ULTIMOS AVANCES EN LA BIOLIXIVIACIÓN DE
CONCENTRADOS CALCOPIRITICOS
Dr. JUAN RIVADENEIRA H.
LIAP-UAI
Muchas Gracias
Introducción
• Mercado del cobre de acuerdo a su vía de procesamiento.
– Minerales: Óxidos v/s Sulfuros.
– Sulfuros: Molienda- Concentrados- Ánodos-ER- Cátodos.
– Óxidos: Chancado- Lixiviación - SX-EW - Cátodos.
• Bajos costos en procesos de biolixiviación de sulfuros.
– Regeneración de insumos H2SO4
– Plantas de SX-EW amortizadas.
– Baja intensidad de energía.
• Foco actual de lixiviación en bajas leyes.
– Procesos masivos, Botaderos, ROM.
• Ambientalmente amigable v/s Fundiciones.
– No genera gases sulfurosos
• Nuevos minerales
– Refractarios o con As
Introducción
Proceso productivo según el mineral
Cobre Sulfurado
Molienda
Flotación
Fundición
Electro refinación
Cobre oxidado
Lixiviación
Extracción por solventes
Electro obtención
Exploración geológica
Extracción, Carguío y Transporte
Chancado
Introducción
Capacidad de Fusión de Concentrados y Refinación de Cobre en Chile
Fuente: Cochilco, 2009
Introducción
0
1.000
2.000
3.000
4.000
5.000
6.000
7.000
2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020
KT
on
Cu
Fin
o
Producción de Cu en Chile
Capacidad de fundición
Capacidad de Refinación
Cobre en concentrados
total Catodos SxEw
• Mina Subterranea y a rajo
abierto
• Buena ubicación Geográfica
de las faenas
• Tecnología de punta en planta
• Investigación y Desarrollo
• Gobierno y nueva
norma de fundiciones:
Codelco y Enami son
las que deberán realizar
la mayor inversiónConstanza Pérez-Cueto
Introducción
• "Estimamos que son más de US$1.350 millones (de inversión). Las
principales inversiones van a estar en las fundiciones públicas" dijo
a La Tercera, Marcelo Fernández, jefe de la oficina de Asuntos
Atmosféricos del Ministerio de Medio Ambiente.
04/07/2012
Terminología
• Biolixiviación: disolución de minerales de su fuente mineral
por acción microbiana.
• Bio-oxidación: es la oxidación mediante microorganismos
del mineral huésped que contiene el componente metálico
de interés. Tratamiento de minerales refractarios de oro.
• Bio-mineria: movilización de elementos de una materia
sólida mediada por bacterias y hongos.
• Bio-hidrometalurgia: campo interdisciplinario en donde se
da una cruza entre aspectos microbiológicos y en especial
geo-microbiológicos y biotecnológicos con mineralogía,
geología, metalurgia, ingeniería química y ingeniería en
minas.
Directo:
Obteniendo electrones directamente de la
reducción del mineral.
Adhesión celular al sustrato mineral.
Indirecto:
ion férrico como transportador de electrones
No requiere contacto de la célula al sustrato.
Modelos de Mecanismos de Lixiviación
•Contacto celular con el sustrato mineral.
•Excreción celular de exopolímeros.
•Acomplejamiento de iones férricos a residuos de ácido glucurónico presentes en el exopolímero.
•Mecanismo de ataque primario.
•Formación de tiosulfato como intermediario de la oxidación del sulfuro.
•Formación de gránulos de sulfuro o gránulos de politionatoen el espacio peri plasmático o en la pared celular.
Modelos de Mecanismos de Lixiviación
Mecanismo del tiosulfato (FeS2, MoS2, WS2).
FeS2 + 6Fe 3+ + H2O S2O32- + 7Fe 2+ + 6H+
S2O32- + 8Fe 3+ + 5H2O 2SO4
2- + 8Fe 2+ + 10H+
2Fe 3+ + 2S2O32- 2FeS2O 3+ 2Fe 2+ + S4O6
2-
Mecanismo de poli sulfuros (ZnS, CuFeS2, FeAsS, etc.)
MS + Fe 3+ + H+ M 2+ + 0.5 H2Sn + Fe 2+
0.5 H2Sn + Fe 3+ 0.125 S80 + Fe 2+ + H+
0.125 S80 + 1.5 O2 + H2O SO4
2- + 2H+
Precipitación del hierro férrico
4 Fe 3+ + 12 H2O 4 Fe(OH)3 + 12 H+
Mecanismos de Lixiviación
426243234242 SOH6OHSOKFe2OH12SOFe3SOK A)
B)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
TE
MP
ER
AT
UR
A, °
C
pH
Fe3+
Fe2O3
FeO(OH)
Fe(OH)3
Formación de Jarosita potásica. A) formula de la reacción química conducente a la formación de jarositas potásicas. B)
diagrama de temperaturas y pH de estabilidad de compuestos de ión férrico, se muestran los parámetros de formación y
estabilidad de las especies que conforman jarositas y hidróxidos de Hierro ( Geothita y Hematita), en rojo se muestra el
área en que es posible encontrar el ión férrico en solución y las estrellas muestran las condiciones operacionales utilizadas
en las experiencias de biolixiviación llevadas a cavo en esta tesis con microorganismos mesófilas, termófilos Moderados y
termófilos extremos ( 39º, 50º y 70ª C Respectivamente) y en condiciones de iso pH 1,5. Adaptado de G. von Weert and
R.J.M. van Lier, Aqueous Pressure Oxidation of Silver – Bearing Cyamide Refractory Concentrates in Acidic Sulfate and
Sulfate – Iodide Media, TMS – EPD Congress JOM 1994, pp 12.
REACCIONES DE OXIDACIÓN DE MINERALES CUPROSOS
H.R.Watling (2006) “The bioleaching of sulphide minerals with emphasis on copper sulphides” hydrometallurgy 84: 81-108
TRFLP
• Mina Subterranea y a rajo
abierto
• Buena ubicación Geográfica
de las faenas
• Tecnología de punta en planta
• Investigación y Desarrollo
Microorganismos descritos en procesos de Biolixiviación
de calcopirita
H. Huber, K.O.Stetter. (1998) “ Hyperthermophiles and their possible potential in biotechnology” Journal of Biotechnology 64: 39-52.
pH 1,5
Aerobiosis
CuFeS2
Fe2(SO4)3
Fe SO4
H2O
O2
pH 7
NAD(P)H
NAD(P)H+
H+
H+
ADP + PiATP
Fe2(SO4)3
FeSO4+ CuSO4 + S°
H2SO4H2SO4SO4=
K F
e3(S
O4) 2
(OH
) 6
Acidithiobacillus ferrooxidans
O2
O2
O2
O2
O2
O2
O2
Modelo propuesto de ataque indirecto por Fe3+
con oxidación de Fe2+
bacterial y O2 como aceptor de electrones en
Acidithiobacillus ferrooxidans.
Se muestra capa de precipitados de jarosita y precipitados de RISCs que se forma tanto sobre la bacteria como sobre la
partícula a biolixiviar. Se incluye ataque de iòn fèrrico sobre la partícula de calcopirita y la generación de un azufre elemental
como subproducto de la reacción. Modelo propuesto para ataque Indirecto en condiciones Mesofílicas.
pH 1,5
Aerobiosis
S°
S°
S°
S°
S°
CuFeS2
K F
e3(S
O4) 2
(OH
) 6
Acidithiobacillus ferrooxidans
O2
O2
O2
O2
O2
O2
O2
Modelo propuesto de ataque directo con oxidación de RISCs y O2 como aceptor de electrones en Acidithiobacillus
ferrooxidans. Se muestra capa de precipitados de jarosita y precipitados de RISCs que se forma tanto sobre la bacteria como sobre la partícula a
biolixiviar. Se incluye ataque de la bacteria sobre los precipitados de RISCs en la superficie de la partícula de calcopirita, los compuestos
RISCs al ser extremadamente insolubles en medio acuoso requieren que la bacteria ataque de forma directa la superficie del mineral ( línea
punteada negra). Modelo propuesto para explicar el ataque Directo en condiciones Mesofílicas, Termofílicas moderadas y Termofílicas
extremas, utilizando oxigeno como aceptor final de los electrones.
pH 1,5
Anaerobiosis
S°
S°
S°
CuFeS2
S°
Cu
FeS
2K Fe3(SO4)2(OH)6
Acidithiobacillus ferrooxidans
Modelo propuesto de ataque directo con oxidación de RISCs y Fe3+
como aceptor de electrones en Acidithiobacillus
ferrooxidans. Se muestra capa de precipitados de jarosita y precipitados de RISCs que se forma tanto sobre la bacteria como sobre la partícula a
biolixiviar. Se incluye ataque de la bacteria sobre los precipitados de RISCs en la superficie de la partícula de calcopirita, los compuestos
RISCs al ser extremadamente insolubles en medio acuoso requieren que la bacteria ataque de forma directa la superficie del mineral ( línea
punteada negra). A la vez al utilizar Fe3+
como aceptor final de los electrones la bacteria genera espacios en su pared celular capaces de unir
precipitados de Fe3+
permitiendo mejorar las capacidades de unirse al sustrato a biolixiviar. Modelo propuesto para explicar el ataque Directo
en condiciones Mesofílicas, Termofílicas moderadas y Termofílicas Extremas con férrico como aceptor final de los electrones.
•Sistema de Biolixiviación de Concentrados en Pilas
•Aireación e irrigación controlada para conservar el calor y así maximizar la
biolixiviación.
•Especies Biológicas atacan los sulfuros y liberan los metales básicos a la
solución.
•El concentrado es recubierto sobre un sustrato de tamaño controlado
(Roca estéril o mineral de baja ley) y apilado.
•La pila se irriga con solución ácida con nutrientes que se recicla.
•Se emplea aire a baja presión para suplir oxigeno- soplado desde la base
de la Pila.
•SX-EW.
•Fierro y Arsénico se remueven vía precipitación.
•Los metales preciosos pueden recuperarse si están presentes.
PROCESO GEOCOAT ®
clonamientoGEOCOAT®
• Cubierta de concentrado (0.5 –
1.0mm) sobre ripio de soporte
• Ripio de soporte +4mm – 25 mm
• Espacios libres permiten alta
permeabilidad
Flujo de Aire
Flujo de Solucion
clonamientoBalance térmico
GEOCOAT®
La acumulación de calor en la pila es determinada por el balance entre la tasa de lixiviación , la tasa de
riego y la tasa de aireación combinada con las condiciones de borde.
Conducción
RadiaciónConvección Evaporación
Aireación
Soluciónes
Condición de borde
Condición de Borde
Transporte de solución y
aire al interior de la pila
La energía es generada por
las reacciones de lixiviación
Irrigación
Aireación y Evaporación
Las reacciones
generan calor en
la pila
Temperatura C°
Evaporación
condensación
Accumulación de Temperatura
Perdida de calor y calor en soluciones de riego
Temperatura ideal
Aireación
Riego
Sobre irrigación enfríaSobre aireación enfría
Balance térmico GEOCOAT®
Pro
fun
did
ad
m
20 70
0
8
Inóculos microbiológicos
• Obtenidos a partir de Bancos de microorganismos pre adaptados a los concentrados de Pucobre y entregados por el Dr Greg Olsen, Little Bear laboratories, Inc ( Geosynfuels, Golden, CO).
• Campañas de bioprospección realizadas en el norte de Chile. Lugares impactados por la industria minera y seleccionados de acuerdo a su capacidad de biolixiviar concentrados calcopirítico en pruebas de matraces.
• drenajes ácidos de minas.• soluciones ricas de percolación.• tranques de relaves (Chañaral). • rio salado y caleta palitos.• fuentes termales del norte de Chile en particular las
termas de rio Negro y El Tatio.
clonamiento
Zona alta
ZA
Zona
media ZM
Zona baja
ZB
Bio prospección de Inóculos
Concentrado de Calcopirita
Biolixiviación en matraz (1L)
Biolixiviación en tanque agitado (35L)
Biolixiviación en Columnas ( Cuarzo y Ripios , 2 y 6 m de altura)
Prelixiviación ácido/férrica en tanque (50L)
Generación de inóculo para
Generación de inóculo para
Análisis químicos,
granulométricos y
Mineralógicos
Análisis químicos,
granulométricos
Análisis de biodiversidad
y químicos
Análisis de
biodiversidad
y químicos
Análisis de
biodiversidad
y químicosAnálisis comparativos de
diversidad y abundancia
relativa por RFLP, T-RFLP
caracterización de
especies dominantes por
clonamiento y
secuenciación
Análisis químicos
comparativos
Composición mineralógica global ESPECIES % PESO %S %Cu %Fe %Zn %As
CALCOPIRITA 52,68 18,44 18,23 16,02
COVELINA 0,11 0,04 0,08
ENARGITA 0,05 0,02 0,03 0,01
PIRITA 27,73 14,81 12,92
ESFALERITA 0,05 0,02 0,03
MAGNETITA 2,78 2,01
HEMATITA 1,36 0,95
LIMONITA 0,05 0,03
RUTILO 0,05
GANGA 15,12 (*)
TOTAL 100,00 33,32 18,33 31,93 0,03 0,01
Composición mineralógica 100% base minerales sulfurados de cobre ESPECIES % PESO %S %CU %Fe
CALCOPIRITA 99,68 22,87 34,49 30,30
COVELINA 0,22 0,05 0,14
ENARGITA 0,10 0,02 0,05 0,01
TOTAL 100,00 22,94 34,68 30,31
Asociaciones mineralógicas de sulfurados de cobre (por especies)
ESPECIES Libre Asoc. Gn. Asoc. Py
Incluí. Gn.
Inc. Py/Gn TOTAL
CALCOPIRITA 93,09 2,19 3,84 0,77 0,11 100,00
COVELINA 50,00 50,00 100,00
ENARGITA 100,00 100,00
Asociaciones mineralógicas de sulfurados de cobre (% Cu)
ESPECIES Libre Asoc. Gn. Asoc. Py
Incluí. Gn.
Inc. Py/Gn TOTAL
CALCOPIRITA 32,11 0,76 1,32 0,27 0,04 34,49
COVELINA 0,07 0,07 0,14
ENARGITA 0,05 0,05
TOTAL 32,23 0,83 1,32 0,27 0,04 34,68
Grado de liberación de cobre Libre Asociado Ocluido TOTAL
92,91 6,20 0,89 100,00
Análisis mineralógicos concentrado calcopirítico.
TRFLP
LEY
Muestra S
%
Cu
%
Fe
%
As
%
Ag
g/T
Au
g/T
Cl-
%
CaCO3
%
Si
%
Concentrado Rougher 29.93 17.75 26.04 0.02 29.40 3.95 0.08 2.88 3.29
Muestras Pre
Lixiviado
Leyes
S CuT FeT Cl- As Ag Au CaCO3 Si
% % % % % g/T g/T % %
Termófilos (Ripios) 29.66 17.75 25.48 0.081 0.016 34.9 4.09 2.96 3.21
Moderados (Ripios) 29.93 17.05 26.04 0.081 0.019 29.4 3.95 2.88 3.29
Mesófilas (Ripios) 30.1 16.95 25.46 0.081 0.019 31.5 3.74 2.84 2.96
Termófilos(Cuartiza) 29.61 16.95 25.82 0.088 0.018 28.4 3.24 2.87 3.06
Moderados (Cuartiza) 30.04 17.15 26.24 0.075 0.019 28.6 4.24 2.88 2.78
Mesófilas (Cuartiza) 30.1 17.25 26.36 0.075 0.020 30.1 4.08 2.94 2.83
B) pre-lixiviados mediante agitación ácida Férrica (10grL/Fe3+
)
A) Recibido
Caracterización química de los concentrados
calcopiríticos
Vista panorámica del deposito de ripios de biolixiviación dispuesto en Planta Biocobre.
En la actualidad Planta Biocobre dispone de más de 7 Millones de Toneladas de Ripios de biolixiviación en 5 niveles o
bancos superpuestos de 10 mts de altura cada uno. Muestras de estos ripios fueron lavadas y seleccionadas
granulométricamente ( 3 a 12 mm) para ser usadas como matriz soporte en pruebas de biolixiviación en columnas de
concentrados de flotación de mineral de calcopirita.
1
2
3
4
5
clonamiento
Muestra
Roca Soporte
Leyes
S CuT FeT Cl- As Ag Au CaCO3 SiO2
% % % % % g/T g/T % %
Ripios 3.34 0.41 11.39 0.102 0.007 3.3 0.14 1.76 25.01
Cuarzo 0.03 0.00 0.00 0.012 0.002 0.0 0.0 0.27 99.58
Análisis químicos de la fracción utilizada de ripios de
lixiviación (Biocobre) y de las muestras de Cuarzo utilizados
como roca soporte.
Determinación mediante técnica de Digestión ácida y determinación de minerales mediante
espectrometría de Absorción Atómica (AAS)
(a)
(c)
(b)
(d)
Imágenes de muestras de los minerales utilizados en pruebas de biolixiviación.
Como roca soporte (a,b) y del concentrado calcopirítico (c), utilizado en las pruebas de biolixiviación en columnas.
Imágenes del mineral de Ripio lavado del desecho lixiviación de Planta Biocobre (a), de mineral de cuarzo lavado (b), del
concentrado calcopirítico recibido (c). Vista superior del concentrado ya aglomerado sobre roca soporte (d), y cargado en
la columna de biolixiviación.
termocupla
controlador
Aire
CO2
2%
Agitación
300 rpm3 L /min
Pulpa:
•5 % sólidos
•pH < 1,5
•Volumen total 50 L
•Volumen operación 35L
Bafles polipropileno
cinta calefactora
aislante térmico
Reactor
polipropileno
Hélice
Acero inoxidable
burbujeador
Concentrado Aglomerado
12 L /hr/m2
Análisis
pH, Eh, Cu T, Fe T, ácidoSolución percolación
Aire
CO2
2%
Solución riego
Concentrado
calcopirítico
Roca
Soporte
Bomba
peristáltica
bolitas de
polipropileno
bolitas de
polipropileno
Análisis Gas
Consumo O2
Cinta calefactor
Termocupla
Controlador
2 L / min.
Ajuste pH =1,5
Columna polipropileno
1mm
Aislante
clonamiento
La inoculación de las experiencias se realizo en dos etapas:
1.- Inoculación primaria, en la etapa de aglomeración en la pulpa de los
concentrados agregada sobre las distintas matrices de roca soporte a una
densidad de siembra de 1,5 X107 células por gramo de concentrado.
2.- En las soluciones de riego de las columnas a una densidad de inoculación de
1,5 X108 Células por ml de solución. En ambos casos la densidad celular fue
determinada mediante conteo de microorganismos por microscopia de luz en
una cámara de Petroff Houser.
Inoculación de las experiencias
Protocolo de Inoculación:
• 1. Pruebas de lixiviación Batch: Reactor de tanque agitado
• 2. Pruebas en columnas
• 3. Análisis moleculares
Resultados
A)
B)
C)
D)
Resultados de las pruebas de biolixiviación por Agitación a 38º, 49º y 69ºC. (valores promedio de
pruebas en duplicado).
A) % de disolución de Cu en la pulpa; B) Concentración de Fe (gr./l) en la pulpa, C) Variación en el pH en la pulpa, D) Variación del
Potencial Electroquímico (Eh respecto al electrodo de platino) en la pulpa. Condiciones operacionales, de 5% sólidos de
concentrado calcopiritico 17,5 % Cu, 35 lts totales de operación, agitación (300rpm) y efectuadas a temperaturas Mesofílicas,
Termofílicas Moderadas y Termofílicas Extremas ( 38°, 49° y 69° C, respectivamente).
Oxidación de Cu sulfurado (%), a partir de análisis de sólidos en columnas de biolixiviación.
Datos obtenidos a partir de muestras sólidas a 38, 64, 84 y 96 días de operación mediante digestión ácida de minerales
muestreados de pruebas realizadas a temperaturas de operación de microorganismos Termófilos, Moderados y Mesófilos (70°, 50°
y 38° C respectivamente) de concentrado calcopirítico de flotación aglomerado sobre matriz soporte de ripios de lixiviación lavados o
bien sobre mineral de cuarzo lavado.
A)
B)
Concentración de Cu (A) y Fe (B) (gr./l) disuelto en las soluciones de biolixiviación recirculadas por cada columna, medio
mediante AAS.
Concentraciones obtenidas mediante AAS de soluciones de percolación obtenidas de pruebas de biolixiviación de concentrado
calcopirítico aglomerado sobre matriz soporte de ripios lavados de lixiviación o sobre mineral lavado de cuarzo. Experiencias
realizadas a temperaturas de operación características de microorganismos Termófilos, Moderados y Mesófilas (70°, 50° o 38°C
respectivamente).
B)
A) C)
D)
Parámetros Cinéticos de las solubilización de cobre y fierro en experiencias en columnas, en relación a la variación de pH y de Potencial
electroquímico Eh del medio lixiviante.
A) % de disolución de Cu; B) % de disolución de Fierro; C) Variación del pH y D) Variación de Potencial Electroquímico Eh en la solución de
biolixiviación de cada columna. Datos generados partir del análisis de las soluciones de biolixiviación de cada una de las columnas mediante AAS ( A
y B) y mediante medición con electrodo de pH Ag/AgCl (para C) y electrodo de Platino ( para D). Muestras tomadas y o medidas de cada una de las
soluciones percoladas provenientes de las columnas cargadas con concentrados calcopiríticos aglomerados en torno a una partícula soporte de
Ripios o de cuarzo y biolixiviadas a temperaturas propias de microorganismos Mesófilos, Termófilos Moderados y Termófilos Extremos
A)
B)
C)
D)
Resultados de proyecciones de la cinéticas industriales de procesamiento de mineral a partir de los datos de consumos y de disolución
de Cu por columna.
A) consumo de ácido Total por columna; B) Proyección del consumo Neto de ácido; C) Tasa (en % diario) de solubilización de cobre por columna.
D) Proyección tasa diaria de consumo de ácido por tonelada de concentrado al día. Proyección de consumos Netos en plantas de SX-EW a tres
distintas temperaturas de operación del proceso de biolixiviación (Termo, Mod y Meso equivalentes a 70°, 50° y 38°C respectivamente),
concentrados aglomerados sobre matriz de ripios de lixiviación lavados o sobre mineral lavado de cuarzo. Calculado a partir de valores de consumo
total de ácido en pruebas de biolixiviación menos los equivalentes ácidos derivados del crédito estimado de ácido generado en la etapa de electro
depositación del cátodo de cobre. (1,54 kg H2SO4 por kg de cátodo electro depositado).
LIAP
Laboratorio de Investigación Aplicada
1 2 3 4 5 6 7 81 2 3 4 5 6 7 8
Consorcio de Cultivos Mesófilos (25-45ºC)
- 5 gr. Calcopirita- 5 gr. Rougher
- 1 gr. Azufre
- 400 ml Medio Basal + 25g/L sulfato ferroso
33ºC
Cultivo precipitado durante 30 min. Cultivo homogenizado
4 semanas
de cultivo
Se toma solo el sobrenadante Se toma del Homogenizado
50 ml
por tubo
50 ml
por tubo
4000 rpm 90 min 4000 rpm 90 min
El pellet fue lavado
con agua ácida ( X3)
El pellet fue lavado
con agua ácida ( X3)
El pellet fue lavado con
PBS-Tween 20 ( X3)El pellet fue lavado con
PBS-Tween 20 ( X3)
Centrifugar en Speed Vac para
secar el pellet, 40 minCentrifugar 13.000 rpm 3 min
0.5 gr para Kit MoBioPellet para
Kit Wizard
OBTENCIÓN DNA GENÓMICO
Pellet para
Kit MoBio
Extracción de DNA metagenómico
1000 pb
1500 pb
Marc
ador
Mesófilo
s (
MoB
io)
Term
ófilo
s M
odera
dos (
MoB
io)
Term
ófilo
s E
xtr
em
os (
MoB
io)
Term
ófilo
s E
xtr
em
os (
Wiz
ard
)
Term
ófilo
s E
xtr
em
os (
Baño)
Acid
ithio
bacill
us f
err
ooxid
ans
Marc
ador
500 pb
Una vez estandarizada las
condiciones de PCR se procedió a
amplificar el gen 16S rDNA para los
distintos consorcios bacterianos
mesófilos, termófilos moderado y
termófilos extremo.
Electroforesis en gel de agarosa 1%.
1 2 3 4 5 6 7
1000 pb
1500 pb
Marc
ador
(100 p
b)
Mesófilo
s (
MoB
io)
Term
ófilo
s M
odera
dos (
MoB
io)
Term
ófilo
s E
xtr
em
os (
MoB
io)
Term
ófilo
s E
xtr
em
os (
Baño)
Term
ófilo
s E
xtr
em
os (
Wiz
ard
)
Acid
ithio
bacill
us f
err
ooxid
ans (
MoB
io)
Reacción en cadena de la polimerasa
PCR
500 pb
Acidithiobacillus ferrooxidans aportado por C. Jerez
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
M M M MTM TM TM TMHae III MspI AluI HhaI Leader (bp)
50 100
Visualización de los patrones de RFLP de productos de PCR del 16s
rDNA de mesófilos (M) y termófilos moderados (TM) extraídos de
pruebas de tanque agitado y digeridos con cuatro enzimas distintas
Gel de acrilamida teñido con plata. Líneas (1) leader 50bp, 2) HaeIII mesófilo, 3) HaeIII t. moderado, 4) MspI mesófilo,
5) MspI t. moderado, 6) AluI mesófilo, 7) AluI t. moderado, 8) HhaI mesófilo, 9) HhaI t. moderado, 10) leader 50bp, 11)
leader 100bp. En círculos rojos se muestran las bandas que parecieran ser compartidas entre los distintos
tratamientos (mesófilas y termófilos moderados).
Estudio de las comunidades biolixiviantes
Clonamiento y secuenciación.
Muestra de algunos de los patrones de RFLP
digeridos con HaeIII de muestras de los 16S rDNA
clonadas.
Los patrones de RFLP obtenidos fueron utilizados para determinar el factor de cobertura de la biblioteca de
clones creada. Patrón leader de 50 pb en primera y última banda , imágenes muestran el número de placa de petri
chequeada y número del clon de la respectiva placa , se incorpora letra que adjudica el patrón de corte a un ribotipo
específico de acuerdo a la placa chequeada.
TABLA VI:
Caracterización de las secuencias de 16S rRNA clonales de acuerdo a su similitud
con las secuencias de bases de datos para bacterias de NCBI.
INOCULOS T_RFLP in silico
Tratamiento N Clon Organismo Relacionado % Identidad E N Acceso Hae III HhaI AluI
Inoculo Meso 2-.28 Sulfobacillus disulfidooxidans 99,5 0 U34974 152 225 232
Inoculo Meso 2-.42 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,5 0 DQ909079 308 262 289
Inoculo Meso 2-.43 Sulfobacillus thermosulfidooxidans 93,1 0 AB089844 137 71 239
Inoculo Meso 2-.8 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,5 0 CP001132 170 206 275
Inoculo Meso 2-.82 Uncultured Sulfobacillus 95,7 0 EF612379 217 149 318
Inoculo Meso 2-.92 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,5 0 CP001219 251 203 232
Inoculo Meso 5-.17 Acidithiobacillus ferrooxidans 96,1 0 DQ529309 169 204 276
Inoculo Meso 5-.2 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,2 0 CP001219 251 203 232
Inoculo Meso 5-.44 Acidithiobacillus ferrooxidans 95,8 0 DQ676505 251 203 232
Inoculo T. Ext 9-.39 Sulfobacillus thermosulfidooxidans 99,4 0 AB089845 130 140 178
Inoculo T. Ext 11-.17 Sulfobacillus thermosulfidooxidans 99,8 0 AB089844 130 140 177
Análisis comparativo de secuencias de 16SrDNA obtenida de los clones mediante secuenciación de los 16SrDNA amplificados
a partir de muestras de DNA genómico de pulpas de experiencias de lixiviación en matraces, 5% p/v concentrado
calcopirítico.
TABLA VI:
Caracterización de las secuencias de 16S rRNA clonales de acuerdo a su similitud
con las secuencias de bases de datos para bacterias de NCBI.
TANQUE AGITADO T_RFLP in silico
Tratamiento N Clon Organismo Relacionado % Id E N Acceso Hae III HhaI AluI
Batch Meso 30A Acidithiobacillus caldus 98,2 0 DQ470072 215 563 231
Batch Meso 33A Leptospirillum ferriphilum 96,4 0 DQ 534052 190 376 218
Batch Meso 34A Thermophilic bacterium 97 0 EF199989 216 563 230
Batch Meso 35A Uncultured Leptospirillum 88,7 2,43E-120 FJ890907 143 328 171
Batch Mod 15B Leptospirillum ferriphilum 93,7 0 DQ 534052 145 329 172
Batch Mod 40B Sulfobacillus thermosulfidooxidans 95,4 0 EU499919 130 140 177
Batch Mod 50B Curvibacter lanceolatus 95,6 0 GU368379 220 207 368
Batch Mod 19B Cupriavidus metallidurans 98,1 0 CP000352 203 70 157
Batch T.Ext 46C Cupriavidus metallidurans 98,5 0 CP000353 203 70 157
Batch T.Ext 56C Leptospirillum ferriphilum 96,7 0 NR_028818 127 137 202
Batch T.Ext 58C Leptospirillum ferriphilum 96,9 0 DQ534052 190 563 230
Batch T.Ext 59C Leptospirillum ferriphilum 98,1 0 AF356830 197 328 224
Batch T.Ext 68C Acidithiobacillus caldus 97,7 0 EU499920 216 503 230
Análisis comparativo de secuencias de 16SrDNA obtenida de los clones mediante secuenciación de los 16SrDNA
amplificados a partir de muestras de DNA genómico de pulpas de experiencias de lixiviación en tanques agitados 5% p/v
concentrado calcopirítico.
TABLA VI:
Caracterización de las secuencias de 16S rRNA clonales de acuerdo a su similitud con las
secuencias de bases de datos para bacterias de NCBI.
COLUMNAS CONCENTRADO CALCOPIRITICO T_RFLP in silico
Tratamiento N Clon Organismo Relacionado % Identidad E N Acceso Hae III HhaI AluI
Ripio Meso 1-.29 Acidithiobacillus ferrooxidans 97,5 0 FN400770 251 203 232
Ripio Meso 1-.33 Acidithiobacillus ferrooxidans 100 0 DQ676505 251 203 232
Ripio Meso 1-.38 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,9 0 AM502931 251 203 232
Ripio Meso 4-.24 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,5 0 CP001132 170 206 275
Ripio Meso 4-.39 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,9 0 CP001219 251 203 232
Ripio Mod 14-.16 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,4 0 CP001132 170 206 275
Ripio Mod 14-.23 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,4 0 DQ909079 308 262 289
Ripio Mod 14-.65 Acidithiobacillus ferrooxidans 98,8 0 CP001219 251 203 232
Ripio Mod m75 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,8 0 DQ676505 251 203 232
Ripio Mod m77 Acidithiobacillus albertensis 99,3 0 NR_028982 251 203 274
Ripio Mod m78 Acidithiobacillus ferrooxidans 100 0 AM502931 232 186 212
Cuarzo Mod 3-.40 Acidithiobacillus thiooxidans 97,2 0 EU084706 226 181 207
Cuarzo Mod 3-.41 Acidithiobacillus thiooxidans 99,8 0 EU084705 226 180 207
Cuarzo Mod 8-.11 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,6 0 CP001219 251 203 232
Cuarzo Mod 8-.41 Acidithiobacillus albertensis 99,9 0 NR_028982 251 203 232
Ripio T. Ext 12-.49 Acidithiobacillus ferrooxidans 97,7 0 AM502931 251 203 232
Ripio T. Ext 12-.64 Acidithiobacillus ferrooxidans 99,6 0 CP001132 170 206 275
Análisis comparativo de secuencias de 16SrDNA obtenida de los clones mediante secuenciación de los 16SrDNA
amplificados a partir de muestras de DNA genómico de sólidos de experiencias de lixiviación en Columnas 20 % p/p
concentrado calcopirítico.
2.- Amplificación
por PCR de genes
16S rRNA3.- Digestión con enzimas de
restricción
1.- Toma de muestras y extracción de DNA
4.- secuenciación y detección de
fragmentos marcados 5.- Ploteo de resultados
6.-Asignación de acuerdo a TRFLP in
Silico.
T-RFLP
Análisis de los polimorfismos de los fragmentos
Terminales por electroforesis capilar
Estudio de las comunidades biolixiviantes
(e)
(b)
(g)
(d)
(a) (c)
(f)
(i)(h)
A. ferrooxidans 251 nt..
A. tiooxidans 226 nt. A. ferrooxidans 203 nt.
A. ferrooxidans 232 nt.
A. albertensis 274 nt.S. disulfooxidans 230 nt.
L. ferriphillum 376 nt.
C. matalidurans 157. nt
A. ferrooxidans sp 170.
L. ferriphillum 190 nt.
Representación de los perfiles de T-RFLP de las secuencias de 16S rDNA extraídas de los consorcios crecidos en las
pruebas de biolixiviación en columnas aglomeradas en torno a Ripios de biolixiviación como roca soporte.
Abundancia relativa (%) de T-RFLP de 16S rDNA obtenidos utilizando las endonucleasas HaeIII (a,d,g), Hha I (b,e,h) y Alu I ( c,f,i).
Perfiles de T-RFLP obtenidos de experiencias en condiciones de operación Mesofílicas (a,b,c) , Termofílicas Moderadas (d,e,f) y
Termofílicas Extremas ( g,h,i). Flechas rojas corresponden a asignación de Grupo según TRFLP in silico con cada endonucleasa
estudiara y fueron obtenidos mediante secuenciación de 16S rDNA clonales.
(a)
(c)
(e) (f)
(d)
(b)A. ferrooxidans 251 nt.
A. ferrooxidans 170 nt..
A. tiooxidans 226 nt.
A. caldus 215 nt.
L. Ferriphillum 145 nt.
S. termosulfooxidans 130 nt.
C. metalidurans 203 nt.L. Ferriphillum 190 nt.
L. ferriphillum 190 nt.
A. tiooxidans 232 nt.
Representación de los perfiles de T-RFLP de las secuencias de 16S rDNA extraídas de los consorcios
crecidos en las pruebas de biolixiviación.
Abundancia relativa (%) de T-RFLP de 16S rDNA obtenidas de Tanques agitados (a,c,e) y de columnas aglomeradas en
torno a Ripios de biolixiviación como roca soporte (b,d,f). Perfiles de T-RFLP obtenidos utilizando endonucleasa Hae III.
Perfiles de T-RFLP obtenidos a partir de experiencias en condiciones de operación Mesofílicas (a,b) , Termofílicas
Moderadas (c,d,) y Termofílicas Extremas ( e,f). Flechas rojas corresponden a asignación según TRFLP in silico para HaeIII
obtenidos mediante secuenciación de 16S rDNA clonales.
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
Imágenes (SEM) Muestras de cuarzo recubierto a 90 días de operación.
Micrografía electrónica de barrido (SEM) de la superficie de cuarzo recubierto en concentrado calcopirítico al final del periodo
de biolixiviación en columna (90 días). Imágenes obtenidas de los biofilms a distinta magnificación ( de acuerdo a escala en
cada imagen) generados en condiciones Mesofílicas 38º ( a,d), Termofílicas Moderadas 50 º (b,e) y Termofílicas Extremas 69º
C (c,f).
•Las recuperaciones de Cobre están relacionadas con la
temperatura de operación de los reactores sean estos de tanque
agitado o de concentrados aglomerados sobre distintas matrices
minerales.
•En las pruebas de biolixiviación en columna a temperaturas
hipertermofílicas las recuperaciones de cobre se correlacionan con
potenciales electroquímicos moderados en relación a los
alcanzados en condiciones mesofílicas y termofílicas moderadas.
•Las diferentes temperaturas de operación pueden alterar
significativamente tanto la riqueza de especies como su
abundancia pero no causan una fuerte alteración en la estructura
de las comunidades bacterianas presentes, sobretodo al tratarse
de experiencias en columnas.
Recapitulando
•Independientemente de las temperaturas de operación las
comunidades que provienen de experiencias en columnas tienden
a mantenerse estables, pero las comunidades provenientes de
experiencias en tanques agitados y matraces presentan fuertes
cambios en su composición dependiendo de la temperatura de
operación.
•Las comunidades estaban mayormente dominadas por bacterias
del genero Acidithibacillus y Sulfobacillus no importando la
temperatura de operación aplicada.
•Los compuestos de iones férricos precipitados sobre las partículas
de mineral en condiciones hipertermofílicas y termofílicas
moderadas actúan como estructurador de los biofilms efecto que
no se aprecia al trabajar en condiciones mesofílicas.
Recapitulando
H2O
pH 7
NAD(P)H
NAD(P)H+
H+
H+
ADP + Pi
ATP
FeSO4+ CuSO4 + S°
+ H2SO4
H2SO4SO4=
Fe SO4
H+
Cu
FeS
2
Fe3+
SO4
Fe2(SO4)3
pH 1,5
Temperatura 70°C
pH 7
O2
O2
O2
O2
O2
O2
O2
Acidithiobacillus ferrooxidans
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