Tipos de microscopios
Ópticos
Electrónicos
Campo claro
Campo Oscuro
Contraste de fase
Confocal
Fluorescencia
Transmisión
Barrido
Microscopía -Resumen
Algunos Conceptos…
Resolución (D)Magnificación
Aumento que logra el equipo
Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar
dos puntos como entidades separadas
¿De qué depende la resolución?
0,5 .
Algunos Conceptos…
n . senθ D =
Longitud de onda del haz de luzλ FILTRO
AZUL
¿De qué depende la resolución?
Algunos Conceptos…
0,5 .
n . D =
λ
senθ
Objetivo
muestra
LENTE CONAN MAYOR
¿De qué depende la resolución?
Algunos Conceptos…
Índice de refracción
Es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz cuando pasa de un medio transparente a otro también transparente. Este cambio de dirección está originado por la distinta velocidad de la luz en cada medio. nAire: 1 nAceite:1,5
0,5 .
nD =λ
. senθ
ACEITE DE INMERSIÓN
Microscopio óptico – Campo oscuro
Observar organismos vivos sin necesidad
de tinción
Objetos brillantes sobre un fondo oscuro
Aumenta pequeñas diferencias en el índice de refracción y densidad en la célula
Microscopio óptico – Contraste de fase
Observar organismos vivos sin necesidad
de tinción
El anillo forma un cono hueco de luz.
El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse respecto del rayo que siga de largo
luz sombra
Células HeLa (Henrietta Lacks) Eritrocitos Humanos
Zygnema Filamentous Algae
Microscopio óptico – Contraste de fase
Microscopio óptico – Interferencia
Permite la visualización detallada sin teñir
Maximiza la diferencia entre los índices de refracción entre las partes de la muestra de forma de hacer visibles los limites celulares
Mismo principio que el microscopio de contraste de fase pero utiliza luz polarizada
Microscopio óptico – Contraste de fase e interferencia - Imágenes
Contraste de fase
Interferencia diferencial
Los objetos pueden también visualizarse por la luz que ellos mismos emiten
Microscopio óptico - Fluorescencia
Restringe infrarrojo
Pasa sólo la λ que permite la excitación del fluorocromo
Aequoria victoria
Microscopio óptico - Fluorescencia
Algunos “objetos” fluorescentes…
GFP(Green fluorescent protein)
Microscopía electrónica
Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
Microscopía electrónica de barrido (SEM)
Microscopía electrónica
Estructura interna y detalles ultraestructurales
Morfología y características de la superficie
Bacilos en división Mitocondria 60.000x
Herpes virus ensamblándose en el núcleo
Bacteria fagocitada por un macrófago
Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Glomérulo renal 1200x
Célula en corte transversal Piel humana
Espermatozoides bovinos
Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Célula vegetal con cristales (falsa tinción)Bacterias sobre un estoma
Glób. RojoGlób. Blanco
Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Elevados costos de los equipos y una infraestructura adecuada no permiten el uso de la técnica en cualquier laboratorio.
Altos costos de procesamiento de las muestras La manipulación de reactivos se torna
peligrosa por la elevada condición tóxica de los mismos.
Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos
La complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado.
Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación
Microscopía electrónica - Ventajas y desventajas
Microscopía de fuerza atómica (AFM)
Imágenes AFM de fibras de colágeno (izquierda) y ADN (derecha).
Imágenes AFM de una célula viva en un medio de cultivo (izquierda) y cromosoma humano (derecha).
Microscopía de fuerza atómica (AFM)
AFM images of M13 phage and mtDNA. M13 phage genomes before (A) and after (B) binding to SSB. Clayton et al, 2006.
ELISAWestern blotDot blotInmunohistoquímicaInmunofluorescenciaCitometría de flujo
Técnicas inmunológicas
Introducción a las Técnicas inmunológicas
Anticuerpo
Antígeno
Técnicas Inmunológicas - Producción de Inmunoglobulinas (anticuerpos)
epitope
Linfocito B
Activación
Antígeno
Técnicas Inmunológicas - Anticuerpos
Epitope A
Epitope C
Epitope B
Los antígenos suelen presentar múltiples copias del mismo epítope, y/o presencia de múltiples epítopes que son reconocidos por múltiples anticuerpos.
Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales
Antígeno
Purificación de Linfocitos B
Sangrado Cultivo de células tumorales
+Fusión
Hibridoma
Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales
Hibridomas
Screening: Búsqueda de hibridoma positivo y aislamiento
Purificación de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas
Técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA)
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)
Para detectar Antígenos
Anticuerpos
Antígeno
Ac. primario
Ac. secundario
Biotina
Cromógeno
Cromóforo
Avidina
Peroxidasa
Revelado – Detección indirecta
Revelado – Detección indirecta
Formación de colores por la acción enzimática de distintos cromógenos
Ventajas ELISA
Gran número de muestras procesadas simultáneamente
Muy sensible
Resultados rápidos
Cuantificación de sustancias diversas (hormonas, fármacos, etc.)
Western blot
Western blot: identificación de proteínas
Transferencia
SDS - PAGE
Gel Membrana
Incubación con Ab y revelado
Transferencia
Western blot
Bloqueo Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado
Biotina-avidina + peroxidasa Revelado
•Sustrato coloreado que precipita al reaccionar•Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima (revelado en placa radiográfica)
Ejemplo Western blot
Membrana nitrocelulosa
50
ActinaDAT
75105160250
Placas radiográficas
Gel acrilamida
Dot blot
DOT BLOT
Dot blot analysis of proteins extracted from wild-type spores and from spores exposing a TTFC chimera. (Ricca and Cutting. Journal of Nanobiotechnology 2003 1:6)
Variante de las técnicas de Southern, Northern y Western blot
Identificación de moléculas
Inmunohistoquímica
Trozo de tejido
Se corta en secciones muy finas y se coloca en un portaobjetos
Anticuerpo 1º Anticuerpo 2º biotinilado
Avidina-peroxidasa Revelado
Inmunohistoquímica: identificación en el tejido
Inmunofluorescencia-colocalización
La colocalización permite determinar si dos antígenos se encuentran en el mismo lugar (nucleo, vacuola, retículo, etc)
dentro de una célula
Citometría de Flujo
Citometría de FlujoCélula Medida En movimiento
Medida de las propiedades de las células mientras están en un flujo de líquido
InmunophenotipificaciónViabilidad/apoptosis/ProliferaciónCiclo celularCambios en la superficieActividad enzimáticaetc
Citometría de Flujo
La presión ejercida por una columna de fluido obliga a las células a “enfilarse” de a una
Citometría de Flujo
Tamaño
Granularidad
La luz que se detecta en la misma dirección del laser (forward) es detectada por el canal Forward Scatter Channel (FSC).La intensidad de la señal detectada se relaciona con el tamaño, y el indice de refracción de las células
La luz que se detecta a 90 grados del haz del laser (side) es detectada por el canal Side Scatter Channel (SSC)La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de estructuras citosólicas en la célula (gránulos, inclusiones, etc)
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