Estudios de ADN
Aplicación Forense,
Paternidad y Parentesco
Dr. Hugo TorioMSc. en Biotecnología Molecular (TUM)
Laboratorio CURIEAsunción – Paraguay
Tel: 200 447
Microsatélites
Short Tandem Repeat
En genética, los microsatélites son secuencias de ADN
en las que un fragmento se repite de manera
consecutiva.
La variación en el número de repeticiones crea
diferentes alelos.
Generalmente se encuentran en zonas no codificantes
del ADN.
Marcadores de STR Cromosomas Somáticos: D16S539, D7S820 D13S317,
F13A01, FESFPS, vWA, CSF1PO, TPOX, TH01, PENTA E, PENTA D, D8S1179, D3S1358, D5S818, F13B, LPL
Cromosoma X: DXS8378, DXS10135, DXS10148; DXS7132, DXS10074, DXS10079; HPRTB, DXS10101, DXS10103; DXS7423, DXS10134, DXS10146
Cromosoma Y: DYS389II, DYS439, DYS389I, DYS385a/b, DYS19, DYS437, DYS392, DYS390, DYS438, DYS393, DYS391
Información sobre STRs
http://www.cstl.nist.gov/strbase/
Other Names Chromosomal
Location
GenBank Accession
UniSTS: none reported 21q22.3
Chr 21; 43.880 Mb (May
2004, NCBI Build 35)
AP001752; has 13
repeats
Penta D
Repeat: [AAAGA] = top strand
Información sobre STRs
http://www.cstl.nist.gov/strbase/
Reported Primers Ref. PCR Primer Sequences
Set 1 Promega PowerPlex 16 (JOE labeled) primer
sequences
5'-[JOE]-GAAGGTCGAAGCTGAAGTG-3'
5'-ATTAGAATTCTTTAATCTGGACACAAG-
3'
Penta D
PCR Product Sizes of Observed Alleles
Allele (Repeat #) Set 1 Repeat Structure
7 399 bp [AAAGA]7
8 404 bp [AAAGA]8
9 409 bp [AAAGA]9
Mutation Rate: 0.14%
Frecuencias alélicas (STRs)http://www.promega.com/products/pm/genetic-identity/population-
statistics/allele-frequencies/
Caso X
De 12 Marcadores Moleculares (5 no coinciden)
(1) D16S539
Padre PAB HOR C+
12
11 11
12
12 11 13 9 13 11
(2) D7S820
PAB HOR C+
12
11
9
11
12 11 9* 11 9
* Alelos homocigotos
Padre
(3) D13S317
PAB HOR C+
12
9
8
12 9 11 9 13 9
Padre
(4) F13A01
PAB HOR C+
5 5
4
5* 4 3.2 5 4
* Alelos homocigotos
Padre
(5) FESFPS
PAB HOR C+
12
11
10
12
12 11 12 11 13 12
Padre
(6) vWA
PAB HOR C+
15
14
16
15 14 18 14 16 14
Padre
(7) CSF1PO
PAB HOR C+
12
11
9
10
12 11 13 12 13 12
Padre
(8) TPOX
PAB HOR C+
10
8
9
8
10 8 13 8 13 8
Padre
(9) TH01
PAB HOR C+
9.3
7
9.3
9.3 7 9 8 8 7
Padre
(10) LPL
PAB HOR C+
12
1010
12
12 10 10 9 12 9
Padre
(11) F13B
PAB HOR C+
9
8
10
9 8 9 6 10 9
Padre
(12) Penta E
14
12
5
PAB HOR C+
12* 16 14 14 12
* Alelos homocigotos
Padre
InformeAUTO CARATULADO: JUAN PABLO MORÁN AMARILLA
PRUEBA DE PCR FENOTIPOS OBSERVADOS CÁLCULOS DEL ÍNDICE DE PATERNIDAD
Marcadores de STR Alegado Padre Menor Madre X Y Indice de paternidad X/Y
D16S539 12 11 13 9 13 11 0 0 EXCLUYE
D7S820 12 11 9* 11 9 0 0 EXCLUYE
D13S317 12 9 11 9 13 9 0 0 EXCLUYE
F13A01 5* 4 3.2 5 4 0 0 EXCLUYE
FESFPS 12 11 12 11 13 12 0,5 0 EXCLUYE
vWA 15 14 18 14 16 14 0 0 EXCLUYE
CSF1PO 12 11 13 12 13 12 0,25 0 EXCLUYE
TPOX 10 8 13 8 13 8 0,25 0 EXCLUYE
TH01 9.3 7 9 8 8 7 0 0 EXCLUYE
LPL 12 10 10 9 12 9 0,25 0 EXCLUYE
F13B 9 8 9 6 10 9 0 0 EXCLUYE
Penta E 12* 16 14 14 12 0 0 EXCLUYE
ÍNDICE DE PATERNIDAD TOTAL (IP TOTAL) = EXCLUYE
PROBABILIDAD DE PATERNIDAD = EXCLUYE
* Alelos homocigotos
Cromosoma XAUTO CARATULADO: EJEMPLO
PRUEBA DE PCR HAPLOTIPOS OBSERVADOS CÁLCULOS DEL ÍNDICE DE HERMANDAD
Marcadores X-STR A. Hermana Hermana X Y Indice de hermandad X/Y
DXS8378 11 10 11
0,25 0,00945 26,45503DXS10135 27 21 23 21
DXS10148 27.1 26.1 27.1 25.1
DXS7132 16 14 14 12
0,25 0,00663 37,70739DXS10074 17 8 17 16
DXS10079 19 18 19 18
HPRTB 14 11 13 11
0,25 0,01061 23,56268DXS10101 30.2 29.2 30.2 28.2
DXS10103 19 17 19 16
DXS7423 16 15 15 14
0,25 0,00386 64,76684DXS10134 39 36 39 38
DXS10146 29 27 27 25
ÍNDICE DE HERMANDAD TOTAL (IH TOTAL) = 1522341
PROBABILIDAD DE HERMANDAD = 99,99993%
*Frecuencias de Haplotipos : http://www.chrx-str.org
Cromosoma Y
*Frecuencias de Haplotipos : http://www.yhrd.org
AUTO CARATULADO: EJEMPLO
PRUEBA DE PCR HAPLOTIPO OBSERVADO CÁLCULOS DEL ÍNDICE DE HERMANDAD
Marcadores Y-STR A. Hermano Hermano X Y Indice de hermandad X/Y
DYS389II 30 30
1 0,00003602 27762
DYS439 12 12
DYS389I 13 13
DYS385a/b 10 14 10 14
DYS19 14 14
DYS437 15 15
DYS392 13 13
DYS390 24 24
DYS438 12 12
DYS393 13 13
DYS391 11 11
ÍNDICE DE HERMANDAD (IH) TOTAL = 27762
PROBABILIDAD DE HERMANDAD = 99,99640%
Aplicación Forense
Aplicación Forense
Cementerio
InformeAUTO CARATULADO: EJEMPLO
PRUEBA DE PCR FENOTIPOS OBSERVADOS CÁLCULOS DEL ÍNDICE DE PATERNIDAD
Marcadores de STR Muestra Ósea Hija Madre X Y Indice de paternidad X/Y
D16S539 13 11 12 11 11 9 0 0 EXCLUYE
D7S820 12 10 11 11 0 0 EXCLUYE
D13S317 12 10 13 9 13 9 0 0 EXCLUYE
F13A01 3.2 5 3.2 5 3.2 0,5 0,225 2,22222
FESFPS 12 11 12 11 12 11 0,5 0,154 3,24675
vWA 17 18 18 17 0 0 EXCLUYE
CSF1PO 13 11 12 10 10 0 0 EXCLUYE
TPOX 12 8 11 11 8 0 0 EXCLUYE
TH01 8 7 9 8 9 0,5 0,107 4,67290
PENTA E 7 5 11 5 20 5 0 0 EXCLUYE
PENTA D 14 10 12 12 11 0 0 EXCLUYE
D8S1179 12 12 10 14 10 0,5 0,126 3,96825
D3S1358 18 16 17 14 17 16 0 0 EXCLUYE
D5S818 12 11 12 11 12 11 0,5 0,157 3,18471
F13B 8 6 10 8 10 9 0,25 0,129 1,93798
LPL 12 10 11 10 11 10 0,25 0,502 0,49801
HPRTB 11 14 13 13 0 0 EXCLUYE
ÍNDICE DE PATERNIDAD TOTAL (IP TOTAL) = EXCLUYE
PROBABILIDAD DE PATERNIDAD = EXCLUYE
Mancha de SangreAUTO CARATULADO: MUESTRAS M4/M5*
PRUEBA DE PCR FENOTIPOS OBSERVADOS CÁLCULOS DEL ÍNDICE DE MATERNIDAD
Marcadores de STR Madre del fallecido Muestras M4/M5 X Y Indice de Maternidad X/Y
D16S539 13 11 11 9 0,25 0,202 1,23762
D7S820 11 9 12 10 0 0 EXCLUYE
D13S317 11 13 12 0 0 EXCLUYE
F13A01 7 6 7 3.2 0,25 0,227 1,10132
FESFPS 11 11 10 0,5 0,452 1,10619
vWA 18 17 17 16 0,25 0,267 0,93633
CSF1PO 13 12 14 11 0 0 EXCLUYE
TPOX 8 11 8 0,5 0,562 0,88968
TH01 7 6 8 6 0,25 0,290 0,86207
PENTA D 9 13 9 0,5 0,186 2,68817
ÍNDICE DE MATERNIDAD TOTAL (IP TOTAL) = EXCLUYE
PROBABILIDAD DE MATERNIDAD = EXCLUYE
*Obs: Las muestras M4 y M5 fueron procesadas individualmente. Ambas presentan el mismo perfil genético.
Monozygotic (MZ) twins are considered being genetically identical, therefore theycannot be differentiated using standard forensic DNA testing.
Here we describe how identification of extremely rare mutations by ultra-deep nextgeneration sequencing can solve such cases.
We sequenced DNA from sperm samples of two twins and from a blood sample of the child of one twin.
Bioinformatics analysis revealed five single nucleotide polymorphisms (SNPs) present in the twin father and the child, but not in the twin uncle.
The SNPs were confirmed by classical Sanger sequencing.
Our results give experimental evidence for the hypothesis that rare mutations willoccur early after the human blastocyst has split into two, the origin of twins, and thatsuch mutations will be carried on into somatic tissue and the germline.
The method provides a solution to solve paternity and forensic cases involvingmonozygotic twins as alleged fathers or originators of DNA traces.
Finding the needle in the haystack: Differentiating “identical” twins in
paternity testing and forensics by ultra-deep next generation
sequencing
Forensic Science International: Genetics
Volume 9, Pages 42–46, March 2014
J. Weber-Lehmann, E. Schilling, G. Gradl, D.C. Richter, J.
Wiehler, B. Rolf
Resultados
Chromosome 04
snp188267982
Chromosome 06
snp41885722
Chromosome 11
snp68781324
Chromosome 14
snp103545720
Chromosome 15
cnp57884799
Mother buccal
mucosaC/C A/A C/C G/G C/C
Child blood C/T (50/50) G/A (50/50) C/T (50/50) A/G (50/50) C/T (50/50)
Twin uncle sperm C/C A/A C/C G/G C/C
Twin uncle buccal
mucosaC/C A/A C/C G/G C/C
Twin uncle blood C/C A/A C/C G/G C/C
Twin father sperm C/T (80/20) G/A (70/30) C/T (80/20) A/G (50/50) C/T (50/50)
Twin father buccal
mucosaC/T (80/20) G/A (75/25) C/C A/G (60/40) C/T (50/50)
Twin father blood C/C A/A C/C G/G C/T (80/20)
Genotypes of the identified SNPs in mother, child and twins. The SNP number refers to an
alignment to the human genome sequence build GRCh37.p10. The figures given in brackets next to
the genotypes are the mixture ratios in % and were estimated from the Sanger sequencing results.
Resultados
NGS results of the SNP on chromosome 4. Results for child, twin uncle and
twin father are visualized with the IGV Viewer. The SNP is in the middle of the
panel (color code: C blue, T red, A green, G brown) and is highlighted with a
red arrow.
Resultados
Sequence of the SNP on chromosome 04. The SNP has position
snp188,267,982. The affected position is highlighted with a red arrow.
LABORATORIO CURIE
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Estudio de material genético ADN/ARN
Muchas gracias por la atención
Dr. Hugo Torio: [email protected]