8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
1/123
VALIDACI N DE UN M TODOALIMENTOS, POR CR
DETERMINACI N
GUATEMA
L
LICENCIATU
UN
ANAL TICO PARA LA CUANTIFICACIMATOGRAF A L QUIDA DE ALTA RESN GUAYABA FRESA (Psidium cattleia
CAMPUS CENTRAL
A DE LA ASUNCI N, AGOSTO DE 20
ISA MARÍA ARIAS GONZÁLEZ
CARNET 20038-07
TESIS DE GRADO
RA EN INGENIER A QU MICA INDUSTFACULTAD DE INGENIERÍA
IVERSIDAD RAFAEL LAND VAR
N DE VITAMINA A ENLUCI N Y SU
um sabine)
4
IAL
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
2/123
TRABAJO PRES
VALIDACI N DE UN M TODOALIMENTOS, POR CR
DETERMINACI N
EL T TULO DE INGENIERA QU M
GUATEMA
L
UN
LICENCIATU
INGENIERÍA
ENTADO AL CONSEJO DE LA FACUL
ANAL TICO PARA LA CUANTIFICACIMATOGRAF A L QUIDA DE ALTA RES
N GUAYABA FRESA (Psidium cattleia
ICA INDUSTRIAL EN EL GRADO ACAD
PREVIO A CONFERÍRSELE
A DE LA ASUNCI N, AGOSTO DE 20
CAMPUS CENTRAL
ISA MAR A ARIAS GONZ LEZPOR
TESIS DE GRADO
IVERSIDAD RAFAEL LANDÍVAR
FACULTAD DE INGENIERÍA
RA EN INGENIER A QU MICA INDUST
AD DE
N DE VITAMINA A ENLUCI N Y SU
um sabine)
MICO DE LICENCIADA
4
IAL
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
3/123
SECRETARIA GENERAL:
VICERRECTORADMINISTRATIVO:
VICERRECTOR DEINTEGRACIÓN UNIVERSITARIA:
VICERRECTOR DEINVESTIGACIÓN YPROYECCIÓN:
VICERRECTORA ACADÉMICA:
RECTOR:AUTORIDADE
AUTORID
DECANO:
VICEDECANO: I
SECRETARIA:
DIRECTOR DE CARRERA:
TER
NOMBRE DINGRA. ISIS
M
MGT
LIC. RI
DR. CARLOS RAFAEL CABARR S P
DRA. MARTA LUCRECIA M NDEZ G
MGTR. LUIS ESTUARDO QUAN MA
LIC. ARIEL RIVERA IRÍAS
LIC. FABIOLA DE LA LUZ PADILLA BLORENZANA
P. EDUARDO VALDES BARRIA, S. J.DE LA UNIVERSIDAD RAFAEL LAN
ADES DE LA FACULTAD DE INGENIE
GTR. JOSE CARLOS RICARDO VEL
ING. CARLOS ENRIQUE GARCIA BICK
GTR. KAREN GABRIELA MORALES
DR. MARIO RENE SANTIZO CALDERO
A QUE PRACTIC LA EVALUACI N
L ASESOR DE TRABAJO DE GRADU ARACELY LOPEZ CIFUENTES DE GA
TR. MARIA LILIAN PAIZ RAMIREZ
. MIRIAM ESTELA CHAVEZ RAMIREZ
ARDO ANTONIO MONTOYA SEGUR
ELLECER, S. J.
ONZ LEZ DE PENEDO
K
ELTRANENA DE
VAR
ÍA
SCHIPPERS
FORD
ERRERA
N
CIÓN LVEZ
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
4/123
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
5/123
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
6/123
Dedicatoria
A Dios y la Virgen por ser lo que soy, por darme la voluntad para terminar misestudios con éxito, la fuerza para levantarme en cada caída, la paz en los
momentos difíciles, y la sabiduría para tomar las mejores decisiones.
A mi mami, por su amor, paciencia, apoyo incondicional, por creer en mí, sobre
todo por sus oraciones que me dieron paz cuando más lo necesitaba.
A mi papi por darme ánimos y consejos a lo largo de la carrera. Por su amor, porcreer en mí y ser paciente en todo momento.
A mis hermanas y cuñado, Colocha, Canche, Seca, y Joe, por darme su alegría,
motivación y ser un ejemplo para mí de la perseverancia, la lucha constante y que
todo se puede lograr. A mi Fernandita bella, por darme su sonrisa y alegría,
haciendo mis días más bonitos.
A mi Guapito, por ser parte importante de mi vida, estando a mi lado durante toda
la carrera, compartiendo desvelos, madrugadas, largas horas de estudio y
celebrando cada triunfo. Por todo su apoyo, su amor, alegría y paciencia, te amo!
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
7/123
Agradecimientos
A las autoridades y personal del Laboratorio CONCALIDAD, por brindarme suconfianza y apoyo para realizar mi trabajo de graduación.
A la Ing.Isis, por su cariño, confianza y apoyo incondicional durante la carrera y la
realización de la tesis, por sus consejos y conocimientos. Sobre todo por ser un
ejemplo para mí de una persona integral en lo profesional y en el personal.
A mis compañeras de trabajo, Lic.Gaby, por su cariño, motivándome todos losdías para finalizar la carrera y la tesis, gracias por sus risas que me alegraban el
día, y todo el apoyo que me brindó, es un gran ejemplo para mí. La Canchita, por
apoyarme en los momentos de estrés, su compañía en las tardes de arduo
trabajo, por su alegría y positivismo ante las dificultades. A Milvis, por toda la
ayuda en la realización de la tesis.
A todos mis amigos que me acompañaron durante la carrera, en los desvelos,
proyectos y triunfos. En especial a Andrea, Chin, y Jorge, por estar pendiente en
todo momento del proceso de la tesis, por su cariño y apoyo.
A toda mi familia y amigos, que de una u otra forma estuvieron pendientes durante
la carrera, motivándome a seguir adelante, creyendo en mí. En especial a la
familia Keller González, Espinoza González, Arias Chupina y Fajardo Galindo. Mil
gracias.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
8/123
Resumen Ejecutivo
El presente trabajo titulado: Validación de un método analítico para la
cuantificación de vitamina A en alimentos en cromatografía líquida de altaresolución y su determinación en guayaba fresa (Psidium Cattleianum Sabine),
surgió por la necesidad de validar un método nuevo para cuantificar la vitamina A,
y aportarlo al laboratorio CONCALIDAD. Influyó por ser Guatemala un país con
problemas de deficiencia de Vitamina A, siendo necesario tener metodologías
validadas con rapidez de obtención de resultados, para que las industrias
alimenticias puedan evaluar el contenido de vitamina A de sus productos, y
cumplir así con los requerimientos que establece la FDA.
Para validar la metodología se evaluaron 9 parámetros de desempeño regidos por
la Norma ISO 17025, los cuales fueron: selectividad, linealidad, límite de
detección, límite de cuantificación, rango, robustez, exactitud, precisión e
incertidumbre. Se trabajó con dos materiales de referencia, uno certificado,
Acetato de Retinol, y el segundo una fórmula infantil, el cual no se encuentra
certificado bajo ninguna norma, pero es un alimento controlado por empresas
reconocidas. Se concluyó que el método es válido bajo todos los parámetros de
desempeño, determinando que el procedimiento debe ser trabajado por analistas
con destrezas técnicas que les permitan desarrollar correctamente el método.
La guayaba fresa es un fruto con potencial de crecimiento en Guatemala, por
cultivarse en climas de subtropicales a fríos. La guayaba fresa es más conocida e
incluso fruto autóctono de Uruguay y Brasil, teniendo altas posibilidades de su
industrialización en Guatemala. Como parte de la aportación a la industria, sedeterminó que el contenido de vitamina A en guayaba fresa fue de
39.64±2.73µER/100g este contenido provino únicamente del valor detectado como
retinol, no se analizaron otras fuentes de provitamina A. Se concluyó por medio del
estudio estadístico, que la Guayaba Fresa posee un contenido de vitamina A
mayor que el de Guayaba Blanca. Descriptores: validación, parámetros de
desempeño, vitamina A, metodología y guayaba fresa.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
9/123
Índice I. Introducción ..................................................................................... 1
1.1 Lo escrito sobre el tema .................................................................. 2 1.2
Resumen Crítico del marco teórico ................................................. 4
1.2.1
Validación de un método analítico ................................................... 4
1.2.2
Verificación ...................................................................................... 4
1.2.3
Propósito de la validación................................................................ 5
1.2.4
Proceso para validar ....................................................................... 7
1.2.5
Requisitos Analíticos ....................................................................... 8
1.2.6
Revisión de los métodos de ensayo ................................................ 9
1.2.7
Selección de los Métodos de Ensayo ............................................ 10
1.2.8 Métodos Normalizados .................................................................. 11
1.2.9
Métodos No Normalizados ............................................................ 12
1.2.10
Métodos Desarrollados por el Laboratorio .................................... 13
1.2.11
Parámetros de desempeño del método ........................................ 13
1.2.12 Cromatografía Líquida de alta resolución (HPLC) ......................... 25
1.2.13
Vitamina A ..................................................................................... 29
1.2.14
Guayaba ........................................................................................ 32
1.2.15
Guayaba Fresa .............................................................................. 35
II. Planteamiento del problema .......................................................... 37
2.1 Objetivos ....................................................................................... 39
2.1.1
Objetivo General ........................................................................... 39
2.1.2
Objetivos Específicos .................................................................... 39
2.2
Hipótesis........................................................................................ 39
2.2.1 Nula ............................................................................................... 39
2.2.2 Alterna ........................................................................................... 39
2.3
Variables ....................................................................................... 39
2.3.1
Variables Independientes .............................................................. 39
2.3.2
Variables Dependientes ................................................................ 40
2.4 Definición de las variables ............................................................. 40
2.4.1
Definición Conceptual ................................................................... 40
2.4.2
Definición Operacional .................................................................. 42
2.5
Alcances y Límites ........................................................................ 44
2.6
Aporte ............................................................................................ 46
III. Método .......................................................................................... 47
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
10/123
3.1
Sujetos y Unidades de Análisis ..................................................... 47
3.2 Instrumentos.................................................................................. 49
3.3 Procedimiento ............................................................................... 56 3.3.1
Procedimiento para la cuantificación de Vitamina A ...................... 56
3.4
Diseño y Metodología estadística .................................................. 59
3.4.1
Diseño Experimental ..................................................................... 59
3.4.2 Experimentos, tratamientos y repeticiones .................................... 59
3.4.3
Descripción de las unidades experimentales ................................ 61
3.4.4
Variables respuestas ..................................................................... 61
3.4.5
Metodología de análisis ................................................................. 62
IV. Presentación y Análisis de resultados ........................................... 70 4.1 Diagrama del proceso para el método para la cuantificación deVitamina A por HPLC .................................................................................... 70
4.2 Diagrama del proceso de validación ............................................. 73
4.3
Parámetros de Desempeño ........................................................... 75
V.
Discusión ....................................................................................... 80
VI.
Conclusiones ................................................................................. 88
VII. Recomendaciones ......................................................................... 89
VIII.
Referencias bibliográficas ............................................................. 90
IX.
Anexos .......................................................................................... 92
9.1
Muestra de Cálculo ....................................................................... 94
9.2
Glosario ....................................................................................... 103
Índice de Tablas
Tabla No1. Guía de matriz para evaluación de Test de Youden y Steiner ............ 22
Tabla No.2 Matriz para evaluación de Test de Youden y Steiner modificada ....... 23
Tabla No.3 Formas de expresar el contenido de Vitamina A ................................ 32
Tabla No.4 Instrumentos utilizados en la metodología .......................................... 49
Tabla No.5 Materiales utilizados en la metodología .............................................. 51
Tabla No.6 Otros materiales.................................................................................. 55
Tabla No.7 Reactivos ............................................................................................ 55
Tabla No.8 Matriz de evaluación para determinar robustez .................................. 66
Tabla No.9 Selectividad ........................................................................................ 75
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
11/123
Tabla No.10 Linealidad ......................................................................................... 75
Tabla No.11 Límite de detección y cuantificación ................................................. 76
Tabla No.12 Repetibilidad ..................................................................................... 76 Tabla No.13 Reproducibilidad ............................................................................... 77
Tabla No.14 Sesgo con un valor teórico de 450 µER/100g ................................... 77
Tabla No.15 Rango ............................................................................................... 77
Tabla No.16 Datos calculados para la determinación de la robustez .................... 78
Tabla No.17 Conclusión de la robustez del método .............................................. 78
Tabla No.18 Conclusión de la robustez del método por medio de reproducibilidad yrepetibilidad ........................................................................................................... 78
Tabla No.19 Incertidumbre para la determinación de vitamina A en fórmula infantil .............................................................................................................................. 78
Tabla No.20 Incertidumbre para la determinación de vitamina A en Guayaba Fresa .............................................................................................................................. 79
Tabla No.21 Contenido de Vitamina A en Guayaba Fresa .................................... 79
Tabla No.21 Datos originales para la determinación de Selectividad y sesgo. ..... 92
Tabla No.22 Datos originales para la determinación de Linealidad y Repetibilidadpor medio de Acetato de Retinol ........................................................................... 92
Tabla No.23 Datos originales para la determinación de Reproducibilidad ............ 93
Tabla No.24 Datos originales para la determinación de Robustez ........................ 93
Tabla No.25 Datos originales para la determinación del contenido de vitamina A enGuayaba Fresa. ..................................................................................................... 93
Tabla No. 26 Repetibilidad de la ecuación de la recta por medio de la curva decalibración. .......................................................................................................... 100
Índice de Figuras y Gráficas
Figura No.1 Elección, desarrollo y evaluación de métodos ................................... 11
Figura No.2 Esquema tiro al blanco para definir exactitud .................................... 18
Figura No.3 Componentes del cromatógrafo líquido de alta resolución ................ 26
Figura No.4 Sistema de inyección manual de muestras ....................................... 27
Figura No.5 Variedades mejoradas de la guayaba ............................................... 34
Figura No.6 Guayaba Fresa .................................................................................. 35
Figura No.7 Diagrama de posibles transformaciones industriales de la Guayaba yGuayaba Fresa ...................................................................................................... 36
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
12/123
Figura No.7 Diagrama de Ishikawa para evaluar las posibles causas de laincertidumbre del método ...................................................................................... 69
Gráfica No.1 Determinación de la Curva de Calibración, para evaluación de lalinealidad del método ............................................................................................ 76
Figura No.9 Cromatograma de análisis de Guayaba Fresa .................................. 79
Figura No.10 Tabla de datos para la distribución normal t-Student, dos colas ... 106
Figura No.11 Diagrama de Flujo para realizar el procedimiento de validación ... 107
Figura No.12 Cromatograma para la concentración de 10µgER/ml .................... 108
Figura No.13 Cromatograma para la concentración de 7.5µgER/ml ................... 108
Figura No.14 Cromatograma para la concentración de 5µgER/ml ...................... 109
Figura No.15 Cromatograma para la concentración de 2.5µgER/ml ................... 109
Figura No.16 Cromatograma para la concentración de 1µgER/ml ...................... 110
Figura No.17 Cromatograma para la concentración de 0.1µgER/ml ................... 110
Figura No.18 Cromatograma para el blanco ....................................................... 111
Figura No.19 Cromatograma para fórmula infantil .............................................. 111
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
13/123
1
I. Introducción
La validación de un método analítico cuantitativo, se realiza con el propósito degarantizar la veracidad de los resultados que se obtengan de los análisis. Para
garantizarlos se han establecido parámetros que aporten información estadística,
ayudando a concluir si el método analítico es válido o no. En Guatemala el
proceso de normalización comenzó en 1956, con la formación del Instituto
Centroamericano de Investigación (ICAITI), uno de los propósitos era controlar la
calidad de los productos finales por medio de análisis químicos. Luego continuo la
creación de la Comisión Guatemalteca de Normas (COGUANOR) en el año de
1962, con la colaboración del Ministerio de Economía y el Ministerio de Salud En
la actualidad la normalización y el control de calidad de los procesos ha tenido un
auge en todos los sectores empresariales, entes autorizados certifican y avalan
sus procesos aportando a las empresas garantía en sus resultados. En los
laboratorios de ensayo se generó la necesidad de cumplir con los reglamentos
nacionales e implementar sistemas de gestión de calidad como lo dicta la Norma
ISO 17025, la cual solicita dentro de sus requisitos técnicos el uso de métodos
validados.
Para la validación del método cuantitativo de Vitamina A en cromatografía líquida
se analizaron diferentes parámetros, estableciendo los siguientes: linealidad,
selectividad, exactitud, precisión, límite de cuantificación, límite de detección,
rango, robustez e incertidumbre. La Vitamina A se encuentra de forma natural en
diversos alimentos y se adiciona cuando se requiere fortificar. Parte fundamental
de la investigación fue la determinación de la vitamina en un alimento fortificado y
en otro que se encuentre de forma natural. Se analizó una fórmula infantil como
alimento fortificado y material de referencia. Como alimento natural se utilizó la
guayaba fresa (Psidium Cattleianum), fruta de clima subtropical con facilidad de
cultivo en Guatemala, con potencial de ser industrializada por sus características
organolépticas y nutricionales. La validación del método aportó a la industria
alimenticia otra opción garantizada para el análisis de la Vitamina A indicada en
alimentos.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
14/123
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
15/123
3
García (2009) plantea una metodología para la cuantificación de vitaminas en
margarina por no existir; con la metodología planteada logró determinar
únicamente la Vitamina A, debido a que el método no fue apropiado para laVitamina E. Se llevó a cabo por medio de Cromatografía Líquida de Alta
Resolución, y la validación se realizó siguiendo los lineamientos de la FDA
(Federal Drug Asociation). Concluyó que la metodología en estudio es precisa,
reproducible, exacta, lineal, selectiva, robusta bajo los cambios y procesos
realizados, además de determinar el límite de cuantificación de 3.01UI/g de
muestra.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
16/123
4
1.2 Resumen Crítico del marco teórico
1.2.1 Validación de un método analítico
De acuerdo a la Norma ISO 8502:1994, validación es la confirmación mediante
examen y suministro de evidencia objetiva que se cumplen los requisitos
particulares para un uso específico previsto. Guía EURACHEM, (2005).
De acuerdo a la Guía EURACHEM (2005), consiste en definir una necesidad
analítica para confirmar que el método utilizado tiene la capacidad de desempeño
de acuerdo a la aplicación. En el proceso de validación está implícito que el
equipo, reactivos y materiales se encuentran en especificaciones, además de
estar calibrados, en el caso de los equipos. El analista que realice el estudio
deberá ser técnicamente competente y con los conocimientos suficientes para
tomar decisiones apropiadas a partir de las observaciones que realice durante el
estudio. El método en estudio será el limitante para el proceso, el desarrollo de la
validación es dependiente del método a utilizar.
1.2.2 Verificación
De acuerdo a la Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010), en algunos casos se puede
realizar una validación menor o verificación cuando se trate de:
- Métodos normalizados.
- Métodos normalizados usados fuera de su alcance propuesto. Ejemplo:
uso en otra matriz.
- Ampliaciones y modificaciones menores de métodos normalizados.Ejemplo: uso en otros analitos.
Se verifican métodos previamente validados, que hayan sufrido alguna alteración
significativa por lo cual deben volver a evaluarse. Estas variaciones pueden ser:
cambio de equipo; cambio de componentes de equipo como columnas y
detectores; cambio analista, y cambio de la matriz que contiene la muestra, entre
otros. Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010)
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
17/123
5
La verificación comprueba que el laboratorio domina el método de ensayo
normalizado y lo utiliza correctamente, en caso de tratarse de un método
normalizado modificado para la verificación se requiere sólo realizar aquellaspruebas que indiquen que la variación realizada no afecta el ensayo. Guía Técnica
No.1 del ISPCH (2010).
1.2.3 Propósito de la validación
Según la Guía EURACHEM (2005), de forma general hay dos propósitos
principales por los que se debe validar un método: la importancia de las
mediciones analíticas y segundo el deber profesional del químico analítico.
- Importancia de las mediciones analíticas
Alrededor del mundo se realizan millones de mediciones por diversos motivos,
entre ellos se pueden mencionar: evaluación de bienes para propósitos de
comercio; como apoyo a la salud; verificar la calidad del agua o alimentos para el
consumo humano; en análisis forenses de fluidos corporales en investigaciones
criminales, y análisis de minerales en la industria minera, entre otras.
Implícitamente cada aspecto de la sociedad está apoyado de alguna forma por
mediciones analíticas, Guía EURACHEM (2005).
Estas mediciones tienen un costo, además surgen costos de las decisiones
tomadas en base a los resultados de dichas mediciones. Por ejemplo, las pruebas
que muestran que algún alimento no es adecuado para su consumo pueden
resultar en demandas por compensación; pruebas que confirmen la presencia dedrogas prohibidas que podrían ocasionar multas, encarcelamiento o más aún, la
ejecución en algunos países. Claramente es importante determinar el resultado
correcto y ser capaz de demostrar que lo es, Guía EURACHEM (2005).
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
18/123
6
- El deber profesional del químico analítico
De acuerdo a la Guía EURACHEM (2005), si el resultado de una prueba no es
confiable entonces tiene poco valor y la prueba no debió haberse realizado bajo
ese procedimiento.
Si un cliente pide un trabajo analítico a un laboratorio, se presupone que el
laboratorio es técnicamente competente, con la experiencia y conocimientos para
realizar el trabajo. Regularmente el cliente no posee los conocimientos que ellaboratorio posee, él espera confiar en los resultados reportados y por lo general
sólo los cuestiona cuando surge una controversia. Guía EURACHEM (2005).
De este modo, el laboratorio y su personal tienen una clara responsabilidad de
corresponder a la confianza del cliente proporcionando la respuesta correcta a la
parte analítica del problema y proporcionando resultados que han demostrado ser
adecuados a su propósito.
Esto lleva implícito que las pruebas realizadas son apropiadas para la parte
analítica del problema que el cliente desea resolver y que el informe final presenta
los datos analíticos de tal manera que el cliente pueda entenderlos fácilmente y
sacar conclusiones apropiadas. La validación del método permite a los químicos
demostrar que el método es adecuado. Guía EURACHEM (2005).
Para que un resultado analítico concuerde con el propósito requerido, eldesempeño del método debe validarse y debe estimarse la incertidumbre del
resultado a un nivel de confianza dado. La incertidumbre deberá ser evaluada y
establecida de una forma que sea ampliamente reconocida, consistente de forma
interna y fácil de interpretar. La mayor parte de la información requerida para
evaluarla se puede obtener durante la validación del método.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
19/123
7
Parte del conocimiento que debe tener el analista químico y el laboratorio es la
toma adecuada de las muestras, la cual es un trabajo de gran habilidad que
requiere entender el problema con su química asociada. Guía EURACHEM(2005).
Según dicha guía, se debe validar un método cuando sea necesario verificar que
sus parámetros de desempeño son adecuados para el uso en un problema
analítico específico.
Por ejemplo:
- Nuevo método desarrollado para un problema específico.
- Método ya establecido revisado para incorporar mejoras o extenderlo a un
nuevo problema.
- Cuando el control de calidad indica que un método ya establecido está
cambiando con el tiempo.
- Método establecido usado en un laboratorio diferente, diferentes analistas o
con diferente instrumentación.
- Para demostrar la equivalencia entre dos métodos, por ejemplo, entre unmétodo nuevo y uno de referencia.
El alcance de la validación o la revalidación requerida dependerá de la naturaleza
de los cambios hechos al aplicar un método a diferentes laboratorios,
instrumentación, operadores y circunstancias en las cuales el método va a ser
utilizado.
1.2.4 Proceso para validar
El laboratorio que utiliza un método es responsable de asegurar que el método
esté validado adecuadamente y si es necesario llevar a cabo trabajo adicional
para complementar los datos ya existentes, Guía EURACHEM (2005).
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
20/123
8
Cuando un método ha sido validado por una organización de aprobación de
normas, como la AOAC Internacional, por lo general, el usuario necesitará
únicamente establecer los datos de desempeño del método para su propio uso.
La Guía EURACHEM (2005), menciona que el laboratorio tiene que decidir cuáles
de los parámetros de desempeño del método necesitan caracterizarse con el fin
de validar el método. La caracterización del desempeño del método es un proceso
costoso pero puede restringirse por consideraciones de tiempo y costo.
Al empezar con una especificación analítica considerada cuidadosamente, setiene una buena base sobre la cual planear el proceso de validación, pero se sabe
que en la práctica esto no siempre es posible.
El laboratorio deberá aplicarlo bajo sus condiciones con las restricciones
impuestas, tomando en cuenta las necesidades del cliente, la experiencia
existente sobre el método y la necesidad de compatibilidad con otros métodos
similares que ya estén en uso dentro del laboratorio o en otros laboratorios, Guía
EURACHEM (2005).
Una serie específica de experimentos proporcionará información sobre varios
parámetros, por lo tanto con una planeación cuidadosa puede minimizarse el
esfuerzo requerido para obtener la información necesaria. Guía EURACHEM
(2005).
1.2.5 Requisitos Analíticos
Frente a un problema analítico particular, idealmente, el laboratorio debería
acordar con el cliente una necesidad analítica, la cual definirá los requisitos de
desempeño que un método debe tener para ser adecuado para resolver el
problema analítico.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
21/123
9
En respuesta a esta necesidad, el laboratorio puede evaluar si los métodos
existentes son adecuados, si es necesario desarrollar un nuevo método, o
modificar métodos existentes. Guía EURACHEM (2005).
1.2.6 Revisión de los métodos de ensayo
De acuerdo a la OGA-GEC-016, (2007), para cada sector técnico, la alta dirección
debe nombrar a una persona experimentada como responsable de la revisión de
los métodos, con el fin de incluir modificaciones, actualizaciones o desarrollar e
implementar nuevos métodos.
Para confirmar que el método se ajusta al uso previsto en el laboratorio es
necesario determinar su desempeño conforme una combinación de las siguientes
técnicas, según lo establecido en la nota 2 del numeral 5.4.5.2 de la Norma
COGUANOR NTG/ISO/IEC 17025, adoptada por la OGA como un criterio de
acreditación para laboratorios de ensayo y calibración:
- La calibración utilizando patrones de referencia o materiales de referencia.
- La comparación con resultados obtenidos por otros métodos.
- Las comparaciones interlaboratorios.
- La evaluación sistemática de los factores que influyen en el resultado.
- La evaluación de la incertidumbre de los resultados basada en el
conocimiento científico de los principios teóricos del método y en la
experiencia práctica. OGA-GEC-016, (2007).
Aun cuando se haya realizado la validación del método, el laboratorio tendrá que
verificar periódicamente que se cumplen los parámetros de desempeño
documentados por parte de la organización que lo desarrolló, modificó y/o publicó.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
22/123
10
Para esta verificación el laboratorio puede utilizar, por ejemplo, muestras
inoculadas o materiales de referencia incorporados a las matrices más
representativas. También tiene que tomar en cuenta los resultados obtenidos delas auditorías internas y externas de sus sistemas de gestión, dejando registro de
las verificaciones, OGA-GEC-016, (2007).
En el documento de la OGA-GEC-016, (2007), menciona que la documentación
referente a la modificación, actualización, validación y verificación del método
debe incluir registros de la determinación de los parámetros de desempeño,
limitaciones de su aplicabilidad, procedimientos para control de calidad, calibracióny control de documentos. Estos registros deben estar disponibles a solicitud de los
miembros del equipo evaluador durante las visitas en sitio, ya sea de evaluación
para la acreditación, seguimiento o reevaluación.
Los procedimientos y responsabilidades para el desarrollo, validación, verificación
e implementación de los métodos deben ser descritos en detalle dentro de la
documentación del sistema de calidad del laboratorio.
1.2.7 Selección de los Métodos de Ensayo
Es responsabilidad del laboratorio utilizar los métodos apropiados para el
propósito, según el alcance requerido. Estos métodos pueden ser normalizados,
no normalizados o desarrollados por el propio laboratorio.
El laboratorio, de común acuerdo con el cliente, puede seleccionar los métodos
utilizando su propio criterio o utilizar aquellos métodos normalizados vigentes en el
país. Si el método es normalizado debe demostrar que éste corresponde a la
última edición, a menos que sea apropiado o posible el uso de una versión anterior
del método. Guía EURACHEM,(2005).
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
23/123
11
Adicionalmente se debe establecer un sistema para evaluar la factibilidad de
implementar los posibles cambios introducidos en las nuevas versiones del
método, determinando las diferencias en cuanto a equipo, formación del personal,instalaciones, y demás aspectos necesarios para la ejecución del ensayo.
Figura No.1 Elección, desarrollo y evaluación de métodos
Fuente: Guía EURACHEM,(2005)
1.2.8 Métodos Normalizados
Las normas de calidad y regulaciones frecuentemente requieren el uso de
métodos normalizados. A la vez, el uso de métodos normalizados es deseable en
situaciones en las que el método será ampliamente utilizado; sin embargo,
algunas veces el laboratorio puede contar con un método propio más adecuado
para el propósito. Los métodos normalizados deben ser utilizados por el
laboratorio exactamente como están descritos.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
24/123
12
1.2.9 Métodos No Normalizados
Los métodos no normalizados deben estar apropiadamente validados para poderutilizarlos, ya sean éstos desarrollados por un tercero o resultado de la
modificación de un método normalizado. En el caso de modificaciones, es
necesario demostrar que éstas no tienen una repercusión sobre la calidad de los
resultados.
De acuerdo a la guía OGA-GEC-016, (2007), el laboratorio debe desarrollar un
procedimiento de ensayo que incluya al menos la siguiente información, previo a la
utilización de un nuevo método:
- La identificación apropiada.
- El alcance.
- La descripción del tipo de objeto a ensayar o a calibrar.
- Los parámetros o magnitudes a ser determinados y los rangos
correspondientes.
- Los aparatos y equipos, incluyendo los requisitos de desempeño técnico.
- Los patrones de referencia y materiales de referencia requeridos.
- Las condiciones ambientales requeridas y cualquier período deestabilización necesario.
- La descripción del procedimiento, incluyendo: La colocación de marcas de
identificación, manejo, transporte, almacenamiento y preparación de ítems
la verificación a realizar antes de comenzar el trabajo, la verificación que el
equipo está trabajando apropiadamente y, cuando sea necesario, ajustar y
calibrar el equipo antes de cada uso, el método de registro de las
observaciones y los resultados, las medidas de seguridad a observar.- Los criterios o requisitos para la aprobación o el rechazo.
- Los datos a ser registrados y el método de análisis y presentación.
- La incertidumbre o el procedimiento para estimarla.
Además, la documentación del método debe incluir las especificaciones
principales resultantes de la validación. OGA-GEC-016, (2007).
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
25/123
13
1.2.10 Métodos Desarrollados por el Laboratorio
Cuando sea el caso, el laboratorio debe demostrar que tiene un plan en el que seincluye la evaluación de su capacidad en cuanto a personal, equipo y demás
recursos que le permitan desarrollar métodos propios. Los métodos desarrollados
por el laboratorio deben estar adecuadamente validados, documentados y
autorizados antes de su uso. Cuando sea posible, se debe emplear material de
referencia con una matriz equivalente a la de la muestra, o bien debe utilizarse un
método de ensayo normalizado alterno, preferiblemente de diferente principio de
medición, para comparar los resultados. OGA-GEC-016, (2007).
1.2.11 Parámetros de desempeño del método
Son las propiedades, características o capacidades cuantificables del método que
indican su grado de calidad, se pueden incluir: exactitud, exactitud relativa,
desviación, desviación positiva, desviación negativa, efecto matricial, repetibilidad,
precisión intermedia, reproducibilidad, especificidad, límite de detección, límite de
cuantificación, linealidad, rango, sensibilidad, robustez y otras característicasrelacionadas con los resultados obtenibles por el método, OGA-GEC-016, (2007).
- Selectividad o Especificidad
De acuerdo al Instituto Nacional de Chile (2010), “La selectividad es el grado en
que un método puede cuantificar o cualificar al analito en presencia de
interferentes.” Generalmente los interferentes se encuentran en la matriz de
análisis. La prueba de selectividad puede diseñarse de acuerdo al método, en el
caso de cromatografía la resolución entrega información sobre la selectividad del
método, en el caso de espectrofotometría el espectro de absorción o un espectro
de masas entrega información al respecto, en especial cuando es comparado en
presencia de una interferencia.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
26/123
14
Una prueba de Selectividad comúnmente utilizada, consiste en analizar un mínimo
de tres reactivos, tres blancos de matriz y tres muestras o estándares de
concentración conocida del analito de interés. Guía Técnica No.1 del ISPCH(2010).
Se deben comparar las lecturas obtenidas para cada caso, y observar si existen
variaciones entre los testigos reactivos, blancos de matrices y estándares o
muestras con analito. Si se encuentran diferencias significativas deberán ser
identificadas y en lo posible eliminadas. Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).
- Linealidad
De acuerdo en la Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010), “La linealidad es la
capacidad de un método de análisis, dentro de un determinado intervalo, de dar
una respuesta o resultados instrumentales que sean proporcionales a la cantidad
del analito que se habrá de determinar en la muestra de laboratorio.”
Para determinar el rango lineal se puede realizar mediante una gráfica deconcentración versus respuesta, donde la respuesta en el caso de cromatografía
corresponde al área identificada. La función determinada por la regresión de la
gráfica se conoce como Función Respuesta o Recta de calibrado, luego de
establecido el rango, se determina la Curva de calibración, que incluirá los valores
analizados desde el valor cero.
La curva de calibración se debe realizar cada vez que se trabaje el método, con
diferentes puntos, incluyendo blanco y el material de referencia de concentración
conocida. Se recomienda abarcar valores cercanos al cero y valores superiores al
valor de interés. El número de puntos a analizar deberá ser establecido por el
analista de acuerdo a la Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
27/123
15
Generalmente el criterio de aceptación cualitativo que se usa para determinar la
linealidad es el coeficiente de correlación: El coeficiente de correlación indica el
grado de relación entre la variable concentración X y la variable respuesta Y de lacurva de calibración. El valor máximo de 1 indica una correlación positiva perfecta
entre X,Y con una pendiente positiva. Cuando r = 0, no existe correlación alguna,
independencia total de los valores X,Y.
De acuerdo a la Guía Técnica No. 1 del ISPCH (2010), en la práctica si r tiene un
valor cercano a uno 1, esto significa que existe correlación con una probabilidad
elevada. Para una curva de calibración o trabajo, es recomendable que elcoeficiente de correlación obtenido sea mayor o igual a 0.999, aunque para el
caso de trazas se admite un valor igual o mayor que 0.99.
Adicionalmente como un mejor indicador se puede realizar una evaluación de
curva de calibración global, haciendo repeticiones de la curva en las mismas
condiciones, realizando una evaluación estadística de prueba t-Student.
Se calcula un valor de t con n-2 grados de libertad, de t para el nivel de confianza
requerido del 95% (α = 0.05), dos-colas, en este caso para un “n” que depende de
los niveles de calibración.
Se desea probar si existe entonces una correlación significativa: La hipótesis nula
H0 es que no existe correlación entre X,Y . Si el valor observado de tr es mayor que
tcrítica, se rechaza la hipótesis nula H0, siendo la correlación lineal significativa con
la probabilidad calculada. Fuente Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).
H0: r=0, El coeficiente de correlación obtenido procede de una población cuya
correlación es cero.
H1: r≠0, El coeficiente de correlación obtenido procede de una población cuya
correlación es distinto de cero.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
28/123
16
Se rechaza la hipótesis nula, las variables están relacionadas.
Se acepta la hipótesis nula, las variables no están relacionadas.
tcrítica se determina por medio de las tablas para un nivel de confianza del 95%
para grados de libertad n-2, por conocer el valor de la media y de la desviación
estándar.
||√ 2 1
Fuente: Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).
Dónde:
tr = Valor del estimador t Student obtenido para el coeficiente de correlación
| r | = Valor absoluto del coeficiente de correlación
n–2 = Número de grados de libertad
r2 = Valor del coeficiente de determinación
- Límite de detección (LDD)
De acuerdo a la Guía EURACHEM (2005), bajo la AOAC, el límite de detección
es: “El menor contenido que puede medirse con una certeza estadística razonable.
O bien el menor contenido de analito, si está presente, que será detectado y que
puede ser identificado”.
Este parámetro de desempeño ha sido utilizado cuando el método estudiado
abarca concentraciones pequeñas a niveles de trazas, aunque también es un
parámetro necesario para determinar el límite de detección. Dado a su
funcionalidad existen confusiones debido a que no existe actualmente un acuerdo
universal sobre la terminología aplicada.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
29/123
17
El término límite de detección no es aceptado ampliamente aunque se usa en
varios documentos sectoriales. La ISO utiliza como un término general “valor
mínimo detectable de la variable de estado definida”. Fuente: Guía EURACHEM(2005). De acuerdo a la Guía EURACHEM (2005). El límite de detección no existe
criterio de aceptación, ya que depende del propósito de la metodología empleada,
pero se puede determinar con la muestra en concentración cercana al blanco.
El primer paso para determinar el límite de detección es calcular el valor crítico, el
cual se determina con un nivel de confianza del 95%, con grado de libertad infinito,
el cual es de 1.645. ∑ ! " 2 " #$2% "
LC=Valor crítico
LOD=Límite de detección
S=Desviación estándar
&=Media'=Datos obtenidos de cada lectura- Límite de cuantificación
“El “límite de cuantificación“(LDC) estrictamente es la concentración más baja del
analito que puede ser determinada con un nivel aceptable de precisión de
repetibilidad y veracidad. También se define por diversas convenciones como la
concentración del analito correspondiente al valor del blanco de muestra más 5, 6
ó 10 desviaciones estándar de la media del blanco.” Fuente: Guía EUROCHEM
(2005).
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
30/123
18
- Exactitud
De acuerdo a la Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010) (Pág. 39), Bajo el manual
del Codex Alimentarius, define la exactitud como el grado de concordancia entre el
resultado de un ensayo y el valor de referencia. El término “exactitud” está
aplicado a un conjunto de resultados de un ensayo, y supone una combinación de
componentes aleatorios y un componente común de error sistemático o sesgo.”
Al ser aplicado a un método de ensayo, la exactitud se refiere a la combinación de
veracidad y precisión. Se puede ejemplificar de acuerdo a la Fig.No.2, los círculos
equivalen al rango en que se espera el valor de referencia, y los puntos a los
resultados analíticos. Mientras más veraz y preciso sea, el método tendrá una
exactitud alta. EURACHEM (2005).
Figura No.2 Esquema tiro al blanco para definir exactitud
Fuente: Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
31/123
19
Dado que la exactitud depende de dos variables, dentro del plan de validación
debe establecerse la forma de evaluación. Para analizar la veracidad se puede
determinar el sesgo o el porcentaje de recuperación, mientras que la precisión pormedio de repetitibilidad y reproducibilidad.
- Sesgo
De acuerdo a Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010) es la diferencia entre la
expectativa relativa a los resultados de un ensayo o una medición y el valor
verdadero. En la práctica el valor convencional de cantidad puede sustituir el valor
verdadero. El sesgo es el error sistemático total en contraposición al error
aleatorio.
Para determinar el sesgo puede utilizarse material de referencia, material
fortificado o material control. Se debe medir un analito de concentración conocida
y se determina la diferencia en valor absoluto entre el valor conocido y la media
del valor obtenido.
- Recuperación
De acuerdo a la Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010), es la fracción de la
sustancia agregada a la muestra (muestra fortificada) antes del análisis, al ser
analizadas muestras fortificadas y sin fortificar. La recuperación permite ver el
rendimiento de un método analítico en cuanto al proceso de extracción y la
cantidad del analito existente en la muestra original. Por lo cual, la recuperación
esta intrínsecamente relacionada a las características de la matriz de la muestra.
Se recomienda realizar a lo menos 6 mediciones de cada uno en lo posible en tres
niveles. Se debe considerar al elegir estos niveles el rango de la curva de
calibración del método, el LDD y el LMP (Límite máximo permitido) establecido. De
manera que los niveles seleccionados permitan entregar la mejor información
posible respecto a la capacidad de recuperación del método, en cuanto a estos
valores críticos.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
32/123
20
- Precisión
La precisión podrá establecerse en términos de repetibilidad y reproducibilidad. El
grado de precisión se expresa habitualmente en términos de imprecisión y se
calcula como desviación estándar de los resultados (Referencia: Manual Codex
Alimentarius 18º Ed.)
a) Repetibilidad:
Es la precisión bajo las condiciones de repetibilidad, es decir, condiciones donde
los resultados de análisis independientes se obtienen con el mismo método en
ítems de análisis idénticos en el mismo laboratorio por el mismo operador
utilizando el mismo equipamiento dentro de intervalos cortos de tiempo. Se puede
determinar registrando a lo menos 6 mediciones bajo las mismas condiciones
(mismo operador, mismo aparato, mismo laboratorio y en corto intervalo de
tiempo) de un analito en un Material de Referencia. Calcular la desviación
estándar (S) y el porcentaje de coeficiente de variación (CV%). Guía Técnica No.1
del ISPCH (2010).
b) Reproducibilidad:
Es la precisión bajo las condiciones de reproducibilidad, es decir, condiciones
donde los resultados de los análisis se obtienen con el mismo método en ítem
idénticos de análisis en condiciones diferentes ya sea de laboratorio, diferentes
operadores, usando distintos equipos, entre otros. Se puede determinar por medio
del coeficiente de Horwitz, o el valor de HorRat. El valor de HorRat es la razón del
coeficiente de variación de las réplicas dentro del coeficiente de variación de
Horwitz. Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010)
- Rango
De acuerdo a la Guía EURACHEM (2005), es necesario determinar el intervalo de
concentraciones del analito o los valores de la propiedad relacionada, sobre los
cuales el método puede aplicarse. Esto se refiere al intervalo de concentraciones o
a los valores de la propiedad relacionada, de las disoluciones medidas.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
33/123
21
En el extremo inferior del intervalo de concentración, los factores limitantes son los
valores del límite de detección y/o cuantificación, depende del método para que
estos sean el extremo inferior del rango.
Otra forma de establecer el rango es la siguiente: en el extremo superior del
intervalo de concentración, las limitaciones serán impuestas por varios efectos que
dependen del sistema de respuesta del instrumento. El rango se puede determinar
por medio de la curva de calibración, la cual contendrá los puntos necesarios para
evaluar la linealidad del método, además de evaluar la menor concentración a la
que se pueda obtener resultados precisos, y la concentración mayor que se tomecomo valor límite máximo. Guía EURACHEM (2005).
- Robustez
La Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010), menciona que la robustez es una medida
de la capacidad del método analítico de no ser afectado por variaciones pequeñas
pero deliberadas de los factores del método.
Este parámetro de desempeño proporciona una indicación de la fiabilidad del
procedimiento en un uso normal, optimiza el método analítico desarrollado o
implementado por el laboratorio, para describir bajo qué condiciones analíticas se
pueden obtener a través de este método resultados confiables.
Un método de ensayo es más robusto entre menos se vean afectados sus
resultados frente a una modificación de las condiciones analíticas. Entre las
condiciones analíticas que podrían afectar a un método se encuentran: analistas,equipos, reactivos, pH, temperatura, tiempo de reacción, estabilidad de la muestra
y otros, Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).
Para poder determinar qué factores afectan al método se aplica el Test de Youden
y Steiner, el cual permite evaluar el efecto de siete variables con sólo ocho análisis
de una muestra.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
34/123
22
Inicialmente se deben identificar aquellos factores del método que posiblemente
afectarían los resultados finales obtenidos a través de este, Guía Técnica No.1 del
ISPCH (2010).
Ejemplo de factores que pueden afectar: temperatura, composición de fase móvil o
soluciones reactivas, pH de solución, tamaño de celda espectrofotométrica, flujo
gas acarreador, split, y otros. Para estudiar la robustez se procede a exponer a
cada factor a un estudio variable, cada variable se estudia mediante un valor alto
(A, B, C) y otro bajo (a,b,c). Los factores a estudiar no deben ser necesariamente
siete; puede considerarse un número menor de variables.
Tabla No1. Guía de matriz para evaluación de Test de Youden y Steiner
Valor de la
variable1 2 3 4 5 6 7 8
A,a A A A A a a a a
B,b B B B b B b b B
C,c C c C c C c C c
D,d D D D d d d D D
E,e E e E e e E e E
F,f F f F F F f f F
G,g G g G G g G G g
Resultado Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8
Fuente: Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).
Se deben establecer las siete comparaciones posibles, es decir las diferencias
entre la variable de mayor valor versus la de menor valor:
∑ ( ∑ )* + , + , +- , +. +/ , +0 , + , +* Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
35/123
23
De este modo se puede conocer el efecto de cada variable. En este sentido,
cuanto mayor sea la diferencia de los resultados entre el valor mayor y el valormenor, mayor influencia tendrá dicha variable en el método analítico.
Como criterio de aceptación para la robustez del método se considera que la
diferencia entre el valor alto y el valor bajo sea superior a la raíz cuadrada de dos
de la desviación estándar del método (S), es decir:
3∑ ( ∑ )
* 4 √2
Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).
- Test Youden y Steiner modificado para tres variables
Cuando no se puedan evaluar 7 variables se puede realizar con menos variables,
en el caso de esta investigación se realizaron con 3 variables.
Tabla No.2 Matriz para evaluación de Test de Youden y Steiner modificada
ExperimentoFactores
ResultadosA B C
1 + + + Y1
2 - + - Y2
3 + - - Y3
4 - - + Y4
Fuente: Zagal.E, Sadzawka. A. (2009).
Para calcular la diferencia entre cada factor se realiza de la misma manera,
únicamente que con n=2. + , +-2
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
36/123
24
- Incertidumbre
De acuerdo a la Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010), es el parámetro asociado al
resultado que caracteriza la dispersión de los valores que razonablemente pueden
ser atribuidos al mesurando. Es importante para un método validado o verificado
por el laboratorio, se realice la determinación de las diferentes fuentes o
componentes de la incertidumbre de la medición presentes:
- Muestreo
- Efectos de la muestra: tipo de matriz, almacenamiento, entre otros.
- Sesgos Instrumentales: Las debidas a las características de los equipos
utilizados para realizar las medidas tales como: resolución, magnitudes de
influencia.
- Analista: las debidas a la serie de mediciones: variaciones en
observaciones repetidas bajo condiciones iguales.
- Condiciones de medición: las debidas al certificado de calibración: en él se
establecen las correcciones y las incertidumbres asociadas a ellas, para un
valor de k (factor de cobertura) determinado, en las condiciones decalibración.
- Método (por ejemplo, al interpolar en una recta), tablas (por ejemplo, las
constantes), pesada, alícuota, efectos computacionales. Guía Técnica No.1
del ISPCH (2010
Para este fin se deberá realizar una evaluación de las incertidumbres tipo A y B
que están presentes en el método:
- Evaluación de incertidumbre tipo A: evaluación de un componente por un
análisis estadístico de los valores de mediciones obtenidos en condiciones
de medición definidas. Ejemplo: realizar varias mediciones en condiciones
de repetibilidad.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
37/123
25
- Evaluación de incertidumbre tipo B: evaluación de un componente
incertidumbre de la medición realizada por otros medios distinto a los deltipo A. Ejemplos: La evaluación basada en la información, obtenidos a partir
de un certificado de calibración. Guía Técnica No.1 del ISPCH (2010).
1.2.12 Cromatografía Líquida de alta resolución (HPLC)
De acuerdo a Skoog (2007), la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) esel tipo de cromatografía de elución más versátil y ampliamente utilizado. Los
químicos la emplean para separar y determinar especies químicas de diversos
materiales orgánicos, inorgánicos y biológicos. En cromatografía líquida, la fase
móvil es un disolvente líquido que contiene la muestra como mezcla de solutos.
Hay diferentes tipos de cromatografía líquida, que suelen clasificarse según el
mecanismo de separación o el tipo de fase estacionaria:
1. Cromatografía de reparto o de líquido-líquido.
2. Cromatografía de adsorción o de líquido-sólido.
3. Cromatografía de intercambio de iones o iónica.
4. Cromatografía de exclusión molecular.
5. Cromatografía de afinidad.
6. Cromatografía quiral.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
38/123
26
Figura No.3 Componentes del cromatógrafo líquido de alta resolución
Fuente: Skoog. (2007)
- Instrumentación
a) Bomba
De acuerdo a Skoog (2007), la bomba debe cumplir ciertos requisitos: capacidad
para generar presiones de hasta 6000 psi, salida libre de pulsos, velocidad de flujo
de 0.1-10ml/min, reproducibilidad relativa de los flujos de 0.5% o menor y
resistencia a la corrosión por diversos disolventes.
Skoog (2007), menciona que existen tres tipos de bombas: de tipo jeringa
impulsada con tornillo, las bombas de vaivén u oscilantes y las bombas
neumáticas o de presión constante. Las de tipo jeringa producen una salida no
pulsada cuya velocidad de flujo se controla con facilidad, de baja capacidad de
250ml, por lo tanto no son apropiadas con cambios en los disolventes.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
39/123
27
Las bombas de vaivén son las más utilizadas. Consisten en una pequeña cámara
cilíndrica que se llena y se vacía con el movimiento oscilante de un pistón. El
movimiento de la bomba produce un flujo pulsado que debe atenuarse después.Una de sus ventajas es que tiene un volumen interno pequeño, una presión de
salida alta hasta de 10,000psi, fácil adaptación a la elución en gradiente y una
velocidad de flujo constante, Skoog (2007).
La bomba neumática tiene una forma más sencilla y cosiste en un recipiente
plegable que contiene un disolvente que puede presurizarse con un gas
comprimido; son sencillas, de bajo costo y no generan pulsos, pero tienen unacapacidad y una salida de presión limitadas, su velocidad de bombeo si depende
de la viscosidad del disolvente, y no son adaptables a la elución en gradiente,
Skoog (2007).
- Sistema de inyección manual de muestras
El más utilizado se basa en un bucle de muestras, existen intercambiables con
diferentes tamaños que varían de 5 a 500µL.
Figura No.4 Sistema de inyección manual de muestras
Fuente: Skoog (2007)
- Columnas
Usualmente se elaboran con tubos de acero inoxidable, o tubos de vidrio o Tygon
para aplicaciones de baja presión. La mayoría tienen una longitud de 10-30 cm y
diámetro interno de 2-5 mm, y con empaques de partículas de 3-10 µm.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
40/123
28
El empaquetamiento más común se prepara con partículas de sílice, que se
sintetizan por aglomeración de partículas submicrónicas de sílice en condiciones
que producen partículas más grandes y de diámetro muy uniforme.
Las partículas resultantes suelen cubrirse con películas orgánicas finas, que se
enlazan química o físicamente con la superficie. También existen columnas
empacadas de alúmina, de polímeros porosos o resinas de intercambio iónico,
Skoog (2007).
Para asegurar que los líquidos que ingresen a la columna estén libres decontaminantes o partículas que desgasten la columna, se colocan precolumnas,
en las cuales su composición de empaquetamiento es similar a la de la columna
analítica, pero con un tamaño de partícula mayor para minimizar la caída de
presión. Skoog (2007).
Además, para asegurar y obtener mejores cromatogramas se puede mantener
constante la temperatura de la columna a unas décimas de grado Celsius. Para
esto los cromatógrafos tienen incluidos calentadores para asegurar la temperatura.
- Detectores
Características de un detector: debe ser pequeño y compatible con el flujo de
líquido, el tipo de detector depende de la naturaleza de la muestra. Existen
diferentes tipos de detectores: están los detectores por absorbancia, fluorescencia,
electroquímico, índice de refracción, conductividad, espectrometría de masas,
FTIR, dispersión de luz, actividad óptica entre otros. Skoog (2007). Encromatografía líquida los más utilizados son por absorción de radiación ultravioleta
o visible, siendo algunos con lámpara de deuterio o de filamentos de tungsteno
con filtros de interferencia.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
41/123
29
Existen dos tipos de cromatografía muy importantes, los cuales dependen de la
polaridad de la fase móvil y de la fase estacionaria. Se encuentra la cromatografía
en fase normal, donde la fase estacionaria es polar y la fase estacionara es nopolar. En la cromatografía en fase reversa ocurre lo contrario, la fase estacionaria
es no polar, en muchos casos hidrocarburos, mientras que la fase móvil es un
disolvente relativamente polar como el agua, metanol, acetonitrilo o
tetrahidrofurano. Skoog (2007).
1.2.13 Vitamina A
De acuerdo a Gil (2010), la vitamina A es un nutriente de gran importancia. Su
deficiencia es la causa más común de enfermedades oculares como la
xeroftalmía, que puede llevar a la ceguera, principalmente a niños de países en
vías de desarrollo. Debido a esto y al mayor riesgo de padecer infecciones, la
deficiencia de esta vitamina es responsable del aumento de la morbilidad y la
mortalidad infantiles.
Además, es antioxidante provocando un efecto protector frente a los procesos de
oxidación celular mediados por radicales libres implicados en la aparición de
enfermedades crónicas como el cáncer, aterosclerosis, cataratas e incluso
envejecimiento.
La vitamina A está implicada en un gran número de procesos fisiológicos, por lo
que es necesario que sus requerimientos se cubran adecuadamente, Gil (2010).
De acuerdo a la FDA, el valor diario recomendado es de 5,000 UI, o bien 1,500µgER, para la población a partir de los 3 años de edad. RTCA 67.01.60:10.
Según Gil (2010), la vitamina A es un término genérico que se utiliza para describir
a los compuestos que presentan la actividad biológica del retinol, como los
retinoides y los carotenoides con actividad provitamínica A.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
42/123
30
La vitamina A fue la primera vitamina en ser definida; en 1915 la vitamina fue
denominada por McCollum y Davis “factor liposoluble A”, atribuyéndole como
propiedad principal la estimulación del crecimiento. En 1920 Drummond le asignóel término “Vitamina A”, aunque no fue aislada hasta 1937 por Morton.
De acuerdo a Gil (2010), en 1930 Moore mostró que la molécula del beta caroteno
presentaba actividad vitamínica A y desde entonces hasta ahora han sido
numerosas las funciones fisiológicas que se le han atribuido, tanto al beta
caroteno como al resto de compuestos englobados en la denominación de
vitamina A.
Los retinoides con actividad vitamínica A se encuentran en la naturaleza en tres
formas: alcohol (retinol), aldehído (retinal o retinaldehído) y el ácido (ácido
retinóico). Además del todo trans-retinol, otros cinco isómeros (7-cis, 9-cis, 11-cis,
13-cis y 9,13-cis-retinal) tienen actividad vitamínica A pero menor a los isómeros
trans, Gil (2010).
Las formas con mayor actividad fisiológica son el retinal y el ácido retinoico. En los
vegetales no existe como tal, pero sí sus provitaminas o precursores carotenoides,
de los cuales existen más de 500, siendo el más importante el β-caroteno. En la
conversión del β-caroteno en vitamina A, ocurren reacciones de oxidación-
reducción, transformándose en retinal, luego en retinol, para finalmente
almacenarse en el hígado como palmitato. En teoría, la ruptura enzimática de los
dos carbonos centrales en la mucosa intestinal liberaría dos moléculas de retinal,
sin embargo en la práctica esta transformación no se logra totalmente y sólo sealcanza el 50% de efectividad, Badui (2006).
Otros carotenoides con actividad provitamínica A son el alfa caroteno, el gama
caroteno y la beta criptoxantina., Gil (2010). Los carotenoides pueden ser
clasificados en dos grandes grupos, según su estructura:
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
43/123
31
- Carotenoides con estructura de hidrocarburos o carotenos, que no
contienen oxígeno.
- Xantofilas u oxicarotenoides, que contienen grupos carboxilo y/o hidroxilo
en sus grupos constituyentes. Gil (2010).
Gil (2010), menciona que tanto los retinoides como los carotenoides son
liposolubles, y por lo tanto solubles en la mayor parte de solventes orgánicos.
En cuanto a las propiedades físicas, la mayoría de las formas de vitamina A son
compuestos cristalinos con un punto de fusión relativamente bajo y debido a su
estructura presentan un espectro de absorción característico que se utiliza para su
identificación.
Por sus propiedades fisicoquímicas, esta vitamina es estable al tratamiento
térmico moderado así como a los agentes reductores y al medio alcalino. Sin
embargo, es muy sensible a la luz, la oxidación, la isomerización y lapolimerización, debido a su estructura de dobles enlaces conjugados. En general,
los ésteres son más estables que las formas alcohólicas y los carotenoides son
menos estables que los retinoides, Gil (2010).
- Fuentes de alimentación
La vitamina preformada se encuentra únicamente en alimentos de origen animal,
ya sea en sitios de almacenamiento, como el hígado, o relacionada con la grasa
de la leche y los huevos; en concentraciones altas se puede encontrar en el aceite
de bacalao y de pez hipogloso. Mahan y Escott.(2001).
Los carotenoides de provitamina A se encuentran en verduras oscuras, o de hojas
amarillas naranja y en frutas, los colores más intensos se relacionan con mayores
concentraciones de carotenoides.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
44/123
32
En el mundo la mayor pare de vitamina A alimentaria la aportan carotenoides. Las
zanahorias, sopas de verduras, vegetales de hojas verdes y mixtas, espinaca,
ensalada verde, jugo de naranja, camote, estofado de res y el melón constituyenlas 10 fuentes máximas de provitamina A. Mahan y Escott (2001).
Tabla No.3 Formas de expresar el contenido de Vitamina A
Compuesto Peso molar g ER/µg µg/ER
Retinol 286.5 1 1
Acetato de retinol 328.5 0.873 1.15Palmitato de retinol 524.8 0.546 1.83
Fuente: Bonifaz (2004)
1.2.14 Guayaba
De acuerdo a Geilfus (1994), su nombre científico es Psidium guajava, de la
familia de las Mirtáceas. La guayaba es originaria de los trópicos americanos,
donde es muy común encontrarla cultivada o en forma silvestre; se ha difundido a
todos los países tropicales y subtropicales, donde es uno de los frutos más
comunes; existen plantaciones comerciales en India, Brasil, Florida, Sudáfrica y
California, entre otros.
El árbol de este fruto es pequeño, de 8 a 9 m de alto como máximo, su tronco
crece de forma irregular con corteza lisa, color marrón que se desprende en
placas. Las hojas son alargadas de 8-18 cm de largo, con nervaduras
pronunciadas.
La flor es blanca, de 2.5 cm de ancho; el fruto redondo, alargado o en forma de
pera; mide entre 2.5-10 cm de largo, es amarillo-verde cuando madura. La pulpa
firme, generalmente de color amarillo, encierra una masa jugosa, amarilla o rosada
con numerosas semillas, según Geilfus (1994).
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
45/123
33
Según indica Geilfus (1994), la guayaba se utiliza comercialmente en forma de
jaleas, mermeladas, dulces y demás conservas. La pulpa adquiere a veces un
color rojo al cocinarse. También se preparan bebidas enlatadas, sorbetes, heladoso tartas. La madera de su árbol es adecuada para herramientas, además de ser
utilizada como leña y en preparación para carbón. Las hojas tienen propiedades
medicinales en particular contra la diarrea y la gastroenteritis.
Geilfus (1994), menciona que la guayaba es una de las frutas tropicales más
importantes en la nutrición; su contenido en vitamina C varía entre 23mg/100g y
500mg/100g, las variedades comunes contienen en promedio 2 a 5 veces másvitamina C que la naranja. También es rica en calcio, fósforo, hierro, vitamina A y
niacina; contiene entre 9 y 29% de carbohidratos según las variedades.
Las variedades silvestres reproducidas por semillas tienen generalmente frutos
pequeños, ácidos, y son los más apreciados para mermeladas, por su alto
contenido en pectina. Existen numerosas variedades mejoradas, reproducidas por
acodo o injerto. Se agrupan a menudo en guayabas rosadas y guayabas blancas.
La guayaba se adapta a una gran variedad de climas, desde tropical húmedo
hasta mediterráneo. Necesita entre 1000 y 4500 mm de lluvia anual para un
crecimiento normal; resiste hasta 6 meses de sequía.
Un clima húmedo todo el año favorece las enfermedades y reduce la producción,
es preferible el clima húmedo con estación seca, según Geilfus (1994). Se puede
encontrar hasta cerca de 2000 metros sobre el nivel del mar, pero la produccióncomercial se limita a 1000 metros.
Se adapta a toda clase de suelos, desde arcilloso y compacto hasta arenoso;
prefiere los suelos ligeramente ácidos. Los suelos calizos no convienen. Gracias a
su sistema de raíces profundas se desarrolla bien en suelos pobres, soporta
sequías prolongadas y resiste inundaciones periódicas.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
46/123
Se propaga por semilla
año. O bien por acodo
reproducir variedades mmás, y se retira un ani
proceso de germinación
Los árboles de semilla e
3 años. Las variedades
árbol (60 a 500 unidade
inferior. Hay una o dosGeilfus (1994).
Figura No.5 Variedades
34
, las cuales conservan su poder germi
s, el cual es el método más fácil y
ejoradas, donde se escogen ramas de 1llo de corteza de 2.5cm de ancho, y l
adecuado. Geilfus (1994).
mpiezan a producir en 2 ó 3 años, los ac
mejoradas pueden producir de 20 a 60
), mientras los árboles de semilla llegan
cosechas al año dependiendo del clima
mejoradas de la guayaba
Fuente: Geilfus (1994)
nativo durante un
ás utilizado para
cm de diámetro oego se sigue un
odos o injertos en
kilos de fruta por
a una producción
, según menciona
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
47/123
1.2.15 Guayaba Fres
Le corresponde el nomblas Mirtáceas, conocida
Peruana. Es originaria
llevaron a China, lueg
“Guayaba china”. Se cul
y Centroamérica, según
Además Geilfus (1994)
arbusto, el cual puede ll25 pies de alto. Posee h
medir 3cm de diámetro,
La Guayaba Fresa es
guayaba común. Se ad
sobre el nivel del mar,
suelos superficiales, y cr
Figura No.6 Guayaba Fr
35
a
re científico Psidium Cattleianum, pertenbajo otros nombres como: Guayaba ja
de Uruguay y Brasil, se cree que lo
emigró a Europa, donde fue otorga
tiva en el Mediterráneo, Hawaii, Florida,
Geilfus (1994).
, menciona que la guayaba fresa cr
gar a ser decorativo en los jardines de ojas brillosas y verde oscuro, generalme
e color rojo o incluso amarillas.
una especie subtropical, más resiste
pta bien a las zonas montañosas a pa
se cultiva de preferencia en clima sec
ece mejor en suelos arcillosos.
esa
Fuente: Propia (2014)
ece a la familia deponesa, Guayaba
s portugueses la
o el nombre de
California, México
ce en forma de
ido a su altura dente el fruto llega a
te al frío que la
tir de 700 metros
, no se adapta a
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
48/123
36
Se determinaron 204 compuestos en el concentrado del aroma de la guayaba
fresa, en mayor cantidad: etanol, alfa-pineno, (Z)-3-hexenol, (E)-beta-cariofileno y
ácido hexadecanóico. Investigaciones han determinado que el extracto de la hojacontiene metabolitos secundarios que tienen propiedades antimicrobianas.
En un estudio con el extracto de la hoja se comprobó al aplicar el extracto en
concentración elevada, que el Streptococcus mutans que creció en biofilm ya no
estaban con vida, según Lim (2012).
La madera es compacta, pesada, durable y resistente. Se utiliza para trabajos detorno, mangos de herramientas, carbón y leña. El árbol es indispensable para la
siembra mixta en la reforestación de las zonas recuperadas y protegidas en Brasil
de acuerdo a Lim (2012).
Figura No.7 Diagrama de posibles transformaciones industriales de la Guayaba y
Guayaba Fresa
Fuente:FAO (2006)
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
49/123
37
II. Planteamiento del problema
En Guatemala luego del surgimiento de la Ley del Sistema de la Calidad en el año2005 con el apoyo del Ministerio de Economía y Salud, aunado a las exigencias
del comercio internacional, los laboratorios de ensayo vieron la necesidad de ser
acreditados bajo la Norma ISO 17025, “Requisitos Generales para la competencia
de los laboratorios de ensayo y calibración”, norma para la cual se encuentra en
proceso de acreditarse el Laboratorio CONCALIDAD. En Guatemala actualmente
hay 18 laboratorios acreditados bajo esta norma, de los cuales solamente uno
tiene una metodología de vitamina A validada para azúcar, OGA (2014).
Dentro de sus requisitos la norma solicita que los métodos utilizados sean
validados, la validación es necesaria al implementar una nueva metodología
dentro de un laboratorio de ensayo. Dependiendo de la procedencia de la
metodología así será el grado de validación. Una metodología desarrollada por el
laboratorio, deberá cumplir con una validación completa, evaluando todos los
parámetros de desempeño que el método requiera.
La Norma establece evaluar nueve parámetros de desempeño para su validación,
siendo éstos: selectividad, linealidad, límite de detección, límite de cuantificación,
precisión, exactitud, rango, robustez, e incertidumbre garantizando que los
resultados del método sean confiables. Estos podrían variar de acuerdo al grado
de validación y también de lo que la metodología requiera. Para este proceso se
pueden utilizar diferentes materiales de referencia, los cuales garantizarán que la
metodología empleada es apta para el propósito final, una vez estos materialessean confiables y de preferencia certificados. Esta investigación aportará una guía
de referencia en la elaboración de validaciones de métodos cuantitativos para
alimentos, siendo funcional para diferentes procesos, ya sea gravimétricos o
cromatográficos.
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
50/123
38
Luego de validar el método, se procedió a determinar el contenido de Vitamina A
en Guayaba Fresa (Psidium Cattleianum), debido a que no existen antecedentesnutricionales en el país. Por ser un fruto poco conocido, no existen datos de
consumo y producción en el país, esta investigación es una iniciativa para la
explotación e investigación de la Guayaba Fresa.
Además, la deficiencia en vitamina A ha sido uno de los problemas de mal
nutrición en Guatemala, por lo tanto se han implementado planes de fortificación,
como la Ley General de Fortificación de Alimentos, para contrarrestar la faltavitaminas, como es el caso de la vitamina A. Dada esta necesidad de fortificar los
alimentos, es necesario también realizar análisis confiables que comprueben el
contenido final de vitamina.
Por lo tanto ¿Es válido en los nueve parámetros establecidos en el plan de
validación, el método planteado para el análisis cuantitativo de la Vitamina A
(Retinol) en alimentos? De ser válido ¿Cuál es el valor de Vitamina A presente en
la Guayaba Fresa?
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
51/123
39
2.1 Objetivos
2.1.1 Objetivo General
- Validar un método analítico por Cromatografía Líquida de Alta Resolución
con detector Ultra Violeta (HPLC/UV).
2.1.2 Objetivos Específicos
- Montar un método analítico para la cuantificación de la Vitamina A (Retinol)
en alimentos.
- Determinar la validez del método analítico propuesto por medio de los
siguientes parámetros estadísticos: selectividad, linealidad, límite de
detección, límite de cuantificación, precisión, exactitud, rango, robustez e
incertidumbre.
- Determinar el contenido de Vitamina A en Guayaba Fresa.
- Comparar el contenido de Vitamina A en Guayaba Fresa y Blanca.
2.2 Hipótesis
2.2.1 Nula- La Guayaba Fresa posee un contenido de Vitamina A mayor o igual que la
Guayaba Blanca.
2.2.2 Alterna
- La Guayaba Fresa posee un contenido de Vitamina A menor que la
Guayaba Blanca.
2.3 Variables
2.3.1 Variables Independientes
- Tiempo de saponificación
- Tiempo de desgasificación
- Composición de fase móvil
- Analista
- Diluciones del estándar de referencia
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
52/123
40
2.3.2 Variables Dependientes
Parámetros estadísticos para validar el método analítico:
- Selectividad- Linealidad
- Límite de detección
- Límite de cuantificación
- Precisión
- Exactitud
- Rango
- Robustez
- Incertidumbre
- Contenido de Vitamina A en el material de referencia
- Áreas de respuesta del estándar de referencia
2.4 Definición de las variables
2.4.1 Definición Conceptual
- Tiempo de saponificación: magnitud física que permite ordenar la secuenciade los sucesos, estableciendo un pasado, un presente y un futuro. Su
unidad en el Sistema Internacional es el segundo. Real Academia Española
(2014).
- Tiempo de desgasificación: magnitud física que permite ordenar la
secuencia de los sucesos, estableciendo un pasado, un presente y un
futuro. Su unidad en el Sistema Internacional es el segundo. Real Academia
Española (2014).- Composición de fase móvil: magnitud que expresa la cantidad de una
sustancia por unidad de volumen. Su unidad en el Sistema Internacional es
el mol por metro cúbico (mol/m3). Real Academia Española (2014.)
- Analista: persona calificada con capacidades técnicas para realizar análisis
del área que este especializado. Persona que hace análisis químicos o
médicos. Real Academia Española (2014).
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
53/123
41
- Diluciones del estándar de referencia: acción de diluir con el fin de disminuir
la concentración de una disolución añadiendo disolvente. Real Academia
Española.
Parámetros estadísticos para validar un método analítico:
- Selectividad: la selectividad es el grado en que un método puede cuantificar
o cualificar al analito en presencia de interferentes. Guía No.1 del ISPCH
(2010).
- Precisión: grado de concordancia entre resultados obtenidos en mediciones
repetidas de un mismo objeto o de objetos similares, bajo condicionesespecificadas. Guía No.1 del ISPCH (2010).
- Exactitud: grado de concordancia entre el promedio de un número infinito
de resultados y un valor de referencia. Guía No.1 del ISPCH (2010).
- Linealidad: la linealidad es la capacidad de un método de análisis, dentro de
un determinado intervalo, de dar una respuesta o resultados instrumentales
que sean proporcionales a la cantidad del analito que se habrá de
determinar en la muestra de laboratorio. Guía No.1 del ISPCH (2010).
- Rango: intervalo de concentraciones de analito dentro del cual se puede
considerar al método validado. EUROCHEM (2005).
- Límite de detección (LDD): “el menor contenido que puede medirse con una
certeza estadística razonable. O bien el menor contenido de analito, si está
presente, que será detectado y que puede ser identificado”. Guía
EURACHEM (2005).
- Límite de cuantificación (LDC): “el límite de cuantificación (LDC)
estrictamente es la concentración más baja del analito que puede serdeterminada con un nivel aceptable de precisión de repetibilidad y
veracidad”. EUROCHEM (2005).
- Robustez: es una medida de la capacidad de un método para mantenerse
sin cambios ante pequeñas pero deliberadas variaciones en sus
parámetros. EUROCHEM (2005).
8/19/2019 Betacarotenos en Una Validacion
54/123
42
- Incertidumbre: parámetro que caracteriza la dispersión de los valores que
podrían ser razonablemente atribuidos al mensurando. EUROCHEM (2005).
- Contenido de Vitamina A en Material de Referencia: unidades equivalentesde Retinol presentes por gramo del material de referencia. Gil. (2010.)
- Áreas de respuesta del estándar de referencia: integración electrónica en
donde un dispositivo digitaliza la señal analógica proporcionada por el
detector, detecta el comienzo y el final de cada pico cromatográfico, integra
digitalmente el área bajo la curva y corrige automáticamente la línea base.
Conceptos fundamentales de cromatografía (2014).
2.4.2 Definición Operacional
- Tiempo de saponificación: tiempo que se llevó a cabo la reacción de
saponificación de las muestras, por medio de una solución de etanol e
hidróxido de potasio, se varió para el análisis de robustez.
- Tiempo de desgasificación: tiempo en el cual se colocaron los frascos de
fase móvil en el baño ultrasónico para permitir la extracción del oxígeno
disuelto en la solución, variando para el análisis de robustez.
- Composición de fase móvil: cantidad en mililitros de metanol, propanol, yagua para la realización de la fase móvil, la cual se varió para el análisis de
robustez.
- Analista: técnico competente que realizó las repeticiones necesarias junto
con el técnico titular para determinar la reproducibilidad del método,
variable tomada para evaluación de robustez.
Parámetros estadísticos para validar método analítico.
- Diluciones del estándar de referencia: seis diferentes diluciones que se
realizaron para determinar la linealidad del método.
- Selectividad: interferencias que puede tener el método de análisis de
Vitamina A, utilizando una muestra de referencia.
- Linealidad: capacida
Top Related