Bioq. María de los Angeles SosaCatedra de Microbiología GeneralFACENA-UNNE
Metodologías moleculares para el diagnóstico en Microbiología
ADN de doble hebra
constituído por dos cadenas de nucleótidos unidos por un esqueleto de azúcar y fosfato, las cuales están- orientadas en sentido opuesto y son complementarias (A=T, G=C). La estructura de doble cadena del ADN es esencial para el proceso de replicación y garantiza que cada célula que se
divide recibe copia idéntica del ADN.
Comencemos analizando la Estructura del ADN
Dogma de la Biología Molecular
Estrategias
¿En que circunstancias se recurre a métodos de biología molecular en microbiología?
•Patógenos intracelulares ( Virus, M.genitalium)•Agentes no cultivables en condiciones de laboratorio (Pneumocystis carinii)•Escasa sensibilidad diagnóstica (Aspergilosis invasora, Candidiasis diseminada)•Proliferación lenta (H. capsulatum, M. tuberculosis )•Cuando se requiere de genotipificación para definir estrategias de acción terapéutica (Ej: HPV, HCV)•Cuando se desea detectar genes de resistencia antimicrobiana.•Poca cantidad de material. (LCR pediátricos)•Alto factor de dilución (análisis de agua)
MICROORGANISMOS METODOLOGÍA
VIRUS
Citomegalovirus PCR / bDNA / CH/secuenciación
HBV PCR / TMA / branched DNA
HCV RT-PCR / RT-PCR RFLP / TMA / branched DNA
HSV 1 y 2 PCR
HIV RT-PCR / bDNA / NASBA / TMA /secuenciación
Virus papiloma humano PCR-RFLP / CH
BACTERIAS
Neiseria gonorrehae PCR / TMA / LCR / CH
Bordetella pertussis PCR
Chlamydia pneumoniae PCR
Chlamydia trachomatis PCR / TMA / LCR/ CH
Legionella pneumophila PCR
Mycoplasma pneumoniae PCR
Mycoplasma hominis PCR
Ureaplasma urealyticum PCR
Mycobacterium tuberculosis PCR / TMA/ LCR
Staphilococcus aureus PCR
HONGOS
Aspergillus spp/Candida spp PCR
Pneumocystis carinii PCR
Estas estrategias diagnósticas pueden ser resumidas en:
A) Hibridación ( Southern blots, sondas moleculares, hibridación “in situ”,etc.).
B) Amplificación de material genético del organismo patógeno (PCR, LCR, etc.)
Ahora....como separo el DNA?
(Sangre, aspirados nasofaringeos, hisopados nasales, exudados, etc)
Obtención de la muestra
PRECIPITACION - Sales (apantallan cargas)
- Alcohol (dism. Cte dielectrica)
RESUSPENDER ADN
Separar las células de interés
Disgregar y homogeneizar (sin romper las células!!!)
ROMPER LAS CELULAS!!!- Medios hipotónicos- Sonicado- detergentes (FL)- Enzimas (Proteínas)
Fase acuosa enriquecida en ADN
EXTRACCION - Sv. Orgánicos
(Fenol, cloroformo, eter)
Extraccion y purificación de ADN
Ensayos de Hibridación
de
Ácidos Nucleicos.
•Southern blot.•Northern blot.•Western blot.•Hibridación in situ (FISH)•Microarray
Hibridación de ácidos nucleicos
Hibridación molecular: Desnaturalización y Renaturalización.
Desnaturalización: la doble hélice de ADN se disocia en dos hebras separadas (por calor o pH ≥ 13)
Renaturalización o hibridación molecular: reconstitución de la doble cadena de acuerdo al principio de complementariedad de bases nitrogenadas. Las cadenas complementarias se mantienen unidas por puentes de hidrógeno → interacciones débiles: las afecta el pH, Tº, concentración salina.
Tº: al ↑ T, ↓ estabilidad del duplex (por ↑ E cinética).Tmelting: -es la T a la cual se separan el 50% de los nt.
- ↑ con el % GC.
1- Sondas de Ácidos Nucleicos.
Sondas de AN: son fragmentos de ADNsc o de ARN puros y homogéneos que permiten detectar una determinada secuencia blanco en una muestra, mediante su complementariedad de bases.
Marcadas radioctivamenteMarcadas no radioctivamente ( Digoxigenina, avidina)
Principios Generales de los Ensayos de Hibridación.
Enzimas de Restricción
Enzimas que afectan AN
1. Modifican AN: fosfatasas, Kinasas, metilasas, etc.
2. Cortan AN: ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ER)
son endonucleasas que reconocen secuencias de ADN bicatenario y la cortan
TIPOS I II III
CORTE at random
fuera de sec de reconocimiento
específico
en sec de reconocimiento
específico
fuera de sec de reconocimiento
Productos heterogéneos homogéneos homogéneos
Enzimas de Restricción
1-Southern Blot
2-Northern Blot.
• Dos características importantes de esta técnica :– Especificidad de la reacción dada por la
complementariedad de la sonda.– La sonda puede encontrar la secuencia
complementaria en una mezcla de millones de moléculas relacionadas pero no complementarias
Hibridación de captura
HPV – Chlamydia trachomatis – Neisseria
Release and Release and denature denature nucleic acidsnucleic acids
Release and Release and denature denature nucleic acidsnucleic acids
Hibridación de captura CH (Digene)
Hybridize RNA Hybridize RNA probe with probe with target DNAtarget DNA
Capture Capture RNA:DNA RNA:DNA hybrids onto a hybrids onto a solid phase solid phase (in tube or microplate format)
React captured React captured hybrids with hybrids with multiple antibody multiple antibody conjugatesconjugates
Detect amplified Detect amplified chemiluminescent chemiluminescent signalsignal
Detect amplified Detect amplified chemiluminescent chemiluminescent signalsignal
Métodos de Amplificación
1. Amplificación de la secuencia diana: PCR (reacción en Cadena de la Polimerasa).
2. Amplificación basada en la transcripción (NASBA o TMA)
3. Amplificación dependiente de la DNA ligasa (LCR)4. Amplificación de la señal (bPCR)
PCR • Amplificar una secuencia en forma exponencial.
• Luego de 35 ciclos, a partir de una copia se puede obtener 236 copias de un fragmento de DNA —68 mil millones de copias.
• Comenzando con 100 copias se puede obtener 3.73 ug de DNA, a partir del cual se puede visualizar en geles, clonar en vectores particulares, secuenciar, etc.
ADN Polimerasatermoestable
Par de“primers”específicos
dH2O estéril
MgCl2
dTTP
dGTP
dCTP
dATP Desoxinucleótidos
Buffer p/ ADN Pol.
PCRPCRMezcla de Mezcla de ReacciónReacción
ADN templado
PCR: Ciclador térmico
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
PCR: pasos de la reacción
– desnaturalización• Separar las hebras
molde para la síntesis de nuevas hebras
PCR
– annealing• “aparear” primers a la
hebra molde para dirigir la síntesis de DNA
• La síntesis de DNA requiere de primers para comenzar
PCR
– Extensión
• Adición de nucleótidos, uno a la vez, para extender la hebra de DNA (extremo 3’) utilizando a la hebra madre como molde
PCR animation
PCR
• Agarosa• Buffer de corrida (ej:TBE)
• Muestra• Buffer de siembra (ej: ABF) densidad marca frente de corrida
PREPARADO DEL GEL SIEMBRA DE LA MUESTRA CORRIDA ELECTROFORETICA
PCRCorridas en gel de Agarosa
Variantes de PCRa) Simplex
b) Nested PCR.
c) Multiplex.
d) PCR real time
PCR Simplede Chlamydia tracomatis
1. Amplificación de una secuencia del gen que codifica para el ARNr 16S
2. Amplificación de una secuencia del plásmido críptico de C. trachomatis.
10 a 100 veces mas sensibles que la primera.
a. PCR - Ct• Muestra: endocervical o uretral / PBS. Neonatos: Secreción conjuntival o aspirados
nasofaríngeos.• Extracción y purificación de ADN: Proteinasa K /
Fenol-cloroformo.• PCR : Primers plásmido Ct específicos : KL1,
KL2
C. trachomatis: 241 pb
Métodos molecularesVentajas • Método “Gold standart” para C. trachomatis• Se independizan del transporte.• Alta sensibilidad y especificidad• Se pueden utilizar sondas simultáneas para
N.gonorrheae y C. trachomatis.• Se puede utilizar en muestras no invasivas
( orina)
b. PCR anidada (nested PCR)
1º Ronda de PCR
2º Ronda de PCR(primers internos al producto de la primer PCR)
-Ventajas:Aumento de la sensibilidad: Se detectan cantidades de ADN muy inferiores a las que se detectan con una PCR normal.Aumento de la especificidad: Al utilizar otros 2 cebadores internos se aumenta la posibilidad de amplificar sólo un tipo de molécula. -Desventaja:Muy sensible a las contaminaciones.
DR--------
Diagnóstico de laboratorio de las infecciones por Mycobacterium tuberculosis
- Microscopía Baciloscopía directa - ZN Búsqueda de BAAR
- Cultivo Medios sólidos: Loewenstein - Jensen Medios líquidos: Bactec - MB Check
- Diagnóstico genético-molecular DNA probes (Identificación en combinación con Bactec) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Importancia del diagnóstico por PCR del Mycobacterium tuberculosis
- Rapidez (vs. cultivo)
- Sensibilidad (vs. microscopía directa)
- Especificidad (vs. microscopís directa)
- Diagnóstico sobre tejidos incluidos en parafina
(de mayor importancia en aquellos casos en los que no seobservan bacilos en el estudio histopatológico, y en estudiosretrospectivos)
c. PCR Multiplex
Se realiza cuando en el análisis es util amplificar varias regiones de un mismo gen o de distintos genes a la vez. En lugar de utilizar una única pareja de cebadores, se utilizan varias parejas, cada una de las cuales amplifica una región diferente. (Ej: E. coli O:157 H: 7)
Leotta y col. Rev. Arg. Microbiol. 37:1-10, 2005
PRIMER SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5’-3’)
UBICACION DENTRO DEL GEN
TAMAÑO
stx1a GAAGAGTCCGTGGGATTACG 1191-1210 130
stx1b AGCGATGCAGCTATTAATAA 1301-1320
stx2a TTAACCACACCCCACCGGGCAGT 426-445 346
stx2b GCTCTGGATGCATCTCTGGT 752-771
PCR Múltiple PCR Múltiple stxstx1 / 1 / stxstx2 / 2 / rfbrfbO157O157
346 bp259 bp
130 bp
O157F CGGACATCCATGTGATATGG 393-413 259
O157R TTGCCTATGTACAGCTAATCC 632-652
PCR Factor eaePRIMER SECUENCIA DEL OLIGONUCLEOTIDO (5’-3’) TAMAÑO
FRAGMENTOpb
SK1 CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC 864
SK2 CCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG
ReferenciaKarch H., Bohm H., Schmidt H, Gunzer F., Aleksic S., Heesemann J. Clonal structure and pathogenicity of Shiga-like toxin-producing, sorbitol-fermenting Escherichia coli O157:H-. J. Clin. Microbiol. 1993; 31: 1200-5.
HIV
Beta actina
gagenv
PCR Múltiple HIV- diagnóstico
HIV- CARGA VIRAL
B- DNA : CHIRON
RT- PCR : AMPLICOR MONITOR ROCHE
NUCLISENS-NASBA : ORGANON-BIO MERIEUX
COBAS TAQMAN HIV 1 : REAL TIME PCR
EASY Q HIV 1 : REAL TIME NASBA
5-PCR en tiempo real
Permite cuantificar, aumento de especificidad y de sensibilidad
•Basado en la detección y cuantificación de un reporter fluorescente.•Se mide emisión de fluorescencia en cada ciclo de la PCR.
Sistemas de reporteros fluorescentes:
Syber Green Se intercala en el DNA doble cadena.
No emite fluorescencia cuando se encuentra en solución, pero sí cuando se encuentra unido al DNA.
Se mido la fluorescencia al final de cada ciclo (luego de la extensión)
VENTAJA:
- Es el más barato.
DESVENTAJA:
- No es específico, si hay amplificación de bandas inespecíficas también va a dar señal.
- No sirve para PCR multiplex
Molecular beacons Sonda que hibrida
específicamente entre los dos primers.5’ Fluorescencia3’ Quencher (apagador)
FRET: (Fluorescent Resonance Energy Transfer) el fluoróforo cuando se encuentra cercano al quencher no fluoresce ya que le transfiere su energía.
La sonda libre en solución toma una estructura de orquilla y no produce fluorescencia Cuando hibridiza con el DNA molde se separa el Fluoróforo y el quencher permitiendo la Fluorescencia.
Sondas Taqman La sonda intacta presenta un efecto FRET.
La actividad 5’ exonucleasa de la polimerasa degrada la sonda Taqman en la extención.
Se separa el fluoróforo del quencher emitiendo Fluorescencia que se incrementa en cada ciclo proporcionalmente a la sonda degradada.
Epidemiología microbiana
• RFLP Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción.(Candida)
• AFLP Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción.(HPV)
• Microarrays o chips de DNA
• Secuenciación
Polimorfismo de Largo de Fragmentos de
Restricción: RFLP Polimorfismo de Largo de Fragmentos de
Restricción: RFLP
Extraccion de ADN genómico.
Corte con enzimas de restricción.
Electroforesis en gel de agarosa.
Aislamientos de C. albicans, restricción con Eco R1, hibridización con sonda 27A
Amplificación por PCR y análisis de longitud de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP o AFLP)
Restricción enzimática
Muestra HPVExtracción de DNA
DNA
Fragmentos de restricción
GENOTIPIF.
PCR
Producto de amplificación
PCR Enzimas de restricción
CLASIFICACION DE LOS HPV CLASIFICACION DE LOS HPV
EN BASE A SU POTENCIAL EN BASE A SU POTENCIAL ONCOGÉNICO ONCOGÉNICO
Tipos virales mucosotropos:Tipos virales mucosotropos:
HPVs de bajo riesgo: 6,11,40,42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81
HPVs de alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82
(Muñoz et al, N Engl J Med 2003)
Genotipificación HPV
RAPD: Random Amplification of Polymorphic DNA
- Amplificación por PCR utilizando un solo primer de secuencia arbitraria.
- Un primer adecuado genera un patrón de bandas distintivo para una determinada especie o una determinada cepa.
Análisis de Aislamientos de C. neoformans Provenientes de Distintas Regiones Geográficas de
Sud AméricaPCR con el primer (GACA)4 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
CH8
CH10
B5
B8
B7
B6
B3
B2
B4
B1
PA10
CH9
PA5
CH11
PA8
PA7
PA3
PA2
PA1
CH6
B10
B9
C30
C28
C24
C29
C27
C25
C6
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
Distancia de Ligamiento
Argentina
Paraguay
Brasil
Esta Técnica permitió identificar genotipos asociados a regiones específicas
Secuenciación de ADN
Ej. aplicaciones en infectología:Ej. aplicaciones en infectología: Determinación de Determinación de resistencia de la transcriptasa reversa y proteasa a resistencia de la transcriptasa reversa y proteasa a antivirales en pacientes HIV+; resistencia a antivirales en pacientes HIV+; resistencia a ganciclovir en CMV y resistencia a rifampicina en ganciclovir en CMV y resistencia a rifampicina en Mycobacterium tuberculosis.Mycobacterium tuberculosis.
DNA CHIPDNA CHIPMICROARREGLOS DE MICROARREGLOS DE
DNADNA
MICROARREGLOS
Diamètre 100µM
Conclusiones
PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa.
• Ventajas:-Es rápida (3-5 minutos por ciclo) y fácil de implementar en manos capacitadas.-Sensible.-Es robusta.-Permite numerosas aplicaciones.
• Desventajas:-Se necesita cierta información de la secuencia en estudio para poder diseñar los
primers.-Limitaciones del tamaño del fragmento a amplificar-Errores de la replicación.-Contaminación (se reduce considerablemente tomando las precauciones
necesarias y en manos experimentadas).
• Errores en la PCR
– Amplicón del tamaño incorrecto - problemas en el diseño del primer
- Problemas en el apareamiento del primer/Baja temperatura de annealing
- Secuencias redundantes
– Ausencia de producto de amplificación – no se produce apareamiento con los primers
– Muy alta temperatura de annealing temperature
- primer dimeros
• Mucha cantidad de molde • No inclusión de la enzyme en la mix• de dNTPs• mucho/poco MgCl2
Productos PCR con errores
mucho/poco MgCl afecta correcciones de la polymerase Baja fidelidad de la enzyme
Taq polymerase vs Pfu
Con esta técnica, prácticamente cualquier segmento de ADN de una determinada bacteria, hongo o virus puede ser amplificado y detectado. Sin embargo, los laboratorios deben analizar varios factores, entre los cuales destaca la aplicación clínica que podría tener la detección de un determinado organismo, así como los costos, sensibilidad y especificidad del examen en comparación con las técnicas tradicionales.
En general, las técnicas de diagnóstico molecular están indicadas cuando un organismo no puede ser cultivado in vitro, o cuando requiere de un medio complejo y largos períodos de incubación.
Interpretación
Debido a la alta sensibilidad de estos exámenes, la interpretación es en algunos casos díficil, ya que el organismo puede no estar viable pero su ADN puede todavía ser amplificado. Además, la presencia de un organismo en una determinada muestra no siempre significa infección. Es por ello que para el caso de infecciones virales (VIH y CMV) se recomienda realizar la determinación de la carga viral, la cual determina la cantidad de secuencias blanco presentes en el plasma de un individuo.
Falsos positivos debido a contaminación.
Falsa positividad debido a la contaminación con ácidos nucleicos, que puede provenir de tres frecuentes: - de contaminación entre muestras -otras muestras clínicas que contienen un número elevado se secuencias blanco- - de la contaminación de reactivos, por amplificaciones anteriores- de la acumulación de productos de PCR (amplicones) en el laboratorio por amplificaciones sucesivas de la misma frecuencia.
Por estas razones, los laboratorios que usan técnicas de amplificación deben tener normas estrictas de control de calidad. En nuestro país no existen regulaciones formales, pero los laboratorios debieran tratar de cumplir el mínimo de requerimientos, como es tener un espacio separado para el procesamiento de la muestra y otro para la amplificación y tener además el personal adecuado para realizar estas técnicas.
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