Pilar García SuárezInstituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), Villaviciosa,
Asturias, Spain
Bacteriófagos y sus aplicaciones en seguridad alimentaria
Jornadas Técnicas Sobre Biocontrol en Fermentación Láctea. 6 y 7 de Septiembre -Complejo Cultural San Francisco - Cáceres
Quesos de
España
WWW. IPLA.CSIC.ES
Tecnología y Biotecnología de P.L.Microbiología molecularFermentos lácticos y bioconservaciónFísico-química
Microbiología y Bioquímica de P.L.Probióticos, prebióticos y exopolisacáridosCultivos lácteos funcionales
INSTITUTO DE PRODUCTOS LÁCTEOS DE ASTURIAS
CSIC
DairySafe Group
Ana RodríguezBeatriz MartínezPilar García
Clara RocesLorena RodríguezDiana GutiérrezSilvia PortillaAna B. CampeloRosana CalvoPablo GonzálezDiana Lueces
ÍNDICE
1. SEGURIDAD ALIMENTARIA
2. BIOCONSERVACIÓN
3. LOS BACTERIÓFAGOS
4. PROTEÍNAS FÁGICAS
5. TERAPIA FÁGICA
6. BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
7. PERSPECTIVAS DE FUTURO
SEGURIDAD ALIMENTARIA
Seguridad alimentaria en el mundo: 2.2 millones de muertes al año (OMS, 2012)
Países industrializados: 5,262 brotes en 2010 EU
NUEVAS TECNOLOGÍAS: - disminuir pérdidas económicas
- bajar los costes procesamiento
- cumplir las normativas legales
- impedir la trasmisión de patógenos
- satisfacer al consumidor (aditivos, poco procesados, listos para comer, )- sostenibilidad
CAUSAS:
- patógenos emergentes
- adaptación de patógenos conservación
- resistencia a antibióticos bacterias zoonóticas
SEGURIDAD ALIMENTARIA
BIOCONSERVACIÓN
La bioconservación es la utilización de microorganismos, incluidos
bacteriofagos, sus productos metabólicos o ambos para conservar los
alimentos (Montville & Chikindas, 2007).
* CULTIVOS INICIADORES Quesos artesanales asturianos
Lactococina 972
Biocontrol de patógenos
* BACTERIOCINAS
* BACTERIOFAGOS
BIOCONSERVACIÓN
LOS BACTERIÓFAGOS
LOS BACTERIÓFAGOS: abundancia y diversidad
- 1031 partículas (104-107 pfu/ml agua mar; 108 pfu/g suelo).
- Eliminan la mitad de la población bacteriana cada 48 h.
- Papel en la evolución de las bacterias acelerando la tasa de mutación.
LOS BACTERIÓFAGOS: abundancia y diversidad
- 5100 especies diferentes
LOS BACTERIÓFAGOS: morfología y ciclo de vida
Tail
Tail fibers
Core
HeadDNA
Environmental signals
Bacteriophage
Host recognition
Adsorption
Insertion(prophage)
Penetration
Replication
Synthesis
AssemblyRelease
LYTIC CYCLE
LYSOGENIC CYCLE
7
6
5
4
3
21
LOS BACTERIÓFAGOS: morfología y ciclo de vida
PROTEÍNAS FÁGICAS: endolisinas y PG hidrolasas
EndolisinasPG hidrolasas asociadas a virión
Lisis
Bacteriófago
ReconocimientoAdsorción
Inserción(profago)
Penetración
Replicación
Síntesis
Ensamblaje
CICLO LITICO
CICLO LISOGÉNICO
7
6
5
4
3
21
MEMBRANA
PE
PT
IDO
GLI
CA
NO
ESPACIO PERIPLASMICO
CITOPLASMA
HIDROLASA
HOLINA
ENDOLISINA
CITOPLASMA
ESPACIO PERIPLASMICO
PE
PT
IDO
GLI
CA
NO Señales
ambientales
L-Ala D-Gln
D-Gln
L-Lys
D-Ala L-Lys
D-Ala
L-Ala
21
6
54
3
D-GlnD-Ala L-Lys
NAM
NAM
NAG
NAG
NAG
NAM
NAG
NAG
NAG
21
6
54
3NAM
NAM
NAG
NAG
NAG
NAM
NAG
NAG
NAG
PROTEÍNAS FÁGICAS: endolisinas y PG hidrolasas
Peptidoglycan hydrolase activities and their bond substrate in the cell wall. 1: N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase; 2: interpeptide bridge endopeptidase; 3: N-acetyl-β-D-glucosaminidase; 4: L-alanoyl-D-glutamateendopeptidase; 5: N-acetyl- β-D-muramidase; 6: Transglycosylase.
Daniel et al., 2010
S. aureus ClyS
Capacidad antimicrobiana: enzibióticos
PROTEÍNAS FÁGICAS: endolisinas y PG hidrolasas
S. aureus LysH5
Obeso et al., 2008
TERAPIA FÁGICA
TERAPIA FÁGICA: los primeros ensayos
Phage discovery
1917 1920 1930 1940 Present
Phage therapy
Antibiotics production
Antibiotic therapy
Phage therapy in former Soviet Union
and Poland
Intestinal disorders (Phagesti)
Bacterial infections (Phagepy, PhageBioderm)
Food safety (LISTEX P100, ListShieldTM, EcoShieldTM)
Crop safety (AgriPhage)
Animal health care (SPLX-1TM
PLSV-1TM, INT-401TM , BioTector)
Bacterial detection (FASTPlaque-ResponseTM, FASTPlaqueTBTM, MicroPhage MRSA/MSSA test,
MRSA screening test, MRSA/MSSA blood culture test)
COMMERCIAL PRODUCTS
G. Eliave Bacteriophage, Virology and Microbiology Institute D’Herelle, 1917
Terapia humana
TERAPIA FÁGICA: algunos productos
TERAPIA FÁGICA: ventajas y desventajas
Ventajas
Especificidad y capacidad de autorreplicaciónEficaciaHistoria de uso seguroNo alteran las propiedades organolépticasLas endolisinas no generan resistencia
Desventajas
Los fagos pueden llevar en su genoma genes codificantes de toxinasRango de huésped estrechoBacterias resistentes a fagosInactivación por las condiciones ambientalesLas endolisinas no actúan sobre gram negativos
TERAPIA FÁGICA: empresasCompany Country Web site Target
Gangagen USA http://www.gangagen.com/ Human infections
Intralytix USA http://www.intralytix.com/ Food safety
Omnilytics USA http://www.phage.com/home5.html Crops (Agriphage)
Phage Biotech Israel http://www.phage-biotech.com/ Human infections
Hexal Genentech Germany http://www.hexal-gentech.com/index.html Human infections
Novolytics UK http://www.novolytics.co.uk/ Human infections
Biophage Inc. Canadá http://www.biophagepharma.net/index.html Environment, human and animal
Biopharm Pharmaceuticals Georgia http://www.biopharmservices.com/Pharma.aspx Human infections
EBI Food Safety Netherlands http://www.ebifoodsafety.com Food safety.(Listex P100TM)
BigDNA UK (http://www.bigdna.com/) Animal infections
JSC Biochimpharm Georgia (http://www.biochimpharm.ge/) Human infections
Biocontrol UK (http://www.biocontrol-ltd.com/) Human infections
Innophage Portugal (http://www.innophage.com/) Human infections
Phico Therapeutics UK (http://www.phicotherapeutics.co.uk/) Human infections
Phage International USA, Georgia (http://www.phageinternational.com/) Human infections
Targanta Therapeutics USA (http://www.targanta.com/) Human infections
Viridax USA (http://www.viridax.com/) Human infections
BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
Disinfection of equipment contact
surfaces
Biopreservation
Reduction of colonization
Phage therapy Biofilms removal
“Farm to fork”
Animals Foodstuff industry
Final product
Storage and marketing
Phage
Biocontrol
Carcass meatraw productsRTE products
Consumer
BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado
2. Descontaminación de superficies
3. Conservación de alimentos
4. Detección de bacterias en la cadena de producción
1. TERAPIA FÁGICA Y PROFILAXIS EN EL GANADO
E. coli O157:H7
Sheng et al. 2006
Tratados
10E6 cfu10E10 pfu/4 días10E6 pfu/ml agua
control
fagos SH1 and KH1
1. TERAPIA FÁGICA Y PROFILAXIS EN EL GANADO
Schmelcher et al., 2012
Staphylococcus aureus
12.5 µg each/gland3.36-log decrease in CFU
Endolisinas
Staphylococcus aureus
Daniel et al., 2010
5 10E9 cfu24h 1 mg endolisina ClyS
1. TERAPIA FÁGICA Y PROFILAXIS EN MANIPULADORES
Endolisina ClyS
BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado
2. Descontaminación de superficies
3. Conservación de alimentos
4. Detección de bacterias en la cadena de producción
biofilm
2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES
2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES
Campylobacter jejuni
Fagos CP8, CP30 y PT14
Siringan et al., 2011
Control tratados
2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES
Endolisinas frente a S. aureus
Sass and Bierbaum 2007 Son et al. 2010
control endolisina
C PT C PT C PT
F12 CJBP1 CJBP3
S DS R
phi-IPLA5 biofilm S. epidermidis 7 días
3h
Gutiérrez et al., 2012
2. DESCONTAMINACIÓN DE SUPERFICIES
biofilm
planctónico
Staphylococcus epidermidis
BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado
2. Descontaminación de superficies
3. Conservación de alimentos
4. Detección de bacterias en la cadena de producción
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
García et al., 2009
Leche S. aureus fagos phiH5 y phiA72
Pasteurizada Cruda semidesnatada Cruda entera
S. aureus + fagos
S. aureus
* Aplicación de la microbiología predictiva
100 80 60 40 20
Figura 11. Superficie de Respuesta del Modelo 4.
Los 3 ejes representan respectivamente el % de Mortalidad, la Temperatura, y el
log10 de la Concentración de Bacteriófagos Añadida.
%M
ort
ali
dad
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Log10fagos
10
15
20
25
30
35
40
Tem
pera
ture
, ºC
100%98%
95%90%
Figura 12. Líneas de contorno en 2D del Modelo 4 indicando las regiones de inhibición y
supervivencia de bacterias. Log10 fagos que garantiza la Mortalidad 100% a 15 ?C.
Log10 fagos
Temperatura (
? C)
7,7
X = temperatura Y = log concent fagos
Mortalidad = – 125,86 + 5,96·x + 28,76·y – 0,745·xy
Obeso et al., 2010
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
logP
FU
mL
-1log
CF
U m
L-1
0
2
4
6
8
10
0 50 100 150 200 250
time (min)
0
2
4
6
8
10
logP
FU
mL
-1log
CF
U m
L-1
0
2
4
6
8
10
0 50 100 150 200 250
time (min)
0
2
4
6
8
10
log
CF
U m
L-1
log
PF
U m
L-1
pH
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25
time (h)
4
5
6
7
log
CF
U m
L-1
log
PF
U m
L-1
pH
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25
time (h)
4
5
6
7
CUAJADA ÁCIDA CUAJADA ENZIMÁTICA
Garcia et al., 2007
S. aureus fagos phiH5 y phiA72
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
pH
fagos
S. aureus
BAL
S. aureus + fagosS. aureus + fagos
fagos
S. aureus
Φ35 y Φ88 S. aureus en queso
0
2
4
6
8
10
leche
cuaja
da24
h48
h qu
eso
5 dqu
eso
8 dqu
eso 1
5 dqu
eso 3
0 dTiempo de maduración
2
3
4
5
6
7
0
2
4
6
8
10
lech
ele
che
3 hle
che
6 hcu
ajada
24
h qu
eso
7 d
ques
o 14
d
Tiempo de maduración
2
3
4
5
6
7Mixta Ácida
pH
pH
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
Bueno et al., 2012
pH
S. aureus
fagos
S. aureus + fagos
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
Combinación de fagos y altas presiones
Tabla et al., 2012
L. monocytogenes phage P100 y A115
Guenther et al. 2009
1 10E3 cfu/gr ml3 10E8 pfu/ gr ml
6 días a 6°C
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
Endolisina LysH5 S. aureus
Obeso et al., 2008
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
LysH5 (45U/ml)LysH5 (160U/ml)
LysH5 (80U/ml)
controlcontrol
* Construcción de proteínas quimera
166 465
CHAP156
CHAP166
LYZ161
LYZ171
636 1
629
156 475
6xHis149 483
CHAP LYZ215
HydH5
Lysostaphin
SH3bEndopeptidase
249 1
132 32 167
HydH5Lyso
884 1
HydH5SH3b
739 1
CHAPSH3b
1 261
156
Rodríguez-Rubio et al., 2012a
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
37 ºC RT
Time (min)
*** *** *****
**
*** ****** ***
37 ºC RT37 ºC RT
Time (min)
*** *** *****
**
*** ****** ***
Proteína CHAPSH3 S. aureus leche cruda
Rodríguez-Rubio et al., unpublished
control con proteína
* Estudio de posibles sinergismos
Endolisina LysH5 (U/ml)
Nisin
a
6 µg/ml
0
5 ng/ml
50 0.078
García et al., 2010Rodríguez-Rubio et al., 2012a
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
control
LysH5
nis
LysH5 + nis
SPlcn972 LysH5
1 1533 nt
506 aa1
GTA GCT CAA GCT ATG CAA GCA AAA CTA ACT AAA76 108 nt
22 32 aaVal Ala Gln Ala Met Gln Ala Lys Leu Thr Lys
lysH5SPlcn972
Rodríguez-Rubio et al., 2012b
3. CONSERVACIÓN DE ALIMENTOS
* Cultivos iniciadores con capacidad protectora
Lactococcus lactis
LysH5
LysH5
LysH5
LysH5
LysH5
lysH5
Pnis
nisR nisKnisK
nisR
LysH5
LysH5
LysH5
SPLcn972
Sec
BIOCONTROL DE PATÓGENOS EN ALIMENTOS
1. Terapia fágica y profilaxis en el ganado
2. Descontaminación de superficies
3. Conservación de alimentos
4. Detección de bacterias en la cadena de producción
L. monocytogenes
1-10 CFU/gr
Kretzer et al., 2007
4. DETECCIÓN DE BACTERIAS EN LA CADENA DE PRODUCCIÓN
Bacillus cereus
Clostridium perfringens
NC
Catalytic Binding
Linker
CBD L. monocytogenes
Schmelcher et al., 2010CFP, cyan fluorescent protein; GFP, green fluorescent protein; RS, RedStar protein
4. DETECCIÓN DE BACTERIAS EN LA CADENA DE PRODUCCIÓN
Agricultura Veterinaria
INT-401™Clostridium perfringens
PLSV-1™Salmonella
Acuicultura, tratamiento de aguas, desinfección de superficies, detección de bacterias, etc.
EcoShield™ ListShield™
SALMONELEX™
MICREOS
LISTEX™
MICREOS
PERSPECTIVAS DE FUTURO
Pilar García SuárezInstituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), Villaviciosa,
Asturias, Spain
Bacteriófagos y sus aplicaciones en seguridad alimentaria
GRACIAS POR SU ATENCIÓN
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