ES 2
525
954
B1
19 OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCAS
ESPAÑA 11
21
Número de publicación: 2 525 954Número de solicitud: 201330777
51 Int. CI.:
C12N 9/24 (2006.01)
A61K 38/47 (2006.01)
A61P 31/04 (2006.01)
12 PATENTE DE INVENCIÓN B1
54 Título: ENZIBIÓTICOS BACTERICIDAS MEJORADOS FRENTE A NEUMOCOCO Y OTRASBACTERIAS
73 Titular/es:
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONESCIENTÍFICAS (CSIC) (90.0%)SERRANO, 11728006 MADRID (Madrid) ES yCIBER ENFERMEDADES RESPIRATORIAS(CIBERES) (10.0%)
72 Inventor/es:
GARCÍA GONZÁLEZ, Pedro;MENÉNDEZ FERNÁNDEZ, Margarita;GARCÍA LÓPEZ , Ernesto;DÍEZ MARTÍNEZ, Roberto;DE PAZ FERNÁNDEZ, Héctor yBUSTAMANTE SPUCH, Noemi
74 Agente/Representante:
UNGRÍA LÓPEZ, Javier
22 Fecha de presentación:
28.05.2013
43 Fecha de publicación de la solicitud:
02.01.2015
Fecha de la concesión:
16.10.2015
45 Fecha de publicación de la concesión:
23.10.2015
56 Se remite a la solicitud internacional:
PCT/ES2014/070429
Fecha de publicación de la mención al informe debúsqueda internacional:14.01.2015
57 Resumen:Enzibióticos bactericidas mejorados frente aneumococo y otras bacterias.La presente invención se encuadra dentro del campode la biotecnología. En la presente invención sepresenta una secuencia polipeptídica derivada delmódulo de unión a pared del enzima lítica del fagoCp7 (Cpl-7), que permite la construcción de nuevasenzimas líticas con actividad bactericida mejorada yamplio espectro. Igualmente, en esta invención seincluyen enzimas quiméricas que contienen dichomódulo de unión a pared mejorado y se dan ejemplosde su actividad frente a especies Gram-positivas yGram-negativas.
Se puede realizar consulta prevista por el art. 37.3.8 LP.Aviso:
DESCRIPCiÓN
ENZIBIÓTICOS BACTERICIDAS MEJORADOS FRENTE A NEUMOCOCO Y OTRAS
BACTERIAS
SECTOR Y OBJETO DE LA INVENCiÓN
5 La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. Más
concretamente, la presente invención se refiere a un polipéptido que se une a la pared
celular de diversos microorganismos (módulo de unión a pared) derivado de la enzima lítica
del fago Cp-7 de Streptococcus pneumoniae. A este módulo de unión a pared se le pueden
acoplar, mediante técnicas de biología molecular, diversos módulos catalíticos que degradan
10 la pared bacteriana (mureín-hidrolasas) lo que genera enzimas líticas con un efecto
bactericida tanto en neumococo como en otras bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.
ESTADO DE LA TECNICA
Streptococcus pneumoniae, o neumococo, es un patógeno Gram-positivo y el principal
agente causal de enfermedades infecciosas tan importantes como neumonía, sepsis y
15 meningitis. Los grupos de población más afectados son los niños menores de cinco años,
los ancianos y los pacientes inmunodeprimidos. De hecho, según estimaciones recientes de
la Organización Mundial de la Salud neumococo es la causa más común de las neumonías
severas en niños de esas edades, tanto en países desarrollados como en los que están en
vías de desarrollo (UNICEF, WHO, 2006. Pneumonia: the forgotten killer of
20 children.http://www.unicef.org/spanish/publications/files/Pneumonia_ The_Forgotten_Killer_of
_Children.pdf). En general, la tasa de mortalidad de las infecciones neumocócicas en la
población pediátrica es mayor que la provocada por el SIDA, la malaria y el sarampión
juntos (Wardlaw et al. 2006. Lancet 368: 1048-1050; Rudan y Campbell. 2009. Lancet 374:
854-856).
25 En los últimos años se ha producido un generalizado incremento de cepas clínicas de
neumococo resistentes a una variedad de antibióticos, sobre todo a los ¡3-lactámicos, lo que
está provocando la búsqueda urgente de otros tratamientos o terapias alternativas para
combatir este patógeno. En este contexto, el uso de mureín-hidrolasas líticas (enzimas que
degradan de forma específica y eficaz el peptidoglicano bacteriano) codificadas por
30 bacterias o bacteriófagos constituye una prometedora línea de investigación para luchar
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contra las infecciones bacterianas. Ya se ha demostrado que este tipo de enzimas
(denominadas enzibióticos) son eficaces para matar "in vivo" determinadas bacterias en una
variedad de modelos animales (Fenton et al. 2010. Bioeng. Bugs 1: 9-16; Fischetti, VA.
2011. Bacteriophage 1:1-7).
5 En el sistema de neumococo se han descrito varias mureín-hidrolasas, tanto bacterianas
como fágicas (Hermoso et al. 2007. Curr. Opino Microbiol. 10: 461-472). Todas ellas son
enzimas modulares con un dominio responsable de la catálisis y otro de la unión al sustrato
insoluble que es la pared celular. Todas estas enzimas con actividad mureín-hidrolasa son,
con excepción de Cpl-7, dependientes de la presencia del aminoalcohol colina para su
10 actividad enzimática. La lisozima Cpl-7, codificada por el fago Cp-7, es capaz de degradar
paredes de neumococo conteniendo tanto colina como su análogo estructural etanolamina.
Cpl-7 contiene un dominio de unión a la pared celular (C-Cpl-7), formado por tres
repeticiones idénticas (motivos CW_7), completamente diferente al que comparten las otras
enzimas colina-dependientes, lo que explica este comportamiento (García et al. 1990. Gene
15 86: 81-88). Hasta el momento se ha demostrado la efectividad como agentes
antibacterianos de Pal (Loeffler et al. 2001. Science 294: 2170-2172), Cpl-1 (Jado et al.
2003. J. Antimicrob. Chemother. 52: 967-973) y LytA (Rodríguez-Cerrato et al. 2007.
Antimicrob. Agents Chemother. 51: 3371-3373) usando diferentes modelos animales de
infección neumocócica.
20 EXPLlCACION DE LA INVENCiÓN
El objeto principal de la presente invención es la construcción de nuevas mureín-hidrolasas
capaces de degradar muy eficazmente la pared celular de neumococo y de otras especies
bacterianas. Los inventores han modificado sustancialmente el módulo de unión a la pared
bacteriana de la lisozima del fago Cp7 de S. pneumoniae, reduciendo su elevada carga neta
25 negativa, para disminuir las interacciones electrostáticas desfavorables que se establecen
entre la envuelta celular (negativamente cargada) y la enzima cuando ésta actúa desde el
exterior de la bacteria (Low et al. 2011. J. Biol. Chem. 286: 34391-34403). Las
modificaciones introducidas en las tres repeticiones que constituyen el módulo de unión al
sustrato (C-Cpl-7) provocan que tenga mayor facilidad de acceso e interacción con la pared
30 bacteriana (peptidoglicano) y, en consecuencia, su capacidad lítica y bactericida sea mayor
que la de la Cpl-7 silvestre, no solo frente a S. pneumoniae sino también frente a otras
bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. En el caso de neumococo, la gran capacidad
bactericida de las nuevas construcciones que emplean este módulo de unión a pared
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mejorado se extiende también a cepas multirresistentes a diversos antibióticos de amplia
importancia clínica.
Asimismo, esta invención también aporta otras construcciones quiméricas que emplean el
mismo módulo de unión a la pared celular, combinado con módulos catalíticos mejorados
5 de Cpl-7 o Cpl-1, lo que demuestra la amplia versatilidad de enzibióticos que se pueden
construir empleando las enzimas líticas ya conocidas.
EXPLICACiÓN DETALLADA DE LA INVENCION
La presente invención describe una secuencia polipeptídica derivada del módulo de unión a
pared del enzima lítica del fago Cp7 (Cpl-7), que permite la construcción de nuevas enzimas
10 líticas con actividad bactericida mejorada y amplio espectro mediante la modificación de, al
menos, 15 aminoácidos clave en la secuencia original o parental de partida C-Cpl-7.
Igualmente, se describe la secuencia de nucleótidos codificante de dicho módulo así como
construcciones genéticas derivadas que incluyen módulos catalíticos procedentes de otros
fagos, o de Cpl-7 mejorados, que permiten la construcción de nuevas enzimas líticas con
15 actividad bactericida mejorada y amplio espectro.
El punto de partida fue el módulo de unión a pared del enzima lítica del fago Cp7 (Cpl-7)
descrito en (García et al. 1990. Gene 86: 81-88). El procedimiento de mejora modificó la
carga neta de las tres repeticiones que forman el dominio de unión a pared (C-Cpl-7) sin que
los cambios de secuencia introducidos alteren el plegamiento de la proteína. La selección de
20 las posiciones a modificar y el tipo de mutación introducida en cada posición se llevó a cabo
teniendo en cuenta la conservación de secuencias dentro de la familia CW_7 (PF08230) y
los modelos a alta resolución previamente generados para N-Cpl-7 (dominio catalítico N-
terminal) y C-Cpl-7 (Bustamante et al. 2010. J. Biol. Chem. 285:33184-33196).
Esta adaptación permite una sustancial mejora de la capacidad de unión del módulo
25 peptídico de unión a pared, lo que combinado con su amplio espectro de bacterias a las que
se une, lo convierte en una herramienta útil para el diseño de nuevos antibióticos con un
espectro interespecies más amplio que los enzibióticos hasta ahora descritos (como
ejemplos: US20120258088, W02013052643, W02010002959, W02008018854,
US2007025978, US2005208038) dado que cubre tanto bacterias Gram-positivas como
30 Gram-Negativas lo que permite que sean usadas como antibióticos en combinación con
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elementos que alteren la pared celular (enzibióticos), o incluso en aplicaciones
biotecnológicas como la purificación y/o concentración de poblaciones bacterianas.
Un resumen de los polinucleótidos y péptidos descritos en la presente invención se resumen
en la siguiente tabla:
Descripción Secuencia Secuencia
polipeptídica nucleotídica
Cpl-7 Secuencia nativa 1 2
N-Cpl-7 Secuencia nativa de dominio catalítico 3 4
L-Cpl-7 Secuencia nativa de linker 5 6
C-Cpl-7 Secuencia nativa de dominio de unión a 7 8
pared
N-Cpl-7N Secuencia mutada de dominio catalítico 9 10
C-Cpl-7S Secuencia mutada de dominio de unión 11 12
a pared
N-Cpl-1 Secuencia nativa de dominio catalítico 13 14
L-Cpl-1 Secuencia nativa de linker 15 16
Cp17-00S Enzima quimérica 17 18
CpI7-NOS Enzima quimérica 19 20
Cp17-00E Enzima quimérica 21 22
Cp11-07S Enzima quimérica 23 24
Cp11-00S Enzima quimérica 25 26
Un primer objeto de la invención se refiere al polipéptido, de ahora en adelante polipéptido
de la invención, que codifica el módulo de unión a pared de la lisina Cpl-7 derivada del fago
de Streptococcus. pneumoniae Cp-7, denominado C-Cpl-7, modificado para que aumente su
25 carga neta lo que le confiere una mayor capacidad de unión a la pared celular bacteriana, y
caracterizado porque su secuencia de aminoácidos presenta una identidad de al menos un
50% con respecto a la secuencia parental SEQ ID NO 7, Y porque comprende alteraciones
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en su secuencia de aminoácidos (como pueden ser, por ejemplo, sustituciones, deleciones
y/o inserciones) en las siguientes posiciones:
la posición homóloga a la posición 216 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (L) original por el aminoácido (K) (mutación L216K),
la posición homóloga a la posición 225 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (D) original por el aminoácido (K) (mutación D225K),
la posición homóloga a la posición 230 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (A) original por el aminoácido (R) (mutación A230R),
la posición homóloga a la posición 233 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (D) original por el aminoácido (N) (mutación D233N),
la posición homóloga a la posición 239 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (D) original por el aminoácido (N) (mutación D239N),
la posición homóloga a la posición 264 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (L) original por el aminoácido (K) (mutación L264K),
la posición homóloga a la posición 273 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (D) original por el aminoácido (K) (mutación D273K),
la posición homóloga a la posición 278 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (A) original por el aminoácido (R) (mutación A278R),
la posición homóloga a la posición 281 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (D) original por el aminoácido (N) (mutación D281 N),
la posición homóloga a la posición 287 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (D) original por el aminoácido (N) (mutación D287N),
la posición homóloga a la posición 312 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (L) original por el aminoácido (K) (mutación L312K),
la posición homóloga a la posición 321 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (D) original por el aminoácido (K) (mutación D321 K),
la posición homóloga a la posición 326 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (A) original por el aminoácido (R) (mutación A326R),
la posición homóloga a la posición 329 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (D) original por el aminoácido (N) (mutación D329N),
la posición homóloga a la posición 335 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (D) original por el aminoácido (N) (mutación D335N).
En una realización particular, el polipéptido de la invención comprende la SEQ ID NO 11.
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Tal y como se utiliza en la presente invención el término "lisina" hace referencia a un enzima
lítica aislada de origen fágico que mediante su unión a la pared bacteriana rompe dicha
barrera mediante al hidrolizar la mureína, o peptidoglicano, que la conforma, para permitir la
salida de la progenie fágica de la bacteria hospedadora y la infección de nuevas bacterias.
5 En la literatura, las enzimas de tipo lisina con actividad mureín-hidrolasa de bacterias Gram-
positivas y sus bacteriófagos presentan una estructura modular, con características
funcionales que las distinguen (Lopez, R. et al. 1997Microb Drug Resist. 3, 199-211). Así, en
la presente invención el término "módulo de unión a pared" de una lisina se refiere al
extremo C-terminal del polipéptido con actividad lisina que permite que ésta éste se una a la
10 pared de la bacteria. El término "módulo catalítico" de una lisina se refiere al extremo N-
terminal del polipéptido con actividad lisina y que le confiere su actividad catalítica mureín-
hidrolasa. Y el término "linker" o "módulo linker" se refiere al fragmento polipeptídico
comprendido entre los dominios C-terminal y N-terminal y que sirve de nexo entre ambos.
En la presente invención, los diferentes dominios se representan aquí con la letra
15 correspondiente a su posición, seguida de la lisina de la que derivan, y una letra
correspondiente al mutante al que se refiere. Así, por ejemplo, C-Cpl-7S se refiere al
extremo C-terminal de la lisina Cpl7 (módulo de unión a pared), mutante S; Así, por ejemplo,
N-Cpl-7 se refiere al extremo N-terminal de la lisina Cpl7 (módulo catalítico), no-mutado.
Como un experto en el estado de la técnica podrá apreciar, es posible combinar los
20 diferentes módulos fágicos para obtener nuevas enzimas con actividad bactericida.
Los diferentes dominios combinados se representan aquí con las letras "Cpl", que se
corresponden a la denominación común de las lisinas empleadas en los ejemplos, seguidas
de un número que indica el fago de origen de la secuencia nativa, y otros tres dígitos que se
corresponden a la posición de cada uno de los módulos empezando por el extremo N-
25 terminal; cada dígito es representado por un cero, cuando se refiere a la secuencia nativa
del número que sigue a las letras Cpl, un número que se corresponde con el fago del cual se
extrae la secuencia nativa y una letra cuando se trata de una variante mutada, así, por
ejemplo:
a) Cpl-7: secuencia nativa de Cpl-7
30 b) Cpl7 -OOS: donde
a. O: módulo catalítico N-terminal, secuencia nativa de Cpl-7.
b. O: módulo linker, secuencia nativa de Cpl-7.1,
c. S: módulo C-terminal de unión a pared, secuencia mutada variante S.
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c) Cp11-00S donde:
a. O: módulo catalítico N-terminal, secuencia nativa de Cpl-1.
b. O: módulo linker, secuencia nativa de Cpl-1.
c. S: módulo C-terminal de unión a pared, secuencia mutada variante S.
5 d) Cp11-07S donde:
a. O: módulo catalítico N-terminal, secuencia nativa de Cpl-1.
b. O: módulo linker, secuencia nativa de Cpl-7.
c. S: módulo C-terminal de unión a pared, secuencia mutada variante S.
Como se ha comentado en la presente invención, el polipéptido de la invención que codifica
10 el módulo de unión a pared de la lisina Cpl-7 modificado para que aumente su carga neta,
presenta una mayor capacidad de unión a la pared celular bacteriana, y combinado con uno
o varios módulos catalíticos, y opcionalmente linkers, procedentes de otros fagos
bacterianos permite la construcción de enzimas lisinas quiméricas con actividad bactericida.
Así, otro objeto de la invención son las enzimas quiméricas, denominadas de ahora en
15 adelante enzimas quiméricas de la invención, que comprenden, al menos, el polipéptido de
la invención y un módulo N-terminal con actividad catalítica mureín-hidrolasa.
Opcionalmente, dichas quimeras pueden presentar también un módulo linker.
Así, un objeto particular de la presente invención es la enzima quimérica de la invención
cuya secuencia comprende el polipéptido de la invención y cuya secuencia además
20 comprende:
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30
a. un módulo catalítico N-terminal que se corresponde con el dominio catalítico N-
terminal de Cp17,
b. un módulo linker que se corresponde con la secuencia dellinker de Cpl-7,
c. el módulo catalítico C-terminal que se corresponde con el polipéptido de la
invención.
Una realización particular de la invención es la enzima quimérica de la invención que se
corresponde con la SEO ID NO 17 (mutante CpI7-00S) donde:
a. un módulo catalítico N-terminal que se corresponde con el dominio catalítico N-
terminal de Cpl7 con SEO ID NO 3,
b. un módulo linker que se corresponde con la secuencia del linker de Cpl-7 con
SEO ID NO 5,
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c. el módulo catalítico C-terminal que se corresponde con el polipéptido de la
invención con SEQ ID NO 11 (C-Cpl-7S).
Así, otro objeto particular de la presente invención es la enzima quimérica de la invención
cuya secuencia comprende el polipéptido de la invención y cuya secuencia además
5 comprende:
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15
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30
a. un módulo catalítico N-terminal que presenta, al menos, las siguientes
mutaciones en posiciones homólogas al módulo catalítico de la Cpl-7 nativa (de
SEQ ID NO 3):
a. la posición homóloga a la posición 25 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (E) original por el aminoácido (Q) (mutación E25Q).
b. la posición homóloga a la posición 68 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (E) original por el aminoácido (Q) (mutación E68Q).
c. la posición homóloga a la posición 69 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (E) original por el aminoácido (A) (mutación E69A).
b. un módulo linker que se corresponde con la secuencia dellinker de Cpl-7,
c. el módulo catalítico C-terminal que se corresponde con el polipéptido de la
invención con C-Cpl-7S.
Una realización particular de la invención es la enzima quimérica de la invención que se
corresponde con la SEQ ID NO 19 (mutante CpI7-NOS) donde:
a. un módulo catalítico N-terminal que presenta, al menos, las siguientes
mutaciones en posiciones homólogas al módulo catalítico de Cpl-7 nativa (de
SEQ ID NO 3) Y comprende la SEQ ID NO 9,
a. la posición homóloga a la posición 25 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (E) original por el aminoácido (Q) (mutación E25Q).
b. la posición homóloga a la posición 68 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (E) original por el aminoácido (Q) (mutación E68Q).
c. la posición homóloga a la posición 69 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (E) original por el aminoácido (A) (mutación E69A).
b. un módulo linker que se corresponde con la secuencia dellinker de Cpl-7 de SEQ
IDN05,
c. el módulo catalítico C-terminal que se corresponde con el polipéptido de la
invención con SEQ ID NO 11 (C-Cpl-7S).
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5
Así, un objeto particular de la presente invención es la enzima quimérica de la invención
cuya secuencia comprende el polipéptido de la invención y cuya secuencia además
comprende:
a. un módulo catalítico N-terminal que se corresponde con el dominio catalítico N-
terminal de Cpl-1,
b. un módulo linker que se corresponde con la secuencia dellinker de Cpl-7,
c. el módulo catalítico C-terminal que se corresponde con el polipéptido de la
invención.
Una realización particular de la invención es la enzima quimérica de la invención que se
10 corresponde con la SEO ID NO 25 (mutante CpI1-00S) donde:
15
20
a. un módulo catalítico N-terminal que se corresponde con el dominio catalítico N-
terminal de Cpl1 con SEO ID NO 13,
b. un módulo linker que se corresponde con la secuencia del linker de Cpl-7 con
SEO ID NO 5,
c. el módulo catalítico C-terminal que se corresponde con el polipéptido de la
invención con SEO ID NO 11 (C-Cpl-7S).
Así, un objeto particular de la presente invención es la enzima quimérica de la invención
cuya secuencia comprende el polipéptido de la invención y cuya secuencia además
comprende:
a. un módulo catalítico N-terminal que se corresponde con el dominio catalítico N-
terminal de Cpl-1,
b. un módulo linker que se corresponde con la secuencia dellinker de Cpl-1,
c. un módulo catalítico C-terminal se corresponde con el polipéptido de la invención.
Una realización particular de la invención es el enzima quimérico de la invención que se
25 corresponde con la SEO ID NO 23 (mutante CpI1-07S) donde:
30
a. un módulo catalítico N-terminal que se corresponde con el dominio catalítico N-
terminal de Cpl1 con SEO ID NO 13,
b. un módulo linker que se corresponde con la secuencia del linker de Cpl-1 con
SEO ID NO 15,
c. el módulo catalítico C-terminal que se corresponde con el polipéptido de la
invención con SEO ID NO 11 (C-Cpl-7S).
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Los aminoácidos individuales en una secuencia se representan aquí como XN, en la que X
es el aminoácido en la secuencia (designado mediante el código de una letra
universalmente aceptado en la nomenclatura de aminoácidos), y N es la posición en la
secuencia. Las mutaciones puntuales tipo sustitución en una secuencia de aminoácidos se
5 representan aquí como X1 NX2 , en la que X1 es el aminoácido en la secuencia de proteína
no mutada, X2 es el/los aminoácido/s nuevos de la secuencia de proteína mutada, y N es la
posición en la secuencia de aminoácidos.
El término "carga neta" de una proteína se define como la suma de todas las cargas
positivas y negativas que lleva la proteína a un determinado pH. Modos de medir calcular la
10 carga neta de una proteína son conocidos en el estado de la técnica, y entre ellos, por
ejemplo, se halla el método descrito en Low et al. 2011. J. Biol. Chem. 286: 34391-34403,
en el que la carga neta (Z) se estima como la diferencia entre el número de (Lisinas +
Argininas) menos el número de residuos de (Ácido aspártico + Ácido glutámico); o el método
utilizado en Sedenterp en el que, además del número de grupos que pueden estar cargados
15 positiva (Lisinas + Argininas + histidinas) o negativamente (Ácido aspártico + Ácido
glutámico + cisteínas), la estimación tiene en cuenta el estado de ionización de los mismos
calculado a partir las constantes de ionización de los distintos grupos y del valor del pH del
medio en que se encuentra la proteína (Laue et al. 1992. Ultracentrifugation in Biochemistry
and Polymer Science pp. 90-125).
20 El término "capacidad de unión a la pared celular bacteriana" hace referencia a la afinidad
que tienen las lisinas fágicas por la pared celular de las bacterias. Una mayor afinidad,
obtenida por ejemplo por mejora de la carga neta polipeptídica, incrementa la cantidad de
lisina fágica que se une la bacteria, y por tanto, la cantidad de pared hidrolizada y, como
consecuencia, una mayor lisis bacteriana.
25 Las mutaciones aquí descritas introducidas en la secuencia polipeptídica SEQ ID No 7 que
se corresponde con el dominio de unión a pared de la lisina Cpl-7 pueden obtenerse
mediante técnicas de ingeniería genética o AON recombinante, como por ejemplo mutando
la secuencia codificante de Cpl-7 (SEQ ID NO 1) mediante mutagénesis dirigida o al azar, o
bien pueden obtenerse a partir de la síntesis química de la secuencia de nucleótidos
30 portadora de las mutaciones.
Además, con la información suministrada, un experto en la materia es capaz de combinar
las mutaciones anteriormente descritas en la presente invención para generar nuevas
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variantes del módulo de unión a pared C-Cpl-7 con actividad similar o mejorada. Una
posibilidad es la sustitución conservativa de los aminoácidos en las posiciones
anteriormente comentadas. Así, por ejemplo, se entiende por sustitución conservativa
aquella que mantiene las características de polaridad y carga del aminoácido sustituido. Por
5 ejemplo, lisina y arginina son aminoácidos cuyas cadenas laterales están cargadas
positivamente a pH neutro, por lo que se acepta que los cambios de lisina por arginina o
viceversa representan cambios conservativos. Se han clasificado los 20 aminoácidos que
constituyen la base de todas las proteínas naturales de acuerdo a su conservatividad en
grupos: (i) aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano); (ii) aminoácidos
10 alifáticos (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina y metionina); (iii) aminoácidos
ionizables básicos (histidina, lisina y arginina); (iv) aminoácidos ionizables ácidos (ácidos
aspártico y glutámico); (v) amidas de aminoácidos ácidos (asparagina y glutamina); y (vi)
aminoácidos hidroxilados (serina y treonina). Algunos autores incluirían la cisteína en este
último grupo.
15 También se incluyen en esta invención los polinucleótidos que codifican para los
polipéptidos de la invención descritos y que se corresponden a variantes de los mismos
obtenidos mediante mutagénesis dirigida del módulo de unión a pared C-terminal de la lisina
Cpl-7 (dominio C-Cpl-7 con SEQ ID NO 7). Dichos polinucleótidos se corresponden con la
secuencia de nucleótidos que constituye la secuencia codificante del polipéptido de la
20 invención, denominados de ahora en adelante polinucleótidos de la invención.
Los términos "polinucleótido", "secuencia nucleotídica", "secuencia de nucleótidos", "ácido
nucleico" y "oligonucleótido" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una
forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o
bioquímicamente modificados.
25 Así, un segundo objeto de la invención hace referencia a la secuencia de polinucleótidos
que codifica el polipéptido de la invención, de ahora en adelante polinucleótido primero de la
invención, caracterizado porque codifica el módulo de unión a pared de la lisina Cpl-7
derivada del fago de S. pneumoniae Cp-7 modificado para que aumente su carga neta (lo
que le confiere una mayor capacidad de unión a la pared celular bacteriana), porque
30 presenta los cambios en su secuencia de aminoácidos descritos anteriormente; y, además,
porque su secuencia presenta una identidad de al menos un 50% con respecto a la
secuencia parental SEQ ID NO 2.
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Así, un objeto preferido de la invención es el polinucleótido primero de la invención que
codifica el polipéptido de la invención que presenta los cambios de aminoácidos L216K,
0225K, A230R, 0233N, 0239N, L264K, 0273K, A278R, 0281 N, 0287N, L312K, 0321 K,
A326R, 0329N Y 0335N. En una realización particular de la invención, el polinucleótido de la
5 invención se corresponde con la SEO ID NO 12 (módulo C-Cpl-7S).
Otro objeto de la invención se corresponde con el polinucleótido que codifica la enzima de la
invención, de ahora en adelante, polinucleótido segundo de la invención, caracterizado
porque comprende un dominio catalítico N-terminal y el dominio de unión a pared C-terminal
se corresponde con el polipéptido de la invención.
10 Otro objeto preferido de la invención es el polinucleótido segundo de la invención que
codifica la enzima quimérica de la invención con un módulo catalítico N-terminal que se
corresponde con el dominio catalítico N-terminal de Cpl-7, un módulo linker que se
corresponde con la secuencia del linker de Cpl-7, y el módulo catalítico C-terminal que se
corresponde con el polipéptido de la invención. En una realización particular, el
15 polinucleótido de la invención se corresponde con la SEO ID NO 18.
Otro objeto preferido de la invención es el polinucleótido segundo de la invención que
codifica la enzima quimérica de la invención con un módulo catalítico N-terminal que se
corresponde con el dominio catalítico N-terminal de Cpl7 mutado N-CpI7-N, un módulo linker
que se corresponde con la secuencia del linker de Cpl-7, y el módulo catalítico C-terminal
20 que se corresponde con el polipéptido de la invención. En una realización particular, el
polinucleótido de la invención se corresponde con la SEO ID NO 20.
Otro objeto preferido de la invención es el polinucleótido segundo de la invención que
codifica la enzima quimérica de la invención con un módulo catalítico N-terminal que se
corresponde con el dominio catalítico N-terminal de Cp11, un módulo linker que se
25 corresponde con la secuencia del linker de Cpl-1, y el módulo catalítico C-terminal que se
corresponde con el polipéptido de la invención. En una realización particular, el
polinucleótido de la invención se corresponde con la SEO ID NO 26.
Otro objeto preferido de la invención es el polinucleótido segundo de la invención que
codifica la enzima quimérica de la invención con un módulo catalítico N-terminal que se
30 corresponde con el dominio catalítico N-terminal de Cp11, un módulo linker que se
corresponde con la secuencia del linker de Cpl-7, y el módulo catalítico C-terminal que se
13
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corresponde con el polipéptido de la invención. En una realización particular, el
polinucleótido de la invención se corresponde con la SEO ID NO 24.
Considerando que las lisinas de distintas cepas y aislados de los fagos de S. pneumoniae,
particularmente del fago Cp7, puedan ser evolutivamente similares, es de esperar que la
5 identidad global de los genes que las codifican sea igual o mayor de un 50%, y más
concretamente al nivel de la secuencia polinucleotídica correspondiente a la SEO ID NO 8
(C-Cpl-7 nativo), sea del 60% o mayor. Además, el grado de identidad o la homología
existente entre las secuencias de aminoácidos de la(s) lisina(s) objeto de la invención y las
secuencias de otras lisinas similares pueden determinarse por métodos conocidos en estado
10 de la técnica. Por ejemplo, a través del alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la
lisina putativa y la correspondiente al módulo C-Cpl-7S de esta memoria (SEO ID NO 11).
El término "homología", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la
semejanza entre dos estructuras debida a una ascendencia evolutiva común, y más
concretamente a la semejanza o identidad entre los nucleótidos de posiciones equivalentes
15 en dos o más polinucleótidos.
El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción
de nucleótidos idénticos entre dos polinucleótidos que se comparan. Los métodos de
comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin
limitarse a ellos, el programa BLASTP o BLASTN, ClustalW y FASTA. Puesto que dos
20 proteínas se consideran homólogas si tienen el mismo origen evolutivo, en general, se
asume que valores superiores de similitud o identidad del 60% indican estructuras
homólogas. Podemos considerar, por tanto, que porcentajes de identidad de, al menos, un
80% mantendrán las mismas propiedades de dicho polipéptido.
Con la información suministrada en la presente invención un experto en la materia es capaz
25 de identificar secuencias de nucleótidos homólogas a las descritas en la presente invención
y que codifican para módulos de unión a pared bacteriana con características idénticas a las
descritas para el polipéptido de la invención. Por tanto, el polinucleótido de la invención
constituye la secuencia codificante de una variante de la módulo de unión a pared de la
lisina Cpl-7 derivada del fago de S. pneumoniae Cp-7 modificado con las características
30 anteriormente descritas, cuya secuencia de nucleótidos se corresponde a:
a) moléculas de ácido nucleico de la secuencia polinucleotídica aislada o en su
cadena complementaria,
14
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b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria es capaz de hibridar
con una secuencia polinucleotídica de (a), o
c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de (a) y/o (b) debido a la
degeneración del código genético.
5 Los polinucleótidos primero y segundo de la invención puede encontrarse aislado como talo
formando parte de los vectores que permiten la propagación de dichos polinucleótidos en
células hospedadoras adecuadas. Por lo tanto, en otro objeto, la invención se refiere a un
vector, en adelante vector primero de la invención, que comprende el polinucleótido primero
de la invención como se describe anteriormente. Otro objeto de la invención se refiere a un
10 vector, en adelante vector segundo de la invención, que comprende el polinucleótido
segundo de la invención como se describe anteriormente.
El vector puede ser, por ejemplo un vector de clonación o un vector de expresión.
Preferiblemente, dicho vector es un plásmido apropiado para la expresión y purificación del
polipéptido de la invención y/o la enzima quimérica de la invención.
15 El término "vector de clonación", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a
una molécula de ADN en la que se puede integrar otro fragmento de ADN, sin que pierda la
capacidad de autorreplicación. Ejemplos de vectores de expresión son, pero sin limitarse,
plásmidos, cósmidos, fagos de ADN o cromosomas artificiales de levadura.
El término "vector de expresión", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a
20 un vector de clonación adecuado para expresar un ácido nucleico que ha sido clonado en el
mismo tras ser introducido en una célula, denominada célula huésped. Dicho ácido nucleico
se encuentra, por lo general, unido operativamente a secuencias de control.
El término "expresión" se refiere al proceso por el cual se sintetiza un polipéptido a partir de
un polinucleótido. Incluye la transcripción del polinucleótido en un ARN mensajero (ARNm) y
25 la traducción de dicho ARNm en una proteína o un polipéptido.
El término "célula hospedadora" o "célula huésped", tal y como se utiliza en la presente
descripción se refiere a cualquier organismo procariota o eucariota que es recipiente de un
vector de expresión, de clonación o de cualquier otra molécula de ADN.
15
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Los vectores adecuados para la inserción de los polinucleótidos primero y segundo de la
invención son plásmidos utilizados para la expresión de proteínas en procariotas tales, a
título ilustrativo, como pT7-7, pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados, mp18, mp19,
pBR322, pMB9, C01 E1, pCR1, RP4, fagos y vectores "lanzadera", tales como pSA3 y
5 pAT28; vectores de expresión en levaduras tales como el plásmido de 2 micras de
Saccharomyces cerevisiae, plásmidos de integración, vectores YEP, plásmidos centrómeros
y similares; vectores de expresión en células de insectos tales como los vectores de la serie
pAC y de la pVL vectores de expresión; vectores de expresión en células de plantas tales
como piBi, pEarleyGate, PAVA, pCAMBIA, PGSA, PGWB, PMDC, PMY, serie de poros y
10 similares, y otros plásmidos de expresión de proteínas utilizados en células eucariotas,
incluyendo baculovirus adecuados para la transfección de células de insecto usando
cualquier sistema disponible en el estado de la técnica.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, una "célula hospedadora" o "célula huésped"
incluye cualquier célula cultivable que puede ser modificada mediante la introducción de
15 ADN no contenido de manera natural en la célula, de aquí en adelante célula hospedadora
de la invención.
Preferiblemente, una célula hospedadora es aquélla en la que el polinucleótido primero de la
invención y el polinucleótido segundo de la invención pueden ser expresados, dando lugar a
un polipéptido estable, modificado post-traduccionalmente y localizado en el compartimento
20 subcelular apropiado. La elección de una célula hospedadora adecuada puede también
estar influida por la elección de la señal de detección. Por ejemplo, el uso de construcciones
con genes reporteros (por ejemplo, lacZ, luciferasa, timidina quinasa o la proteína verde
fluorescente "GFP") puede proporcionar una señal seleccionable mediante la activación o
inhibición de la transcripción del gen de interés en respuesta a una proteína reguladora de la
25 transcripción. De cara a conseguir una selección o "screening" óptimo, el fenotipo de la
célula hospedadora deberá ser considerado.
Una célula hospedadora de la presente invención incluye células procariotas y eucariotas.
Entre las procariotas se incluyen organismos Gram negativos (por ejemplo, Escherichia col!)
o Gram positivos (por ejemplo, bacterias del género Bacillus). Las células procariotas se
30 usarán, preferiblemente, para la propagación de la secuencia del control de la transcripción
del vector que contiene el(los) polinucleótido(s) objeto(s) de la invención, lo que permitirá
conseguir un mayor número de copias del vector conteniendo el(los) polinucleótido(s)
objeto(s) de la invención. Entre las células hospedadoras procariotas adecuadas para la
16
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transformación de este vector se encuentran, por ejemplo, pero sin limitarse a, E. coli,
Bacillus sub tilis , Sa/monella typhimurium, y otras especies dentro de los géneros
Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. Las células eucariotas incluyen, entre otras,
células de levadura, células de plantas, células de hongos, células de insectos, células de
5 mamífero, y células de organismos parásitos (por ejemplo, Trypanosomas). Tal y como se
emplea en esta memoria, el término levadura no incluye sólo levadura en el sentido
taxonómico estricto, es decir, organismos unicelulares, sino también hongos multicelulares
similares a las levaduras u hongos filamentosos. Ejemplos de especies son Kluyveromyces
la ctis , Schizosaccharomyces pombe, y Ustilago maydis, con Saccharomyces cerevisiae y
10 Pichia pastoris como organismos preferidos. Otras levaduras que pueden utilizarse en la
producción de la(s) secuencia(s) polipeptídica(s) de la presente invención son Neurospora
crassa, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Candida tropicalis, y Hansenula polymorpha.
Los sistemas de cultivo con células hospedadora de mamífero incluyen líneas celulares
establecidas como las células COS, células L, células 3T3, células de ovario de hámster
15 chino (CHO), células madre embrionarias, con las células BHK, HeK o HeLa como células
preferidas. Las células eucariotas son, preferiblemente, utilizadas para la expresión del gen
recombinante mediante la aplicación de la secuencia de regulación de la transcripción o el
vector de expresión de la presente invención.
Así otro objeto de la invención se refiere a un método de obtención del polipéptido de la
20 invención, de ahora en adelante método primero de la invención, que comprende:
25
30
1) Introducir el vector primero de la invención en una célula hospedadora
adecuada (célula hospedadora primera de la invención),
2) Cultivar la célula hospedadora primera de la invención en un medio adecuado,
y,
3) Purificar el polipéptido de la invención con mayor carga neta y mayor capacidad
de unión a la pared celular bacteriana.
Así otro objeto de la invención se refiere a un método de obtención de la enzima quimérica
de la invención, de ahora en adelante método segundo de la invención, que comprende:
1) Introducir el vector segundo de la invención en una célula hospedadora
adecuada (célula hospedadora segunda de la invención),
2) Cultivar la célula hospedadora segunda de la invención en un medio adecuado,
y,
3) Purificar la enzima quimérica de la invención con mayor carga neta y mayor
capacidad de unión a la pared celular bacteriana.
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Un cultivo de células hospedadoras se refiere al proceso de mantener y crecer las células
hospedadoras. Los cultivos celulares necesitan condiciones contraladas de temperatura, pH,
porcentajes de gases (oxígeno y dióxido de carbono), así como la presencia de los
nutrientes adecuados para permitir la viabilidad y la división celular. Los cultivos celulares
5 pueden desarrollarse en sustratos sólidos como el agar, o en medio líquido, lo que permite
cultivar grandes cantidades de células en suspensión.
El término "purificar" tal y como se emplea en la descripción, se refiere al aislamiento del
polipéptido de la invención o de la enzima quimérica de la invención y a su concentración,
del resto de polipéptidos presentes en el medio de cultivo y de la célula hospedadora de la
10 invención. El aislamiento del polipéptido de la invención puede llevarse a cabo mediante
técnicas de solubilidad diferencial, cromatografía, electroforesis o isoelectroenfoque. Las
técnicas de cromatografía pueden estar basadas en el peso molecular, la carga iónica
(basada en el estado de ionización de los aminoácidos en las condiciones de trabajo), la
afinidad de la proteína por determinadas matrices o columnas cromatográficas, o mediante
15 etiquetas de purificación, y puede realizarse en columna, en papel o en placa. El aislamiento
de la proteína puede realizarse, por ejemplo, mediante precipitación con sulfato amónico,
cromatografía líquida rápida (FPLC, del inglés "Fast Protein Liquid Cromatography") o
cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC, del inglés "High Performance Liquid
Chromatography"), empleando sistemas automatizados que reducen notablemente el tiempo
20 de purificación e incrementan el rendimiento de la purificación.
La expresión "etiqueta de purificación" o "etiqueta de afinidad", tal y como se utiliza en la
presente descripción se refiere a una secuencia de aminoácidos que ha sido incorporada
(generalmente, por ingeniería genética) a una proteína para facilitar su purificación. La
etiqueta, que puede ser otra proteína o una secuencia corta de aminoácidos, permite la
25 purificación de la proteína, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad. Etiquetas de
purificación conocidas en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse a, el
péptido de unión a calmodulina (CBP), la enzima glutatión-8-transferasa (G8T) o una cola
de residuos de histidina.
Un experto en el estado de la técnica conoce las técnicas por las que se puede obtener el
30 polinucléotido de la invención, que podría hacerse, por ejemplo, pero sin limitarse a, por
mutagénesis dirigida o al azar a partir de un polinucleótido no mutado, mediante síntesis
química del polinucleótido completo, o a través del ensamblado de fragmentos de ADN que
codifiquen para distintas porciones de la secuencia que se desea obtener.
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Así, otro objeto de la invención se refiere al uso del polinucleótido primero de la invención
para la obtención del polipéptido de la invención con mayor carga neta y mejor capacidad de
unión a la pared bacteriana.
Otro objeto de la invención se refiere al uso de la célula primera hospedadora de la
5 invención para la obtención del polipéptido de la invención. Preferentemente, la célula
hospedadora primera de la invención es una bacteria, más preferentemente Eseheriehia eoli.
Otro objeto de la invención se refiere al uso del polinucleótido segundo de la invención para
la obtención de la enzima quimérica de la invención con mayor carga neta y mejor
capacidad de unión a la pared bacteriana.
10 Otro objeto de la invención se refiere al uso de la célula hospedadora segunda de la
invención para la obtención de la enzima quimérica de la invención. Preferentemente, la
célula hospedadora segunda de la invención es una bacteria, más preferentemente
Eseheriehia eoli.
En el estado de la técnica son conocidas técnicas de marcaje como los inmunoensayos que
15 se basan en el reconocimiento por parte de un anticuerpo de una determinada secuencia
polipeptídica, o epitopo. En este caso, el polipéptido de la invención puede unirse a la pared
bacteriana mediante el reconocimiento del peptidoglicano que la recubre; esta característica,
como el experto en el estado de la técnica puede apreciar, permite, sobre todo en el caso de
las bacterias Gram-positivas, el empleo del polipéptido de la invención en aplicaciones
20 biotecnológicas como el marcaje y la captura de las bacterias de interés.
Así, un objeto particular de la invención lo constituye el polipéptido de la invención
caracterizado por que está unido a una etiqueta de marcaje. Etiquetas de marcaje
comúnmente empleadas incluyen, pero no se limitan a, biotina, moléculas fluorescentes,
moléculas radiactivas, sustratos cromogénicos, marcadores quimioluminiscentes, enzimas, y
25 similares; éstos permiten la detección de una bacteria en, por ejemplo, un tejido mediante,
por ejemplo, el uso de marcaje fluorescente, lo que permitiría observar su capacidad de
infectividad.
Otro objeto particular de la invención lo constituye el polipéptido de la invención
caracterizado por que está unido a una partícula de aislamiento para la concentración de la
30 población bacteriana de una muestra. Partículas de aislamiento pueden ser, por ejemplo,
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pequeñas esferas magnéticas (beads) o de sepharosa. Este tipo de partículas permiten el
aislamiento de las bacterias de una muestra, particularmente aquellas de interés clínico
como por ejemplo esputos, exudados, biopsias, etc., pero también aquellas de interés
forense como muestras de semen o saliva, y tras una centrifugación, su concentración. Las
5 bacterias así aisladas pueden luego ser sometidas a una PCR para su identificación, o bien
su cultivo en medios adecuados para la identificación mediante técnicas clásicas de
microbiología, bien conocidas por el experto en el estado de la técnica. Este tipo de
concentración previa a la identificación es de particular interés en el caso de aquellas
muestras en las que la identificación es particularmente difícil debido al bajo número de
10 células de interés en la muestra.
Tal y como se ha comentado, las lisinas tienen la capacidad de romper las paredes celulares
por las que presentan afinidad, provocando la muerte bacteriana. Así, las enzimas
quiméricas de la invención, que comprenden, al menos, el polipéptido de la invención, un
módulo catalítico con actividad mureín-hidrolasa, y opcionalmente un linker, pueden ser
15 empleadas como biocidas tanto en aplicaciones terapéuticas (antibióticos) como en la
limpieza antiséptica de superficies y materiales contra bacterias pertenecientes, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo:
20
a) Gram positivas, preferentemente, Streptococcus, Staphylococcus, Bifidobacterium,
Corynebacterium, Lactococcus, Mycobacterium, Listeria, Clostridium, Bacillus,
Actinomyces, y más preferentemente, Streptococcus. pneumoniae, Streptococcus.
pyogenes, Streptococcus. mitis, Streptococcus. aga/actiae, Streptococcus. iniae,
Streptococcus. mutans, Streptococcus. dysga/actiae, Staphyilococcus. aureus,
Bacillus ado/escenties, C/ostridium. jeikeium, Enterococcus. faecalis, Lactococcus.
lactis, and Mycobacterium smegmatis.
25 b) Gram negativas, preferentemente, Escherichia, Pseudomonas, Salmonella,
Campilobacter, Shigella, Yersinia, Vibrio, Helicobacter, Bartonella, Neisseria y
Bordetella, y más preferentemente, Escherichia coli, y Pseudomonas putida,
Así, otro objeto de la invención lo constituye el uso de la enzima quimérica de la invención
en la elaboración de un medicamento o una composición farmacéutica para el tratamiento
30 de una infección bacteriana o como antiséptico. Preferentemente, dicho tratamiento está
dirigido contra Streptococcus. pneumoniae, Streptococcus. pyogenes, Streptococcus. mitis,
Streptococcus. aga/actiae, Streptococcus. iniae, Streptococcus. mutans, Streptococcus.
dysga/actiae, Staphyilococcus. aureus, B. acillus ado/escenties, C/ostridium. jeikeium,
Enterococcus. fa e ca lis, Lactococcus. lactis, and Mycobacterium. Smegmatis.
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Otro objeto de la invención lo constituye una composición farmacéutica útil para el
tratamiento de enfermedades infecciosas o como antiséptico, en adelante composición
farmacéutica de la invención, que comprende al menos una enzima quimérica de la
invención, en cantidad farmacéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o más
5 adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en
dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la
materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas o
antisépticas.
10 En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva"
se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de eliminar los microorganismos
patógenos, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada,
entre otras causas, para el caso de una composición terapéutica, por las características
propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la
15 alteración o trastorno, y de la ruta, forma y frecuencia de administración; y para el caso de
una composición antiséptica, las condiciones del entorno, la forma de aplicación, entre otras.
En otra realización particular, dicha composición farmacéutica se prepara en forma de una
forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La
composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por
20 cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la
forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización
particular, la administración de la composición terapéutica proporcionada por esta invención
se efectúa por vía parenteral, por vía oral, por vía intraperitoneal, subcutánea, etc. Una
revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los
25 excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en
el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid.
Otra realización particular de la invención lo constituye la composición farmacéutica de la
invención donde la enzima quimérica de la invención comprende una secuencia
perteneciente, a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención, al siguiente
30 grupo: SEO ID NO 17, SEO ID NO 19, SEO ID NO 23, SEO ID NO 25.
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A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los
expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se
desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los
5 siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que
sean limitativos de la presente invención.
EXPLICACiÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Esquema de las construcciones de enzibióticos. A) Esquema de enzimas
silvestres. B) Esquema de lisozimas modificadas y quimeras.
10 Figura 2. Localización de las mutaciones introducidas en los mutantes Cp17-00S y
CpI7-NOS. A) Estructura de la segunda repetición de C-CpI7-00S (SEQ ID NO 11)
mostrando los aminoácidos modificados, e identificación de la zona reconocida por "fpocket"
como sitio de unión a la pared celular mediante el conjunto de esferas grises. En la parte
superior se muestra la secuencia de una repetición seguida del linker. Sobre fondo gris los
15 residuos conservados dentro de la familia CW_7. B) Localización de las mutaciones
introducidas en N-CpI7-N (SEQ ID NO 9). La cavidad catalítica está situada en el centro del
barril.
Figura 3. Cinética de lisis de la cepa R6 de S. pneumoniae por diferentes variantes de
Cpl-7 a distintas concentraciones de enzima. Los ensayos fueron realizados en PBS, pH 6.0,
20 a 37°C. Panel superior, Cpl-7; Panel medio, CpI7-00S; y panel inferior, CpI7-NOS.
Figura 4. Actividad bactericida de las lisozimas sobre la cepa R6 de S. pneumoniae.
Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su
incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron
realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 ¡Jg/ml.
25 Figura 5. Actividad bactericida de las lisozimas sobre la cepa D39 de S. pneumoniae.
Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su
incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron
realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 ¡Jg/ml.
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Figura 6. Actividad bactericida de las lisozimas sobre la cepa P007 de S. pneumoniae.
Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su
incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron
realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 ¡Jg/ml.
5 Figura 7. Actividad bactericida de las lisozimas sobre la cepa P008 de S. pneumoniae.
Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su
incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron
realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 ¡Jg/ml.
Figura 8. Actividad bactericida de las lisozimas ensayadas sobre la cepa 048 de S.
10 pneumoniae. Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras
tras su incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos
fueron realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 ¡Jg/ml.
Figura 9. Actividad bactericida de las lisozimas ensayadas sobre de S. pyogenes.
Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su
15 incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron
realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 ¡Jg/ml.
Figura 10. Actividad bactericida de las lisozimas ensayadas sobre S. aureus. Panel
superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su incubación
durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron realizados
20 con una concentración de enzima de 5 ¡Jg/ml.
Figura 11. Actividad bactericida de las lisozimas ensayadas sobre S. iniae. Panel
superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su incubación
durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron realizados
en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 ¡Jg/ml.
25 Figura 12. Actividad bactericida de las lisozimas ensayadas sobre S. mitis SK598.
Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células viables de las muestras tras su
incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las mismas. Los ensayos fueron
realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de enzima de 5 ¡Jg/ml.
23
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Figura 13. Actividad bactericida de las lisozimas ensayadas sobre E. coli DH108
pretratadas con 0.01% carvacrol. Panel superior, cinética de lisis. Panel inferior, células
viables de las muestras tras su incubación durante 60 min en ausencia y en presencia de las
mismas. Los ensayos fueron realizados en PBS, pH 6.0, a 37°C y con una concentración de
5 enzima de 5 ¡Jg/ml.
Figura 14. Modelo animal de infección en embriones de pez cebra. Representación del
porcentaje de viabilidad de embriones de peces cebra en las pruebas de infección con S.
pneumoniae o S. pyogenes y tratamiento con Cpl7 -OOS. Las barras indican desviaciones
stándard y los asteriscos resultados estadísticamente significativos con respecto a los
10 controles. Para el análisis estadístico se ha realizado el test de Anova (p<0.01).
MODO DE REALlZACION DE LA INVENCION
Ejemplos
Ejemplo 1. Generación de dominios de unión a pared C-Cpl-7 mejorados. El
procedimiento de mejora está basado, fundamentalmente, en la modificación de la carga
15 neta de las tres repeticiones que forman el dominio C-Cpl-7 sin que los cambios de
secuencia introducidos alteren el plegamiento de la proteína. La selección de las posiciones
a modificar y el tipo de mutación introducida en cada posición se llevó a cabo teniendo en
cuenta, por tanto, la conservación de secuencias dentro de la familia CW_7 (PF08230) y los
modelos a alta resolución previamente generados para N-Cpl-7 y C-Cpl-7 (Bustamante et al.
20 2010. J. Biol. Chem. 285:33184-33196). Se construyeron 2 mutantes en los que se
modificaron una posición por repetición (CpI7-00E, SEO ID NO 21)) Y cinco posiciones por
repetición (CpI7- OOS, SEO ID NO 17) de C-Cpl-7, todas ellas situadas en zonas alejadas de
los posibles sitios de unión a la pared, según el análisis de la estructura llevado a cabo con
el programa "Fpocket" (Le Guilloux et al. 2009. BMC Bioinf. 10: 168) (Figura 2 A). Se
25 construyó asimismo un tercer mutante (CpI7-NOS, SEO ID NO 19) en el que además de las
mutaciones de Cp17-00S se mutaron tres aminoácidos no conservados de N-Cpl-7, todos
situados fuera de la cavidad catalítica (Figura 2B). Mediante dichas mutaciones la carga
neta de la proteína pasó de -28.8 (Cpl-7) a -25.8 (CpI7-00E), -10.85 (CpI7-00S) Y -7.85
(CpI7-NOS) y se ha invertido, de negativa a positiva, la carga de las repeticiones CW_7 en
30 los dos últimos mutantes.
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Simultáneamente, y con el objetivo de facilitar la creación de futuras mutaciones puntuales,
se rompió la degeneración de secuencia que tiene la región codificante de C-Cpl-7 en la
proteína silvestre, introduciendo en cada posición codones frecuentemente utilizados por E.
coli que, sin modificar la secuencia de aminoácidos, permitieron también optimizar la
5 expresión de las formas mutadas. En la Figura 1 se muestra la organización estructural de
Cpl-7 y los mutantes mejorados junto con la carga neta total calculada para cada uno de
ellos a pH neutro. Las secuencias codificantes de cada forma mutada, junto con las
secuencias de aminoácidos se incluyen al final del ejemplo.
Los genes codificantes para las distintas variantes se obtuvieron por síntesis química a
10 través de la empresa ATG:biosynthetics como derivados del plásmido pUCo Para optimizar
la expresión de las proteínas, los fragmentos de ADN respectivos se subclonaron en el
plásmido pT7-7 utilizando los sitios Ndel y Pst1. Los plásmidos resultantes (pTRD750,
pTR753 y pTR752 codificantes de CpI7-00S, CpI7-NOS y CpI7-00E, respectivamente) se
transformaron en E. coli BL21 (DE3) Y las células transformadas se crecieron en LB tras
15 inducir con IPTG (isopropil-¡3-D-tiogalactopiranósido). Los niveles de expresión de las
proteínas recombinantes fueron elevados y la purificación se llevó a cabo siguiendo el
procedimiento establecido para Cpl-7 silvestre. Las muestras purificadas se mantuvieron
congeladas a -20°C en 20 mM fosfato (pH 6.0). El mantenimiento de la estructura nativa de
Cpl-7 en los mutantes se verificó comparando los espectros de dicroísmo circular de la
20 forma silvestre y los mutantes (estructuras secundaria y terciaria) y los perfiles de
sedimentación obtenidos por ultracentrifugación analítica (estructura cuaternaria).
Ejemplo 2. Construcción de proteínas híbridas con actividad bactericida portadoras
de C-CpI7-00S con espectro de acción ampliado
Se han construido dos lisozimas híbridas portadoras del módulo catalítico de Cpl-1 (N-Cpl-1)
25 fusionado a C-Cpl-7S mediante los linker de las formas nativas de Cpl-1 (quimera CpI1-00S)
y Cpl-7 (quimera CpI1-07S). En la Figura 1 se muestra la organización estructural de las
enzimas parentales (panel A) y de las mureín-hidrolasas híbridas construidas (panel B). Las
secuencias codificantes, junto con las secuencias de aminoácidos se incluyen al final del
ejemplo. Como puede verse en la Figura 1 B, la carga neta de las quimeras es
30 significativamente inferior a la Cpl-7 silvestre.
Los genes codificantes para las quimeras se obtuvieron por síntesis química a través de la
empresa ATG:biosynthetics como derivados del plásmido pUCo Para optimizar la expresión
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de las proteínas se procedió de la forma descrita en el ejemplo 1 para las variantes de Cpl-7.
Las quimeras se purificaron siguiendo un procedimiento paralelo al descrito para Cpl-7 y sus
mutantes. Las muestras purificadas se mantuvieron congeladas a -20°C in 20 mM fosfato
(pH 6.0).
5 Ejemplo 3. Actividad bactericida de los mutantes de C-Cpl-7 y quimeras portadoras de
C-CpI7-00S
Una vez puesto a punto el protocolo para la producción de las mureín-hidrolasas expresadas
en E. coli, se purificaron las correspondientes proteínas y se llevaron a cabo ensayos de
actividad bactericida sobre S. pneumoniae y otras bacterias, tanto Gram-positivas como
10 Gram-negativas (Tabla 1). Como se puede observar en los datos de la Tabla 2, y a
diferencia de Cpl-1, las enzimas portadoras del módulo C-Cpl-7 tienen un rango de huésped
ampliado, ya que degradan no sólo las paredes de neumococo sino también las de otras
bacterias, que no contienen colina en sus envueltas celulares, tanto Gram-positivas (S.
pyogenes, S mitis y E. faecalis, entre otras) como Gram-negativas (por ejemplo, P. putida y
15 E. coli). Los módulos mejorados potencian de forma significativa la actividad bactericida,
como se deduce del hecho de que Cp17-00S tenga el mismo nivel de actividad que Cpl-7 a
una concentración 2.5 veces menor y de que, en igualdad de condiciones, la caída en el
número de células viables producida por las enzimas modificadas sea"" 1 O veces mayor en
un porcentaje importante de casos (Tabla 2). Es importante destacar que este aumento de la
20 actividad bactericida se observa también frente a aislados clínicos multirresistentes de
neumococo (cepas 048, 69 Y 1515), frente a S. mitis (otro patógeno de enorme relevancia
clínica) y frente a especies como E. coli que pueden ser o no patogénicas. De entre todas
las enzimas construidas, Cp17-00S es la más activa frente S. pneumoniae, S. mitis y E. coli
ya que su capacidad bactericida supera, o como mínimo iguala, a las de las otras enzimas
25 que contienen el módulo C-Cpl-7 o variantes del mismo (Tabla 3), y su CMI para la cepa de
neumococo ATTCC 49619 es cuatro veces inferior a la de Cpl-7 (Tabla 2). Cp17-00S
constituye por tanto el primer ejemplo de la optimización de las propiedades enzimáticas de
una mureín-hidrolasa nativa de neumococo, en este caso codificada por un fago, que es
capaz de hidrolizar diversas paredes bacterianas, más allá de las de su sustrato homólogo.
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5
10
15
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Tabla 1. Lista de bacterias utilizadas
Bacteria
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Streptococcus mitis
Streptococcus agalactiae
Streptococcus iniae
Streptococcus mutans
Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis
Staphylococcus aureus
BifidobaGterium adolescentis
Corynebacterium jeikeium
Enterococcus faecalis
Lactococcus lactis subsp. lactis
Mycobacterium smegmatis
Escherichia coli
Cepa
R6
P007
P008
039 048 69
1515
SK598
12344
49456
13813
29178
25175
9542
12600
12600
43734
19433
9936
19420
Origenb
CIB
CIB
CIB
CIB
CIB
ISCIII
ISCIII
CECT
CIB
CIB
CECT
CECT
CECT
CECT
CECT
CECT
OSM
CECT
CECT
CIB
CIB
25 Pseudomonas putida KT2442 CIB
30
aATCC, American Type Culture Collection. bCIB, Centro de Investigaciones Biológicas;
CECT, Colección Española de Cultivos Tipo; OSMZ, Oeutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; ISCIII, Instituto de Salud Carlos 111.
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Tabla 2. Análisis de células viables de las diferentes cepas estudiadas tras incubarlas
durante 60 min con distintas mureín-hidrolasas
Bacteria Cpl-1 Cpl-7 Cp17- Cp17- Cp17- Cp11- Cp11-005 N05 OOE 075 005
5 Gram-positivas
S. pneumoniae
R6 * +++ ++++ ++++ +++ +++ +++
039 * ++ +++ ++ ++ +++ +++
P007 * ++ ++ ++ ++ ++ ++
10 P008 * ++ +++ ++ ++ ++ ++
048 ++++ + ++ ++ ++ ++ ++
69 * ++ +++ n.d. n.d. n.d. n.d.
1515 * ++ +++ n.d. n.d. n.d. n.d.
S.pyogenes +++ ++++ +++ +++ +++ +++
15 S. mitis SK598 +++ +++ ++ ++ ++ ++
49456 ++++ +++ ++++ n.d. n.d. n.d. n.d.
S. agalactiae S. iniae + + + + + +
20 S. mutans + +
S. dysgalactiae + + + + + +
S. aureus B. adolescentis + + + + + +
C. jeikeium 25 E. faecalis ++ ++ n.d. n.d. n.d. n.d.
L. lactis M. smegmatis
Gram-negativas
E. coli OH 1 08 + +++ + + + +
30 P. putida ++ ++ + KT2442 (-) Sin efecto; n.d. no determinado; (+) Descenso de 1 unidad logarítmica en
células viables; (++) Descenso de 2 unidades logarítmicas en células viables; (+++)
Descenso de 3 unidades logarítmicas en células viables; (++++) Descenso de 4 o
35 más unidades logarítmicas en células viables; (*) < 10 unidades formadoras de
colonias/mI.
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5
Tabla 3. Concentración mínima inhibitoria (CMI)
Enzibióticos
Cpl-7
Cp17-00S
Cpl-1
CMI
256 IJg/ml
64 IJg/ml
16 IJg/ml
Los ensayos de lisis sobre las bacterias Gram-positivas ensayadas se realizaron a
diferentes concentraciones de enzima (Figura 2), y como concentración standard se escogió
5IJg/ml (Figuras 4-14). Finalmente, en el ensayo estándar se usó una solución de la bacteria
a estudiar resuspendida en tampón PBS (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na2HP04·2
10 H20, 2 mM KH2P04, pH 6.0) con un valor de 00550 == 0.6 y, tras añadir una determinada
cantidad de enzima purificada, se midió la evolución de la turbidez de la muestra a 550 nm
(00550 ) incubando durante 60 minutos a 3TC. A diferentes intervalos se tomaron alícuotas
de las muestras para observar la morfología celular al microscopio óptico y se calculó el
número de células viables (Figuras 3-13).
15 En general, las mureín-hidrolasas han demostrado su efectividad contra bacterias Gram-
positivas pero se han mostrado ineficaces contra las Gram-negativas, debido a la presencia
en estas últimas de una membrana externa que impide el acceso directo de la enzima al
peptidoglicano, su sustrato natural; consistentemente, los mismos resultados se obtuvieron
en nuestro caso con E. coli y P. putida. Es por ello que se recurrió a combinar el tratamiento
20 enzimático con la adición de compuestos capaces de inducir alteraciones de la membrana
externa y, por tanto, facilitar la acción de las mureín-hidrolasas añadidas desde el exterior.
Para dicha estrategia se seleccionaron algunos aceites esenciales que habían demostrado
tener actividad antibacteriana y cuyo modo de acción está asociado a la modificación de las
membranas celulares (Burt, S. 2004. Int. J. Food Microbiol. 94:223-253). Más
25 concretamente, se ha descrito que el carvacrol y el timol son capaces de desintegrar la
membrana externa de bacterias Gram-negativas, liberando lipopolisacáridos e
incrementando la permeabilidad de la membrana citoplásmica al ATP (Helander et al. 1998.
J. Agr. Food Chem. 46:3590-3595). Así pues, se probaron distintas concentraciones (0.1 %,
0.01% Y 0.001%) de estos dos aceites esenciales utilizando E. coli y P. putida como
30 sistemas modelo (datos no mostrados). Finalmente se eligió carvacrol al 0.01 % por su
capacidad para promover la acción lítica de algunas de las mureín-hidrolasas ensayadas sin
tener apenas efecto bactericida por sí mismo. En estas condiciones, la tasa de muerte
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inducida por Cp17-00S a 5 f..lg/ml transcurridos 60 min superaba en dos unidades
logarítmicas (P. putida) y tres unidades logarítmicas (E. coli) a la provocada únicamente por
el carvacrol (Figura 13 y Tabla 2), mientras que la lisozima Cpl-1, dependiente de colina
para su actividad, se mostró completamente ineficaz.
5 En la Tabla 2 se resumen los valores obtenidos para las tasas de muerte celular causadas
por las distintas enzimas en las cepas testadas. A partir de los mismos se puede concluir
que la modificación del módulo de unión a pared celular de C-Cpl-7, y en particular los
cambios introducidos en el módulo C-Cpl-7S, potencian significativamente la actividad
antimicrobiana de las lisinas que los portan, haciéndolas particularmente eficaces frente a
10 las distintas cepas de neumococo ensayadas, incluidos los aislados clínicos
multirresistentes, así como frente a S. pyogenes, y S. mitis, otros dos importantes patógenos
humanos.
Ejemplo 4. Actividad bactericida de los mutantes de C-Cpl-7 in vivo.
Para validar estos resultados obtenidos in vitro en un modelo de infección animal, se puso a
15 punto un modelo utilizado previamente para estudiar la patogénesis de estafilococos y que
supone una alternativa al clásico modelo murino: los embriones de pez cebra (Miller y Neely.
2004. Acta Trop. 91 :53-68). Embriones de 72 horas mantenidos en medio E3 (5 mM NaCI,
0,17 mM KCI, 0,33 mM CaCb and 0,33 mM MgS04 , pH 7.0) se expusieron, por inmersión, a
la acción de neumococo (cepa 039) oS. pyogenes durante 7 horas a 28.5'C, al cabo de las
20 cuales se lavaron con medio E3 y se trataron con buffer o con una solución de mureín-
hidrolasa (25 IJg ml-1). En estas condiciones la tasa de mortalidad de los embriones
infectados era significativa con respecto a los controles no expuestos a las bacterias (22.6%
para S. pneumoniae y 29.4% para S. pyogenes). Como se muestra en la Figura 14, la
adición de Cpl7 -OOS a las muestras infectadas elevó de forma significativa la tasa de
25 supervivencia (99% en el caso de neumococo y 95.3% en el caso de S. pyogenes). Por el
contrario el tratamiento con Cpl-1 sólo protegió a los embriones infectados por S.
pneumoniae. Estos resultados demuestran la capacidad de Cp17-00S y otras mureín-
hidrolasas portadoras del módulo C-Cpl-7 mejorado para actuar como antimicrobianos in
vivo frente a infecciones causadas por patógenos susceptibles a las mismas (Figura 14).
30 Materiales y métodos
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Bacterias y medios de cultivo. Las cepas bacterianas utilizadas se enumeran en la Tabla
1 y las características de las cepas de neumococo se resumen a continuación: R6, cepa de
laboratorio no capsulada; 039 (cápsula tipo 2); P007 (cápsula tipo 3) (Oomenech et aL,
2009. Environ. Microbiol. 11 :2542-2555); P008 (cápsula tipo 4) (similar a P007 pero
5 transformada con ONA de un tipo 4 capsular), y 048 (cápsula tipo 23F), 1515 (cápsula tipo
6B) y 69 (cápsula tipo 19F) son aislados clínicos multirresistentes (Ramos-Sevillano et al.
2012. Antimicrob. Agents Chemother. 56:5534-5540). Las bacterias Gram-positivas se
sembraron en medios BHI (C. jeikeium, S. dysga/actiae, S. iniae) , LB (M. smegmatis
mc2155), M17 (L. lactis) , BM (B. adolescentes), y C+Y (todas las demás), y se crecieron a
10 3TC sin agitación, excepto S. iniae que fue con agitación (Lacks y Hotchkiss. 1960.
Biochim. Biophys. Acta 39: 508-517). E. coli y P. putida se crecieron, con agitación, en
medio LB a 37°C y 30°C, respectivamente (Sambrook y Russell. 2001. Molecular Cloning. A
Laboratory Manual). Las cepas se conservaron congeladas a -70'C en medio de cultivo al
que se añadió glicerol al 10% (v/v) (concentración final).
15 Construcción de genes y purificación de proteínas. Los genes codificantes de CpI7-00S,
CpI7-NOS, CpI7-00E, Cp11-00S y Cp11-07S se obtuvieron a partir de plásmidos
recombinantes sintetizados por la empresa ATG:biosynthetics (Merzhausen, Alemania).
Para dichas síntesis se partió de los genes nativos cpl-1 y cpl-7 (García et al. 1988. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85: 914-918; García et al. 1990. Gene 86: 81-88). La secuencia de C-
20 Cpl-7 se modificó para invertir su carga neta de elevadamente negativa a positiva,
basándose en la observación de Low y colaboradores de que la carga neta del módulo
catalítico de las mureín-hidrolasas fágicas determina el que la actividad bactericida de las
mismas dependa o no de la adquisición de módulos de unión a la pared celular (Low et al.
2011. J. Biol. Chem. 286: 34391-34403), yen la hipótesis de que la carga de los módulos de
25 unión a la pared celular podría tener en efecto comparable, aunque no haya sido
previamente observado. Tras un exhaustivo análisis de la conservación de secuencias en
las familias GH-25 (módulo catalítico de Cpl-1 y Cpl-7; PF081183) y de las repeticiones
CW_7 (PF08230; código de acceso a PFAM), y basándose en la información estructural
disponible (Bustamante et al. 2010. J. Biol. Chem. 285:33184-33196), se introdujeron
30 mutaciones que por su naturaleza o localización no deberían afectar a la estructura de los
mutantes. De esta manera, se mutaron varios residuos localizados tanto en el módulo N-
terminal como en el C-terminal por lo que la carga neta pasó, por ejemplo, de -28.8 (Cpl-7) a
-10.85 (CpI7-00S) y -7.85 (CpI7-NOS). Los cambios introducidos se detallan en el ejemplo 1.
En todos los casos, se aprovecharon estas síntesis para cambiar algunos codones de los
35 genes originales, pero sin provocar cambios en la secuencia de aminoácidos, con el objetivo
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de optimizar la expresión en E. coli y facilitar la introducción de nuevas mutaciones
puntuales en C-Cpl-7 al romper la repetición perfecta de codones que existe en esta región
en el gen silvestre. Los genes codificantes de estas enzimas, suministrados por
ATG:biosinthetic en un plásmido derivado de pUC, se subclonaron en el plásmido pT7-7 y
5 su expresión se llevó a cabo en la cepa de E. coli BL21 (DE3).
La pureza de las proteínas recombinantes se verificó por SDS-PAGE y espectrometría de
masas (MALDI-TOF). Las enzimas purificadas se conservaron a -20°C y se diluyeron en
PBS (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na2HP04 and 1.8 mM KH2P04), pH 6.0, antes de
realizar los ensayos. Las concentraciones de proteína se midieron espectrofotométricamente
10 utilizando los coeficientes de absorción molar a 280 nm.
Las secuencias de todas estas mureín-hidrolasas y sus genes codificantes se muestran en
los esquemas de los ejemplos 1 y 2. La carga neta de las proteínas y sus módulos a pH
neutro se calculó a partir de la secuencia de aminoácidos con el programa Sendterp (Laue
et al. 1992. En Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science (Harding,
15 SE, Rowe, AJ, y Horton, JC, eds) pp. 90-125, Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK).
Evaluación de la conservación de la estructura nativa de los mutantes de Cpl-7. La
conservación del estado nativo se verificó por dicroísmo circular (DC) y ultracentrifugación
analítica. Los espectros de DC se registraron (UV-Iejano y UV-cercano) en las condiciones
previamente descritas por Bustamante et al. (2010), utilizando un espectropolarímetro J-81 O.
20 Los experimentos de velocidad de sedimentación se realizaron en una ultracentrífuga
Optima XL-A a 45.000 rpm utilizando células de doble sector. La distribución de coeficientes
de sedimentación se calculó modelando por mínimos cuadrados no lineales los datos
experimentales, con el programa SEDFIT (Laue et al. 1992. En Analytical Ultracentrifugation
in Biochemistry and Polymer Science (Harding, SE, Rowe, AJ, y Horton, JC, eds) pp. 90-
25 125, Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK). Todas las medidas se realizaron en 20
mM fosfato, pH 6.0, a 20°C.
Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI). Las CMls para Cpl-7, Cp17-
OOS Y Cpl-1 (Tabla 3) se midieron usando la cepa control para ensayos de susceptibilidad en
neumococo ATCC 49619 (serotipo 19 F) (http://www.lgcstandards-
30 atcc.org/Products/AII/49619.aspx). Se siguió el método de microdilución aprobado por el
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), usando caldo Mueller-Hinton 11 ajustado
en cationes (Becton, Dickinson and Co., Le Pont-de-Claix, Francia) suplementado con
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sangre lisada de caballo al 5% (CA-MHB-LHB). Los ensayos se realizaron por triplicado y se
procedió a su lectura tras 20-24 horas a 37°C.
Ensayo de actividad bactericida y cálculo de células viables. Las bacterias en fase
exponencial de crecimiento se centrifugaron y se resuspendieron en 1.5 mi de PBS
5 ajustando la turbidez final de las suspensiones a una 00550 == 0,6. A estas muestras se
añadieron concentraciones adecuadas de las diferentes enzimas purificadas, o un volumen
equivalente de PBS (controles). Los tubos se incubaron a 3TC durante una hora
midiéndose la 00550 a distintos tiempos de incubación. En los ensayos con bacterias Gram-
negativas, las células se resuspendieron en PBS suplementado con la concentración
10 deseada de carvacrol o timol (0.1 %, 0.01 % Y 0.001 %) antes de proceder de la forma
anteriormente descrita, y se realizaron controles en ausencia y en presencia de los mismos.
Para calcular el número de células viables, se realizaron diluciones seriadas de las muestras
en PBS y se sembraron en placas de agar en medio C+Y o de agar-sangre (agar de soja
tripticaseína suplementado con 5% de sangre desfibrinada de carnero) en el caso de las
15 bacterias Gram-positivas y en placas de agar-LB en las Gram-negativas. Las placas se
incubaron toda la noche a 37'C y se contaron las co lonias. Todos los ensayos se realizaron
por triplicado.
Ensayo de actividad bactericida en el modelo de embriones de pez cebra. Los
embriones silvestres distribuidos por ZF-biolabs (Tres Cantos, Madrid), se mantuvieron de
20 acuerdo a los protocolos estándar (Westerfield M. 1993. The zebrafish book. A guide for the
laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). Eugene: The University of Oregon Press) y
se trataron con pronasa (2 mg/ml) durante 2 minutos para eliminar el corion 24 h después
de la fecundación. Durante los experimentos los embriones se mantuvieron en medio E3 (5
mM NaCI, 0,17 mM KCI, 0,33 mM CaCb and 0,33 mM MgS04), pH 7, a 28.5'C. A las 72 h
25 de la fecundación, los embriones se expusieron a la acción de los patógenos, agregando las
bacterias ("" 108 CFU ml-1) previamente resuspendidas en medio E3. Al cabo de 7 h las
muestras se lavaron de forma exhaustiva (7 veces) con medio E3 para eliminar las bacterias
y se agregó Cp17-00S o Cpl-1 (dosis única de 25 f..lg), o la cantidad equivalente de tampón
(controles). La evolución de los embriones se siguió durante cinco días, añadiendo medio E3
30 fresco cada día. Los embriones se consideraron muertos cuando no se observó movimiento
y desaparecía poco tiempo después la transparencia de los mismos. Controles con
muestras libres de bacterias se realizaron en paralelo. Se emplearon un total de 255
embriones distribuidos individualmente en placas de 96 pocillos. Se probaron las siguientes
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5
10
15
condiciones (24-36 embriones para cada condición) y cada experimento se repitió un
mínimo de tres veces:
Control (embriones + medio E3)
Control + enzima ensayada
Infección con S. pneumoniae 039
Infección con S. pneumoniae 039 + tratamiento con las enzimas ensayadas (CpI7-
OOS o Cpl-1)
Infección con S. pyogenes
Infección con S. pyogenes + tratamiento con las enzimas ensayadas (CpI7-00S o
Cpl-1 )
En la Figura 14 se muestran las tasas de supervivencia de los embriones en las distintas
condiciones ensayadas. La viabilidad de los embriones incubados con la cepa R6 de
neumococo (no patogénica) o con la cepa 039 inactivada por calentamiento (10 min a 65°C)
era equivalente a la de los controles.
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REIVINDICACIONES
1. Polipéptido que consiste en el módulo de unión a pared de la lisina epl-7, e-epl-7,
modificado para que aumente su carga neta lo que le confiere una mayor capacidad de
unión a la pared celular bacteriana, y caracterizado porque su secuencia de aminoácidos
5 presenta una identidad de al menos un 50% con respecto a la secuencia parental SEQ ID
NO 7, Y porque comprende, al menos, las siguientes alteraciones en su secuencia de
aminoácidos:
10
15
20
25
30
35
la posición homóloga a la posición 216 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (L) original por el aminoácido (K),
la posición homóloga a la posición 225 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (O) original por el aminoácido (K),
la posición homóloga a la posición 230 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (A) original por el aminoácido (R),
la posición homóloga a la posición 233 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (O) original por el aminoácido (N),
la posición homóloga a la posición 239 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (O) original por el aminoácido (N),
la posición homóloga a la posición 264 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (L) original por el aminoácido (K),
la posición homóloga a la posición 273 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (O) original por el aminoácido (K),
la posición homóloga a la posición 278 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (A) original por el aminoácido (R),
la posición homóloga a la posición 281 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (O) original por el aminoácido (N),
la posición homóloga a la posición 287 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (O) original por el aminoácido (N),
la posición homóloga a la posición 312 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (L) original por el aminoácido (K),
la posición homóloga a la posición 321 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (O) original por el aminoácido (K),
la posición homóloga a la posición 326 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (A) original por el aminoácido (R),
la posición homóloga a la posición 329 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (O) original por el aminoácido (N),
35
ES 2 525 954 B1
la posición homóloga a la posición 335 de dicha secuencia, que sustituye el
aminoácido (D) original por el aminoácido (N).
2. Polipéptido según la reivindicación 1 caracterizado por que su secuencia se
corresponde con la secuencia SEQ ID NO 11.
5 3. Polinucleótido caracterizado por que codifica para el polipéptido según las
reivindicaciones 1 y 2.
4. Polinucleótido según la reivindicación 3 caracterizado por que su secuencia se
corresponde con la secuencia SEQ ID NO 12.
5. Vector caracterizado por que comprende, al menos, el polinucleótido según las
10 reivindicaciones 3 y 4.
6. Célula hospedadora caracterizada por que comprende, al menos, el vector según la
reivindicación 5.
7. Célula hospedadora según la reivindicación 6 caracterizada por ser Escherichia coli.
8. Método de obtención del polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado por
15 que comprende:
a) introducir el vector según la reivindicación 5 en una célula hospedadora
adecuada
b) cultivar la célula hospedadora según las reivindicaciones 5 y 6 en un medio
adecuado, y,
20 c) purificar el polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2.
25
9. Uso del polinucleótido según las reivindicaciones 3 y 4 para la obtención del polipéptido
según las reivindicaciones 1 y 2.
10. Uso de la célula hospedadora según las reivindicaciones 5 y 6 para la obtención del
polipéptido según las reivindicaciones 1 y 2.
36
ES 2 525 954 B1
11. Polipéptido según la reivindicación 1 y 2 caracterizado por que está unido a una etiqueta
de marcaje.
12. Uso del polipéptido según la reivindicación 11 en técnicas de marcaje bacteriano.
13. Uso del polipéptido según la reivindicación 12 caracterizado por que está unido a una
5 partícula de aislamiento útil para la concentración de la población bacteriana de una
muestra.
10
14. Enzima quimérica caracterizada por que, al menos, comprende los siguientes
polipéptidos:
a) un módulo catalítico N-terminal procedente de un fago bacteriano,
b) un módulo de unión pared C-terminal según las reivindicaciones 1 y 2.
15. Enzima quimérica según la reivindicación 14 caracterizado por que su secuencia se
corresponde con alguna de las siguientes SEO ID NO 17, SEO ID NO 19, SEO ID NO 23,
SEO ID NO 25.
16. Polinucleótido caracterizado por que codifica una enzima quimérica según las
15 reivindicaciones 14 y 15.
17. Polinucleótido según la reivindicación 16 caracterizado por que su secuencia se
corresponde con alguna de las siguientes SEO ID NO 18, SEO ID NO 20, SEO ID NO 24,
SEO ID NO 26.
18. Vector caracterizado por que comprende, al menos, el polinucleótido según las
20 reivindicaciones 16 y 17.
19. Célula hospedadora caracterizada por que comprende, al menos, el vector según la
reivindicación 18.
20. Célula hospedadora según la reivindicación 19 caracterizada por ser Escherichia coli.
37
ES 2 525 954 B1
5
21. Método de obtención de la enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15 que
comprende:
a) introducir el vector según la reivindicación 18 en una célula hospedadora
adecuada
b) cultivar la célula hospedadora según las reivindicaciones 19 y 20 en un medio
adecuado, y,
c) purificar la enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15.
22. Uso del polinucleótido según las reivindicaciones 16 y 17 para la obtención de la enzima
quimérica según las reivindicaciones 14 y 15.
10 23. Uso de la célula hospedadora según las reivindicaciones 19 y 20 para la obtención de la
enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15.
24. Uso de la enzima quimérica según las reivindicaciones 14 y 15 en la elaboración de una
composición farmacéutica útil para el tratamiento de una infección bacteriana o como
antiséptico.
15 25. Composición farmacéutica útil para el tratamiento de enfermedades infecciosas o como
antiséptico caracterizada por que comprende al menos una enzima quimérica según las
reivindicaciones 14 y 15.
26. Composición farmacéutica según la reivindicación 25 caracterizada por que la
secuencia de la enzima quimérica se corresponde con alguna de las siguientes: SEO ID NO
20 17, SEO ID NO 19, SEO ID NO 23, SEO ID NO 25.
27. Composición farmacéutica según la reivindicación 25 caracterizada por que contiene
además un adyuvante y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
28. Composición farmacéutica según las reivindicaciones 25 a 27 caracterizada por que
contiene además otro principio activo.
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ES 2 525 954 B1
<110> Consejo Superior de Investigaciones CientíficasCIBER Enfermedades Respiratorias
<120> ENZIBIÓTICOS BACTERICIDAS MEJORADOS FRENTE A NEUMOCOCO Y OTRAS BACTERIAS
<130> 2013-0312
<160> 26
<170> BiSSAP 1.2
<210> 1<211> 342<212> PRT<213> Cp-7
<220> <223> Native Sequence
<400> 1Met Val Lys Lys Asn Asp Leu Phe Val Asp Val Ala Ser His Gln Gly 1 5 10 15 Tyr Asp Ile Ser Gly Ile Leu Glu Glu Ala Gly Thr Thr Asn Thr Ile
20 25 30 Ile Lys Val Ser Glu Ser Thr Ser Tyr Leu Asn Pro Cys Leu Ser Ala
35 40 45 Gln Val Ser Gln Ser Asn Pro Ile Gly Phe Tyr His Phe Ala Trp Phe
50 55 60 Gly Gly Asn Glu Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Arg Tyr Phe Leu Asp 65 70 75 80 Asn Val Pro Thr Gln Val Lys Tyr Leu Val Leu Asp Tyr Glu Asp His
85 90 95 Ala Ser Ala Ser Val Gln Arg Asn Thr Thr Ala Cys Leu Arg Phe Met
100 105 110 Gln Ile Ile Ala Glu Ala Gly Tyr Thr Pro Ile Tyr Tyr Ser Tyr Lys
115 120 125 Pro Phe Thr Leu Asp Asn Val Asp Tyr Gln Gln Ile Leu Ala Gln Phe
130 135 140 Pro Asn Ser Leu Trp Ile Ala Gly Tyr Gly Leu Asn Asp Gly Thr Ala 145 150 155 160 Asn Phe Glu Tyr Phe Pro Ser Met Asp Gly Ile Arg Trp Trp Gln Tyr
165 170 175 Ser Ser Asn Pro Phe Asp Lys Asn Ile Val Leu Leu Asp Asp Glu Lys
180 185 190 Glu Asp Asn Ile Asn Asn Glu Asn Thr Leu Lys Ser Leu Thr Thr Val
195 200 205 Ala Asn Glu Val Ile Gln Gly Leu Trp Gly Asn Gly Gln Glu Arg Tyr
210 215 220 Asp Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Asp Pro Gln Ala Val Gln Asp Lys 225 230 235 240 Val Asn Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Ile Ala Asp Leu Thr Thr Val
245 250 255 Ala Asn Glu Val Ile Gln Gly Leu Trp Gly Asn Gly Gln Glu Arg Tyr
260 265 270 Asp Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Asp Pro Gln Ala Val Gln Asp Lys
275 280 285 Val Asn Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Ile Ala Asp Leu Thr Thr Val
290 295 300 Ala Asn Glu Val Ile Gln Gly Leu Trp Gly Asn Gly Gln Glu Arg Tyr 305 310 315 320 Asp Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Asp Pro Gln Ala Val Gln Asp Lys
325 330 335 Val Asn Glu Leu Leu Ser
340
<210> 2<211> 1029
1
P20133077728-05-2013
Listado de Secuencias
ES 2 525 954 B1
<212> DNA<213> Cp-7
<220> <221> source<222> 1..1029<223> /mol_type="unassigned DNA"
/organism="Cp-7"
<400> 2atggttaaga aaaatgattt atttgtagac gttgcaagcc atcaaggcta cgacatttca 60
ggaattttag aagaagcagg gacaacaaac acaattatta aagtgtcaga aagtacaagc 120
tatttaaacc cttgcttgtc tgctcaagtg agccagtcaa atcctatcgg gttttatcat 180
tttgcttggt ttggtggaaa tgaagaagaa gcagaagcag aagcacgcta tttccttgat 240
aacgtgccta cacaagttaa ataccttgta ctagattatg aagaccatgc aagcgcaagc 300
gtacaaagaa acactaccgc gtgcttacgc tttatgcaaa ttatcgcaga agctggatat 360
acacctattt attatagtta caaaccgttt acgcttgata atgtggacta tcagcagatt 420
ttagcacagt tccctaattc tctatggatt gcaggctatg gcttaaatga tggtacagct 480
aactttgaat actttccaag catggacggt atcagatggt ggcaatattc tagtaacccg 540
tttgacaaga atattgtact gttagatgat gagaaagaag ataatataaa caatgaaaac 600
actctaaaaa gccttaccac agtagccaac gaggtcattc agggactttg gggcaacggt 660
caagaacgtt atgacagttt agcgaatgca gggtatgacc cccaagcggt tcaagacaaa 720
gtgaatgaaa tcttaaacgc tagagaaatt gcagacctta ccacagtagc caacgaggtc 780
attcagggac tttggggcaa cggtcaagaa cgttatgaca gtttagcgaa tgcagggtat 840
gacccccaag cggttcaaga caaagtgaat gaaatcttaa acgctagaga aattgcagac 900
cttaccacag tagccaacga ggtcattcag ggactttggg gcaacggtca agaacgttat 960
gacagtttag cgaatgcagg gtatgacccc caagcggttc aagacaaagt gaatgaatta 1020
ctttcataa 1029
<210> 3<211> 188<212> PRT<213> Cp-7
<220> <223> N-terminal domain Cpl-7
<400> 3Met Val Lys Lys Asn Asp Leu Phe Val Asp Val Ala Ser His Gln Gly 1 5 10 15 Tyr Asp Ile Ser Gly Ile Leu Glu Glu Ala Gly Thr Thr Asn Thr Ile
20 25 30 Ile Lys Val Ser Glu Ser Thr Ser Tyr Leu Asn Pro Cys Leu Ser Ala
35 40 45 Gln Val Ser Gln Ser Asn Pro Ile Gly Phe Tyr His Phe Ala Trp Phe
50 55 60 Gly Gly Asn Glu Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Arg Tyr Phe Leu Asp 65 70 75 80 Asn Val Pro Thr Gln Val Lys Tyr Leu Val Leu Asp Tyr Glu Asp His
85 90 95 Ala Ser Ala Ser Val Gln Arg Asn Thr Thr Ala Cys Leu Arg Phe Met
100 105 110 2
P20133077728-05-2013
ES 2 525 954 B1
Gln Ile Ile Ala Glu Ala Gly Tyr Thr Pro Ile Tyr Tyr Ser Tyr Lys 115 120 125
Pro Phe Thr Leu Asp Asn Val Asp Tyr Gln Gln Ile Leu Ala Gln Phe 130 135 140
Pro Asn Ser Leu Trp Ile Ala Gly Tyr Gly Leu Asn Asp Gly Thr Ala 145 150 155 160 Asn Phe Glu Tyr Phe Pro Ser Met Asp Gly Ile Arg Trp Trp Gln Tyr
165 170 175 Ser Ser Asn Pro Phe Asp Lys Asn Ile Val Leu Leu
180 185
<210> 4<211> 564<212> DNA<213> Cp-7
<220> <221> source<222> 1..564<223> /mol_type="unassigned DNA"
/note="N-terminal domain Cpl-7"/organism="Cp-7"
<400> 4atggttaaga aaaatgattt atttgtagac gttgcaagcc atcaaggcta cgacatttca 60
ggaattttag aagaagcagg gacaacaaac acaattatta aagtgtcaga aagtacaagc 120
tatttaaacc cttgcttgtc tgctcaagtg agccagtcaa atcctatcgg gttttatcat 180
tttgcttggt ttggtggaaa tgaagaagaa gcagaagcag aagcacgcta tttccttgat 240
aacgtgccta cacaagttaa ataccttgta ctagattatg aagaccatgc aagcgcaagc 300
gtacaaagaa acactaccgc gtgcttacgc tttatgcaaa ttatcgcaga agctggatat 360
acacctattt attatagtta caaaccgttt acgcttgata atgtggacta tcagcagatt 420
ttagcacagt tccctaattc tctatggatt gcaggctatg gcttaaatga tggtacagct 480
aactttgaat actttccaag catggacggt atcagatggt ggcaatattc tagtaacccg 540
tttgacaaga atattgtact gtta 564
<210> 5<211> 16<212> PRT<213> Cp-7
<220> <223> Linker Cpl-7
<400> 5Asp Asp Glu Lys Glu Asp Asn Ile Asn Asn Glu Asn Thr Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 6<211> 45<212> DNA<213> Cp-7
<220> <221> source<222> 1..45<223> /mol_type="unassigned DNA"
/note="Linker Cpl-7"/organism="Cp-7"
3
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ES 2 525 954 B1
<400> 6gatgatgaga aagaagataa tataaacaat gaaaacactc taaaa 45
<210> 7<211> 138<212> PRT<213> Cp-7
<220> <223> C-Terminal domain
<400> 7Leu Thr Thr Val Ala Asn Glu Val Ile Gln Gly Leu Trp Gly Asn Gly 1 5 10 15 Gln Glu Arg Tyr Asp Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Asp Pro Gln Ala
20 25 30 Val Gln Asp Lys Val Asn Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Ile Ala Asp
35 40 45 Leu Thr Thr Val Ala Asn Glu Val Ile Gln Gly Leu Trp Gly Asn Gly
50 55 60 Gln Glu Arg Tyr Asp Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Asp Pro Gln Ala 65 70 75 80 Val Gln Asp Lys Val Asn Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Ile Ala Asp
85 90 95 Leu Thr Thr Val Ala Asn Glu Val Ile Gln Gly Leu Trp Gly Asn Gly
100 105 110 Gln Glu Arg Tyr Asp Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Asp Pro Gln Ala
115 120 125 Val Gln Asp Lys Val Asn Glu Leu Leu Ser
130 135
<210> 8<211> 420<212> DNA<213> Cp-7
<220> <221> source<222> 1..420<223> /mol_type="unassigned DNA"
/note="C-terminal domain Cpl-7"/organism="Cp-7"
<400> 8agccttacca cagtagccaa cgaggtcatt cagggacttt ggggcaacgg tcaagaacgt 60
tatgacagtt tagcgaatgc agggtatgac ccccaagcgg ttcaagacaa agtgaatgaa 120
atcttaaacg ctagagaaat tgcagacctt accacagtag ccaacgaggt cattcaggga 180
ctttggggca acggtcaaga acgttatgac agtttagcga atgcagggta tgacccccaa 240
gcggttcaag acaaagtgaa tgaaatctta aacgctagag aaattgcaga ccttaccaca 300
gtagccaacg aggtcattca gggactttgg ggcaacggtc aagaacgtta tgacagttta 360
gcgaatgcag ggtatgaccc ccaagcggtt caagacaaag tgaatgaatt actttcataa 420
<210> 9<211> 188<212> PRT<213> Cp-7
<220> <223> N-terminal domain Mutant 7N
<400> 94
P20133077728-05-2013
ES 2 525 954 B1
Met Val Lys Lys Asn Asp Leu Phe Val Asp Val Ala Ser His Gln Gly 1 5 10 15 Tyr Asp Ile Ser Gly Ile Leu Glu Gln Ala Gly Thr Thr Asn Thr Ile
20 25 30 Ile Lys Val Ser Glu Ser Thr Ser Tyr Leu Asn Pro Cys Leu Ser Ala
35 40 45 Gln Val Ser Gln Ser Asn Pro Ile Gly Phe Tyr His Phe Ala Trp Phe
50 55 60 Gly Gly Asn Gln Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala Arg Tyr Phe Leu Asp 65 70 75 80 Asn Val Pro Thr Gln Val Lys Tyr Leu Val Leu Asp Tyr Glu Asp His
85 90 95 Ala Ser Ala Ser Val Gln Arg Asn Thr Thr Ala Cys Leu Arg Phe Met
100 105 110 Gln Ile Ile Ala Glu Ala Gly Tyr Thr Pro Ile Tyr Tyr Ser Tyr Lys
115 120 125 Pro Phe Thr Leu Asp Asn Val Asp Tyr Gln Gln Ile Leu Ala Gln Phe
130 135 140 Pro Asn Ser Leu Trp Ile Ala Gly Tyr Gly Leu Asn Asp Gly Thr Ala 145 150 155 160 Asn Phe Glu Tyr Phe Pro Ser Met Asp Gly Ile Arg Trp Trp Gln Tyr
165 170 175 Ser Ser Asn Pro Phe Asp Lys Asn Ile Val Leu Leu
180 185
<210> 10<211> 564<212> DNA<213> Cp-7
<220> <221> source<222> 1..564<223> /mol_type="unassigned DNA"
/note="N-terminal domain Mutant Cpl-7N"/organism="Cp-7"
<400> 10atggttaaaa agaacgacct gttcgttgac gttgcgtctc accagggtta cgacatctct 60
ggtatcctgg aacaggcggg taccaccaac accatcatca aagtttctga atctaccagc 120
tacctgaacc cgtgcctgtc tgcgcaggtt tctcagtcta acccgatcgg tttctaccac 180
ttcgcgtggt tcggtggtaa ccaggcggaa gcggaagcgg aagcgcgtta cttcctggac 240
aacgttccga cccaggttaa atacctggtt ctggactacg aagaccacgc gtctgcgtct 300
gttcagcgta acaccaccgc gtgcctgcgt ttcatgcaga tcatcgcgga agcgggttac 360
accccgatct actactctta caaaccgttc accctggaca acgttgacta ccagcagatc 420
ctggcgcagt tcccgaactc tctgtggatc gcgggttacg gtctgaacga cggtaccgcg 480
aacttcgaat acttcccgtc tatggacggt atccgttggt ggcagtactc ttctaacccg 540
ttcgacaaaa acatcgttct gctg 564
<210> 11<211> 138<212> PRT<213> Cp-7
<220> <223> C-terminal domain Mutant Cpl-7S
<400> 11Leu Thr Thr Val Ala Asn Glu Val Ile Gln Gly Lys Trp Gly Asn Gly 1 5 10 15
5
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ES 2 525 954 B1
Gln Glu Arg Tyr Lys Ser Leu Ala Asn Arg Gly Tyr Asn Pro Gln Ala 20 25 30
Val Gln Asn Lys Val Asn Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Ile Ala Asp 35 40 45
Leu Thr Thr Val Ala Asn Glu Val Ile Gln Gly Lys Trp Gly Asn Gly 50 55 60
Gln Glu Arg Tyr Lys Ser Leu Ala Asn Arg Gly Tyr Asn Pro Gln Ala 65 70 75 80 Val Gln Asn Lys Val Asn Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Ile Ala Asp
85 90 95 Leu Thr Thr Val Ala Asn Glu Val Ile Gln Gly Lys Trp Gly Asn Gly
100 105 110 Gln Glu Arg Tyr Lys Ser Leu Ala Asn Arg Gly Tyr Asn Pro Gln Ala
115 120 125 Val Gln Asn Lys Val Asn Glu Leu Leu Ser
130 135
<210> 12<211> 415<212> DNA<213> Cp-7
<220> <221> source<222> 1..415<223> /mol_type="unassigned DNA"
/note="C-terminal domain Mutant 7N"/organism="Cp-7"
<400> 12gacgaccgtt gcgaatgaag ttatccaagg taaatggggt aatggccagg agcgctacaa 60
atctctggcc aaccgtggtt acaatccgca ggccgtgcag aataaagtta acgagattct 120
gaatgcgcgt gagatcgcgg atctcactac ggtggcaaac gaagtgattc aaggcaagtg 180
ggggaacggg caggaacggt acaagtcctt ggcaaaccgc ggctacaacc cacaggcagt 240
acagaacaag gtaaacgaaa tcttgaacgc tcgcgaaatt gctgacctta ccacagtagc 300
caatgaggtc attcagggaa aatggggcaa cggtcaagaa cgttataaaa gtttagcgaa 360
tcgagggtat aatccccaag cggttcaaaa taaagtgaat gaattacttt cataa 415
<210> 13<211> 188<212> PRT<213> Cp-7
<220> <223> N-terminal domain Cpl-1
<400> 13Met Val Lys Lys Asn Asp Leu Phe Val Asp Val Ser Ser His Asn Gly 1 5 10 15 Tyr Asp Ile Thr Gly Ile Leu Glu Gln Met Gly Thr Thr Asn Thr Ile
20 25 30 Ile Lys Ile Ser Glu Ser Thr Thr Tyr Leu Asn Pro Cys Leu Ser Ala
35 40 45 Gln Val Glu Gln Ser Asn Pro Ile Gly Phe Tyr His Phe Ala Arg Phe
50 55 60 Gly Gly Asp Val Ala Glu Ala Glu Arg Glu Ala Gln Phe Phe Leu Asp 65 70 75 80 Asn Val Pro Met Gln Val Lys Tyr Leu Val Leu Asp Tyr Glu Asp Asp
85 90 95 Pro Ser Gly Asp Ala Gln Ala Asn Thr Asn Ala Cys Leu Arg Phe Met
100 105 110 Gln Met Ile Ala Asp Ala Gly Tyr Lys Pro Ile Tyr Tyr Ser Tyr Lys
115 120 125 6
P20133077728-05-2013
ES 2 525 954 B1
Pro Phe Thr His Asp Asn Val Asp Tyr Gln Gln Ile Leu Ala Gln Phe 130 135 140
Pro Asn Ser Leu Trp Ile Ala Gly Tyr Gly Leu Asn Asp Gly Thr Ala 145 150 155 160 Asn Phe Glu Tyr Phe Pro Ser Met Asp Gly Ile Arg Trp Trp Gln Tyr
165 170 175 Ser Ser Asn Pro Phe Asp Lys Asn Ile Val Leu Leu
180 185
<210> 14<211> 564<212> DNA<213> Cp-7
<220> <221> source<222> 1..564<223> /mol_type="unassigned DNA"
/note="N-terminal domain Cpl-1"/organism="Cp-7"
<400> 14atggttaaaa agaatgattt atttgtagat gtttcaagtc acaacggtta cgatataaca 60
ggtatcttgg agcaaatggg aacaactaac accatcatta aaatttctga aagtacgacc 120
tatttaaacc cttgcttgtc tgctcaagtg gagcagtcaa accctattgg cttttatcac 180
ttcgcacgct ttggcggaga cgtagcagaa gccgaaagag aagcgcagtt tttccttgac 240
aacgtgccta tgcaagttaa ataccttgta ttggactacg aggacgaccc aagcggagac 300
gcacaagcga acactaacgc atgcttacgc tttatgcaga tgattgctga cgctggatat 360
aaacctattt attatagtta taaaccgttt acacatgata atgtggacta tcagcaaatc 420
cttgcacagt tccctaattc tctatggatt gcaggctatg gcttaaacga tggtacagct 480
aactttgaat acttcccaag catggacggg ataagatggt ggcagtattc tagtaacccg 540
tttgacaaga atattgtact gtta 564
<210> 15<211> 11<212> PRT<213> Cp-7
<220> <223> Linker Cpl-1
<400> 15Asp Asp Glu Glu Asp Asp Lys Pro Lys Thr Ala 1 5 10
<210> 16<211> 33<212> DNA<213> Cp-7
<220> <221> source<222> 1..33<223> /mol_type="unassigned DNA"
/note="Linker Cpl-1"/organism="Cp-7"
<400> 16gacgatgaag aagacgacaa gccaaagacc gct 33
7
P20133077728-05-2013
ES 2 525 954 B1
<210> 17<211> 342<212> PRT<213> Artificial Sequence
<220> <223> Artificial Chimera
<400> 17Met Val Lys Lys Asn Asp Leu Phe Val Asp Val Ala Ser His Gln Gly 1 5 10 15 Tyr Asp Ile Ser Gly Ile Leu Glu Glu Ala Gly Thr Thr Asn Thr Ile
20 25 30 Ile Lys Val Ser Glu Ser Thr Ser Tyr Leu Asn Pro Cys Leu Ser Ala
35 40 45 Gln Val Ser Gln Ser Asn Pro Ile Gly Phe Tyr His Phe Ala Trp Phe
50 55 60 Gly Gly Asn Glu Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Arg Tyr Phe Leu Asp 65 70 75 80 Asn Val Pro Thr Gln Val Lys Tyr Leu Val Leu Asp Tyr Glu Asp His
85 90 95 Ala Ser Ala Ser Val Gln Arg Asn Thr Thr Ala Cys Leu Arg Phe Met
100 105 110 Gln Ile Ile Ala Glu Ala Gly Tyr Thr Pro Ile Tyr Tyr Ser Tyr Lys
115 120 125 Pro Phe Thr Leu Asp Asn Val Asp Tyr Gln Gln Ile Leu Ala Gln Phe
130 135 140 Pro Asn Ser Leu Trp Ile Ala Gly Tyr Gly Leu Asn Asp Gly Thr Ala 145 150 155 160 Asn Phe Glu Tyr Phe Pro Ser Met Asp Gly Ile Arg Trp Trp Gln Tyr
165 170 175 Ser Ser Asn Pro Phe Asp Lys Asn Ile Val Leu Leu Asp Asp Glu Lys
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