-6) y que al comparar
con los perfiles cromatográficos presentados más adelante a pH ácido y básico, se observa una
disminución parcial y no total de los mismos picos.
Figura 4-9: Propuesta de degradación por hidrólisis neutra. Ejemplificación de la
transformación de quercetina-3-O-(6''-malonil)-glucósido (1) a quercetina-3-O-glucósido (3).
En el estudio de la estabilidad en condiciones de estrés (bajo la misma metodología empleada
en esta tesis) de un extracto de Passiflora quadrangularis, éste se clasificó como prácticamente
estable tras 5 días de reacción. El resultado obtenido para esta especie en comparación con el
extracto de granadilla, puede deberse a su composición en flavonoides tipo vitexina, orientina
y derivados de éstos, cuyas unidades de azúcar, no presentaban sustituciones en los grupos
hidroxilo. Por el contrario, como se propone en la Figura 4-9, el grupo carbonilo de los
flavonoides glucosilados sustituidos, es altamente susceptible a ataques nucleofílicos,
explicando así la menor estabilidad del extracto de P. ligularis (153).
78 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
4.2.2 Estabilidad bajo condiciones de estrés de hidrólisis ácida
Tras someter el extracto a las condiciones iniciales planteadas en el árbol de decisión Figura
4-3 (HCl 0.1N, reflujo, 8h), el contenido de flavonoides totales disminuyó en un 89.99%, siendo
necesaria la evaluación de una condición de estrés menos severa. En el segundo nivel evaluado
(HCl 0.01N, 8h, 40ºC), no varió significativamente el contenido de FT , entre el punto inicial y
final de la reacción ( t0: 47.22 ± 0.407 y t8: 49.31 ± 0.444 mg-eq de isoquercetina/g de extracto
seco), pero sí se generaron algunos cambios en el perfil cromatográfico del extracto, tal como
se observa en la
Figura 4-10.
Figura 4-10: Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés a pH ácido –
HCl 0.01N, 8h, 40ºC- en tiempo cero (negro) y punto final (azul). Los picos numerados en
negrilla representan los flavonoides de identidad conocida que presentaron principales
1
3
4 8
12 13 2
5
15 14 11
9
7 10
Capítulo 4 79
cambios. Condiciones cromatográficas descritas en la sección ¡Error! No se encuentra el
origen de la referencia..
Las mismas 5 principales transformaciones descritas para la hidrólisis neutra, fueron
observadas bajo la condición de hidrólisis en ácido clorhídrico 0.01N, durante 8h a 40ºC;
donde la hidrólisis del grupo malonil en los picos 3, 8, 9, y 10 o del acetilo del compuesto 13,
aumentaron los flavonoides glicosilados quercetina-3-O-glucósido (1), kaempferol-3-O-
glucósido (4), luteolina-7-O-glucósido (2), isoramnetina-3-O-glucósido (7) y crisina-7-O-
glucósido (12) respectivamente (Mecanismo de reacción planteado en la Figura 4-11).
Figura 4-11: Propuesta de degradación por hidrólisis ácida. Ejemplificación de la
transformación de luteolina-7-O-(6''-malonil)-glucósido (9) a luteolina-7-O-glucósido (2).
A pesar de que no se presentara una degradación significativa en términos del CFT, sí se
observaron cambios en el perfil cromatográfico, y siendo las condiciones inicialmente
evaluadas muy severas para el extracto, se decidió clasificar su estabilidad como MUY LÁBIL
frente a hidrólisis ácida. El hecho de que no se hayan presentado cambios de degradación
significativos en la segunda condición evaluada puede explicarse ya que, bajo estas
condiciones de estrés, el ácido es quien cataliza el ataque nucleofílico (no el agua como en el
caso de la hidrólisis neutra) y por ende, la reacción se da más rápidamente y con menor energía
(temperatura).
Reportes en la literatura sobre las posibles degradaciones de los flavonoides varían de acuerdo
con el tipo de condiciones evaluadas, la matriz estudiada y las características estructurales de
los diferentes tipos de flavonoides presentes en la misma. Sin embargo, algunas similitudes
fueron encontradas con los resultados aquí presentados. Un estudio de estabilidad de Radix
hedysari, matriz con un alto contenido de isoflavonas malonil-glucósidos, reportó que estos se
80 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
transformaban fácil y completamente en las isoflavonas glicosiladas; y que éstas, a pesar de
presentar el enlace glucosídico O-C (enlace hemiacetal lábil a los ácidos) (102), no se
degradaban a las agliconas respectivas en un rango de pH 2-7 (173); comportamiento
observado para el extracto de P. ligularis.
Un comportamiento distinto se observó para los flavonoides presentes en el extracto de P.
quadrangularis, ya que los flavonoides diglicosilados como orientina-2”-O-xilósido y vitexina-
2”-O-xilósido fácilmente se hidrolizaron en sus respectivos flavonoides mono-C-glucosilados;
y estos a su vez, debido a las condiciones de temperatura y acidez, se degradaban en los
isómeros de vitexina y orientina. Aun así, dicho extracto se clasificó como lábil debido a la poca
degradación de los flavonoides totales (153).
4.2.3 Estabilidad bajo condiciones de estrés de hidrólisis básica
Similar a lo ocurrido en las condiciones de hidrólisis ácida, el porcentaje de degradación
obtenido en el extracto tras la primera prueba de estrés propuesta en el diagrama Figura 4-3,
superó el rango de 20-80% (93.08%). El nivel de condiciones más leve seguido, conllevó a la
disminución del CFT desde 47.42 ± 0.540 hasta 16.27 ± 0.212 mg-eq de isoquercetina/g de
extracto seco, es decir, 65.67% de degradación del contenido de flavonoides en el extracto;
valor que permite clasificar su estabilidad como MUY LÁBIL ante la hidrólisis básica.
Consecuente con la disminución de los flavonoides cuantificados, los perfiles cromatográficos
mostrados en la Figura 4-12, demuestran mayor degradación de los metabolitos en
comparación con las dos condiciones de pH anteriormente analizadas; ya que disminuyeron
tanto los picos esterificados en la unidad de glucosa (3, 8, 9, 10, 13) como algunos de los
flavonoides monoglucosilados respectivos (1, 2, 4 y 7). Dicho comportamiento de menor
estabilidad en medios alcalinos, se relaciona con el carácter levemente ácido aportado por los
grupos hidroxilo fenólicos en la estructura de los flavonoides, los cuales facilitan su reactividad
(174). Adicionalmente, se ha reportado que los hidroxilos, al encontrarse ionizados a alto pH,
son susceptibles a la oxidación y consecuente degradación de los núcleos de flavonoides
(175,176). Esto podría explicar la ausencia de picos nuevos en el cromatograma
correspondientes a las agliconas. Resultados similares se encontraron en un estudio de
Capítulo 4 81
degradación forzada de Ginkgo biloba, los flavonol-glicósidos y las agliconas quercetina,
isoramnetina y kaempferol, mostraron ser más inestables bajo condiciones de hidrólisis básica
que ácida, siendo la quercetina la más lábil (177).
Nuevamente, los resultados obtenidos en el estudio bajo condiciones de estrés del extracto de
P. quadrangularis, fueron más favorables respecto a P. ligularis, ya que éste fue clasificado
como lábil, presentando cambios mínimos en la cuantificación de flavonoides totales y en el
perfil cromatográfico (153). Lo anterior puede deberse a que los flavonoides mayoritarios en
el primer extracto son flavonas-8-C-diglucosiladas, y aunque no es claro el motivo, se reporta
en la literatura que la estabilidad de los flavonoides se ve influenciada por el número de
glicosilaciones, de modo que flavonoides di-glicosilados son más estables que los
monoglicósidos (178).
Figura 4-12: Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés a pH básico –
NaOH 0.01N, 8h, 40ºC- en tiempo cero (gris) y punto final (azul). Los picos numerados en
negrilla representan los flavonoides de identidad conocida que presentaron principales
cambios. Condiciones cromatográficas descritas en la sección ¡Error! No se encuentra el
origen de la referencia..
1
3
4 8
9
12
13
6
2
1
5
7 10 11
14 15
82 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
De acuerdo con los cambios cromatográficos observados y lo encontrado en la literatura, se
plantea en la
Figura 4-13, las degradaciones dadas en los flavonoides identificados en el extracto de
granadilla. La hidrólisis inicialmente se da en el enlace tipo éster de la glucosa, para obtener
los flavonoides monoglucosilados (
Figura 4-13, A), de los cuales, crisina-7-O-glucósido (12) mostró mayor estabilidad que
quercetina-3-O-glucósido (1), luteolina-7-O-glucósido (2), kaempferol-3-O-glucósido (4) e
isoramnetina-3-O-glucósido (7), picos que sí presentaron cierta disminución, y por ende,
pudieron sufrir la hidrólisis del enlace glucosídico y consecuente degradación oxidativa de sus
agliconas (
Figura 4-13, B).
Figura 4-13: Degradación por hidrólisis básica. A. Propuesta del mecanismo de hidrólisis del
enlace tipo éster; ejemplificación de la transformación de crisina-7-O-(6”-O-acetil)-glucósido
(13) en crisina-7-O-glucósido (12). B. Mecanismo de hidrólisis del enlace glucosídico
(179,180); ejemplo de degradación de quercetina-3-O-glucósido (1). El grado de
desprotonación en la estructura depende del pH del medio y valor de pKa de cada uno de los
hidroxilos fenólicos.
4.2.4 Estabilidad bajo condiciones de estrés de oxidación
Al comparar el perfil cromatográfico de la reacción de oxidación con peróxido de hidrógeno
30% en los tiempos 0 y 24 horas (
Capítulo 4 83
Figura 4-15, A), se observaron los mismos cambios obtenidos para las condiciones de estrés
por hidrólisis, es decir, aumentaron los flavonoides glicosilados quercetina-3-O-glucósido (1),
luteolina-7-O-glucósido (2), kaempferol-3-O-glucósido (4), isoramnetina-3-O-glucósido (7), y
crisina-7-O-glucósido (12). Consecuentemente, se observa en la
Figura 4-15-B, la alta similitud entre los cromatogramas de los últimos muestreos tomados
tanto en la condición de peroxidación, como de hidrólisis neutra, lo cual puede indicar, que las
condiciones de reacción no fueron lo suficientemente fuertes como para lograr la oxidación de
los flavonoides, y por ende, los cambios observados corresponden a un proceso de hidrólisis.
Algunas características estructurales como la presencia de grupos hidroxilos libres,
especialmente en el anillo B o en la posición 3 del anillo C, y el doble enlace entre los carbonos
2 y 3 en el anillo C, facilitan la donación de átomos de hidrógeno a radicales, o la deslocalización
de los mismos dentro de la estructura del flavonoide, generando su oxidación (Figura 4-14).
Sin embargo, la presencia de sustituyentes como los azúcares en los grupos –OH, disminuyen
ese comportamiento pro-oxidante de los flavonoides (178) y por ende, el alto contenido de
flavonoides glicosilados en el extracto de P. ligularis, podría explicar la poca reactividad frente
a las condiciones oxidativas evaluadas.
De este modo, y teniendo en cuenta que no hubo una degradación significativa del contenido
de flavonoides totales (t0h: 49.215 ± 1.126; t24h: 49.67 ± 0.518 mg-eq de isoquercetina/g de
extracto seco), se puede clasificar al extracto de hojas de granadilla como PRÁCTICAMENTE
ESTABLE. Esta misma clasificación fue asignada al extracto estandarizado de hojas de P.
quadrangularis previamente estudiado bajo las mismas condiciones de estrés (153).
84 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Figura 4-14: Ejemplo de oxidación de flavonoides (178).
Capítulo 4 85
Figura 4-15: Cromatogramas del extracto optimizado bajo condiciones de oxidación con H2O2
30%, temperatura ambiente. A. Comparación perfiles en tiempo cero (negro) y punto final 24h
(rosa). Los picos numerados en negrilla representan los flavonoides de identidad conocida
que presentaron principales cambios. B. Comparación entre el perfil de peroxidación punto
final 24h (rosa) e hidrólisis neutra a las 12h (azul). Condiciones cromatográficas descritas en
la sección ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia..
4.2.5 Estabilidad bajo condiciones de estrés fotolíticas
1
3
4 7 8
9
12
A
B
13
2
5 10 14
15
86 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Al comparar el perfil cromatográfico del extracto optimizado antes de iniciar la exposición a la
luz y en diferentes días durante el ensayo, no se observaron cambios drásticos, tal como se
muestra en la Figura 4-16, A. Sin embargo, la cuantificación de flavonoides totales el décimo
y trigésimo día, indicó valores de degradación de 2.85% (t0: 58.34 ± 1.587; t1: 56.68 ± 2.050
mg-eq de isoquercetina/g de extracto seco) y 11.46% (t2: 51.660 ± 0.498 mg-eq de
isoquercetina/g de extracto seco) respectivamente, logrando clasificar el extracto como
FOTOESTABLE, ya que incluso en la máxima condición propuesta por la guía de Singh y Bakshi,
no se alcanzó un nivel de degradación significativo.
Teniendo en cuenta la composición de flavonoides presentes en el extracto de hojas de
granadilla -principalmente de tipo flavona, flavonol o flavonoles glicosilados- el resultado
obtenido bajo esta condición de estrés es consecuente con diferentes estudios de
fotoestabilidad de flavonoides, que demuestran que las principales características
estructurales que determinan la fotoreactividad de estos compuestos son: la presencia del
grupo enona (cetona α,β-insaturada), y especialmente el grupo 3-OH en el anillo C (Figura
4-16, B). De modo que los flavonoides que no presentan dichas características, por ejemplo:
flavanonas (ninguno de los dos grupos), flavonas (sólo cuentan con la enona); o los flavonoles
glicosilados en la posición 3, son más estables (181–183). El mismo comportamiento de
fotoestabilidad fue observado para la especie P. quadrangularis, cuya composición en
flavonoides se caracteriza por la presencia de flavonas mono y di-glucosiladas (153).
Capítulo 4 87
Figura 4-16: A. Cromatograma del extracto optimizado bajo condiciones de estrés fotolíticas.
En tiempo cero (negro) y punto final día 30 (azul). B. Características estructurales que
disminuyen la fotoestabilidad de flavonoides. Condiciones cromatográficas descritas en la
sección ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia..
4.3 Conclusiones
Mediante la guía de pruebas de estrés propuesta por Singh y Bakshi, se logró estudiar la
estabilidad inherente del extracto optimizado de P. ligularis respecto al contenido de
flavonoides totales. Tanto la cuantificación de éstos, como la evaluación de los cambios
generados en el perfil cromatográfico, permitieron establecer la alta estabilidad que presenta
bajo condiciones oxidativas y fotolíticas, al ser clasificado como PRÁCTICAMENTE ESTABLE
y FOTOESTABLE respectivamente. Por el contrario, demostró niveles de degradación
significativos que lo catalogaron como un extracto LÁBIL en medios de hidrólisis neutra y MUY
LÁBIL en hidrólisis ácida y básica.
Con estos resultados, fue posible identificar como principal mecanismo de degradación, la
hidrólisis del grupo malonilo o acetilo de aquellos flavonoides malonil/acetil-glucosilados, lo
cual generó un aumento en el contenido de los respectivos flavonoides monoglucosilados.
B
A
5. Caracterización biofarmacéutica del extracto optimizado de P. ligularis
La absorción es una etapa clave en la biodisponibilidad (BD) de un fármaco, entendiéndose por
BD, la velocidad y extensión a la que un ingrediente farmacéutico activo o fracción activa se
absorbe a partir de una forma farmacéutica y se encuentra disponible en la circulación
sistémica (20). Es un proceso dinámico de transferencia del fármaco desde el lumen
gastrointestinal, a través del epitelio intestinal y hacia la circulación portal; que se puede
expresar mediante la primera ley de Fick, aplicado a membranas:
𝐽𝑝𝑎𝑟𝑒𝑑 = 𝑃𝑝𝑎𝑟𝑒𝑑 ∗ 𝐶𝑖𝑛𝑡
Donde Jpared es el flujo del fármaco a través de la membrana intestinal, Ppared es la
permeabilidad efectiva; es decir, la velocidad a la que el fármaco disuelto cruzaría la pared
intestinal y Cint es la concentración en el líquido luminal en contacto con la membrana. Es decir
que, el flujo de un fármaco es producto de la permeabilidad y la solubilidad del mismo (15).
Comprender la interacción entre estos dos parámetros y su impacto en la absorción del
fármaco, es esencial para alcanzar una biodisponibilidad aceptable (184). Ambas propiedades,
constituyen la base para el sistema de clasificación biofarmacéutico (SCB), el cual tiene un
papel importante en el desarrollo y formulación de nuevos ingredientes activos.
En este capítulo, se discuten los resultados de permeabilidad y solubilidad obtenidos para los
flavonoides presentes en el extracto de P. ligularis, con el fin de proporcionar información
preliminar sobre su proceso de absorción, y poder plantear una clasificación biofarmacéutica
de los mismos.
90 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
5.1 Metodología
5.1.1 Determinación de la solubilidad
La solubilidad de los flavonoides presentes en el extracto optimizado, se evaluó en diferentes
medios de disolución (agua y buffers en un rango de pH desde 1.2 hasta 7.4) a dos
temperaturas, 25 y 37ºC ± 2ºC. Las soluciones amortiguadoras se prepararon de acuerdo con
las especificaciones de la USP 39 (185), tal como se detalla en la Tabla 5-1.
Tabla 5-1: Composición de las soluciones buffers preparadas.
Solución
amortiguadora
(I)*
Composición Cantidad Agua
destilada c.s.p
pH 1.2 (0.135) KCl 0.2M 50 mL
200 mL HCl 0.2 M 85 mL
pH 4.5 (0.05) NaC2H3O2 . 3H2O 1.5 g
500 mL
CH3COOH 2N 7 mL
pH 6.8 (0.0724) KH2PO4 0.2 M 50 mL
200 mL NaOH 0.2 M 22.4 mL
pH 7.4 (0.0891) KH2PO4 0.2 M 50 mL
200 mL NaOH 0.2 M 39.1 mL
De ser requerido se ajustó el pH utilizando ácido clorhídrico 2M o hidróxido de
sodio 2M según el caso. *I: Fuerza iónica expresada en molaridad.
Se evaluó la solubilidad de 2 solutos presentes en el extracto: isoquercetina y los flavonoides
totales (FT) como marcadores activos. La isoquercetina fue evaluada dentro del extracto (ISQ-
OPT) y como estándar (ISQ-EST), con el fin de conocer posibles cambios en la solubilidad de
los compuestos al formar parte de la matriz vegetal.
Para determinar si las soluciones saturadas de extracto y estándar se encontraban en el
equilibrio, se cuantificó el contenido de FT e isoquercetina a través del tiempo hasta no
encontrar variaciones en cada concentración. Esto sin superar el tiempo de degradación
Capítulo 5 91
previamente evaluado en las pruebas de estabilidad bajo condiciones de estrés, es decir, 12
horas para el medio acuoso y hasta 8 horas para los buffers.
Las muestras se sometieron a agitación (50 rpm) y temperatura constante en un Heidolph
Polymax 1040-Inkubator 1000, posteriormente, se centrifugaron las muestras a 18000 rpm,
los sobrenadantes se filtraron por membranas de tamaño de poro 0.45 µm, para finalmente ser
diluidos con MeOH-agua (1:1) y cuantificados mediante las curvas de calibración descritas en
el Capítulo 2, Tabla 2-2. Cada condición fue evaluada por triplicado; los resultados se
presentan como la media ± desviación estándar.
La clasificación de alta o baja solubilidad para FT, ISQ-OPT, e ISQ-EST se determinó según el
número de dosis (Do), Ecuación 5-1𝐷𝑜 =𝑀𝑜/𝑉𝑜
𝐶𝑠=
𝐶𝑖𝑛
𝐶𝑠 Ecuación 5-1.
Do es un número adimensional que se define como la relación entre la concentración inicial
(Cin) y la solubilidad de un compuesto (186).
𝐷𝑜 =𝑀𝑜/𝑉𝑜
𝐶𝑠=
𝐶𝑖𝑛
𝐶𝑠 Ecuación 5-1
Donde Mo es la dosis (mg), Cs es la solubilidad (mg/mL) y Vo corresponde al volumen de agua
recomendado para la administración de un medicamento por vía oral, 250 mL (15). Do > 1
indica baja solubilidad y Do < 1 alta solubilidad.
Es necesario tener presente que la categorización de la solubilidad según el sistema de
clasificación biofarmacéutica, se basa en la potencia máxima reportada para el producto de
liberación inmediata (16); de modo que para el caso del extracto se tuvieron en cuenta las
dosis evaluadas en el ensayo de tolerancia a la glucosa (Figura 3-9). Aunque se observó el
efecto anti-hiperglicemiante en todas las dosis evaluadas, se seleccionó la de 250 mg/kg como
la más alta ya que, como se mencionó previamente, de acuerdo con otros estudios realizados
en el grupo de investigación por Rey, et al, en la dosis máxima de 500 mg/kg, los extractos
hidroalcohólicos de las hojas de P. ligularis conllevaron a niveles de glicemia muy bajos
considerados como hipoglicemia, efecto no deseado (11). Una vez seleccionada la dosis
máxima del extracto, se calculó la dosis equivalente de FT e ISQ-OPT que se administró a los
92 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
ratones en 250 mg extracto/Kg; para cada dosis obtenida se estimó la dosis equivalente en
humanos según la conversión basada en el área de superficie corporal (187), para finalmente
poder calcular el número de dosis. En el caso de ISQ-EST, se realizó el mismo procedimiento
teniendo en cuenta la dosis máxima del flavonoide encontrada en la literatura para ensayos de
actividad hipoglicemiante/antidiabética.
Adicionalmente, se debe considerar el valor de solubilidad más bajo encontrado en el rango de
pH fisiológico (1 a 8), a excepción de que el fármaco demuestre tener solubilidad dependiente
del pH, en cuyo caso se recomienda establecer la clasificación según el pH de cada segmento
del tracto gastrointestinal (15).
5.1.2 Determinación de la permeabilidad intestinal mediante el modelo Single Pass Intestinal Perfusion (SPIP)
Reactivos, materiales y equipos
Metoprolol ≥ 98% de Alfa AesarTM, fue utilizad como marcador de alta permeabilidad. Estándar
de quercetina-3-O-β-D-glucósido, ≥ 90%, de Sigma Aldrich para evaluar la permeabilidad de la
isoquercetina pura. Se usó como anestésico inyectable pentobarbital sódico, Penthal® (64.8
mg/mL, INVET). Acetonitrilo (HoneywellTM), metanol (Merck®) grado HPLC, ácido
trifluoroacético (Sigma Aldrich), ácido fórmico (Carlo Erba) y agua purificada mediante un
sistema Milli-Q Millipore® fueron los solventes usados para el análisis por UHPLC.
Los materiales requeridos durante el procedimiento quirúrgico fueron: jeringas de 1 y 5 mL
para la preparación y administración de la anestesia, catéter Jelco calibre 24G, suero fisiológico
estéril (NaCl 0.9%), campos quirúrgicos y gasa estéril, suturas quirúrgicas de polipropileno 4-
0, y agujas pericraneales calibre 23G (Medex®) a las cuales se les cortó la aguja y el conector
hembra, para poder utilizar el tubo vinílico restante como canal de salida del intestino. La
bomba peristáltica Minipuls-3 (Gilson) con cabezal de 4 canales, requería para su instalación
dos tipos de mangueras, en el cabezal se ubicaban dos mangueras de Viton® (diámetro interno
0.6mm, diámetro externo 2.5mm) y el extremo de salida de cada una se unía mediante un
Capítulo 5 93
conector de acero inoxidable (D.I 0.8mm) a una manguera de silicona (D.I 0.6mm, D.E 2.5mm),
la cual era insertada en el segmento intestinal correspondiente.
Los análisis por cromatografía líquida de todas las muestras fueron realizados en un equipo
Thermo scientific Dionex Ultimate 3000 equipado con un detector de arreglo de diodos Dionex
Ultimate 3000, bomba cuaternaria Dionex Ultimate 3000 RS, desgasificador en línea e inyector
automático. Los datos se procesaron utilizando el software Chromeleon Client, versión 6.80
SR15.
Animales
Los animales suministrados por el Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de
Colombia, bajo el aval del Comité de ética de la Facultad de Ciencias (Acta 09 de 2018) fueron
ratas macho Wistar de 7 a 15 semanas de edad (250-370g). Se aclimataron en condiciones de
temperatura constante (22 ° C ± 1), ciclos de luz/oscuridad de 12 horas, y consumo de alimento
y agua ad libitum previo a la realización de los ensayos.
Medios de perfusión y tratamientos evaluados
En este estudio se seleccionaron los segmentos de yeyuno e íleo para evaluar la permeabilidad
de los marcadores activos en el extracto, teniendo en cuenta reportes previos de la literatura
donde, bajo el mismo modelo de permeabilidad (SPIP), se identificaron estas dos secciones del
intestino como los sitios anatómicos donde se da la mayor absorción de algunos flavonoides
(188,189).
Teniendo en cuenta los diferentes valores de pH reportados para cada uno de los segmentos
intestinales en ratas (duodeno: 5.8-6.5; yeyuno: 6.5-6.8; íleo: 6.8-7.4; (190,191)), y que se ha
demostrado que la permeabilidad de las sustancias puede verse influenciada tanto por el
segmento evaluado como por el pH intraluminal, se seleccionó la composición de los medios
de perfusión para el yeyuno e íleo reportados por Roos y colaboradores (192), en los cuales se
encontraron las mejores correlaciones entre los datos de permeabilidad en ratas y en humanos
para 4 fármacos modelo, Tabla 5-2.
94 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Tabla 5-2: Composición de los medios de perfusión para yeyuno e íleo.
Composición Yeyuno
Buffer 67mM, pH 6.5 Íleo
Buffer 100mM, pH 7.4
NaCl (g) 5 4
KH2PO4 (g) 6,35 1,81
Na2HPO4 (g) 3,16 8,48
Agua Milli-Q c.s.p 1000 mL 1000 mL
Se evaluó la permeabilidad en yeyuno e íleo de cinco tratamientos. El grupo I, compuesto del
marcador de permeabilidad seleccionado, metoprolol (alta permeabilidad), se preparó de
acuerdo con la potencia máxima prescrita en humanos dividida en 250 mL de medio, con el fin
de representar la concentración máxima del fármaco en el intestino. Los grupos II, III y IV,
corresponden a la perfusión del extracto en 3 concentraciones diferentes, cada una
correspondiente a las 3 dosis en las cuales se ha evaluado la actividad biológica por Rey, et al
(11). En el grupo V, se preparó el estándar de isoquercetina a la concentración en la cual se
encuentra en el extracto optimizado. Se muestra en la Tabla 5-3 las concentraciones a las
cuales se prepararon los tratamientos.
Tabla 5-3: Preparación de los tratamientos a evaluar mediante el ensayo de perfusión
intestinal en yeyuno e íleo.
Grupo Tratamiento Concentración Dosis
equivalente de CFT c
Dosis equivalente
de ISQ d
Categoría dosis e
I Metoprolol a 0.4 mg/mL
II Extracto OPT 125 mg/Kg
12.5 mg/mL 7.470 1.771 Baja
III Extracto OPT 250 mg/Kg
25 mg/mL 14.94 3.543 Media
IV Extracto OPT 500 mg/Kg
50 mg/mL 29.88 7.085 Alta
V Isoquercetina 0.015 mg/mL b 0.150
aPotencia máxima prescrita del fármaco: 100 mg. bConcentración cuantificada en el extracto: 14.17 ±
0.667 mg de isoquercetina/g extracto seco, equivalente a 15.13 ± 0.609 µg isoquercetina/mL.
cExpresado en mg-eq isoquercetina/kg. dExpresado en mg de isoquercetina/kg. eCategoría de la dosis
administrada del extracto optimizado.
Capítulo 5 95
La preparación de las muestras fue la siguiente: en 50 mL de cada uno de los medios de
perfusión (pH 6.5 y pH 7.4) se disolvió la cantidad necesaria para alcanzar la concentración
descrita en la Tabla 5-3. Posteriormente se sonicaron hasta lograr la disolución completa de
las muestras (5-10 minutos) y finalmente, se ubicaron en una plancha con agitación magnética
y temperatura (37ºC) constante durante el tiempo de duración del ensayo.
Validación de metodología analítica para la cuantificación del marcador de
permeabilidad
Para el análisis de metoprolol, se utilizó la misma fase estacionaria empleada para la
cuantificación de flavonoides, columna Phenomenex® Kinetex C18 (100 × 2,1 mm; 2,6 μm),
temperatura del horno 40ºC. La fase móvil consistió de ácido trifluoroacético (TFA) al 0.1% en
agua como fase A, y TFA 0.1% en acetonitrilo como fase B, en el siguiente gradiente: 10%-30%
B (0-2 min), 30% B (2-5 min), 10% B al min 8. Un volumen de 3μL de las muestras eran
inyectadas y eluidas a un flujo de 0.5 mL/min. La longitud de onda de máxima absorbancia fue
222 ηm.
Se prepararon por triplicado soluciones que contenían el marcador de alta permeabilidad, en
un rango de concentraciones entre 10-200 μg/mL. Todas las diluciones fueron realizadas en
MeOH-agua (1:1) y las muestras filtradas por 0.22 μm previo a su inyección en el equipo. El
método fue validado de acuerdo con los parámetros de selectividad, linealidad, precisión,
exactitud, límite de detección y de cuantificación, de la guía ICH (90).
Ensayo in situ de perfusión intestinal de un solo paso (SPIP)
Los animales fueron puestos en ayuno con libre acceso a agua por 14-16 horas previo a la
realización de cada ensayo. Las ratas se anestesiaron con una dosis de 60 mg/Kg de
pentobarbital sódico por vía intraperitoneal (IP), y una vez alcanzado el estado de anestesia
profunda se procedió de la siguiente manera:
1. Se canalizó una de las vías periféricas de la cola mediante un catéter Jelco Nº 24, con el
fin de administrar por vía intravenosa refuerzos de la anestesia diluida en suero
fisiológico (al 30% de la dosis inicial), para mantener el estado de anestesia del animal
durante todo el ensayo.
96 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
2. Se rasuró el área abdominal del animal y se ubicó en la zona quirúrgica destinada para
la realización del ensayo, la cual se encontraba aclimatada mediante un calentador de
ambientes para el mantenimiento de la temperatura corporal de la rata (Ver ¡Error!
No se encuentra el origen de la referencia.). El procedimiento quirúrgico inició al
realizar una incisión de 3-4 cm en la línea media del abdomen, rodeada con el campo
quirúrgico para exponer el intestino delgado, e identificar el punto inicial y final a
canular en cada segmento. Para el yeyuno, se realizó un pequeño corte a 5 cm del
ligamento de treitz; mientras que el comienzo del íleo se ubicaba 20 cm arriba del
ciego, en cada punto de partida se conectó la manguera respectiva proveniente de la
bomba peristáltica y se aseguró cuidadosamente mediante un punto de sutura; a partir
de allí, se midió cada segmento de aproximadamente 10 cm y se canuló de igual forma
el punto de salida con las tuberías previamente obtenidas de las agujas pericraneales
(Ver ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.). El área intestinal expuesta
fue finalmente tapada con gasa estéril, y constantemente humedecida con solución
salina a 37ºC.
3. La etapa de perfusión inició realizando un lavado con el buffer respectivo de cada
segmento (pH 6.5 para el yeyuno, pH 7.4 para el íleo), a un flujo de 1 mL/min por
aproximadamente 15 min para expulsar cualquier material sólido que pudiese quedar
remanente del ayuno, posteriormente se disminuyó el caudal a 0.5 mL/min por 15
minutos más. Seguidamente, se perfundió el tratamiento a un flujo constante de 0.2
mL/min. Después de 60 min de perfusión (tiempo aproximado para alcanzar el estado
de equilibrio de la sustancia con la membrana intestinal), se colectó el perfusado de
salida de cada segmento durante intervalos de 15 minutos (0, 15, 30, 60, 75, 90, y 105
min), en viales de vidrio previamente pesados.
4. Cada vial colectado fue inmediatamente pesado. Luego, una alícuota de 1mL fue
tomada con micropipeta y pesada en un tubo de microcentrífuga para determinar la
densidad de la solución de salida; esto con el fin de realizar la corrección gravimétrica
del flujo de salida. Todas las muestras se refrigeraron hasta terminar el ensayo y
posteriormente se almacenaron a -80ºC hasta ser analizadas.
5. Transcurrido los 105 minutos de muestreo, se sacrificó el animal mediante
sobredosificación del anestésico. Finalmente, se retiró cada segmento intestinal para
medir su diámetro y longitud exacta.
Capítulo 5 97
6. Se realizó la cuantificación de los analitos de interés tanto en las muestras perfundidas
colectadas (concentración de salida) como en las soluciones preparadas de cada
tratamiento (concentración de entrada). Para el caso de los tratamientos II-IV, se
cuantificó el contenido deFT y el contenido de isoquercetina.
Teniendo en cuenta que por cada ensayo se evaluaba la permeabilidad de un único tratamiento
(un animal, dos segmentos intestinales) y que se establecieron cinco réplicas por cada uno, la
planeación de los ensayos consistió en realizar series de experimentos por réplicas de todos
los tratamientos, es decir, que en un primer ciclo se efectuaba la primer réplica de los 5
tratamientos, en el segundo ciclo la segunda réplica, y así sucesivamente hasta completar los
5 ensayos para cada grupo; esto con el fin de que la diferencia de edad de los animales entre
las 5 series de experimentos, afectara a todos los tratamientos por igual.
Figura 5-1: Montaje para ensayo de perfusión intestinal de un solo paso. A. Calentador de
ambientes. B. Zona quirúrgica. C. Cubeta para recolección de residuos y ubicación de viales
colectores. D. Bomba peristáltica. E. Plancha de calentamiento y agitación magnética con
muestras a perfundir. F. Viales de vidrio de 10 mL vacíos y pesados. G. Balanza analítica.
B
A
C
D
E
F
G
98 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Figura 5-2: Ilustración de la canulación de los segmentos intestinales.
Tratamiento de las muestras colectadas
Para la cuantificación de los metabolitos en las muestras colectadas, éstas se centrifugaron a
6000 rpm y alícuotas de los sobrenadantes eran tomadas y diluidas con MeOH-agua (1:1) en
caso de ser necesario. Finalmente, las soluciones se filtraron por membranas de poro de 0.22
µm y se inyectaban en el cromatógrafo UHPLC.
Análisis de los datos
El ensayo SPIP se basa en el principio de que la concentración del ingrediente activo que es
perfundido disminuye hasta alcanzar el estado de equilibrio en el segmento intestinal (la tasa
de entrada general iguala la tasa de salida general). Mediante la comparación de la
concentración que entra y la concentración de la solución que sale del segmento aislado, se
puede determinar la velocidad y grado de absorción a través de la membrana intestinal (Peff)
(193).
Para determinar la absorción de una sustancia es necesario considerar que el proceso de
absorción y secreción de agua durante el ensayo de perfusión, puede afectar el flujo de la
Capítulo 5 99
solución perfundida, e introducir errores en el cálculo de la permeabilidad efectiva (Peff, cm/s),
de modo que existen diferentes métodos para corregir el flujo de salida. El método
gravimétrico consiste en convertir el peso del perfusado intestinal colectado en un periodo de
tiempo, en un parámetro volumétrico, de tal forma que se pueda corregir el flujo de salida del
segmento intestinal (Ecuación 5-2𝑄𝑆 = 𝑃𝑆 𝐷𝑆⁄
𝑡 Ecuación 5-2) y con este valor,
corregir la concentración de salida de la solución del fármaco (Ecuación 5-3𝐶𝑆(𝑐𝑜𝑟) = 𝐶𝑆 ×𝑄𝑆
𝑄𝐸
Ecuación 5-3), para finalmente calcular el coeficiente Peff (Ecuación 5-4𝑃𝑒𝑓𝑓 =
−𝑄𝐸×ln(𝐶𝑆(𝑐𝑜𝑟)
𝐶𝐸)
2𝜋𝑟𝑙 Ecuación 5-4) (194). Los cálculos descritos a continuación se aplicaron
a los 7 muestreos tomados posterior a los 60 minutos de alcanzado el equilibrio.
Corrección de la concentración de salida (Cs(cor))
𝑄𝑆 = 𝑃𝑆 𝐷𝑆⁄
𝑡 Ecuación 5-2
𝐶𝑆(𝑐𝑜𝑟) = 𝐶𝑆 ×𝑄𝑆
𝑄𝐸 Ecuación 5-3
Donde,
QS: Flujo de salida del perfusado
Ps: Peso neto del perfusado colectado
Ds: Densidad del perfusado colectado
t: Tiempo (15 minutos)
Cs(Cor): Concentración de salida corregida
Cs: Concentración de salida cuantificada
QE: Flujo de entrada (0.2 mL/min)
Cálculo del coeficiente de permeabilidad efectiva (Peff)
𝑃𝑒𝑓𝑓 =−𝑄𝐸×ln(
𝐶𝑆(𝑐𝑜𝑟)
𝐶𝐸)
2𝜋𝑟𝑙 Ecuación 5-4
En la Ecuación 5-4, CE corresponde a la concentración de entrada, es decir, la cuantificada en
las soluciones preparadas de los tratamientos; r y l, a las medidas del radio y longitud tomadas
para cada segmento intestinal.
100 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
El coeficiente de Peff se calculó para cada muestreo realizado en el respectivo segmento
intestinal, de manera que los 7 datos obtenidos por segmento se promediaron para obtener el
valor de permeabilidad de cada réplica. Posteriormente, se calculó la Peff promedio y
desviación estándar entre las 5 réplicas, reportando así, el coeficiente de permeabilidad
efectiva promedio de cada tratamiento para el yeyuno e íleo.
Se observa en la Ecuación 5-2, que para calcular el flujo de salida es necesario tener en cuenta
la densidad del perfusado; la mayoría de reportes en la literatura asumen la densidad de todas
las soluciones colectadas como 1 mg/mL. Sin embargo, hay quienes proponen que esta
suposición puede introducir errores en el cálculo de Qs y consecuentemente de Peff,
considerando que factores como la posible erosión celular de la mucosa intestinal, causada por
la canulación y el flujo de ingreso de la solución, pueden generar la salida de ciertos
componentes solubles e insolubles en el perfusado, lo que puede alterar su densidad (194).
Por tal motivo, se quiso comparar el procedimiento de cálculo de la Peff asumiendo la densidad
como 1 mg/mL (Método A), con el procedimiento considerando la densidad específica de cada
solución (Método B).
5.1.3 Análisis estadístico
Se utilizó el programa GraphPad Prism® (versión 6, San Diego, CA, EE. UU.) para aplicar la
prueba t-Student en caso de evaluar las diferencias entre dos grupos, o ANOVA de dos vías para
múltiples comparaciones. Se consideraron diferencias estadísticamente significativas a
valores de p ≤ 0.05.
5.2 Resultados y discusión
5.2.1 Solubilidad de flavonoides totales e isoquercetina en el extracto optimizado
La solubilidad puede entenderse de manera cualitativa como la interacción espontánea entre
dos o más componentes que generan una dispersión molecular homogénea en un solvente
dado (195); y en términos cuantitativos, como la cantidad máxima de un soluto que una
Capítulo 5 101
cantidad dada de solvente puede mantener en solución, el punto de equilibrio entre el soluto
sin disolver y soluto solubilizado. Dicha capacidad puede verse afectada por características
fisicoquímicas de la molécula, como su estructura química y estado cristalino, o condiciones
específicas como la composición del solvente, el pH, temperatura y presión atmosférica (196).
Es necesario aclarar que, bajo las condiciones de ensayo establecidas, es posible hablar de la
solubilidad aparente de los marcadores activos. Dos definiciones se encuentran en la literatura
respecto a este concepto: entenderse como la solubilidad dinámica o metaestable, es decir, la
concentración de una sustancia en solución en equilibrio aparente (sobresaturación) (197); o,
la solubilidad de un soluto que se determina en un sistema tamponado (buffer) a pH definido,
y omite el efecto de la producción de sales con los contraiones que existen en la fase tampón,
sobre el valor de solubilidad estimado (195). Ambas definiciones aplican para los resultados
discutidos a continuación.
Con el fin de analizar más fácilmente el efecto del pH y la temperatura del medio en la
solubilidad aparente de los flavonoides presentes en el extracto optimizado (Tabla 5-4), se
muestra gráficamente en la Figura 5-3 los resultados obtenidos. Es necesario aclarar que no
se logró alcanzar una concentración de equilibrio (constante) de los FT en los diferentes
medios a 37ºC, a pesar de haber llegado al punto máximo de saturación del sistema a una
concentración de 1g de extracto por ml de solución, en concentraciones superiores a esta no
era posible dispersar el extracto en ninguno de los medios debido a la alta viscosidad de la
mezcla.
Tabla 5-4: Solubilidad aparente de flavonoides totales e isoquercetina en el extracto
optimizado de P. ligularis, y estándar de isoquercetina, en diferentes medios acuosos.
Marcador T
(ºC) Agua pH 1.2 pH 4.5 pH 6.8 pH 7.4
CFT 25 11,40 ± 0,585 10,04 ± 0,429 11,35 ± 0,529 9,204 ± 0,025 10,28 ± 0,277
37 > 9,243 ± 0,223 > 13,02 ± 0,156 > 13,73 ± 0,032 > 10,68 ± 0,368 > 10,53 ± 0,432
ISQ-OPT
25 2,725 ± 0,130 2,136 ± 0,075 2,733 ± 0,083 2,199 ± 0,015 2,569 ± 0,006
37 2,012 ± 0,041 2,625 ± 0,016 2,858 ± 0,008 2,291 ± 0,054 2,266 ± 0,142
25 0,071 ± 0,004 0,055 ± 0,002 0,077 ± 0,005 0,144 ± 0,005 0,223 ± 0,014
102 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
ISQ-EST 37 0,160 ± 0,001 0,142 ± 0,007 0,195 ± 0,003 0,213 ± 0,016 0,349 ± 0,012
Datos expresados en mg/mL, promedio ± desviación estándar (n=3).
Figura 5-3: A. Solubilidad aparente de flavonoides totales en soluciones acuosas a diferente
pH y temperatura. B. Solubilidad de isoquercetina como componente del extracto optimizado
(ISQ-OPT) y como compuesto puro (ISQ-EST), en soluciones acuosas a diferente pH y
temperatura. Los datos se expresan como promedio ± DS (n=3); fueron analizados mediante
un ANOVA de dos vías, seguido de una prueba Sidak de múltiples comparaciones para las
solubilidades de cada solución entre las dos temperaturas, con un valor de significancia **p
<0.01, ***p <0.001 y ****p <0.0001.
Como se mencionó anteriormente, los flavonoides son ácidos débiles que presentan diferentes
valores de pKa debido a la ionización de los grupos hidroxilos fenólicos. Para la quercetina se
A
B
Capítulo 5 103
han descrito valores de pKa de los 5 hidroxilos, entre 6.38-12.82 (176), 7.49 a 11.69 para el
kaempferol (198), 7.06 para el hidroxilo 4’ en la luteolina o 7.80 en la posición 7 del núcleo
isoramnetina (199), 8.0 y 11.9 para los dos hidroxilos libres en crisina (200). De modo que, al
aumentar el grado de ionización de los flavonoides del extracto con las soluciones preparadas
a pH > 5, se esperaba un incremento en la solubilidad aparente de los mismos. Sin embargo, se
observó un cambio descendente en la solubilidad de los flavonoides totales y la isoquercetina
contenida en el extracto, a pH 6.8 y 7.4, en las dos temperaturas evaluadas, pero especialmente
en agua a 37ºC.
Dicho comportamiento podría entenderse al tener en cuenta los siguientes aspectos. Primero,
que la solubilidad es el punto final que representa la capacidad de disolución; éste último es
un proceso termodinámico que involucra el rompimiento de las interacciones soluto-soluto, la
creación de espacios entre las moléculas del solvente y la inserción en dicho espacio de la
molécula de soluto previamente aislada. Este proceso se ve favorecido entre mayor atracción
o similitudes fisicoquímicas hayan entre el soluto y el solvente (195,196). Segundo, que el
extracto optimizado de P. ligularis es un sistema multi-componente en el cual, metabolitos
altamente solubles en agua como las saponinas, se encuentran en mayor cantidad dentro del
extracto que los flavonoides (ver como referencia los picos en los tiempos de retención 37-40
min de la Figura 2-2, B, correspondientes a las saponinas). Las saponinas identificadas hasta
el momento en el extracto son de tipo lanostano con dos unidades de azúcar (78); y la
solubilidad en agua de este tipo de compuestos aumenta con el número de unidades de azúcar
presentes en la estructura (201).
Por ende, es posible que la disolución de las saponinas y otros metabolitos secundarios dentro
de la mezcla, no permita que se cuente con el agua libre suficiente para la disolución total de
los flavonoides; efecto observado tanto para los FT como ISQ-OPT en las dos temperaturas
evaluadas, pero no para el estándar de isoquercetina. En el último caso sí se obtuvo el
comportamiento esperado de mayor solubilidad aparente a mayor pH, tanto a 25º como 37ºC.
Con el fin de verificar la significancia del efecto del pH sobre la solubilidad de los solutos, se
realizó una prueba de ANOVA de dos vías, seguido de la prueba post-hoc de Tukey para
comparar los valores de solubilidad aparente entre los pH. Para FT a 37ºC, no se encontró
diferencia estadísticamente significativa en la solubilidad a pH 6.8 y 7.4; se obtuvo diferencia
104 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
significativa (p <0.01) entre los buffers a pH 1.2 y 4.5, y diferencia altamente significativa
(p<0.0001) en todas las demás comparaciones posibles entre las soluciones. Las
comparaciones bajo la condición de 25ºC sí mostraron diferencias entre los pH 6.8 y 7.4
(p<0.001) pero no entre los medios a pH 1.2 y 4.5, ni entre pH 4.5 y el agua.
En el caso de la ISQ-OPT a 37ºC, la solubilidad aparente a pH 1.2 y en el agua fue
significativamente diferente con un valor de p<0.01 y levemente significativa entre los pH 4.5-
6.8, y 4.5-7.4 (p < 0.05); se encontró mayor diferencia entre la solubilidad a pH 4.5 y el agua
(p<0.001). Por el contrario, a 25ºC, el pH de la solución no afectó significativamente la
solubilidad aparente de la isoquercetina dentro del extracto, ya que sólo se encontró diferencia
al comparar los resultados obtenidos a pH 1.2 y 4.5 (p<0.05). La solubilidad aparente tampoco
varió significativamente en función del pH para la isoquercetina pura (ISQ-EST), en ninguna
de las dos temperaturas evaluadas.
Por otro lado, al comparar el efecto de la temperatura en la solubilidad aparente de los
flavonoides en cada solución acuosa (significancia estadística detallada en la Figura 5-3), se
observó que solamente a pH 7.4 de FT, y buffers a pH 4.5 y 6.8 de ISQ-OPT, no se obtuvieron
diferencias estadísticamente significativas. Pocas explicaciones se pueden plantear al respecto
considerando que en ningún medio a 37ºC se alcanzó el equilibrio aparente de los flavonoides
dentro de la matriz del extracto. Sin embargo, en los resultados de ISQ-EST sí se observó un
aumento en la solubilidad aparente al incrementar la temperatura, aproximadamente el doble
de lo obtenido a 25ºC en todos los medios acuosos. Esto podría indicar que el proceso de
disolución de la isoquercetina es endotérmico, teniendo en cuenta que en procesos de este
tipo, las temperaturas ambientales relativamente altas aumentan la solubilidad de los solutos,
mientras que disminuyen la solubilidad de aquellos con procesos exotérmicos (196). Se
encontraron algunos datos variables en la literatura sobre la solubilidad de isoquercetina en
agua a 25ºC, como por ejemplo, 206 nmol/mL (0.095 mg/mL) (202), 0.807 mg/mL (203) y 3
mM (1.39 mg/mL) (204).
A pesar de los inconvenientes mencionados anteriormente para establecer el equilibrio
aparente de los flavonoides dentro del extracto, es evidente que la solubilidad de los mismos
aumenta considerablemente al hacer parte de la matriz vegetal, teniendo en cuenta que la
Capítulo 5 105
solubilidad de la isoquercetina ISQ-OPT fue mucho mayor, y altamente significativa
(p<0.0001), respecto a la de ISQ-EST en todas las condiciones estudiadas. Reportes similares
en la literatura han descrito efectos sinérgicos entre los componentes de los extractos
vegetales que mejoran la solubilidad de los metabolitos, como, por ejemplo, el aumento en la
solubilidad de hiperósido al ser mezclado con flavonoides característicos de extractos de
Hypericum perforatum L. (205), o la alta solubilidad de rutina determinada en un extracto de
Physalis peruviana, en comparación con la del estándar puro (41).
Algunas posibles explicaciones para tales efectos sinérgicos se han propuesto, como
considerar que los extractos cuentan usualmente con un alto contenido de metabolitos
hidrofílicos de bajo peso molecular (como los metabolitos primarios) (206) que promueven la
hidratación rápida de la matriz, lo que resulta en un aumento de la humectación (207); y
también, que otros metabolitos presentes en la matriz pueden actuar como componentes
solubilizantes, por ejemplo, surfactantes naturales como las saponinas (206).
Adicionalmente, es importante tener en cuenta que dependiendo de la cristalinidad (tipo de
estructura cristalina o polimorfo) que presente un soluto, variará su punto de fusión, un factor
determinante de la solubilidad. De este modo, es posible que la ISQ-EST se encuentre en estado
cristalino y, por ende, presente mayor punto de fusión y consecuentemente, menor solubilidad
aparente respecto a la ISQ-OPT, la cual podría encontrarse en forma amorfa dentro del
extracto. Es de esperarse que un amorfo cuente con mayor solubilidad aparente que cualquiera
de sus formas cristalinas (208).
Finalmente, se calculó el número de dosis (Do) de los marcadores activos del extracto
optimizado de P. ligularis, como criterio para establecer la alta o baja solubilidad en el marco
del SCB. Como se mencionó previamente, Do es la relación entre la concentración del fármaco
administrado en 250 mL (un vaso de agua aproximadamente) y su solubilidad por saturación
en agua, lo que también puede entenderse como el número de vasos de agua requeridos para
disolver la dosis del fármaco. Es por esto que un número de dosis menor o igual a 1 indica una
alta solubilidad y mayor a 1 indica baja solubilidad (209).
Se presenta en la Tabla 5-5 los resultados obtenidos para los flavonoides totales e
isoquercetina en el extracto y el estándar de isoquercetina. Se decidió calcular el Do con los
valores de solubilidad más bajos obtenidos a 37ºC (Tabla 5-4), ya que no se obtuvieron
106 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
diferencias estadísticamente significativas en las solubilidades a pH 6.8 y 7.4, valores de pH de
los segmentos estudiados en el ensayo de permeabilidad, yeyuno e íleo respectivamente.
Tabla 5-5: Número de dosis Do calculado para los flavonoides totales e isoquercetina
contenidos en el extracto optimizado de P. ligularis, e isoquercetina pura.
Marcador
Dosis máxima
del extracto
en ratones
(mg/kg)
Dosis
equivalente del
marcador
(mg/kg)
Dosis
estimada en
humanos, Mo
(mg) c
Solubilidad
más baja, Cs
(mg/ml)
Do
CFT 250 14.94 a 72.88 9.243 0.032
ISQ-OPT 250 3.542 a 17.28 2.012 0.034
ISQ-EST 200 b 975.6 0.142 27.48
a Dosis calculada según la concentración de FT (59.76 mg-eq isoquercetina/g extracto seco) e
isoquercetina (14.17 mg isoquercetina/g extracto seco) en el extracto. b Dosis reportada en ratones
diabéticos KK-Ay (210). c Estimación según la fórmula de conversión: dosis en ratón/12.3; ajustando al
peso de referencia en humanos 60kg (187).
De acuerdo con estos resultados, se puede catalogar a los FT y a ISQ-OPT, según el SCB como
altamente solubles (Do < 1) y a la isoquercetina estándar como poco soluble (Do > 1).
La solubilidad es uno de los parámetros biofarmacéuticos más relevantes, considerando que
con éste se busca alcanzar la concentración deseada del fármaco en la circulación sistémica,
para lograr el efecto farmacológico (195). Una alta solubilidad acuosa representa alta
concentración del fármaco en el fluido gastrointestinal, lo que promueve la permeación del
fármaco; por el contrario, baja solubilidad, conlleva a poca disponibilidad del mismo para su
absorción (201). Alrededor del 40% de los fármacos disponibles en el mercado presentan baja
solubilidad y, entre 80-90% de los candidatos a fármacos fallan en la etapa de investigación y
desarrollo debido a problemas en su solubilidad (195).
Por ende, se destaca el efecto de la matriz vegetal y las interacciones entre los componentes
del extracto de P. ligularis, que aumentaron la solubilidad de la isoquercetina y demás
Capítulo 5 107
flavonoides del extracto; una de las propiedades clave para el desarrollo de un producto
terapéutico.
5.2.2 Evaluación de la permeabilidad de los flavonoides presentes en el extracto optimizado
Aunque existen diferentes métodos para evaluar la permeabilidad intestinal de una sustancia,
de los más empleados, células Caco-2, el método de saco evertido, y SPIP (Single Pass Intestinal
Perfusion), este último presenta algunas ventajas sobre los demás. Por ejemplo, condiciones
fisiológicas más similares a las de administración oral in vivo, como la presencia de microflora
intestinal, enzimas y transportadores de membrana; además de presentar menor sensibilidad
a las variaciones de pH y la posibilidad de estudiar diferencias regionales. Todo lo anterior lo
ha catalogado como el modelo más confiable y asertivo para poder realizar predicciones de
permeabilidad en humanos (211,212)
Para la evaluación de la permeabilidad en ratas, se tuvieron en cuenta diferentes
consideraciones para el método de perfusión intestinal in situ SPIP. Se evaluó la estabilidad
(punto inicial y punto final) de las soluciones perfundidas, mantenidas a 37ºC durante el
tiempo de duración del ensayo (aproximadamente 4h) (Anexo B-a); además de la selectividad
de cada método analítico (Anexo B-b). Los resultados de la validación del método para la
cuantificación del marcador de permeabilidad se encuentran en el Anexo: Información
suplementaria capítulo 5-c).
Para calcular correctamente la concentración del soluto que es perfundido, se necesita una
medida exacta del volumen de líquido al interior del intestino. Se seleccionó el método
gravimétrico para calcular el flujo neto de agua y así corregir el flujo de salida del perfusado,
ya que, otros métodos reportados implican la co-perfusión de marcadores no absorbibles
como el rojo de fenol, o isótopos radio-marcados como 14C-PEG. El primero, puede interferir
con la absorción o cuantificación analítica de los compuestos, y el segundo, puede implicar
otros aspectos regulatorios y de seguridad en los ensayos (213). Adicionalmente, diferentes
estudios han confirmado la equivalencia y exactitud del método gravimétrico para la
corrección del flujo (213,214). Como se mencionó anteriormente, el coeficiente de Peff
calculado para cada réplica correspondió al promedio de las permeabilidades efectivas
108 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
calculadas en cada tiempo de muestreo, una vez alcanzado el equilibrio. El estado de equilibrio
se evaluó al graficar la relación de concentración de entrada sobre salida en función del tiempo
y observar una relación constante. Se muestra en la Figura S5- 3 del anexo B, un ejemplo de
dicha gráfica y de la matriz de cálculo utilizada para determinar la Peff por medio de los dos
métodos (variaciones del método gravimétrico) evaluados.
Al comparar mediante una prueba t-Student de dos vías (p<0.05), los resultados de
permeabilidad efectiva obtenidos según el método A (asumiendo densidad como 1 mg/mL) y
método B (densidad determinada para cada solución) para cada tratamiento (Tabla 5-6), no
se encontró diferencia estadísticamente significativa entre cada par de datos, de modo que
asumir como 1 mg/mL la densidad de todas las soluciones colectadas no afectó la corrección
gravimétrica del flujo. Esto podría dar razón del manejo cuidadoso y delicado que se dio al
tejido al momento de su manipulación y canulación, además de los beneficios de un tiempo de
lavado y pre-equilibrio suficientes, considerando que algunas referencias en la literatura
describen el tiempo de lavado como el suficiente hasta observar un efluente claro, y 30 minutos
en promedio para alcanzar la fase de equilibrio (188,215).
Se exponen de aquí en adelante, las diferentes comparaciones realizadas entre los
tratamientos a partir de los resultados obtenidos en el método A.
Capítulo 5 109
Tabla 5-6: Coeficiente de permeabilidad efectiva (Peff) de FT, ISQ-OPT e ISQ-EST.
Marcador
Categoría de
dosis
administrada
Peff (cm/s) - Método A Peff (cm/s) - Método B
Yeyuno Íleo Yeyuno Íleo
CFT
Baja 3,312 x 10-5
(6,502 x 10-6)
6,711 x 10-5
(1,743 x 10-5)
3,664 x 10-5
(9,266 x 10-6)
6,999 x 10-5
(1,735 x 10-5)
Media 5,105 x 10-5
(1,223 x 10-5)
5,940 x 10-5
(6,794 x 10-6)
5,060 x 10-5
(1,548 x 10-5)
6,294 x 10-5
(7,564 x 10-6)
Alta 4,704 x 10-5
(7,053 x 10-6)
4,149 x 10-5
(6,793 x 10-6)
5,204 x 10-5
(6,770 x 10-6)
4,501 x 10-5
(6,205 x 10-6)
ISQ-OPT
Baja 3,952 x 10-5
(8,469 x 10-6)
5,604 x 10-5
(1,260 x 10-5)
4,121 x 10-5
(9,848 x 10-6)
5,867 x 10-5
(1,272 x 10-5)
Media 5,255 x 10-5
(8,444 x 10-6)
5,631 x 10-5
(7,404 x 10-6)
5,704 x 10-5
(9,602 x 10-6)
5,941 x 10-5
(7,609 x 10-6)
Alta 4,535 x 10-5
(5,500 x 10-6)
3,597 x 10-5
(6,772 x 10-6)
4,852 x 10-5
(6,144 x 10-6)
3,945 x 10-5
(6,555 x 10-6)
ISQ-EST 0.15 mg/kg 1,290 x 10-4
(3,412 x 10-5)
1,055 x 10-4
(2,336 x 10-5)
1,306 x 10-4
(3,462 x 10-5)
1,079 x 10-4
(2,213 x 10-5)
Datos expresados como el promedio (Desviación estándar), n=5. Método A: Peff calculada asumiendo
densidad de todos los perfusados como 1 mg/mL. Método B: Peff calculada con la densidad determinada para cada solución.
La permeabilidad es un parámetro que permite medir la capacidad de un fármaco para
atravesar una membrana biológica, es decir caracterizar su absorción, un proceso complejo
que puede involucrar diferentes vías (201). Dentro de los mecanismos de transporte pasivo
(difusión de componentes mediado por un gradiente de concentración que no requiere ningún
gasto de energía metabólica), se encuentra el transporte paracelular, dado a través de las
uniones estrechas entre los enterocitos; el transporte transcelular (difusión desde la
membrana apical, a través del citoplasma celular, hasta llegar a la membrana basolateral) y la
difusión transcelular facilitada por transportadores, que se produce mediante el paso de un
fármaco por su gradiente electroquímico sin la utilización de energía (216,217). Por el
contrario, en el transporte activo, el cual sí necesita energía; el mecanismo transcelular activo
mediado por transportadores, requiere de un mecanismo de acoplamiento entre la proteína
de membrana y la molécula del fármaco, para que éste sea liberado hacia el lado basolateral.
Adicionalmente, se encuentran los mecanismos de eflujo, transportadores involucrados en la
110 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
expulsión de las moléculas desde el citoplasma del enterocito hacia el lumen intestinal (216)
(Figura 5-4).
Los transportadores de entrada, ya sea por el mecanismo transcelular facilitado o activo, se
caracterizan por su capacidad de saturación y especificidad; mientras que los de eflujo,
presentan baja selectividad y son altamente expresados en los enterocitos, confiriendo así una
limitante para la absorción intestinal. De los primeros se encuentran las proteínas de la
superfamilia SLC (solute carrier), por ejemplo, PEPT, OCT, OATP, entre otros; y de los
segundos, se destacan los transportadores dependientes de ATP (o transportadores ABC-ATP
binding cassette) tales como, P-gp (glicoproteína P), MRP (multidrug ressitance-associated
proteins) y BCRP (Brest cancer resistance protein) (216,217).
Figura 5-4: Principales mecanismos de permeación intestinal de fármacos. A, difusión
transcelular; B, transporte paracelular; C, transporte transcelular facilitada por
transportadores; D, transcelular activo mediado por transportadores; E, eflujo. Figura creada
en BioRender.com.
Capítulo 5 111
Es importante tener en cuenta, que adicional a estas barreras mecánicas de las células, los
principios activos deben enfrentarse a barreras biológicas que afectan su absorción, como la
posible degradación por la microflora intestinal y el metabolismo catalizado por diferentes
enzimas (201).
Con el fin de tener una idea preliminar del posible mecanismo de absorción de los flavonoides
presentes en el extracto, se evaluó la Peff de los mismos en las 3 dosis categorizadas como baja,
media y alta. Se observa en la
Figura 5-5 que tanto para los flavonoides totales como la isoquercetina en el extracto, no se
encontraron diferencias significativas en la Peff de las dosis evaluadas, en el yeyuno, lo cual
sugiere un mecanismo de transporte pasivo que no involucre un proceso de saturación (215).
Por el contrario, en el segmento del íleo, se obtuvo para ambos marcadores un
comportamiento de permeabilidad dependiente de la concentración, donde la Peff disminuyó
significativamente al aumentar la dosis administrada. Este comportamiento se ha relacionado
en reportes de la literatura, con un mecanismo de transporte pasivo transcelular que involucre
un proceso saturable, potencialmente mediante una proteína transportadora (215,218). Sin
embrago, es importante tener en cuenta que en dichos estudios se evaluó la permeabilidad
efectiva al aumentar la concentración de un único compuesto, y no una matriz compleja como
en el caso del extracto de P. ligularis. De modo que también es necesario considerar que, al
aumentar la concentración del extracto, aumentara la competencia entre los metabolitos del
mismo por los transportadores de membrana.
112 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Figura 5-5: Coeficiente de permeabilidad efectiva de FT (A) e isoquercetina contenida en el
extracto optimizado ISQ-OPT y como estándar ISQ-EST (B), por SPIP en ratas (n=5).
Las diferencias estadísticamente significativas se analizaron mediante un ANOVA de dos vías, seguido
de un test de Tukey (*p<0.05, **p<0.01) al comparar las dosis administradas en cada segmento; o
seguido de un test de Sidak para comparar la Peff entre yeyuno e íleo (#p<0.05).
Debido a que solamente se obtuvo diferencia significativa en la permeabilidad de FT entre el
yeyuno e íleo en la dosis más baja administrada, se puede deducir que ninguno de los dos
marcadores activos del extracto optimizado de P. ligularis, presenta absorción dependiente del
sitio intestinal (en los dos segmentos evaluados).
Por otro lado, al comparar la Peff de ISQ-OPT e ISQ-EST, se observa un aumento significativo en
la permeabilidad del estándar respecto a las 3 dosis evaluadas del flavonoide en el extracto
A
B
Capítulo 5 113
(p<0,0001 respecto a todas las dosis en el yeyuno, p<0.01 y p<0.0001 comparado con las dosis
baja-media y alta respectivamente, en el íleo). De acuerdo con la literatura, se han reportado
diferentes procesos involucrados en la absorción de isoquercetina (Figura 5-6¡Error! No se
encuentra el origen de la referencia.). Algunos estudios mediante ensayos de saco intestinal
evertido han propuesto la posible interacción de la quercetina-3-O-glucósido con el co-
transportador de Na+-D-glucosa (SGLT1), que permitiría el transporte directo del flavonoide
(219,220). Sin embargo, otros estudios aclaran que aunque esta interacción se diera, no se ha
encontrado el compuesto intacto en muestras de plasma de voluntarios humanos, ni en
ensayos con ratas (221,222). Por otro lado, diferentes autores han confirmado la hidrólisis a
quercetina, mediada por la enzima lactasa-floricina hidrolasa (LPH); de este modo la aglicona
puede absorberse a través de la membrana intestinal o ser metabolizada en el interior del
epitelio intestinal, a glucurónido de quercetina por enzimas como las UGTs (uridina-difosfato
glucuroniltransferasas) (222–224); y considerando que las reacciones de conjugación (tanto
con ácido glucurónico, sulfato u O-metilación) en el intestino delgado son muy eficientes,
difícilmente se pueden encontrar las agliconas libres en el plasma u orina (225).
Figura 5-6: Posibles mecanismos de absorción reportados para isoquercetina. Q-3-gluc:
quercetina-3-O-glucósido; Q: quercetina; LPH: lactasa-floricina hidrolasa; SGLT1:
transportador de glucosa dependiente de sodio; β-G: β-glucosidasa; UGT: uridina-difosfato
glucuroniltransferasa; Q-glucA: glucurónidos de quercetina. Modificado de Gee,J; et al. 2000,
(220). Figura creada en BioRender.com.
114 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
En términos generales, se esperaría que los demás flavonoides glucosilados presentes en el
extracto, presentaran procesos de absorción y metabolismo similares debido a la poca
variabilidad estructural entre ellos (flavonoles o flavonas O-C glucosilados). Esta propuesta se
soportaría con los resultados de Németh y colaboradores, donde solamente los glucósidos de
diferentes flavonoles, flavanonas, isoflavonas y antocianinas fueron eficazmente hidrolizadas
por la enzima LPH (agliconas unidas a otro tipo de azúcares como ramnosa, arabinosa o xilosa
no fueron sustratos de la enzima) (226). Varios de los flavonoides identificados en el extracto
de P. ligularis, han sido reportados como sustratos de la LPH en el estudio mencionado,
específicamente quercetina-3-O-glucósido, quercetina-3-O-malonilglucósido, kaempferol-3-O-
glucósido, luteolina-7-O-glucósido, y apigenina-7-O-glucósido. Es decir, que se podría
considerar la hidrólisis como la etapa limitante en el proceso de absorción en este tipo de
compuestos (más que la permeación de la aglicona por el epitelio intestinal), de modo que es
posible que las enzimas LPH responsables de la hidrólisis se encontraran más disponibles para
actuar sobre la isoquercetina pura, en comparación con la perfusión del extracto optimizado,
donde al presentarse otros flavonoides glucosilados, éstos pueden competir por la cantidad de
enzimas de hidrólisis limitada en un segmento intestinal específico (224). Dando como
resultado una menor cantidad de isoquercetina hidrolizada y metabolizada y
consecuentemente, menores cambios entre la concentración de salida y entrada de ISQ-OPT.
En resumen, según los resultados obtenidos mediante el ensayo SPIP y lo reportado en la
literatura, es posible que los flavonoides del extracto optimizado de P. ligularis, al ser todos de
tipo O-glucósido, sean inicialmente hidrolizados, a sus respectivas agliconas, por la enzima
LPH en el borde de la membrana apical y que éstas posteriormente, permeen mediante
mecanismos de difusión pasiva y transporte transcelular facilitado al interior del epitelio
intestinal; dos mecanismos previamente reportados para diferentes agliconas como
quercetina, apigenina y kaempferol (188,215).
Adicionalmente, es necesario tener en cuenta el papel que pueden jugar los transportadores
de eflujo en la absorción de los flavonoides, ya que diferentes constituyentes de extractos
vegetales han sido identificados tanto como sustratos, como inhibidores de algunas proteínas
de eflujo (ejemplo, P-gp, BCRP y MRP1) entre ellos, los flavonoides (206,227).
Capítulo 5 115
5.2.3 Clasificación biofarmacéutica de los flavonoides presentes en el extracto optimizado de P. ligularis
Finalmente, se resume en la tabla Tabla 5-7, los resultados de solubilidad y permeabilidad
obtenidos para los flavonoides del extracto optimizado de P. ligularis. La determinación de alta
o baja permeabilidad se realizó comparando el valor de Peff de los marcadores activos en la
dosis media con la Peff del metoprolol (16), en el segmento del yeyuno. Se seleccionó este
segmento considerando que es la sección del intestino delgado principalmente reportada para
la clasificación biofarmacéutica (SCB) de principios activos, y además, en el que se han
propuesto correlaciones entre la Peff en ratas y Peff en humanos para poder predecir los valores
de Peff y Fa (fracción absorbida) en humanos. Por ende, se propone también, la permeabilidad
efectiva y fracción absorbida predichas para humanos (Peff-pred y Fa-pred respectivamente) de
los marcadores activos presentes en el extracto optimizado de P. ligularis. Ambos se calcularon
de acuerdo a los modelos de correlación planteados por Zakeri y colaboradores, según estudios
de permeabilidad mediante SPIP en ratas, donde; Peff-pred = 11.04 Peff (rata) – 0.0003; y Fa-pred =
1 - e-38450 Peff (rata) (212).
Tabla 5-7: Clasificación biofarmacéutica, Peff y Fa predicha en humanos de FT, ISQ-OPT e ISQ-
EST.
Marcador
activo
Solubilidad Permeabilidad Clase del
SCB
Peff-pred
Humanos
Fa-pred
Humanos Do Categoríaa Peff (cm/s) Categoríab
FT 0.032 Alta 5,10E-05 Baja III 2,64,E-04 0,86
ISQ-OPT 0.034 Alta 5,25E-05 Baja III 2,80,E-04 0,87
ISQ-EST 27.48 Baja 1,29E-04 Alta II 1,12,E-03 0,99
a Do < 1, alta solubilidad; Do > 1, baja solubilidad. b Según Peff del marcador de alta permeabilidad,
metoprolol (7.75E-05 cm/s). c De acuerdo con el SCB (15).
Aunque se han reportado diferentes estudios relacionados con la absorción de isoquercetina,
utilizando tanto modelos celulares Caco-2 como de perfusión in situ, éstos no mencionan
valores de permeabilidad efectiva del flavonoide. Se enfocan especialmente en estudiar el
116 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
mecanismo de absorción de la isoquercetina, para lo cual, sólo buscan cuantificar el compuesto
o sus productos de metabolismo (glucurónidos) en los lados basolateral/apical en el caso de
ensayos Caco-2, o en las muestras de perfusados y/o plasma en el ensayo SPIP (222–224). De
acuerdo con Zuo y colaboradores, aunque se obtuvo un valor bajo de permeabilidad aparente
para isoquercetina en Caco-2, aclaran que en los ensayos en ratas, este valor fue mucho mayor
(no lo reportan), siendo absorbida y biotransformada rápidamente (lo cual es consistente con
los resultados obtenidos para ISQ-EST); y que las diferencias entre los dos resultados pueden
deberse a la falta de expresión de enzimas y transportadores en el modelo celular (224). Otro
reporte encontrado sobre la evaluación de la permeabilidad de isoquercetina mediante el
ensayo SPIP, analizó la Peff del flavonoide siendo componente de un extracto acuoso de Amomi
fructus, sin comparar respecto al compuesto estándar. En este caso, determinaron valores de
Peff (×10-4cm/s) 0.5995 ± 1.471, 0.5268 ± 2.324 y 0.9981 ± 2.987, para duodeno, yeyuno e íleo
respectivamente (228).
Por otro lado, no se encontró información en la literatura respecto a la clasificación
biofarmacéutica de isoquercetina, de modo que los resultados obtenidos en este trabajo,
podrían considerarse como un aporte significativo a la información biofarmacéutica de este
flavonoide y cómo sus propiedades pueden cambiar al ser parte de una matriz vegetal.
Es claro que la biodisponibilidad oral de una sustancia activa, es función principalmente de la
Peff a través de la membrana intestinal, la solubilidad en el medio gastrointestinal y, la
estabilidad metabólica. Dicho de otro modo, la biodisponibilidad (F) depende principalmente
de: la fracción absorbida del ingrediente activo (Fa), la fracción que escapó del metabolismo en
la pared intestinal (Fg), y la fracción que escapó del metabolismo hepático (Fh), es decir, F = Fa*
Fg* Fh (229).
Gracias al potencial predictivo del ensayo de permeabilidad in situ SPIP, fue posible calcular
los posibles valores de Peff-pred y Fa-pred en humanos de los metabolitos de interés. Se ha
reportado que la Fa en humanos podría definir tres clases de absorción de fármacos in vivo:
baja absorción (Fa: 0-30%), intermedia (Fa: 30-90%) y completa (Fa: 90-100%) (193,211). De
manera que de acuerdo con los resultados obtenidos (Tabla 5-7), se podría decir que los
flavonoides del extracto optimizado de P. ligularis presentan absorción intermedia (86% para
FT y 87% para ISQ-OPT) y el estándar de isoquercetina, absorción completa (99%). Es
Capítulo 5 117
necesario precisar que al calcular la Fa-pred del marcador de permeabilidad empleado,
metoprolol, se obtuvo una fracción absorbida del 95%, igual a la Fa reportada para éste en
humanos (≥95%) (211,212).
Como se mencionó anteriormente, el sistema de clasificación biofarmacéutica permite analizar
el impacto de dos propiedades fundamentales en la absorción intestinal de una sustancia
activa; la solubilidad y la permeabilidad. Provee la información básica para tomar decisiones
en torno a la manipulación de las características estructurales y fisicoquímicas de un candidato
a fármaco, para mejorar sus condiciones de absorción (217).
Para el caso de los compuestos de la clase II, la solubilidad es el parámetro limitante de la
absorción, y como se mencionó previamente, es uno de los mayores retos biofarmacéuticos a
modificar efectivamente. Esto en parte porque, aunque se logre aumentar la solubilidad
aparente del fármaco mediante diferentes tipos de formulaciones, esto no necesariamente se
refleja en un aumento de la biodisponibilidad oral. Lo anterior se ha relacionado con que las
aproximaciones que se suelen llevar a cabo para aumentar la solubilidad, tienen un efecto
concomitante sobre la permeabilidad del fármaco, de hecho, ésta puede aumentar, no cambiar,
o incluso disminuir (230).
Respecto a los compuestos de la clase III, se sabe que la permeabilidad intestinal es lo que
limita la velocidad de absorción de los compuestos en esta categoría (15); como consecuencia,
la tasa de disolución suele ser menos importante que la velocidad o tiempo del tránsito
gastrointestinal, y éste suele ser sensible a los efectos de los excipientes en la formulación
(231), un aspecto importante a tener en cuenta para poder mejorar la permeabilidad. También
se sabe que las bombas de eflujo pueden jugar un papel importante sobre la absorción de este
tipo de compuestos. Sin embargo, el efecto dependerá de 3 aspectos principales, (1) la afinidad
de los compuestos por la proteína, que como se mencionó anteriormente, los flavonoides, en
caso de tener afinidad por los transportadores pueden actuar como sustratos o
moduladores/inhibidores (especialmente en el caso de matrices vegetales que son una mezcla
de diferentes estructuras químicas); (2) el nivel de expresión de los transportadores a lo largo
del intestino, de modo que la interacción con los transportadores puede ser más significativa
en unos segmentos que en otros; o incluso (3), podría no verse afectada significativamente la
absorción debido a la baja permeabilidad, ya que la baja cantidad de los metabolitos al interior
118 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
de los enterocitos podría conllevar a transportadores sub-saturados (229). Estudios más
especializados se requieren para elucidar el efecto de los transportadores en la absorción del
extracto de P. ligularis.
Dentro de las aproximaciones de tecnología farmacéutica principalmente estudiadas para el
mejoramiento de la permeabilidad de fármacos se encuentran (232):
- La formación de profármacos, que busca aumentar la lipofilicidad de los compuestos para
promover el transporte pasivo. Sin embargo, su aplicación a matrices vegetales sería compleja
debido a que implica la formación de una nueva entidad química, una aproximación cuya
especificidad sería difícil de controlar en una mezcla variada de estructuras químicas.
- Los potenciadores de la permeabilidad (permeation enhancers, PEs) pueden modificar las
propiedades reológicas del mucus, alterar la fluidez de la membrana gástrica, inhibir enzimas
como las proteasas o las bombas de eflujo, pero se debe evaluar su uso con precaución debido
a potenciales efectos adversos en humanos.
- La técnica de contraiones o ion-pairing, la cual consiste en acomplejar las moléculas de
interés con especies iónicas de carga opuesta, de manera que se neutraliza la carga del fármaco
y favorece la difusión pasiva a través de la membrana, sin embargo, presenta la limitante de
que la interacción iónica formada no sea lo suficientemente fuerte y el complejo se disocie
durante la etapa de permeación.
- Y finalmente, las aproximaciones basadas en micro y nanotecnología, son de las más
investigadas actualmente para mejorar la entrega de fármacos pues se presume que debido al
pequeño tamaño de partícula en las formulaciones, se pueden favorecer diferentes
propiedades (entre ellas la permeabilidad) y proporcionar mejoras significativas en la
biodisponibilidad (232). Técnicas como nanoemulsiones, microemulsiones, o formulaciones
basadas en lípidos (como los sistemas de entrega de fármacos autoemulsificables), han sido
aplicadas con éxito para fitoconstituyentes y extractos vegetales (233–235).
Finalmente se puede decir que, aunque la absorción es un proceso complejo de las
interacciones entre factores fisicoquímicos/biofarmacéuticos de los ingredientes activos y los
procesos biológicos dados al interior del organismo, los resultados presentados anteriormente
aportan información valiosa para comprender cómo se lleva a cabo esta etapa en los
flavonoides encontrados en el extracto optimizado de hojas de Passiflora ligularis. Se deben
Capítulo 5 119
tener en cuenta las características mencionadas para los compuestos de la clase III del SCB,
para el desarrollo de una formulación que potencialmente mejore la permeabilidad de los
flavonoides del extracto, y consecuentemente su biodisponibilidad oral.
5.3 Conclusiones
Se estableció que la matriz del extracto modifica favorablemente la solubilidad acuosa de la
isoquercetina (y probablemente la de los demás flavonoides, considerando que son todos
estructuralmente similares) desde poco a altamente soluble, pero, además, mantiene la
característica de alta solubilidad a diferentes valores de pH, lo que permite sugerir, que sea
altamente soluble a lo largo de todo el tracto gastrointestinal.
Al relacionar los resultados obtenidos en el ensayo de permeabilidad in situ SPIP, con lo
reportado en la literatura para flavonoides O-glucosilados, se logró sugerir que los flavonoides
del extracto, tras ser hidrolizados en el lumen intestinal, permean la membrana intestinal
mediante mecanismos de transporte pasivo; y que debido a la competencia de los flavonoides
por la enzima hidrolasa LPH, éstos no puedan atravesar tan rápida/fácilmente el epitelio, a
diferencia del estándar de isoquercetina.
Finalmente, la caracterización de la solubilidad (alta) y permeabilidad (baja) de los flavonoides
en el extracto, permitió catalogarlos dentro de la clase III del sistema de clasificación
biofarmacéutico, y, al estándar de isoquercetina en la clase II; de modo que es evidente el efecto
de la matriz vegetal sobre la absorción de los flavonoides. Gracias al modelo de permeabilidad
empleado, fue posible proponer valores de permeabilidad efectiva y fracción absorbida en
humanos, que permitieron identificar a los flavonoides presentes en el extracto, de absorción
intermedia, y al estándar de isoquercetina, de absorción completa.
6. Conclusiones y recomendaciones
6.1 Conclusiones
Se desarrolló y validó una metodología analítica por UHPLC-DAD para la cuantificación de los
metabolitos/marcadores establecidos como activos, los flavonoides. Gracias a la mayor
resolución obtenida para el perfil cromatográfico de extractos de las hojas de P. ligularis, se
decidió contribuir a la identificación de los flavonoides presentes en el extracto hidro-
alcohólico, mediante el análisis por UHPLC-MS/MS y la dereplicación con la literatura o
librerías disponibles en línea. De este modo, además de confirmar los flavonoides previamente
identificados para extractos polares de esta especie, se propuso la presencia de dos flavonoles
acetil-glucosilados y una flavona malonil-glucosilada.
Las condiciones de extracción asistida por ultrasonido, para la obtención de un extracto de
hojas de P. ligularis optimizado en el contenido de flavonoides, fueron, etanol al 63%, 70ºC y
33 minutos. Dicho extracto mostró mayor actividad antiglicante in vitro y efecto anti-
hiperglicemiante in vivo, que el extracto obtenido por infusión de las hojas.
Se determinó la estabilidad del extracto optimizado, en función de la degradación de los
flavonoides totales bajo diferentes condiciones de estrés. Éste se clasificó como lábil ante
hidrólisis neutra, muy lábil, en hidrólisis ácida/básica; prácticamente estable a la
peroxidación, y fotoestable.
Se describió la alta solubilidad y baja permeabilidad de los marcadores activos. De acuerdo con
esta caracterización, se catalogaron los flavonoides del extracto optimizado de P. ligularis,
dentro de la clase III del Sistema de Clasificación Biofarmacéutico.
122 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas de
Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
6.2 Recomendaciones
Complementar los estudios de estabilidad realizando pruebas de estabilidad acelerada e
intermedia que permitan proponer la vida útil aparente del extracto optimizado.
Realizar ensayos de incubación del contenido intestinal con el extracto optimizado y con el
estándar de isoquercetina, con el fin de evaluar posibles degradaciones por bacterias en el
lumen intestinal.
Se recomienda realizar ensayos de permeabilidad que involucren la co-perfusión del extracto
con inhibidores de transportadores de eflujo, para poder tener mayor claridad en el efecto que
dichas proteínas pueden tener en el proceso de absorción de los flavonoides; o evaluar
posibles interacciones de los metabolitos del extracto como inhibidores de los mismos.
Desarrollar prototipos de formulación que mejoren las características biofarmacéuticas del
extracto, puntalmente la permeabilidad, con el fin de posiblemente aumentar la
biodisponibilidad del mismo.
Adelantar ensayos de biodisponibilidad en modelos animales que permitan obtener mayor
información respecto a las etapas de distribución, metabolismo y eliminación de los
flavonoides presentes en el extracto, junto con estudios de toxicidad aguda, subcrónica y/o
crónica del extracto optimizado de P. ligularis.
A. Anexo: Información suplementaria Capítulo 2 y 3
Figura S3- 1: Certificado de identificación taxonómica.
124 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas
de Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
lo g [ In h ib id o r]
Inh
ibic
ión
de
la
fo
rm
ac
ión
de
AG
Es
(%
)
1 .5 2 .0 2 .5 3 .0 3 .5
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
In fu s ió n O p tim iza d o
Figura S3- 2: Actividad antiglicante de extractos de hojas de Passiflora ligularis. Resultados expresados
como promedio ± LC 95%.
lo g [ Is o q u e rc e t in a ]
Inh
ibic
ión
de
la
fo
rm
ac
ión
de
AG
Es
(%
)
0 1 2 3
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
Figura S3- 3: Actividad antiglicante de isoquercetina. Resultados expresados como promedio ± LC 95%.
Anexo A. Información suplementaria capítulo 3 125
lo g [A s tra g a lin a ]
Inh
ibic
ión
de
la
fo
rm
ac
ión
de
AG
Es
(%
)
0 .8 1 .0 1 .2 1 .4 1 .6
0
2 0
4 0
6 0
8 0
Figura S3- 4: Actividad antiglicante de astragalina. Resultados expresados como promedio ± LC 95%.
lo g [Q u e rc e t in a ]
Inh
ibic
ión
de
la
fo
rm
ac
ión
de
AG
Es
(%
)
0 .8 1 .0 1 .2 1 .4 1 .6
0
2 0
4 0
6 0
8 0
Figura S3- 5: Actividad antiglicante de astragalina. Resultados expresados como promedio ± LC 95%.
B. Anexo: Información suplementaria capítulo 5
a) Estabilidad de las soluciones perfundidas
A
B
Anexo B. Información suplementaria capítulo 5 127
Figura S5- 1: En negro soluciones preparadas en buffer al iniciar ensayo y en rosa, perfil de la
misma solución al finalizar tiempo del ensayo. A. Perfiles del metoprolol, λ: 222 ηm. B. Perfiles
del extracto preparado a la dosis media, λ: 350 ηm. C. Perfiles de ISQ-EST, λ: 260 ηm.
b) Selectividad y especificidad de los métodos analíticos
Con el fin de evaluar la capacidad de los métodos analíticos para analizar el analito de interés
en presencia de otros componentes que pudiesen estar presentes en la matriz biológica, se
muestra la comparación de un cromatograma típico del blanco de perfusión intestinal
obtenido tras la etapa de lavado del intestino, las soluciones preparadas en buffer y el
perfundido intestinal obtenido para cada tratamiento evaluado. Se observa que no se
presentaron picos de compuestos endógenos del contenido intestinal que interfirieran con los
picos de los analitos.
C
128 Contribución a la caracterización biofarmacéutica de un extracto de hojas
de Passiflora ligularis (granadilla) optimizado en flavonoides
Figura S5- 2: En negro, blanco de perfusión; en azul solución preparada en buffer; y rosa, la
misma solución pero colectada del intestino. A. Perfiles del metoprolol, λ: 222 ηm. B. Perfiles
del extracto preparado a la dosis media, λ: 350 ηm. C. Perfiles de ISQ-EST, λ: 260 ηm.
C
B
A
Anexo B. Información suplementaria capítulo 5 129
c) Validación método analítico para la cuantificación de metoprolol.
Tabla S5- 1: Datos de linealidad y sensibilidad de la curva de calibración de metoprolol.
Analito
Rango de
linealidad
(µg/mL)
Ecuación de
calibración (r2)a
F calculado
b
LDDc
(µg/mL)
LDCd
(µg/mL)
Metoprolol
(222 ηm) 10.00-200.0 y = 0.1297x – 0.0714 0.9993
24153.55 0.100 0.250
a Coeficiente de correlación. b Valor tabulado: F1,16 = 4.494; a un nivel de confianza del 95%. c
LDD: límite de detección. d LDC: límite de cuantificación.
Tabla S5- 2: Precisión y exactitud de curva de calibración del metoprolol.
Analito (µg/mL) Precisión Exactitud
Repetibilidad (1 día)
X ± %CV (n=3)
Precisión intermedia
(3 días) X ± %CV
(n=3)
%Recuperación X ± %CV (n=3)
Metoprolol (222 ηm)
10.00 1.264 ± 1.957 1.277 ± 0.905 103.1 ± 1.038
100.0 12.82 ± 2.480 12.97 ± 1.104 102.6 ± 0.928
200.0 25.79 ± 1.232 29.96 ± 1.404 101.1 ± 1.141
A
B
Figura S5- 3: A. Ejemplo de la matriz de cálculo para la Peff de FT-250 mg/kg en el íleo. B. Aproximación del estado estacionario CFT-250
mg/kg en el íleo.
0,00,E+00
1,00,E-01
2,00,E-01
3,00,E-01
4,00,E-01
5,00,E-01
6,00,E-01
7,00,E-01
8,00,E-01
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180
Co
ut-
cor/
Cin
min
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