IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA
Estudiante:
Laura Silvana Pérez Restrepo
Asesor:
Idalyd Fonseca González, M.Sc, Dr.Sc.
Profesor Asistente
INSTITUTO DE BIOLOGIA
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
MEDELLIN, OCTUBRE 2011
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
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El camino hacia una vida productiva,
llena de felicidad y éxito comienza cuando
logramos que nuestras acciones sean
congruentes con nuestros valores y
principios.
Benjamín Franklin
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DEDICATORIA
A mi Dios a quien le debo mi vida, gracias por iluminar mi camino y por todas las
bendiciones que me llegan cada día. A mi abuela, que aunque ya no está con nosotros, llenó
mi vida de bellas enseñanzas, gracias por brindarme todo el amor y ternura, por enseñarme
a vivir y por hacerme la mujer que soy ahora.
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AGRADECIMIENTOS
Nuevamente le doy gracias a mi Dios por su eterno amor y compañía, por las mil cosas
maravillosas que me proporciona cada día.
A mis padres Deisy Restrepo y Ruben Pérez, por su compañía, amor, comprensión,
enseñanzas y por la fe que tienen en mí y el apoyo que me han brindado toda mi vida.
A mi asesora de tesis la Dra. Idalyd Fonseca por brindarme esta oportunidad y el apoyo
para hacer que mi sueño de ser bióloga se haga realidad.
A Julián Mosquera por estar siempre a mi lado en esta etapa de mi vida apoyándome y
brindándome sus consejos, amor y comprensión.
Al Instituto de Biología de la Universidad de Antioquia en cabeza del Dr. Nicolás Jaramillo
por ayudarme en mi formación de pregrado.
Al Dr. Omar Triana por abrirme las puertas del grupo BCEI para realizar mi tesis y por
apoyar mi trabajo.
A José Usme Ciro por sus brindarme sus consejos, amistad y su ayuda.
A mis compañeros del grupo BCEI por su ayuda, por el conocimiento que me brindaron,
sus críticas constructivas, por estar pendientes de mi. En especial a Sebastián, Victor,
Nelson, Dahyana, Edilson, Laura, Yoman y Santiago.
A Duver y Sair por apoyarme y ayudarme en todo lo relacionado con el laboratorio y por
brindarme su amistad.
A la Universidad de Antioquia por brindarme, tantos espacios educativos y de formación, a
todos mis profesores del pregrado en especial al profesor Omar Ocampo Jiménez por
enseñarme a ver la biología con dedicación y a Silvia por ayudarme con todas los asuntos
administrativos.
A mis compañeros del pregrado en biología en especial a Andrea, Cristina, Sara, Edwin,
Rafa, Andrés, Laura Rueda y Ana, por brindarme esa amistad tan maravillosa y por estar
siempre pendientes de mi.
A mi familia materna y paterna por apoyarme y darme tantos consejos.
A los funcionarios de la Dirección Local de Salud de Bello por ayudarme en la colección
del material biológico y por su comprensión.
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Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
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Tabla de contenido
1. RESUMEN ......................................................................................................................... 9
2. ANTECEDENTES ........................................................................................................... 10
2.1 FIEBRE POR DENGUE EN EL MUNDO ................................................................ 10
2.2 FIEBRE POR DENGUE EN LAS AMERICAS ........................................................ 12
2.3 FIEBRE POR DENGUE EN COLOMBIA ................................................................ 13
2.4 BIOLOGIA DE A. aegypti .......................................................................................... 14
2.4.1 CICLO DE VIDA DE A. aegypti ......................................................................... 16
2.5 Biología del DENV ..................................................................................................... 18
2.5.1 Estructura y composición del DENV ................................................................... 19
2.5.1 Proteínas estructurales del DENV ........................................................................ 20
2.5.2 Proteínas no estructurales del virus ...................................................................... 21
2.6 Prevención y control de la fiebre por dengue ............................................................. 24
2.6.1 Vigilancia virológica ............................................................................................ 24
2.6.2 Vigilancia entomológica ...................................................................................... 25
2.6.3 Control vectorial ................................................................................................... 25
3. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA .................................................................................... 27
4. HIPÓTESIS: ..................................................................................................................... 30
5. OBJETIVOS: .................................................................................................................... 30
6. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................. 31
7. METODOLOGIA ............................................................................................................. 33
7.1 AREA DE ESTUDIO ................................................................................................. 33
7.1.1 Ubicación del municipio de Bello ........................................................................ 33
7.1.2 Características del municipio de Bello ................................................................. 34
7.2 Colección del material biológico ................................................................................ 34
7.3 Extracción y purificación de ARN .............................................................................. 35
7.4 Cuantificación de ARN ............................................................................................... 35
7.5 Identificación de DENV y serotipos de DENV .......................................................... 35
7.5.1. Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR) ....... 36
7.6 Visualización de fragmentos virales ........................................................................... 37
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7.7 Determinación de la tasa mínima de infección viral en mosquitos ............................ 37
8. RESULTADOS ................................................................................................................ 38
8.1 Colección del material biológico ................................................................................ 38
8.2 Identificación de los especímenes ............................................................................... 39
8.3 Análisis genético ......................................................................................................... 39
8.3.1 Extracción de ARN .............................................................................................. 39
8.3.2 Cuantificación del ARN ....................................................................................... 40
8.3.3 Evaluación de la integridad del ARN ................................................................... 40
8.3.4 Identificación de DENV y serotipos .................................................................... 41
8.3.5. Determinación de la mínima concentración. ....................................................... 41
9. DISCUSIÓN ..................................................................................................................... 44
10. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 47
11. PERSPECTIVAS ........................................................................................................... 48
12. BIBLIOGRAFIA. ........................................................................................................... 49
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Lista de figuras
Figura 1 Países y áreas con riesgo para la transmisión de dengue 2008
Figura 2 Ciclo de transmisión de los DENV
Figura 3 Ciclo de vida de A. aegypti
Figura 4 Representación esquemática del virión maduro, E: envoltura proteica, M: proteína
asociada a membrana, C: proteína core
Figura 5 Genoma de los DENV. Se representa el marco de lectura abierto flanqueado por
dos regiones no traducidas, codifica para 3 proteínas estructurales: C, M y E, y 7 proteínas
no estructurales (NS): NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5
Figura 6 Mapa del municipio de Bello (Antioquia) mostrando su división administrativa en
10 comunas
Figura 7 Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio mostrando la amplificación
del gen ribosomal AAS7. M: machos; H: hembras; El numero indica la cantidad de
mosquitos por pool; CN: control negativo; la flecha indica el tamaño de la banda
amplificada (300pb)
Figura 8 Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio mostrando la amplificación de
los serotipos DENV-2 (carril 2: 362 pb), DENV-3 (carril 3: 265 pb) y DENV-4 (carril 4:
426 pb); Carril 5: muestra positiva correspondiente al serotipo DENV-3.
Figura 9. Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio mostrando la amplificación
de las diluciones seriadas realizadas para determinar la sensibilidad de la RT-PCR.
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Lista de tablas
Tabla 1 Secuencias nucleotídicas, posiciones consenso (DV1) y primers de tipo específico
(DSP1-4) para la identificación de los serotipos virales
Tabla 2 Barrios muestreados en Bello y la comuna a la que pertenecen
Tabla 3 Distribución de mosquitos en pools y total de pools
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1. RESUMEN
La fiebre por dengue (FD) y su complicación más frecuente, la fiebre hemorrágica por
dengue (FHD) son, en Colombia, la enfermedad transmitida por vectores más prevalente
después de la malaria. Esta arbovirosis es una patología de alto poder epidémico que en los
últimos años se presenta en más del 80% del territorio colombiano, debido principalmente a
la extensa dispersión del vector A. aegypti. Dado el cada vez más creciente número de
casos confirmados de FD/FHD, es fundamental la vigilancia epidemiológica permanente, y
como parte de esta, la vigilancia virológica incluyendo la identificación del virus tanto en
las poblaciones humanas como en los mosquitos en áreas endémicas, con el fin de controlar
y prevenir epidemias, disminuyendo el riesgo de infección con el virus dengue (DENV).
La detección temprana de los casos con la identificación del serotipo circulante, unida al
monitoreo entomológico representan indiscutiblemente la forma más eficaz de evitar brotes
epidémicos; Considerando que la introducción de nuevos serotipos en las poblaciones
humanas susceptibles es uno de los mayores factores de riesgo para la emergencia de brotes
y epidemias de FHD, y que en el municipio de Bello (Antioquia) se registra co-circulación
de al menos dos serotipos virales y casos confirmados de FHD, el objetivo de nuestro
estudio fue identificar la presencia del DENV en poblaciones naturales de adultos del
mosquito vector A. aegypti en el área urbana del Bello, mediante la estandarización de la
reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR), empleando
primers específicos para la región NS3 del DENV. La colección del material biológico se
realizo durante los levantamientos de índices aédicos realizados en compañía del personal
de la Dirección Local de Salud de este municipio. De todo el material colectado (1182
larvas y 52 adultos), fue posible identificar la presencia del serotipo DENV-3 en dos
hembras de A. aegypti capturadas durante un brote epidémico de 2009 en el barrio Peréz, de
la comuna Suaréz; este serotipo DENV-3 estuvo co-circulando con los otros 3 serotipos en
Antioquia entre el 2009 y 2010 según los registros confirmados en aislados humanos. Lo
anterior apoya la posibilidad de que el virus puede mantenerse activo en la población de
insectos durante los periodos no epidémicos permitiendo la aparición permanente de casos
de FD y aumentando la probabilidad de ocurrencia de FHD en el municipio de Bello. Estos
resultados confirman que la técnica molecular empleada es específica para DENV y
sensible al detectar 0.2ng/ul de virus. Aunque la tasa mínima de infección en este estudio
fue de 1.621, a futuro esto puede aumentar si se realizan estrategias de búsqueda de
vectores focalizadas en los lugares con mayor infestación larvaria y reportes de casos de
FD/FHD. La vigilancia virológica en las poblaciones de mosquitos es una herramienta útil
en la predicción de epidemias y debería, en los casos en que sea posible, incluirse en la
vigilancia epidemiológica.
Palabras clave: Aedes aegypti, virus dengue, serotipo, vigilancia, Colombia.
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2. ANTECEDENTES
2.1 FIEBRE POR DENGUE EN EL MUNDO
La fiebre por dengue (FD) es una enfermedad viral, de carácter endémico-epidémico,
transmitida por mosquitos del género Aedes, principalmente por Aedes aegypti (Linnaeus
1762), que hoy constituye la arbovirosis más importante a nivel mundial en términos de
morbilidad, mortalidad y afectación económica (Henchal EA y Putnak JR, 1990).
Esta enfermedad se caracteriza por fiebre bifásica, cefalea, dolor generalizado, postración,
erupción, linfadenopatía y leucopenia. La más seria complicación de la FD es la fiebre
hemorrágica por dengue (FHD), caracterizada por anomalías de hemostasia y el aumento de
la permeabilidad vascular, resultando algunos casos en un síndrome de choque
hipovolémico denominado Síndrome de Choque por Dengue (SCD)(WHO, 1975).
El dengue también es capaz de expresarse mediante las llamadas formas “atípicas” que son
relativamente infrecuentes y resultan de la afectación particularmente intensa de un órgano
o sistema: encefalopatía, miocardiopatía o hepatopatía por dengue, entre otras (Martínez E,
1995; Martínez E, 1997).
Desde el año 1997, el virus del dengue (DENV) y su principal vector, el mosquito A.
aegypti presentan distribución mundial con más de 2,5 billones de personas viviendo en
zonas endémicas y un registro anual de cerca de 100 millones de casos de FD y varios
cientos de miles de casos de FHD, dependiendo de la actividad epidémica (Gubler DJ,
1998).
El DENV es miembro de la familia flaviviridae; está constituido por cuatro serotipos de un
virus ARN que son serológicamente diferenciables (DENV 1, 2, 3 y 4) y que comparten
analogías estructurales y patogénicas, por lo que cualquier ser humano puede producir las
formas graves de la enfermedad sin presentar inmunidad cruzada; Las personas que viven
en áreas endémicas pueden infectarse con cualquiera de los cuatro serotipos de DENV y
además pueden presentarse infecciones por dos serotipos simultáneamente (Wang WK et
al., 2003), lo cual determina la importancia de la identificación del serotipo y el genotipo de
la cepa infectante en relación con el desarrollo de la enfermedad.
La virulencia viral y la respuesta inmune son considerados los dos mayores factores en la
patogénesis de la FHD. Actualmente se considera la hipótesis de “infección secundaria”
como la principal causa del incremento en el número de casos de FHD y SCD en el mundo
(Guzmán MG et al., 2007).
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La inmunidad que deja la infección por cada uno de los serotipos virales es duradera,
probablemente de por vida y se expresa por la presencia de anticuerpos (Ac) neutralizantes
hemotípicos. No existe inmunidad cruzada de serotipos, excepto durante las primeras
semanas o algunos meses después de la infección (Martínez, 1998). Sin embargo, cuando
una persona tiene Ac neutralizantes contra uno de los DENV y se infecta con otro serotipo,
se produce una respuesta exclusiva de la infección por DENV llamada amplificación
dependiente de anticuerpos (ADA) que es aumento de la viremia, lo cual condiciona y
favorece el desarrollo de la forma grave de la enfermedad (Guzmán MG et al., 1992;
Halstead, 2002).
En las últimas 4 décadas el DENV emergió como el mayor problema de salud en muchas
áreas tropicales y subtropicales en el mundo, especialmente en las áreas urbanas donde el
virus se mantiene y en el cual el hombre es el principal reservorio y el mosquito A. aegypti,
el principal vector (Morier, L. et al., 2000). Ahora hay un resurgimiento mundial con una
expansión de la distribución geográfica tanto de los mosquitos vectores como de los virus
(figura 1), además de la aparición de FHD en nuevos países (Gubler DJ, 1997).
Comparando con nueve países reportados en 1950, hoy la distribución geográfica del
DENV incluye más de 100 países en todo el mundo. Muchos de estos no habían reportado
FD/FHD en más de 20 años y algunos no presentan antecedentes de la enfermedad.
Comparado con los reportes de la década de 1950, el dengue se ha convertido en una de las
principales causas de mortalidad infantil en varios países de Asia y de América del Sur
(Guha-Sapir y Schimmer B, 2005).
Los factores responsables por el dramático resurgimiento y emergencia de las epidemias de
FD/FHD como problemas de salud pública global aun no se entienden completamente
(Gubler DJ y Clark GG, 1995); Se sabe que casi la mitad de la población mundial está en
riesgo de sufrir esta infección por habitar en áreas tropicales y subtropicales. Así mismo, el
incremento del transporte aéreo (mecanismo ideal para transportar los DENV a zonas
urbanas) durante el cual más de 400 millones de viajeros de Europa y Norteamérica cada
año cruzan las fronteras y regresan a sus países procedentes de zonas endémicas en Asia,
África y América Latina. Además se sugiere que el resurgimiento de la FD está
estrechamente relacionado con los cambios sociales y demográficos de los últimos 50 años.
La decadencia en las infraestructuras de los sistemas de salud pública de los países en
desarrollo durante los últimos 30 años (Gubler DJ, 1998), la vivienda deficiente, el
hacinamiento, la disponibilidad de depósitos de agua, la ausencia de sistemas de
alcantarillado y sistemas deficientes de manejo de residuos asociados con la urbanización
no planeada han creado condiciones ideales para el incremento en la transmisión de la
FD/FHD en los centros urbanos de las zonas tropicales (TDR, 2006). A todo esto se le
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suma la falta de implementación de un control efectivo del mosquito en áreas donde el
dengue es endémico. El control vectorial es hasta ahora es la única estrategia de prevención
de la FD/FHD y la forma más efectiva de controla la transmisión de los DENV mediante el
uso de adulticidas y larvicidas; Lamentablemente, el desarrollo de resistencia a insecticidas
y la falta de métodos integrados de control han disminuido la efectividad del control
químico.
2.2 FIEBRE POR DENGUE EN LAS AMERICAS
Los cambios epidemiológicos en las Américas han sido muy dramáticos. Durante los años
1960s dos pandemias de dengue afectaron al Caribe y Venezuela. La primera epidemia
declarada en 1963, fue causada por el DENV-3 y azotó el Caribe después de casi 20 años
de inactividad, en zonas como Jamaica, Puerto Rico, las islas de las Antillas menores y
Venezuela. La segunda epidemia ocurrió en el Caribe y Venezuela entre 1968 y 1969 y los
serotipos circulantes fueron DENV-2 y DENV-3 (PAHO, 1997). Durante los años 1960s
estos dos serotipos causaron grandes epidemias en Colombia donde no se había observado
dengue desde 1951. Luego en los años 1980s cinco países sudamericanos (Brasil, Bolivia,
Paraguay, Ecuador y Perú) que no habían sufrido por el DENV anteriormente o que se
habían visto libres del virus por varios decenios, padecieron epidemias explosivas a causa
del DENV-1. En 1993 los últimos dos países latinoamericanos tropicales, Costa Rica y
Panamá los cuales se habían visto libres de dengue por varios decenios, informaron sobre
casos de transmisión indígena de dengue, con el serotipo DENV-1. En los años 1980s, la
introducción de nuevas cepas y serotipos del virus produjo grandes epidemias de FD en las
Américas. Varios países de la región cambiaron su estatus de no endémicos o
hipoendémicos (un solo serotipo presente) a hiperendémicos (múltiples serotipos
presentes), lo que llevó a la emergencia de epidemias de FHD con un patrón
epidemiológico semejante al visto 25 años antes en el sudeste asiático (Gubler DJ, 1987).
El primer brote de FHD reportado en las Américas ocurrió en 1981 en Cuba; durante esta
epidemia se notificó un total de 344.203 casos de dengue, de los que 10.312 se clasificaron
como graves por la OMS y 158 fueron mortales; este brote de FHD es el acontecimiento
más importante de la historia del dengue en las Américas. Ya que después de este, todos los
años, excepto en 1983, se informa en todo el continente americano sobre casos confirmados
de FHD.
Actualmente, la FD es endémica en casi todos los países de la región de las Américas,
presentando brotes cíclicos cada 3 a 5 años, siendo cada año epidémico mayor que el
precedente. Los cuatro serotipos del DENV circulan en la región. En el periodo 2001-
2007, más de 30 países de las Américas notificaron un total de 4.332.731 casos de FD,
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106.037 casos de FHD y una tasa de letalidad de 1,2% (OPS, 2008). Solo en el 2008, se
reportó un total de 1.050.590 casos de FD, incluyendo 38.066 casos de FHD y 554
defunciones (OMS, 2009). Hasta la semana epidemiológica 31 del 2011 se han notificado
en la Región de las Américas un total de 890.756 casos de dengue, incluido 10.840 casos de
dengue grave y 488 defunciones por dengue (PAHO, 2011).
Figura 1: Países y áreas con riesgo para la transmisión de dengue 2008. Fuente:
http://www.mosquitaire.com/cms/website.php?id=/en/tigermosquitos/dengue.htm
2.3 FIEBRE POR DENGUE EN COLOMBIA
En Colombia la FD es endémica en casi todos los asentamientos humanos ubicados por
debajo de los 1.800 msnm. A. aegypti es el principal transmisor del dengue en Colombia y
se encuentra distribuido en el 80% del territorio colombiano (MPS, 2006). Durante los
años 1960s, los serotipos DENV-2 y DENV-3 causaron grandes epidemias de FD; la
primera, ocurrió entre 1971 y 1972, y fue ocasionada por DENV-2, mientras que la de
1975-1977 se dio por DENV-3. En diciembre de 1989 se registró el primer caso de FHD en
Puerto Berrio (Antioquia); desde ese momento se observa en Colombia una tendencia
rápida al incremento en el número de casos, al pasar de 5.2 casos por cada 100.000
habitantes en la década de los 1990s a casi 18.1 casos por cada 100.000 habitantes en los
últimos siete años (INS, 2010). Los departamentos que históricamente presentan mayor
transmisión de dengue en el país son: Atlántico, Santander, Norte de Santander, Valle del
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Cauca, Antioquia, Tolima, Huila, Casanare y Cundinamarca, entre ellos se distribuye más
del 60% de los casos notificados anualmente en lo que ha transcurrido del presente siglo.
Hasta la semana epidemiológica No. 37 del 2011 se han notificado en el Sistema de
Vigilancia de Salud Pública (SIVIGILA) del Instituto Nacional de Salud: 24.408 casos
totales de dengue (23.408 casos FD y 1066 de FHD) y se han reportado 276 muertes
confirmadas (PAHO, 2011). Este problema de salud pública es debido a múltiples factores
entre estos la reemergencia e intensa transmisión viral con tendencia creciente, el
comportamiento de ciclos epidémicos cada vez más cortos, el aumento en la frecuencia de
brotes de FHD y otras formas graves de la enfermedad, la circulación simultánea de los
cuatro serotipos, la infestación por A. aegypti en más del 90% del territorio nacional situado
por debajo de los 2200 msnm, y la urbanización de la población por problemas de violencia
en el país, pone en riesgo a aproximadamente 25 millones de personas que habitan en zonas
urbanas con transmisión de esta enfermedad. El comportamiento epidemiológico de la
enfermedad en las últimas décadas es ascendente, caracterizado por aumento exponencial
de las áreas endémicas en las diferentes décadas. Su comportamiento cíclico se caracteriza
por picos epidémicos cada tres o cuatro años, relacionados con el reingreso de nuevos
serotipos al país (Root H, 1980).
2.4 BIOLOGIA DE A. aegypti
A. aegypti es un mosquito cuyo origen se ubica en la región etiópica, que nuclea la mayor
cantidad de especies del subgénero Stegomyia Theobald, 1901, de la cual hace parte este
culícido; en el África este mosquito es una especie silvestre, y ancestralmente desde allí
inició una dispersión pasiva, que lo llevó a convertirse en un mosquito cosmopolita. Está
presente en la mayor parte de las áreas tropicales o subtropicales comprendidas entre los
45º de latitud norte y los 35º de latitud sur, en las zonas isotermales intermedias a los 20ºC
(Agrelo SR, 1996). Sin embargo, la naturaleza doméstica de esta especie probablemente
ejerza más influencia en la distribución mundial que el clima o las variables climáticas. A.
aegypti está estrechamente relacionado con los asentamientos humanos y se encuentra
fácilmente entre los edificios o casas para poder así alimentarse de los humanos y descansar
(Jansen CC y Beebe NW, 2010).
Los hábitos del mosquito son netamente antropofílicos y domésticos, con radicación de
criaderos en la vivienda o su peridomicilio. Depósitos de agua ubicados en objetos o
construcciones como neumáticos, baterías viejas, recipientes de todo tipo, botellas, floreros
y piletas, entre otros, le sirven a A. aegypti para establecer sus criaderos en agua limpia, con
bajo tenor orgánico y de sales disueltas, mediante la puesta de huevos en la superficie del
recipiente a la altura de la interfase agua-aire (Agrelo SR, 1996). La hembra del mosquito
se alimenta durante el día con un alto pico de actividad en la mañana y en el atardecer.
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Ellas vuelan en sentido contrario al viento, desplazándose mediante lentas corrientes de
aire, siguiendo los olores y gases emitidos por el huésped. Cuando están cerca de los
asentamientos humanos utilizan estímulos visuales para localizar al huésped mientras sus
receptores táctiles y térmicos las guían hacia el sitio de alimentación. El propósito
primordial de la alimentación sanguínea es proporcionar una fuente de proteínas para el
desarrollo de los huevos. El hospedero infectado transmite el virus al mosquito y entre 8 -
10 días el virus se replica, primero en el epitelio intestinal y posteriormente a través de la
hemolinfa se disemina a otros tejidos como los ganglios nerviosos, cuerpo graso, cerebro,
esófago y glándulas salivales del mosquito hembra, el cual permanece infectado y
asintomático toda su vida (Martínez E, 2004; Sánchez VL, 2006). Los títulos virales más
altos ocurren entre los 7-10 días postinfección en el intestino medio y entre los 7-17 días en
el abdomen. Títulos virales altos en cabeza y glándulas salivales se detectan entre los 12-18
días después de la infección (Salazar MI et al., 2007). Luego de 7 a 14 días de incubación
en el mosquito (periodo extrínseco de incubación), el genotipo del virus y factores
ambientales como humedad y temperatura, el mosquito puede infectar a un humano
susceptible (Gubler DJ, 1998; Rice CM, 1996; Salazar MI et al., 2007) (Figura 2).
Figura 2: ciclo de transmisión de los DENV
Tomado de: http://www.diariodeciencias.com.ar/imagenes/transmission-of-
dengue.JPG&imgrefurl
Los mosquitos A. aegypti de diferentes orígenes geográficos presentan diferencias en la
susceptibilidad a la infección con el DENV (Gunther J et al., 2007). Aunque la transmisión
horizontal (humano-mosquito) es la más frecuente, existen reportes de transmisión vertical
o transovarica (donde la hembra infectada es capaz de transmitir el virus a su progenie)
experimental (Rosen L et al., 1983) y natural (Hull B et al., 1984). La presencia del DENV
fue demostrada en cerca del 40% de larvas y progenie de hembras de A. albopictus
infectadas oralmente con DENV-2 (Gonçalves CM et al., 2004) y en hembras de A. aegypti
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Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
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inoculadas intratoráxicamente con DENV-3 (Joshi V et al., 2002). Factores como el
serotipo y la cepa del virus, la especie del mosquito y la línea de A. aegypti (con alta o baja
susceptibilidad al DENV) afectan este mecanismo de infección (Agrelo SR, 1996; Kautner
I et al., 1997).
Algunos estudios sugieren que aunque la transmisión vertical ocurre a una muy baja tasa
para casi todos los arbovirus, esta puede ser un factor importante en la prevalencia y
mantenimiento del DENV en la naturaleza (Gunther J et al., 2007). Fouque F et al., (2004)
encontraron larvas de A. aegypti en plantas que estaban localizadas a 30km del
asentamiento humano más cercano en la Guinea Francesa respaldando la idea que estas
larvas pudieron haberse infectado verticalmente y ser un reservorio para el DENV.
Adicionalmente, se ha registrado que en regiones con temporadas secas de 3-6 meses, la
alta resistencia a la desecación que presentan los huevos del mosquito podría contribuir al
mantenimiento de algunos arbovirus como el virus de la fiebre amarilla y el DENV (Kuno
G y Chan GJ, 2005).
Un estudio en Asia mostró evidencias de cambios en los hábitats entre los dos principales
vectores del DENV en el cual A. aegypti se muestra mas exofílico y menos antropofílico
que A. albopictus (Gunther J et al., 2007), sugiriendo la ocurrencia de un intercambio entre
los ciclos urbano y selvático, lo cual a su vez puede relacionarse indirectamente con la
transmisión vertical del DENV y su papel en la epidemiologia de la enfermedad.
2.4.1 CICLO DE VIDA DE A. aegypti
Son insectos de metamorfosis completa (holometábolos), que durante su desarrollo
ontogénico pasan por los estados de huevo, larva (con cuatro estadios larvales), pupa y
adulto (Figura 3).
Huevos: miden aproximadamente 1 mm de longitud, en forma de cigarro, son más limpios
que los huevos de la mayoría de las especies que se crían en recipientes. En el momento
de postura son blancos, pero muy rápidamente adquieren un color negro brillante. Son
fecundados durante la postura y el desarrollo embrionario se completa en 48 horas si el
ambiente es húmedo y cálido, pero puede prolongarse hasta cinco días con temperaturas
más bajas. Los huevos eclosionan en un lapso de 2 a 3 días. Después de ese periodo, son
capaces de resistir la desecación y las temperaturas extremas con sobrevidas de siete meses
a un año. Una vez completado el desarrollo embrionario, un porcentaje reducido de huevos
pueden resistir largos períodos de desecación, y pueden prolongarse por más de un año en
algunas ocasiones. La capacidad de resistencia a la desecación es uno de los principales
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obstáculos para el control del mosquito y ésta condición, además, permite transportarlos a
grandes distancias en recipientes secos.
Larvas: presentan un ciclo de cuatro estadios larvales, son netamente acuáticas y como la
mayoría de los insectos holometábolos, esta fase es el período de mayor alimentación y
crecimiento. Se alimentan de material orgánico sumergido o acumulado en las paredes y el
fondo de recipientes, para lo cual utilizan las cerdas bucales en forma de abanico. Se
asemejan a otras larvas de mosquitos por la cabeza y el tórax ovoide y el abdomen de nueve
segmentos. El segmento posterior del abdomen tiene cuatro branquias lobuladas para la
regulación osmótica y un sifón para la respiración en la superficie del agua. Las larvas son
fotosensibles. La duración del desarrollo larval depende de la temperatura, la disponibilidad
de alimentos y la densidad de larvas en el recipiente. Los primeros tres estadíos se
desarrollan rápidamente, mientras que el cuarto demora más tiempo con mayor aumento de
tamaño y peso. En condiciones rigurosas el cuarto estadío larval puede prolongarse por
varias semanas, hasta siete meses, previo a su transformación en pupa. Las larvas de A.
aegypti pueden diferenciarse a simple vista de las larvas de otras especies por su sifón más
corto que el de la mayoría de los otros culícidos.
Pupas: La pupa es el ultimo estado acuático de A. aegypti; estas no se alimentan, presentan
un estado de reposo donde se producen importantes modificaciones anatómico-fisiológicas
hasta la aparición de los adultos. Reaccionan inmediatamente a estímulos externos tales
como vibración y se desplazan activamente por todo el recipiente. Se mantienen en la
superficie del agua debido a su flotabilidad y ésta propiedad facilita la emergencia del
insecto adulto. El período pupal dura de 1 a 3 días en condiciones favorables, con
temperaturas entre 28 y 32°C. Las variaciones extremas de temperatura pueden rezagar este
período.
Adulto: Al emerger de la pupa, el insecto adulto permanece en reposo permitiendo el
endurecimiento del exoesqueleto y las alas. Dentro de las 24 horas siguientes a la
emergencia pueden aparearse iniciándose la etapa reproductora del insecto. El
apareamiento en general se realiza durante el vuelo pero en algunas ocasiones se lleva a
cabo en una superficie horizontal o vertical. A. aegypti es un mosquito oscuro con bandas
blancas en las bases de los segmentos torsales y un característico diseño en forma de lira en
el mesonoto (sección del tórax del mosquito). Las hembras son las únicas que succionan
sangre. Esta alimentación sanguínea es necesaria como fuente de proteína para el desarrollo
de los huevos. La alimentación sanguínea y la postura se llevan a cabo principalmente
durante el día, especialmente durante las primeras horas o a la media mañana y a media
tarde o al anochecer. Si una hembra completa su alimentación (2 o 3 mg de sangre)
desarrollará y pondrá aproximadamente 200 huevos, dispersos en distintos lugares. La
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18
hembra grávida es atraída hacia recipientes oscuros o sombreados con paredes duras, sobre
las que deposita sus huevos y prefiere aguas relativamente limpias con poco contenido de
materia orgánica. El macho se diferencia de la hembra por sus antenas plumosas y sus
palpos más largos. Sus partes bucales no están adaptadas para chupar sangre por lo que se
alimentan de carbohidratos como el néctar de las plantas.
Figura 3: ciclo de vida de A. aegypti.
Tomado de:
http://ceibal.edu.uy/UserFiles/P0001/ODEA/ORIGINAL/101112_dengue_prevencion3.elp/
conociendo_al_aedes_aegypti.html
2.5 Biología del DENV
Los DENV pertenecen al genero flavirirus que forma parte de la familia Flaviviridae. Los
flavivirus son 70 virus, mayormente transmitidos por artrópodos (arbovirus) y están
clasificados en 10 grupos (o especies), entre ellos: Virus Dengue, Virus Encefalitis
Japonesa, Virus TBE (del inglés Tick-Borne Encephalitis), Virus Fiebre Amarilla, Virus
Modoc, Virus MBE (del inglés Mosquito-Borne Encephalitis), Virus Ntaya, Virus Río
Bravo, Virus Uganda S y Virus Tyuleniy (Henchal EA y Putnak JR, 1990). Gran número
de estos son patógenos para el hombre, por lo que son los causantes de problemas de salud
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19
pública mundial. Todos los miembros de esta familia comparten los mismos antígenos
determinantes, lo que hace difícil la identificación de cada virus por las técnicas clásicas de
serología.
El DENV incluye cuatro serotipos cercanamente relacionados pero antigénicamente
diferentes; cada serotipo comprende varios genotipos que exhiben diferencias en sus
características de infección tanto en el mosquito vector como el humano hospedador
(Holmes EC y Twiddy SS, 2003).
2.5.1 Estructura y composición del DENV
Los DENV se caracterizan por tener una cápside icosahédrica rodeada por una membrana
lipídica o envoltura, con un diámetro aproximado de 50 nm (Henchal EA y Putnak JR,
1990). En su interior contienen como genoma una molécula de ARN de cadena sencilla y
polaridad positiva de 10.7 kb. El genoma viral presenta la estructura “cap” en el extremo 5´
y carece de poli(A) en el extremo 3´terminal. El único marco de lectura abierto está
flanqueado por dos regiones no traducidas, que codifica a las tres proteínas estructurales: la
proteína de la envoltura E, la proteína asociada a la membrana M, y la proteína de la
cápside C, y a las siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y
NS5) (Linderbach BD y Rice CM, 2003) (Figura 4).
Figura 4: Representación esquemática del virión maduro, E: envoltura proteica, M:
proteína asociada a membrana, C: proteína core.
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20
2.5.1 Proteínas estructurales del DENV
El virión maduro contiene tres proteínas estructurales: C, proteína de la nucleocápside o
núcleo; M, proteína asociada a la membrana y E, proteína de la envoltura. Los virus
inmaduros contienen una proteína conocida por prM; que es un precursor de M. Los genes
que codifican las proteínas estructurales del DENV se encuentran en el extremo 5' del
genoma y comprenden un poco más de una cuarta parte de la capacidad de codificación del
ARN viral. El orden de los genes para las proteínas estructurales del extremo 5' terminal es
C-prM(M)-E (Figura 5) (Henchal EA y Putnak JR, 1990).
La proteína C es componente básico de la nucleocápside, es el primer polipéptido viral
sintetizado durante la traducción y presenta un peso molecular de 13.5 kd. Es rica en
residuos de lisina y arginina los que le confieren un carácter altamente básico que permite
su interacción con el ARN viral, con el que forma la nucleocápside como componente
estructural. Esta proteína está involucrada en funciones biológicas de la partícula viral
como el tropismo celular, fusión de membranas e inducción de anticuerpos neutralizantes.
La infección con uno de los serotipos estimula la producción de anticuerpos neutralizantes
primarios contra la envoltura de la proteína, confiriéndole así larga vida inmune al serotipo.
La existencia de anticuerpos neutralizantes a un serotipo puede promover el ambiente de la
infección con otro serotipo. Este modelo anticuerpo-dependiente postula que la severidad
de la enfermedad es el resultado de anticuerpos heterólogos no neutralizantes los cuales
facilitan la infección del virus en células mononucleares durante una segunda infección con
un serotipo diferente (Lanciotti RS et al., 1992).
La prM (22 kb) es el precursor glicosilado de la proteína estructural M (8 kb). La
separación proteolítica de este precursor por una proteasa del aparato de Golgi, durante la
maduración viral, es lo que da origen a la formación de la proteína M. Esta escisión parece
estar ligada a la liberación del virus, pero no ocurre necesariamente en todas las moléculas
proteicas presentes en la membrana viral, ya que en ocasiones aparece la proteína M junto a
la prM en el virión maduro. Anticuerpos contra prM pueden mediar la inmunidad de tipo
protectora, quizás por la neutralización de los viriones liberados que contienen prM no
clivada.
La proteína M madura es una proteína de membrana extracelular o de virus maduros,
resultado de la proteólisis de prM y la eliminación de la porción amino terminal. Está
estrechamente asociada a la envoltura lipídica. La formación de proteína M a partir de prM
parece crucial en la morfogénesis del virus, lo que implica un incremento en la infectividad
y la reorganización de la estructura de la superficie viral. No obstante, a la fecha el papel de
la proteína M en el virión no es bien conocido.
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
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21
La proteína E es una glicoproteína con un peso molecular entre 51 y 60 kD, es la
mayoritaria de la envoltura, glicosilada y la más conservada; la fusión con la célula huésped
es inducida a pH bajo. Está estrechamente asociada a la envoltura lipídica (Henchal EA y
Putnak JR, 1990). Se presenta como un homodímero en la superficie del virión maduro e
intracelularmente se puede encontrar como un heterodímero junto a la proteína prM. La
proteína E es el componente principal de las proyecciones de la superficie del virión
observadas por microscopía electrónica y contiene los determinantes antigénicos
responsables de la neutralización del virus y la hemaglutinación de eritrocitos, induciendo
respuesta inmunológica en el huésped infectado. Se ha propuesto que en ella están
localizados la mayoría de los marcadores moleculares para la patogenicidad (Leitmeyer KC
et al., 1999). La infección con uno de los serotipos estimula la producción de anticuerpos
neutralizantes primarios contra la envoltura de la proteína, confiriéndole así larga vida
inmune al serotipo. La existencia de anticuerpos neutralizantes a un serotipo puede
promover el ambiente de la infección con otro serotipo. En este modelo anticuerpo-
dependiente, la severidad de la enfermedad es postulada a ser el resultado de anticuerpos
heterólogos no neutralizantes facilitando la infección del virus en células mononucleares
durante una segunda infección con un serotipo diferente (Lanciotti RS et al., 1992).
2.5.2 Proteínas no estructurales del virus
Hasta la fecha se han identificado siete proteínas no estructurales del virus (NS): NS1,
NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5 (Figura 5).
La proteína no estructural NS1 es una glicoproteína de 48 kD que contiene dos señales del
tipo Asn -X-Ser/Thr, usadas para la adición de carbohidratos; estos sitios parecen estar
conservados en todos los flavivirus. Puede estar en forma secretada y no secretada. Es
sintetizada en el retículo endoplásmico rugoso como una proteína monomérica y en un
período corto se une formando un homodímero. Esta forma es más hidrofóbica y se
desconoce si el incremento de la hidrofobicidad es un resultado de la dimerización o alguna
modificación postraduccional. Una vez formado este dímero, la glicoproteína es
transportada al aparato de Golgi donde sufre modificaciones y de aquí pasa a la superficie
celular, liberándose al medio extracelular (Perera R y Kuhn RJ, 2008). La función de la
NS1 en la replicación viral no ha sido bien dilucidada. Se ha planteado que posee un papel
en la replicación temprana. Basados en análisis mutacional se ha relacionado con la
morfogénesis viral. A su vez, mutaciones de esta proteína afectan la virulencia de la
partícula viral. También se relaciona con la respuesta inmune específica de serotipo
(Henchal EA y Putnak JR, 1990).
La NS3 es la segunda proteína en tamaño, con un peso molecular entre 68 y 70 kD y se
encuentra asociada a la membrana. Es altamente conservada en los flavivirus y se piensa
que es un componente de la maquinaria enzimática de la replicación del ARN viral. La
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
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22
comparación de sus secuencias nucleotídicas y los análisis bioquímicos sugieren que es
trifuncional, conteniendo actividad de proteasa (contra la poliproteína), de helicasa y de
ARN trifosfatasa trifosfato (formación de la estructura 5' cap). Su extremo N terminal
contiene el dominio catalítico de la proteasa NS2b-NS3, parecido a la serina-proteasa de las
subfamilias de las tripsinas. Esta triada catalítica está conformada por His 51, Asp 75 y Ser
135. Se cree que la actividad proteolítica de esta enzima sea la responsable del corte de
NS2b, NS3, NS4a, NS5 y del extremo carboxilo de la proteína C. En esta proteína existen
regiones homólogas con la familia de las helicasas, así como un fragmento C terminal de 50
kD derivado de la proteólisis, que tiene actividad ARN trifosfatasa y está involucrado en la
formación de la estructura de la caperuza del extremo 5´ del genoma del flavivirus (Xu T et
al., 2005).
Las proteínas no estructurales como NS1 y NS3, son capaces de inducir una respuesta
inmune protectora en modelos murinos y, al no estar asociadas con partículas vírales libres
no hay riesgo que la infección sea potenciada por anticuerpos facilitadores. Esta
característica las hace buenas candidatas para ser incluidas en el desarrollo de vacunas
contra el dengue (Antuñano FJ y Mota J, 2000).
Las regiones hidrofóbicas menos conservadas de la poliproteína del DENV son procesadas
en al menos cuatro proteínas no estructurales adicionales (NS2a, NS2b, NS4a y NS4b).
Poco se conoce de las funciones de estas en el ciclo de vida de los flavivirus. Sin embargo,
se conoce que la NS2b, de 27 kD, junto con la NS3 forman un complejo esencial para el
procesamiento de todos los sitios de corte de las proteínas no estructurales y las
estructurales (Henchal EA y Putnak JR, 1990).
La última proteína codificada es la NS5, que es la más grande de 103 a 104 kD, bifuncional
y una de las más conservadas en los flavivirus. Es una proteína básica y se cree que
funciona como una ARN polimerasa dependiente del ARN, aunque no se ha verificado
directamente. Esto se basa en la presencia de una región altamente conservada (YF NS5
666-668) característica de este tipo de enzima presente en los virus ARN con cadena
positiva. Se ha sugerido que puede estar involucrada en la metilación de la estructura de la
caperuza 5´ terminal (Henchal EA y Putnak JR, 1990).
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
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23
Figura 5: Genoma de los DENV. Se representa el marco de lectura abierto flanqueado por
dos regiones no traducidas, codifica para 3 proteínas estructurales: C, M y E, y 7 proteínas
no estructurales (NS): NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b y NS5.
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
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24
2.6 Prevención y control de la fiebre por dengue
La prevención y control de la FD/FHD es cada vez más necesaria conforme aumenta la
distribución geográfica de los mosquitos y de los virus así como el incremento en la
incidencia de la enfermedad. Desafortunadamente, las herramientas disponibles para
prevenir las infecciones por DENV son muy limitadas. Hasta la fecha no se dispone de
ningún medicamento específico para el tratamiento de la FD/FHD y aunque se están
desarrollando vacunas potencialmente eficaces para controlar los cuatro serotipos del virus,
tomará un tiempo antes de que estén licenciadas para su uso en salud pública. Por el
momento, los métodos más efectivos para prevenir y controlar la FD/FHD son el
diagnóstico inmediato de los casos de fiebre aunado al tratamiento clínico adecuado y la
reducción del contacto humano-vector (Parks W y Lloyd L, 2004).
En Colombia la vigilancia epidemiológica del dengue se basa en la vigilancia clínica
(síntomas y signos compatibles), serológica (determinación de anticuerpos IgM en suero de
pacientes), virológica (aislamiento viral y determinación del serotipo) y entomológica
(índices de infestación larvaria y de adultos del vector) (Ospina M, 2004).
2.6.1 Vigilancia virológica
El diagnóstico del laboratorio es esencial para la confirmación del dengue; este incluye
técnicas de aislamiento e identificación del virus, de diagnóstico serológico y de biología
molecular (detección del ARN del dengue). La detección de antígenos virales en sueros
virémicos es necesaria para las investigaciones clínicas y epidemiológicas y debe realizarse
rápidamente para implantar tempranamente el tratamiento anti-choque a los enfermos y la
detección precoz de un brote.
En diferentes investigaciones como se ha podido constatar que la viremia ocurre en la
etapa temprana del período febril del dengue y su eliminación es cuando disminuye la
fiebre y aumentan los niveles de anticuerpos (Vaughn DW et al., 1997). Los primeros en
demostrar esto fueron Ashbur y Craig en una investigación en Manila en 1906. Si bien los
estudios virológicos de DENV son determinantes para la vigilancia de la enfermedad, la
capacidad instalada de laboratorios es limitada, la utilización de estos estudios debe ser
racional y oportuna, de acuerdo con la situación específica de cada región y los objetivos y
necesidades de información del sistema de vigilancia virológica.
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
25
2.6.2 Vigilancia entomológica
Se emplea para determinar cambios en la distribución geográfica del vector, para obtener
mediciones relativas de la población de vectores a lo largo del tiempo y para facilitar las
decisiones apropiadas y oportunas en lo referente a intervenciones. Puede servir para
identificar las zonas de alta densidad de infestación o los periodos de aumento de las
poblaciones. En zonas donde el vector ya no está presente, la vigilancia entomológica es
fundamental para detectar rápidamente nuevas introducciones antes que se generalicen y
sean difíciles de eliminar. La vigilancia de la susceptibilidad de la población de vectores a
los insecticidas también es parte integral de cualquier programa de control químico
vectorial. En Colombia las actividades de vigilancia entomológica del dengue son
realizadas por las autoridades locales de salud y en general se resumen en el levantamiento
clásico de índices aédicos.
2.6.3 Control vectorial
Saneamiento ambiental. Incluye estrategias para reducir los criaderos de mosquitos, tales
como el manejo de los recipientes de almacenamiento de agua (por ejemplo, cubiertas a
prueba de mosquitos para tinajas de almacenamiento de agua, partículas de poliestireno en
tanques de agua), abastecimientos de agua mejor diseñados y fiables, y reciclaje de residuos
sólidos, tales como neumáticos desechados, botellas y latas.
Control biológico. Uso de especies larvívoras como peces (Gambussia y Poecilia),
tortugas, algas del orden Chlorococcales, microsporidios y copépodos como Mesocyclops
longisetus. La estrategia más difundida de control biológico es el uso de la toxina del
Bacillus thuringensis var. Israelensis (Bti), el cual es un bacilo aeróbico, Gram positivo,
flagelado, que forma esporas. Durante la biogénesis se inicia la producción de la toxina
denominada también cuerpo cristalino, endotoxina- delta o cuerpo parasporal.la propiedad
insecticida del cristal se manifiesta cuando es ingerido por la larva durante su alimentación,
la pro-toxina se disuelve y activa (se convierte en toxina) por las proteasas y el pH alcalino
del intestino medio; la d-toxina se adhiere a las células epiteliales del intestino medio,
creando poros en la membrana intestinal y afectando al equilibrio de iones, y el tejido
pierde la capacidad de regular la permeabilidad. Como resultado, el intestino medio es
rápidamente inmovilizado, las células epiteliales se lisan, la larva deja de alimentarse, el pH
del intestino cae por la mezcla con la hemolinfa. Este pH bajo permite que las esporas
germinen y provoquen una septicemia y muerte de la larva. La muerte ocurre en 6 minutos
aproximadamente a altas concentraciones o a más de 24 horas a bajas concentraciones de
Bti (Chui VWD et al., 1995).
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
26
Control químico. Pese a que existen diversas estrategias de control, el control químico
sigue siendo la forma más efectiva en el control de brotes y epidemias de dengue. El uso de
insecticidas puede dividirse en dos métodos principales: atacar a los mosquitos adultos
(adulticidas) y/o atacar sus formas inmaduras (larvicidas). Una falencia de este sistema es la
resistencia a insecticidas la cual ya ha sido detectada en algunas poblaciones colombianas
de A. aegypti, por lo que es fundamental la vigilancia periódica de la susceptibilidad de este
vector (WHO, 2006; Santacoloma L et al, 2010; Fonseca-González I et al, 2011; Ocampo
CB et al, 2011)
Larvicidas. La finalidad de los larvicidas es matar los mosquitos en las etapas
inmaduras en los criaderos que se pueden destruir. Los efectos son duraderos pero necesitan
mantenimiento. El uso de larvicidas es común en las zonas que no cuentan con un
suministro adecuado de agua potable, agua para bañarse y para limpieza del hogar. A.
aegypti a menudo se desarrolla en contenedores para el almacenamiento de agua, por lo
cual los larvicidas deben tener poca toxicidad a mamíferos y no deben cambiar
significantemente el sabor, olor o color del agua.
Adulticidas: Estos productos se encargan de matar los mosquitos en la etapa adulta,
lo cual se consigue generalmente con la nebulización del insecticida. El efecto es inmediato
y de corta duración; al rociarlos, no duran más que unos pocos minutos y solo son eficaces
contra los vectores adultos presentes. El rociamiento se recomienda solo durante las
epidemias para concentrarse en las hembras infectadas y lograr su eliminación reduciendo
así la circulación del virus en la comunidad.
Reguladores de Crecimiento de Insectos (IGRs). Son compuestos químicos
similares a las hormonas que regulan el crecimiento en los insectos mediante la inhibición
de síntesis de quitina y los análogos a hormonas juveniles. Los reguladores del crecimiento
de los insectos, tanto juvenoides como ecdisoides, han sido muy utilizados en las últimas
décadas como una de las alternativas más promisorias al uso de insecticidas
convencionales, con vistas al control de insectos que constituyen plagas tanto en la salud
pública como en la agricultura. Esto es porque, en lo fundamental, son compuestos
biológicamente específicos, no tóxicos al hombre y otros organismos beneficiosos,
biodegradables y menos propensos al desarrollo de resistencia por los insectos.
Participación comunitaria. La cooperación de la comunidad es fundamental para un
control efectivo y sostenible de A. aegypti, al controlar la presencia de criaderos artificiales
en casas, edificios u alrededores, reduciendo así la densidad de este vector en la zona
domiciliar. De esta forma, la educación primaria en la salud y movilización social deben ser
partes integrales de los programas de control (WHO, 2006).
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
27
3. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
En Colombia, la FD/FHD es la enfermedad transmitida por vectores más prevalente,
después de la malaria. El dengue es una patología de alto poder epidémico que en los
últimos años se presenta en sus formas clásica y hemorrágica en una gran parte del
territorio colombiano debido, entre otros casos a la alta dispersión del vector A. aegypti en
el país. Hasta el mes de octubre de 2011 se registraron 25.929 casos totales de dengue entre
estos 24.810 de FD y 1.119 casos de FHD. La letalidad alcanzó las 41 muertes confirmadas
mientras que 40 aún se encuentran en estudio. En Colombia, el 95% de los casos de dengue
se presentan en poblaciones ubicadas por debajo de los 1.000 metros de altitud siendo los
departamentos más afectados Valle, Norte de Santander, Casanare, Huila, Tolima,
Antioquia y Atlántico (MPS, 2010; PAHO, 2011). Considerando la alta incidencia
presentada en los tres primeros meses del año 2010 y las condiciones ambientales como el
fenómeno del niño que contribuyen a la reproducción del mosquito vector y en
consecuencia aumentan la probabilidad de infección, las autoridades de salud en Colombia
declararon la alerta epidemiológica para la FD/FHD (PAHO, 2010).
Desafortunadamente, las herramientas disponibles actualmente para prevenir, detectar y
tratar la FD/FHD son limitadas; no existe un test diagnóstico que sea específico, práctico y
económico; no hay medicamentos contra el DENV (WHO, 2007) y aunque se ha diseñado
una vacuna tetravalente aun no ha sido licenciada. Esto obliga a las autoridades locales y
departamentales de salud a intensificar las acciones de vigilancia epidemiológica de la
enfermedad, incluyendo la vigilancia entomológica y virológica.
Desde la aparición del primer caso de FHD en diciembre de 1989, en Puerto Berrío
(Antioquia), se observa en el departamento una tendencia al rápido incremento en el
número de casos. Entre 1994 y 2003 la incidencia osciló entre 0.02 y 4.2 casos por 100.000
habitantes, registrándose en 1998 el mayor número de casos, con una letalidad del 6%,
debido a una gran epidemia que afectó el departamento de Antioquia. De acuerdo a la
presentación de casos las regiones más afectadas son: Magdalena Medio, Nordeste,
Occidente y Valle de Aburrá, con compromiso principalmente de la población entre 15 y 44
años (Ospina M, 2004).
La vigilancia entomológica en Antioquia se limita a la determinación de los índices
aédicos. Diferentes estudios han demostrado que los actuales indicadores entomológicos
no parecen evaluar efectivamente el riesgo de transmisión o definir umbrales para
epidemias de dengue (Focks et al., 2000) dado que la densidad mínima del vector bajo la
cual no hay transmisión de dengue aun no está definida. En Antioquia los tanques, canecas
y llantas son los principales criaderos del vector. Los índices de infestación larvaria (Índice
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
28
de Breteau) oscilan entre 10.2 y 11.6 y sitúan al departamento entre los de alto riesgo, de
acuerdo a los criterios definidos por la OMS.
Como el dengue es una enfermedad de áreas tropicales es necesario la continua vigilancia e
identificación del virus en las poblaciones en especial en áreas endémicas donde se
presentan casos todo el año, con el fin de controlar y prevenir epidemias y así disminuir el
riesgo, controlar la prevalencia y el mantenimiento del virus en la naturaleza.
En 1992 se inició la vigilancia virológica en Antioquia, demostrando la circulación de los
serotipos 2 y 4. Desde el año 1993 hasta el 2001 circularon los serotipos 1,2 y 4. En
Antioquia el serotipo 3 se detectó por primera vez en el año 2002 en los municipios de
Bello, Medellín, Cáceres, Valdivia, San Pedro de Urabá, Cisneros y Turbo, en coincidencia
con un aumento en el número de casos. En los años posteriores se determino la circulación
de los cuatro serotipos (1 (2002, 2004-2008); 2 (2002); 3 (2002-2006) y 4 (2006)). En
Colombia, los cuatro serotipos están circulando hace más de 20 años y el genotipo ha sido
documentado para todos menos el serotipo 3 (Romero-Vivas et al., 1998; Diaz F, 2005;
Ocazionez R et al., 2006; Ocazionez R et al., 2007).
La detección temprana de casos, unida al monitoreo entomológico representan
indiscutiblemente, la forma más eficaz de evitar brotes epidémicos. Sin embargo, la
vigilancia virológica está afectada por la baja especificidad y sensibilidad de las pruebas
utilizadas (la alta frecuencia de reacción cruzada de los anticuerpos con los determinantes
antigénicos que comparte el DENV con otros miembros de la familia Flaviviridae)
(Kautner I et al., 1997), por lo que en ocasiones deben prevalecer los criterios clínicos y
epidemiológicos para la clasificación de casos y toma de decisiones, los cuales dependen de
la experticia del médico tratante, quienes en muchos casos no son los profesionales clínicos
en áreas tropicales.
Aunque la vigilancia virológica en humanos es importante (para el sondeo del virus y los
estudios patogénicos) esta es limitada por el tiempo de la muestra, el diagnostico
confirmatorio es post-mortem (muchos pacientes mueren en el estado de efervescencia o
poco después); en relación con la toma de muestras para la identificación del serotipo, esta
debe realizarse entre los días 4-5 del inicio de la enfermedad donde el pico de viremia es
alto (la viremia varia considerablemente dependiendo de los días de evolución de la
enfermedad) ya que con los días aumenta los títulos de IgM y disminuyen las partículas
virales. Adicionalmente en zonas tropicales donde confluyen simultáneamente diversas
enfermedades con síntomas similares a la FD/FHD sumado a las deficiencias en la atención
médica complican aun más la identificación del serotipo viral dado que es improbable que
las muestras de pacientes sean tomadas durante los primeros 5 días de iniciados los
síntomas.
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
29
Teniendo en cuenta que la introducción de nuevos serotipos en las poblaciones humanas
susceptibles es el mayor factor de riesgo para la emergencia de brotes y epidemias de FHD,
y que en el municipio de Bello se registra co-circulación de al menos dos serotipos virales y
casos confirmados de FHD, es necesaria buscar metodologías alternativas que permitan la
identificación de los serotipos circulantes en este municipio endémico para la enfermedad.
En este sentido, la determinación del DENV y sus serotipos en poblaciones de mosquitos
colectados en campo es una forma sensible, especifica y rápida para el diagnostico precoz
de la infección del dengue y la delimitación de zonas geográficas en riesgo epidémico. La
vigilancia virológica en mosquitos infectados naturalmente puede ser un componente
adicional de los sistemas de alerta temprana ya que es posible determinar la infección
durante el periodo extrínseco de incubación.
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
30
4. HIPÓTESIS:
Considerando que Bello presenta características ecológicas como altitud, humedad y
temperatura que favorecen la presencia del vector de la fiebre por dengue A. aegypti y que
el registro permanente de casos de FD determinan el carácter endémico de este municipio,
es posible identificar la presencia del virus dengue en poblaciones naturales de adultos de
A. aegypti.
5. OBJETIVOS:
OBJETIVO GENERAL
Identificar la presencia del virus dengue en poblaciones naturales de adultos del mosquito
vector A. aegypti en el municipio endémico de Bello.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Participar en los levantamientos trimestrales de índices aédicos durante 2009-2010
mediante visitas domiciliarias, junto con el personal de la Dirección Local de Salud de
Bello (DLSB) en todas las 10 comunas de este municipio.
Determinar los serotipos circulantes del virus dengue mediante RT-PCR (reacción en
cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa) en mosquitos A. aegypti adultos de
poblaciones naturales colectados en las 10 comunas de Bello.
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
31
6. JUSTIFICACIÓN
El incremento de la transmisión del DENV es causado principalmente por fallas en el
control de las poblaciones mosquito vector A. aegypti, la introducción y la rápida
diseminación de nuevas cepas de virus en una región, por los viajes aéreos y la creación de
condiciones ecológicas adecuadas en ciudades del trópico que permiten la coexistencia de
serotipos del DENV. La causa principal de brotes epidémicos de FD/FHD es la presencia
de nuevos serotipos circulando especialmente en áreas endémicas, además de la
variabilidad de estos serotipos y la virulencia de las cepas del virus.
Los brotes epidémicos de dengue pueden ser mitigados grandemente usando métodos de
diagnóstico rápido y confiable que permitan el control y manejo de los pacientes. Un
diagnóstico confirmatorio depende del aislamiento viral y solo puede ser realizado
mediante la detección del antígeno viral, genoma o partículas virales. Hasta hace poco esto
solo era posible a través de los diferentes métodos de aislamiento viral como los cultivos
celulares lo cual implicaba una alta inversión en infraestructura y personal. En la actualidad
hay disponibilidad de técnicas como la RT-PCR que permiten detectar ARN especifico del
virus en diferentes muestras incluyendo mosquitos (Lanciotti RS et al., 1992; Chow VTK
et al., 1993; Seah CLK et al., 1995)
Estudios en Singapur, Venezuela y México han demostrado que las pruebas de RT-PCR
pueden detectar pequeñas cantidades de virus. Esta metodología ha sido empleada para
detectar y serotipificar el DENV en mosquitos A. aegypti recogidos en campo durante bajos
y altos periodos de transmisión determinando la tasa mínima de infección en poblaciones
locales de mosquitos. La técnica es suficientemente sensible como para detectar un
mosquito infectado entre 60 mosquitos no infectados (Chow VTK et al., 1993; Seah CLK
et al., 1995; Urdaneta L et al., 2005); la técnica también es útil en la estimación de la
capacidad vectorial de los mosquitos al detectar el virus en los diferentes tejidos del
mosquito.
El uso de RT-PCR en investigaciones epidemiológicas permite no solo localizar
geográficamente los mosquitos infectados sino detectarlos hasta seis semanas antes del
inicio del brote epidémico, permitiendo una correlación entre los mosquitos infectados con
la vivienda o los sitios de trabajo de las personas afectadas por la enfermedad. Además, la
vigilancia de los mosquitos infectados con el DENV puede ayudar a monitorear las tasas de
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
32
infección en el vector identificando específicamente el serotipo causal y eliminando las
frecuentes reacciones cruzadas que se presentan entre los arbovirus.
Lo anterior provee una herramienta adicional que puede incorporarse en los sistemas de
alerta temprana para predecir una epidemia en una región particular. Estos procedimientos
resaltan la importancia de los estudios vectoriales para producir resultados rápidos y
reproducibles. Igualmente, este tipo de investigaciones moleculares son una aproximación
para el control de estas enfermedades, brindando así una importante relación de la
información sobre la biología molecular del vector y las interacciones ventor-patógeno.
La identificación temprana de un brote epidémico de cualquier enfermedad infecciosa es
un paso fundamental en la implementación de medidas efectivas de control y en la
reducción de la morbilidad y mortalidad en las poblaciones humanas. Si se identifica el
DENV en poblaciones naturales del mosquito entonces puede ser posible determinar el
riesgo epidémico de FD al identificar la introducción de un nuevo serotipo en una
población humana susceptible así como el riesgo epidémico de FHD al determinar la
frecuencia de segundas infecciones asociadas con el desarrollo de esta complicación. La
circulación de nuevos o antiguos serotipos fácilmente identificados en poblaciones
naturales de mosquito constituye un elemento importante de los sistemas de alerta temprana
de la enfermedad. Igualmente, la estandarización e implementación de nuevas y sencillas
herramientas moleculares por parte de las autoridades de salud puede mejorar las
estrategias de prevención y control en un área endémica como el municipio de Bello.
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
33
7. METODOLOGIA
7.1 AREA DE ESTUDIO
Este trabajo se realizó en las 10 comunas del área urbana del municipio de Bello (Figura 6).
La tabla 1 presenta los barrios muestreados.
7.1.1 Ubicación del municipio de Bello
Bello hace parte del Valle de Aburrá. El municipio cuenta con un área total de 142,36 Km²
de los cuales 19,7 Km² son suelo urbano y 122,66 km² son suelo rural. Este valle está
totalmente urbanizado en su parte plana, y muy poblado en sus laderas. Al valle lo cruza el
Río Medellín, el cual corre en dirección sur-norte, y a lo largo de sus 70 kilómetros recibe
en su recorrido el tributo de 57 quebradas. La ciudad, por estar ubicada en la zona tórrida,
no registra cambios estacionarios del clima. El índice promedio de precipitación es de
1.347 mm., y su temperatura está determinada por pisos térmicos que van del páramo,
pasando por el frío hasta llegar al medio, en donde está la cabecera, la cual tiene una
temperatura promedio de 23 °C durante todo el año, intercalando períodos secos y lluviosos
y se ve refrescada por los vientos que se encañonan a lo largo del valle y que soplan durante
todo el año.
Figura 6: mapa del municipio de Bello (Antioquia) mostrando su división administrativa
en 10 comunas.
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
34
7.1.2 Características del municipio de Bello
De acuerdo con las cifras del censo del DANE en 2005, Bello cuenta con 371.973
habitantes. Es la segunda aglomeración urbana del área metropolitana del Valle de Aburrá,
que suma en total 3.312.165 personas. El municipio cuenta con una densidad poblacional
de aproximadamente 2.496 por kilómetro cuadrado. El 47.1% de sus habitantes son
hombres y el 52,9% mujeres. La tasa de alfabetismo en la población mayor de 5 años de
edad es del 92.9%. Según las cifras de la Gobernación de Antioquia basadas en la encuesta
de Calidad de Vida 2004, el estrato socio-económico predominante en el municipio es el 2
(bajo) con el 39.3%, seguido por el estrato 3 (medio-bajo) con el 36.1% y el estrato 1 (bajo-
bajo) con un 20.2%. En una menor proporción también están los estratos 4 (medio) y 5
(medio-alto) con un 4.3% y 0.1% respectivamente, que son principalmente viviendas
campestres ubicadas en las veredas del municipio. En los últimos años la ciudad ha venido
teniendo un crecimiento descontrolado principalmente por la migración de poblaciones
desplazadas procedentes de otros municipios del departamento, con asentamientos tipo
invasión en algunos barrios. La mayoría de la población desplazada vive en viviendas
construidas informalmente en un alto nivel de hacinamiento. El 96.4% de la población tiene
servicio de acueducto aunque en el estrato 1 el suministro de agua es inconstante. Índices
de Breteau (IB) mayores al 5% se registran en 49 (59.7%) de los 82 barrios del área urbana.
7.2 Colección del material biológico
Durante el periodo comprendido entre Mayo del 2009 a Febrero del 2011 con la
colaboración de los funcionarios de la Dirección Local de Salud de Bello (DLSB) se
participó en el levantamiento de índices aedicos con el fin de recolectar larvas y adultos de
A. aegypti para la determinación de la infección y el serotipo viral. Los índices aédicos
evalúan la situación entomológica en una localidad determinada y permiten la vigilancia y
monitoreo de las medidas de control de A. aegypti en dicha localidad. La DLSB realiza 4
levantamientos anuales en todas las comunas de Bello, específicamente dos levantamientos
durante época seca (Dic-Feb; Jun-Ago) y dos durante época de lluvias (Mar-May; Sept-
Nov). Estos levantamientos se realizan mediante visitas domiciliarias durante las cuales se
recolectan larvas y/o pupas y adultos de A. aegypti en los diferentes tipos de criaderos del
mosquito.
Las larvas y pupas fueron transportadas directamente en agua desde criadero al insectario
del Grupo de Biología y Control de Enfermedades Infecciosas (BCEI). Los adultos se
transportaron vivos en bolsas ziploc con un poco de aire. Los insectos inmaduros se
tuvieron en condiciones estándar de 28°C y 70-80% de humedad relativa en recipientes con
agua y se alimentaron con pescarina diariamente hasta que llegaron al estado adulto.
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
35
Se colectaron varias larvas en un solo criadero puesto que las hembras de A. aegypti
ovipositan pequeñas cantidades de huevos en numerosos sitios (Reiter, 2007); sabiendo
esto, se deduce que varias hembras pusieron sus huevos en el mismo sitio durante la época
de postura. Esto descarta la posibilidad de muestrear hermanos o individuos muy
cercanamente relacionados (Ravel S et al., 2001).
7.3 Extracción y purificación de ARN
Para la extracción del ARN se siguió la metodología tradicional descrita por Cáceres
(2003); brevemente, los adultos fueron homogenizados en pools de máximo 5 mosquitos en
un tubo (eppendorf) con 500 ul de trizol y macerados para la extracción de ácidos
nucleicos; después se adicionaron otros 500 ul de trizol y se centrifugó a 12000 r.p.m a 4°C
por 10 min. El sobrenadantte se transfirió a un nuevo vial, se incubó el homogenizado por 5
min a temperatura ambiente y luego se adicionaron 200ul de cloroformo; se incubó a
temperatura ambiente por 15 min, y la suspensión se centrifugó 12000 r.p.m por 15min,
luego se transfirió la fase superior a un nuevo vial, se adicionaron 500ul de isopropanol y se
mezcló para precipitar el ARN; se incubó por 10 min a temperatura ambiente, se centrifugó
de nuevo a 12000 r.p.m por 10 min, se descartó el sobrenadante y se lavó el precipitado
con 1ml de etanol al 75% tratado con agua DEPC. El precipitado se centrifugó a 7500 r.p.m
por 5min, se descartó el etanol y se secó el pellet. El precipitado se resuspendió en 25ul de
agua libre de RNAsas y se incubó por 10 min a 55-60°C y se almacenó -80°C hasta ser
utilizado.
7.4 Cuantificación de ARN
La cuantificación del ARN total se realizó en un NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer
mediante un procedimiento espectrofotométrico, para lo cual se midió la absorbancia a 260
nm de las muestras de ARN. La pureza del ARN se determinó midiendo la absorbancia a
280 nm y calculando la razón A260/A280 (valor que debe ser superior a 1.8). La
concentración aproximada de la muestra se calculó utilizando la siguiente relación: 1
unidad de absorbancia a 260 nm equivale a 40 μg/ml de ARN.
7.5 Identificación de DENV y serotipos de DENV
La presencia de DENV en larvas y adultos colectados en campo se evidenció mediante RT-
PCR (reacción en cadena de la polimerasa después de la transcriptasa reversa) usada
anteriormente para detectar el DENV en saliva de Aedes (Chow et al., 1998). La
identificación de los serotipos circulantes se realizó mediante análisis moleculares sobre los
adultos de A. aegypti colectados vivos en campo. Los individuos fueron sacrificados por
congelamiento y mantenidos en solución de RNA later® (QIAGEN) hasta la extracción del
ARN. El ARN obtenido se sometió a transcripción reversa (RT) para ser convertido en
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
36
cADN y luego se realizó la reacción de PCR utilizando los iniciadores y el protocolo
descrito por Seah CLK et al., (1995).
7.5.1. Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR)
Antes de realizar la identificación del serotipo se evaluó la integridad del ARN mediante
amplificación del gen ribosomal AAS7 usando los primers específicos para A. aegypti
descritos en Günther J et al., 2007 5_- ACGTGAAATCGTTCGTGACATTAAG(sentido)
y 5 _-TTAACTTAGAAGCACTTGCGGTGAA (anti-sentido).
La retro-transcripción (RT) fue realizada usando el kit para RT-PCR QUANTITECT
SYBR GREEN (Quiagen®); La RT se realizó a 48° por 45 min. Luego 35 ciclos de PCR de
30s, 55° por 60s y 68° por 60s, y un ciclo final de 68° por 10 min.
Para detectar el serotipo de DENV se usaron los primers para el gen NS3 descritos por Seah
CLK et al., 1995 (Ver tabla 1).
Tabla 1: Secuencias nucleotídicas, y posiciones consenso arriba (DV1) y primers de tipo
específico abajo (DSP1-4) para la identificación de los serotipos virales.
Primer
(orientación) Secuencia
Posición
nucleotídica
Tamaño
en pb
DV1 (+) 5’-GGRACKTCAGGWTCTCC-3’
DSP1 (-) 5’-AGTTTCTTTTCCTAAACACCTCG-3’ 5067-5045 169
DSP2 (-) 5’-CCGGTGTGCTCRGCYCTGAT-3’ 5279-5260 362
DSP3 (-) 5’-TTAGAGTYCTTAAGCGTCTCTTG-3’ 5174-5152 265
DSP4 (-) 5’-CCTGGTTGATGACAAAAGTCTTG-3’ 5342-5320 426
Nucleótidos ambiguos: K (G/T), R (A/G), W (A/T), Y(C/T).
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
37
7.6 Visualización de fragmentos virales
La identificación del serotipo viral se verificó considerando el tamaño en pb obtenido por
visualización en electroforesis en agarosa al 1.5% (DEN1: 169 pb, DEN2: 362 pb, DEN3:
265 pb, DEN4: 426 pb). El ARN viral utilizado como control positivo procedió de cultivos
celulares infectados con los diferentes serotipos, los cuales fueron gentilmente facilitados
por José Ciro Usme del Laboratorio Neurociencias de la SIU-UdeA.
7.7 Determinación de la tasa mínima de infección viral en mosquitos
Se determinó la tasa mínima de infección (MIR) de A. aegypti con el DENV en poblaciones
naturales como se describe en Urdaneta L et al., 2005, basándonos en el supuesto básico
en que sólo un individuo infectado existe en un pool positivo. Por definición, la MIR tiene
define el límite inferior de la verdadera tasa de infección. Cuando las tasas de infección son
bajas y/o el pool es de tamaño pequeño, MIR proporciona una buena
estimación de la verdadera tasa infección de infectados ya que la posibilidad de que exista
más de un individuo en un pool positivo es insignificante (Gu W et al., 2004)
MIR= (numero de mosquitos positivos / numero total de mosquitos analizados)*1000
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
38
8. RESULTADOS
8.1 Colección del material biológico
Los insectos fueron colectados en los Barrios de Bello que tenían reportes de ser áreas de
alto riesgo o de tener una alta densidad vectorial, que hacen parte del programa de
vigilancia entomológica de la DLSB; estos barrios fueron visitados al menos una vez
durante los levantamientos de índices médicos: Las casas muestreadas en cada barrio
fueron escogidas al azar por los integrantes de la DLSB; cada casa visitada fue sometida a
una búsqueda meticulosa de larvas y adultos de mosquitos, dentro y en sus alrededores,
teniendo en cuenta las horas de mayor actividad hematofágica del mosquito es decir entre
las 9am y las 12m. Los individuos adultos fueron colectados con pequeñas redes de barrido
y los estadios inmaduros se colectaron con pipetas paster y luego se mantuvieron en viales
o en bolsas con agua del mismo criadero hasta su transporte al insectario del BCEI. Cada
espécimen colectado se identificó con el nombre del barrio, la dirección de la casa y la
fecha de colección. Los barrios visitados se muestran en la tabla 2. Los principales
criaderos donde el mosquito realiza parte de su ciclo de vida son canecas, tanques, plantas
en agua y recipientes de plástico que puedan contener agua reposada, donde las hembras
realizan su oviposición.
En el insectario del BCEI los individuos adultos fueron llevados a -20°C para provocarles
un choque térmico y luego ser almacenados en viales eppendorff con solución RNA later
(Quiagen®) a -80°C para conservar la integridad del ARN.
Tabla 2: Barrios muestreados en Bello y la comuna a la que pertenecen
BARRIO COMUNA FECHA
Prado # 8. Niquía Mayo 2009
Prado #8. Niquía Septiembre 2009
Granjas #8. Niquía Mayo 2009
Bucaros #3. Santa Ana Mayo 2009
Santa Ana #3. Santa Ana Mayo 2009
Villa María #5. La Cumbre Mayo 2009
Pachelly #6. Bellavista Mayo 2009
Altos de Niquía #7. Altos de Niquía Mayo 2009
Altos de Niquía #7. Altos de Niquía Septiembre 2009
Ciudad Niquía #8. Niquía Mayo 2009
Cafetal #5. La Cumbre Septiembre 2009
Buenos Aires #4. Suárez Septiembre 2009
Sonora #5. La Cumbre Septiembre 2009
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
39
Selva #7. Altos de Niquía Septiembre 2009
Niquía #8. Niquía Septiembre 2009
La Camila #9. Fontidueño Septiembre 2009
La Camila #9. Fontidueño Agosto 2010
Guasimalito #7. Altos de Niquía Septiembre 2009
Bellavista #6. Bellavista Diciembre 2009
Gran avenida #2. Madera Diciembre 2009
Pérez #4. Suárez Diciembre 2009
Pérez #4. Suárez Junio 2010
Pérez #4. Suárez Agosto 2010
Cabañitas #2. Madera Diciembre 2009
La Gabriela #10. Acevedo Diciembre 2009
Villa María #5. La cumbre Diciembre 2009
Playa Rica #6. Playa Rica Diciembre 2009
Espíritu Santo #4. Suárez Diciembre 2009
Madera #2. Madera Diciembre 2009
París #1. París Diciembre 2009
Primavera #5. La Cumbre Junio 2010
Maruchenga #1. París Junio 2010
San Gabriel #6. Bellavista Agosto 2010
Riachuelo #4. Suaréz Agosto 2010
Urapanes #8. Niquía Agosto 2010
Hermosa provincia #7. Altos de Niquía Agosto 2010
Tierra adentro Agosto 2010
8.2 Identificación de los especímenes
Todas las hembras y machos analizados fueron primero identificadas correctamente con
ayuda de un estereomicroscopio como A. aegypti siguiendo la clave taxonómica de Rueda
(2004).
8.3 Análisis genético
8.3.1 Extracción de ARN Se realizó la extracción de ARN de 1000 mosquitos colectados
en los barrios registrados en la tabla 2. Los mosquitos fueron agrupados en un total de 282
pools, distribuidos en máximo 5 mosquitos por pool y separados según el sexo y el lugar de
colección.
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
40
Tabla 3: Distribución de mosquitos en pools y total de pools
Numero de
mosquitos por pool
Total de mosquitos
por pool
Total de
pools
1 72 72
2 82 41
3 76 25
4 182 45
5 822 164
Total 1234 347
8.3.2 Cuantificación del ARN
Al realizar la cuantificación se pudo apreciar que la cantidad de ARN que se obtuvo de
cada pool estuvo entre 270.5 ng/ul – 1535.6 ng/ul, con una pureza promedio de 1.85
(260/280) por pool. Se realizaron diluciones para realizar todas las RT-PCR con el ARN a
una concentración de 50 ng/uL.
8.3.3 Evaluación de la integridad del ARN
Para verificar la integridad del ARN extraído se realizó la amplificación del gen ribosomal
AAS7 (300 pb) de A. aegypti (Figura 6). De este análisis solo el 0.002% de los pools
analizados no tuvo amplificación lo que pudo deberse a una degradación del ARN. Estas
muestras fueron descartadas.
Figura 7: Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio mostrando la amplificación
del gen ribosomal AAS7. M: machos; H: hembras; El numero indica la cantidad de
300pb
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
41
mosquitos por pool; CN: control negativo; la flecha indica el tamaño de la banda
amplificada (300pb).
8.3.4 Identificación de DENV y serotipos
Solo el 0.002% del total de mosquitos analizados resultó positivo para DENV por RT-PCR;
El pool positivo contenía 2 mosquitos hembras los cuales fueron colectados en el barrio
Pérez en Diciembre de 2009. La determinación del serotipo identificó la presencia de
DENV-3 en la muestra positiva (Figura 8).
Figura 8: Gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio mostrando la amplificación
de los serotipos DENV-2 (carril 2: 362 pb), DENV-3 (carril 3: 265 pb) y DENV-4 (carril 4:
426pb); Carril 5: muestra positiva correspondiente al serotipo DENV-3.
8.3.5. Determinación de la mínima concentración.
Para corroborar la sensibilidad de la RT-PCR después de haber obtenido nuestros
resultados decidimos realizar un ensayo con diluciones seriadas a partir de la concentración
inicial de 85.8 ng/ul las cuales fueron desde 1:10 hasta 1: 10000000 del ARN del DENV.
La figura 9, muestra los resultados de los productos de amplificación obtenidos por RT-
PCR para el serotipos DENV- 2 en una electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Marcador DENV-2 DENV-3 DENV-4 Muestra + CN
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
42
Figura 9. Gel de agarosa al 1% mostrando la amplificación de las diluciones a partir de
DENV-2. Carril 1: marcador de peso, 2: DENV-2 (85.8ng/ul), 3: dilución 1:10 (18ng/ul), 4:
1:100 (2.3ng/ul), 5: 1:1000 (1.9ng/ul), 6: 1:10000 (1ng/ul), 7: 1:100000 (0.2ng/ul), 8:
1:1000000 (0.001ng/ul), 9: 1: 10000000 (0.00001ng/ul), 10: control negativo.
El límite de detección fue 1:100000 para nuestro serotipo estudiado de DENV; esto nos
muestra una sensibilidad de detección del virus obtenido a partir de una concentración viral
de 0.2 ng/ul. Al comparar esto con la baja sensibilidad en la detección del DENV en los
pools de mosquitos capturados en campo observamos que pudo ser debido a un bajo titulo
viral en los moquitos inferior a 0.2 ng/ul.
8.3.6 Determinación de la tasa mínima de infección viral en mosquitos
Se determinó la tasa mínima de infección de A. aegypti con el DENV en poblaciones
naturales como se describe en Urdaneta L et al., 2005.
Determinación de la tasa mínima de infección para A. aegypti larvas y adultos
colectados en campo
MIRA.aegypti= (numero de mosquitos positivos / numero total de mosquitos analizados)*1000
MIRA.aegypti = 2/1234 x 1000 = 1.621
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
43
Determinación de la tasa mínima de infección para larvas de A. aegypti colectados
en campo.
MIRlarvas = (numero de larvas positivas / numero de larvas totales)* 1000
MIRlarvas= 0/ 1182 x 1000 = 0
Determinación de la tasa mínima de infección para A. aegypti adultos colectados en
campo.
MIRadultos = (numero de adultos positivos / numero de adultos totales)* 1000
MIRadultos= 2/ 52 x 1000 = 38.462
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
44
9. DISCUSIÓN
En las últimas dos décadas, la epidemiología del dengue en Colombia ha cambiado
dramáticamente con un incremento en la frecuencia e intensidad de los brotes epidémicos, a
pesar de los esfuerzos realizados por los programas locales de control. Para disminuir el
riesgo a la salud humana y los costos sociales y económicos asociados a las enfermedades
arbovirales como la FD/DHF, es necesario conocer la dinámica de transmisión de los
DENV y desarrollar con estos datos programas de vigilancia epidemiológica. La vigilancia
virológica debería incluir la detección temprana de la circulación del virus y su serotipo no
solo en humanos sino también en los mosquitos vectores, a fin de disponer de verdaderos
sistemas de alerta temprana de epidemias y/o brotes de esta enfermedad. Para cumplir con
esto es clave el diagnóstico seguro y la correcta identificación del serotipo que causa la
patología, para lo cual la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa con
transcripción reversa (RT-PCR) ha demostrado ser ampliamente eficiente. La vigilancia
virológica de mosquitos recogidos en campo y analizados por esta técnica ha sido sugerida
como herramienta en el monitoreo y en los sistemas de alerta temprana para brotes de
DENV en áreas endémicas y para la detección de los serotipos que sean introducidos
recientemente en dichas áreas (Chow et al., 1998, Méndez F et al., 2006).
El desarrollo e implementación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha
facilitado la aparición de un gran número de ensayos de diagnóstico para detectar virus,
incluyendo varias pruebas para detectar el DENV (Lanciotti RS, 1992). Estudios enfocados
en usar esta técnica molecular para detectar los serotipos del DENV en mosquitos han sido
realizados en zonas endémicas de Venezuela y Singapur (Chow VTK et al., 1998, Castro
et al., 2004, Urdaneta L et al., 2005). Aunque algunos de estos trabajos se limitaron solo al
análisis de datos epidemiológicos, cuando la epidemia ya se había establecido, la técnica
demostró alta sensibilidad y especificidad para DENV comparada con los métodos
serológicos usados con este mismo objetivo pero en humanos. Considerando la importancia
de conocer los serotipos que circulan en el municipio endémico de Bello y conociendo
que la segunda infección con algunos serotipos y genotipos del virus se asocian con
manifestaciones clínicas graves como la FHD y el SCD, y dado que existen reportes
previos de co- circulación de dos o más serotipos en este municipio, nuestro trabajo evaluó
el potencial de la detección del DENV en mosquitos traídos directamente de campo y
colectados en barrios con registros de infestación por A. aegypti.
En este estudio, la aproximación molecular usada involucró múltiples primers que estaban
dirigidos al gen que codifica la proteína no estructural NS3, lo cual permitió no solo
identificar la infección específica con virus dengue eliminando la posibilidad de reacciones
cruzadas con otros flavivirus, además de identificar el serotipo viral causante de esta
infección en el mosquito. Para corroborar la sensibilidad de la RT-PCR después de haber
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
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obtenido nuestros resultados se realizó un ensayo con diluciones seriadas desde 85.8 ng/ul
hasta 0.0001 ng/ul del ARN obtenido a partir del DENV-2. El límite mínimo de detección
fue 0.2 ng/ul; la baja sensibilidad en la detección del DENV con los pools de mosquitos
capturados en campo podría entonces relacionarse con un titulo viral en los moquitos
menor a esta concentración. Otra posibilidad es que dado que las extracciones de ARN en
nuestro estudio fueron realizadas a partir de todo el mosquito, esto podría haber resultado
en un efecto inhibitorio originado por la cantidad de tejido del mosquito.
La tasa mínima de infección (MIR) de 1.621 calculada en este estudio para A. aegypti en
Bello contrasta con resultados anteriores obtenidos en otras ciudades hiperendémicas como
Maracay en Venezuela donde se encontraron 16 por cada 1000 mosquitos (Urdaneta et al.,
2005) y en Singapur donde fue de 57,6 por cada 1000 mosquitos (Chow et al., 1998). No
obstante, la MIR podría aumentar si se incrementa el número de especímenes como en el
estudio de Urdaneta et al. (2005) en Venezuela donde se colectaron 4,597
aproximadamente. Para obtener una cantidad de mosquitos significativa se deben
considerar diversos factores como el tipo de instrumentos para realizar las colectas, el uso
de ovitrampas pegajosas, o las trampas de mosquitos BG-centinela (Ritchie et al., 2004).
Las colecciones del material de campo para nuestro trabajo se realizaron dentro de las
actividades convencionales del levantamiento de índices aédicos, las cuales están limitadas
en términos de recurso humano (el cual es contratado directamente por la DLSB y en
muchos casos carece de entrenamiento en entomología o es temporal) y de recurso físico (el
personal solo dispone de redes de barridos de fabricación casera). Lo anterior también
permitiría confirmar la transmisión vertical, sugerida en otros estudios como el de Gunther
J et al. (2007) en donde las larvas colectadas directamente de campo sobrepasaron las
4.000. En nuestro periodo de estudio, el DENV solo fue detectado en hembras adultas de A.
aegypti lo que sugiere que en la población está ocurriendo transmisión horizontal. Nosotros
detectamos la presencia de DENV-3 en estas hembras, las cuales fueron colectadas en
diciembre del 2009 en una casa donde habitaban personas con diagnóstico clínico de FD,
según información de la DLSB. Durante este mismo año, el Laboratorio Departamental de
Salud de Antioquia confirmó la circulación de DENV-3 en el municipio de Bello y sus
municipios vecinos en sueros aislados de pacientes con diagnostico confirmado de FD
(comunicación personal Dra. Marta Ospina); lo anterior está directamente relacionado con
el brote de la enfermedad ocurrido a finales del 2009 y principios del 2010. Chow et al.
(1998) en Singapur detectaron mosquitos infectados con DENV seis semanas antes de que
se presentaran casos en los humanos. Aunque nuestro estudio no permite determinar el
momento preciso del periodo epidémico durante el cual nuestro pool infectado se detectó, si
nos muestra que la técnica puede incluirse en estudios epidemiológicos a mayor escala,
donde los resultados obtenidos en la población de mosquitos puedan correlacionarse con los
obtenidos a partir de pruebas serológicas humanas.
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
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Los resultados del presente estudio confirman la importancia de la vigilancia epidemio-
virológica a través de la detección de mosquitos infectados naturalmente con DENV, como
una forma eficiente y rápida para la predicción de brotes de dengue.
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
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10. CONCLUSIONES
De la muestra de mosquitos analizados se identificó un pool de dos hembras
infectado con DENV-3, lo que muestra la utilidad de la técnica RT-PCR empleada
para detectar el virus en poblaciones naturales de A. aegypti.
Nuestros resultados confirman que la región del virus NS3 amplificada, es sensible
y específica para detectar y tipificar los serotipos de DENV circulantes en
poblaciones naturales del mosquito A. aegypti.
La tasa mínima de infección (MIR) baja (1.621) que se observa en poblaciones
naturales del mosquito se ve reflejada en este estudio, encontrando un solo pool de
dos mosquitos hembras infectado de un total de 282 pools.
Este estudio enfatiza la utilidad de las herramientas moleculares en los sistemas de
alerta temprana, contribuyendo a la disminución del riesgo de epidemias en una
región particular, al predecir el/los serotipos del virus DENV circulantes en la
naturaleza.
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
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11. PERSPECTIVAS
Es recomendable incluir una mayor cantidad de especímenes y disponer de
controles positivos de mosquitos infectados, se debe conocer la cantidad de virus
con la que están infectados para así poder determinar hasta que rango de titulo viral
puede detectar la técnica RT-PCR.
Deben implementarse estrategias de recolección de mosquitos más efectivas con el
fin de obtener un mayor número de adultos, y por lo tanto una mayor probabilidad
de encontrar infección por DENV en A. aegypti.
Con el fin de una mejor aplicación epidemiológica, es fundamental correlacionar los
datos de la vigilancia virológica en mosquitos con los datos obtenidos a partir de
muestras humanas.
IDENTIFICACION DE VIRUS DENGUE EN POBLACIONES NATURALES DE
Aedes aegypti DEL MUNICIPIO DE BELLO, ANTIOQUIA.
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